Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ, ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ ПРОТОСКОЛЕКСОВ ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ, ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ ПРОТОСКОЛЕКСОВ ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS"

На правах рукописи

Руднева Ольга Вячеславовна

ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ, ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ ПРОТОСКОЛЕКСОВ ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS

Специальность 03,00,19 — паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К .И. Скрябина (ВИГИС).

Научные руководители:

Доктор биологических наук Бережко В. К.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Бенедиктов Игорь Иванович кандидат биологических наук Андреева Галина Николаевна

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

заседании диссертационного совета Д 006Ж1.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС.

/Ъ

Автореферат разослан УОАД 2006 г.

Шй

часов на

Ученый секретарь диссертационного советг доктор биологических наук

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Диетный и альвеолярный эхинококкозы относятся к числу наиболее опасных гельминтозоонозов, представляющих серьезную угрозу для здоровья человека и являющихся актуальными для ветеринарной медицины. Распространение этих заболеваний за последние годы увеличивается по причине усиления урбанизации» возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальных условий жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля.

Невозможность ранней клинической диагностики ларвального эхинококкоза приводит к необходимости разработки и усовершенствования иммунологических методов, так как полученная с их помощью информация имеет не только диагностическое значение, но может служить также для оценки эпидемической и эпизоотической ситуации. Немаловажное значение для успешной борьбы и профилактики ларвальных цестодозов, как эхинококкозы, приобретает разработка иммунопрофпластических средств на основе специфических антигенов паразита н неспецифических иммуностимулирующих препаратов. Применение иммунопрофилактических средств позволяет значительно повысить сопротивляемость организма, снизить, а в некоторых случаях и предотвратить заражение животных. Проведение полноценных иммунодиагносшческих и

иммунопрофилактических исследований невозможно без наличия активных и высокоспецифичных антигенов, для получения которых в последние годы стали применять биотехнологические методы, к числу которых относится и клеточная технология. Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в искусственных питательных средах путем их многократного пассирования. В свете вышеизложенного актуальными представляются исследования по использованию клеточной технологии для получения антигенов протосколексов из вторичных ларвоцист Елпи1Шоси1ап5 разного возраста и их иммунологической характеристики.

Исходя из этого была поставлена цель - получить «клеточные» антигены из протосколексов Е.ти1Шоси1апз, выделенных из 2-, 4- и 6-месячных ларвоцист паразита, провести их иммунохимический анализ, оценить диагностическую эффективность и изучить протективные свойства.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить 2-, 4- и б-месячные ларвовдеты Е.пшШоси1апз, выделить клетки протосколексов и подобрать оптимальные условия их культивирования в искусственных питательных средах для получения клеточных метаболитов.

2) Провести отбор антигеноактивных серий клеточных^ метаболитов («клеточных» антигенов). Г™ "¡"к \ (-' Л

5 Ь^-Жя?

3) Собрать банк сывороток крови от животных и люден, зараженных E-granulosus, E.multilocularis, другими гельминтами и клинически здоровых.

4) Провести иммунохимнческий анализ полученных типов «клеточных» антигенов E.multiloctilaris в сравнении с соматическим экстрактом и 3-дневными экскреторно-секреторными продуктами культивируемых in vitro протоскодексов Е.multilocularis.

5) Оценить диагностическую эффективность иммукоферментвой реакция с «клеточными» антигенами разных типов при цветном эхинококкозе человека и животных.

6) Изучить протективные свойства «клеточных» антигенов E.mtütilocularis разного возраста в комплексе с иммуномодулятором работаном, а также с полным адъювантом Фрейнда при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе.

Научная новкзн^

Впервые иммунохимическнм анализом с различными антисы воротками установлено 1-2 идентичных антигенных компонента в «клеточных» антигенах протосколексов из 2-, 4- и 6-месячных ларвоцист ЕлггаМ ocularis, соматическом экстракте и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах культивируемых in vitro протосколексов паразита. Впервые на основании разработанных параметров постановки иммуноферменгной реакции со всеми типами «клеточных» антигенов протосколексов E.multilocularis проведена сравнительная оценка их диагностической эффективности при цветном эхинококкозе свиней и человека. Установлена чувствительность иммуиотеста при диетном эхинококкозе свиней соответственно 75,6; 73,3;73,3%; специфичность -68,9; 72,1; 69,6%; при цнетном эхинококкозе человека — 89,66; 89,66; 86,2%; и - 82,07; 86,2; 86,2%. Впервые изучены протективные свойства подученных «клеточных» антигенов протосколексов E.multilocularis в комплексе с иммуномодулятором риботаном и с полным адъювалтом Фрейнда при экспериментальном эхинококкозе. Эффективность защиты в первом случае составила соответственно 91,7; 91,7; 83,4%; во втором -80,0; 90,0 и 70,0%.

Практическая значимость

Материалы диссертационной работы Рудневой О.В. вошли в «Методику идентификации "клеточных" антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН.

В заявку на изобретение «Способ профилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатняоза)». Получено положительное решение на выдачу патента№2004129658/13(0323б6) от 11.10.2004г.

Установленная диссертантом иммунохимическнм анализом идентичность антигенов-метаболитов культивируемых в искусственной питательной среде клеток протосколексов E.multilocularis , выделенных из 2-, 4 - и 6-месячных ларвоцист паразита, доказывает экономическую

целесообразность использования в культуральной работе для получения «клеточных» антигенов эхинококков ларвоцнст Е.тЫЫосикш не более 3-4-месячного возраста, что позволит сократил, как срок содержания инвазированных экспериментальных животных, так и затраты на их кормление. Апробация работы.

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

1. Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (2002-2004гг).

2. Заседаниях Ученого Совета ВИГИС (2002-2005гг)

3. Секции «Инвазионные болезни животных «Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005г).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Культивирование клеток протосколексов, выделенных из ларвоцист £,пш1Шоси1ап$ 2,4 и 6 — месячного возраста, получение «клеточных» антигенов.

2. ИммунохимическиЙ анализ «клеточных» антигенов разного типа с использованием кроличьей гипериммунной сыворотки к соматическому экстракту протосколексов паразита, сыворотки человека с подтвержденным диагнозом цистяого и альвеолярного эхннококкоза и сыворотки экспериментально зараженных ЕлшМоси1ага крыс.

3. Оценка диагностической эффективности ИФР с «клеточными» антигенами Е.ши]й1оси1апз разного типа с сыворотками людей и свиней.

4. Протектнвные свойства полученных «клеточных» антигенов при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано б научных работ и 2 работы приняты к публикации.

Объем и структура лиссептапии. Материалы диссертации изложены на_

страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы

включает_источников, в том числе отечественных и_зарубежных

авторов. Работа иллюстрирована_таблицами и_рисунками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен анализ работ по антигенам эхинококков, их характеристике, диагностической эффективности и достижениям в области иммунодиагностики, а также обзор исследований по иммунопрофилактике ларвальных цестодозов, перспективность этого направления в плане создания антипаразитарных вакцин.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы

Получение инвазиеного материала. Для приготовления клеточной культуры из прото-сколексов Е. тикЦосиЗат использовали вторичные ларвоцисты альвеолярного эхинококка, которые выделяли от предварительно зараженных крыс-доноров. Гельмиитный материал для заражения крыс-доноров получали из НМПиТМ. Выделенными из вторичных ларвоцист паразита в стерильных условиях протосколексами и ацефалоютстами заражали крыс в дозе 4000-6000 экземпляров на одно животное внутрибрюшинно в физрастворе с антибиотиками.

Убой эксперимен-тально зараженных крыс проводила в сроки, предусмотренные целью наших дальнейших исследований, а также при необходимости заражения новой нарпш животных-доноров.

Получение вторичных ларвоцист К миШ1оси1агк 2, 4 и 6 — месячного возраста, приготовление первичной клеточной культуры протосколексов, проверка ее жизнеспособности. Работу с гельминтным материалом Е. лш1Шоси1ап$ проводили в стерильном боксе в ламинаре с вытяжкой. Ларвоцисты паразита 2, 4 и 6-месячного возраста получали от животных-доноров, отдельно измельчали ножницами или с помощью мясорубки до гомогенного состояния. Каждую порцию гомогената, полученную от разновозрастных ларвоцист Елт1й)оси1ап5, промывали стерильным физиологическим раствором (0,9%) хлористого натрия над мельничным газом с диаметром ячейки 0,3 мм. Фильтрат распределяли в цилиндры с коническим дном и отстаивали в течение 15-20 минут. Затем надосаяочную жидкость отсасывали резиновой грушей со вставленной в ее конец пастеровской пипеткой и заменяли свежим физиологическим раствором. Содержимое цилиндров взбалтывали путем пропускания воздуха из груши и после 10-15 минут отстаивания снова удаляли надосадочную жидкость и заменяли свежим физиологическим раствором. Эту операцию повторяли 5-7 раз, постепенно сокращая срок отстаивания с целью очистки протосколексов от обрывков выводковых капсул, а также от погибших протосксшексов, которые осаждаются с меньшей скоростью, чем живые. Для приготовления первичной клеточной культуры отмытый материал подвергали нежной гомогенизации в течение 5-7 мин в ручном гомогенизаторе с добавлением 0,5-1,0 мл стерильного физиологического раствора (0,9%) до получения однородной массы. Полученную гомогенную массу пропускали

Схема проведения экспериментальных исследований

;1 Выделение гротосмлекоо, пригогмлежв ялвгсцной «улиуры :

Ж"

КуЛЫМИр! иание оито!прото«олекс<я ЕлиШ искусственней петельной среде г-;'"'-

Ч Пол*чение тетин« мепошнгсв клепжпротосплеко»

♦ 1 ... . •

Иссладова^ийкпетсмньаыетаболип-овИйР, вьщьпение : % ■■':: 1 атгенваптньасерий' ^ /: ^

*

г -: ; Оцвнгадишоои«ш1й^фе1гивнош

ада ж.

и Прв1ер|пт*19Ж9^юцихс»ойт8ктгенозщ>ньк€сриА ; V ететшньд шге9япит»

через фильтры с диаметром ячеек 220,110 и 50 мкн, Процесс гомогенизации и отделения клеток повторяли 3-5 раз. Качество гомогенизации и определение жизнеспособности выделенных клеток проводили на предметном стсклс при увеличении микроскопа 20x10.

Полученную суспензию клеток помешали в стерильную центрифужную пробирку, добавляли физраствор с антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина) и центрифугировали при 1000-1200 об/миа в течение 5-7 минут. Процедуру отмывания повторяли не менее 5-7 раз. Жизнеспособность полученных клеток из протосколексов Е. тиШ1оси1ап5 проверяли в камере Горяева путем окрашивания 0,4% раствором трипанового синего при увеличении микроскопа 20x10 общепринятым методом. Культуры, содержащие не менее 85-37% жизнеспособных клеток, использовались в дальнейшей работе. Концентрацию клеток в суспензии для последующего культивирования доводили до б00-800тыс/мл.

Культивирование клеток протосколексов из ларвоцист Е.тиЫ1оси1аг1в разного возраста, получение клеточных метаболитов, оценка их антигенной активности, В качестве ростовой среды для культивирования клеток использовали искусственную питательную среду постоянного состава - ИРМЫ 640 с добавлением 2 мл глутамина и 8 мг геэтамшиша (4%) на 100 мл среды и 5% эмбриональной сыворотки плода крупного рогатого скота.

Клеточную культуру помешали в СОз-инкубатор с заданными параметрами температуры (37° С) и поступления газов (С0у5%) при 70%-й влажности для культивирования. Отбор клеточных метаболитов производили на 7-10 день культивирования в период формирования монослоя с помощью автоматической пипетки, причем после каждой манипуляции проводили замену наконечника. После отбора метаболитов культуры клеток пересевали в новую порцию питательной среды необходимого состава, подогретой в водяной бане до 37°С.

Процесс роста и пролифирации клеток в питательных средах контролировали под микроскопом. Поскольку получение полноценной популяции возможно только от культуры, состоящей из жизнеспособных клеток, то перед каждым пассажем проводили просмотр и оценку качества клеток в монослое. Для продолжения культивирования отбирали культуры, содержащие клетки, имеющие типичную для данной культуры морфологию с четко очерченными границами между клетками. Если в поле зрения регистрировали клетки с вакуолями, включениями и другими признаками шггапатологан, такие культуры для культивирования не применяли. Из планшетов с выросшим клеточным монослоем отбирали ростовую среду (клеточные метаболиты), а к оставшимся на пластике клеткам добавляли необходимое количество соответствующей ростовой среды, подогретой до 37°С.

Наличие специфических антигенных компонентов в метаболитах клеточных культур протосколексоа E.multilocularis устанавливали с помощью иммуноферментной реакции типа ELISA (Voller А, et al., 1974) с некоторыми модификациями применительно к нашим условиям. Реакцию проводили в полистироловых планшетах отечественного производства. Положительным контролем в реакции при отборе антигеноакшвных серий метаболитов клеток служили сыворотки убойных свиней с подтвержденным диагнозом естественной инвазии ^granulosus и сыворотки людей, зараженных E.granulosus и Е, multilocularis (диагноз подтвержден хирургически), а отрицательным - сыворотки свиней, у которых при вскрытии гельминтной инвазии не обнаружили, и сыворотки здоровых людей - доноров.

Антиген использовали в титре 1/2 и 1/4. Разведение осуществляли карбонатно-бикарбоиатным буфером (БКБ), pH 9,6. Сенсибилизацию планшета проводили при +4°С в течение 18-20 часов с последующим отмыванием несвязавшихся с полистиролом белков 0,05% раствором Tween-20 на дистиллированной воде три раза по 3-5 минут после каждого этапа реакции. Сыворотки крови разводили 1:100 в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7,2, с добавлением 0,05% Tween-20 и 0,05% бычьего сывороточного альбумина (БСА). В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови человека, а также антитела диагностические прошв IgG сыворотки крови свиньи, меченые лероксндазой. Разведение конъюгата проводили тем же буфером, что и сыворотки, увеличив концентрацию БСА в 10 раз. Планшеты с сывороткой и конъюгатом инкубировали при +37 °С в течение одного часа. В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин на нитратном буфере, pH 4.7, с добавлением стабилизированной перекиси водорода. Реакцию останавливали внесением в каждую лунку 50% серной кислоты в количестве 50 мкл. Оптимальные разведения всех компонентов (антиген, сыворотка и конъюгат), используемых в реакции, устанавливали опытным путем на основе максимальной разницы в оптической плотности между отрицательной и положительной контрольными сыворотками.

Учет реакции проводили на автоматическом анализаторе колориметрическом иммуноферментном 340/АТС фирмы SLT-labsistems (Австрия) при длине волны 492 нм. Пробу считали положительной,, если ее оптическая плотность превосходила значение оптической плотности отрицательного контроля в два и более раза. Оценку результатов проводили только в том случае, если в лунках с отрицательной контрольной сывороткой и без сыворотки (контроль конъюгата) окраска была слабо-желтая или отсутствовала,

Серии метаболитов клеточных культур, показавших хорошую антигенную активность с контрольными сыворотками, использовали в дальнейшей работе.

Контроль клеточных метаболитов на стерильность, безвредность, определение содержания белка

Контроль клеточных метаболитов па стерильность

Для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу «клеточного» антигена высевали на МПА, МПБ и МППБ по одной пробирке, а на грибковую контаминацию - на среду (агар) Сабуро в две пробирки. На микоолазменную контаминацию пробу «клеточного» антигена высевали на полужидкий агар (0,3%), приготовленный на ферментативном переваре бычьего сердца с 10% сыворотки лошади, 10% дрожжевого экстракта и 100 ЕД/мл пенициллина в две пробирки. Контроль вели в течение трех пассажей на этой среде. Посевы на МПА, МПБ и МППБ выдерживали в течение 10 суток при 37 "С, на полужидком агаре - 14 дней при 37 °С и на среде Сабуро - 15 дней при комнатой температуре. При обнаружении хотя бы одного из ко ягам ииантов партию считали нестерильной.

Контроль на безвредности, Испытания проводили на 10 белых беспородных мышах, не использовавшихся ранее в экспериментах. Для выявления посторонних вредных агентов каждому животному внутримышечно вводили «клеточный» антиген в дозе 0,5 мл. Наблюдение вели на протяжении 28 суток. «Клеточный» антиген считали безвредным, если на протяжении периода наблюдения животные оставались клинически здоровыми.

Определение содержания белкз, Концентрацию белка в клеточных метаболитах определяли на спектрофотометре СФ -26, ЛОМО, при длине волны 280 им.

В качестве контроля использовали питательную среду культивирования.

Иммупохими ческий анализ метаболитов («клеточных» антигенов ) культивируемых протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист К тиШ1оси!агк

Иммунохимический анализ «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцисг Е. тиМосЫат проводили реакцией иммунодиффузии (РИД) в 1%-ном агаровом геле (Шсо) в варианте «семерка», «пятерка», «тройка». РИД ставили по методу Гусева и Цветкова (1960) в модификации применительно к нашим условиям. Для анализа антигенного спектра исследуемых объектов использовали:

а) гипериммунную кроличью сыворотку к антигенам соматического экстракта протосколексов паразита;

Гипериммунную сыворотку получали от 2 кроликов, которых иммунизировали 3-х кратно подкожно с интервалом 2-3 дня возрастающими дозами соматического экстракта протосколексов Е.ти№1оси1ага с последующей внутривенной ренммунизацией, проведенной через 2$ дней после последней иммунизирующей дозы антигена. В общей сложности каждый кролик получил по 7,2 мг белка-антигена. Через 7-10 дней после

реиммунпзации у кроликов из ушной вены была взята кровь и приготовлена сыворотка.

Активность пптериммунной сыворотки предварительно проверяли

ИФР.

б) сыворотки пациентов с хирургически подтвержденным диагнозом цветного и альвеолярного эхинококкоза приобретали из 24-й клинической больницы г-Москвы.

с) сыворотки от экспериментально зараженных Е. multilocularis белых крыс нам предоставил д.мл. Коваленко ФЛ.

Исследование «клеточных» антигенов протосколексов из

разновозрастных ларвоцист Е. multilocularis иммуно фермен тной реакцией (ИФР)

а) с сыворотками свиней;

Отобранные в процессе культуралъной работы антигеноакгивные серии клеточных метаболитов («клеточные» антигены) протосколексов из 2, 4 и 6-месячных ларвоцист Ejnultilocularis были оценены иммуиоферменшым методом (типа ELISA) на твердой фазе в непрямом варианте определения ашктел к антигенам эхинококка однокамерного в сыворотках убойных свиней. Исследовали 135 и 124 сыворотки свиней, приобретенных в Московской и Саратовской областях. В состав этих сывороток входило 45 с подтвержденным при вскрытии диагнозом цветного эхинококкоза, 90 и 79 проб or инвазированных другими гельминтами и клинически здоровых животных без видимой патологии.

б) с сыворотками людей.

Сравнительную оценку отобранных «клеточных» антигенов протосколексов, выделенных из 2, 4 и б-месячных ларвоцист E.muItiJocuIaris, провели иммунофермеетным тестом типа ELISA с сыворотками людей, приобретенных из 24-й клинической больницы г.Москвы и из НИИ эпидемиологии в микробиологии им. Н.ФХамалеи. Дня анализа использовали 60 проб сывороток, в том числе 29 проб с подтвержденным хирургически диагнозом цисшого и 2-альвеолярного эхинококкоза, 2 пробы от пациентов с серологически подтвержденной инвазией токсокароза «larva migrans»; 2 — трихинеллеза (Т.spiralis) и 25 проб сывороток от клинически здоровых доноров.

ИФР ставили по стандартной методике Voller et al., (1974), предварительно определив оптимальное разведение «клеточных» антигенов и титр конъюгата на основе максимальной разницы в проявлении реакции (по оптической плотности) между положительной и отрицательной контрольной сывороткой, В качестве конъюгата при анализе сывороток свиней использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови свиней, меченные пероксидазой, а при работе с сыворотками людей -антитела диагностические против IgG сыворотки человека, меченные пероксидазой.

Изучение илшунопрофилакти ческих свойств «клеточных» антигенов при вторичном альвеолярном эхинококкоземышей в комплексе а) с иимуномодулятором риботаном:

Непосредственно перед проведением экспериментов па лабораторных животных- моделях определяли необходимое количество иммунизирующей дозы «клеточных» антигенов Е.тиШосЫапБ (по белку) в объемном выражении и смешивали с рассчитанной согласно инструкции дозой иммуномодулягора риботана. Приготовленные партии иммунопрепаратов, представляющих собой смесь «клеточных» антигенов протосколексов из вторичных ларвоцист Е.тиШ1оси1ат 2,4 и 6 - месячного возраста (отдельно каждый) и риботана, использовали в эксперименте по изучению их протектнвных свойств при вторичном альвеолярном эхинококкозе на мышах. Разовая иммунизирующая доза иммунопрепарата составляла 0,2 мл (80 мгк белка) «клеточного» антигена и 5 мкл риботана. Диалогичный иммунопрепарзт был приготовлен также из 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов паразита, который использовали как базовый контрольный. Опыт провели на 120 белых беспородных мышах, массой 18-20г, распределенных на 10 равноценных групп по 12 мышей в каждой.

Первые 4 группы мышей получили 3-кратпо подкожно с интервалом 10 дней по 0,2 мл иммунопрепарата из соответствующего «клеточного» и экскреторно-секреторного антигена и 5 мкл риботана, последующие 4 группы были иммунизированы аналогично такой же дозой соответствующих испытуемых антигенов без иммуномодулягора риботана, 9-я группа животных получала только дозу нммуномодулятора и 0,2 мл стерильного физиологического раствора, з 10-я группа - контрольные мыши, иммунизации не подвергались, им вводили по 0,2 мл стерильного физиологического раствора.

Через 14 дней после последней иммунизирующей дозы все подопытные мьшш были заражены инвазявным материалом Е.ти1Шоси1апз в дозе 200+20 экз. протосколексов и ацефалоцист. Убой подопытных животных и оценку протективной эффективности «клеточных» антигенов проводили на 70-й и 90-й дни после заражения. б) с полным адъюеаитом Фрейнда.

Аналогичный эксперимент по оценке иммунопрофилактических свойств «клеточных» антигенов протосколексов из 2,4 и 6-месячных ларвоцист паразита провели с использованием в качестве иммуностимулирующего средства полного адьюванта Фрейнда (ПАФ). Перед началом эксперимента произвели расчет необходимого количества каждой партии «клеточного» антигена из протосколексов Е.тиШ)оси1аш в объемном выражении и тщательно перемещали с ЛАФ (в соотношении 1:0,5) до получения гомогенной массы. Расчет вели по белку таким образом, чтобы каждое иммунизированное животное получило по 0,2 мл приготовленного иммунопрепарата, содержащего 80 мкг белка-антигена.

Опыт провели на 70 белых беспородных мышах, массой 18-20 г, распределенных на 7 равноценных групп по 10 животных в каждой группе. Иммунизацию мышей проводили 3-кратно подкожно с интервалом 10 дней.

Первые три труппы мышей получили подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней иммунопрепараты, приготовленные из «клеточных» антигенов протосколексов 2,4 а 6 - месячных ларвоцист Е.ши1й!оси1апз в смеси с ПАФ соответственно. Четвертая, пятая и шестая группы мышей были иммунизированы таким же образом «клеточными» антигенами протосколексов из разновозрастных ларвоцист ачьвеолярного эхинококка в той же дозе, но без ПАФ, седьмая контрольная груша животных иммунизации не подвергалась. По истечении 14 дней всех подопытных мышей заражали подкожно инвазивным материалом £.пш1Шоси1ат в дозе 200+20 протосколексов и ацефалоцист.

Убой и оценку пммунопрофнпактического эффекта проводили в те же сроки, что и в первом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований показали, что но все серии клеточных метаболитов содержат антигеноактивные компоненты. Антигенную активность установили в 20 (90,9%), 24 (91,6%) и 25 (78,1%) сериях клеточных метаболитов протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист Е.тиМоси1ап$ соответственно. Концентрация белка в «клеточных» антигенах протосколексов составила 2175, 4600 и 3500 мкг/мл соответственно.

Анализ результатов иммунохимических исследований (табл.1), проведенных реакцией иммуиодиффузии (РИД) с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки к антигенам соматического экстракта протосколексов Е.ти1Шоси1аш, показал в гомологичной системе не менее 56 комплексов антигеы-антжело, которые проявлялись в основном четкими линиями преципитации.

Таким образом, соматический экстракт протосколексов, судя по РИД, имеет в своем составе не менее 6 антигенных компонентов (эпитопов), способных стимулировать синтез антител у иммунизированных им кроликов.

Аналогичные исследования, проведенные с «клеточными» антигенами из протосколексов, выделенных из 2, 4 и б-месячных ларвоцист паразита и этой же антисывороткой, позволили выявить не более 1-2 комплексов антиген-антитело. Причем представляющие эти комлексы линии преципитации были четкими и показали реакцию идентичности с таковыми в гомологичной системе реакции.

В варианте «пятерка», где в центральную лунку вносили сыворотку человека с подтвержденным диагнозом цистного эхинококкоза, а по периферии - соматический экстракт протосколексов, 3-дневные экскреторно-секреторные продукты

Таблица It

Иммушитмический анализ «клеточных» антигенов протосколексов E-multilocuiariz.

число комплексов антиген-антттоао в реакции ммъетводиффузнщ

аягигеяы

№ ц/о сммротта ^icipair прогоосо декюв e.multuo-culans j-двсвные экскреторво-софе-торные продугш nponxxo* деютв e.innffflo-cubrís «клеточный» аг прогосишек-совю2-ммлчгак ларвопнет e.nmltilocularis «k.ieiomhuft» аг upotocwjkjkjt- сое из 4-мссячиых дарвинист fmultiloculnri s «клеточные» аглз протосколексов 6-месачнмх aapborcurt e.mumlociü «ris

1. кродичь* пгоеркмаущ&я (а) 5 1-2 1-2 1-2 1

2. кролнчь* гкисрякмуня&я (s) 6 2 2 2 1-2

3. цнстный jxhmikokrai (человек) 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2

4. альаеохфни! (человек) 1 1 1 1-2 1

5, альвеолярный эхгокигоиоз (крыса, экеи. зараденве) 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2

примечания: аг - антиген

культивируемых m vitro протосколексов паразита и «клеточные» антигены протосколексов, выделенных из 2, 4 и б -месячных вторичных ларвоотст E.multiloctilaris, в РИД выявили не более двух комплексов антиген-антитело. Линии преципитации, представляющие эти комплексы в агаровом геле с сывороткой больного цветной формой эхинококкоза, имели более диффузный характер в сравнении с реакцией, наблюдаемой с гипериммунной сывороткой

Аналогичный вариант реакции провели с сыворотками экспериментально зараженных E.multil ocularis крыс, где также регистрировали не более 1-2 комплексов антиген-антитело. Полученные нами данные подтверждают мнение исследователей иммунологов об отсутствии корреляции между числом потенциальных и функциональных антигенных компонентов.

Оценка диагностической эффективности «клеточных» антигенов протосколексов Е.тиШ1оси1агЬ из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист при цистном эхинококкозе свиней и человека. а) при эхинококкозе свиней

Результаты иммуноферментного анализа «клеточных» антигенов из 2-месячных протосколексов паразита, представленные в табл.2, показали, что из 45 проб сывороток инв аз иро ванных эхинококками свиней 34 прореагировали положительно, а 11 - отрицательно. Таким образом, чувствительность теста с этим антигеном составила 75,6%, а специфичность -68,90%

Таблица 2.

Диагностическая эффективность «клеточного» антигена протосколексов из 2-месячных ларвоцист Е,тиШ1оси1аг1$ при устном эхинококкозе свиней.

№ п/п Исследуемые сыворотки крови свиней. Кол-во проб «Клеточный» АГ протосколексов из 2-месячных ларвоцист Emultilocularis

Результаты ИФР*

+ - 4.%

1 Ипвазированн ые E.grenulosus 45 34 11 75,6%

2 Инвазированные другими гельминтам« и клинически здоровые 90 28 62 68,9%

примечания: ифр - ишоиофермапкн реакши г аг-антиген

«ч» - чувствитедьаость «с» - специфичность

- положительный результат «-» - отрицательный результат

Аналогичные исследования, проведенные с «клеточным» антигеном протосколексов из 4- и 6-месячных ларвоцист Ejnuttilocularis, со 124 сыворотками крови свиней, представленные в табл.3 и 4, показали следующие результаты: из 45 проб сывороток крови свиней, инвазированных E.granulosus, в 33 реакция с обоими антигенами была положительной, в 12 -отрицательной. Таким образом, чувствительность ИФР с этими антигенами составила 73,3%.

Таблица 3.

Диагностическая эффективность «клеточного» антигена протоскалексоч из 4-месячных .шрвоцист Е.тиШ1осикв-1ч при цистно.ч эхинококкозе свиней.

№ п^я Исследуемые сыворотки крови свиней. Кол-во гтроб «Клеточный» ЛГ протосколексов из 4-месячных лар вопиет Е.ти1Шоси1ат

Результаты ИФР*

+ - Ч,% с.%

1 Ин базированные 45 33 12 73,3%

2" Инвазиро ванные другими гельмиктячи к клинически здоровые 79 22 57 72,1%

примечаыиг ифр - нммуноферментазя реакция аг-8тнтсн «ч» • чувствительность «с» - специфичность «+»- положительный результат - отрицательный результат

Таблица 4.

Диагностическая эффективность «клеточного» антигена протосколексое из 6-месячных щтсщист Е.тиШоси!шпри цистиом эхинохокказе свиней.

№ п/п Исследуемые сыворотки крови свиней. Кол-во проб «Клеточный» ЛГ протосколексое из 6-месячных ларвоцист Е.тиМ1оси1ал5

Результаты ИФР*

+ - 4,% С,%

I Инвазиро ванные 45 33 12 73,3%

2 Инвазиро ванные другими гельминтами и клинически здоровые 79 24 55 69,6%

примечания; ифр - иммуноферметна» реакция аг- антиген «ч» * чувствительность «с» - специфичность «+» * положительный результат «-»- отрицательный результат

В то же время оценка специфичности этих антигенов, проведенная с 79 пробами сывороток крови свиней с другими инвазиями и клинически здоровых, несколько различалась.

Так, с «клеточным» антигеном из 4-месячных протосколексов паразита 57 проб сывороток прореагировали в ПФР отрицательно, что составило 72,1% специфичности. С «клеточным» антигеном из 6-месячных л ар вопиет E.multilocutaris отрицательная реакция была зарегистрирована в 55 случаях, что соответствует специфичности 69,6%.

б) при эхинококкозе человека

Исследования, проведенные с сыворотками крови людей (табл.5) в количестве 60 проб, в том числе с сывороткой крови пациентов с подтвержденным диагнозом цистного (29 проб) н альвеолярного эхинококкоза (2 пробы), трихинеллеза (2 пробы), токсокароза «larva migrans» (2 пробы) и клинически здоровых доноров (25 проб) показали следующие результаты: из 29 проб сывороток крови пациентов с диагнозом цистного эхинококкоза с «клеточным» антигеном протосколексов из 2-месячных ларвоцист 26 прореагировали положительно, 3 - отрицательно. Таким образом, чувствительность теста в этом случае составила 89,66%. С обоими сыворотками крови пациентов с альвеолярной формой эхинококкоза реакция была положительной, что соответствует 100%-пой чувствительности.

С сыворотками крови пациентов с гетерологачнымн инвазиями и клинически адоровых-доноров результаты анализа были следующие: при трихинеллезе из 2 сывороток одна показала положительный результат, при токсокарозе «larva migrans» из 2 также одна прореагировала положительно, а из 25 проб сывороток крови клинически здоровых пациентов положительную реакцию регистрировали в 3 случаях (12,0%). Специфичность ИФР без учета данных по альвеолярному эхинококкозу, таким образом, составила 82,07%. Аналогичный анализ, проведенный ИФР с этим же набором сывороток крови людей и «клеточным» антигеном протосколексов из 4-месячных ларвоцист E.mul til ocularis показал такую же чувствительность теста 89,66%, поскольку из 29 проб сывороток крови больных цистной формой эхинококкоза положительную реакцию регистрировали в 26 случаях.

Судя по результатам иммуноферментного анализа с сыворотками крови пациентов с гетерологичными инвазиями и клинически здоровых доноров специфичность теста составила 86,2%.

ИФР с «клеточным» антигеном протосколексов из б-месячкых вторичных ларвоцист паразита и тех же сывороток крови пациентов показала чувствительность и специфичность 86,2%. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что клетки протосколексов, выделенных из разного возраста ларвоцист E.muitilocularis, при культивировании в искусственной питательной среде при оптимально подобранных условиях активно растут и размножаются, выделяя в среду обитания антигеноаюивные продукты метаболизма, имеющие диагностическое значение.

Таблния 5.

Сравнительная диагностическая эффективность *клеточных* антигенов из протосколексов яареоцист Е. тиШЬЫапх разного

возраста при цистном эхинококкозе человека.

Рм£льтагь| || ФР*

Группы людей, Пробы сывороток Кол-во гроб Клеточный АГ прото-схоясксов ю 2-месячных ларвоцисгЕ. пшНИосиЗап^ Клеточный АГ прото-схолскиэв из 4-мссячных ларвоцисг Б. пшНйосиЫз Клеточный АГ протосколексов из 6-мссячных ларвоцистЕ, ти№1оси1ат

+ _ 4% С% + - 4% С% + - 4% с%

Эхинококков цн сгний 29 26 3 89,66 82,07 26 3 89,66 86,2 25 4 86,2 86,2

Эхииококкоз альвеолярный 2 2 - 100 г - 100 2 - 100

Трихинеллез 2 1 1 1 1 1 1

Токсокароз "1ат гги£пиш" 2 1 1 1 1 1 1

Клинически здоровые доноры Итого 25 60 3 22 2 23 2 23

Примечания: ИФР-иммуноферментная реакция #4» - ч}<вствителъностъ «С» ' специфичность АГ- антиген

- положительный результат

- отрицательный результат

Сопоставимость полученных нами данных в диагностических исследованиях со всеми испытанными антигенными препаратами сведетельствует о том, что набор антигеноакгивных компонентов в клеточных метаболитах протосколексов из разновозрастных ларвоцист E.multilocularis практически не отличается, поскольку разница в чувствительности и специфичности иммунотеста с этими антигенами была незначительной.

Изучение иммун о про фил акти ческих свойств «клеточных» антигенов протосколексов при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе мышей

а) в комплексе с иммуномодулятором риботаном Анализ результатов этих исследований мы провели на 90-Й день после проверочного заражения экспериментальных животных.

Суммирование полученных нами данных, представленных в таблице б, свидетельствует о том, что наибольший эффект защиты достигался при иммунизации мышей специфическим антигенным препаратом в комплексе с иммуностимулятором риботаном (группы I, III и V табл. 6,).

В первой группе мышей, иммунизированных "клеточным1 антигеном протосколексов из 2-месячных ларвоцист паразита в комплексе с риботаном, только у одной мыши при вскрытии в печени обнаружили ларвоцисты Ejmiltilocularis, размером менее 1,5 мм в диаметре без инвазивных элементов. Аналогичный результат регистрировали в 3-й группе, мыши которой были иммунизированы таким же антигеном протосколексов, выделенных из 4-месячных ларвоцист альвеолярного эхинококка. Таким образом, в этих группах был отечен самый высокий защитный эффект (91,7%). № 12 мышей 5-й группы, иммунизированных "клеточным" антигеном протосколексов из 6-месячных ларвоцист паразита с риботаном, у 2 были обнаружены в печени единичные, мелкие без зародышевых элементов, ларвоцисты, что повлияло на протективный эффект и снизило его до 83,4%.

Что касается мышей, которых иммунизировали только антигенными препаратами, без иммуномодулятора (группы 2,4,б,табд 6), то эффективность защиты у них не превышала 75% (2,4 группа) и 66,7% (6 группа). В этих группах, как правило, у 3-4 подопытных мышей регистрировали единичные ларвоцисты паразита без зародышевых элементов в отличие от таковых, обнаруженных у контрольных животных, не подвергавшихся иммунизации. У последних многочисленные ларвоцисты находили в брюшной полости и во всех внутренних органах, размером до 25 мм в диаметре с развившимися протосколексами. Большинство контрольных мышей погибло до момента вскрытия.

Таблви* 6.

Прогпехгяивные свойства «клеточного» антигена (КлАГ) протоскадексш из 2-, 4 и б' месячных ларвоцаст К. тиЫ1оси1аг1з в комплексе с иммуыанодулятором риботаном при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе мышей.

Номере пМ Каш. честно ММШСЙВ гругав Иммунизирующее средство, бета* Два мрстення,»* Ж) Кси-во ШНХС2 жткпньк, Эффектов ВКЯЪ зшаяы, К Примечание

I .. 11 КлЛГ2-и«. 80 ысг (0.2мл ) + ри6отан5 м*г 200 £20 1(8,33 М) «1.1« V омноймьппк обнаружен» единичные ларнщксты в печет без иквазивиых элемзгтт.

П I! Кл АГ2-МСС. «0 мхг (ОЛт ) +■ р-р 5 ьгег 200 + 20 3(25,0%) 71,0% У трех мышей обнаружены нарвсцисгы 1.5-2 мм в «квиетре, заролшпевые элементы отсутствовали.

ш 12 Кд АГ4-КМ-80 мкг (0,1мл ) иг 200+20 91,7« V двух мышей регистрировали очяь ммгеие «янннчвыв, вез 5ира*мкиых пом™ лмроцнпы в печои

IV 12 Ю1АГ4.ИЖ. шг {0.2мл ) + фцз р.р 5 мкг 200 + 20 3(25,0«) 75,0« У трех мышей регистрировали во внутренних органах дирводиоты паразита без зародашкящх эвеисщо»

V 12 КлАГ 6-мах 80м>г(0-2мз) + рибаетан 5 мкг 200 + 20 2(16.6%) »3,4% У трех мышей регасгрнровыи ыелгке, слипчныс .тавреоиепд. бе инвазионных элииапов.

VI 12 К1ЛГ2-М0С. 80 юг (ОЛю ) + фю. р-р 5 мкг 100 + 20 4(33.3%) 66.7% У четырех мьшкЯ обааружвы лавроасисты да 2мм о днвмегре; зародышевые злемогш отсутствовали

VII 12 ЭСП801ЛГ (0.2 д)+ риСсглн 5 юсг 200 + 20 3(25,0%) 75.0« Впскэд трех мыпкй регистрировали оаврацьлты 0,5-2,5 в дваиетре, заредышевые хгсмеит етсугстоонли

та 12 ЭСП80 иг (0Дд)+фю.р-р; мп- 200 + 20 5(41.7%) В печени к бркчшюв полости пяти мшгкК обнаружим лавроцветы Оез зародышевых элементов.

и 12 Фт. р-р (0,2 + рибапк 5 мкг 200 + 20 10(83,34} 16.7« У болытаетва заразившие* ыытеЯ регистрировали лавроивсш с яродишевыки злимоггамн в С^исмтюй тюгосгн и & печея»

X 12 Фю р-р 0,2 м.) 200 + 20 12(1 ООН) - Вое мыши яразишкь, лавронксты ¡1.1 15-25 мм в брюшной полосга и »а внутренних органах Прогоскдеиами

Примечаю»: «Ка*АГ Е,го ~4Фкгочный»анп1гаЕЫ1шососсиэши№1йси1аги

«КпнЛГЕ,т +Р - «ьмтичный» ипиген СсГшзскхжш; ти1йЬси1алэ + рибогад ЭСП -жчктерно-секреторные продукты.

Подопытные животные, получившие в качестве иммунизирующего препарата только иммуностимулятор риботан (группа 9), как показали результаты вскрытня, оказались в большинстве зараженными. У 10 мышей из этой труппы регистрировали многочисленные достаточно больших размеров ларвоцисты с зародышевыми элементами паразита и только у 2 (16,6%) такие поражения отсутствовали. В качестве базового антигена в иммунопрофилактических исследованиях мы использовали 3-дневные экскреторно-секреторные продукты (ЭСП) культивируемых протосколексов E.muMocularis, которые также вводили мышам в комплексе с рнботаном (группа 7) и без него (группа 8), В результате этих исследований установили, что защитный эффект в первом случае составил 75,0%, во втором - 58,3%.

Таким образом, использование всех типов антигенов в комплексе с иммуномодулятором рнботаном оказывало наибольший защитный эффект и предохраняло больше животных от последующего проверочного заражения.

Полученные нами данные позволяют сделать предварительное заключение, что «клеточные» метаболиты протосколексов Echinococcus multilocularis, выделенные из 2-, 4- и 6- месячных ларвоцист паразита, имеют в своем составе антигены, обладающие защитными свойствами.

б) в комплексе с полным адьювантом Фрейнда Аналогичные исследования по оценке протективных свойств "клеточных" антигенов протосколексов из разновозрастных ларвоцист альвеолярного эхинококка мы провели также в комплексе с полным адьювантом Фрейнда (ПАФ), Полученные результаты, представленные в табл.7, явились убедительным подтверждением данных первого эксперимента с иммуномодулятором риботаном о наличии в "клеточных" антигенах протосколексов из разновозрастных ларвоцист E.multilocularis иммунопрофилактнческих компонентов, способных в значительной степени предохранять иммунизированных ими животных от последующего заражения. Убой экспериментальных мышей, проведенный на 90-й день после проверочного заражения, показал, что животные, иммунизированные "клеточными" антигенами протосколексов из ларвоцист альвеолярного эхинококка 2,4 и 6-месячного возраста в комплексе с ПАФ (группы 1,2,3), в большинстве своем оставались свободными от инвазии. Эффективность защиты составила 80,0; 90,0; 70,0 %. Причем у мышей этих групп, у которых регистрировали единичные ларвоцисты без инваэивных элементов, отметили существенные различия в сравнении с контрольной группой, не подвергавшейся иммунизации. У последних, как правило, в эти же сроки убоя регистрировали многочисленные ларвоцисты паразита в печени и в брюшной полости, довольно значительных размеров (15-20мм в дм) с большим числом инвазивных элементов. В последующих трех группах (4:5,6) мышей, иммунизированных теми же «клеточными» антигенами протосколексов паразита без адьюванта, защитный эффект к проверочному заражению проявился слабее и был в пределах 50-60%. Однако и в этих группах заразившиеся мыши отличались от контрольных, не подвергавшихся предварительной иммунизации, как по количеству обнаруженных у них

ларвоцист эхинококка, так и по их размерам и наличию инвазивных элементов.

Таблпщ 7,

Протективные свойства «клеточного» антигена (КлАГ) протосхояексоя из 2, 4 и б-месячных зарвоцист Е. тиШоси!агЬ в комплексе спачным адьювантом Фрейнда (ПАФ) при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе мышей.

Номер* и/о Коли -чество мышей в труиие Иммунизирующее средство, дпи'мкг боги* Доте мрмжеива,** эо Коя-во ЗарВЗПЬ-ИПСТСЯ животных Эффектней- ость защит, % Примечание

I 10 Кя АГ2-Ч6С. 80ИЫ- + ПАФ 200 + 10 2(20«) 80« У шухмытей обнаружены лавроцвсты да 1,5 им в диаистре, бга янвдоиннныч элементов

В 10 К.чАГ4-мес. «Омгг + ПЛФ (0.2ыл) 200 + 20 1(10,0%) 90« Лавроцнет паразита регветр^фовояи у ОЛГЮ0 миош. Онн мелкие, без зародмпгепых теистов

Ш 10 Кл АГб-мее. 80 нхг (0.2мл) + ПАФ 200 +20 300«) Угрехыышсй регистрировали ловроттисти в брошки полост

IV 10 Кл ЛГ 2-ыес. 8Омп-(О.2ш0 200 +20 5(50,0%) 50« Половит мышей в труппе быля инлгаф0ваяы,та1Ь10у одно! «алан в шрвоивепа овнаружлы нлвдоюттые гаедект.

V 10 КяАГ4-мес. 80 и*г (0.2мл) 200 + 20 4(60,06%) 60% У четырех мьгакб этой груты регистрировали едоничлме, мелкие шрвопястн, без зародглквт эдемеЕГгов

VI 10 КлЛГб-мес, 80мжг (0.2ш|) 200 + 20 4(40,0«) 60% У лещрек мышей ва&лены мяопяиеяешп« иикве, бе) икваэиовЕых эдемевгтое лавроцветы

VII 10 Фнчкоя р^-р (ОДмл) (сантропь) 200 + 20 юиоотц - Заразились все мыши. Мвиичнсисиюи яа1фсчсисты в&Швны в лечепн, в броппюй полости, 15-20 цем в диаметре, в большинстве сдоеч сформировавшиеся протосюлетсы

* - нммуюсзвцва З-крггааа, кшсрьал 10 двсй

" - заржите через Л «ней пооле лоспедигй иммунизапки

Убой экспердонтг&льцых жявагндо через 40 дней после ироверочного ^арйжешш

Полученные предварительные обнадеживающие результаты дают основание продолжить исследования в этом направлении, уделив наибольшее внимание отработке дозы вводимых антигенов, способу введения и кратности.

Немаловажное, а возможно и основное значение имеет интервал между иммунизация ми, поскольку отдаленные сроки введения антигена после первичного иммунизирующего цикла оказывают нммунизаторное воздействие на организм с оптимально завершенной перестройкой иммунологической реактивности и поэтому вызывающей максимальный эффект. Однако получение максимального иммунизирующего эффекта находится в зависимости от подготовительной иммунизации. При введении в организм больших доз антигена или частом антигеном раздражении можно получить обратный эффект.

ВЫВОДЫ

1). Проведено культивирование клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист E.multüocularis 2-,4- и 6- месячного возраста, получены антигены клеточной культуры («клеточные» антигены) с содержанием белка 2175 мкг/мл; 4600мкг/мл и 3500мкг/мл соответственно.

2). Реакцией иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле проведен иммунохимический анализ «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и б - месячных вторичных ларвоцист Б. multilocularis с кроличьей гипериммунной сывороткой к антигенам экстракта протосколексов паразита, сывороткой экспериментально зараженных Е. multilocularis крыс и сывороткой человека с подтвержденным диагнозом цистного и альвеолярного эхинококкозов н установлено наличие в них идентичных антигенов.

3). В гомологичной системе РИД {гипериммунная кроличья сыворотка х экстракт протосколексов Е. multilocularis) выявлено не менее 5-6 комплексов антиген-антитело; между этой же антисывороткой ы антигенами клеточной культуры протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis проявлялась не более 1-2 комплексов антиген-антитело, представленных в РИД идентичными полосами преципитации.

4). Установлено наличие в «клеточных» антигенах протосколексов 2,4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis диагностического антигенного компонента, способного выявлять специфические антитела в сыворопгках экспериментально зараженных Е .multilocularis крыс и сыворотках больных циста ой и альвеолярной формой эхинококкоза.

5). Проведена сравнительная оценка диагностической эффективности «клеточных}) антигенов протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis иммуноферментной реакцией при цистном эхинококкоэе свиней; установлена чувствительность и специфичность теста 75,6; 73,3 и 73,3% и 68,9; 72,1 и 69,6% соответственно.

6). Диагностическая эффективность ИФР с «клеточными» антигенами протосколексов то 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis при цистном эхинококкозс человека составила соответственно 89,7, 89,7 и 86,2% по чувствительности и 82,07,86,2 и 86,2% по специфичности.

7). Изучены иммунопрофилахгические свойства «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е.

тиМосЫага в сравнении с 5-дневными экскреторно-секретоными продуктами культивируемых протосколексов паразита при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе мышей. Эффективность защиты составила 75,0; 75,0, и 66,7%; 58,3% соответственно. Показано усиление иммунной защитной реакции под действием ««клеточных» антигенов протосколексов в комплексе с иммуиомодуяятором риботаном и адъюваитом Фрейнда.

8). Установлено, что 3-кратная подкожная иммунизация мышей «клеточным» антигеном протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. тЫШосЫагк в комплексе с иммуномодулятсром риботаном (доза 80 мкг белка и 5 мкл рнботана), предохраняла большинство мышей от заражения инвазивным материалом Е. ти1й1оси]аЛ5. Защитный эффект составил 91,7; 91,7и 83,4%

9). Иммунизация мышей «клеточными» антигенами протосколексов из 2,4 и 6 - месячных ларвоцист Е.тиЫоЫапз в комплексе с полным адъювангом Фрейнда предохраняла их от последующего заражения Е.тиМоси1ат на 80,0; 90,0 и 70,0% соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертационной работы вошли в «Методику идентификации "клеточных" антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и в заявку на изобретение «Способ профилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза)» Получено положительное решение на выдачу патента №2004129658/13(032366) от 11.10,2004

Установленная иммунохимическим анализом идентичность антигенов-метаболитов культивируемых в искусственной питательной среде клеток протосколексов Елтщ1Шоси1ап5 , выделенных из 2-, 4 - и 6-месячных ларвоцист паразита, доказывает экономическую целесообразность использования в культуральной работе для получения «клеточных» антигенов эхинококков ларвоцист Е.шЛЛосЫалз не более 3-4-месячного возраста, что позволит сократить как срок содержания инвазированных экспериментальных животных, так к затраты на их кормление.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бережко В.К., Руднева О.В. Диагностические свойства антигенов клеточной культуры Echinococcus multilocularis // Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями»-2003, вып. 4, с.76-78.

2. Бережко BJC., Руднева О.В., Далаева И.Б. Иммунохимический анализ метаболитов клеточной культуры протосколексов Echinococcus multilocularis // Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями» - 2004, вып. 5, с. 63-66.

3. Руднева О.В. Культивирование клеток дестод, как способ получения диагностических антигенов// Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезням н»-2004, вып.5. - с.336-339.

4. Руднева О.В., Бережко BJC. Иммунопрофияактичсские свойства «клеточных» антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis разного возраста. // В сб. ««Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями»-2005. - вып.б - с.306-309.

5. Руднева О.В. Диагностическая эффективность клеточных метаболитов-антигенов протосколексов ларвонист Echinococcus multilocularis при цистном зхинококкозе.// Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 2005. - т.41. -с.305-311.

6. Бережко BJC., Руднева О.В. Иммунопрофилактика ларвальных цестодозов (достижения, перспективы)// Тр. Всес. ин-та гельминтол, -

2005. - т.41. - с.86-101,

7. О.В.Руднева, И.Б.Далаева, В.К.Береягко Иммунохнмический анализ и диагностическая эффективность «клеточных» антигенов Echinococcus multilocularis при зхинококкозе свиней// Тр. Всес. ин-та гельминтол. -

2006. -т.42. - с.

8. Бережко В.К., Руднева О.В. Методика идентификации «клеточных» антигенов эхинококков // Тр. Всес. ин-та гельминтол. -2006.- т.42.-с.

к исполнению 13/02/2006 Исполнено 14/02/2006

Заказ № 74 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское т., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru