Физико-химическая характеристика клеточных антигенов эхинококков и разработка иммунопрофилактического средства

Сасикова, Марина Руслановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химическая характеристика клеточных антигенов эхинококков и разработка иммунопрофилактического средства
ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Физико-химическая характеристика клеточных антигенов эхинококков и разработка иммунопрофилактического средства"

□03484461

На правах рукописи

Сасикова

Марина Руслановна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ ЭХИНОКОККА И РАЗРАБОТКА ИММУНОПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА

Специальность 03.00.19-паразитология

2 6 НОЯ 2009

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003484461

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина» РАСХН

Научный руководитель

доктор биологических наук, Бережко Вера Кузьминична

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бенедиктов Игорь Иванович

доктор биологических наук Жданова Ольга Борисовна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Курский государственный университет»

Д 006.011.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина» (ВИГИС). Адрес: 117218, Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС Автореферат размещен на официальном сайте ГНУ ВИГИС Россельхозакадемии http://www.gnuvigis.nxt.ru

Автореферат разослан" я?." .2009 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций,

♦3009 г. в

.часов на

доктор биологических наук

В.К. Бережко

Введение

Актуальность темы. Эхинококкоз — это один из самых значимых и широко распространенных паразитозов в мире, представляющий серьезную проблему не только для ветеринарии, но и для медицины (Garippa G et al., 2004).

Особенно остро эта инвазия проявляется в регионах с развитым овцеводством и скотоводством как из-за наносимого экономического ущерба животноводству, так и большего риска заболевания человека, являющегося одним из промежуточных хозяев гельминта (Kammerer WS, Schantz РМ., 1993; Mandell GL et al., 2000).

Проблема профилактики и ликвидации гельминтозов сельскохозяйственных животных продолжает оставаться актуальной, несмотря на многочисленные разработки способов и методов борьбы с ними. Особую сложность представляют собой тканевые формы гельминтозов, как ларвальные цестодозы, паразитологическая диагностика которых не представляется возможной, а недостаток, а иногда отсутствие эффективных антигельминтных препаратов при этих гельминтозах выдвигает в качестве первоочередной задачи — изыскание и разработку иммунопрофилактических средств на основе специфических антигенов паразита и неспецифических иммуностимулирующих препаратов. Применение иммунопрофилактических средств позволяет значительно повысить сопротивляемость организма, снизить, а в некоторых случаях и предотвратить заражение животных.

Необходимым условием создания иммунопрофилактических средств против ларвального и имагинального эхинококкозов является получение активных, стандартизированных, видоспецифичных антигенов паразитов.

В последние годы в паразитологии успешно применяются биотехнологические методы получения антигеноактивных препаратов, к числу которых относится и клеточная инженерия, позволяющая использовать для этой цели культуры клеток из различных антигеноактивных субстанций паразитов. Для получения специфических антигенов цестод методом

клеточной инженерии можно использовать как протосколексы, так и яйца паразитов, содержащие инвазионные онкосферы. Однако в целях безопасности и обеспечения необходимой стерильности наиболее предпочтительным является использование протосколексов или герминативной оболочки.

В свете вышеизложенного считаем целесообразными и актуальными исследования по получению клеточных антигенов эхинококков, их физико-химической характеристики и разработки на их основе иммунопрофилактического препарата при эхинококкозе.

Цели и задачи исследования Основной целью наших исследований было получить «клеточные» антигены и 3-дневные экскреторно-секреторные продукты протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus, провести их физико-химическую характеристику и разработать на основе клеточных антигенов Е. multilocularis и иммуностимулирующих средств иммунопрофилактический препарат при эхинококкозе.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить «клеточные» метаболиты и 3-дневные экскреторно-секреторные продукты протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus

2) Провести отбор антигеноактивных серий «клеточных» антигенов протосколексов эхинококков иммуноферментной реакцией (ИФР)

3) Установить реакцией иммунодифузии (РИД) в агаровом геле наличие антигенов паразита в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах культивируемых in vitro протосколексов эхинококков

4) Провести физико-химическую характеристику клеточных антигенов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов эхинококков электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ)

5) Изучить иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе с:

а) иммуномодудятором Гапа-Вет

6) иммуномодулятором ронколейкином

в) с противоопухолевым препаратом «К»

б) Оценить лечебное действие клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе с:

а) иммуномодулятором ронколейкином

б) противоопухолевым препаратом «К»

7) Изучить протективные свойства клеточных антигенов Е. multilocularis при эхинококкозе собак в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином.

Научная новизна

Впервые проведена сравнительная физико-химическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Б. granulosus и Е. multilocularis и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов культивирования протосколексов методом электрофореза в ПААГ. Установлено в белковом спектре исследуемых антигенов протосколексов Е. granulosus соответственно 18 и 9,а Е. multilocularis 16 и 8 компонентов. Наиболее четко выраженные мажорные белковые компоненты в исследуемых антигенах протосколексов обоих видов эхинококков располагались в области подвижности белков мол. массы 200; 116; 66; 45; 31 и 14,4 кДа. Антигенные компоненты исследуемых биоматериалов выявляли антитела класса IgG в сыворотках больных цистной и альвеолярной формой эхинококкоза, что подтверждает значительную идентичность входящих в их состав белков-антигенов и возможность их взаимозаменяемости. Впервые изучены протективные свойства иммунопрофилактических препаратов на основе «клеточных» антигенов протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодуляторами Гала-Вет, ронколейкином и противоопухолевым препаратом «К» при экспериментальном альвеолярном эхннококкозе. Эффективность защиты составила соответственно: 91,7%; 83,3%; 100%. Установлено, что 2-кратная внутримышечная иммунизация собак клеточным антигеном протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином значительно повышает резистентность животных к заражению протосколексами Е. granulosus (количество развившихся паразитов в 6,03 раз ниже, чем в контроле, все выделенные гельминты от иммунизированных собак были без сформированного терминального членика). Эффективность защиты составила 94,5 %.

Установлено, что клеточные антигены в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином и противоопухолевым препаратом «К» не оказывают лечебного действия при альвеолярном эхннококкозе.

Практическая значимость

Материалы диссертационной работы Сасиковой М. Р. использованы в разработке «Технологического регламента на комплексный иммунопрепарат для профилактики альвеолярного гидатидоза», одобренного секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.09.2007г.).

Подана заявка на изобретение «Способ профилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза)».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

1)~научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (2006-2009гт.)

2) заседаниях Ученого совета ВИГИС (2006-2008гг.)

3) секции «Инвазионные болезни животных отделения ветеринарной медицины РАСХН (2007г.)

Личный вклад соискателя

Представленная диссертационная работа является результатом экспериментальных исследований автора по изучению физико-химических и иммунопрофилактических свойств клеточных антигенов и экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus. Все исследования проведены автором самостоятельно под руководством д.б.н. Бережко В. К., которая оказывала научно-методическую помощь в проведении экспериментов и анализе полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

• Получение клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus, отбор антигеноактивных серий ИФР, иммунохимический анализ полученных биоматериалов

• Физико-химическая характеристика клеточных антигенов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. granulosus и Е. multilocularis методом электрофореза в ПААГ

• Иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе:

а) с ронколейкином

б) с Гала-Вет

в) с биопрепаратом «К»

• Изучение лечебного действия клеточных антигенов с ронколейкином и противоопухолевым биопрепаратом «К» при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе.

• Протективные свойства клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном эхинококкозе (Е. granulosus) собак в комплексе с ронколейкином.

Публикации

По теме диссертации опубликовано б работ, 3 из которых в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Объем и структура диссертации

материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы включает 180 источников, в том числе 50 отечественных и 130 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 39 рисунками.

1. Обзор литературы

Представлен анализ литературы по способам получения и характеристики антигенов эхинококков, обзор исследований по иммунопрофилактике ларвальных цестодозов, перспективности вакцинопрофилактики при гельминтозах.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Получение вторичных ларвоцист Echinococcus multilocularis, цист Е. granulosus, приготовление первичной клеточной культуры, клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus.

Вторичные ларвоцисты Е. multilocularis получали от животных-доноров спустя 4 месяца после их заражения инвазивным материалом паразита в дозе 750±50 протосколексов и ацефаггоцист на животное. Цисты Е. granulosus с жизнеспособными протосколексами приобретали от естественно инвазировапных овец. Работу по выделению протосколексов, определению их жизнеспособности и приготовлению первичной клеточной культуры проводили в стерильном боксе в ламинаре с вытяжкой по методу Бережко, Кленовой (1999), Далаевой, Бережко (2005).

Отмытые и приготовленные для дальнейшей работы протосколексы Е. multilocularis и Е. granulosus распределяли на 2 порции, одну из которых использовали для приготовления клеточной культуры, а другую - для получения 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов.

В качестве ростовой среды для культивирования клеток использовали искусственную питательную среду постоянного состава - RPMI-1640 с добавлением 2 мл глутамина и 8 мг гентамицина (4%) на 100 мл среды и 5% эмбриональной сыворотки плода крупного рогатого скота.

Клеточную культуру помещали в С02-инкубатор с заданными параметрами температуры (37° С) и поступления газов (С02-5%) при 70%-й влажности для культивирования.

Отбор клеточных метаболитов производили на 7 - 10 день культивирования в период формирования монослоя с помощью автоматической пипетки с заменой наконечника после каждой манипуляции с целью сохранения стерильности культуры.

Для получения экскреторно-секреторных продуктов протосколексов эхинококков использовали ту же среду, что и для культивирования клеток с добавлением противогрибкового препарата (амфотерицип В). Жизнеспособность протосколексов поддерживали в СО2 инкубаторе при тех же параметрах, что и для культивирования клеток.

Экскреторно-секреторные продукты протосколексов отбирали на 3-й день культивирования также автоматической гашеткой, соблюдая правила работы с культурами клеток с целью сохранения стерильности. Полученный антигенный материал хранили при -20°С до использования в работе.

2.1.2. Отбор антигеноактивных серий «клеточных» метаболитов протосколексов эхинококков иммуноферментной реакцией, определение наличия антигенов паразита в антигеиоактивных сериях клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах культивируемых in vitro протосколексов эхинококков РИД

Наличие специфических антигенных компонентов в метаболитах клеточных культур протосколексов Е. multilocularis устанавливали ИФР типа ELISA (Voller А. et al., 1974) с некоторыми модификациями, применительно к нашим условиям и РИД. ИФР осуществляли в микроварианте в полистироловых планшетах для иммунодиагностических исследований одноразового использования отечественного производства. Положительным контролем в реакции служили сыворотки убойных свиней с подтвержденным диагнозом естественной инвазии E.granulosus и сыворотки людей, зараженных E.granulosus и E.multilocularis (диагноз подтвержден хирургически), а отрицательным - сыворотки свиней, у которых при вскрытии гельминтной инвазии не обнаружили, и сыворотки здоровых людей - доноров.

Учет реакции проводили на автоматическом анализаторе колориметрическом иммуноферментном 340/АТС фирмы SLT-labsistems (Австрия) при длине волны 492 нм. Пробу считали положительной, если ее оптическая плотность (ОП) превосходила значение ОП отрицательного контроля в два и более раза.

Серии метаболитов клеточных культур, показавших в ИФР достаточную антигенную активность, проверяли в дальнейшем на наличие специфических антигенов эхинококков РИД в агаровом геле. РИД ставили по методике Гусева и Дветкова (i960) с некоторыми модификациями применительно к нашим условиям. В реакции использовали контрольные сыворотки, что и в ИФР. Для анализа антигенного спектра исследуемых объектов применили:

а) гипериммунную кроличью сыворотку к антигенам соматического экстракта протосколексов Е. multilocularis

б) гипериммунную кроличью сыворотку к антигенам соматического экстракта протосколексов Е. granulosus

в) сыворотки пациентов с хирургически подтвержденным диагнозом альвеолярного и цистного эхинококкоза, приобретенные из 24-й клинической больницы г. Москвы.

г) сыворотки естественно инвазированных E.granulosus свиней (диагноз подтвержден при вскрытии)

2.1.3. Физико-химическая характеристика клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Б. granulosus электрофорезом в полиакриламидном геле

Исследование клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно — секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus мы

провели денатурирующим электрофорезом в вертикальной камере («Хеликон», Россия) в пластинах полиакриламидного геля (ПААГ) 10x8 см, источник питания ПЭФА-1. Нижний разделяющий гель - 5x8 см. Градиент разделяющего геля 15%-8% полиакриламида

(акриламид/метиленбисакриламид в соотношении 29:1). Концентрирующий гель - 5% полиакриламид (акриламид/метиленбисакриламид в соотношении 29:1).

1. Буфер разделяющего геля: 0,375 М Трис-HCl pH 8,8; 0,1 % SDS

2. Буфер разделяющего геля: 0,125 М Трис-HCl pH 6,8; 0,1 % SDS

3. Электродный буфер: 25тМ Трис-ОН; 250 шМ глицина; 0,1% SDS.

Электрофорез проводили при силе тока 25 гпА на один гель, разделение

до выхода красителя (бромфенолового синего) из геля.

В качестве маркеров для определения молекулярной массы белковых компонентов в составе исследуемых биоматериалов использовали: апротинин (6500 Да); лизоцим (14400 Да); ингибитор трипсина (21500 Да); углекислая ангидраза (31000 Да); овальбумин (45000 Да); бычий сывороточный альбумин (66000 Да); фосфорилаза (97(4)000 Да); ß-галактозидаза (116000 Да); миозин (200000 Да).

Окрашивание и фиксацию электрофореграмм проводили в 1,0% растворе амидочерного 10 Б на 7 % -ной уксусной кислоте в течение 15-20 мин., отмывку 7 % - ной уксусной кислотой.

2.1.4. Иммунопрофнлактичсскне свойства клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis в комплексе:

а) с нммуиомодулятором Гала-Вет

б) с нммуиомодулятором роиколейкином

в) с противоопухолевым препаратом «К»

а) с иммуномодулятором Гала - Вет

Непосредственно перед проведением экспериментов на лабораторных животных-моделях определяли необходимое количество иммунизирующей дозы «клеточных» антигенов (КлАГ) Е. multilocularis (по белку) в объемном выражении и смешивали с рассчитанной согласно инструкции дозой иммуномодулятора Гала - Вет. Приготовленные партии иммунопрепаратов, представляющих собой смесь «клеточных» антигенов протосколексов из вторичных ларвоцист Е. multilocularis и Гала — Вет, использовали в эксперименте по изучению их протективных свойств при вторичном альвеолярном эхинококкозе на мышах. Разовая иммунизирующая доза иммунопрепарата составляла 0,2 мл (60 мгк белка) «клеточного» антигена и 22 мкг Гала-Вет (в 0,2 мл стерильного физраствора).

Опыт по оценке протективных свойств КлАГ и иммуномодулятора Гала-Вет провели на 48 белых беспородных мышах, массой 16-18 г, распределенных на 4 равноценные группы по 12 мышей в каждой. Экспериментальных животных иммунизировали подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней. Первая группа мышей получала Гала - Вет в дозе 22 мкг в 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Мыши 2-ой группы были иммунизированы КлАГ протосколексов Е. multilocularis в дозе 60 мкг белка в

комплексе с иммуномодулятором Гала - Вет (22 мкг/мышь) в 0,2 мл того же раствора, а 3-й группы - только КлАГ в той же дозе. Мышам 4-й контрольной группы в сроки иммунизации вводили по 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Проверочное заражение мышей проводили спустя 20 дней после цикла иммунизации протосколексами и ацефалоцистами E.multilocularis в дозе 750±50 экз., убой и вскрытие - на 90-й день инвазии.

б) с иммуномодулятором ронколейкином

Аналогичный эксперимент по оценке иммунопрофилактических свойств КлАГ протосколексов Е. multilocularis провели с использованием в качестве иммуностимулирующего средства иммуномодулятора ронколейкина. Перед началом эксперимента определили необходимое количество КлАГ протосколексов Е. multilocularis в объемном выражении (из расчета 60 мкг белка-антигена/мышь) и смешали с иммуномодулятором ронколейкином из расчета 180 ME/мышь. В конечном итоге каждое иммунизированное животное получало по 0,2 мл приготовленного иммунопрепарата, содержащего 60 мкг белка-антигена и 180 МЕ ронколейкина.

Опыт провели на 48 белых беспородных мышах, массой 18-20 г, распределенных на 4 равноценные группы по 12 животных в каждой группе. Иммунизацию мышей проводили 3-кратно подкожно с интервалом 10 дней.

Первая группа мышей получала ронколейкин в дозе 180 МЕ в 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Мыши 2-ой группы были иммунизированы КлАГ протосколексов Е. multilocularis в дозе 60 мкг белка в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином (180 ME/мышь) в 0,2 мл того же раствора, а 3-й группы - только КлАГ в той же дозе. Мышам 4-й контрольной группы в сроки иммунизации вводили по 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Проверочное заражение, убой и вскрытие проводили в те же сроки (см. выше).

в) с противораковым биопрепаратом «К»

Аналогичный эксперимент по оценке иммунопрофилактических свойств КлАГ протосколексов Е. multilocularis провели с использованием в качестве иммуностимулирующего средства противоопухолевого биопрепарата «К». Расчет необходимого количества КлАГ (по белку) протосколексов Е. multilocularis провели подобно первым двум опытам. Биопрепарат «К» вводили мышам 3-кратно в возрастающих дозах, рекомендованных в экспериментах по иммунопрофилактике раковых заболеваний мышей.

Опыт провели на 48 белых беспородных мышах, массой 16-18 г, распределенных на 4 группы по 12 мышей в каждой. Экспериментальных животных иммунизировали подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней. Первая группа мышей получала биопрепарат «К» (1-е введение - 5 ЕД/мышь, 2-е -15 ЕД, 3-е - 45 ЕД) в 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Мыши 2-ой группы были иммунизированы КлАГ протосколексов Е. multilocularis в дозе 60 мкг белка в комплексе с препаратом «К» (дозы биопрепарата «К»

аналогично, как в 1-й группе мышей) в 0,2 мл того же раствора, а 3-й группы - только КлАГ в той же дозе. Мышам 4-й контрольной группы в сроки иммунизации вводили по 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Проверочное заражение, убой и вскрытие проводили в те же сроки (см. выше).

2.1.5. Оценка лечебного действия клеточных антигенов нротосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе с:

а) иммуномодулятором роиколейкином

б) противоопухолевым биопрепаратом «К»

а) Опыт по оценке иммунотерапевтических свойств иммуномодулятора ронколейкина проводили согласно инструкции (по лечению онкологических заболеваний).

Количество вводимого КлАГ Е. multilocularis экспериментальным мышам по белку, как и в предыдущих опытах, составляло 60 мкг, а иммуномодулятора ронколейкина 200 ME/мышь в 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Таким образом, в эксперименте по изучению лечебных свойств иммунопрепарата из ронколейкина и КлАГ Е. multilocularis при вторичном альвеолярном эхинококкозе на мышах была испытана доза, включающая 60 мгк белка КлАГ и 200 МЕ ронколейкина в 0,2 мл стерильного физ. р-ра.

Опыт по оценке иммунотерапевтических свойств КлАГ и ронколейкина провели на 36 белых беспородных мышах, массой 16-18 г, распределенных на 3 группы по 12 мышей в каждой. Животные были заражены протосколексами и ацефалоцистами в дозе 200±50 экз/животпое 12.03.2007г. Начало лечения 27.03.2007г. Первая группа мышей получала 200 МЕ ронколейкина в 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Мышам 2-ой группы вводили КлАГ нротосколексов Е. multilocularis в дозе 60 мкг белка в комплексе с ронколейкином 200 МЕ в 0,2 мл того же раствора. Мышам 3-й контрольной группы вводили по 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Схема лечения: 5 инъекций подряд, через месяц курс повторяли.

б) Опыт по оценке лечебных свойств противоракового биопрепарата «К» провели на 36 белых беспородных мышах, массой 16-18 г, распределенных на 3 группы по 12 мышей в каждой. Животные были заражены протосколексами и ацефалоцистами в дозе 200±50 экз/животное 12.03.2007г. Начало лечения 27.03.2007г.

Первая группа мышей получала биопрепарат «К» (15 ЕД) в 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Мышам 2-ой группы вводили КлАГ нротосколексов Е. multilocularis в дозе 60 мкг белка в комплексе с биопрепаратом «К» (дозы препарата «К» аналогично, как в 1-й группе мышей) в 0,2 мл того же раствора. Мышам 3-й контрольной группы вводили по 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Схема лечения: 12 инъекций подряд.

2.1.6. Дротектнвные свойства клеточных антигенов Е. multilocularis при эхинококкозе собак в комплексе с иммуномодулятором ронколсйкином.

В эксперименте использовали 12 беспородных щенков в возрасте 5-6 месяцев, предварительно дегельминтизированных суспензией паразицида в дозе 1 мл/кг массы. Через 3 недели после дегельминтизации провели копроскопические исследования щенков, подтвердившие отсутствие у них половозрелых форм кишечных цестод. Собаки были распределены на 4 группы по 3 животных в каждой. Первая группа бьша иммунизирована двукратно с интервалом 20 дней внутримышечно клеточным антигеном протосколексов Е. multilocularis (доза 2 мл -1,7мг и 4 мл-3,4 мг белка-антигена соответственно) в комплексе с иммуномодулятором ронколсйкином (доза 15000 ЕД/гол.). Собаки второй группы были иммунизированы таким же способом только клеточным антигеном (в тех же дозах), а третьей - только ронколейкином (15000 ЕД/гол). Животным четвертой группы в дни иммунизации вводили стерильный физраствор. Через 2 недели после завершающей дозы вводимых препаратов всех экспериментальных собак заразили протосколексами Е. granulosus в дозе 1000±50 экз/животное. Вскрытие и подсчет развившихся гельминтов провели через 30-37 дней после заражения.

2.2. Результаты исследований

В результате культуральной работы было получено 27 серий клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis и 19- Е. granulosus, а также 11 и 7 серий 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus соответственно. Все полученные культуральные продукты обоих видов эхинококков проверили на антигенную активность (ИФР) с использованием положительных и отрицательных контрольных сывороток.

Проверка антигенной активности полученных биоматериалов показала, что не все они имеют в своем составе антигены паразита в достаточной концентрации.

Так, из 27 серий клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis антигены паразита установлены в 19 (70,3%), а из 19 аналогичных продуктов протосколексов Е. granulosus в 14 (73,7%).

Аналогичная проверка в ИФР 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus показала их достаточно высокую антигенную активность. Из 11 серий 3-дневных экскреторно секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis 9 (81,8%) содержали активные антигены паразита, что касается аналогичного материала Е. granulosus, то все 7 (100%) серий были атигеноактивными.

В полученных «клеточных» антигенах из протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus и их 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах определили спектрофотометрически содержание белка, которое составило для клеточных метаболитов Е. granulosus и Е. multilocularis 6200;

4600; для 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов — 6980; 5125 мкг/мл соответственно.

Выделенные ИФР серии антигеноактивных клеточных метаболитов протосколексов из исследуемых вторичных ларвальных эхинококков были проверены РИД на наличие антигенов паразита с указанными выше сыворотками (табл. 1).

Реакция иммунодифузии с гипериммунными сыворотками к антигенам соматического экстракта протосколексов эхинококков в гомологичной системе РИД показала незначительные различия в активности Е. multilocularis и Е. granulosus: в первой регистрировали 6 комплексов антиген-антитело, во второй 6-7 (табл. 1). Таким образом, соматические экстракты протосколексов исследуемых паразитов имеют в своем составе не менее 6-7 антигенных компонентов, стимулирующих антителогенез у иммунизированных ими животных. Анализ антигеноактивных серий клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus, проведенный РИД с этими сыворотками (таб. 1), показал соответственно 3 и 2-3 комплекса антиген-антитело, представленных достаточно четкими линиями преципитации. Причем, как правило, полосы преципитации в количественном и качественном отношении более четко проявлялись в РИД с гипериммунной сывороткой к антигенам соматического экстракта протосколексов цистного эхинококка.

Аналогичные исследования, проведенные РИД с 3-дневными экскреторно-секреторными продуктами протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus с гомологичными и гетерологичными гипериммунными сыворотками, также подтвердили наличие в них специфических антигенов. Полученные антигенные продукты были исследованы РИД на наличие функциональных антигенных компонентов с сыворотками больных пациентов цистной и альвеолярной формой эхинококкоза и с сывороткой естественно инвазированных Е. granulosus свиней (табл. 1). Количество регистрируемых комплексов антигеи-антитело также было не менее 1-2 и зависело от антигенной активности клеточных метаболитов.

Результаты физико-химической характеристики клеточных антигенов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов эхинококков электрофорезом в ПААГ

В белковом спектре 3-диевных метаболитов культивируемых протосколексов Е. granulosus и Е. multilocularis регистрировали соответственно 18 и 16 компонентов, отличающихся по электрофоретической подвижности, степени окрашивания и молекулярной массе.

В 3-дневных экскретах и секретах протосколексов Е. granulosus проявилось 18 компонентов, располагающихся в диапазоне белков мол. массы от 14,4 до 200,0 кДа. Наиболее четко выраженные 5 мажорных компонентов располагались в области подвижности белков, имеющих мол. массу 200,0 кДа — 1; 116,0 кДа - 1; 2 из них - 66,0 кДа и один между белками мол. массы 45,0 и 66,0 кДа.

Таблица 1

Иммунохимический анализ 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов и «клеточных» антигенов (метаболитов)

протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus

№ п/п Сыворотки Число комплексов антиген- антитело в реакции иммунодифузии

3-дневные экскреторно-секреторные продукты протосколексов Е. multilocularis 3-дневные экскреторно-секреторные продукты протосколексов Е. granulosus Экстракт протосколексов Е. multilocularis Антигеноактивные серии клеточных метаболитов Серии клеточных метаболитов средней активности Серии клеточных метаболитов слабой антигенной активности

1 Кроличья гнпериммунная к антигенам соматического экстракта E.multilocularis 3-4 2-3 5 3 1 -

2 Кроличья гипериммунная к антигенам соматического экстракта Е. granulosus 3 4 6 2-3 1 -

3 Альвеолярный эхинококкоз (человек) 1 -2 1 1-2 2 1 -

4 Цистный эхинококкоз (гидатидоз) человек 1 2 1-2 1-2 1 -

5 Цистный эхинококкоз свиней - ■ - 1 1 - -

В области белков мол. массы 45,0 кДа и 14,4 кДа проявились довольно хорошо выраженные, но диффузного характера полосы. Все остальные 12 компонентов представлены на электрофореграмме более слабо выраженными полосами в области белков мол. массы 116,0; 97,0; 31,0 и 21,5 кДа.

Аналогичный электрофоретаческий анализ 3-диевных продуктов метаболизма протосколексов E.multilocularis позволил определить не менее 16 компонентов, располагающихся в диапазоне белков мол. массы 21,5 -200,0 КДа. Однако необходимо отметить, что на электрофореграмме мажорные компоненты проявлялись в основном в области белков мол. массы между 66,0 и 45,0 кДа.

Четкие различия между исследуемыми биоматериалами из Е. granulosus и Е. multilocularis отметили в области подвижности белков мол. массы 200,0 кДа, а также в диапазоне белков мол. массы от 45,0 до 21,5 кДа. В этой области наиболее четко проявились белковые компоненты 3-дневных продуктов метаболизма протосколексов Е. multilocularis, в то же время на этой электрофореграмме не регистрировали компонент в области подвижности белков мол. массы 14,4 кДа, который довольно четко проявился в биоматериале из Е. granulosus.

Электрофоретаческий анализ клеточных метаболитов протосколексов Е. granulosus и Е. multilocularis не выявил существенных различий как в количественном отношении, так и в проявлении белковых компонентов на электрофореграмме. В этих биоматериалах проявилось не менее 8-9 компонентов в диапазоне белков мол. массы 31,0 - 200,0 кДа. Наиболее четко выраженные, 3 мажорные полосы представляли белковые компоненты мол. массы 45,0; 66,0 кДа и одна - между 45,0 и 66,0 кДа. Не менее 3 полос более диффузного характера представляли на электрофореграмме белковые компоненты мол. массы 116,0 и 200,0 кДа.

При сравнительном анализе электрофореграмм с исследуемыми биоматериалами отметили одну общую закономерность, а именно во всех из них наиболее четко выраженные полосы представляли белковые компоненты мол. массы между 45,0 и 66,0 кДа.

Результаты иммунопрофилактических свойств «клеточных» антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе с:

а) иммуномодулятором Гала-Вет

б) иммуномодулятором ронколейкином

в) с противоопухолевым биопрепаратом «К»

а) с иммуномодулятором Гала - Вет Результаты исследований по оценке протективного действия препарата Гала-Вет, КлАГ протосколексов E.multilocularis и Гала-Вет в комплексе с КлАГ представлены в таблице 2. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что наибольший эффект защиты (91,7%) достигался при иммунизации мышей специфическим антигенным препаратом в комплексе с

Таблица 2

Протективные свойства'Гала — Вет и клеточного антигена (КлАГ) протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном

№ груп п Кол-во мышей в группе Иммуниз ирующее средство, доза* Доза зара женил**, экз. Кол-во зара зивших ся мышей Эффект ивность защиты, % Примечание

1 12 Гала-Вет (22мкг) 750±50 3 75 У трех мышей обнаружены единичные ларвоцисты в брюшной полости без зародышевых элементов.

2 12 Гала-Вет (22мкг) КлАГ (бОмкг бека) 750±50 1 91,7 У одной мыши обнаружены единичные ларвоцисты на паренхиме печени, при микроскопии которых зародышевые элементы не обяаружены.

3 12 КлАГ (60 мкг белка) 750±50 3 75 У трех мышей обнаружены ларвоцисты в брюшной полости и на паренхиме печени, у одной- с зародышевыми элементами.

4 конт роль 12 Физиолог ический р-р 750±50 12 — Все мыши заразились, ларвоцисты массой 0,105-1086 гр.в брюшной полости и во внутренних органах с протосколексами.

*- иммунизация подкожно, 3-кратно с интервалом 10 дней **- заражение через 20 дней после последней иммунизации

иммуномодулятором Гала-Вет. Животные этой группы оставались свободными от инвазии после проверочного заражения и только у одной мыши обнаружили единичные ларвоцисты, размер которых не превышал 1 -2 мм, без инвазивных элементов. Что касается мышей 1-й группы, которым вводили иммуномодулятор Гала - Вет, защитный эффект у них не превышал 75%. Аналогичную эффективность регистрировали у мышей, иммунизированных только КлАГ протосколексов Е.ти1Шоси1алз. В обоих случаях у 3 животных при вскрытии в печени и брюшной полости обнаружили единичные ларвоцисты, размером - более 5 — 10 мм и массой 105-334мг, в основном без зародышевых элементов.

Все животные контрольной группы, которым вводили стерильный физиологический раствор, были заражены. У них при вскрытии в брюшной полости и во внутренних органах обнаружили многочисленные ларвоцисты, массой 105-1086 мг с развившимися жизнеспособными протосколексами.

б) с иммуномодулятором ронколейкином

Результаты исследований по оценке протективного действия препарата ронколейкина, КлАГ протосколексов Е.гтшШ1оси1ап5 и ронколейкина в комплексе с КлАГ представлены в таблице 3. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что наибольший эффект защиты достигался при иммунизации мышей специфическим антигенным препаратом в комплексе с ронколейкином. Животные этой группы оставались свободными от инвазии на 83,3% после проверочного заражения. У 2-х мышей обнаружили ларвоцисты, размером 1-2 мм, без инвазивных элементов. Что касается мышей 1-й группы, которым вводили иммуномодулятор ронколейкин, защитный эффект у них не превышал 58,3%. Несколько выше была эффективность защиты у мышей, иммунизированных только КлАГ протосколексов Е.ти1Шоси1аш. В обеих группах у 5 и 4 животных соответственно при вскрытии в печени и брюшной полости обнаружили единичные ларвоцисты, размером - более 10-15 мм и массой 110-400 мг, у некоторых с зародышевыми элементами.

Таким образом, введение мышам только ронколейкина или иммунизация КлАГ без иммуномодулятора не обеспечивала формирование достаточно эффективного иммунитета, защищающего их от последующего заражения. Все животные контрольной группы, которым вводили стерильный физиологический раствор, были заражены. У них при вскрытии в брюшной полости и во внутренних органах обнаружили многочисленные ларвоцисты, массой 120-1500 мг с развившимися жизнеспособными протосколексами.

в) с противоопухолевым биопрепаратом «К»

Результаты исследований по оценке протективного действия биопрепарата «К», КлАГ протосколексов Е.тиШ1оси1ап5 и биопрепарата «К» в комплексе с КлАГ представлены в таблице 4. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что наибольший эффект защиты (100%) достигался при иммунизации мышей специфическим антигеном в комплексе с биопрепаратом «К». Животные этой группы оставались свободными от

Таблица 3

Протективные свойства ронколейкина и клеточного антигена (КлАГ) протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе (гидатитозе) мышей

№ груп п Кол-во мышей в группе Иммуниз ирующее средство, доза* Доза зара жения**, экз. Кол-во зара зивших ся мышей Эффект ивность защиты, % Примечание

1 12 Ропколей КИН (180 ME) 750±50 5 58,3 У пяти мышей обнаружены единичные ларвоцисты в брюшной полости, у 2-х с зародышевыми элементами.

2 12 Ропколей кип (180 ME) КлАГ (бОмкг белка) 750±50 2 83,3 У двух мышей обнаружены единичные ларвоцисты на паренхиме печени, при микроскопии которых зародышевые элементы не обнаружены.

3 12 КлА1" (60 мкг белка) 750±50 4 65,7 У четырех мышей обнаружены ларвоцисты в брюшной полости и на паренхиме печени, у одной- с зародышевыми элементами.

4 копт роль 12 Физиолог ический Р-Р 750±50 12 — Все мыши заразились, ларвоцисты массой 120-1500 мг. в брюшной полости и во внутренних органах с протосколексами.

*- иммунизация подкожно, 3-кратпо с интервалом 10 дней **- заражение через 20 дней после последней иммунизации

Таблица 4

Протективные свойства биопрепарата «К» и клеточного антигена (КлАГ) протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе (гидатитозе) мышей_

№ груп п Кол-во мышей в группе Иммупиз ирующее средство, доза* Доза зара жения**, экз. Кол-во зара зивших ся мышей Эффект ивность защиты, % Примечание

1 12 Биопрспа рат «К» (первое введение -5ЕД/ мышь, 2-е -15ЕД, 3-е-45 ЕД) КлАГ (бОмкг бека) 750±50 0 100% У иммунизированных мышей не обнаружены ларвоцисты.

2 12 Биопрепа рат «К» (дозы препарата как в первой группе) 750±50 2 83,3% У двух мышей обнаружены едипичные ларвоцисты в брюшной полости без зародышевых элементов.

3 12 КлАГ (бОмкг белка) 750±50 3 75 У трех мышей обнаружены ларвоцисты в брюшной полости и на паренхиме печени, у одной-с зародышевыми элементами.

4 конт роль 12 Физиолог ический р-р 750±50 12 — Все мыши заразились, ларвоцисты массой 0,105 - ¡086 гр. в брюшной полости и во внутренних органах с протосколексами.

* - иммунизация подкожно, 3-кратно с интервалом 10 дней

** - заражение через 20 дней после последней иммунизации

инвазии после проверочного заражения. Что касается мышей 2-й группы, которым вводили только биопрепарат «К», защитный эффект у них составил 83,3%. У двух мышей из этой группы обнаружены единичные ларвоцисты в брюшной полости без зародышевых элементов. У мышей, иммунизированных только КлАГ иротосколексои E.multilocularis, эффективность защиты составила 75%. При вскрытии и исследовании органов у 3 животных из этой группы в печени и брюшной полости обнаружили единичные ларвоцисты, размером - более 5-10 мм и массой 105-334мг, у одной мыши с зародышевыми элементами.

Таким образом, иммунизация мышей биопрепаратом «К» стимулировала у них достаточно выраженную иммунную реакцию, предохраняющую от последующего заражения большинство животных. В то же время у мышей, которых иммунизировали только КлАГ, эффективность защиты была несколько ниже. Все животные контрольной группы, которым вводили стерильный физиологический раствор, были заражены.

У них при вскрытии в брюшной полости и во внутренних органах обнаружили многочисленные ларвоцисты, массой 105-1086 мг с развившимися жизнеспособными протосколексами.

Полученные данные подтвердили, что клеточные антигены, представляющие собой метаболиты культивируемых в искусственной питательной среде клеток протосколексов E.multilocularis, имеют в своем составе компоненты иммунопрофилактического действия. Эти антигены стимулируют иммунные механизмы и предохраняют животных от последующего заражения. Защитный эффект повышается при иммунизации животных специфическим антигеном в комплексе с иммунос тимулирующими препаратами.

Однако при использовании комплекса иммуносредств в каждом конкретном случае необходима осторожность, особенно при дозировании препаратов, поскольку «перегрузка» иммунной системы может вызвать обратный эффект. Для получения максимальной эффективности необходимо использовать оптимально подобранные дозы, которые позволяют направить иммуностимулирующее действие биопрепаратов на усиление иммунной ответной реакции и повышение устойчивости животных к заражению. Одновременное применение этих средств со специфическими антигенами гельминтов значительно усиливает ответную иммунную реакцию, что в последующем проявляется устойчивостью к заражению.

Результаты оценки иммунотерапевтического действия клеточных антигенов протосколексов £. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозс в комплексе:

а) с иммуномодулятором ронколейкином

б) с противоопухолевым биопрепаратом «К»

а) Результаты опыта по изучению иммунотерапевтического действия КлАГ протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином показали,

что у всех пролеченных животных 1-й и 2-й групп развились многочисленные ларвоцисты паразита с жизнеспособными протосколексами. Разницы между контрольной и пролеченными группами не наблюдалось. Все органы в брюшной полости были поражены (практически отсутствовала ткань органов) ларвоцистами паразита, массовая доля которых равнялась 5060% от массы тела хозяина.

б) Аналогичный анализ результатов по изучению иммунотерапевтического действия КлАГ протосколексов Е. multilocularis в комплексе с противоопухолевым биопрепаратом «К» также показал, что у животных 1-й группы, которым вводили только биопрепарат «К», масса развившихся ларвоцист паразита составляла 30-40% от массы тела хозяина, в основном без зародышевых элементов. Только у одной мыши из этой группы были обнаружены протосколексы и ацефалоцисты Е. multilocularis.Y животных 2-й группы, которым вводи биопрепарат «К» в комплексе с КлАГ протосколексов Е. multilocularis, масса образовавшихся ларвоцист не превышала 10-15% от общей массы тела хозяина. Все ларвоцисты были без зародышевых элементов. Одна мышь из этой группы оказалась свободной от инвазии. У всех мышей 3-й контрольной группы развившиеся ларвоцисты паразита составляли 50-70% от массы тела хозяина с инвазионными элементами.

Оценка протективного действия клеточных антигенов Е. multilocularis при эхинококкозс собак с иммуномодулятором ронколейкином.

Анализ результатов по оценке протективной эффективности клеточного антигена протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином показал, что собаки, двукратно иммунизированные этим препаратом, оказались после проверочного заражения слабо инвазированы Е. granulosus. У них обнаружили 110-131 экз. паразитов, в среднем по группе (118,6±13,2экз.) Причем оказалось, что длина всех выделенных в этой группе эхинококков была не более 1,2 мм без сформированного третьего членика. Эффективность защиты составила 94,5%.

У собак 2-й группы, которых иммунизировали только клеточным антигеном протосколексов Е. multilocularis, обнаружили 680-893 экз. (в среднем 788,3±8,4 экз.) паразита длиной 1,44 мм со сформированным терминальным члеником без яиц эхинококка. В этой группе протективный эффект составил 66,5%.

При вскрытии собак 3-й группы, иммунизированных только иммуномодулятором ронколейкином, число выделенных паразитов было 1254-1368 экз. (в среднем 1307,6±14,5 экз.) длиной не менее 1,76 мм. Также как и у животных второй группы выделенные эхинококки имели

сформированный терминальный членик с незначительным количеством яиц паразита. Эффективность защиты у этих животных была в пределах 39,3%.

Что касается собак 4-й группы, которым вводили физраствор, они все были'заражены, у них обнаружили 2064-2301 экз. (в среднем 2156,6±25,3 экз.) цестоды, длиной около 2,3 мм. У этих собак все выделенные цестоды были половозрелые с большим количеством яиц паразита в терминальном члепикс.

Резюмируя полученные данные можно констатировать, что 2-кратная иммунизация собак комплексным препаратом, включающим клеточные антигены протосколексов Е. multilocularis и иммуномодулятор ронколейкин, обеспечивает достаточно эффективную иммунную защиту против заражения Е. granulosus. Тем не менее, на наш взгляд, вопрос этот требует дальнейшего изучения, как в плане подбора оптимальных доз клеточного антигена, так и использование его в комплексе с другими эффективными иммуностимулирующими средствами нового поколения. Такие исследования, безусловно, потребуют значительного числа экспериментальных животных, однако, учитывая, что эхинококкоз в последние годы приобрел большое социальное значение почти во всех регионах России, активизация работ по разработке иммунных средств защиты от эхинококкозов должна быть признана приоритетным направлением паразитологии.

Выводы

1. Проведено культивирование клеток протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus в искусственной питательной среде RPMI-1640 в условиях С02-инкубатора, получено соответственно 27 и 19 серий клеточных метаболитов, из которых 19 (70,3%) и 14 (73,7%) имели в своем составе по данным иммуноферментной реакции (ИФР) паразитарные антигены.

2. Культивированием протосколексов обоих видов эхинококков в течение 3-х дней при тех же условиях получено соответственно 7 и 11 серий 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов, из которых 7 (100%) и 9 (81,1 %) по данным реакции иммунодифузии были антигеноактивными.

3. Электрофорезом в полиакриламидном геле в клеточных метаболитах Е. multilocularis и Е. granulosus проявлено соответственно 8 и 9, а в 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах культивируемых протосколексов исследуемых паразитов по 16 и 18 белковых компонентов, располагающихся в области подвижности белков молекулярной массы от 14,4 до 200 кДа.

4. Реакцией иммунодифузии в агаровом геле с использованием сывороток больных цистной и альвеолярной формой эхинококкоза и сывороток свиней с естественной инвазией Е. granulosus в полученных биоматериалах протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus установлено наличие функциональных антигенов паразитов.

5. Установлено, что 3-кратная подкожная иммунизация мышей клеточным антигеном протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором Гала-Вет (доза 60 мкг белка клеточного антигена и 22 мкг иммуномодулятора Гала-Вет) предохраняла 91,7% мышей от последующего заражения Е. multilocularis.

6. Иммунизация мышей клеточным антигеном протосколексов Е. multilocularis (60 мкг белка-антигена) совместно с иммуномодулятором ронколейкином (180 МЕ) вызывала защитный эффект в пределах 83,3%.

7. Установлен наибольший защитный эффект (100%) от заражения Е. multilocularis при 3-кратной подкожной иммунизации клеточным антигеном протосколексов паразита (доза 60 мкг белка-аитигена) в комплексе с биопрепаратом «К» увеличивающимися дозами (в количестве 5 ЕД; 15 ЕД и 45 ЕД)

8. Клеточный антиген протосколексов Е. multilocularis, введенный зараженным мышам на 15 день инвазии совместно с иммуномодулятором ронколейкином или противоопухолевым биопрепаратом «К», не проявил иммунотерапевтического действия.

9. Установлен значительный протективный эффект клеточного антигена протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином при эхинококкозе собак. У 2-кратно иммунизированных собак с интервалом 20 дней в дозе 1500 МЕ ронколейкина и 1,7 мг белка - клеточного антигена количество выделенных паразитов было в 6,03 раза меньше, чем в контроле. Все выделенные эхинококки были без сформированного третьего членика. Эффективность защиты составила 94,5%.

Практические предложения

Материалы диссертационной работы использованы в разработке «Технологического регламента на комплексный иммунопрепарат для профилактики альвеолярного гидатидоза», одобренного секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.09.2007г.).

Установленная иммунохимическим анализом значительная идентичность антигенов-метаболитов Е. multilocularis и Е. granulosus и обнадеживающие результаты по иммунопрофилактике эхинококкоза (Е. granulosus) собак клеточными антигенами протосколексов Е. multilocularis доказывает экономическую целесообразность их использования для повышения резистентности собак к заражению Е. granulosus, так как получение протосколексов Е. multilocularis требует меньше времени (3-4 месяца), затрат на содержание и кормление экспериментальных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бережко В. К., Сасикова М. Р., Руднева О. В. Метаболиты культивируемых клеток, протосколексов Echinococcus multilocularis в иммунопрофилактике вторичного альвеолярного эхинококкоза.// Материалы докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»,- 2006.- вып. 7.- с.63-66.

2. Сасикова М. Р. Физико-химическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis.// Труды Всероссийского института гельминтологии им. К. И. Скрябина.- 2006.-№ 44.- с. 202-206

3. Бережко В. К., Далаева И. Б., Сасикова М. Р. Диагностическая эффективность метаболитов культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.// Российский паразитологичесютй журнал.- 2007.- №2.-с.30-34.

4. Сасикова М.Р., Бережко В. К. Защитные свойства иммуномодулятора Гала-Вет в комплексе с клеточным антигеном Echinococcus multilocularis при экспериментальном гидатидозе.// Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2007.- Лг°4,- с.26-28.

5. Сасикова М. Р., Бережко В. К., Каллиникова В. Д. Препарат «К» -иммунопрофилактическое средство при экспериментальном альвеолярном гидатидозе.// Материалы докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»,- 2007,- вып. 8.- с. 308313.

6. Сасикова М. Р., Бережко В. К. Защитные свойства иммуномодулятора ронколейкина в комплексе с клеточным антигеном Echinococcus multilocularis при экспериментальном альвеолярном гидатидозе. // Материалы докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», 2009.- вып. Ю.-с. 340-343.

Подписано в печать:

30.10.2009

Заказ № 2900 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сасикова, Марина Руслановна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Способы получения и характеристика антигенов эхинококков.

1.2. Иммунопрофилактика эхинококкозов.

Глава И. Собственные исследования.

2. Материалы и методы.

2.1.1. Получение вторичных ларвоцист Echinococcus multilocularis, цист Е. granulosus, приготовление первичной клеточной культуры.

2.1.2. Культивирование клеток протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus в синтетической питательной среде, получение клеточных метаболитов.

2.1.3. Получение 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus.

2.1.4. Исследование клеточных метаболитов иммуноферментной реакцией (ИФР), выделение антигеноактивных серий, определение в них антигенов паразита реакцией иммунодифузии (РИД).

2.1.5. Физико-химическая характеристика клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ).

2.1.6. Иммунопрофилактические свойства клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis в комплексе:.

2.1.6.1. с иммуномодулятором Гала-Вет.

2.1.6.2. с иммуномодулятором ронколейкином.

2.1.6.3. с противоопухолевым биопрепаратом «К».

2.1.7. Изучение иммунотерапевтического действия клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе:.

2.1.7.1. с иммуномодулятором ронколейкином.

2.1.7.2. с противоопухолевым биопрепаратом «К».

2.1.8. Протективные свойства клеточных антигенов Е. multilocularis при эхинококкозе собак в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Анализ данных по культивированию клеток протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus.

2.2.2. Характеристика и контроль метаболитов клеточных культур и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов из вторичных ларвоцист Е. multilocularis и Е. granulosus.

2.2.3. Отбор и характеристика антигеноактивных клеточных метаболитов клеток протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus ИФР, РИД.

2.2.4. Результаты физико-химической характеристики клеточных метаболитов и экскреторно-секреторных продуктов протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus.

2.2.5. Оценка иммунопрофилактического действия клеточных антигенов Е. multilocularis при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе в комплексе:.

2.2.5.1. с иммуномодулятором Гала-Вет.

2.2.5.2. с иммуномодулятором ронколейкином.

2.2.5.3. с противоопухолевым биопрепаратом «К».'.

2.2.6. Оценка иммунотерапевтического действия клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе:.

2.2.6.1. с иммуномодулятором ронколейкином.

2.2.6.2. с противоопухолевым биопрепаратом «К».

2.2.7. Оценка протективного действия клеточных антигенов Е. multilocularis при эхинококкозе собак с иммуномодулятором ронколейкином.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химическая характеристика клеточных антигенов эхинококков и разработка иммунопрофилактического средства"

Актуальность темы. Эхинококкоз - это один из самых значимых и широко распространенных паразитозов в мире, представляющий серьезную проблему не только для ветеринарии, но и для медицины (Garippa et al., 2004; Budke et al., 2006).

Особенно остро эта инвазия проявляется в регионах с развитым овцеводством и скотоводством, причем не только из-за наносимого экономического ущерба животноводству, но и из-за большего риска заболевания человека, являющегося одним из промежуточных хозяев гельминта (Auer, Aspöck 1991; Kammerer, Schantz, 1993; Mandell et al., 2000; Eckert, 2000). Источником заражения человека являются дикие и в основном домашние плотоядные (Kreidl et al., 1998; Eckert, Deplazes, 2004; Deplazes, 2006; Petavy et al., 2008).

Человек заражается, употребляя в пищу загрязненные яйцами гельминта продукты, или через загрязненную воду.

Если в России заболевание людей цистной и альвеолярной формами гидатидоза за 1986-1995 годы составило около 1,1 случаев на 100 тысяч населения, то в последние годы этот показатель значительно увеличился. Ежегодно регистрируется 2500 первично выявленных больных (по данным Госсанэпиднадзора МЗ РФ, 2001). Заболеваемость эхинококкозом на территории Российской Федерации в 2008 году увеличилась по сравнению с предыдущим годом на 5,4 % (Онищенко, 2008). Доля городских жителей в последние два года составляет 48% от общего числа больных. Высокая заболеваемость эхинококкозом регистрируется, в Ямало- Ненецком (5,36 на 100 тыс.населения), Чукотском автономных округах (1,99 на 100 тыс.населения), Карачаево-Черкесской Республике (3,97 на 100 тыс.населения), республиках Алтай (1,94 на 100 тыс.населения), Калмыкия (1,40 на 100 тыс.населения),Саха (Якутия) (1,26 на 100 тыс.населения), Башкортостан (1,63 на 100 тыс.населения), Оренбургской (2,31 на 100 тыс.населения), Саратовской (1,78 на 100 тыс.населения), Курганской (1,35 на 100 тыс.населения) областях. За период с 1996 год по 2008 год зарегистрировано 109 летальных исходов от эхинококкоза, наибольшее число которых приходится на Красноярский край (21,1%) и Оренбургскую область (19,2%). Этот показатель растет как из-за усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, так и в связи с ухудшением социальной жизни и снижением санитарно-эпидемиологического контроля (Маркин, 1999; Мусаев, 1999; Kovalenko et al., 2002).С другой стороны, значительно повысилась эффективность диагностических методов, особенно с внедрением в клиническую практику высокоинформативных методов диагностики этого заболевания, например таких как УЗИ и рентгеновская компьютерная томография (Kaimal, 1982, Nisenbaum, Rowling, 1995; Omac Tufekcioglu, 2007; Caremani et al., 1993; De Werra et al., 2007; Macpherson, 1992; Weill et al. 1991).

В связи с вышеизложенным актуальными представляются исследования по разработке иммунопрофилактических средств против ларвального и имагинального эхинококкозов с использованием антигенов паразита различного происхождения и способов получения. В последние годы в паразитологии успешно применяются биотехнологические методы получения антигеноактивных препаратов, к числу которых относится и клеточная инженерия, которая позволяет использовать культуры клеток для решения многих научных и прикладных задач биологии, медицины и сельского хозяйства. Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в искусственных питательных средах путем их многократного пассирования. Хотя работ по культивированию клеток тканей и органов гельминтов немного, подобные исследования проводились давно и были сделаны конкретные выводы о такой возможности (Sakamoto et al., 1967; Rickard, Bell, 1971; Sakamoto, 1978; Smith, 1979; Fiori et al., 1988; Furuya et al., 1990; Furuya, 1991; Feng et al., 1992, 1993; Гламаздин, 1997, 1997; Lu et al., 1998). Очищенные экскреторно-секреторные антигены, полученные при культивировании гельминтов рода Echinococcus, используются для изучения иммунитета и вакцинации животных (Heath, 1976; Rickard, 1978; Onawunmi, Coles, 1980; Osbom, Heath, 1982).

Поэтому получение стандартизированных видоспецифичных антигенов эхинококков, эффективных в диагностике и иммунопрофилактике эхинококкозов, является одной из актуальных задач, в решении которой большое значение имеют биотехнологические методы. Для получения специфических антигенов цестод методом клеточной инженерии можно использовать как протосколексы, так и яйца паразитов, содержащие инвазионные онкосферы. Тем не менее в целях безопасности и с учетом обеспечения необходимой стерильности наиболее предпочтительным является использование протосколексов или герминативной оболочки. Яйца же с инвазионными онкосферами, хотя и обладают значительной антигенной активностью, представляют опасность для исследователей и требуют более тщательной и длительной стерилизации от микрофлоры кишечника, что может повлиять на жизнеспособность получаемых из них клеток и на процесс культивирования. В свете вышеизложенного считаем целесообразными и актуальными исследования по получению клеточных антигенов эхинококков, их физико-химической характеристики и разработки на их основе иммунопрофилактического препарата при эхинококкозе.

Цели и задачи исследования Целью работы было получить «клеточные» антигены и 3-дневные экскреторно-секреторные продукты протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus, провести их физико-химическую характеристику и разработать на основе клеточных антигенов эхинококков и иммуностимулирующих средств иммунопрофилактический препарат при эхинококкозе.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) получить «клеточные» метаболиты и 3-дневные экскреторно-секреторные продукты протосколексов Е. multilocularis и Е. granulosus;

2) провести отбор антигеноактивных серий «клеточных» антигенов протосколексов эхинококков иммуноферментной реакцией (ИФР);

3) установить реакцией иммунодифузии (РИД) в агаровом геле наличие антигенов паразита в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах культивируемых in vitro протосколексов эхинококков;

4) провести физико-химическую характеристику клеточных антигенов и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов эхинококков электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ);

5) изучить иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе на мышах в комплексе с:

- иммуномодулятором Гала-Вет;

- иммуномодулятором ронколейкином;

- противоопухолевым биопрепаратом «К»;

6) оценить лечебное действие клеточных антигенов . протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе с:

- иммуномодулятором ронколейкином;

- противоопухолевым биопрепаратом «К»;

7) изучить протективные свойства клеточных антигенов Е. multilocularis при эхинококкозе собак в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином

Научная новизна

Впервые проведена сравнительная физико-химическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Е. granulosus и Е. multilocularis и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов культивирования протосколексов методом электрофореза в ПААГ. Установлено в белковом спектре исследуемых антигенов протосколексов Е. granulosus соответственно 18 и 9, а Е. multilocularis 16 и 8 компонентов. Наиболее четко выраженные мажорные белковые компоненты в исследуемых антигенах протосколексов обоих видов эхинококков располагались в области подвижности белков мол. массы 200; 116; 66; 45; 31 и 14,4 кДа.

Антигенные компоненты исследуемых биоматериалов выявляли антитела класса IgG в сыворотках больных цистной и альвеолярной формой эхинококкоза, что подтверждает значительную идентичность входящих в их состав белков-антигенов и возможность их взаимозаменяемости. Впервые изучены протективные свойства иммунопрофилактических препаратов на основе «клеточных» антигенов протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодуляторами Гала-Вет, ронколейкином и противоопухолевым биопрепаратом «К» при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе. Эффективность защиты составила соответственно: 91,7%; 83,3%; 100%. Установлено, что 2-кратная внутримышечная иммунизация собак клеточным антигеном протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином значительно повышает резистентность животных к заражению протосколексами Е. granulosus (количество развившихся паразитов в 6,03 раз ниже, чем в контроле, все выделенные гельминты от иммунизированных собак были без сформированного терминального членика).

Установлено, что клеточные антигены в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином и противоопухолевым биопрепаратом^ «К» не оказывают лечебного действия при альвеолярном эхинококкозе.

Практическая значимость

Подана заявка на изобретение «Способ профилактики ларвального альвеолярного эхинококкоза».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

1) научной конференции «Теория и практика Борьбы с паразитарными болезнями (2006-2008гг.)

2) заседаниях Ученого совета ВИГИС (2006-2008гг.)

3) секции «Инвазионные болезни животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № .2007г.)

Основные положения, выносимые на защиту

• Иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе в комплексе: иммуномодулятором ронколейкином

- иммуномодулятором Гала-Вет противоопухолевым биопрепаратом «К»

• Протективные свойства клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis при экспериментальном эхинококкозе собак в комплексе с ронколейкином

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, 3 из которых в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертационной работы изложены на 135 страницах компьютерного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы включает 190 источников, в том числе 52 отечественных и 138 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 36 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Сасикова, Марина Руслановна

Выводы

2. Культивированием протосколексов обоих видов эхинококков в течение 3-х дней при тех же условиях получено соответственно 7 и 11 серий 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов, из которых 7 (100%) и 9 (81,1%) по данным реакции иммунодифузии были антигеноактивными.

5. Установлено, что 3-кратная подкожная иммунизация мышей клеточным антигеном протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуностимулятором Гала-Вет (доза 60 мкг белка клеточного антигена и 22 мкг иммуностимулятора Гала-Вет) предохраняла 91,7% мышей от последующего заражения Е. multilocularis.

7. Установлена наибольшая эффективность (100%) от заражения Е. multilocularis при 3-кратной подкожной иммунизации клеточным антигеном протосколексов паразита (доза 60 мкг белка-антигена) в комплексе с биопрепаратом «К» увеличивающимися дозами (в количестве 5 ЕД; 15 ЕД и 45 ЕД)

8. Клеточный антиген протосколексов Е. multilocularis, введенный зараженным мышам на 15-й день инвазии совместно с иммуномодулятором ронколейкином или противоопухолевым биопрепаратом «К», не обладал иммунотерапевтическим действием.

9. Установлен значительный протективный эффект клеточного антигена протосколексов Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором ронколейкином при эхинококкозе собак. У 2-кратно иммунизированных собак с интервалом 20 дней в дозе 1500 МЕ ронколейкина и 1,7 мг белка — клеточного антигена количество выделенных паразитов было в 6,03 раза меньше, чем в контроле. Все выделенные эхинококки были без сформированного третьего членика. Эффективность защиты составила 94,5%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сасикова, Марина Руслановна, Москва

1. Аделыпин Ф. К., Баллад Н. Е., Коваленко Ф. П. Оценка протективной активности очищенных фракций альвеококкового антигена при экспериментальном альвеококкозе линейных мышей. // Мед. паразитология и паразитарные болезни.- 1983.- № 2.-21-26.

2. Аделыпин Ф. К. Подходы к иммунотерапии экспериментального альвеококкоза линейных мышей и крыс с использованием иммуномодуляторов.// Актуальн. проб. мед. и вет. паразитол тез. докл. междунар. науч. конф. Витебск,- 1993, с. 22.

3. Алферова М.В. Реакция сколексопреципитации при экспериментальном цистициркозе крупного рогатого скота.// «Болезни с.-х. животных» труды УзНИВИ, Ташкент. 1978. -т.28, ч.1.-26-28.

4. Аминжанов М. Изучение возможности иммунизации собак против Е. granulosus.// Узбекск. биол. ж., 1977, № 2. 57-59.

5. Аминжанов М. Иммунопрофилактика эхинококкоза животных.// Болезни с-х животных. Труды УзНИВИ, Ташкент, 1980, т. 30, ч. 1, с. 15-18.

6. Aminjanov М. The biological basis for prophylaxis against Echinococcus in animals in Uzbek republic.// Abst. of Papers Presented at the 9th Int. Conf. of the WAAVP, Budapest 13-17 July 1981, Hungary, 1981, p. 49.

7. Aminjanov M. Vaccine against Echinococcus.// Parassitologia, 1996, 38, № 1-2; 190

8. Аминжанов M., Аминжанов Ш. Вакцина для профилактики эхинококкоза овец в Узбекистане. МПиПБ, 1999, № 2: 58.

9. Aminjanov М., Rasulov Sh., Amaninjanov Sh. The vaccine for prevention of Echinococcosis of animals.// The 19th Int. Conf. of the WAAVP, aug. 10-14, 2003, New Orleans, Louisiana, USA, p. 80.

10. Ашмарин И. П. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов.// Издательство ЛГУ,-1975 г.

11. Бережко В. К., Бессонов А. С. Получение метаболитов перевиваемой культуры клеток метоцестоды Taenia crassiceps.// Тр. Всес. ин-та гельминтол. 1996, т.32, с. 18-22

12. Бережко В. К., Кленова И. Ф. Антигенная активность клеточных метаболитов протосколексов Coenurus cerebralis.// Тр. Всес. ин-та гельминтол.-1999.-Т.35.-С.39-45.

13. Berezhko V.K., Bessonov A. S. Cell metabolites of Echinococcus multilocularis application as diagnostic antigens.// XXXIII Archivos Internacionales de la Hydatidosis, 1999, 286.

14. Бережко В.К., Сивкова Т. Н. Антигены клеточной культуры и их использование в иммунодиагностике и иммунопрофилактике.// Тезисы IT Международ, научн. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» М., 2000, с.21-22.

15. Бережко В. К., Бессонов А. С. Использование клеточных метаболитов Е. multilocularis в качестве диагностических антигенов.// Ветеринария.-2000.-№2.-С.31 -34.

16. Гламаздин И.Г. Культивирование отдельных клеток гельминтов и получение диагностически ценных антигенов.// Актуальные проблемы ветсанконтроля сельскохозяйственной продукции.- М.-МГУПБ.- 1997.

17. Гламаздин И.Г., Радина О.В. Первичная клеточная культура D.caninum.// Сб. к 100-летию со дня рождения И.В. Орлова.-МГУ ПБ.-1999.

18. Гребенщикова В. И., Роскин Г. И. Противораковый антибиотик круцин.// М.: МГУ, 1968. С. 57-65.

19. Гусев А. И., Цветков В. С. К технике постановки реакции микропреципитации в агаре.// Лаб. Дело.- 1961, № 2, 43-45.

20. Далаева И. Б., Бережко В. К. Методический подход к типированию культивируемых клеток протосколексов Echinococcus multilocularis. // Материалы научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями».- 2005.- вып. 6.- с. 97-99

21. Зильберблат Г. С. Противораковый антибиотик круцин.//М.: МГУ, 1968. С. 220-234.

22. Ибрагимов P.M. Получение и биохимическая характеристика атигенных (аллергенных) фракций эхинококка.// Автореф. дисс. канд. биол. наук Алма-Ата.-1970.- С.98-99.

23. Каллиникова В. Д. Противораковые свойства жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi.// Тула: Гриф и К, 2004.- 280с.

24. Клименко В. В., Сазанов А. М. Перекрестореагирующие антигены у Fasciola hepatica и F. gigantica// Тр. Всес. ин — та гельминтол.-1975.-Т. 22.-е. 85-91.

25. Кленова И.Ф. Разработка клеточной технологии получения антигенов цестод (на примере Coenurus cerebralis и Echinococcus multilocularis): Дис. канд. вет. наук. М.-1999.-125с.

26. Kovalenko F. et al. Hydatid diseases of human (cystic and alveolar) in Russia (1983 1997).// Acta Parasitológica, VIII Europ. Multicolloquiym of Parasitol., July, 2002. - 2002. - V. 45. - № 3. -P. 241-242.

27. Kosminkov N. Immunization as a prophylactic method against bovine cysticercosis//c 2-nd Int. Symp. Taeniasis (Cysticercosis and Hydatidosis) Echinococcosis, Ceske Budejovice, 1985, Proc. Ceske Budejovice.- 1986.- P. 35-39.

28. Косминков И. E. Диагностика и профилактика цистицеркозов и ценуроза жвачных // Дисс. д-ра вет. наук. М. — 1990.

29. Красюкова JI.C. Культивирование клеток ларвоцист эхинококка и использование его протосколексов для отбора антгельминтных препаратов: Дисс.канд. биол. наук. М.-1987.-184с.

30. Красюкова J1.C. Получение клеточной суспензии из ткани эхинококкового пузыря // 10 конф. Укр. об-ва паразитол., Одесса, 1986. - ч.З. матер, конф. Киев. - 1988 - с.21-22.

31. Курбанов А. Т., Степанковская Л. П. Сравнительная оценка антигенной активности эхинококковых жидкостей от различных видов животных.// Возбудители и переносчики паразитов и меры борьбы с ними. 1988.

32. Курочкина К. Г. Специфическая профилактика диктиокаулеза, фасциолеза и эхинококкоза сельскохозяйственных животных.// Дис. док. вет. наук. М.-1999.-с.220.

33. Leykina E.S., Dalin M.V., Ballad N.E., Tchebyshev N.V., Zorikhina V.l., Poletaeva O.G. Isolation of diagnostical helminth antigens and their use in serodiagnosis.// Helmintologia.-1981.-V.18.-P.273-280.

34. Маркин А. В. Эпидемическая ситуация по гельминтозам в России (1986-1995).// Материалы докл. науч. конф. «Теор. и практ. борьбы с паразитарн. болезнями».-1999.-С.152-154

35. Мусаев Г. X. Эпидемиологические аспекты развития эхинококкоза.// Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М., 18-20 мая, 1999, с.170-171

36. Онищенко Г. Г. О заболеваемости эхинококкозом в Российской Федерации в 2008 году.// Письмо №01/12554-9-23 от 31.08.2009

37. Пинаев Г. П. Методы культивирования клеток, «Наука», 1988.-319 с.

38. Плиева А. М. Эколого эпизоотологические особенности эхинококкоза животных в регионе Центрального Кавказа.// Дис. док. биол. наук. М.- 2007.- с. 320

39. Руднева О.В. Культивирование клеток цестод, как способ получения диагностических антигенов// Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями»-2004, вып.5. с.336-339.

40. Руднева О.В. Диагностическая эффективность клеточных метаболитов-антигенов протосколексов ларвоцист Echinococcus multilocularis при цистном эхинококкозе.// Тр. Всес. ин-та гельминтол. — 2005. т.41. - с.305-311.

41. Руднева О.В., Бережко B.K. Иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis разного возраста. // Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями»-2005. -вып.6 с.306-306.

42. Сивкова Т.Н. Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры при цистном гидатидозе животных // Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями» Москва, 2002. вып. 3. - с.305-307.

43. Сивкова Т.Н. Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры протосколексов Echinococcus granulosus при цистном гидатидозе животных // Труды ВИГИС, т.38, -Москва, 2002. - с. 278-284.

44. Сивкова Т.Н., Бережко В.К. Эффективность антигенов клеточной культуры протосколексов Echinococcus granulosus и Echinococcus multilocularis в диагностике цистного гидатидоза свиней. // Ветеринария. 2002. - №8. - с.7.

45. Судьина Т. И. (Скрынникова) Иммуногенная активность вакцины, полученной на основе культивирования онкосфер Multiceps multiceps in vitro при экспериментальном ценурозе овец.//Бюл. Всес. ин-та гельминтол,- 1990.- вып 54.- с. 103-104.

46. Скрынникова Т. И. Онкосферальный секреторный антиген Multiceps multiceps для профилактики ценуроза овец.// Дис. канд. вет. наук. М.-1993.- 134с.

47. Цэцэгсайхан Батмоих, Каллиникова В. Д., Карпенко П. П.// Сб. трудов московской научной, теоретико — практической конф. Монгольских студентов, магистрантов, аспирантов и докторантов, обучающихся в ВУЗАХ Р.Ф. Москва.- 2004.- вып. 1.- С.15-17;

48. Шакаров А. Г. , Зубицкая М. А., Буриев А. П., Рахимов А. Т. Сравнительная оценка антигенов (АГ) однокамерного эхинококка в диагностических тест-системах. 1-й иммунол. съезд, Сочи, 15-17 ноября 1989г.: Тез. секц. и стенд, сооб. Т.1, М, 1989, с. 183

49. Шумова Н.С. Разработка специфической профилактики тенуикольного цистицеркоза овец // Дисс. канд. вет. наук. Москва. 1994.- 133с.

50. Adams А. М. Growth rates of germinal cells of Echinococcus multilocularis and E. vogeli.// Bull. Soc. fr. Parasitol. 1990- v8 suppl № l-p.148.

51. Ali-Khan Z. Host-parasite relationship in Echinococcosis. I. Parasite biomass and antibody response in three strains of inbred mice against graded doses of Echinococcus multilocularis cysts.//J.Parasitol.-1974.-V.60.-P.231-235.

52. Ali-Khan Z., Siboo R. Immune complexes experimental alveolar hydatidosis. // «Tropenmed und Parasitol». — 1983, V.34., №3. -P.187-192.

53. Al-Yaman F. M., Knobloch J. Isolation and partial characterization of species-specific and cross-reactive antigenc of Echinococcus granulosus cyst fluid.// Mol. And Biochem Parasitol., 1989., 37,№ 1, 101-107.

54. Auer H, Aspöck H. Incidence, prevalence and geographic distribution of human alveolar echinococcosis in Austria from 1854 to 1990.//Parasitol Res 1991, 77: 430^136.

55. Bouchara J. P., Robert R., Senet J. M., Leynia de la Jairige P.// Luse en evidence de communautés antigeniques hote-parasite dans l'hydatidose.//Bull. Soc. pathol. exot.// 1985, 78, № 5 Bis, 707-711.

56. Budke CM, Deplazes P, Torgerson PR. Global socioeconomic burden of cystic echinococcosis.// Emerg. Inf. Dis. (2006), 12: 296303.

57. Capron A., Biguet S., Vemes A. Le diagnostic immunoelectrophoretique de l'hydatidose.// J. dyliydatidiogie Sim. ed. Lion.-1967.-P.27-40.

58. Capron A., Yarzabal L., Vernes A., Fruit J. Le diagnostique immunologique de ehcinococcose humaine.//Path. Bid.-1970.-V.18.-N 7-8.-P.357-365.

59. Caremani, M., R. Maestrini, U. Occhini, S. Sassoli, A. Accorsi, A. Giorgio, and C. Filice. Echographic epidemiology of cystic hydatid disease in Italy.//Eur. J. Epidemiol. 1993. 9:401-404.

60. Chordi A., Kagan ITIdentification and characterization of antigenic components of sheep hydatid fluid by immunoelectrophoresis.//J. Parasit.-1965.-V.51 .-N1.-P.63-71.

61. Craig P.S., Rickard M.D. Anti-oncospheral antibodies in the serum of lambs experimentally infected with either Taenia ovis and Taenia hydatygena.// «Z.Parasitenk».-1981.-V.64.№2.-P.169-177.

62. D'Amelio R.; Pontsilli O:; Dayal R.; De Rosa F.; Barnet M.; Teggi A.; Brighouse G.; Lambert P. H. Characterization of parasite antigens from human hydatid cyst fluid by SDS-PAGE and IEF.// Medical microbiology and Immunology.- 1985.-1.- 43-50

63. Dada, B. J., and E. D. Belino. Immunization of sheep against cystic hydatidosis with homologous and heterologous metacestode antigens.// Int. J. Zoonoses.- 1981.-8:20-25.

64. De Werra C, Condurro S, Tramontano S, Perone M, Donzelli I, Di Lauro S, Di Giuseppe M, Di Micco R, Pascariello A, Pastore A, Diamantis G, Galloro G. Hydatid disease of the liver: thirty years of surgical experience.// Chir Ital. 2007; 59: 611-625

65. Deplazes P. Ecology and epidemiology of Echinococcus multilocularis in Europe.// Parassitologia 2006, 48: 37-39

66. Dieckman A., Frank W.// Isolation of viable germinal cells from Echinococcus multilocularis.// Parasitol Res.// 1988, 74, № 3, 297298.

67. Dieckmann-Schuppert A., Ruppel A., Burger R., frank W. Echinoccoccus multilocularis: in vitro secretion of antigen by hybridomas from metacestode germinal cells and murine tumor cells//Experimental Parasitology.- 1989,- V.29.- P. 186-191.

68. Digenis G. A., Konyalian A., Thorson R. In vivo transfer 14C-4-cholesterol from mouse host to encapsulated Trichinella soiralis larvae.// Lipids.- 1970.- V. 5.- N 2.- P. 282-283.

69. Dixon J.B., Jenkins P., Carter S.D., Craig P.S. Abnormal immunoregulation in metacestode infection.//16th. Int. Congr. of Hydatidology, Beijing, China, 1993. V.30. -P.290.

70. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: characterisation of the main antigenic component (Arc 5) of hydatid fluid.// Exp.Parasitol.-1977.-V.43. №2 -P.307-314.

71. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: comparison between antigens in scolices and hydatid fluid.// Int.J.Parasitol.-1978.-V.8.-P.259-265.

72. Dottorini S., Sparvoli M., Baldeiii F., Fiorio M., Tassi C. Echinococcus granulosus: diagnosis of hydatid disease in sheep.// Riv. Parassitol.-1984.-V.45.-N2.-P.333-340.

73. Dumon H. N'Doundou M. Y., Mary Ch., Toga J., Gambarelli F., Franck J., Faugere B., Quilici M. Obtention d'antigens metaboliques d Echinococcus granulosus par culture de scolex, resultants préliminaires.// Bull. Soc. fr. parasitol.- 1984, № 3, 123-125.

74. Dumon H., Gambarelli F., Doumbo O., Quilici M. Hydatidose chez l'enfant en Bovence. Mise en evidence de foyers urbains.// Bull, Soc. pathol, exot.- 1986, 79,№ 5 664-669

75. Dusanic D. G. Serologic and enzymatic investigations of Trichinella spiralis. 2. Characterization of larva lactic dehydrogenase.// Exp. Parasitol.- 1967.- V. 20.- N 3.- P. 288-294.

76. Eckert J, Conraths FJ, Tackmann K. Echinococcosis: an emerging or re-emerging zoonosis.// Int. J. Parasitol. 2000; 30:1283-94

77. Eckert J, Deplazes P. Biological, epidemiological, and clinical aspects of echinococcosis, a zoonosis of increasing concern.// Clin Microbiol Rev 2004; 17:107-35.

78. Façon B., Chamekh M., Dissons C., Capron A. Molecular cloning of an E. granulosus protein expressing an immunogenetic epitope of antigen 5. //Mol. and Biochem. Parasitol. -1991. v. 45, N 2. -p. 233-240.

79. Faubert G. M. Antigenic character of parasitic organisms. Ill Parasite products in the regulation of the immune response. // Rev. Adv. Parasitol. Proc. 4-th Int. Congr. Parasitol., Warszawa, 19-26 aug. 1978. Warszawa, 1981.-P. 604-608.

80. Feng J.-J., Xiao S.-H., Guo H.-K, Shen B.-G., Xue H.-C. Isolation of germinal cells from the secondary cysts of Echinococcus granulosus harbored in mice.// Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases.-1992.-V.10,№2.-P.86-89.

81. Feng J.J., Wang J.Y., Qu J. A., Xiao S.H. ELIB of specific antigens in vitro cultivated cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus.// Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases.-1993.-V.ll, №1.- P.63-65.

82. Feng J.-J., Xiao S.-H., Guo H.-F., Shen B.-G., Jiao W. Screening antyhydatid drugs using cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus.// Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases.-1993.-1 l(№l):12-6.

83. Fiori P.L., Monaco G., Scappaticcis S., Pugliese A., Canu N., Cappuccinelli P. Establishment of cell cultures from hydatid cysts of Ehinococcus granulosus. // Int. J. Parasitol. 1988. - V. 18. - P.297-305.

84. Furuya K., Honnra H., Kumagai M. A cell line derived from larvae Echinococcus multilocularis. // Bull. Soc. Fr. Parasitol. 1990. -V.8, suppl. №>1. — P. 159.

85. Furuya K.// An istablished cell line of larval Echinococcus multilocularis.// Int. J. Parasitol., 1991,21,№ 2, 233-240

86. Garippa G., Varcasia A., Scala A. Cystic echinococcosis in Italy from the 1950s to present.// Parassitologia 2004, 46: 387-391,

87. Gonzalez G., Nieto A., Fernandez C., Om A., Wernstedt Ch., Hellman U. Two different 8 kDa monomers are involved in the oligomeric organization of the native Echinococcus granulosus antigen B. // Parasite Immunol. 1996. - V. 18, №12. - P.587-596.

88. Gottstein B., Eckert J., Fey H. Serological differentiation between Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis in man.// Z. Parasitenk.-1983.-V.69.-N3 .-P.347-3 56.

89. Haernandez A., Nieto A. Inducion of protective immunity against murine secondary hydatidosis.// Parasite Immunol. 1994. -V.16,№ 10. - P.537 - 544

90. Hariri M. N., Schvabe C. W., Koussa M. Host-parasite relationships in echinococcosis.XI. The antigens in the indirect hemagglutination test for hydatid disease.// Am.J.Trop.Med.-1965.-V.14.- P.592-604.

91. Harrison J.S., Parkhouse R.M.E. Antigens of Taeniid cestodes in protection, diagnosis and escapl. // Parasite Antigens Protect. Diagn. And Esape. 1985. — P.159-172.

92. Harrison L.J. & Parkhouse R.M.- Antigens of taeniid cestodes in protection. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1985, 120, 159-172.

93. Heath D.D. Resistance of Taenia pisiformis larvae in rabbits: Immunisation against infection using non-living antigens from in vitro culture.// Intern .J.Parasitology.-1976.-V.6.-P. 19-24.

94. Heath D.D. Immunobiology of Echinococcus infections. In The biology of Echinococcus and hydatid disease.// Allen & Unwin, London.-1986.- 164-188.

95. Heath D.D., Holeman B., Shaw P.J. Echinococcus granulosus: the mechanism of oncosphere lysis by sheep complement and antibody. // Int. J. Parasitol. 1994. - V.24, №7. - P.929-935.

96. Heath D.D., Lawrence S. B. Definition of a protective molecule against infection of sheep with Echinococcus granulosus.// 8th Int. Congr. Of Parasitol. 10-14 oct. 1994. Izmir-Turkey. Abstracts, V.l: 213.

97. Heath D.D. Immunology of Echinococcus infections. In Echinococcus and hydatid disease. // CAB International, Wallingford, Oxon.- 1995.- 183-232.

98. Heath D.D. & Holeman B- Vaccination against Echinococcus in perspective. // Acta trop., 1997. 67, 37-41.

99. Hughes D. L., Hanna R. E., Symonds H. W. Fasciola hepatica: IgG and IgA levels in the serum and bile of infected cattle// Exp. Parasitol.- 1981.- V. 52.- № 2.- P. 271-279.

100. Kagan I., Norman L. Antigenic analisis of Echinococcus antigens by agar diffusion techniques.// Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1961.- V. 10.- N5.-P.727-734.

101. Kagan I., Norman L. Analisis of helminth antigens . (Echinococcus granulosus and Shistosoma mansoni) by agar gel methods.// Ann. N. Y. Acad. Sci.-1963.-V.l 13.-P.130-53.

102. Kagan I., Agosin M. Echinococcus Antigens.// Bull. Wed. Heth Org. 1968, 39, 1, 13-24.

103. Kagan I., Norman L. Evaluation of Echinococcus antigens for the diagnosis of hidatid disease.// Rev. Iber. Parasitol., 1979, 39, № 14, 153-164.

104. Kaimal KP. Computed tomography in the diagnosis of pericardial cyst.// Am. Heart J. 1982; 103: 566-7.

105. Kammerer WS, Schantz PM. Echinococcal disease.// Infect Dis Clin North Am 1993;7:605-18.

106. Kanwar J.R., Kanwar R. Purification and partial immunochemical characterization of low molecular mass diagnostic Echinococcus granulosus immunogen for sheep hydatidosis.// FEMS Immunol, and Med. Microbiol.-1994.-V.9.-N2.-P.101-108.

107. Kreidl P, Allerberger F, Judmaier G, Auer H, Aspöck H, Hall AJ, Domestic pets as risk factors for alveolar hydatid disease in Austria. // Am. J. Epidemiol.- 1998.- 147: 978-981.

108. Kudrna K., Procopic J. Vaccination against cestodes review and prospect. // 2nd Int. Symp. Taeniasis, 2-7 Dec., Ceske Budejovice. - 1986. -P.46-55.

109. Lightowlers M.W. Cestode infections in animals: Immunological diagnosis and vaccination.// Rev. Sei.et ted. off. Int. Episoot.-1990.-V.9.-N2.-P.463-467.

110. Lightowlers M.W., Roife R., Ganci Ch. G. Taenia saginata: vaccination against cysticercosis in cattle with recombinant oncosphere antigens// Exp. Parasitol. 1996. - V.84, №3. - P.330-338.

111. Lightowlers M.W., Lawrence S.B., Gauci C.G., Young j., Ralston M.J., Maas D. Vaaccination against hydatidosis using a defined recombinant antigen.// Parasite Immunology. 1996. - V. 18, №9. - P.457 -462.

112. Lightowlers M.W., Heath D.D. Immunity and vaccine control of Echinococcus granulosus infection in animal intermediate hosts Parassitologia.- 2004.- 46: 27-31.

113. Lu J.H., Cheng W.X., Guo Z. M., Kong Ch. Q., Feng D.U., Li D.Ch., Guo J.M. et al. Cultivation of an Echinococcus granulosus larvae cell line// Chin. J. vet. Sci.-1998.-V.18, №5.-P.479-482.

114. Machnicka B. The common antigens of Cysticercus bovis and Taenia saginata. // Bull. Acad. Pol. Sei. Ser. Sei. Biol. 1974. - V.22, №3.-P. 197-199.

115. Macpherson CNL, Use of ultrasound in the diagnosis of parasitic disease.// Trop Doct 1992, 22: 14-20.

116. Mc Laren D. J. Disquse as an evasiwe stratagem of parasitie organisns. // Parasitology. 1984. - V.88, №4,- P.597 -611.

117. Mc Laren D. J., Terry R. J. Antiparasite vaccines.// Trans Roy. Soc. Trop. Med. Hyd., 1989, 83, № 2, 145-146

118. Mc Manus D.P. Characterization of taeniid cestodes by DNA analysis. // Rev. sei. et tech. off int epizool. 1990. - P.489-510.

119. Mandell GL, Douglas RG, Bennett JE, Dolin R. In: Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and practice of infectious diseases.// 5th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2000:2956-65.

120. Manweiler E., Thöle A., Leberer I. Beiträge zur Immundiagnostik der Echinokokkose des Menschen.// Zbl.

121. Bakteriol.// Paraziten K. Intektions Kraiikh und Hyg.// 1977.ABt. 1-Orig, A. 238, № 4, c.494-502.

122. Marcos Cidrera E., Torres Rodrigues J. M., Amaral Olivera M. Reacciones cruzadas entre sueros de enfermos de hidatidosis y un antigeno soluble de T. saginata; estidio inmunoelectro foretico.// Rev. Iber. Parasitol., 1984, 44, № 3, 253-263.

123. Mitchell G. H. A vaccine for ovine cysticercosis.// Vaccine, 1989, v 7, №5, 379

124. Mitchell G. F. Problems specific to parasite vaccines.// Parasitology.-1989. v 98.- p. 9-28

125. Monzon C. M., Coltorti E. A., Varela-Diaz V. M. Application of antigens from T. hydatigena cyst fluid for the immunodiagnosis of human hydatidosis.// Z. Parasitenk, 1985, 71, № 4, 533-537.

126. Movsesijan, M., and Z. Mladenovic. Active immunisation of dogs against Echinococcus granulosus.// Vet. Glas. -1970. -24:189193.

127. Movsesijan, M., A. Sokolic, and Z. Mladenovic. Studies on the immunological potentiality of irradiated Echinococcus granulosus forms: immunization experiments in dogs. // Br. Vet. J. -1968.-124: 425-432.

128. Murrell K. D., Despommier D. D. Immunization of swine against Trichinella spiralis.// Vet. Parasitol.- 1984.- V.15.- N 3/4.- P. 263-270.

129. Nisenbaum HL, Rowling SE. Ultrasound of focal hepatic lesions.// Semin Roentgenol. 1995.-30: 324-3346.

130. Onawunmi O.A., Coles G.C. Attempt tu immunise sheep with culture antigens of Taenia hydatigena.// Res. In. Veter. Sci.-1980.-V.29.-№ 1 .-P. 102-103.

131. Oriol R., Williams J.F., Perez Esandi M.V., Oriol C. Purification of lipoprotein antigens of Echinococcus granulosus from sheep hydatid fluid.//Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1971.-V.20.-P.569-574.

132. Osborn O J., Heath D.D., Roberts M.G. Vaccination of sheep against Taenia ovis. The response to various dose rates of antigens obtained by incubation of oncosperes in vitro. // Res. Vet. Sei., 1982,V. 32, №3,-P. 351-353.

133. Osborn P.J., Heath D.D. Immunisation of lambs against Echinococcus granulosus using antigens obtained by incubation of oncospheres in vitro//Res.Vet. Sci.-1982.-V.33.-P.132-133.

134. Pery P., Luffau G., Petit A., Charley J. Immunogenicity of phosphorylcholine bearing antigens.// 4th Inter. Congr. Parasitology, 19-26 aug.- 1978. Warshaw.-P. 130.

135. Play ford M.C., Ooi H.K., Oku Y., Kamiya M. Immunology: rodent intermediate Host models for alveolar echinococcus: biology and immunology.// Alveolar Echinococcosis Liver — Sapporo. 1993. -P. 33-49.

136. Pozzuoli R., Musiani P., Arm E., Piantelli M., Mazzarella R./Echinococcus granulosus: Isolation and characterization of sheep hydatid fluid antigens.//Exp.Parasitol.-1972.-V.32.-P.45-55.

137. Pozzuoli R., Musiani P., Arm E., Patrono C., Piantelli M. Echinococcus granulosus: evaluation of purified antigens' immunoreactivity.// Exp.Parasitol.-1974.-V.35.-P.52-60.

138. Pozzuoli R., Piantelli M., Perucci C., Arm E., Musiani P.// Isolation of the most immunoreactive antigens of Echinococcus granulosus from sheep hydatid fluid.// J.Immunol.-1975.-V.115.-P.1459-1463.

139. Rafiei A., Craig P. S. The immunodiagnostic potential of protoscolex antigens in human cystic echinococcosis and the possible influence of parasitic strain.// Ann. Trap. Med and Parasitol; 2002, 96, №4,383-389.

140. Rickard M.D., Bell K.J. Successful vaccination of lambs against infection with Taenia ovis using antigens produced during in vitro cultivation of the larval stages.// Res.Vet.Sc.-1971 (.-V.12.-N4.-P.401-402.

141. Rickard M.D., Adolph A.J. Vaccination of calves against Taenia saginata infection using a «parasite-free» vaccine. // Vet. Parasitology. 1976. - №1. - P.389.

142. Rickard M.D., White J.B., Boddington E.B. Vaccination of lambs against infection with Taenia ovis. // Austr. Vet. J. — 1976. -V.52.№5. -P.209-214.

143. Rickard M.D., Adolph A.J. Vaccination of lambs against infection with Taenia ovis using antigens collected during short-term in vitro incubation of activated T. ovis oncospheres. // Parasitology. -1977. V.75, №2. - P. 183-188.

144. Rickard M.D. The use of in vitro culture of Taeniid cestode larvae to collect antigens for immunization against infection. //4-th Intern.Congr. Parasitol. 19-26 Aug. 1978. Warsawa. Short Commun. Sect.-P.67.

145. Rickard M.D., Harrison G.B.J., Heath D.D., Lightowlers M.W. Taenia ovis recombinant vaccine-«quo vadit».// Parasitology.-1995.-V.110.-P.5-9.

146. Rothwell T. L. W., Merrit G. C. Vaccination against the nematode Trichostrongylus colubriformis. 2. Attempts to protect guinea pigs with worm acetylcholinesterase.// Inter. J. Parasitol.-1975. V. 5.-P. 453-460.

147. Sakamoto T., Yamashita J., Ohbayashi M. Studies of echinococcosis, XVIII, Observations on tissue cultured germinal cells of larval Echinococcus multilocularis.//Jpn. J. Vet. Res.-1967.-V.15-P. 75-83.

148. Sakamoto T. Development of echinococcal tissue cultured in vitro and in vivo.//Mem. Fac. Agric. Kagoshima Univ.-1978.-V.14.№23-P.109-113.

149. Sakamoto T., Kotani T.// Stadies on Echinococcus. XX. Preliminary observation of the in vitro cultivation of larval tissues of Echinococcus multilocularis in culture chamber of porous membrane.// Jap.J.Vet.Res.-l 967.-V. 15.-N4.-P. 165-170.

150. Sakamoto T. Observation on hystogenesis and serial passages of larval Echinococcus multilocularis in diffusion chamber inserted into the abdominal cavity.// XVII. Int. Congr. Of Hydatidology, 1995.-P.133.

151. SHI Zhiyun, WANG Yana, LI Zongji, MA Rui, ZHAO Wei.// Cloning, Expression, and Protective Immunity in Mice of a Gene Encoding the Diagnostic Antigen P-29 of Echinococcus Granulosus.// ActaBiochim Biophys Sin .-2009, 41: 79-85

152. Smith M.A. Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis: in vitro Culture of the Strobilar stages from Protoscoleces.//Angew.Parasit.-1979.-V.20.-P.137-147.

153. Smithers S., Terry R. The immunology of Schistosomiasis.// J. Parasitol.- 1969.- V. 7.- P. 41-95.

154. Stromberg B., Soulsby E. J. L. Heterologous helmunth induced resistance to Ascaris suum in guinea pigs.// Vet. Parasitol.- 1977.- V. 3.-№2.- P. 169-175.

155. Su D. M., Cao H. X., Wen B. I. Immunochemical analysis of hydatid fluid from different sources as diagnostic antigen in human hydatidosis.// Chinese Journal of Parasitic Diseasen Control, 1988, 1, № 1,29-31.

156. Tuerhong Ha. J., Zhang Z.Z., Zhang W.B., Hasyet Qi.P.S. Studies on immunization of sheep hydatidosis. //16th Int. Congr. of Hydatidol., Beijing, oct. 12-16, 1993. Beijing, China. 1993. -P.302.

157. Turcecova L., Kolarova L., Dubinsky P., Martinek K. Characteristics of antigens in tapeworms of the genus Echinococcus. //Helmintilogia.-1997.-V.34.- N3,- P. 188-189.

158. Turcecova L., Snabel V., Beladicova V., Dubinsky P. Genetic diversity of Echinococcus spp. In Slovakia.// Helminthologia, 2000, 37., 3: 178.

159. Varela-Diaz V. M., Coltorti E. A., Rickard M. D., Torres J. M. Comparative antigenic characterisation of Echinococcus granulosus and Taenia hydatigena cyst fluids by Immunoelectrophoresis. // Res. Vet. Sci.- 1977.- V.23, №2.-P.213-216.

160. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E. A microplate method of enzyme-linked immunosor bent assay and it's application to malaria. // Bull. Wld. Hlth. Org.-1974.-V.l, №2.P.209-211.

161. Wang P., Feng X. H. Analysis of antigenicity of Echinococcus granulosus cyst fluid from different hosts in Xinjiang.// 16th Int. Congr. of Hydatidology, Beijing, Oct. 12-16, 1993. Beiging, China, 1993:300.

162. Yarzabal L. A., Bout D. T., Naguira F. R., Capron A. R. Further observation on the specificity of antigen 5 of Echinococcus granulosus.// J. Parasitol., 1977, 63, № 3, 495-499.

163. Zhang L. H., Mc Manus D. P. Purification and N-Terminal amino acid sequencing of Echinococcus granulosus antigen 5.// Parasite Immunology, 1996, 18,№ 12: 597-606.

164. Zhang W, Zhang Z, Shi B, Li J, et al. Vaccination of dogs against Echinococcus granulosus, the cause of cystic hydatid disease in humans. Infect Dis 2006, 194(7): 966-974.

165. Zhu X. Q., Don L.Q., Shi X.H., Sun X.Q., Wang X.H., Niu B.H. Stadies on excretory-secretory (ES) antigens of Echinococcus granulosus: the immunogenicity of ES antigens of the protoscolex. // Chin. J. Vet. Sci a Technol., 1991(a).-V.21, №11.-P. 8-10.

166. Zhu X. Q., Don L.Q., Shi X.H., Sun X.Q., Wang X.H., Niu B.H. Stadies on excretory-secretory (ES) antigens of Echinococcus granulosus: the immunogenicity of ES antigens from oncosphere.// Chin. J. Vet. Sci a Technol., 1991(6). - V.21, №9. - P. 6-9.

167. Zhu X. Q., Dou L.Q., Shi X.H., Sun X.Q., Wang X.Q, Niu B.H. Stadies on excretory-secretory antigens of Echinococcus granulosus.// Int. Conf. on Parasitic Zoonoses, Sept. 20-24, 1994. Changchun, China, Abstracts 1994; 18-19.

Информация о работе

Сасикова, Марина Руслановна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.19

Диссертация

Физико-химическая характеристика клеточных антигенов эхинококков и разработка иммунопрофилактического средства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы