Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Онкосферальный секреторный антиген Multiceps multiceps для профилактики ценуроза овец

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Онкосферальный секреторный антиген Multiceps multiceps для профилактики ценуроза овец"

рссШ^скля АКЛДЕШ СШШСОХОЗЯЙСТВЕНШХ НАУК ЕС^ОС^ШЙмтШО-ПССШОБАХтСЮШ ИНСТИТУТ ГЕЛЪШШТОЮПШ

i W I.Mll Íwíw'j - ,, „ „ _ .

яшшп акдцешша К.й. Скрябина

Йа правах рукописи СКРЫШШКОВА Тагьяна Ивановна

ОПКССФЕРАЛЬШЙ СЕКРЕГОРБНЙ ШИПЯ IfflMICEPfl 1ЭТЮХСЕРЗ да ПРОШАКТШ ЦЕНУРОЗА ОБЩ

Снстиалыгооть 03.00.20 - гвдьшшталогпя

А В Г О Р Е S S F A. т'

диссертации па оойскадяо ученой стотгатт каздддага вегершгаршг наук

Ноохва - XS93

Работа выполнена во Всероссийском паучно-ксслодоватедтьскеа институте гелышпгологт! иывпл ахадвшта К.И. Скрябина (ВИГЕО).

Научкао руководит сив - доктор бколоппосклх наук

Н.И. Боподшасов,

доктор вотеринарннх шуг., ирофессор U.E. Костиков

Официальные сяношкга: доктор лоторшзарпш: паук, профессор 'd.i. Даукадюва кавдодая? биологических наук O.A. Варжовшхй

Ведущая организация - Московская веторштарнап акадсшш ]з.:епн академика К.И. Скрябина

Загдата дкссортащш состоится 1993 г.

в часов ца аасодаяжн споцеолеееровонпого оовога Д-020.04.01

при Всеросскйскои научно-нссдодовательском институте гсльшш'го-логнн шош акадоаика К.И. Скрябина,

Адрсо: 11.7259, Москва, Б. Черецушишская, 20. С диссертацией нозшо оэаакошться в библиотеке ВЙШС.

Автореферат разослан

Ученый сехфотарь * спещзлизЕровашого сохета, доктор вехарзиарши наук

С.В. Боразшша

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш. Проблема ликвидация ценуроза овец является для юга России, республик Средней Азе* и Казахстана на сегодня актуальной. Большинство овцеводческих хозяйств стационарно неблагополучно по данному заболевании в течение многих лет.

Гельминтологическая наука внесла большой вклад в решение данной проблемы: детально изучен цикл развития возбудителя ценуроза и пути взаимного заражения дефинитивного и промежуточного хозяев, установлена зависимость отдельных звеньев эпизоотической цепи этого гельминтоза, разработаны общепрофила-гические ветер--нарно-санитарныэ правила, основанные на знании биологии паразитов (В.И. Бондарева, 1955, I9S3; К.И. Абуладзе, 1957, 1963, 1964; P.C. Щульц, 1954, 1958; Е.Е. Щуыакович, 1957, 1958, 1966; В.Ф.Никитин, 1958, 1959, 1961, 1963; И.Х. Ирга' та, 1965; Н.М. Матчанов, 1968, 1971, 1972, 1973, 1985; И.И. Зиниченко, 1969; А.К. Журавец, 1974, 1982, 1987, 1989; Б,Т. Рамазавов, 1979; A.C. Бессонов,198Г, Х986, 1992; К.В. Иахбазян, 1985; В.М. Шамхалов, 1986, 1988; И. Ашшяанов, 1988, 1990). Однако правила в условиях производства (особенно на летних отгонных пастбищах) нередко нарушаются " полноценность их выполнения сомнительна в различных хозяйствах, в результате чего гельминтоз широко распространен, особенно в зонах интенсивно развитого животноводства.

Одним из перспективных направлений борьбы с ценурозом овец является иммунопрофилактика," что доказано возможностью формирования напряденного иммунитета с помощью противоцестодозных вакцин в нашей стране и за рубежом. Научные сообщения последних лет показала, что у сельскохозяйственных животных, действительно, развивается иммунитет к тканевыа гаюАскнтозам. Доказано, что центральную роль в защитном иммунитете при цестодозах играют антитела, а тдмуннзадия животных неочищенными антигенами вызывает высокую степень защити ( Clegs J.A., Smith U.A., 1978, Elckard U.D., Williams J.P., 1982). Идеальная вакцина не только должна предохранять животных от заражения, но и'вызывать табель уже развитых лнчшок. Достигнуть этого, по мнению Rickard ц.п. а ffilliana J.P. гораздо сложнее, так кап их попытки вакцинации животных онкосфвральшши антигенами оказалась безуспешными н не

привели к гибели личинок. С другой стороны, иммунизация антигенами, полученными из среды культивирования активированных онко-сфер тений защищала промежуточных хозяев от заражения инвазионными яйцами. Успех по сообщении Н.Е. Косминкова (I986),Hickard M.D., Adolph A.J. (1977), Onawiirmrt O.A.,Coles йД980), Eajasekariah G.K., Mitchell &.T., Kickard M.D.(I980), Osborn P.J., Heath d.d.(1982), Verstex A., Tustin R.C. (1987) И др. был достигнут в отношении ягнят против Taenia ovia,T.hydatigeim, Kulticeps mulfcicep3, Echinococcus granulosus , кроликов против Т.pisiformis, мышей против T.taeniaeformls (Bydatigera taeniae!ormis),a телят против Taeniarhynchus eaginatus.

В настоящее время существует дефицит средств специфической и иеспещфической профилактика ценуроза озоц и разработка альтернативных технологий получения надегных средств Еялунопрофн-лактики является актуальной.

Цель 2 задачи исследований. Целью наших исследований было получение биопрепарата, обладающего иммуногенной активностью, для профилактика ценуроза овец.

Конкретно в задачи исследований входило:

- разработать технология получения онкосферального секреторного антигена Uult iceps nalticops;

- исследовать шэдунохшические свойства и провести контроль антигена;

- разработать схемы иммунизации овец онкосферальнш секреторный антигеном для профилактика ценуроза;

« определить протактивную активность полученного антигена в производственном опыте.

Научная новизна, разработан способ получения активированных опкосфер U.multiceps, повшаиций их выход из оболочек до 60$.

Усовершенствованы среди для культивирования in. vitro опкосфер N. zmiiticepe с целы получения их экскреторно-секреторных продуктов.

Разработана технология получения снкосферального секреторного антигена M.multicepa.

Методом иммунохшического анализа онкосферального секреторного антигена, вызывающего выработку специфических антител в крови иммунизированных животных, показано наличие специфического

- ь -

белкового компонента с м.м. 14,4 кД.

Впервые пзучепа активность сшсосфералыгого секреторпого антигена М. шиИасорз в реакции непрямой геыагглитинацпи па трех , тшунизироватаихх группах зптотшх.

На основе онкосферального секреторного антигена М.ви:Н;1сера

создала и испитана в производственных условиях противоцеяу-роапая вакцина, обладающая высоким профилактическим эффектом (59,6# защиты) при спонтанном заражении овод ценурозом.

Практическая ценность работч. На основе разработанной технологии получения онкосферального сокретораого антигена Н.щЩ;!-оера создала и испытана в производственных условиях против оце-пурозная вшщипа.

На "Способ получения актнвпрованшос опкосфор цостод" подана заявка В 4937428Д5/041612 от 17.05.1991 г. и получено положительное решение ВНИИГПЭ от 21.II. 1991 г.

Апробация работа.

• Материалы диссертации доложена:

1. На конференции колодах учоннх н специалистов (Москва, ВИГИС, 1990).

2. На конференции "Эколого-бислогнчзсклз и фаунистнчесхие аспекты гельминтозе®" (г. Ереван, 20-22 г-ля 1991 г.).

3. На заседаниях Ученого совета ВИГИС (Москва, 1989-1393гг.).

Основше положения, вшосияа на защиту:

1. Технология получения онкосферального секреторного антигена i5.nultj.cep3.

2. Изучение имцувохзшпческих свойств ошсосфзрального секреторного антигена М.тШ;1серз.

3. Иротективное действие вшащны на основа онкосферального секреторного аптигона при спонтанном ценурозе овец.

Публикации. По тоиэ диссертации опубликованы три статьи.

П ШКШШ лпссет/гатш. Диссертация излогена на '№£> страницах кашшошеного текста. Состоит пз введения, обзора литература, раздела "(агериалы п метода", шэстл глав собствешшх исследований и пх обсуждения, впводов. Работа шшострнрована у2-таблпцаиз п расункаад. Список литератур! содержат 0 у чествошшх и зарубегнах источников.

I. ОБЗОР ЖХШТУИ

в лпгвуагурЕоа сбэорэ представлены сведения о технологиях получения средств гацушпро^шзкткхк ларвалыгих тсшздозов. Проанализированы работы, вюшчакдо методы активирования н )дгхь'ш-рарованЕя озпсосфер, получения протохшзнкх антигенов. Подробно представлена работи, касшвдося проверен протектквних свойств оакоофоранькнх антигенов теиияд и их Еммунохкшческого анализа.

2. соесгшше ксслщшлгш

2.1. Материалы к методы

Научные исследования проведены в лаборатории биохимии и биотехнологии БИГКС, иа окснерпмекталькоЗ базе Курилово к колхозе "Бирлпк" Ногайского района Дагестана.

Голкжпгы для проведения исследований получали ог окопе-риментальзто шпзазкровашшх собак. Его неспособность яиц М.ки11;1-ссгс определяли по метода А.Г. Камаловой (1949), методу Н.Е. Когазшкова и Т.И. СудышоЙ (Скршгалковой) (1991) с пос-ледувдим подсчетом выхода (в процентах), а также заражением яг-иях.

Для выяснения олздшальшис условий освобогдешш онкосфер Н. юихисерз опробована различные прописи искусственного желудочного (ИКС) и искусственного кишечного соков (ИКС), позволпв-шх найти оптимальные их варианты. Для поддержания етзнеснособ-ноств онкосфер в искусственных условиях предложена пропись питательной среды, в которой в точение 2-х суток способны развиваться начальные стадии личиночной формы М.пи1Ъ1сора.Б результате опытов по культивированию активированных онкосфер ии1Ы-сера по разработанной нами методике бшя получена экскретор-по-секретораые продукты - предполагаемый антиген, который впоследствии использовался в атом качестве. В ходе наработки антигена освобождались от са:.!их онкосфер путем центрифугирования среди культивирования и концентрировали его с помощью полиэтклепгли-коля (м.и. 6000).

Для ы,мунохшического анализа огпсосферального секреторного антигена использовали метод электрофореза (Э$) в лолиакрилаьнд-;:он геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (ДСН) ( ХлеиИа и.К., 1970), имлуноэлектрофореза, реакцию двойной иммунодеффузни по

Ouchfcorlony О. (1958). Иснздшю ст>ороток проводили по истоду Н.Е. Баллад (1974).

Ак'хевность антигоиа определяли ротадеой яепряиой те»аитяа>-тннация (РИГА) по Halbere К. (1937), стерильность и безвредность обзопрлиягвин моаодпш. Концентрацию 6ej_ca в онкосфоральном секреторном антигоно определит no Xawry о. il. et ад1951).

Статистическая обработка датшх проведена по методу Стъю-декга.

2.2. Результаты исследований а гас обсуждение

2.2.1. Экспериментальное заражение собак леолехеш/л Соекигиз cerebralis

С цежо получения исходного г.ахоргала для изготовления он-косфорзльного секреторного антигена (ОСА) - яиц цестодц M.multi-сорв, собак заражали сколекссмя С.согьогаИз. Всего било проведено 8 оштов по зараяспзпэ собак. Из 3G ннвазаровашшх саздов зараг-еникки оказались II еивстпшс (ЗС$), из 15 инвазпроваиышс санок - 9 (2Э;1). Пол coöaic в пашах опытах пе влиял решающим образом па восприимчивость к зараяснип. Цестоды достигали половоЗ зрелости, в среднем, чероз 65 'дней поело заражения. У отдельп^с собак мульткцепец достигши половозролостп п начинали ввделять члепнки га 53й день после заражения.

Анализируя наши результат и да;шые лкторатуряюс источников, можем согласиться с гаюзлем С.А. Копгойаова (1987) о том, что сроки прешагшалыгаго ра: птля цеппя мозгового у собак,как п других тошщ, обуславливается рядом физиологических, генетических л гопсс факторов, таких Kaie возраст, пол, порода coöaic, сезон заражения, условия кормлония, географическое положение места, г/;о проводили эксперимент. В нагих ояитах при заражения собак количество сколексоз C.oerGbralis но превышало 70-80,при недостатке материала пгаотпшл задава i 40-50 сколексов. Пряхи-вар?*ость ларвоцист составила от 2,5 до 35$. Цонурусн обладали лоеысокоЗ устойчивостью к внешим'воэдэйствпям, оптимальной для сохранения их пятазиопности била температура +4°С в течение 10 суток. Локализацию цснурусов в цозжечкв по наблюдали ни разу, в лобпой доло в 35,7^ случаев, в лобнэ-теьгешюЙ - И,3%, в ви-

сочно-теменной - 28,6%, в затылочной — 21,456 случаев. При вскрытии 15 черепных коробок овец обнаружили по 2 пузнря в 8 случаях (53,3$) и ни разу не находили ценурусов в спинном мозге и в других органах.

2.2.2. Экспериментальное заражение овец яйцами M.multioop3

В наших опытах яйца M.multioeps при хранении в физиологическом растворе с антибиотиками в течение длительного времени (64 суток) оставались инвазионными, несмотря на то, что еизнэ-способность по нашему методу и методу Г.А. Кшаловой была шяь -лена только у яиц. Окончательным критерием пнвазиошгостл онкосфер служил процент заразившихся животных. Заражение проводили такяе для получения сывороток крови от больных ценурозом животных, используемых в иммунологических реакциях.

В опыте по заражении 6-ти ягнят 3-х месячного возраста использовали 64-х дневную культуру яиц M.nulfcicepa. Доза заражонкя составила 4 то. япц на I голову. Тяжелая форда острой стадии ценуроза с летальным исходом имела место у 2-х ягпят, у других животных отмечалась.стертая форма клинических признаков 1-й стадии ценуроза,

У двух ягнят из 4-х зараженных оставшихся в зшзых последняя стадия ценуроза проявилась на 40-50 сутки, две предыдущих стадин протекали без видимых клинических признаков. На продолжительность скрытого периода,по-видимому, повлияли множественность шгвазшг и своеобразная локализация паразита (В.И. Бонда-рэва, 1963). У остальных ягпят наблюдали с 24-го по 32-й день улучшение общего состояния, но в дальнейшем наступало узудше-ше, а с 89-го дня - яркое проявление юшшческих признаков ценуроза.

2.2.3. Активирование онкосфер M.muiticeps

В результата многочисленных опытов удалось добиться последовательного снятая оболочек о онкосфер, в то se время оставляя их зшзпеспособшии. С целью высвобождения онкосфер из оболочек ыы использовали ЮС следующего состава: пепсин - I г, концентрированная соляная кислота - I мл, физиологический раствор до" 100 мл. Опыт нашей работы показал, что углекислота, образовав-

ианея от вэашдодоЮтЕКя: соляной кислоты из ИЕС л бикарбоната натрия пз 1КС, являотся важным стимулятором активирования ошсосфзр н приводит к значптельномуувеличепкю количества подвилгон: ош;о~ сфор. Поэтому ШС поело 1,5~2х часового инкубирования выливала, оставляя приблизительно I ил и бистро дс 'аютиш 5 мл ИКС. Всого било использовано 22 вариация ИКС, в результате чого бия найден его оптимальный состав.

Таблша й I

Результаты определения активности ошсосфер М. ии1Ъ1сврв в различных составах искусственного кшючного сока

!__Номера, рзстпотюв

Ко!.шонектн IKCG ! ! 1 ! П ! Ш ! ! 1У ! : У ! У1 1 га

Пагафоатпн (г) I Г I - I I i

iTalíCOg I I I I I I i

Золчь свежая* ' Келчь зшлорогзнная?6 (мл) 5х 5х 5х 5х 20х 20й 5ä

Тртшсш! (цг) - 40 40 40 40 40 -

JÍBna3a (;лг) - - 30 30 30 30 -

Дистиллированная вода до 100 ыл

Активность- {%) 5-7 •1С 30 5 50 35 3

В составе икс известной лроппен ileath d.d. н Sayth j.d. (1970) с зег.юрег.ешгой яалчыэ в концентрации (раствор JS 7) активными били только 3% онносфер M.aultlccpa. Замена заморогеяной холчп на свегув в той же концентрации (раствор & I) повышала количество активкроватшх онкосфер почтл вдаоо, оно составляло уде 5-7? от общего числа псслодуе!Шх онкосфер. Введение в раствор со сведей делчыэ трипсина (раствор $ 2) прлвало к увелачешш поданд-внх онкосфьр до 10%, а при добавление липазц в количество 30 иг па 100 ил раствора (раствор JS 3) активными бшш уав 30 пз 100 обработанных онкосфэр. С уволячепзец концентрации свежей Евлча в

составе ИКС до 20% выход подвижных онкосфер увеличился до 505? (раствор К 5), замороженной - до 35% (раствор й 6), а отсутствие панкреатина, компенсированное введением трипсина и липазы (раствор Л 4), вели к уменьшению количества активированных онкосфер до Ъ%. Содержание бикарбоната натрия оставалось постоянным. Таким образом, факторами, обеспечивающими достаточно высокий выход подвижных онкосфер, оказались: введение в составизвестной прописи липазы, частично, трипсина, и увеличение концентрации свежей желчи.

При подборе оптимальной концентрации липазы и свежей желчи крупного рогатого скота процентное содержание других компонентов ИКС оставалось постоянным. Увеличение концентраций желчи и липазы повышало активирование онкосфер до определенных пределов. Оптимальная концентрация липазы - 0,03-0,455, желчи - 20-30$. Использовали свежую желчь, т.к. замороженная при -20°С, снижала активирование онкосфер почти в два раза. При хранении желчи при температуре +4°С, она теряла свою активность уже на 3-й сутки, и процент активированных онкосфер резко падал с 50$ до 5-85?. Опыт кашей работы позволил заметить, что желчь здоровых молодых бычков и телочек оказывала несравненно более сильное воздействие на активирование онкосфер, чем желчь старого и пораженного фасциолезом, дикроцеллозом и эхшококкозом крупного рогатого скота. Яйца М.ииШсерэ в ИКС выдерживали 15-25 минут в термостате при 37-38°С. Хотя концентрация водородных ионов не была решающим фактором, но от нее в конечном счете зависши активность ферментов в составе ИКС, а значит активность онкосфер. Величина рН ИЖС составляла 1,0-1,5, ИКС - 8,1-8,4. При повышены! рН до 8,5 - 8,8 количество подвзешых онкосфер снижалось.

Используя описанную технологию обработки яиц М. ки]^1сера нам удавалось добиться 100#-ного освобождения от оболочек онкосфер. Активность последних составляла в среднем 50-607». С увеличением сроков хранения яхц при температуре +4°С в физиологическом растворе с антибиотиками высвобсгдснпо онкосфер проходило труднее.

Как показали результаты экспериментов, успех активирования онкосфер цостодц М. си1С1серз зависит прежде всего от сроков хранения яиц. .".стельности их обработки, качественного и коли-

честветшого состава ¡ЕС и ИКС.

2.2.4. Культивирование in vitro ошсосфер М. multiceps

Культивирование онкосфер проводили целью получения экскре-торно-секреторши антигенов. Одновременно наблюдали за развитием онкосфер M.nulticeps в культуральных срезах разного состава. Последние, в основном,состояли из искусственной питательной среды 199 с сывороткой крови телят или крупного рогатого скота с добавлением антибиотиков - гентамицина или стрептомицина с пенициллином в разных соотношениях.

Работу проводили в условиях бокса. Посев осуществляли в чашки Петри в концентрации 4000 онкосфер/мл шш 200000 на 50 «л среды. Культивирование проведали в течение 48 часов при температура 37,5-38°С с регулярным контролем культуры на жизнеспособность и отсутствие микрофлоры.

В первые сутки на хвостовом конце онкосфэры начинала формироваться небольшая полость, заполненная бесцветной прозрачной жидкостью. Через 48 часов онкосферы удваивались в размерах, полость становилась большей по величине и была хорошо заметна. Исследования Ogren R.E. (1962) показали, что личинки тениид нагл-вают формироваться за счет мультипликации специфических зароды-йэзнх клеток внутри онкосферы. Однако следует отметить, что состав сред культивирования онкосфер Ш. oulticepa влтал на их рост и развитие в разной степени. Всего было испытано 10 культуральных сред.

Таблица й 2.

Влзяние сывороток кровн животных на развитие in vitro онкосфер M.ml-ticeje

¿У Состав среда культивирования j

1. Среда 199 + сыворотка крови телят (10%) +++•

2. Среда IS9 + сыворотка крови телят (20?) +++-

3. Среда 1j9 + сыворотка крови КРС (10?) •»■

4. Среда 199 + сыворотка крови КРС (20%) ++

Состав среда культивирования | ^^^о^™"4

5. Среда 129 . "иммунная сыпоротка" ягнят -

6, Среда 199 +

Условные обозначения: - нет роста; + незначительное развитие;

++ почти нормальное развитие; +++ нормальное развитие.

Таблица В 3.

Влияние антибиотиков на развитие онкосфер И. си1г!серз а рост банальной микрофлоры в культуральных сродах

г ! Гпага тглтгг^пчгог.ыт.птс ' ?ОСТ баНЭЛЬ- ! ОЦОШ'.й рйЗ-

ь [ ирода культивирования, содергл- . - »тктюйлоти ¡вития лита-п/п щая 10% сыворотки крови телят (когонш) ног

I. Среда 199 + 100 ЕД/мл пенициллина + 100 мкг/мл стрептомицина единичные +++

2. Срода 199 + 200 ВД/мл пенициллина + 200 ыкг/мл стрептош- цина отсутствие ++

3. Среда 199 + 40 ыкг/ыл гентамицина отсутствие +++

4. Срода 199 отдельные +

Усиленный рост личинок наблодался в культуральноО ореде, обогащенной сывороткой крови телят, т.е. сывороткой ыолодюс затотных. Впесошзе сыворотки крова телят в концентрации 10% стшдулировало ■ рост 8ОЙ личинок, её удвоенная концентрация - 90-95?. При замене сыворотки крови телят сывороткой крови крупного рогатого скота в концентрации 10$ регистрировали рост 30-35$ ошеосфер, внесение 20$ сыворотки крови поддерживало развитие 40-56$ личинок.

Таким образом, для получения максимального количества развевающиеся личинок М. miJ.fci.cep5 лучне использовать сыворотку кро-

■ — iü —

ни телят. Ео отсутствие в среде культивирования, вероятно, но обоспечиват развиващихся личинок достаточным количеством пита-тольшгс веществ, что воцот к замедлению их роста. Высокие концентрации (20$) снхзороткя но усиливав рост последшис, а приводят к появлению балласта в виде сшзороточннх белков в будущем антигене, не виполняк^сс лммуногенной функция. Оптимальной концентрацией сыворотки крови телят в куяътурольпой среде долнла бить IOÍ-иая концентрация. Следует отметить, что в снворотко крови животных, которые бнлл преаде инзазированн M.nulticeps, онкосферн не развивались.

Одновременно с выбором оптимальных сред культивирования личинок M.nulticepo изучали влияние концентрации антибиотиков на развитие онкосфер. На основании подученных результатов, нами установлено, что уменьшение в среде культивирования содержания антибиотиков (пенициллина и стрептомицина) ведет к появле-шш колонии банальной микрофлоры, а увеличение их содержания йы-зывает угнетение развивающихся личинок. Оптимальная концентрация антибиотиков для культуры онкосфэр М. multicepo составляет для певищшппгз и стрептомицина - 100 ЕД/мл и 100 ккг/мл среди, гопташвдша - 40 мкг/мл.

Анализ известной литературы по культивированию онкосфер цестод и предварительные эксперименты позволили отобрать наиболее приешшмыо условия и разработать собственную методику куль-тявирования онкосфор M.nulticepa. Она отличалась от методики . Eickard M.D. и Bell K.J. (1971) составом среды, длительностью культивирования, количеством культивируемых онкосфер в единице объема среды. В результате опытов по культивировании онкосфер М. nsulticeps нами били получены экскроторно-секреториые продукты - предполагаемый антиген, который впоследствии использовался в этом качестве. I шг ОСА был эквивалентен экскретам и секретам 20000 omeoofep М. multieeps. Б ходе -наработки антигена ш ос-вобозкдались от саг,их онкосфер путем центрифугирования среди инкубации при 16000 od/мин в течение 60 минут при тепиературе +4°С и концентрировали его с помощью нолиэтлленгликоля u.M. 6000.

2.2,5. Характеристика и контроль онкосферального секреторного антигена М.ки11;1сэрз

2.2.5.1. Электрофоретический анализ онкосферального секреторного антигена М. иш1Ь1серв

Анализ ОСА, кулътуральной среды и компонента среды - сыворотки крови телят позволял заключить, что по количеству белковых компонентов, выявленных методом дискэлектрофоре за в полиакриламвдном геле, они отличаются. Первая фракция СХЧ, дающая характерную ок раску на белок и достаточно интенсивно окрашенная, имела низкую и.м. около 14,4 кД. Эта фракция отсутствовала как в кулътуральной среде, так и сыворотке крови телят. В ОСА при подобранных ваш оптимальных режимах электрофореза обнаружено 7 белковых фракций с м.ы. около 14,4, 18,0, 25,0, 30,0, 40,0, 43,0, 94,0 кД, в культуральной среде - 6, в сыворотке крови телят - множество. Посколыг" ОСА готовили на основе питательной среды 199, обогащенной 10$ сыворотки крови телят, на электрофореграммах проявлялись балки, общие как для антигена, так и для контролей. Это же отмечали 'Чокагй М.». в КаМ^аг Л'.С. (1976), питавшиеся очистить "культуральннй" антиген Т.р1з1гогт1в. Кроме белков сыворотки они обнаружили две слабоокррпенные полосы, отсутствующие в сыворотке крови кроликов, о величинах этих белков не сообщалось.

Использованное наш окрашивание дискэлектрофореграмм с разогнанными образцами ОСА на полисахарида йодной кислотой-надн дало отрицательные результаты. .

2.2.5.2. Анализ иммунных сывороток и онкосферального секреторного антигена М.вхШ;! -ерв в реакции двойной иммунодаффуэш

Реакция двойкой шмунодиффузии использовалась наш для выявления специфических прецилитияов в сыворотках крови зараженных ценурозом и в.муш1зированных ОСА животных, а также дая антигенного анализа экскретов и секретов.

Результаты исследований показали, что в варианте "тройка* между ОСА и иммунными сывороткаш двукратно и однократно иммунизированных животных формирсЕ£. лсь две идентичные полосы прецши-твцта, свидотельствулдие о присутствии в ОСА, по крайней море,

двух компонентов, на которые синтезируются антитела у животных. Для идентг*икации выявленных полос преципитации в сыворотках иммунизированных животных воспользовались вариантом "пятерка". В качества антигенов наряду с ОСА использовали культуральнуп среду, сыворотку крови телят и ценурусную жадность, а в качестве антисыворотки активную иммунную сыворотку. Мезду антисызороткой и ОСА, антисывороткой и сывороткой крови телят было выявлено 4 полосы преципитации, две из которых давали реакцию идентичности. Две из четырех полос преципитации, образованных между ОСА и антисывороткой, были идентичны аналогичным, выявленным между куль-туральной средой и той же антисывороткой. В то же время только одна из них была идентична линии преципитации, образованной между антнсывороткой и сывороткой крови телят. Полосы преципитации меаду антнсывороткой и антигеном ценурусной жидкости отсутствовали.

Чтобы подтвердить присутствие специфических компонентов в пашем антигене использовали метод адсорбции гетерологичных антител с последующим контролем полноты истощения реакцией двойной имыунодиффузки. Лдя этого провели истощение преципитирущих иммунных антисквороток животных, полученных на ОСА, культуральной средой. Истощенные таким образом антисыворотки исследовали в реакции имцунода|фузии с гомологичным (ОСА) и гетерологнчным (культуральная среда) антигенами. Отсутствие полос преципитации мезду истощаемой сывороткой и гетерологнчным антигеном свидетельствовало о полнота истощения. В результате исследования балл подучены полосы нрецшгатацип только в гомологичных .системах. Мэзду ОСА я аптисыворогкой формировались две четко выраженные полосы прэщшитацш. Такуа ке картдпу наблюдали при анализе сывороток херова яивотпнх, шалупизироваших однократно. Однако, следует от-гепть, ^то две полоса арецнпятацги, образованные меяду сшзорот-жоН овоц п гомологичтом антигеном, бняи дафйгавиия л не очень погяо г-чракегашчти. Это свздегольствовало о тем, что гее компоненты ОСА, учасгвуюг^га з.сшггезо антител, вступали в действие после первой пзлупЕзацаи, повторная лшь усиливала антителогенез, но габор шлэтешга: компонентов оставался преянкя.

Аналлз ОСА х: антигена цонурускол .тццкостя. с сыворотками экспериментально зараженных ценурозом гнвотних но дал пологатоль-

шее результатов. Эти данные в определенной степени согласуются с сообщением Р.Г. Яраева (1972), который с целью выявления функциональных антигенов в экстратах имаго M.EuXtioeps с сколекссв С.corebralia гакхе использовал реакцию шлунодиффузии с сыворотками экспериментально зараиеиных ценурозом аивотных, но вынужден был от нае отказаться, т.к. даяе при 4-5-кратных концентрациях испытуемых сывороток реакция была слабо положительной.

2.2.5.3. Иглцтпоалектрофоретическпй апализ • онкосфералиого секреторного антигена M.:-dltloepa

Иымуноэлекгрсфоретический анализ ОСА с использованием сывороток от иммунизированных животных показал наличие 3 дуг преципитации, расположенных на анодном конце электрофорегракш. Дута преципитации выявлены также при взаимодействии исследуемых анте-сывороток с контроляма - кульгуральной средой ы сывороткой крови телят, "озможно, это обусловлено стимулированием слабого иьмуы-пого ответа и естественно низшим уровней специфических антител в сиЕороткс крови иммунизированных ЕШ30Т1ШХ.

"'акиы образом, тгмунознмический анализ показал наличие в ОСА. белкового компонента с ы.м. 14,4 кД, отсутствующего-в кокт-ролях - среде культивирования и сыворотке крови телят. Методом двойной юмунодиффузии доказана возможность формирования специфического ответа организма хозяина на введение ОСА.

2.2.5.4. Контроль антигена на стерильность, безвредность, содержание белка и активность

Казэдую приготовленную серию антигена проверяли на отсутствие шханических примесей, стерильно ль, безвредность, содержание белка п активность.

Проверка на старильносда?. Посевы ОСА в целях бактериологического контроля на МПБ и MIA в течение 10-и дней и на глюкозный бульон Сабуро с целью проверки та загрязненность грибаш в тече-еиз 14 дней оставались стерильными.

Проверка на безвредность. Бее етвотше (ыышя) оставались клинически здэровыш в точение 10-е дне! и ка мосте внутри бр»-ежнного введения антигена в 'озе 0,5 ыл по было воспалительных явлений.

Содержание белка в концентрированном антигене составило 23,1 1,ь т/т, в лсконцентрированном - 5,75 ± 0,46 иг/т.

Антигенную активность определяли реакцией пепрямой гемаг-глюткнацш. В опыте использовали 20 ягнят 7-™ месячного возраста породы финский лалдрас, которых разделили на 4 группы по 5 голов в каздой: ягнятам 1-й группы вводили внутримышечно I мл антигена с X мл полного адьюваита Фрейнда (ПАФ) двукратно с интервалом 21 день; 2-й группы - I ш антигена без ПАФ двукратно, 3-Я группы - Г мл антигена с I ил ПАФ одно1фатио; 4-я группа слукшш контролен. Кровь для исследования брали до иммунизации л на 3, 7, 10, 15, 20, 45. 60, 75, 90 и 120-е сутки после повторного введения - у ягнят 1-2 я 2-й групп и после однократного - у ягнят 3-й группа.

Исходпне показатели титров антител, вырагепные в логариф-ках, составили в 1-й группо - 0,6, в остальных трех группах ~ - 0,4-

Таблица й Д.

Динамика специфических-антител.в РИГА

Дни после- ! довапиА . I

Г т> 7 п п а

П

!

17

0 0,6 2 0,24, 0,4 ± 0,24 0,4 ± 0,40 0,4 ± 0,24

3 1,8 ± 0,58 1,4 ± 0,5 0,4 ± 0,40 0,2 ± 0,20

7 2,6 ± 1,12 1,2 ± 0,2 2,0 ± 0,63 0,4 ±0,24

10 2,4 ± 0,40® 3,0 ± 1,30 7,2 ± 0,37й 0,2 ± 0,20

15 5,6 ± I,57® 4,2 ± 1,02я 6,8 ± 1,02^ 1,4 ± 0,24

20 5,4-± 0,93* 3,6 ± 0,813 3,4 ± 0,87 1,0 ± 0,32

45 8,0 ± 0,95ж 3,2 ± 0,66 3,0 ± 1,30 1,2 ± 0,49

60 3,8 ± 1,П5 1,8.± 0,86 2,2 ± 1,07 0,6 ± 0,24

75 5,4 ± 0,93я 1,8 ± 0,80 2,4 ± 0,98 0,6 ± 0,24

90 1,8 ± 1,32 1,8 ± 0,80 1,8 ± 0,58 0,6 ± 0,24

120 6,0 ± 1,14я 2,8 ± 0,92 2,0 ± 1,05 1,6 ± 0,40

Примечание: я - Р> 0,95 относительно контроля.

- ib -

Концентрация специфячеоких аптигел в крови иймунпзаровам-нвх ягнят была значительно вше, чем у глаотшх контрольной груп-ни. Наибольшие показатель* логарифмов титров специфических антител отметили в 1-ой группе животных. Титры антител до 10-го дня в крови гивотннх нарастали плавно, но, в основном, антитела к ОСА появлялись на 15-20-й день (5, 6-5,4 logg), достигая глксц-иума па 45 сутки после повторной иммунизации (8,0 logg в среднем по группе). На 60-й день, судя по показателя:,! log 2 титров антител (3,8), происходило снижение их уровня в циркуляции, который, однако, вновь повглаяся на 75 су tick до 5,4 logg. Начиная с 90-х суток, отиетвлл сшпшиис татра гуморальных антител овец этой группы по сравнении с предвдущпм сроком в 3 раза (I.Diogg). Новый подъем уровня специфических антител в крови гпвотных каб-ладалп на 120 сутки (6,0 logg).

В крови животных второй. группы концентрация специфических антител была нио, чем в первой, но она постепенно нарастала и долго деркалась на одном уровне. Иммунный ответ на повторное введение антигена проявлялся в увеличении сроков выработки антител, хотя без действия адыавакга этот процесс происходил не так выра«;енно.

В крови ягнят третьей группы, Ешуппзированшл: однократно антигеном с адьеванги,,, регистрировала резкое, но кратковременное повышение титров специфических антител. Поскольку ягнята этой группы па получили повторной антигенноЗ стшуляцпи, тигр антител у них значительно снижался. К 90-i.sy дни эксперимента у животных всех опытных групп'регистрировали тенденцию к снижения титров антител, выявляемых в РНГА. Однако на 120-Й день исследований наблюдали второй подъеи уровня антител у ваюпширо-вашшх ягнят. По сравнению с группой контроля концентрация специфических антител в 1-ой группе была еынз в 3,В раза, во 2-ой - в 1,8 раза, в 3-еЯ - в 1,3 раза.

Сравнивая результаты, получешшэ нами в РНГА после ыдлу-¡изации ОСА н дашше, полученные Р.Г. Яраевнм (1972) при акспе-ргшнтальном заражении ягляг ценурозом, ш обнарукшш много общего а данамгпе антителогенеза. В настах опытах наиболее близкими по шинному ответу к н7*« оказались животные 1-ой группы.

- :я

Cxe-Ti Kf*.«vB3?P!ci:t япвотяих, разработанные ипмяг в охспери-:'.cirro, лог-гя ti основу произподстпвлпнх нспнтоотй ОСА в условиях

inój'nronojry'nicro по ценурозу хозяйства.

2.2.6. ТГропзволстгешшо исльтгшгя онкос^оргигнюго епкрототяюх'о алгпгет Я. r-ulticena

Оянт по вичунпзацпп ягхтг против ценуроза проводили л колхоза "Барггак" Ногайского -радона Дагестана. Колхоз считается неблагополучна по цспурозУг гибель ягнят от целуроза ежегодно составляет 6-10,1 от логолопья кгпят текущего года роядепгя.

В производственном опкто по проверке лрогектявннх свойств ОСА било использовано 500 яглят 2,5 месячного возраста грозненской породи. В качества дкьпяавта использовали масляный адыэ-ваат Всосотапого паучно-лссл сдовательского япуряого института (Bcepoccn-Amtt лаучпо-исслодоватрльсгай пнетптут защити ктеот-;шх).

' .Табяэда & й.

Результаты прснзгодствошшх испытать опкосфсралтого секреторного ентнгена М. nulticopa в условиях колхоза "Еирлшс" Ногайского района Дагестана

! !Кол-во

Tío-a янтРТР!га (Кратность л интервал дсоа ан.иена 1 БВОдешш антигена

! irnzx

I 100 I I мл (23 иг белка) + . двукратно с интер-мл адьзванта палом 14 дней -

2 100 0, iíí ,5 мл (11,5 мг бел- двукратно с интер-i) + 0,5 ¡.и здьюванта валом 14 дней I

3 50 I I мл (23 мг белка) -t- двукратно с иптер-мл адыованта валом 21 день -

4 250 непммунизнровапныЗ контроль 17

% !Кол-во '' !ливот-

Специальных мероприятий, предусмотренных инструкцией по борьбе с гельминтозагш, но проводили. Овцы заражались на пастбищах. Общая продолжительность наблюдений за животными составила 7,5 мо-

сяцев. В первой и третьей опытной группах ш было зарегистриро- • вано ни одного случая клинического проявления или падежа животных от ценуроза. Во. второй: опытной группе был вынужденно убит один ягненок при подозрении на ценуроз. При патологоанатомичео-ком вскрытии в головном шзге был обнаружен один пузырь размером 2,5 см в диаметре покрытый налетом фибрина.

В контрольной группе (250 ягнят) было зарегистрировало 17 (6,8$) случаев падежа и вынужденного убоя'животных. Патолого-анатомичаское вскрытие подтвердило диагноз "ценуроз". Все обнаруженные ценурусы были жизнеспособными со сформированными развивающимися сколексаш;.

Согласно нашим расчетам экономический эффект при применении вакцины составил 16 руб. на I рубль затрат.

Производственные испытания протективкого действия предложенной нами на основе ОС! вакцинн показали, что она обладает достаточно высоким профилактическим аффектом (99,6$ защиты).

вывода

1. Разработал способ получения активированных онкосфер М. m'lticcpa, повышающий их выход из оболочек до 60?. Предлогов состав искусственного кишечного сока/ содержащий 1% панкреатина, 1% бикарбоната натрия, 0,04$ трипсина, 0,03$ липазы и 20$ свежей жёлчи крупного рогатого скота.

2. Лучшей средой для культивирования in vitro онкосфор U. nulticeps среди испытанных нами оказалась среда, состоящая из питательной среды 199, обогащенной 10-20$ сыворотки крови телят. Оптимальная концентрация антибиотиков для культуры онкосфер Н. nuiticeps составила для пенициллина и стрептомицина .

- 100 ЕД ж 100 шг/ш! среды, соответственно, для гонтамгинна

- 40 мкг/мл.

3. Разработана технология получения онкосфералыюго секреторного антигена на основе культивирования активированных онкосфер M.mlticepa, Контроль антигена показал, что он безвреден, стерилен, I мл содержит ~ 23 ыг белка.

4. Реакцией непрямой геиагглютинацш (РНГА) установлено, что онкосфералышй секреторный антиген обладает достаточной активность». Наиболее силъ>~ай и продопщтольннЕ ЕщушшЕ ответ

регистрировали в ЮТА у ягхшт на двукратное с интервалом 21 день парентеральное введение антигена с полним сдьювантом Фрейнда в соотношении 1:1.

5. Электрофоротичсский анализ показал наличие в составе опкосфералыгсго секроторного антигена специфического белкового компонента с м.м. около 14,4 хД. Реакцией двойной иммунодиффу-зни доказано, что у ятпят па введение антигена вырабатывается специфический гоядунннй ответ. Методом адсорбции гетерологичных аптитол выявлены две четко выранешше полосы преципитации мезду онкосфералышл секреторным антигеном а сыворотками икмунизиро-ванных ливотных.

6. Производственные испытания ошсосферального секреторного аптигэпа М. тиЗД^серп в качестве вакщпш против ценуроза овец показали его высокие протептивпыэ свойства.

СПЕСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Судьипа Т. И. (Скршшикова). Имыуногенная активность вакщпш, полученной на основе культивирования онкосфер ЫиИ;1сера шоШсзрв 1п \ritxo при экспериментальной ценурозе овец // Бюллетень Б11ГИС. - 1930. - Был. 54. - С. 103-104.

2. Судьпна Т.Н. ССкрышшкова). Получешо экскроторпо-сок-реторного антигена для иммунизации ягнят против ценуроза // Бюллетень БИГИС. - 19911 - Был. 55. - С. 100-102.

3. Судьина Т.Н. (Скрынннкова). Перспективы профилактики ценуроза овец // Тезисы докладов научной конференция "Эколого-био-лоппеские п фаупистические аспекты'гольмиптозов", г. Ереван. -Ереван, 1991. - С. 105-107.