Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метод контроля и критерии оценки антигенной активности вакцины против ценуроза овец

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Метод контроля и критерии оценки антигенной активности вакцины против ценуроза овец"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ

НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ ИМЕНИ К.И.СКРЯБИНА

л п

На правах рукописи

ШИРКО МОХАМЕД САЛЕХ ТАЛАБАНИ

МЕТОД КОНТРОЛЯ И КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ АНТИГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЦЕНУРГ/ А ОВЕЦ

03.00.20 —гельминтология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 1994

Работа выполнена в Московской Государственной ака-емии прикладной биотехнологии

Научный руководитель

Официальные оппоненты

доктор ветеринарных наук, профессор Н.Е.Косминков

доктор ветеринарных на у к Успенский A.B.

доктор биологических наук Полетаева О.Г.

Ведущая организация

— Московская ветеринарная академия им.К.И.Скря-бина

ита диссертации состоится

"¿Я "

¿1994

час. на заседании специализированного совета

Д 020 04.01 при Всероссийском научно-исследовательскогу институте гельминтологии им.К.И Скрябина (ВИГИС)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек« ВИГИС.

Автореферат разослан " Л " 1994 г.

в

Ученый секретарь специализированного совета, доктор ветеринарных наук

С.В.Березкин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш. Проблема профилактики и ликвидации гель-(нтозов сельскохозяйственных животных, в том числе и ценуроза ipe бра явного овэц, продолжает оставаться актуальной, несмотря I многочисленные разработки способов и методов борьбы с ними. 1Иболее перспективным направлением в системе мер борьбы с гель-1нтозами является разработка средств специфической профилакти-I.

Вопросы иммунитета при инвазиях давно привлекают внимание :еных, так как знание антигенной структуры паразитов и механиз-иммунологической перестройки, происходящих в организме хозя-, определяет стратегию разработки вакцин при гельминтоза* житных.

Эти вопросы изучались в разные годы учеными нашэй страны

.И.Скрябин, Р.С.Щульц, К.И.Абуладза, В.С.Ершов, Р.П.Петров,

П.Шихсбалова, Е.С.Лейкана, О.Г.Полетаева, ЭД.Даугалиева, A.C.

ссоно.4, В.В.Филпппов, Н.Е.Кооминков я др.) а за рубежом СелмеИ, Heath, Eickard, Lloyd, vesïer , ,7illia-r.s ,ûsbom).

В результате исследований установлен патогенез гельмпитозоз позиций иммунологической перестройка организма животных, осно-й которой является выработка высоксспецтфтчных белков определен-го тнпа - иммуноглобулинов или аитзтэл.

KSK показали иослэдования последних лет ( üeatai, s-nyth 37, Rickard et al 1982, Vester, Tust in 1982, 1987),

тзгены, полученные от цестод на разных стадиях их развитая, зывае? в органпэма иявотных ту или иную степень защиты. Розуль-гы этих исследований привели к разработке средств спацпфэтзспой

иммунопрофилактики,' основанных на использовании антигенных компонентов, где в качестве активного начала используются антигены, получаемые .из различных стадий развития или участков тела возбудителя. Однако таких вакцин в ветеринарии еще мало (В.П.Урбан, 1985)..Имеются сообщения об успешном создании и применении вакцин против цистицеркозов животных, об использовании их против диктио-каулеза в фасциолеза овец и телят (T.A.Miller,1987, н.к.кшег < В.Х. Murrays 1989, М.Д. Rickard 1982, Э.Х.Даугалиева, 1989). Однако создание эффективных вакцин против гальминтозов ограничено, хотя ведутся работы по выработке молекулярных субъединичных вакцин.

Важным достижением в проблеме профилактики тканевых гельмин-тозов является разработка вакцины против ценуроза овец (П.Е.Костиков , 1986), основу которой составляют онкосферы М. """lticeps и продукты их жизнедеятельности после культивирования в течение ' двух суток в среде 199 с добавлением, в нее сыворотки крови телят и последующим внесением в культуру консерванта и адъюванта. Вакцина прошла успешные испытания в хозяйствах Тверской области, Казахстана и Северного Кавказа.

Утвержденный техническими условиями (ТУ) контроль активности вакцины при еа изготовлении предусматривает иммунизацию восприимчивых животных (ягнят) с последующим их заражением. Результаты проверки.учитываются через 2,5 месяца. Такой длительный срок проверки активности вакцины в связи с сезонностью применения вакцины затрудяет использование ее в хозяйствах в оптимальные сроки. Поэтому вопросы, связанные с усовершенствованием контроля активности вакцины после еэ изготовления, требуют дальнейшей разработки. Разработка чувствительных иммунохимических методов индикации биопрепаратов с помощью антител позволяет подойти к про-

бйеме разработка лабораторного метода контроля активности вак-. од против ценуроза.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным перед нами была поставлена цель - усовершенствовать метод контроля и определить критерии оценки антигенной активности вакцины против ценуроза овец.

Для достижения поставленной цели необходимо .было решить следующие задачи:

1. Определить принципиальную, возможность оценки антигенной активности вакцины с использованием методов иммунохимического анализа.

2. Подобрать лабораторную модель и разработать схему иммунизации для получения специфических антисывороток, пригодных для проведения контроля вакцины на присутствие специфического антигена.

3. Охарактеризовать антигенный состав вакцины.

4. Сравнить результаты исследований антигенной и иммуно-генной активности вакцины в лабораторных и производственных условиях с определением ее протективных свойств^

5. Предложить лабораторный, метод контроля я критерии оценка антигенной активности противоценурозвой вакцины.

Научная новчзна. Методами физико-химического а шшунохимячес-кого анализа изучен антигенный состав вакцины против ценуроза и

предложен метод контроля активности ее.

Показана принципиальная возможность и определены критерии оценки антигенной активности вакцины против ценуроза путем определения титра специфических антител у иммунизированных кроликов в реакции двойной диффузионной преципитации. Оптимизирована схема иммунизации кроликов при получении специфической антисыворотки к антигенному комплексу вакцины, получена иммунная сыворотка и определена ее активность и специфичность.

Практическая ценность. Разработан и предложен лабораторный метод контроля антигенной активности вакцины против ценуроза овец, позволяющий сократить сроки исследования и значительно снизить затраты на их проведение. Получение специфической антисыворотки к антигенному комплексу вакцины дает возможность осуществлять иммуно— химические исследования по совершенствованию вакцинных препаратов против ценуроза и других тениццозов.

Основные положения, выносимые на защиту: I. Антигенный состав вакцины против ценуроза

2. Разработка оптимальных условий получения специфических антисывороток, методы и критерии оценки антигенной активности вакцины против ценуроза овец.

3. Метод контроля антигенной активности вакцины.

4. Лабораторные и производственные испытания иммуногенной и антигенной активности вакцины против ценуроза по результатам применения предложенного метода контроля.

Апробация работы. Результаты доложены;

1. На Всесоюзной конференции "Эхинококкозы и цистицеркозы" (•Караганда, 1990)

2. На заседаниях кафедры инфекционных и паразитарных болезней-с.-х. животных Московской Государственной академии прикладной биотехнологии (Москва, 1990—1993 гг.)

3. На расширенном заседании кафедр ветеринарно—санитарного факультета МГАЛБ (Москва, 1993)

Публикации. По материалам диссертации Опубликовано-3 работы, отражающие основные положения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .;/■■'

Обзор литературы посвящен вопросам- антигенного строения гель— «гатов и вопросам получения из них антигенов для иммунизации жи-зотных. Рассмотрены различные иммунохимические методы контроля за )азвитием антителообразования и специфика иммунного ответа у ки-¡отных при гвльшштозах.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в период с 1990 по 1993 гг. В опытах исполь-ювали кроликов породы шиншилла в возрасте 12 месяцев, массой 1,5- . : кг, овец в возрасте 5-6 месяцев, подобранных по принципу аналогов :о массе и полу, клинически здоровых. Работу проводили в виварии ГАПБ и колхозе "Мечты Ильича" Тверской области. Лабораторные иссле— ования выполняли на кафедре инфекционных и паразитарных болезней .-х. животных МГАПБ. В исследованиях использовали фязико-хткгаэс-из, иммунохимические и клинические методы. Результаты исслздова-ий обрабатывали на ЭВМ.

Производственные испытания проводили в стацконарго иаблаго-|лучном по цэнурозу хозяйстве Карачаево-Черкессии, где пораяение 1вц составляло до 9,Ъ% ежегодно.

2.2. Выбор метода, критерии и оценка антигенной активности эотивоценурозной вакцины. Одним- из главных услоый, обеспечивающих ^фективность любого иммунизирующего препарата, является соблюдение ¡хнологии его изготовления. Именно выполнение этого условия позво— гет получать стандартные препараты, не отличающиеся по своим античным ^свойствам. Однако это не исключает-необходимости контроля

кавдой серии вакцины. Поскольку в защитном механизме, при вакцинации животных важную роль играют гуморальные факторы иммунитета, то критерием оценки протективных свойств вакцин могут служить данные по их антигенной активности, способности вырабатывать антитела в организме.

Антигенная активность вакцинных препаратов оценивается по способности специфического иммуногена вызывать образование антител. Исходя из этого, для оценки антигенной активности Бакцины можно использовать любую иммунохимическую реакцию, основанную на взаимодействии антиген-антитело. Наиболее предпочтительными для этйй цели, по мнению большинства исследователей, являются реакции иммунбдиффузии в геле, позволяющие.не только выявить число ант№-генных комплексов, но, что особенно важно, показать их идентичность. Эти реакции имеют значительные преимущества-перед другими. К их числу относится прежде всего стабильность образующихся в геле полос цреципитации, которые не изменяются при небольших колебаниях температуры и не исчезают в течение длительного времени. Переход' от избытка антигена к избытку антител происходит постепенно, в связи с чем область преципитации выявляется легко. При участии в реакции нескольких систем антиген-антитело в РИД образуется несколько полос преципитации. Они достаточно чувствителы-. и специфичны.

Таким образом, для определения антигенной активности вакцин лучше использовать реакции иммунодиффузии в геле как наиболее простые и информативные. Среди них наибольшее распространение получила реакция двойной преципитации (РДЦ), которая позволяет выявлять состав сложных антигенов, степень их очистки, антигенную активности. и др. К преимуществам этой реакции относится появление стабильных полос преципитации в относительно короткий срок (2448 часов).

Учитывая характер антигена, простоту и доступность описанного метода, мы при решении вопроса о выборе метода контроля остановили свой выбор именно на реакции двойной диффузионной преципитат ции.

2.3. Определение потенциальной активности антигенного комл-. декса вакцины против ценуроза.

Результативность постановки реакций для определения антигенной активности препарата зависит от компонентов иммунной реакции — антигена и антител.

Для стимуляции антителообразования у животных иммуногены збычно смешивают с адъювангами (при первичной иммунизации). Наибольшее распространение для этой цели получил адыовант Фрейн— 1&. Помимо неспецифической стимуляции иммунной системы животного, этот адыовант выполняет депонирующую функцию по отношению к имму-югену. Схема иммунизации животного (последовательность, сроки, ¡пособ введения) является при этом важным фактором, от которого Iависит результативность дальнейших исследований.

При выборе животного для получения сывороток крови с высо— :им титром антител должна учитываться степень чужеродности имму— ;огена для продуцента. В большинстве случаев предпочтение отдают роликам.

В практической иммунологии считается, что белки обладают олее высокой иммуногенностыо, тогда как липиды, углеводы и нук— еиновые кислоты менее антигенны и специфичны. Оптимальную по ачеству иммунную сыворотку получают от животных при введении алых доз антигена (от 10 до 100 мкг белка).

Высокий уровень содержания антител в сыворотке крови живот-эго позволяет использовать ее в больших разведениях, что сводит з минимума проявление перекрестных реакций. Еысокая степень видности при этом означает, что реакция'антиген-антитело быстро

достигает равновесного состояния и указывает на значительное сродство антигена к антителу.

На первом этапе наших исследований мы определили возможность получения'иммунного ответа у кроликов на введение им противоце— нурозной вакцины.

3 опыте были использованы кролики, которым -дважды, с интервалом. 10 дней, внутримышечно вводили вакцину против ценуроза в дозе по 0,1 мл. Такая схема иммунизации соответствовала схеме применения вакцины согласно ТУ (1986). Кровь для исследования брали до, на 5, 10 дни после первой и на 10 день после второй иммунизации. Контролем служили сыворотки крови кроликов до иммунизации и сыворотки крови неиммунизированных животных.

Методом диск-электрофореза мы провели исследования белковых фракций сыворотки крови кроликов и установили, что после введения вакцины в организма происходи? уменьшение альбуминных фракций, особенно к 10 дню после второго введения вакпины, в 4-5 раз по сравнению с содержанием до вакцинации:

49,581 1,79 % при 56,32+0,13 % в контроле. Содержание гамма—гло— бултовых фракций достоверно изменялось к 10 дню после второго введения вакцины, причем на протеинограммах у вакцикированных кроликов появлялась выраженная фракция гамма-й—глобулинов, отсутствующая в контроле. Содержание ее через 10 дней после второй вакцинации составило в среднем 4,26_Ю,32 % (Р 0,001). Увеличение в сыворотке крови гамма—глобулинов может служить показателем синтеза антител к антигенам вакцины.

Однако специфическая активность полученных антисывороток в реакции двойной диффузионной преципитации оказалась очень низкой, что побудило нас искать другие схемы иммунизации.

2.4. Оптимизация схемы иммунизации для получения специфических антисывороток к антигенному комплексу вакцины.Для получения высокоактивных антисывороток мы испытали две схемы иммунизации.При первой схема кроликов иммунизировали смесью вакцины с полным адъювантом Фрейнда.Для получения стабильной эмульсии смесь многократно набирали в шприц и выпускали через тонкуо иглу.Качество эмульсии оценивали удовлетворительно,если она не распадалась в воде в течение получаса. Эмульсию в количестве 0,2 мл вводили внутримышечно с повторной иммунизацией через 10 дней в той же дозе. Кровь для исследования брали до, на 5, 10 дни после первой и на 10, 20 и 30 дни после второй иммунизации. Контролем служили сыворотки крови кроликов до вакцинации.

Вторая схема иммунизации включала внутрикожное введение кроликам полного адъюванта Фрейнда в подушечки всех четырех лап в дозе по 0,2 мл на введение. Через 7 дней кроликам вводили вакцину в дозе 0,2 мл, повторную иммунизацию проводили через 15 дней той же дозой. Кровь для исследования брали до, через 5, 10 и 15 дней после первого введения вакцины и на 10, 20 и 30 дни после повторной иммунизации.

Результаты исследования сывороток крови кроликов, иммунизированных по описанным выше схемам, показали, что антитела (преципи-тины) после первого введения вакцины были зарегистрированы у животных второй группы на 15 день. При этом они формировали в геле эдин, а при концентрировании сывороток — два комплекса антиген-антитело с недостаточно четкими линиями преципитации. Повторная иммунизация кроликов второй группы значительно активизировала процесс у животных, и на 10 день после второго введения вакцины четит» зыявлялись 2-3 линии преципитации при титре специфических антител С:4, и одна четкая полоса преципитации выявлялась при титре 1:64

Характерным для сыворток этого срока было и то, что положительная реакция преципитации проявлялась без предварительного концентрирования и разведении антигена 1:2 и 1:4.

$ кроликов первой группы на 10 день после первого введения вакцины преципитины не были выявлены ни у одного животного. Повторная иммунизация кроликов давала слабо выраженный ответ, проявляющийся формированием одного комплекса антиген-антитело при титре специфических антител 1:2. Причем, повышения уровня антител не отмечено и к 30 дню после повторной вакцинации.

Сравнительная оценка полученных результатов показала, что вторая схема иммунизации кроликов, при которой в сыворотках крови накапливается достаточное количество специфических антител-преци-питинов, способных в РДП формировать четкие полосы преципитации при титре сывороток 1:4-1:64 на 10 день после второго введения вакцины, позволяет получить достаточно активную преципитирущую

сыворотку к антигенному комплексу вакцины.

Для подтверждения объективности оценки активности вакцины

■ нами были проведены контрольные исследования ранее приготовленной серии вакцины против ценуроза. Результаты исследований показали, что введение этой серии вакцины вызывало у кроликов выраженный синтез специфических антител, что проявилось формированием .в РДП 3 четких комплексов антиген-антитело при титре сывороток 1:4 и одной полосы преципитации при титре антител 1:64. Это согласоват-лось с данными контроля проверки активности вакцины согласно ТУ (1986), по которым данная серия, вакцины была признана пригодной для применения в овцеводческих хозяйствах.

Таким образом, в результате выполненной работы по совершенствованию контроля активности противоценурозной вакцины мы предлагаем следующую схему иммунизации кроликов:

I. Предварительное внутрикожное введение полного адъюванта Фрейнда в дозе по 0,2 мл в подушечки передних и задних лап. 8

2. Двукратная иммунизация кроликов испытуемой вакциной дозе по 0,2 мл внутримышечно с интервалом 15 дней.

3. Получение сывороток крови от кроликов на 10 день после второго введения вакцины.

4. Определение титра антител в сыворотке крови кроликов с помощью реакции двойной преципитации в агаровом геле (РДП)

5. Оценка активности вакцины

Антигенная активность противоценурозной вакцины признается нами достаточной, если в РДД формируются 2-3 четкие полосы преци^-питации с иммунными сыворотками кроликов в титре 1:4 и одна полоса при титре 1'.64. Эти показатели могут служить критерием оценки активности вакцины и возможности применения ее в производственных' условиях.

2.5* Характеристика антигенного состава вакцины против ценуроза. Изучение антигенной структуры вакцинных препаратов проводили поэтапно. На первом этапе определяли потенциальную возможность активности антигена и выявили те компоненты, которые играют главную роль в иммунизирующем воздействии на организм хозяина.

Изучение антигенного комплекса вакцины осуществляли методом ;иск—электрофореза с додецилсульфатом натрия в буферной системе [еммли в вертикальной системе прибора на пластинах геля. Показано, [то в составе вакцины против ценуроза имеется белковая фракция [нтенсивно и характерно окрашивающаяся с молекулярной массой около !4,4 кД, которая отсутствовала в контроле. Остальные фракции вак— [ины соответствовали по молекулярной массе и подвижности аналогичным | контроле. Вакцинный препарат, содержащий антигенный комплекс с юлекулярной массой 14,4 кД, реагировал со специфической ачтисыво— откой в РДП.

Полученные результаты совпадают с результатами других иссле— ователей [Р^а,, 19-У-? ), которые выделяли из тениид белок с

молекулярной массой 14,0 кД, обладающий выраженными антигенными свойствами при введении его крысам. Наши результаты совпадают и с результатами Т.И. Судьиной (1993), которая выделила из онкосфе— рального секреторного антигена (ОСА) белковую фракцию с м.м. 14,4 кД, обладавшую антигенными свойствами при введении ее ягнятам.

2.6. Проверка активности вакцины в производственном опыте. Для подтверждения объективности оценки активности контролируемой нами вакцины был проведен опыт по выяснению ее профилактической эффективности на ограниченном количестве ягнят. Кроме того, мы исследовали динамику антителообразования при разных сроках ревакцинации и различных дозах с целью оптимизации условий применения.

В опыте было 4 группы ягнят по 10 голов в каждой, в возрасте 5-6 месяцев, подобранных по приниципу аналогов по массе и полу. Первой и второй группе животных вакуину вводили однократно в дозе I и 2 мл соответственно. В третьей группе вакцину ягнятам вводили двукратно в дозе по I мл с интервалом 10, 15 и 20 дней, в четвертой — двукратно в дозе по 2 мл с такими же интервалами. У ягнят первой и второй групп кровь для исследования брали до, на 10 и 20 дни после введения вакцины, а у ягнят в третьей и четвертой группах — до, в день повторной вакцинации и на 20 день после второй. Контролем служили сыворотки крови до вакцинации и сыворотки крови невакцинированных ягнят того же возраста, находившихся в той же отаре.

Результаты исследований сывороток крови, полученных от животных первой и второй групп, показали, что специфические антитела в РДП обнаруживались в сыворотке крови только после ее концентрирования, что свидетельствует о слабой антигенной активности вакцины после однократной иммунизации.

Ревакцинация заметно усиливала антителообразование в организ— е ягнят, что позволило нам на 20 день после введения вакцины вы-влять специфические антитела в реакции двойной диффузионной преци-итация в титре 1:4, при этом обнаруживались 2^3 четкие полосы реципитании комплекса антиген-антитело.

Наиболее интенсивно процесс антителообразования протекал у ивотннх при ревакцинации через 15 дней. Увеличение дозы вакцины э 2 мл не влияло значительно на титр антител, он составлял 1:4, цнако выявляли большое число животных, формировавших в РДП не знее 3 комплексов антиген—антитело.

Учитывая полученные данные, мы провели производственный опыт ) иммунизации ягнят текущего года рождения против ценуроза конт— >лируемой нами серии вакцины. В совхозе, неблагополучном по це— грозу, вакцинировали 1000 ягнят. Остальные 3200 ягнят чтого же |да рождения не вакцинировались. Животные находились в одних ота-

и выпасались в течение лета на одних пастбищах. Результаты ыта показали, что из 1000 ягнят, которым вводили по I мл вакци-: двукратно с интервалом 15 дней, не заболело ценурозом ни одно вотное, тогда как из 3200 невакцинированных животных ценуроз отчей у 195.

Показано, что у животных, иммунизированных вакциной против

нуроза, развивается достаточно напряженный иммунитет, способный едохранить их от заражения.

Для подтверждения того, что у иммунизированных животных раз— вается достаточно напряженный иммунный ответ на антигены вакци-, мы провели изучение динамики накопления иммуноглобулинов раз-с классов. Исследованию подвергали сыворотки крови ягнят, позленных в производственный опыт. Сыворотку получали до, в день зторной и на 20 день после ре иммунизации. Контролем служили сы-ютки крови ягнят до иммунизации.

Изучение динамики уровня иммуноглобулинов отдельных классов показало, что содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови животных до вакцинации находилось в пределах физиологической нормы и составляло 16,1+0,45, - 1,22+_0,18, -0,69+р 08

мг/мл, при этом следует отметить, что уровень о казался минимальным для данного возраста (5-6 месяцев) животных. В процессе иммуногенеза у ягнят после введения вакцины через 15 дней уровень М значительно увеличивался, тогда как ^ Ь'увеличивался постепенно. Вторичная иммунизация вызывала повышение уровня иммуноглобулинов класса (г до 24,7+0,18 мг/мл и не приводила к заметному накоплению иммуноглобулинов каасса М. Концентрация его составляла на 20-день после второй иммунизации 2,97+0,18 мг/мл. Уровень^ А на разных этапах иммуногенеза колебался незначительно и составлял в среднем 0,82+0,03 мг/мл.

Полученные данные свидетельствуют, что при введении вакцины против ценуроза в организме ягнят происходит накопление иммуноглобулинов классов М, особенно после повторной вакцинации. Это совпадает с мнением большинства исследователей (Федоров Ю.Н. ,1981, И олуэктова. И.Ф., 1985, Л.Е . Кацова, 1963, Б.Ы. Красов, 1969 и др.)

Исследования сывороток крови от вакцинированных ягнят, проведенные методом электрофореза в ПААГ, показали, что происходят определенные изменения в белковых фракциях сыворотки. Так, отмечено уменьшение содержания альбуминовой фракции до 20,2+0,73 % на 10 день после повторного введения вакцины и увеличение количества гамма-глобулиновых фракций, причем увеличение происходит за счет появления гаммат-2—глобулинов, содержание которых составило на 10 день после повторного введения вакцины 11,6_г0,09 %.

Представленные данные сввдетельствуют об иммунологических изменениях в организме ягнят, связанных: с образованием специфических

антител и формированием устойчивости к заражению ценурозом.

2.7 ■ Проверка антигенности вакцины с помощью кроличьих гипериммунных сыовороток. При оценке 'присутствия в противоценурозной вакцине специфического антигена, ответственного за.формирование иммунитета у животных, необходимо наличие активной иммунной сыворотки. Хотя получение таких иммуносывороток не представляет особого труда, тем не менее для их приготовления требуется время и наличие животных—доноров, что создает определенные неудобства в работе. Иеходя-из этого, необходимо установить возможность использования предварительно приготовленной иммунной сыворотки к антигенам противоценурозной вакцины для-контроля ее различных серий.

Нами были исследованы в реакции иммунодиффузии в геле две серии противоценурозной вакцины с использованием специфической сыворотки крови, полученной иммунизацией кроликов по предложенной нами схеме. Одна из этих серий была исследована в предыдущих опытах, где оценивалась нами как пригодная для вакцинации животных в производственных условиях.

В результате проведенных исследований установлено, что гипер-ишунная сыворотка, полученная к одной из серий вакцины, способна выявлять идентичные антигенные комплексы и в другой анализируемой серии противоценурозной вакцины. Об идентичности выявляемых компонентов свидетельствует полное слияние полос преципитации, проявленных в двух исследуемых иммунных тест-системах.

Полученные нами данные позволяют заключить, что для контроля антигенности каждой серии вновь приготовленной противоценурозной вакцины можно использовать предварительно полученные гипериммунные антисыворотки, содержащие преципитирующие антитела не ниже 1:16 в РДО.

выводы

1. Методами физико-химического и иммунохимического анализа подтверждено присутствие в различных сериях вакцины против ценуроза специфического антигена в виде комплекса белков с молекулярной массой 14,4 кД, ответственного за антигенную и иммуногенную активность вакцинного препарата.

2. Оптимизированы условия и схема получения гипериммунных кроличьих сывороток для выявления антигенного комплекса в составе ггротивоценурозной вакцины.

3. Определены критерии оценки и показана принципиальная возможность использования лабораторного метода контроля активности вакцины путем иммунизации кроликов и определения титра специфических антител к антигенному комплексу вакцины в реакции диффузиан-ной преципитации.

Вакцина против ценуроза признается пригодной к использовани в производственных условиях при формировании 2-3 четких комплексов антиген-антитело с иммунной сывороткой в титре 1:4 и одного комплекса при титре 1:64.

4. Показано, что введение ягнятам антигенного комплекса вакцины против ценуроза вызывает выраженную иммунологическую реакцию организма, характеризующуюся закономерными изменениями уровня иммуноглобулинов отдельных классов и синтезом специфических антител, выявляемых в реакции ди<|!фуэионной преципитации.

5. По результатам иммунологических исследований оптимизированы дозы и сроки ревакцинации, обеспечивающие формирование иммунитета у животных.

6. Контролируемые серии вакцины против ценуроза с помощью предложенных методов показали в производственных условиях выраженные протективные свойства.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен метод контроля и критерии-оценки антигенной активности вакцины против ценуроза.

2. Разработана схема иммунизации и условия получения специфических иммунных сывороток к антигенному комплексу вакцины против ценуроза для проведения имыунохимических реакций, включающая:

подготовку кроликов к иммунизации

— двукратную иммунизацию кроликов

— получение специфической иммунной сыворотки

— проведение лабораторных иммунохимических исследований

— оценка результатов антигенной активности вакцины

— заключение о пригодности вакцины в производственных условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Контроль иммуногенности противоценурозной вакцины на основе изменения протеинограммы сыворотки крови кроликов / Н.Е. Космин— ков, С.Э. Жавнис, Г.Л. Верховская, Ш. Бурхан // Тез. докл. научно— практ. конф. "Современное состояние и перспективы оздоровления хозяйств от эхинококкоза и цистицеркоза". Караганда 2-3 октября 1990.— М., 1990. С.78-80

2. Талабани Ш. Динамика накопления антител у ягнят при вакцинации против ценуроза: Сб.научн.тр. МВА. Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней. М., 1994. - 140 с.

3. К вопросу определения антигенности вакцины против ценуроза / Косминков Н.Е., Верховская Г.Л., Талабани Ш.: Тр. МВА Сб. научн. тр. МВА. Актуальные вопросы инфекционных и паразитарных болезней. М.: МВА., 1994. - 140 с.