Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка клеточной технологии получения антигенов цестод

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата ветеринарных наук, Кленова, Инна Федоровна, Москва

Российская академия сельскохозяйственных наук Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии

имени К. И. Скрябина

На правах рукописи

Клёнова Инна Федоровна

Разработка клеточной технологии получения антигенов цестод (на примере Coenurus cerebralis и Echinococcus

multilocularis).

Специальность 03.00.19 - паразитология,

гельминтология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель-доктор биологических наук В.К. Бережко

Москва - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ............................................... б

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................... 11

1.1. Антигены цестод. Иммунодиагностика, иммунопрофилактика цестодозов.........................11

1.2. Биотехнологические методы получения антигенов цестод................................................24

а) генно-инженерная технология; ................... 24

б) клеточная технология ........................... 29

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .......................... 33

2.1. Материалы и методы............................33

2.1.1. Культивирование клеток протосколексов

С. cerebralis и вторичных ларводист Е. multilocularis в искусственных питательных средах .................... 33

а) приобретение гельминтного материала, подготовка лабораторной посуды, различных материалов, инструментов, растворов для проведения культураль-

ной работы; ...........................................34

б) техника получения первичной клеточной культуры, культивирование клеток в искусственных питательных средах и отбор клеточных метаболитов .............. 35

2.1.2. Экспериментальное заражение собак про-тосколексами С. cerebralis, приготовление онко-сферального секреторного антигена (ОСА); .............. 39

2.1.3. Контроль клеточных метаболитов на стерильность и безвредность, определение содержания

белка в клеточных метаболитах .........................40

2.1.4. Определение специфических антигенов в клеточных метаболитах протосколексов

С. cerebralis: ........................................41

а) иммуноферментной реакцией (ИФР); ............. 41

б) реакцией иммунодиффузии в геле (РИД); ........ 42

в) исследование сывороток экспериментально зараженных С. cerebralis овец ИФР в динамике инвазии ............................ 44

2.1.5. Иммунизация овец клеточными метаболитами («клеточным» антигеном) С. cerebralis и ОСА, получение сывороток в динамике иммунизации ............ 45

2.1.6. Определение активности «клеточного» антигена протосколексов С. cerebralis и ОСА с иммунными сыворотками от овец: ........................ 4 6

а) ИФР; ..........................................4 6

б) РИД ...........................................47

2.1.7. Определение диагностически активных компонентов в «клеточном» антигене протосколексов С. cerebralis ..................................47

2.1.8. Получение клеточных метаболитов вторичных ларвоцист Е. multilocularis и определение специфических антигенов в клеточных метаболитах вторичных ларвоцист Е. multilocularis: .......................... 48

а) ИФР ..........................................4 8

б) РИД ..........................................4 8

2.1.9. Определение диагностически активных компонентов в «клеточном» антигене Е. multilocularis ....... 4 9

2.1.10. Изучение иммунопрофилактических свойств «клеточного» антигена Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе ........... 50

2.1.11. Статистическая обработка полученных результатов ...........................................51

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .......................... 52

3.1. Анализ данных по культивированию клеток протосколексов С. cerebralis и вторичных ларвоцист Е. multilocularis ...........................52

3.2. Результаты экспериментального заражения собак и получение онкосферального секреторного антигена (ОСА) ........................................57

3.3. Характеристика и контроль клеточных метаболитов С. cerebralis и Е. multilocularis .............57

3.4. Иммунохимическая и иммуноферментная характеристика антигенов клеточных метаболитов С. cerebralis ..................................58

3.5. Анализ сывороток овец, иммунизированных «клеточным» антигеном С. cerebralis и ОСА РИД ........67

3.6. Иммуноферментный анализ сывороток овец, иммунизированных «клеточным» антигеном

С. cerebralis и ОСА...................................72

3.7. Диагностическая эффективность «клеточного» антигена С. cerebralis ...........................-.....79

3.8. Характеристика антигенов клеточных метаболитов Е. multilocularis ИФР и РИД .................80

3.9. Диагностическая эффективность «клеточного» антигена Е. multilocularis ........................... 87

3.10. Оценка иммунопрофилактических свойств «клеточного» антигена Е. multilocularis ............... 8 9

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................ 91

Выводы...............................................106

Список использованной литературы ..................... 108

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Современная иммунология при гель-минтозах располагает достаточно большим научным материалом о формировании иммунитета у зараженных гельминтами животных и перспективности использования средств специфической иммунопрофилактики, имеющей важное значение при разработке комплексной программы борьбы с этими заболеваниями (Lightowlers M. W., 1990, 1993 и др.).

Экспериментально доказано, что характер развивающихся иммунологических реакций, как и напряженность иммунитета при тканевых гельминтозах, к числу которых относятся и ларвальные цестодозы, выражены сильнее (Clegg J. А., Smith M. А., 1978; Rickard M. D., Williams J. F., 1982; Косминков H. E., 1986; Бережко В. К., 1994 и др.). Под действием антигенов гельминтов активизируются эффекторные механизмы иммунной системы (Т-клетки, макрофаги, нейтро-филы, тучные клетки, эозинофилы, B-клетки, системы комплемента) , способствующие разрушению патогенных объектов и удалению их из организма хозяина. Аналогичный механизм заложен и в действии противоцестодозных вакцин, основу которых составляют антигены паразитов, полученные различными способами (Wickerhauser, 1976; Smith, 1978; Ayuya, 1979; Lloyd 1979; Osborn, 1982; Косминков, 1986 и др.). Достигнутые успехи в иммунопрофилактике ценуроза (Косминков, Скрынникова, 1993), тенуикольного цистицеркоза (Шу-мова, 1987; Косминков, 1990), эхинококкоза (Richard et al., 1995) и других ларвальных цестодозов свидетельствуют

о необходимости продолжения исследований в этом направлении и, особенно в плане разработки эффективных, недорогостоящих и длительно функционирующих источников получения антигенов цестод. Решение последней проблемы приобретает особое значение, поскольку получение достаточных количеств антигенного материала сопряжено с большими трудностями, а иногда просто невозможно из-за отсутствия необходимых условий для содержания зараженных животных источников паразитов.

В последние годы наметился определенный прогресс в отношении получения иммунодиагностических, иммунопрофилак-тических и лечебных средств в области паразитологии с использованием биотехнологических методов.

Так, на основе генной инженерии стало возможным целенаправленное получение биологически активных веществ путем введения в геном реципиентной клетки участка ДНК, являющегося функциональной единицей, кодирующего синтез необходимого белка.

Одним из перспективных направлений биотехнологии является клеточная инженерия, которая позволяет использовать культивируемые клетки для решения многих научных и прикладных задач биологии, медицины и сельского хозяйства. Клеточные культуры являются важным объектом в изучении механизмов канцерогенеза, дифференцировки клеток и в производстве противовирусных вакцин. Культуры клеток активно используются как продуценты биологически активных веществ, обладающих различными свойствами. Успехи культивирования иммунокомпетентных клеток создали возможность применения культур клеток в паразитологии. Представляется

перспективным получение антигенов-метаболитов, продуцируемых пролиферирующими клетками гельминтов в искусственных питательных средах.

Необходимость применения биотехнологических подходов в получении антигенных препаратов особенно остро ощущается при ларвальных цестодозах. Последнее связано с трудностью, а иногда и невозможностью приобретения достаточного количества гельминтного материала для проведения иммунологических исследований при этих гельминтозах. В то же время использование клеточной технологии позволяет не только значительно сократить расход источника антигена, но и по возможности значительно увеличить срок функциональной активности культуры клеток, продуцирующих антигены паразита.

Исходя из вышеизложенного и, в связи с существующим дефицитом специфических иммунопрофилактических средств при ларвальных цестодозах, считаем целесообразной и актуальной работу по разработке клеточной технологии получения перевиваемой культуры клеток источника антигенов для проведения иммунодиагностических и иммунопрофилактических исследований.

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований было разработка клеточной технологии получения антигенов цес-тод, оценка их антигенной активности, иммунодиагностиче-ской и иммунопрофилактической эффективности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

разработать технологию получения первичной суспензии

жизнеспособных клеток цестод (Coenurus cerebralis, Echinococcus multilocularis);

подобрать оптимальные условия культивирования клеток в искусственных питательных средах для получения перевиваемой культуры клеток, продуцирующих метаболиты — «клеточные» антигены;

провести иммунизацию овец «клеточными» антигенами протосколексов С. cerebralis, получить сыворотки в динамике иммунизации;

исследовать иммунохимические и антигенные свойства «клеточных» антигенов;

— оценить иммунодиагностические и иммунопрофилактиче-ские свойства «клеточных» антигенов.

Научная новизна. Впервые на примере С. cerebralis и Е. multilocularis разработана клеточная технология получения перевиваемой культуры клеток-продуцентов антигено-активных метаболитов, представляющих научно-практический интерес в иммунодиагностике и иммунопрофилактике цестодо-зов. Методами иммунохимического и иммуноферментного анализа в «клеточных» антигенах исследуемых видов цестод выявлены компоненты, идентичные антигенам паразитов.

Впервые проведена сравнительная оценка активности «клеточного» антигена протосколексов ценурусов и онкосфе-рального секреторного антигена М. multiceps в иммунофер-ментной реакции с сыворотками овец, иммунизированных этими препаратами.

Впервые проведена оценка диагностической эффективности «клеточных» антигенов С. cerebralis и Е. multilocu-

laris в ИФР. На основе «клеточных» антигенов вторичных ларвоцист альвеолярного эхинококка изготовлены иммунопре-параты, показавшие в условиях эксперимента на мышах высокий профилактический эффект.

Практическая ценность работы. На основе материалов проведенной работы разработана «Методика получения перевиваемой клеточной культуры цестод», утвержденная на заседании секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН.

Получено свидетельство о рационализаторском предложении на «Способ получения антигенов цестод на основе клеточной технологии».

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены:

1. На заседании секции «Инвазионные болезни животных (Москва, февраль, 1999 г.)

2. На заседаниях Ученого совета ВИГИС (Москва, 19961998 гг.).

3. На конференции ВОГ (Москва, 1997 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения перевиваемой культуры клеток цестод С. cerebralis и Е. multilocularis, продуцирующих метаболиты — «клеточные» антигены.

2. Иммунохимические свойства и антигенная активность клеточных метаболитов С. cerebralis и Е. multilocularis.

3. Выявление диагностически активных компонентов С.

cerebralis и E. multilocularis в «клеточных» антигенах.

4. Иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов Е. multilocularis.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы, приложения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Антигены цестод. Иммунодиагностика, иммунопрофилактика

цестодозов.

Проблема профилактики и ликвидации гельминтозов сельскохозяйственных животных продолжает оставаться актуальной, несмотря на многочисленные разработки способов и методов борьбы с ними. Особую сложность представляют собой тканевые формы гельминтозов, как ларвальные цестодозы, паразитологическая диагностика которых не представляется возможной, а недостаток, а иногда отсутствие эффективных антигельминтных препаратов при этих гельминтозах выдвигает в качестве первоочередной задачи — изыскание и разработку иммунопрофилактических средств.

Иммунопрофилактика, которая достигается иммунизацией животных специфическими антигенными препаратами гельминтов и сопровождается формированием защитной реакции к последующему заражению, является одним из перспективных направлений борьбы с этими гельминтозами.

Анализ научной литературы показал различные подходы к получению антигенов гельминтов, используемых как в иммунодиагностике, так и в иммунопрофилактике гельминтозов. В целом эти подходы включают использование в качестве антигенов ослабленных облучением гельминтов; соматические экстракты из них; метаболические или экскреторно-секреторные антигены, вырабатываемые культурами гельминтов in vitro.

По своей природе антигены гельминтов можно классифицировать как функциональные, основу которых составляют в основном экскреты и секреты гельминтов и соматические, содержащиеся в тканях тела и высвобождающиеся при нарушении целостности цист, их гибели и распаде в теле хозяина.

В настоящее время накопилось достаточное количество экспериментальных данных по иммунохимической характеристике и диагностической эффективности тех и других. Однако диагностические качества соматических антигенов половозрелых гельминтов не удовлетворяли исследователей ввиду слабой специфичности. Это в первую очередь обусловлено многокомпонентностью антигенов паразитов и антигенной изменчивостью последних в период роста личинки до взрослой особи, наличием антигенов с иммуносупрессивными свойствами и общими с хозяином, приобретенными паразитами в процессе эволюции в целях уклонения от иммунного ответа хо-

зяина (Mitchell G., 1989). Применение таких антигенов в большинстве случаев не позволяло дать точный ответ на вопрос, каким гельминтом или гельминтами заражены животные. Их различная активность, а также нежелательные перекрестные реакции с сыворотками животных, зараженных гетероло-гичными видами, значительно затрудняли и делали фактически невозможной дифференциацию гельминтозов.

В совершенствовании методов изучения антигенов, установлении филогенетических связей между различными видами гельминтов большую роль сыграло применение таких методов, как иммунодиффузия в гель, иммуноэлектрофорез, адсорбция гетерологичных антител и других. Эти методы позволили показать, например, что антиген, дающий 5-ую дугу преципитации и исключительно пригодный для диагностики эхинокок-коза человека, выявлен также в жидкости личиночного пузыря Taenia hydatigena (Varela-Diaz V. М. , Coltorti Е. А., Rickard М. D. , Torrkc J. М., 1977), а антитела к этому антигену имеются в сыворотке овец, инвазированных личиночными стадиями Т. ovis, Т. hydatigena и в сыворотке овец, зараженных Е. granulosus (Jong W. К., Heath D. D., 1979) .

Из 18-19 антигенов эхинококковой жидкости и 23 экстракта альвеококковых узлов видоспецифическими для эхинококка и альвеококка оказались соответственно 8 и б антигенных компонентов, из которых только два в каждом из этих гельминтов способны выявлять антитела у зараженных людей и животных (Разаков, 1975, 1976).

Из 13 выявленных антигенов половозрелых Multiceps mul-ticeps один определен как видоспецифический (Яраев,

1971) . На основе метода адсорбции гетерологичных антител автор сделал вывод, что ряд антигенов жидкости пузыря Со-enurus cerebralis сохраняется у половозрелых паразитов и участвует в иммуногенезе у собак при мультицептозе. О значительном антигенном родстве Т. hydatigena и Т. ovis свидетельствуют данные Craig, Rickard (1982), которые показали, что экскреторно-секреторные антигены цистицерков этих гельминтов оказались менее реактивными, чем таковые взрослых цестод или их онкосфер и со всеми этими антигенами наблюдалась яркая перекрестная реакция с сыворотками ягнят с моноинвазиями. Авторы заключили, что онкосферы этих цестод имеют общие антигенные детерминанты с другими стадиями жизненного цикла этих паразитов, но вместе с тем они содержат уникальные стадиоспецифические детерминанты, свойственные только антигенам онкосфер. Перекрестные реакции между антигенами протосколексов Т. hydatigena и Т. pisiformis гетерологичными сыворотками собак, зараженных Taenia spp., наблюдали Jenkins, Rickard (1985), ложнопо-ложительные ответы регистрировали Varma et al (1986) в НРГА с сыворотками зараженных эхинококками людей при использовании антигенов личинок и целых цестод (С. cellulosae, Т. solium, Т. hydatigena). Качественный анализ антигенов Т. hydatigena, Т. pisiformis и Е. granulosus методами электрофореза в лолиакриламидном геле и иммунобло-тинга с сыворотками с