Иммунохимический анализ, диагностическая эффективность и протективные свойства клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis

Руднева, Ольга Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунохимический анализ, диагностическая эффективность и протективные свойства клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis
ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимический анализ, диагностическая эффективность и протективные свойства клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis"

у *

На правах рукописи

Руднева Ольга Вячеславовна

ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ, ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ ПРОТОСКОЛЕКСОВ ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS

Специальность 03.00.19 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС).

Научные руководители:

Доктор биологических наук Бережко В.К.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Бенедиктов Игорь Иванович кандидат биологических наук Андреева Галина Николаевна

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

м научно-

исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

с о

часов на

доктор биологических наук

БЕРЕЖКО В.К.

ДООСА

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Цистный и альвеолярный эхинококкозы относятся к числу наиболее опасных гельминтозоонозов, представляющих серьезную угрозу для здоровья человека и являющихся актуальными для ветеринарной медицины. Распространение этих заболеваний за последние годы увеличивается по причине усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальных условий жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля.

иммунопрофилакгических исследований невозможно без наличия активных и высокоспецифичных антигенов, для получения которых в последние годы стали применять биотехнологические методы, к числу которых относится и клеточная технология. Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в искусственных питательных средах путем их многократного пассирования. В свете вышеизложенного актуальными представляются исследования по использованию клеточной технологии для получения антигенов протосколексов из вторичных ларвоцист Е.тиШ1оси1ап5 разного возраста и их иммунологической характеристики.

Исходя из этого была поставлена цель - получить «клеточные» антигены из протосколексов Е.ти1Шоси1алз, выделенных из 2-, 4- и 6-месячных ларвоцист паразита, провести их иммунохимический анализ, оценить диагностическую эффективность и изучить протекгивные свойства.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить 2-, 4- и 6-месячные ларвоцисты Е.тиШ1оси1апз, выделить клетки протосколексов и подобрать оптимальные условия их культивирования в искусственных питательных средах для получения клеточных метаболитов.

2) Провести отбор гарий «суточных метаболитов

(«клеточных» антигенов).

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.П 9»

3) Собрать банк сывороток крови от животных и людей, зараженных E.granulosus, E.multilocularis, другими гельминтами и клинически здоровых.

4) Провести иммунохимический анализ полученных типов «клеточных» антигенов E.multilocularis в сравнении с соматическим экстрактом и 3-дневными экскреторно-секреторными продуктами культивируемых in vitro протосколексов E.multilocularis.

5) Оценить диагностическую эффективность иммуноферментной реакции с «клеточными» антигенами разных типов при цистном эхинококкозе человека и животных.

6) Изучить протективные свойства «клеточных» антигенов E.multilocularis разного возраста в комплексе с иммуномодулятором риботаном, а также с полным адъювантом Фрейнда при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе.

Научная новизна

Впервые иммунохимическим анализом с различными антисыворотками установлено 1-2 идентичных антигенных компонента в «клеточных» антигенах протосколексов го 2-, 4- и 6-месячных ларвоцист E.multilocularis, соматическом экстракте и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах культивируемых in vitro протосколексов паразита. Впервые на основании разработанных параметров постановки иммуноферментной реакции со всеми типами «клеточных» антигенов протосколексов E.multilocularis проведена сравнительная оценка их диагностической эффективности при цистном эхинококкозе свиней и человека. Установлена чувствительность иммунотеста при цисшом эхинококкозе свиней соответственно 75,6; 73,3;73,3%; специфичность -68,9; 72,1; 69,6%; при цистном эхинококкозе человека - 89,66; 89,66; 86,2%; и - 82,07; 86,2; 86,2%. Впервые изучены протективные свойства полученных «клеточных» антигенов протосколексов E.multilocularis в комплексе с иммуномодулятором риботаном и с полным адъювантом Фрейнда при экспериментальном эхинококкозе. Эффективность защиты в первом случае составила соответственно 91,7; 91,7; 83,4%; во втором -80,0; 90,0 и 70,0%.

Практическая значимость

Материалы диссертационной работы Рудневой О.В. вошли в «Методику идентификации "клеточных" антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН.

В заявку на изобретение «Способ профилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза)». Получено положительное решение на выдачу патента №2004129658/13(032366) от 11.10.2004г.

Установленная диссертантом иммунохимическим анализом идентичность антигенов-метаболитов культивируемых в искусственной питательной среде клеток протосколексов E.multilocularis , выделенных из 2-, 4 - и 6-месячных ларвоцист паразита, доказывает экономическую

целесообразность использования в культуральной работе для получения «клеточных» антигенов эхинококков ларвоцисты E multilocularis не более 3-4-месячного возраста, что позволит сократить как срок содержания инвазированных экспериментальных животных, так и затраты на их кормление. Апробация работы.

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

1. Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (2002-2004гг).

2. Заседаниях Ученого Совета ВИГИС (2002-2005гг)

3. Секции «Инвазионные болезни животных «Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005г).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Культивирование клеток протосколексов, выделенных из ларвоцист E.multilocularis 2,4 и 6 - месячного возраста, получение «клеточных» антигенов.

2. Иммунохимический анализ «клеточных» антигенов разного типа с использованием кроличьей гипериммунной сыворотки к соматическому экстракту протосколексов паразита, сыворотки человека с подтвержденным диагнозом цистного и альвеолярного эхинококкоза и сыворотки экспериментально зараженных E.multilocularis крыс.

3. Оценка диагностической эффективности ИФР с «клеточными» антигенами Е multilocularis разного типа с сыворотками людей и свиней.

4. Протективные свойства полученных «клеточных» антигенов при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ и 2 работы приняты к публикации.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на_

страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы

включает_источников, в том числе отечественных и_ зарубежных

авторов. Работа иллюстрирована_таблицами и_рисунками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен анализ работ по антигенам эхинококков, их характеристике, диагностической эффективности и достижениям в области иммунодиагностики, а также обзор исследований по иммунопрофилактике ларвальных цестодозов, перспективность этого направления в плане создания антипаразитарных вакцин.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы

Получение инвазивного материала. Для приготовления клеточной культуры из прото-сколексов Е. multilocularis использовали вторичные ларвоцисты альвеолярного эхинококка, которые выделяли от предварительно зараженных крыс-доноров. Гельминтный материал для заражения крыс-доноров получали из ИМПиТМ. Выделенными из вторичных ларвоцист паразита в стерильных условиях протосколексами и ацефалоцистами заражали крыс в дозе 4000-6000 экземпляров на одно животное внугрибрюшинно в физрастворе с антибиотиками.

Убой эксперимен-тально зараженных крыс проводили в сроки, предусмотренные целью наших дальнейших исследований, а также при необходимости заражения новой партии животных-доноров.

Получение вторичных ларвоцист Е. multilocularis 2, 4 и 6 -месячного возраста, приготовление первичной клеточной культуры протосколексов, проверка ее жизнеспособности. Работу с гельминтным материалом Е. multilocularis проводили в стерильном боксе в ламинаре с вытяжкой. Ларвоцисты паразита 2, 4 и 6-месячного возраста получали от животных-доноров, отдельно измельчали ножницами или с помощью мясорубки до гомогенного состояния. Каждую порцию гомогената, полученную от разновозрастных ларвоцист Е.multilocularis, промывали стерильным физиологическим раствором (0,9%) хлористого натрия над мельничным газом с диаметром ячейки 0,3 мм. Фильтрат распределяли в цилиндры с коническим дном и отстаивали в течение 15-20 минут. Затем надосадочную жидкость отсасывали резиновой грушей со вставленной в ее конец пастеровской пипеткой и заменяли свежим физиологическим раствором. Содержимое цилиндров взбалтывали путем пропускания воздуха из груши и после 10-15 минут отстаивания снова удаляли надосадочную жидкость и заменяли свежим физиологическим раствором. Эту операцию повторяли 5-7 раз, постепенно сокращая срок отстаивания с целью очистки протосколексов от обрывков выводковых капсул, а также от погибших протосколексов, которые осаждаются с меньшей скоростью, чем живые. Для приготовления первичной клеточной культуры отмытый материал подвергали нежной гомогенизации в течение 5-7 мин в ручном гомогенизаторе с добавлением 0,5-1,0 мл стерильного физиологического раствора (0,9%) до получения однородной массы. Полученную гомогенную массу пропускали

Схема проведения экспериментальных исследований

Получение вторичных ларвоиртстЕ.тиМосьйагН

Через 1 Через 6

месяца после м кяша после ^И месяца после

заражения заражения ^Н заражения

Выделение г|кггоию1екот, щттшкш клегсчноИ кулиуры

нультюирование тети првгосголеисо* ЕллйНошйгВ в иечгсетввннвй гаптальиой среде

Палртенмвтеточимс йетедаопкги клетоя првгосипвксов Е.таЙ1оси1«1*

ис следе* ание кпекнньк мегабалягов *1№, вьделеик " " жпсаноатвньв серий

О црнка диагностической »ффекгивност

Проверка иииуню^ющих »ойств антгенсактмвньк ««ркй тетотнья метаболитов

через фильтры с диаметром ячеек 220, 110 и 50 мкн. Процесс гомогенизации и отделения клеток повторяли 3-5 раз. Качество гомогенизации и определение жизнеспособности выделенных клеток проводили на предметном стекле при увеличении микроскопа 20x10.

Полученную суспензию клеток помещали в стерильную центрифужную пробирку, добавляли физраствор с антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина) и центрифугировали при 1000-1200 об/мин в течение 5-7 минут. Процедуру отмывания повторяли не менее 5-7 раз. Жизнеспособность полученных клеток из протосколексов Е. multilocularis проверяли в камере Горяева путем окрашивания 0,4% раствором трипанового синего при увеличении микроскопа 20x10 общепринятым методом. Культуры, содержащие не менее 85-87% жизнеспособных клеток, использовались в дальнейшей работе. Концентрацию клеток в суспензии для последующего культивирования доводили до 600-800тыс/мл.

Культивирование клеток протосколексов из ларвоцист Е. multilocularis разного возраста, получение клеточных метаболитов, оценка их антигенной активности. В качестве ростовой среды для культивирования клеток использовали искусственную питательную среду постоянного состава - RPMI-1640 с добавлением 2 мл глутамина и 8 мг гентамицина (4%) на 100 мл среды и 5% эмбриональной сыворотки плода крупного рогатого скота.

Клеточную культуру помещали в СО^-инкубатор с заданными параметрами температуры (37° С) и поступления газов (С02-5%) при 70%-й влажности для культивирования. Отбор клеточных метаболитов производили на 7-10 день культивирования в период формирования монослоя с помощью автоматической пипетки, причем после каждой манипуляции проводили замену наконечника. После отбора метаболитов культуры клеток пересевали в новую порцию питательной среды необходимого состава, подогретой в водяной бане до 37°С.

Процесс роста и пролифирации клеток в питательных средах контролировали под микроскопом. Поскольку получение полноценной популяции возможно только от культуры, состоящей из жизнеспособных клеток, то перед каждым пассажем проводили просмотр и оценку качества клеток в монослое. Для продолжения культивирования отбирали культуры, содержащие клетки, имеющие типичную для данной культуры морфологию с четко очерченными границами между клетками. Если в поле зрения регистрировали клетки с вакуолями, включениями и другими признаками цитопатологии, такие культуры для культивирования не применяли. Из планшетов с выросшим клеточным монослоем отбирали ростовую среду (клеточные метаболиты), а к оставшимся на пластике клеткам добавляли необходимое количество соответствующей ростовой среды, подогретой до 37°С.

Наличие специфических антигенных компонентов в метаболитах клеточных культур протосколексов Е. multilocularis устанавливали с помощью иммуноферментной реакции типа ELISA (Voller А. et al., 1974) с некоторыми модификациями применительно к нашим условиям. Реакцию проводили в полистироловых планшетах отечественного производства. Положительным контролем в реакции при отборе антигеноактивных серий метаболитов клеток служили сыворотки убойных свиней с подтвержденным диагнозом естественной инвазии E.granulosus и сыворотки людей, зараженных E.granulosus и E.multilocularis (диагноз подтвержден хирургически), а отрицательным - сыворотки свиней, у которых при вскрытии гельминтной инвазии не обнаружили, и сыворотки здоровых людей - доноров.

Антиген использовали в титре 1/2 и 1/4. Разведение осуществляли карбонатно-бикарбонатным буфером (БКБ), pH 9,6. Сенсибилизацию планшета проводили при +4°С в течение 18-20 часов с последующим отмыванием несвязавшихся с полистиролом белков 0,05% раствором Tween-20 на дистиллированной воде три раза по 3-5 минут после каждого этапа реакции. Сыворотки крови разводили 1:100 в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7,2, с добавлением 0,05% Tween-20 и 0,05% бычьего сывороточного альбумина (БСА). В качестве коньюгата использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови человека, а также антитела диагностические против IgG сыворотки крови свиньи, меченые пероксидазой. Разведение конъюгага проводили тем же буфером, что и сыворотки, увеличив концентрацию БСА в 10 раз. Планшеты с сывороткой и конъюгатом инкубировали при +37°С в течение одного часа. В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин на цитратом буфере, pH 4,7, с добавлением стабилизированной перекиси водорода. Реакцию останавливали внесением в каждую лунку 50% серной кислоты в количестве 50 мкл. Оптимальные разведения всех компонентов (антиген, сыворотка и конъюгат), используемых в реакции, устанавливали опытным путем на основе максимальной разницы в оптической плотности между отрицательной и положительной контрольными сыворотками.

Учет реакции проводили на автоматическом анализаторе колориметрическом иммуноферментном 340/АТС фирмы SLT-labsistems (Австрия) при длине волны 492 нм. Пробу считали положительной, если ее оптическая плотность превосходила значение оптической плотности отрицательного контроля в два и более раза. Оценку результатов проводили только в том случае, если в лунках с отрицательной контрольной сывороткой и без сыворотки (контроль конъюгага) окраска была слабо-желтая или отсутствовала.

Серии метаболитов клеточных культур, показавших хорошую антигенную активность с контрольными сыворотками, использовали в дальнейшей работе.

Контроль клеточных ' метаболитов на стерильность, безвредность, определение содержания белка

Контроль клеточных метаболитов на стерильность

Для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу «клеточного» антигена высевали на МПА, МПБ и МППБ по одной пробирке, а на грибковую контаминацию - на среду (агар) Сабуро в две пробирки. На микоплазменную контаминацию пробу «клеточного» антигена высевали на полужидкий агар (0,3%), приготовленный на ферментативном переваре бычьего сердца с 10% сыворотки лошади, 10% дрожжевого экстракта и 100 ЕД/мл пенициллина в две пробирки Контроль вели в течение трех пассажей на этой среде. Посевы на МПА, МПБ и МППБ выдерживали в течение 10 суток при 37 °С, на полужидком агаре - 14 дней при 37 °С и на среде Сабуро - 15 дней при комнатной температуре. При обнаружении хотя бы одного из контаминантов партию считали нестерильной.

Контроль на безвредность. Испытания проводили на 10 белых беспородных мышах, не использовавшихся ранее в экспериментах. Для выявления посторонних вредных агентов каждому животному внутримышечно вводили «клеточный» антиген в дозе 0,5 мл. Наблюдение вели на протяжении 28 суток. «Клеточный» антиген считали безвредным, если на протяжении периода наблюдения животные оставались клинически здоровыми.

Определение содержания белка. Концентрацию белка в клеточных метаболитах определяли на спектрофотометре СФ -26, ЛОМО, при длине волны 280 нм.

В качестве контроля использовали питательную среду культивирования.

Иммунохимический анализ метаболитов («клеточных» антигенов ) культивируемых протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист Е. multilocularis

Иммунохимический анализ «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист Е. multilocularis проводили реакцией иммунодиффузии (РИД) в 1%-ном агаровом геле (Difco) в варианте «семерка», «пятерка», «тройка». РИД ставили по методу Гусева и Цветкова (1960) в модификации применительно к нашим условиям. Для анализа антигенного спектра исследуемых объектов использовали:

а) гипериммунную кроличью сыворотку к антигенам соматического экстракта протосколексов паразита;

Гипериммунную сыворотку получали от 2 кроликов, которых иммунизировали 3-х кратно подкожно с интервалом 2-3 дня возрастающими дозами соматического экстракта протосколексов E.multilocularis с последующей внутривенной ре иммунизацией, проведенной через 28 дней после последней иммунизирующей дозы антигена. В общей сложности каждый кролик получил по 7,2 мг белка-антигена. Через 7-10 дней после

реиммунизации у кроликов из ушной вены была взята кровь и приготовлена сыворотка.

Активность гипериммунной сыворотки предварительно проверяли

ИФР.

б) сыворотки пациентов с хирургически подтвержденным диагнозом цистного и альвеолярного эхинококкоза приобретали из 24-й клинической больницы г.Москвы.

с) сыворотки от экспериментально зараженных Е. multilocularis белых крыс нам предоставил д.м.н. Коваленко Ф.П.

Исследование «клеточных» антигенов протосколексов из разновозрастных ларвоцист Е. multilocularis иммуноферментной реакцией (ИФР)

а) с сыворотками свиней;

Отобранные в процессе культуральной работы антигеноактивные серии клеточных метаболитов («клеточные» антигены) протосколексов из 2, 4 и 6-месячных ларвоцист E.multflocularis были оценены иммуноферментным методом (типа ELISA) на твердой фазе в непрямом варианте определения антител к антигенам эхинококка однокамерного в сыворотках убойных свиней. Исследовали 135 и 124 сыворотки свиней, приобретенных в Московской и Саратовской областях. В состав этих сывороток входило 45 с подтвержденным при вскрытии диагнозом цистного эхинококкоза, 90 и 79 проб от инвазированных другими гельминтами и клинически здоровых животных без видимой патологии.

б) с сыворотками людей.

Сравнительную оценку отобранных «клеточных» антигенов протосколексов, выделенных из 2, 4 и 6-месячных ларвоцист E.multilocularis, провели иммуноферментным тестом типа ELISA с сыворотками людей, приобретенных из 24-й клинической больницы г.Москвы и из НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. Для анализа использовали 60 проб сывороток, в том числе 29 проб с подтвержденным хирургически диагнозом цистного и 2-альвеолярного эхинококкоза, 2 пробы от пациентов с серологически подтвержденной инвазией токсокароза «larva migrans»; 2 - трихинеллеза (T.spiralis) и 25 проб сывороток от клинически здоровых доноров.

ИФР ставили по стандартной методике Voller et al., (1974), предварительно определив оптимальное разведение «клеточных» антигенов и титр конъюгата на основе максимальной разницы в проявлении реакции (по оптической плотности) между положительной и отрицательной контрольной сывороткой. В качестве конъюгата при анализе сывороток свиней использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови свиней, меченные пероксидазой, а при работе с сыворотками людей -антитела диагностические против IgG сыворотки человека, меченные пероксидазой.

Изучение иммунопрофилактических свойств «клеточных» антигенов при вторичном альвеолярном эхинококкозе мышей в комплексе

а) с иммуномодулятором риботаном:

Непосредственно перед проведением экспериментов на лабораторных животных-моделях определяли необходимое количество иммунизирующей дозы «клеточных» антигенов Е.тиМосиЬпв (по белку) в объемном выражении и смешивали с рассчитанной согласно инструкции дозой иммуномодулятора риботана. Приготовленные партии иммунопрепаратов, представляющих собой смесь «клеточных» антигенов протосколексов из вторичных ларвоцисг Е.тиМкхяйапв 2, 4 и 6 - месячного возраста (отдельно каждый) и риботана, использовали в эксперименте по изучению их протективных свойств при вторичном альвеолярном эхинококкозе на мышах. Разовая иммунизирующая доза иммунопрепарата составляла 0,2 мл (80 мгк белка) «клеточного» антигена и 5 мкл риботана. Аналогичный иммунопрепарат был приготовлен также из 3-дневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов паразита, который использовали как базовый контрольный. Опыт провели на 120 белых беспородных мышах, массой 18-20г, распределенных на 10 равноценных групп по 12 мышей в каждой.

Первые 4 1руппы мышей получили 3-кратно подкожно с интервалом 10 дней по 0,2 мл иммунопрепарата из соответствующего «клеточного» и экскреторно-секреторного антигена и 5 мкл риботана, последующие 4 группы были иммунизированы аналогично такой же дозой соответствующих испытуемых антигенов без иммуномодулятора риботана, 9-я группа животных получала только дозу иммуномодулятора и 0,2 мл стерильного физиологического раствора, а 10-я группа - контрольные мыши, иммунизации не подвергались, им вводили по 0,2 мл стерильного физиологического раствора.

Через 14 дней после последней иммунизирующей дозы все подопытные мыши были заражены инвазивным материалом Е.ти№1оси1апз в дозе 200+20 экз. протосколексов и ацефалоцист. Убой подопытных животных и оценку протективной эффективности «клеточных» антигенов проводили на 70-й и 90-й дни после заражения. б) с полным адъювантом Фуейнда.

Аналогичный эксперимент по оценке иммунопрофилактических свойств «клеточных» антигенов протосколексов из 2,4 и 6-месячных ларвоцист паразита провели с использованием в качестве иммуностимулирующего средства полного адъюванта Фрейнда (ТТАФ). Перед началом эксперимента произвели расчет необходимого количества каждой партии «клеточного» антигена из протосколексов Е.тиМосЫапБ в объемном выражении и тщательно перемешали с ПАФ (в соотношении 1:0,5) до получения гомогенной массы. Расчет вели по белку таким образом, чтобы каждое иммунизированное животное получило по 0,2 мл приготовленного иммунопрепарата, содержащего 80 мкг белка-антигена.

Опыт провели на 70 белых беспородных мытах, массой 18-20 г, распределенных на 7 равноценных групп по 10 животных в каждой группе. Иммунизацию мышей проводили 3-кратно подкожно с интервалом 10 дней.

Первые три группы мышей получили подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней иммунопрепараты, приготовленные из «клеточных» антигенов протосколексов 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист ЕтиШоайапв в смеси с ПАФ соответственно. Четвертая, пятая и шестая группы мышей были иммунизированы таким же образом «клеточными» антигенами протосколексов из разновозрастных ларвоцист альвеолярного эхинококка в той же дозе, но без ПАФ, седьмая контрольная группа животных иммунизации не подвергалась. По истечении 14 дней всех подопытных мышей заражали подкожно инвазивным материалом Е.тиЖ1оси1ап5 в дозе 200+20 протосколексов и ацефалоцист.

Убой и оценку иммунопрофилакгического эффекта проводили в те же сроки, что и в первом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований показали, что не все серии клеточных метаболитов содержат антигеноактивные компоненты. Антигенную активность установили в 20 (90,9%), 24 (91,6%) и 25 (78,1%) сериях клеточных метаболитов протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист Е.пшМостйапя соответственно. Концентрация белка в «клеточных» антигенах протосколексов составила 2175, 4600 и 3500 мкг/мл соответственно.

Анализ результатов иммунохимических исследований (табл.1), проведенных реакцией иммунодиффузии (РИД) с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки к антигенам соматического экстракта протосколексов Е.ти1Шоси1ап8, показал в гомологичной системе не менее 56 комплексов антиген-антитело, которые проявлялись в основном четкими линиями преципитации.

Таким образом, соматический экстракт протосколексов, судя по РИД, имеет в своем составе не менее 6 антигенных компонентов (эпитопов), способных стимулировать синтез антител у иммунизированных им кроликов.

Аналогичные исследования, проведенные с «клеточными» антигенами из протосколексов, выделенных из 2, 4 и 6-месячных ларвоцист паразита и этой же антисывороткой, позволили выявить не более 1-2 комплексов антиген-антитело. Причем представляющие эти комлексы линии преципитации были четкими и показали реакцию идентичности с таковыми в гомологичной системе реакции.

В варианте «пятерка», где в центральную лунку вносили сыворотку человека с подтвержденным диагнозом диетного эхинококкоза, а по периферии - соматический экстракт протосколексов, 3-дневные экскреторно-секреторные продукты

Таблящ 1.

Иммунохимический анализ «клеточных» антигенов протоскалексов E.multilocularis.

Число комплексов антиген-антитело в реакции иииуноднффузии

Антигены

№ п/п Сыворотки Экстракт лротоско лексов E.multilocularis 3-дневные экскрегорно-секре-торные продукты протосколексов E.multilocularis «клеточный» АГ иротосколек-сов из 2-месячных ларвоцист Е. multiloculans «клеточный» АГ протосколексов из 4-мссячных ларвоцист Е multiloculari s «клеточный» АГ из протосколексов 6-месячных ларвоцист Emultilocul axis

1. Кроличья гипериммунная (а) 5 1-2 1-2 1-2 1

2. Краличы пшериммунная (6) 6 2 2 2 1-2

3. Цисшый эхиноюкхоз (человек) 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2

4. Альвеолярный ЭХИНОКОККОЗ (человек) 1 1 1 1-2 1

5 Альвеолярный эхинококкоз (крыса, эксп. заражение) 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2

Примечания. АГ - антиген

культивируемых in vitro протосколексов паразита и «клеточные» антигены протосколексов, выделенных из 2, 4 и 6 -месячных вторичных ларвоцист E.multilocularis, в РИД выявили не более двух комплексов антиген-антитело. Линии преципитации, представляющие эти комплексы в агаровом геле с сывороткой больного цистной формой эхинококкоза, имели более диффузный характер в сравнении с реакцией, наблюдаемой с гипериммунной сывороткой

Аналогичный вариант реакции провели с сыворотками экспериментально зараженных E.multilocularis крыс, где также регистрировали не более 1-2 комплексов антиген-антитело. Полученные нами данные подтверждают мнение исследователей иммунологов об отсутствии корреляции между числом потенциальных и функциональных антигенных компонентов.

Оценка диагностической эффективности «клеточных» антигенов протосколексов E.multilocularis из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист при цистном эхинококкозе свиней и человека.

а) при эхинококкозе свиней

Результаты иммуноферментного анализа «клеточных» антигенов из 2-месячных протосколексов паразита, представленные в табл.2, показали, что из 45 проб сывороток инвазированных эхинококками свиней 34 прореагировали положительно, а 11 - отрицательно. Таким образом, чувствительность теста с этим антигеном составила 75,6%, а специфичность -68,90%

Таблица 2.

Диагностическая эффективность «клеточного» антигена протосколексов из 2-месячных ларвоцист E.multilocularis при цистном эхинококкозе свиней.

№ п/п Исследуемые сыворотки крови свиней. Кол-во проб «Клеточный» АГ протосколексов из 2-месячных ларвоцист E.multilocularis

Результаты ИФР*

+ - 4,% С,%

1 Инвазированные Е.кгали1озиз 45 34 11 75,6%

2 Инвазированные другими гельминтами и клинически здоровые 90 28 62 68,9%

ИФР - иммуноферментная реакция

Примечания. АТ, _____г

АГ-антиген

«Ч» - чувствительность

«С» - специфичность

«+» - положительный результат

«-» - отрицательный результат

Аналогичные исследования, проведенные с «клеточным» антигеном протосколексов из 4- и 6-месячных ларвоцист Е.тш№1оси1ап5, со 124 сыворотками крови свиней, представленные в табл.3 и 4, показали следующие результаты: из 45 проб сывороток крови свиней, инвазированных Е.^апЫоБШ, в 33 реакция с обоими антигенами была положительной, в 12 -отрицательной. Таким образом, чувствительность ИФР с этими антигенами составила 73,3%.

Таблица 3.

Диагностическая эффективность «клеточного» антигена протосколексов из 4-месячных ларвоцист Е.тиШ1оси1агк при цистном эхинококкозе свиней.

Кол-во проб «Клеточный» АГ протосколексов из 4-месячных ларвоцист Е тиМосЫапв

№ п/п Исследуемые сыворотки крови свиней Результаты ИФР*

+ - 4,% С,%

1 Ин Базированные Е ¿ггалЫозш 45 33 12 73,3%

2 Инвазированные другими гельминтами и клинически здоровые 79 22 57 72,1%

Примечания- ИФР - иммуноферментная реакция АГ - антиген «Ч» - чувствительность «С» - специфичность «+»- положительный результат «-» - отрицательный результат

Таблица 4.

Диагностическая эффективность «клеточного» антигена протосколексов из 6-месячных ларвоцист Е.тиШ1оси1ап$ при цистном эхинококкозе свиней.

№ п/п Кол-во проб «Клеточный» АГ протосколексов из 6-месячных ларвоцист Е.тиШ1оси1ат

Исследуемые сыворотки крови свиней. Результаты ИФР*

+ - 4,% С,%

1 Инвазированные Е.вгашккдо 45 33 12 73,3%

2 Инвазированные другими гельминтами и клинически здоровые 79 24 55 69,6%

Примечания- ИФР - иммуноферментная реакция АГ- антиген «Ч» - чувствительность «С» - специфичность «+»- положительный результат «-»- отрицательный результат

В то же время оценка специфичности этих антигенов, проведенная с 79 пробами сывороток крови свиней с другими инвазиями и клинически здоровых, несколько различалась.

Так, с «клеточным» антигеном из 4-месячных протосколексов паразита 57 проб сывороток прореагировали в ИФР отрицательно, что составило 72,1% специфичности. С «клеточным» антигеном из 6-месячных ларвоцист E.multilocularis отрицательная реакция была зарегистрирована в 55 случаях, что соответствует специфичности 69,6%.

б) при эхинококкозе человека

Исследования, проведенные с сыворотками крови людей (табл.5) в количестве 60 проб, в том числе с сывороткой крови пациентов с подтвержденным диагнозом циста ого (29 проб) и альвеолярного эхинококкоза (2 пробы), трихинеллеза (2 пробы), токсокароза «larva migrans» (2 пробы) и клинически здоровых доноров (25 проб) показали следующие результаты: из 29 проб сывороток крови пациентов с диагнозом цистного эхинококкоза с «клеточным» антигеном протосколексов из 2-месячных ларвоцист 26 прореагировали положительно, 3 - отрицательно. Таким образом, чувствительность теста в этом случае составила 89,66%. С обоими сыворотками крови пациентов с альвеолярной формой эхинококкоза реакция была положительной, что соответствует 100%-ной чувствительности.

С сыворотками крови пациентов с гетерологичными инвазиями и клинически здоровых-доноров результаты анализа были следующие: при трихинеллезе из 2 сывороток одна показала положительный результат, при токсокарозе «larva migrans» из 2 также одна прореагировала положительно, а из 25 проб сывороток крови клинически здоровых пациентов положительную реакцию регистрировали в 3 случаях (12,0%). Специфичность ИФР без учета данных по альвеолярному эхинококкозу, таким образом, составила 82,07%. Аналогичный анализ, проведенный ИФР с этим же набором сывороток крови людей и «клеточным» антигеном протосколексов из 4-месячных ларвоцист E.multilocularis показал такую же чувствительность теста 89,66%, поскольку из 29 проб сывороток крови больных цистной формой эхинококкоза положительную реакцию регистрировали в 26 случаях.

Судя по результатам иммуноферментного анализа с сыворотками крови пациентов с гетерологичными инвазиями и клинически здоровых доноров специфичность теста составила 86,2%.

ИФР с «клеточным» антигеном протосколексов из 6-месячных вторичных ларвоцист паразита и тех же сывороток крови пациентов показала чувствительность и специфичность 86,2%. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что клетки протосколексов, выделенных из разного возраста ларвоцист E.multilocularis, при культивировании в искусственной питательной среде при оптимально подобранных условиях активно растут и размножаются, выделяя в среду обитания антигеноактивные продукты метаболизма, имеющие диагностическое значение.

Таблица S.

Сравнительная диагностическая эффективность «клеточных» антигенов из протосколексов ларвоцист К multilocularis разного

возраста при цистном эхинококкозе человека.

Результаты ИФР*

Группы людей, Пробы сывороток Кол-во проб Клеточный АГ протосколексов из 2-месячных Клеточный АГ протосколексов из 4-месячных Клеточный АГ протосколексов из 6-месячных

ларвоцисгЕ multilocularis ларвоцист В. multilocularis ларвоцист Е. multilocularis

+ - 4% С% + - 4% С% <■ + - 4% С%

Эхинококкоз цистный 29 26 3 89,66 82,07 26 3 89,66 86,2 25 4 86,2 86,2

Эхинококкоэ альвеолярный 2 2 - 100 2 - 100 2 - 100

Трихинеллез 2 1 1 1 1 1 1

Токсокароз "larva migrans" 2 1 1 1 1 1 1

Клинически здоровые доноры 25 3 22 2 23 2 23

Итого 60

Примечания: ИФР - иммуноферментная реакция «Ч» - чувствительность «С» - специфичность АГ - антиген

«+» - положительный результат «-» - отрицательный результат

Сопоставимость полученных нами данных в диагностических исследованиях со всеми испытанными антигенными препаратами сведетельствует о том, что набор антигеноактивных компонентов в клеточных метаболитах протосколексов из разновозрастных ларвоцист Е.тиШ1оси1апз практически не отличается, поскольку разница в чувствительности и специфичности иммунотеста с этими антигенами была незначительной.

Изучение иммунопрофилактических свойств «клеточных» антигенов протосколексов при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе мышей

а) в комплексе с иммуномодулягором риботаном

Анализ результатов этих исследований мы провели на 90-й день после проверочного заражения экспериментальных животных.

Суммирование полученных нами данных, представленных в таблице 6, свидетельствует о том, что наибольший эффект защиты достигался при иммунизации мышей специфическим антигенным препаратом в комплексе с иммуностимулятором риботаном (группы 1,1П и V табл. 6.).

В первой группе мышей, иммунизированных "клеточным' антагеном протосколексов из 2-месячных ларвоцист паразита в комплексе с риботаном, только у одной мыши при вскрытии в печени обнаружили ларвоцисты Е.тиМосЫат, размером менее 1,5 мм в диаметре без инвазивных элементов. Аналогичный результат регистрировали в 3-й группе, мыши которой были иммунизированы таким же антигеном протосколексов, выделенных из 4-месячных ларвоцист альвеолярного эхинококка. Таким образом, в этих группах был отмечен самый высокий защитный эффект (91,7%). Из 12 мышей 5-й группы, иммунизированных "клеточным" антигеном протосколексов из 6-месячных ларвоцист паразита с риботаном, у 2 были обнаружены в печени единичные, мелкие без зародышевых элементов, ларвоцисты, что повлияло на протективный эффект и снизило его до 83,4%.

Что касается мышей, которых иммунизировали только антигенными препаратами, без иммуномодулятора (группы 2,4,6,табл 6), то эффективность защиты у них не превышала 75% (2,4 группа) и 66,7% (6 группа). В этих группах, как правило, у 3-4 подопытных мышей регистрировали единичные ларвоцисты паразита без зародышевых элементов в отличие от таковых, обнаруженных у контрольных животных, не подвергавшихся иммунизации. У последних многочисленные ларвоцисты находили в брюшной полости и во всех внутренних органах, размером до 25 мм в диаметре с развившимися протосколексами. Большинство контрольных мышей погибло до момента вскрытия.

Таблица 6.

Протективные свойства «клеточного» антигена (КлАГ) протосколексов из 2-, 4 и б- месячных ларвоцист Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором риботаном при экспериментальном альвеолярном эхинокоюсозе мышей.

Номера п/п Количество мышей в группе Иммунизирующее СрСДСГВО, мкг белка* Доза заражения,•• экз Кол-во заразившихся ЖИВОТНЫХ, % Эффектов иосгь защит, % Примечание

I 12 Кл Al'2-иес 80 мкг (0 2мл) + риботан5 мкг 200 + 20 1(8,33 %) 91,7% У одной мыти обнаружены единичные ларвсщиста в печени без инвазивных элементов.

II 12 Кл АГ 2-мсс. 80 мкг (0.2мл ) + физ. р-р 5 мкг 200 + 20 3(25,0%) 75,0% У трех мышей обнаружены ларвоцвсш 1,5-2 мм в диаметре, зародышевые элемента отсутствовали

Ш 12 КлАГ4-мес. 80 мкг (0 2мл ) + рибоган 5 мкг 200 + 20 8,33% 91,7% У двух мышей регистрировали очень мелкие единичные, без зародышевых элементов лавроцисты в печени

IV 12 Кл АГ4-мес 80 мкг (0 2мл) + физр-р5мю 200 + 20 3(25,0%) 75,0% У трех мышей регистрировали во внутренних органах ларвоцисты паразита без зародышевых элементов

V 12 КлАГб-мес 80 мкг (0 2мл) + риб(ялан5 мкг 200 ±20 2(16,6%) 83,4% У трех мышей регистрировали мелкие, единичные лаврощгсты, без инвазионных элементов.

VI 12 Кл АГ 2-мес 80 мкг (0.2мл) + физ р-р 5 мкг 200 + 20 4(33.3%) 66,7% У четырех мышей обнаружены лавроцисты до 2мм в диаметре, зародьщквые элементы отсутствовали

vn 12 ЭСП 80 мкг (0,2 л) + риботак 5 мгг 200 + 20 3(25,0%) 75,0% В печени зрех мышей репклрирсвали лавроцисты 0,5-2,5 мм в диаметре, зародышевые элементы отсутствовали

УШ 12 ЭСП 80 мкг (0,2л) + ф|в.р-р5мкг 200 + 20 5(41,7%) 58,3 В печени и брюшной полости пяти мышей обнаружены лавроцяяы без зародышевых элементов

к 12 Физ р-р (0,2 мл) + рибтан S мкг 200 + 20 10(83,3%) 16,7% У большинства заразившихся У-Ы1ШЙ регистрировали лавроцисты с зародышевыми элементами в брюшной полости и в печени

X 12 Физ р-р 0,2 мл 200 ±20 12(100%) - Все мыши заразились, лавроцисты да. 15-25 мм в брюшной полости и во внутренних органах протоскелексами

Примечание' «Кл»АГ Km - «щеточный» штгиген Echinococcus multilocularis

«Кл»АГ Е т +Р - «клеточный» антител Echinococcus multilocularis + риботая ЭСП - экскреторно-секреторные продукт

Подопытные животные, получившие в качестве иммунизирующего препарата только иммуностимулятор риботан (группа 9), как показали результаты вскрытия, оказались в большинстве зараженными У 10 мышей из этой группы регистрировали многочисленные достаточно больших размеров ларвоцисты с зародышевыми элементами паразита и только у 2 (16,6%) такие поражения отсутствовали. В качестве базового антигена в иммунопрофилакгических исследованиях мы использовали 3-дневные экскреторно-секреторные продукта (ЭСП) культивируемых протосколексов E.multilocularis, которые также вводили мышам в комплексе с риботаном (группа 7) и без него (группа 8). В результате этих исследований установили, что защитный эффект в первом случае составил 75,0%, во втором - 58,3%.

Таким образом, использование всех типов антигенов в комплексе с иммуномодулятором риботаном оказывало наибольший защитный эффект и предохраняло больше животных от последующего проверочного заражения.

Полученные нами данные позволяют сделать предварительное заключение, что «клеточные» метаболиты протосколексов Echinococcus multilocularis, выделенные из 2-, 4- и 6- месячных ларвоцист паразита, имеют в своем составе антигены, обладающие защитными свойствами.

б) в комплексе с полным адъювантом Фрейнда Аналогичные исследования по оценке протективных свойств "клеточных" антигенов протосколексов из разновозрастных ларвоцист альвеолярного эхинококка мы провели также в комплексе с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ). Полученные результаты, представленные в табл.7, явились убедительным подтверждением данных первого эксперимента с иммуномодулятором риботаном о наличии в "клеточных" антигенах протосколексов из разновозрастных ларвоцист E.multilocularis иммунопрофилакгических компонентов, способных в значительной степени предохранять иммунизированных ими животных от последующего заражения. Убой экспериментальных мышей, проведенный на 90-й день после проверочного заражения, показал, что животные, иммунизированные "клеточными" антигенами протосколексов из ларвоцист альвеолярного эхинококка 2,4 и 6-месячного возраста в комплексе с ПАФ (группы 1,2,3), в большинстве своем оставались свободными от инвазии. Эффективность защиты составила 80,0; 90,0; 70,0 %. Причем у мышей этих групп, у которых регистрировали единичные ларвоцисты без инвазивных элементов, отметили существенные различия в сравнении с контрольной группой, не подвергавшейся иммунизации. У последних, как правило, в эти же сроки убоя регистрировали многочисленные ларвоцисты паразита в печени и в брюшной полости, довольно значительных размеров (15-20мм в дм) с большим числом инвазивных элементов. В последующих трех группах (4:5,6) мышей, иммунизированных теми же «клеточными» антигенами протосколексов паразита без адъюванта, защитный эффект к проверочному заражению проявился слабее и был в пределах 50-60% Однако и в этих группах заразившиеся мыши отличались от контрольных, не подвергавшихся предварительной иммунизации, как по количеству обнаруженных у них

ларвоцист эхинококка, так и по их размерам и наличию инвазивных элементов.

Таблица 7.

Протективные свойства «клеточного» антигена (КлАГ) протосколексов из 2, 4 и 6-месячных ларвоцист Е multilocularis в комплексе с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) при экспериментальном альвеолярном эхинококком мышей.

Номера п/п Количество мышей в хруппе Иммунизирующее средство, доза*мхг белка* Доза заражения,** экз Кол-во заразившихся животных ,% Эффективность защиты, % Примечание

I 10 Кл АГ2-мес ¡¡Омкг + ПАФ (0 2мл) 200 ±20 2(20%) 80% У двухмышей обнаружены лавроцисты до 1,5 мм в диаметре, без инвазионных элементов

П 10 Кл АГ4-мес 80МШ-+ПАФ (0.2мл) 200 ±20 1(10,0%) 90% Лавроцнст паразита регистрировали у одной мыши. Они мелкие, без зародышевых элементов

Ш 10 Кл АГ б-мес 80 мжг (02мл) + ПАФ 200 + 20 3(30%) 70% У трех мышей регистрировали лавроцисты в брюшной полости

IV 10 Кл АГ 2-мес 80 мкг (0 2мл) 200 + 20 5(50,0%) 50% Половина мышей в группе были инвазированы, только у одной мыши в ларво цистах обнаружены инвазионные элементы

V 10 Кл АГ4-мес. 80 миг (02мл) 200 + 20 4(60,06%) 60% У четырех мышей этой группы регистрировали единичные, мелкие ларвоцясты, без зародышевых элементов

VI 10 Кл АГб-мес. 80 мкг (0 2мл) 200 + 20 4(40,0%) 60% У четырех мышей найдены многочисленные мятгие, беч тпияипиных элементов лавроцисты

VII 10 Физиол р-р (0,2мл) (контроль) 200 + 20 10(100%) - Заразилась все мыши. Многочисленные лавроцисты найдены в печени, в брюшной полости, 15-20 ым в диаметре, в большинстве своем сформировавшиеся прогоехолексы

* - иммунизация 3-кратная, интервал 10 дней

*♦ - заражение через 14 дней после последней иммунизации

Убой экспериментальных животных через 90 дней после проверочного заражения.

Полученные предварительные обнадеживающие результаты дают основание продолжить исследования в этом направлении, уделив наибольшее внимание отработке дозы вводимых антигенов, способу введения и кратности.

Немаловажное, а возможно и основное значение имеет интервал между иммунизациями, поскольку отдаленные сроки введения антигена после первичного иммунизирующего цикла оказывают иммунизаторное воздействие на организм с оптимально завершенной перестройкой иммунологической реактивности и поэтому вызывающей максимальный эффект. Однако получение максимального иммунизирующего эффекта находится в зависимости от подготовительной иммунизации. При введении в организм больших доз антигена или частом антигеном раздражении можно получить обратный эффект.

ВЫВОДЫ

1). Проведено культивирование клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е.multilocularis 2-,4- и 6- месячного возраста, получены антигены клеточной культуры («клеточные» антигены) с содержанием белка 2175 мкг/мл; 4600мкг/мл и 3500мкг/мл соответственно.

2). Реакцией иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле проведен иммунохимический анализ «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis с кроличьей гипериммунной сывороткой к антигенам экстракта протосколексов паразита, сывороткой экспериментально зараженных Е. multilocularis крыс и сывороткой человека с подтвержденным диагнозом цистного и альвеолярного эхинококкозов и установлено наличие в них идентичных антигенов.

3). В гомологичной системе РИД (гипериммунная кроличья сыворотка х экстракт протосколексов Е. multilocularis) выявлено не менее 5-6 комплексов антиген-антитело; между этой же антисывороткой и антигенами клеточной культуры протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis проявлялась не более 1-2 комплексов антиген-антитело, представленных в РИД идентичными полосами преципитации.

4). Установлено наличие в «клеточных» антигенах протосколексов 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis диагностического антигенного компонента, способного выявлять специфические антитела в сыворотках экспериментально зараженных E.multilocularis крыс и сыворотках больных цисгаой и альвеолярной формой эхинококкоза

5). Проведена сравнительная оценка диагностической эффективности «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis иммуноферментной реакцией при цистном эхинококкозе свиней; установлена чувствительность и специфичность теста 75,6; 73,3 и 73,3% и 68,9; 72,1 и 69,6% соответственно.

6). Диагностическая эффективность ИФР с «клеточными» антигенами протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е multilocularis при цистном эхинококкозе человека составила соответственно 89,7, 89,7 и 86,2% по чувствительности и 82,07, 86,2 и 86,2% по специфичности.

7). Изучены иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е.

multilocularis в сравнении с 3-дневными экскреторно-секретоными продуктами культивируемых протосколексов паразита при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе мышей. Эффективность защиты составила 75,0; 75,0, и 66,7%; 58,3% соответственно. Показано усиление иммунной защитной реакции под действием ««клеточных» антигенов протосколексов в комплексе с иммуномодулятором риботаном и адъювантом Фрейнда.

8) Установлено, что 3-кратная подкожная иммунизация мышей «клеточным» антигеном протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором риботаном (доза 80 мкг белка и 5 мкл риботана), предохраняла большинство мышей от заражения инвазивным материалом Е. multilocularis. Защитный эффект составил 91,7; 91,7 и 83,4%

9). Иммунизация мышей «клеточными» антигенами протосколексов из 2,4 и 6 - месячных ларвоцист E.multilocularis в комплексе с полным адъювантом Фрейнда предохраняла их от последующего заражения E.multilocularis на 80,0; 90,0 и 70,0% соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертационной работы вошли в «Методику идентификации "клеточных" антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и в заявку на изобретение «Способ профилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза)» Получено положительное решение на выдачу патента №2004129658/13(032366) от 11.10.2004

Установленная иммунохимическим анализом идентичность антигенов-метаболитов культивируемых в искусственной питательной среде клеток протосколексов E.multilocularis , выделенных из 2-, 4 - и 6-месячных ларвоцист паразита, доказывает экономическую целесообразность использования в культуральной работе для получения «клеточных» антигенов эхинококков ларвоцисты E.multilocularis не более 3-4-месячного возраста, что позволит сократить как срок содержания инвазированных экспериментальных животных, так и затраты на их кормление.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бережко В.К., Руднева О.В. Диагностические свойства антигенов клеточной культуры Echinococcus multilocularis // Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями»-2003, вып.4, с.76-78.

2. Бережко В.К., Руднева О В., Далаева И.Б. Иммунохимический анализ метаболитов клеточной культуры протосколексов Echinococcus multilocularis // Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями» - 2004, вып. 5, с. 63-66.

3. Руднева О.В. Культивирование клеток цестод, как способ получения диагностических антигенов// Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями»-2004, вып.5. - с.336-339.

4. Руднева О.В., Бережко В.К. Иммунопрофилактичсские свойства «клеточных» антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis разного возраста. // В сб ««Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями»-2005. - вып.6 - с.306-309.

5. Руднева О.В. Диагностическая эффективность клеточных метаболитов-антигенов протосколексов ларвоцист Echinococcus multilocularis при цистном эхинококкозе.// Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 2005. - т.41. -с.305-311.

6. Бережко В.К., Руднева О.В. Иммунопрофилактика ларвалышх цестодозов (достижения, перспективы)// Тр. Всес. ин-та гельминтол. -

2005. -т.41. -с.86-101.

7. О.В.Руднева, И.Б.Далаева, В.К.Бережко Иммунохимический анализ и диагностическая эффективность «клеточных» антигенов Echinococcus multilocularis при эхинококкозе свиней// Тр. Всес. ин-та гельминтол. -

2006. -т.42. - с.

8. Бережко В.К., Руднева О.В Методика идентификации «клеточных» антигенов эхинококков // Тр. Всес. ин-та гельминтол. -2006,- т.42.-с.

Принято к исполнению 13/02/2006 Заказ № 74

Исполнено 14/02/2006 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 уутете.аЛо^ега! ги

1200C fi

»"4659

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Руднева, Ольга Вячеславовна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Антигены эхинококков, их характеристика, диагностическая эффективность.

1.2 Иммунопрофилактика ларвальных 22. цестодозов.

2. Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы.

2.1.1. Подготовка к проведению культуральной работы. 43.

2.1.2. Получение инвазивного материала Е. multilocularis, 44. заражение белых крыс.

2.1.3. Получение вторичных ларвоцист Е. multilocularis 2, 4 и 6 - месячного возраста, приготовление первичной клеточной культуры протосколексов, проверка ее 48. жизнеспособности.

2.1.4. Культивирование клеток протосколексов из ларвоцист E.multilocularis разного возраста, получение клеточных метаболитов, оценка их антигенной активности. 49.

2.1.5. Контроль клеточных метаболитов на стерильность, безвредность, определение содержания белка. 53.

2.1.6. Иммунохимический анализ антигенов-метаболитов клеточной культуры протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист Е. multilocularis 54. а) с кроличьей гипериммунной сывороткой к антигенам соматического экстракта протосколексов паразита; 54. б) с сывороткой человека с подтвержденным диагнозом цистного и альвеолярного эхинококкозов; 55. с) с сыворотками экспериментально зараженных Е. multilocularis белых крыс. 55.

2.1.7. Исследование антигеноактивных серий метаболитов («клеточных» антигенов) протосколексов из ларвоцист Е. multilocularis иммуноферментной реакцией 55. (ИФР). а) с сыворотками свиней; 55. б) с сыворотками людей. 55.

2.1.8 Изучение иммунопрофилактических свойств «клеточных» антигенов при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе мышей в комплексе 56. а) с иммуномодулятором риботаном; 56. б) с полным адъювантом Фрейнда. 58.

2.1.9. Статистическая обработка результатов. 59.

2.2 Результаты исследований. 59.

2.2.1. Анализ данных по культивированию клеток протосколексов Е. multilocularis из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист паразита. 59.

2.2.2. Характеристика и контроль «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист Е. multilocularis. 61.

2.2.3. Результаты иммунохимического анализа «клеточных» антигенов протосколексов. 66.

2.2.4. Оценка диагностической эффективности «клеточных» антигенов протосколексов из 2-, 4- и 6-месячных ларвоцист Е. multilocularis. 72. а) при цистном эхинококкозе свиней; 72. б) при цистном эхинококкозе людей. 75.

2.2.5. Сравнение диагностической эффективности «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6 - месячных ларвоцист Е. multilocularis при цистном эхинококкозе 82. человека.

2.2.6. Иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов в комплексе с риботаном при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе мышей. 86.

2.2.7. Иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов в комплексе с адъювантом Фрейнда при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе мышей. 91.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимический анализ, диагностическая эффективность и протективные свойства клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis"

Актуальность проблемы.

Цистный и альвеолярный эхинококкозы являются одними из наиболее опасных гельминтозоонозов. Распространение в России цистной и альвеолярной формы эхинококкозов за 1986-1995 годы остается примерно на одном уровне - около 1,1 случаев на 100 тысяч населения. За последние годы этот показатель может несколько увеличиться по причине усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальных условий жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля (Коваленко Ф.П. и др., 2002).

Невозможность ранней клинической диагностики ларвального эхинококкоза приводит к необходимости разработки и усовершенствования иммунологических методов, так как полученная с их помощью информация имеет не только диагностическое значение, но может служить также для оценки эпидемической и эпизоотической ситуации. Немаловажное значение для успешной борьбы и профилактики ларвальных цестодозов, как эхинококкозы, приобретает разработка иммунопрофилактических средств на основе специфических антигенов паразита и неспецифических иммуностимулирующих препаратов. Применение иммунопрофилактических средств позволяет значительно повысить сопротивляемость организма, снизить, а в некоторых случаях и предотвратить заражение животных. Проведение полноценных иммунодиагностических и иммунопрофилактических исследований невозможно без наличия активных и высокоспецифичных антигенов, получение которых традиционными методами в последние годы стало достаточно проблематичным, поскольку требует значительных количеств исходного гельминтного материала. В процессе инвазии при ларвальных цестодозах, как и при других гельминтозах в организме хозяина синтезируются антитела различной специфичности, причем некоторые из них являются продуктом действия антигенных компонентов, являющихся общими для большинства гельминтов, что значительно затрудняет разработку иммунодиагностических методов. Экспериментально установлено, что диагностическая эффективность иммунореакций в большой степени зависит от качества используемых антигенов. Поэтому получение стандартизированных видоспецифичных антигенов гельминтов является одной из актуальных задач, в решении которых большое значение имеют биотехнологические методы. С развитием биотехнологии стало возможным конструирование иммунодиагностических и иммунопрофилактических препаратов нового поколения, основанных на использовании генной инженерии и гибридомной техники. Применение этих технологий позволило создать рекомбинантные пептиды, обладающие свойствами антигенов.

К числу перспективных направлений биотехнологии в получении антигеноакгивных препаратов из гельминтов относится и клеточная инженерия, которая позволяет использовать культуры клеток для решения многих научных и прикладных задач биологии, медицины и сельского хозяйства. Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в искусственных питательных средах путем их многократного пассирования. Хотя работ по культивированию клеток тканей и органов гельминтов немного, подобные исследования проводились давно и были сделаны конкретные выводы о такой возможности (Sakamoto Т. et al., 1967; Rickard M.D., Bell K.J., 1971; Sakamoto Т., 1978; Smith М.А., 1979; Fiori et al., 1988; Furuya K. et al., 1990; Feng J.-J. et al., 1992; Lu J.H. et al., 1998). Очищенные экскреторно-секреторные антигены, полученные при культивировании гельминтов рода Echinococcus, используются для изучения иммунитета и вакцинации животных (Heath D.D., 1976; Rickard M.D., 1978; Onawunmi О.А., Coles G.C., 1980; Osborn О J., Heath D.D., 1982).

В свете вышеизложенного актуальными представляются исследования по использованию клеточной технологии для получения антигенов протосколексов из вторичных ларвоцист E.multilocularis разного возраста, изучению идентичности «клеточных» антигенов иммунохимическим методом и оценке их диагностической и протективной эффективности.

Цели и задачи исследования.

Основной целью наших исследований было получить «клеточные» антигены из протосколексов E.multilocularis, выделенных из 2-, 4- и 6-месячных ларвоцист паразита, провести их иммунохимический анализ, оценить диагностическую эффективность и изучить протективные свойства.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить 2-, 4- и 6-месячные ларвоцисты E.multilocularis, выделить клетки протосколексов и подобрать оптимальные условия их культивирования в искусственных питательных средах для получения клеточных метаболитов.

2) Провести отбор антигеноактивных серий клеточных метаболитов.

6) Изучить протективные свойства «клеточных» антигенов E.multilocularis разного возраста в комплексе с иммуномодулятором риботаном, и также с полным адъювантом Фрейнда при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе.

Научная новизна

Впервые иммунохимическим анализом с различными антисыворотками установлено 1-2 идентичных антигенных компонента в «клеточных» антигенах протосколексов из 2-, 4- и 6-месячных ларвоцист E.multilocularis, соматическом экстракте и 3-дневных экскреторно-секреторных продуктах культивируемых in vitro протосколексов паразита.

Впервые на основании разработанных параметров постановки иммуноферментной реакции со всеми типами «клеточных» антигенов протосколексов E.multilocularis проведена сравнительная оценка их диагностической эффективности при цистном эхинококкозе свиней и человека. Установлена чувствительность иммунотеста при цистном эхинококкозе свиней соответственно 75,6; 73,3;73,3%; специфичность - 68,9; 72,1; 69,6%; при цистном эхинококкозе человека - 89,66; 89,66; 86,2%; и - 82,07; 86,2; 86,2%. Впервые изучены протекгивные свойства полученных «клеточных» антигенов протосколексов Е.multilocularis в комплексе с иммуномодулятором риботаном и с полным адъювантом Фрейнда при экспериментальном эхинококкозе. Эффективность защиты в первом случае составила соответственно 91,7; 91,7; 83,4%; во втором-80,0; 90,0 и 70,0%.

Практическая значимость

Установленная диссертантом иммунохимическим анализом идентичность антигенов-метаболитов культивируемых в искусственной питательной среде клеток протосколексов Е.multilocularis , выделенных из 2-, 4 - и 6-месячных ларвоцист паразита, доказывает экономическую целесообразность использования в культуральной работе для получения «клеточных» антигенов эхинококков ларвоцисты Е.multilocularis не более 3-4-месячного возраста, что позволит сократить как срок содержания инвазированных экспериментальных животных, так и затраты на их кормление.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы представленны и обсуждены на:

1. Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (2002-2004гг).

2. Заседаниях Ученого Совета ВИГИС (2002-2005гг)

3. Секции «Инвазионные болезни животных «Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005г).

Основные положения, выносимые на защиту

Культивирование клеток протосколексов, выделенных из ларвоцист Е.multilocularis 2,4 и 6 - месячного возраста, получение «клеточных» антигенов.

Иммунохимический анализ «клеточных» антигенов разного типа с использованием кроличьей гиперимунной сыворотки к соматическому экстракту протосколексов паразита, сыворотки человека с подтвержденным диагнозом цистного и альвеолярного эхинококкоза и сыворотки экспериментально зараженных E.multilocularis крыс.

Оценка диагностической эффективности ИФР с «клеточными» антигенами E.multilocularis разного типа с сыворотками людей и свиней.

Протективные свойства полученных «клеточных» антигенов при экспериментальном альвеолярном эхинококкозе.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ и 2 работы приняты к публикации.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 200 источников, в том числе 53 отечественных и 147 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 24 рисунками. и

1. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Руднева, Ольга Вячеславовна

4. Выводы

1). Проведено культивирование клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист E.multilocularis 2-,4- и 6-месячного возраста, получены антигены клеточной культуры («клеточные» антигены) с содержанием белка 2175 мкг/мл 4600мкг/мл и 3500мкг/мл соответственно.

2, 4 и 6 - месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis проявлялась не более 1-2 комплексов антиген-антитело, представленных в РИД идентичными полосами преципитации.

4). Установлено наличие в «клеточных» антигенах протосколексов 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis диагностического антигенного компонента, способного выявлять специфические антитела в сыворотках экспериментально зараженных E.multilocularis крыс и сыворотках больных цистной и альвеолярной формой эхинококкоз.

6). Диагностическая эффективность ИФР с «клеточными» антигенами протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis при цистном эхинококкозе человека составила соответственно 89,7, 89,7 и 86,2% по чувствительности и 82,07, 86,2 и 86,2% по специфичности.

7). Изучены иммунопрофилактические свойства «клеточных» антигенов протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis в комплексе с иммуномодулятором риботаном и полным адъювантом Фрейнда при экспериментальном вторичном альвеолярным эхинококкозе мышей.

8). Установлено, что 3-кратная подкожная иммунизация мышей «клеточным» антигеном протосколексов из 2, 4 и 6-месячных вторичных ларвоцист Е. multilocularis в дозе 80 мкг белка и 5 мкл риботана предохраняла мышей от заражения инвазивным материалом E. multilocuiaris. Защитный эффект составил 91,7; 91,7 и 83,4%

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Руднева, Ольга Вячеславовна, Москва

1. Аделыиин Ф.К., Баллад Н.Е., Коваленко Ф.П. Оценка протекгивной активности очищенных фракций альвеококкового антигена при экспериментальном альвеококкозе линейных мышей// Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 1983. -Т.61, №2. -С.21-26.

2. Аделыиин Ф.К., Баллад Н.Е., Сажин В.А. Биохимический состав неочищенного альвеококкового антигена // «Фауна, сист. биол. и экол. гельминтов и их промежуточных хозяев.» Горький, 1983, с.3-5.

3. Аделыиин Ф.К., Ярулин Г.Р. Оценка иммунизирующей активности антигенов альвеококка с помощью РИГА и РИФ //Мед. паразитол. и паразитарные болезни. 1983. - Т.61, №6. - С.46-50.

4. Алферова М.В. Реакция сколексопреципитации при экспериментальном цистициркозе крупного рогатого скота.// «болезни с.-х. животных» труды УзНИВИ, Ташкент. 1978. -т.28, ч.1.-26-28.

5. Баллад Н.Е. Изучение антигенных компонентов цистицерков Cysticercus bovis.//Tp.Bcec. института гельминтологии.-1971.-Т.17.-С.269-270.

6. Баллад Н.Е. Иммунохимическая характеристика антигенов, выделяемых на личиночной стадии Taeniarhynchus saginatus./Яр.Всес. института гельминтологии.-1973.-№2.-С.131-136.

7. Баллад Н.Е., Шамхалов В.М., Белозеров С.Н., Клименко В.В., Шеховцов Н.В., Написанова Л.А. Изучение диагностической эффективности иммуноферментной реакциипри эхинококкозе овец в производственных условиях.//Бюлл. ВИГИС.-1991 .-Т.53.-С. 10-15.

8. Баллад Н.Е., Гаврилова Е.М., Зорихина В.И. Эффективность применения иммуноферментного метода в диагностике эхинококкоза и альвеококкоза в зависимости от степени очистки антигена. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. -1979.-т.48., №2.-С. 70-76.

9. Баллад Н.Е., Гаврилова Е.М., Белова И.Н. Определение диагностического значения иммуноферментного метода (на примере определения антител к антигенам эхинококка). // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 1986. - №3. - С. 2226.

10. Berezhko V.K., Klimenko V.V., Uspensky A.V., Shekhovtsov N.V. Field trials of diagnosis of hydatidoses in sheep.// Bull. Soc. fr. parasitol. 1990, 8. suppl.№2., - p.908.

11. Бережко В.К., Бессонов А.С. Изучение метаболитов клеток перевиваемой культуры метацестоды T.crassiceps.//Tp. Всес. ин-та гельминтол.-1996.-Т.32.-С. 1822.

12. Бережко В.К., Кленова И.Ф. Антигенная активность клеточных метаболитов протосколексов Coenurus cerebralis.//Tp. Всес. ин-тагельминтол.-1999.-Т.35.-С.39-45.

13. Бережко В.К., Коваленко Ф.П. Клеточные метаболиты вторичных ларвоцист Echinococcus multilocuiaris как диагностический антиген при эхинококоозах. // Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с празитарными болезнями». Москва. - 1999. - с.30-32.

14. Бережко В.К., Бессонов А.С./Использование клеточных метаболитов E.multilocularis в качестве диагностических антигенов./Ветеринария.-2000.-№2.-С.31 -34.

15. Бережко В.К., Кленова И.Ф. Культивирование клеток цестод в искусственных питательных средах и характеристика антигенов клеточной культуры// Материалы юбилейной конф.,посвященной 20-летию КБГСХА, секция «Зооветеринарные науки», Нальчик. 2001. - С.59-61.

16. Бережко В.К., Кленова И.Ф., Коваленко Ф.П. Иммунопрофилактические свойства антигенов клеточной культуры метацистоды Echinococcus multilocularis при экспериментальном альвеолярном гидатидозе мышей//Тр. Всесс. ин-та гельминтол.-2001. -Т.37. С. 34-41.

17. Бессонов А.С. Специфическая профилактика паразитарных болезней //Ветеринария. 2000. - №11. -С.3-6.

18. Бессонов А.С. альвеолярный эхинококкоз и гидатидоз // Из-во Россельхозакадемии. Москва. 2003.-334стр.

19. Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А., Денисенко Г.Ф., Гололобова М.Т., Панкова Г.Е., Камыкова Т.Т. Культура клеток и тканей животных: Учебно-методическое пособие//Ставропол ь.-1980,-112с.

20. Залаторене А.Тучноклеточная реакция в некоторых органах белых крыс при введении эхинококкоз но го антигена //В сб. "Теор. и пракг. вопр. паразитол. Материалы 8-й научной конференции по проблемакм паразитологии в Прибалтике", Тарту. 1979. - С.73-74.

21. Збарский А.И., Тумольская Н.И./Оценка состояния Т- и В -систем иммунитета у больных эхинококкозами с помощью клеточных и гуморальных тестов // Мед. паразитол. и паразитар. болезни 1983. - Т.61, №2. - С. 15-21.

22. Зорихина В.И., Баллад Н.Е./Серологические методы диагностики эхинококкоза.//Эхинококкозы. Методы исслед., леч., проф.-М.-1990.-С.49-61.

23. Зорихина В.И., Баллад Н.Е./Иммунологический метод (ELISA) в диагностике эхинококкозов.//4-я научи, конф. по паразитол.-Варна.-1983.-С.238-239.

24. Зорихина В.И., Баллад Н.Е., Кишинян А.Ш./Сравнительная эффективность ИФР и РИГА в диагностике эхинококкоза.// Мед.паразитол. и паразитарн. бол.-1982.-№2.-С.21-24.

25. Ибрагимов P.M. Получение и биохимическая характеристика атигенных (аллергенных) фракций эхинококка. //Автореф. дисс. канд. биол. наук Алма-Ата.-1970.- С.98-99.

26. Кленова И.Ф. Разработка клеточной технологии получения антигенов цестод (на примере Coenurus cerebralis и Echinococcus multilocularis): Дисс.канд. вет. наук. М.-1999.-125с.

27. Коваленко Ф.П. и др. «Способ моделирования ларвального альвеококкоза» А.с. СССР № 991485 // Бюл. «Открытия и изобретения». 1983. - № 3. - С. 238.

28. Kovalenko F. et al. «Hydatid diseases of human (cystic and alveolar) in Russia (1983 1997)» // Acta Parasitologica, VIII Europ. Multicolloquiym of Parasitol., July, 2002. - 2002. - V. 45. -№ 3.-P. 241-242.

29. Косминков И.Е. Диагностика и профилактика цистицеркозов и ценуроза жвачных //Дисс. д-ра вет. наук. М. -1990.

30. Красюкова Л.С. Культивирование клеток ларвоцист эхинококка и использование его протосколексов для отбора антгельминтных препаратов: Дисс.канд. биол. наук. М.-1987.-184с.

31. Красюкова Jl.С. Получение клеточной суспензии из ткани эхинококкового пузыря //10 конф. Укр. об-ва паразитол., Одесса, -1986. ч.З. матер, конф. Киев. - 1988 - с.21-22.

32. Михайлов С.Н., Тротт В.Ф./ Об иммунных реакциях больных альвеококкозом печени// Гельминтозы человека. Респ. сб. научн. трудов. Ленинград. 1987. - С. 177-181.

33. Новак М.Д./Иммунодиагностика эхинококкоза овец и крупного рогатого скота.//Мат. докл. научи, конф. «Актуальн. вопр. теор. и прикл. тремат-ии и цестод-ии».-М.-1997.-С. 104106.

34. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Опыт получения рекомбинантных белков-антигенов Echinococcus granulosus. //Труды ВИГИС, т.40, - Москва, 2004. - с. 256-275.

35. Петров П., Юрупова Д., Ешкенази M./ELISA в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза.//Эпидемиол., микробиол. и инфекц. Болезни.-1981 .-Т. 18.-№2.-С. 178-181.

36. Пинаев Г. П. «Методы культивирования клеток», 1989.

37. Подопригора Г.И., Збарский А.И. Перспективы развития иммунодиагностического и иммунопрофилактического направления в паразитологии.//Мед. паразитол. и паразитарн. болезни,-1990.-№5.-С.26-30.

38. Подопригора Г.И., Старкова Т.В., Эккерт Д., Готстейн Б. Сравнительная эффективность коммерческих тестов (российского и швейцарского производства) иммуноферментного анализа на эхинококкоз.// Мед. паразитол. и паразитарн. болезни.- 1994.-№3.-С.51-52.

39. Раззаков Ш.А. Выявление видоспецифических и перекрестно реагирующих антигенных компонентовэхинококка и альвеококка.//Мед. паразитол. и паразитарн. болезни,-1975.-Т.44.-№4.-С. 118-155.

40. Разаков Ш. А. Получение сывороток узкой специфичности и их использование для идетнификации антигенных компонентов эхинококка и альвеококка. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 1976. -Т.45, №2, - С.148-150.

41. Раззаков Ш.А. Сравнительная антигенная характеристика разных образцов эхинококковой жидкости и экстрактов альвеококковых узлов.// Мед. паразитол. и паразитарн. болезни.- 1975.-№2.-С. 137-142.

42. Сивкова Т.Н. Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры при цистном гидатидозе животных // В сб. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями (зоонозы).» Москва, 2002. вып. 3. - с.305-307.

43. Сивкова Т.Н. Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры протосколексов Echinococcus granulosus при цистном гидатидозе животных // Труды ВИГИС, т.38, -Москва, 2002. - с. 278-284.

44. Сивкова Т.Н., Бережко В.К. Эффективность антигенов клеточной культуры протосколексов Echinococcus granulosus и Echinococcus multilocularis в диагностике цистного гидатидоза свиней. // Ветеринария. 2002. - №8. - с.7.

45. Спиер Р.Е. и Гриффите Дж. Б. «Биотехнология клеток животных», 1989.

46. Тумольская Н.И., Збарский А.И., Кудряшова Н.М. Некоторые показатели иммунитета у больных эхинококкозом и альвеококкозом в зависимости от особеностей течения заболевания. // Мед. паразитол. и паразитар. болезни 1983. -Т.61, №5. - С. 10-16.

47. Шумова Н.С. Разработка специфической профилактики тенуикольного цистицеркоза овец // Дисс. канд. вет. наук. Москва. 1994. - 133с.

48. Ali-Khan Z. Host-parasite relationship in echinococcosis. I. Parasite biomass and antibody response in three strains of inbred mice against graded doses of Echinococcus multilocuiaris cysts.//J.Parasitol.-1974.-V.60.-P.231-235.

49. Ali-Khan Z., Siboo R. Echinococcus multilocuiaris immunoglobulin and antibody response in C57BL/6S mice. // «Exp. Parasitol». 1982, - V.53., №1. - P.97-104.

50. Ali-Khan Z., Siboo R. Immune complexes experimental alveolar hydatidosis. // «Tropenmed und Parasitol». 1983, -V.34., №3.-P. 187-192.

51. Allintas N., Ozensoy S. Application of biotin-avidin system: determination of antybody response in hydatidosis. // 6th Int. Helminthol. Simposium the High Tatras, CSFR., sept. 23-27, Progr. and Abstr. -1991. P.93.

52. Auer H., Hermentin K., Aspock H. In vitro production of Echinococcus antigens for diagnosis. // «Progr. and Abstr. of the V Europ. Multicolloq. of Parasitol., sept. 4-9, 1988, Budapest, Hungary», 1988. P.10-6.

53. Bareja U.K., Basak S., Thusoo Т.К. Immunodiagnosis of human hydatiddisease.//J.Commun.Diseases.-1997.-N4.-P.313-319.

54. Brandonisio O., Greco В., Panaro M., Altamura M., Jarillo E. Antiparasite immutity and evasion strategies from the host. // Biomed. Lett. 1993. - V.48, №191. - P.235-246.

55. Bout D., Fruit J., Capron A. Purification d'un antigene specifique de liquide hydatique.//Anns Immunol.Inst.Pasteur.-1974.-V.125C.-P.775-788.

56. Bhattacharya A., Bhattacharya S., Sehgal D. Molecular basis of immune response against parasites. // Curs. Sci India. 1991. -V.60, №9-10.-P.569-580.

57. Bruschi Fabrizio Nodulazione delle cellule intflammatorie nelle infezione da elminti // Ann. 1st. Super. Sanita. 1997. - 33, №4. -c.541-549.

58. Capron A., Biguet S., Vernes A. Le diagnostic immunoelectrophoretique de l'hydatidose.//J. dvHydatidiogie Sim. ed. Lion.-1967.-P.27-40.

59. Capron A., Biguet S., Vernes A., Afchain E. Structural antigenique des helminthes. Aspects immunologigues. Des relations hoste-parasite // Pathol. Bid. 1968, V.16. - P.121-138.

60. Capron A., Wakelin D., Tsuji M., Antigenic character of parasitic organisms VI Final remarks.// Rew. Adv. Parasitic. Proc. 4 Int. Congr. Parasitol КОРА IV, Warszawa, 19-26 Aug. 1978, Warszawa, 1981. P.618-621.

61. Capron A., Dessaint J.P. Molecular basis of host-parasite relationship: towards the definition of protective antigens. // Immunol. Rev. 1989. -V. 112. - P.27-48.

62. Capron A., Dessaint J. Immunologic aspects of schistosomasis. //Annu. Rev. Med.: Select. Top. Clin. Sci. 1992. — V.43. - P.209-218.

63. Capron A., Yarzabal L., Vernes A.,Fruit J. Le diagnostique immunologique de ehcinococcose humaine.//Path. Bid.-1970.-V.18.-N 7-8.-P.357-365.

64. Chordi A., Kagan ^Identification and characterization of antigenic components of sheep hydatid fluid by immunoelectrophoresis.//J. Parasit.-1965.-V.51 .-NI.-P.63-71.

65. Contreras M., Del, Gallo S., Salinas Sapunar J., Sandoval L., Solis F. Evaluation of ELISA IgG, using a piorified antigen in thediagnosis of human hydatidosis. // Bol. Chileno Parasitol., 1994. — V.49, №1/2,-P. 24-30.

66. Craig P.S., Rickard M.D. Anti-oncospheral antibodies in the serum of lambs experimentally infected with either Taenia ovis and Taenia hydatygena.// «Z.Parasitenk».-1981.-V.64.№2.-P.169-177.

67. Cuesta Bandera C., Guillen Liera J.L., Casado escribano N. Diagnostico de la hydatidosis natural у experimental. Analisis de las resultados obtenidos por diversas pruebas.//Rev.iber. Parasitol.-1982.-P.359-365.

68. Dieckmann-Schuppert A., Ruppel A., Burger R., frank W. Echinoccoccus multilocularis: in vitro secretion of antigen by hybridomas from metacestode germinal cells and murine tumor cells//Experimental Parasitology.-1989,- V.29.- P. 186-191.

69. Dixon J.В., Jenkins P., Carter S.D., Craig P.S. Abnormal immunoregulation in metacestode infection.//16th. Int. Congr. of Hydatidology, Beijing, China, 1993. V.30. - P.290.

70. Dottorini S., Sparvoli M., Baldelli F., Fiorio M., Tassi C. Echinococcus granulosus: diagnosis of hydatid disease in sheep.//Riv. Parasitol.-1984.-V.45.-N2.-P.333-340.

71. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: comparison between antigens in scolices and hydatid fluid.//lnt.J.Parasitol.-1978.-V.8.-P.259-265.

72. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: characterisation of the main antigenic component (Arc 5) of hydatid fluid.//Exp.Parasitol.-1977.-V.43. №2 -P.307-314.

73. Eckert J., Jacquiler P., Baumann D., Raeber P.A. Echinokokkose des Menschen in der Schweiz,1984-1992.//Schweiz. med. Wochenschr. 1995. - 125. - №42. - 19891998.

74. Edwards G.T., Herbert J.V. Preliminary investigations into the immunization of lambs against infection with Taenia multiceps metacestodes. /Л/et. Parasitol. 1982. - V.9, №3-4. - P. 193199

75. Faubert G. M. Antigenic character of parasitic organisms. Ill Parasite products in the regulation of the immune response. // Rev. Adv. Parasitol. Proc. 4-th Int. Congr. Parasitol., Warszawa, 19-26 aug. 1978. Warszawa, 1981. P. 604-608.

76. Felleisen R., Gottstein B. Comparative analysis of fullength antigen 11/3 from Echinococcus multilocularis and Echinococcus granulosus . // Parasitology, 1994. -V. 109, №2: 223-232.

77. Felleisen R., Zimmermann V., Muller N., Gottstein B. Cellular immunerresponse in alveolar echinococcosis to recombinant antigens. // 8th Int. Congr. of Parasitol., 10-14 Oct. 1994. Izmir-Turkey, Abstr., V.1.-P.155.

78. Feng J.J., Wang J.Y., Qu J.A., Xiao S.H. ELIB of specific antigens in vitro cultivated cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus. .//Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases.-1993.-V.ll, №1.- P.63-65.

79. Feng J.-J., Xiao S.-H., Guo H.-F., Shen B.-G., Jiao W. Screening antyhydatid drugs using cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus.//Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases.-1993.-11 (№1): 12-6.

80. Fiori P.L., Monaco G., Scappaticcis S., Pugliese A., Canu N., Cappuccinelli P. Establishment of cell cultures from hydatid cysts of Ehinococcus granulosus. // Int. J. Parasitol. 1988. - V.18. -P.297-305.

81. Fischman A./A new whole-scolex complement-fixation test for hydatid disease.//Bull.Wld. Hlth. Org.- 1968.-T.39.-№l.-P.43-48.

82. Frosch P., Hartmann M., Muhlschlegol F., Frosch M. Sequence heterogeneity of the echinococcae antigen B. // Mol. and Biochem. Parasitol. 1994.- V.64, №1: 171-175.

83. Furuya К., Honnra H., Kumagai M. A cell line derived from larvae Echinococcus multilocuiaris. // Bull. Soc. Fr. Parasitol. -1990. -V.8, suppl. №1. P.159.

84. Garabedian J.A./Evaluation of the reactivity of hydatid whole-scolex antigen in hydatid disease serology.//Ann. Trop. Med. Parasit.-1971.-V.65.-N3.-P.385-391.

85. Gemmell M.A., Johnstone P.D. Factors regulating tapeworm populations: estimation of the duration of asquired immutity by sheep to Taenia hydatigena. //Research in Veterinary Science, -1981.-V.30, №1. P.53-56

86. Gonzalez G., Nieto A., Fernandez C., Orn A., Wernstedt Ch., Hellman U. Two different 8 kDa monomers are involved in the oligomeric organization of the native Echinococcus granulosus antigen B. // Parasite Immunol. 1996. - V.18, №12. - P.587-596.

87. Gottstein В., Eckert J., Fey H. Serological differentiation between Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocuiaris in man.//Z. Parasitenk.-1983.-V.69.-N3.-P.347-356.

88. Gottstein В., Tshudi K., Eckert J.,Ammann R. Em-2-ELISA for the follow-up of alveolar echinococcosis after complete resection of liver lesions.//Trans.Roy.Soc.Trop.Med.andHyg.-1989.-V.83.-N3.-P.389-393.

89. Gottstein В., Schantz P.M., Todorov Т., Saimot A.G., Jacquier P. An internation study on the serological differential diagnosis ofhuman cystic and alveolar echinococcosis.//Dull.W.H.0.-1986.-V.64.-NI.-P.101-105.

90. Gottstein B. Immunodiagnosis of human infection by larval cestodes.//Progr. and Abstr. of the V-th Europ. Multicollog. of Parasitol., sept. 4-9., 1988., - Budapest, Hungary. Budapest. -1988.-10-15.

91. Gottstein В., Schantz P.M., Wilson J.F. Serological screening for Echinococcus multilocularis infections with ELISA//Lancet, 1985, V.1, №8437, P. 1097-1098.

92. Haernander A., Nieto A. //Parasite Immunol. 1994. - V.16, №10. - P.537-544

93. Hariri M.N., Schvabe C.W., Koussa M. Host-parasite relationships in echinococcosis.XI. The antigens in the indirect hemagglutination test for hydatid disease.//Am.J.Trop.Med.-1965.-V.14.- P.592-604.

94. Harrison J.S., Parkhouse R.M.E. Antigens of Taeniid cestodes in protection, diagnosis and escapl. // Parasite Antigens Protect. Diagn. And Esape. 1985. - P. 159-172.

95. Heath D.D. Resistance of Taenia pisiformis iarvae in rabbits: Immunisation against infection using non-living antigens from in vitro culture.//lntern.J.Parasitology.-1976.-V.6.-P. 19-24.

96. Heath D.D., Holeman В., Shaw P.J. Echinococcus granulosus: the mechanism of oncosphere lysis by sheepcomplement and antibody. //Int. J. Parasitol. 1994. - V.24, №7. - P.929-935.

97. Helbig M., Frosch P., Kern P., Frosch M. Serological differentiation between cystic and alveolar echinococcosis by use of recombinant larval antigens.// J. Clin. Microbiol. 1993. - V.31, №12. -P.3211-3215.

98. Hilwing R.W., Cramer J.D./ln vivo cross-creactivity of Taenia saginata and Taenia crassiceps antigens in bovine cysticercosis. /Л/et. Parasitol. 1983. - V. 12, №2. - P. 155-164.

99. Hira P.R., Bahr G.M., Shweiki H.M., Behlehani K. An-enzyme-linked immunosorbent assay using an are 5 antigen for the diagnosis of cystic hydatid disesse. // Ann. Trop. Med. and Parasitol., 1990. V.84., № 2. - P. 157-162.

100. Hulsmeier A.J., Gehrid P.M., Geyer R., Sack R., Gottstin В., Deplaces P., Kohler P. A major Echinococcus multilocularis antigen is mucin-type glycoprotein.//J. Biol. Chem. 2002. -V.277,№8. - P.5742-5748.

101. Ito A. Evaluation of alveolar and cystic echinococcosis by immunoblot analisis.//Arch. Int. de la hydatidosis., V. 52.-XVIII Int.Congr.Hydatidol.-Lisboa Portugal.-1997.-P. 217.

102. Ito A. Serodiagnosis of echinococcosis in humans and animals. // 16th Int. Conf. of the WAAVP. Progr. and Abstr. 10-15 Aug. 1997. - Sun. City, South Africa. - 1997. - P.42.

103. Jong W. K., Heath D. D. «Ars 3» antibodies in mera of sheep infected with Echinococcus granulosus, Taenia hydatigena and Taenia ovis. //Parasite Immunology. 1979. - P.27-38.

104. Kagan I., Norman L.Antigenic analisis of Echinococcus antigens by agar diffusion techniques.// Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1961.- V.10.- N5.-P.727-734.

105. Kagan I., Norman L. Analisis of helminth antigens (Echinococcus granulosus and Shistosoma mansoni) by agar gel methods.//Ann. N. Y. Acad. Sci.-1963.-V.113.-P. 130-53.

106. Kamiya M. Workshop summary: Zoonosis environmental transmission as exemplified by echinococcosis. // Vet. Parasitol. -1996.-V.64., № 1-2. -P.149-151.

107. Kanwar J.R., KanwarR. Purification and partial immunochemical characterization of low molecular mass diagnostic Echinococcus granulosus immunogen for sheep hydatidosis.//FEMS Immunol, and Med. Microbiol.-1994.-V.9.-N2.-P.101-108.

108. Kassai T. Die immunologische Reaktivitat des Wirtes als Umveltfaktor und ihre Bedeutung fur die Entwicklung des Parasitismus. //Angew. Parasitol. 1979. - V.20, №3. - P. 123131.

109. Knobloch I., Lederer I., Mannweiler E. Species-specific immunodiagnosis of human Echinococcus with grude antigens.//Eur. I.Clin. microbial.-1984.-V.3,№6.-554-555.

110. Kudrna К., Procopic J. Chalone-like inhybition of DNA syntesis in helminths, //folia Parasitologca. 1985. - V.35, №2. -P.145-149.

111. Kudrna K., Procopic J. Vaccination against cestodes review and prospect. //2nd Int. Symp. Taeniasis, 2-7 Dec., Ceske Budejovice. - 1986. - P.46-55.

112. Kumar D., Gaur S.N.S., Pathak K.M.Z., Pant G.B. factional and characterisation of the cystecercus of Taenia solium.// Res. Vet. Sc., -1987. V.43., №3. - P. 395-397.

113. Lauriola L., Piantelli M., Pozzuoli R., Arm E., Musiani P. Echinococcus granulosus: preparation of specific antisera against antigens in sheep hydatid fluid.//Zbl.Bakt.ParasitKde Abt I, Abt.Orig. A.-1978.-V.240.-P.251 -257.

114. Leykina E.S., Dalin M.V., Ballad N.E., Tchebyshev N.V., Zorikhina V.I., Poletaeva O.G. Isolation of diagnostical helminth antigens and their use in serodiagnosis.//Helmintologia.-1981.-V. 18.-P.273-280.

115. Lightowlers M.W. Cestode infections in animals: Immunological diagnosis and vaccination.//Rev. Sci.et ted. off. Int. Episoot.-1990.-V.9.-N2.-P.463-467.

116. Lightowlers M.W., Ganci C.G., Heath D., Muller V. Echinococcus granulosus EG95 vaccine clon belongs to a multigene family with homologenes in E.multilocularis //17th Jnt

117. Congr. Hydatidol., 6-10 Nov. 1995, Limassol Cyprus. Abstracts. - 1995.-P.197.

118. Lightowlers M.W., Roife R., Ganci Ch. G. Taenia saginata: vaccination against cysticercosis in cattle with recombinant oncosphere antigens// Exp. Parasitol. 1996. - V.84, №3. -P.330-338.

119. Lightowlers M.W., Lawrence S.B., Gauci C.G., Young j., Ralston M.J., Maas D. Vaaccination against hydatidosis using a defined recombinant antigen.// parasite Immunology. 1996. -V.18, №9. - P.457 - 462.

120. Lu J.H., Cheng W.X., Guo J.M. et al./ Cultivation of an Echinococcus granulosus larvae cell line// Chin. J. vet. Sci.-1998.-V.18, №5.-P.479-482.

121. Lu J.H., Cheng W.X., Guo Z.M., Kong Ch.Q., Feng D.U., Li D.Ch., Guo J.M. Культивирование линии клеток из личинок Ecinococcus granulosus. // Chin. J. vet. Sci.-1998.-V.18, №5,-P.479-482.

122. Lu J.H., Li D.Ch., Guo Z.M., Zhang S.Z., Feng D.U., Guo J.M., Иммуногенность и реакгогенность экскреторных антигенов из клеточной линии Ecinococcus granulosus. // Chin. J. vet. Sci.-1999.-V.19, №6.-P.566-568.

123. Lu J.H., Guo Z.M., Yu X.B., Feng D.U., Li D.Ch., Cheng W.X./ The cell line establishment and immunogenic study of Echinococcus granulosus//Acad. J. Sun Yal-Sen Univ. Med. Sci.,-2001.-№2 (22),- P. 81-84.

124. Luffau G., Pery P. /Antigenic structure of nematodes and prospects for vaccination on against helminth infections // Vet. Sc. Communic. 1978. - №2, №1, P.11-22

125. Machnicka В. The common antigens of Cysticercus bovis and Taenia saginata. // Bull. Acad. Pol. Sci. Ser. Sci. Biol. 1974. -V.22, №3. - P.197-199.

126. McLaren D. Disquse as an evasiwe stratagem of parasitie organisns. //Parasitology. 1984. - V.88, №4,- P.597-611.

127. McManus D.F. Characterization of taeniid cestodes by DNA analysis. // Rev. sci. et tech. off int epizool. 1990. - P.489-510.

128. Meriona A., Bout D., Capron A. Evaluation of ELISA and RAST using purified antigens for diagnosis of hydatidosis. // Pathol. biol. - 1984. - V.32, №1. - P. 15-22.

129. Mitchell G.F. Problems specific to parasite vaccines.// Parasitology. -1989. V.98. - P. 19-28.

130. Musiani P., Piantelli M., Lauriola L., Pozzuoli R. Echinococcus granulosus: specific quantification of the two most immunoreactive antigens in hydatid fluids.//J.CIin.Path.-1978.-V.31.-P.475-478.

131. Musoke A.J., Williams J.F./lmmunoglobulins associated with passive transfer of resistance to Taenia taeniaeformis in the mouse. //Immunology. 1975.-V.28, №1/3.-P. 97-101

132. Norman L., Kagan I., Chordi A./Further studies on the analisis of sheep hydatid fluid by agar gel methods.//Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1964.-V. 13.-N6.-P.816-821.

133. Onawunmi O.A., Coles G.C. Attempt tu immunise sheep with culture antigens of Taenia hydatigena.//Res. In. Veter. Sc.-1980.-V.29.-№1 .-P. 102-103.

134. Onawunmi O., Coles G. Attempt tu immunise sheep with culture antigens of Taenia hydatigena.// Res. vet. Sci. 1980. -V.29, №1. - P.122-123.

135. Oriol R., Williams J.F., Perez Esandi M.V., Oriol C./Purification of lipoprotein antigens of Echinococcus granulosusfrom sheep hydatid fluid.//Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1971.-V.20.-P.569-574.

136. Osborn P.J., Heath D.D./ Immunisation of lambs against Echinococcus granulosus using antigens obtained by incubation of oncospheres in vitro// Res.Vet. Sci.-1982.-V.33.-P. 132-133.

137. Osborn О J., Heath D.D., Roberts M.G. Vaccination of sheep against Taenia ovis. The response to various dose rates of antigens obtained by incubation of oncosperes in vitro. // Res. Vet. Sci., 1982, 32, №3,-P. 351-353.

138. Piantelli M., Pozzuoli R., Arm E., Musiani P./ Echinococcus granulosus: identification of subunits of the maior antigens.// J. lmmunoL-1977.-V.119.-P. 1382-1386.

139. Playford M., Kamiya M. Immune response to Echinococcus multilocularis infection in the mouse model: a review //Jap. J. Vet. Res.- 1992.-V.40, №2-3,-P. 113-130

140. Playford M.C., Ooi H.K., Oku Y., Kamiya M. Immunology: rodent intermediate Host models for alveolar echinococcus: biology and immunology // Alveolar Echinococcosis Liver -Sapporo. 1993. - P. 33-49.

141. Pozzuoli R., Musiani P., Arm E., Piantelli M., Mazzarella R./Echinococcus granulosus: Isolation and characterization of sheep hydatid fluid antigens.//Exp.Parasitol.-1972.-V.32.-P.45-55.

142. Pozzuoli R., Musiani P., Arm E., Patrono C., Piantelli M./ Echinococcus granulosus: evaluation of purified antigens' immunoreactivity.//Exp.Parasitol.-1974.-V.35.-P.52-60.

143. Pozzuoli R., Piantelli M., Perucci C., Arm E., Musiani P./lsolation of the most immunoreactive antigens of Echinococcus granulosus from sheep hydatid fluid.//J.lmmunol.-1975.-V.115.-P. 1459-1463.

144. Rau M.E., Tanner C.E. BCG supresses growth and metastasis og hydatid infections. //Int. J. Parasitol. 1975. -V.256, №5515. - P.318-319.

145. Rau M.E., Tanner C.E. Echinococcus multilocularis in the cotton rat: growth of intrathoracie metastases following surgical removal of subcutaneous cysts //Int. J. Parasitol. 1976. - V.6, №2. - P.151-153

146. Reuben J.M., Tanner C.E. Immunoprophylaxis with BCG of experemental Echinococcus multilocularis infections.// «4th Int. Congr. Parasitol. Warszawa. 1978. Shot Commun. Sec. E.»,lodz, - P. 51-52.

147. Reuben J.M., Tanner C.E., Rau M.E. Immunoprophylaxis with BCG of experemental Echinococcus multilocularis infections.// Infect, and Immun. 1978. - V.21, №1.-P. 135-139.

148. Rhoads M.L., Murrel K.D., Dilling G.W., Wong W.M., Baker N.F. A potential diagnostic reagent for bovine Cysticercosis.// J. Parasitol., -1985. V.71,№6, - P.779-787.

149. Rickard M.D. The use of in vitro culture of Taeniid cestode larvae to collect antigens for immunization against infection. //4-th Intern.Congr. Parasitol. 19-26 Aug. 1978. Warsawa. Short Commun. Sect.-P.67.

150. Rickard M.D. Vaccination of calves against Taenia saginata infection using antigens collected in vitro cultivation of larvae cestodes.// 4th Inter. Congr. Parasitology. 19-26 aug. 1978, Warszawa.- Shot Commun. Sec. E. P. 134-135

151. Rickard M.D., White J.В., Boddington E.B. Vaccination of lambs against infection with Taenia ovis. // Austr. Vet. J. 1976. -V.52.№5. - P.209-214.

152. Rickard M.D., Adolph A.J. Vaccination of calves against Taenia saginata infection using a «parasite-free» vaccine. // Vet. Parasitology. 1976. - №1. - P.389.

153. Rickard M.D., Adolph A.J. Vaccination of lambs against infection with Taenia ovis using antigens collected during short-term in vitro incubation of activated T. ovis oncospheres. //Parasitology. 1977. -V.75, №2. - P. 183-188.

154. Rickard M.D., Arundel J.H., Adolph A.J. A preliminary field trial to evaluate the use of immunization for the control of naturally asquired Taenia saginata infection in cattle. // Res. vet. Sci.1981. V.30, №1. - P. 104-108.

155. Rickard M.D., Bell K.J. Successful vaccination of lambs against infection with Taenia ovis using antigens produced during in vitro cultivation of the larval stages.//Res.Vet.Sc.-1971 (.-V.12.-N4.-P.401-402.

156. Rickard M.D., Harrison G.B.J., Heath D.D., Lightowlers M.W. Taenia ovis recombinant vaccine-«quo vadit».// Parasitology. -1995.-V.110.-P.5-9.

157. Rickard M.D., Williams J. Hydatidosis cysticercosis: immune mechanisms and immunisation against infection.// Adv. Parasitol.1982.-V.21 .-P.229-296.

158. Riley E.M., Dixon J.В., Jenkins P., Ross G. Echinococcus granulosus infection in mice: host responses during primary andsecondary infection // Parasitology. 1986. - V.92, №2. - P.391-403.

159. Ris D.R., Hamel K.L., Mackle Z.M./ Evaluation of ELISA test for the diagnosis of cystic hydatid disease in sheep.//Res.Vet.Sci.-1987.-V.43.-N2.-P.257-269.

160. Sakamoto Т., Yamashita J., Ohbayashi M. Studies of echinococcosis, XVIII, Observations on tissue cultured germinal cells of larval Echinococcus multilocularis.//Jpn. J. Vet. Res.-1967.-V.15-P. 75-83.

161. Sakamoto T. Development of echinococcal tissue cultured in vitro and in vivo.//Mem.Fac.Agric.Kagoshima Univ.-1978.-V. 14. №23-P. 109-113.

162. Silverman P.H., Poynter D., Podger K.R. Studies on larval antigens derived by cultivation of some parasitic nematodes in simple media: protection tests in laboratory animals. // J. Parasitol. 1962. - V.48, №4. - P.562 -571.

163. Smith M.A. Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis: in vitro Culture of the Strobilar stages from Protoscoleces.//Angew.Parasit.-1979.-V.20.-P.137-147.

164. Soulsby E.J.L. Mechanism of immunity to Helminths. // J. of Amer. Vet Med. Ass. 1961. - V. 138, №7. - P. 355-362.

165. Soulsby E.J.L. Systeme immunitaire et parasites gastro-intestinaux: guels sont les obstacles a la production de vaccins. // Ann. med. vet. 1988.- V.132, №3. - P.227-230.

166. Svilenov D., Heymer В., Haferkamp O. Immunomorphology and pathogenesis of echinococcosis. Ill Microscopic immunofluorescence studies in experimental alveolar echinococcosis. //Infection. 1978. -V.6, №1. - P. 12-15.

167. Tassi C., Dottorini S., Tolu A.G., De Rosa F. Diagnosis of hydatid disease in sheep by indirect hemagglutination test.//Rev.Parasitol.-1980.-V.41.-P.61-66.

168. Tassi C, Dottorini S., Scalise G., Geranio N. Echinacoccus granulosus: diagnosis of human hydatid disease by the indirect hemagglutination reaction with antigens from hydatid fluid and scoleces.//lnt. J.Parasitol.-1981 .-V.II.-P.85-88.

169. Taylor M.G. Irradiation-attenuated antiparasitic vaccines in ruminants. Present status and future prospects. //Isot. and Radiat Parasitol. IV Proc. Adv. Group Meet., Cambridge., 1979., Vienna. — 1981. P.83-89.

170. Tuerhong Ha.J., Zhang Z.Z., Zhang W.B., Hasyet Qi.P.S. Studies on immunization of sheep hydatidosis. //16th Int. Congr. of Hydatidol., Beijing, oct. 12-16, 1993. Beijing, China. 1993. -P.302.

171. Turcecova L., Kolarova L., Dubinsky P., Martinek K. Characteristics of antigens in tapeworms of the genus Echinococcus. //Helmintilogia.-1997.-V.34.- N3.- P. 188189.

172. Varela-Diaz V., Coltorti E., Ricardes M.I., Guisantes J.A., Yarsabal L.A. The immunoelectrophoretic characterisation ofsheep hydatid cyst fluid antigens.//Am.J.Trop.Med.Hyg.-1974,-V.23.- P. 1092-1096.

173. Varela-Diaz V., Coltorti E./Techniques for the immunodiagnosis of human hydatid disease .//Buenos Aires: Pan American Zoonosis Center.-1976.

174. Varela-Diaz V. M.f Coltorti E. A., Rickard M. D., Torres J. M. Comparative antigenic characterisation of Echinococcus granulosus and Taenia hydatigena cyst fluids by immunoelectrophoresis. // Res. Vet. Sci. 1977. - V.23, №2.-P.213-216.

175. Varela-Diaz V.M., Eckert J., Rausch R.L., Coltorti E.A., Hess H. Detection of the Echinococcus granulosus diagnostic arc 5 in sera from patients with surgically-confirmed E. multilocularis infection. //Z.Parasitenk, 1977. - V.53, №2, - P. 183-188.

176. Varela-Diaz V.M., Guarnera E.A., Coltorti E. A., et al. Significance of hydatid immunodiagnostic surveys to health care and estimation of prevalence in the argentine province of chubut. //"Tropen. Med and Parasutol" 1983. - V.34, №2, - P.98-104.

177. Vogel M., Gottstein В., Muller N., Seebeck T. Production of a recombinant antigen of Echinococcus multilocularis with high immunodiagnostic sensitivity and specificity. // Mol. and Biochem. Parasitol. 1988. - V.31, №2. - 117-126.

178. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E. A microplate method of enzyme-linked immunosor bent assay and it's application to malaria. // Bull. Wld. Hlth. Org.-1974.-V.I, №2.P.209-211.

179. Wikerhauser Т., Zukovic M., Dzakula N. Taenia saginata and Taenia hydatigena. Intramuskula vaccination of calves with oncospheres. // Exp. Parasitol. -1971. V.30, №1. - P.36-40.

180. Zhu H.X., Don L.Q., Shi X.H., Sun X.Q., Wang X.H., Niu B.H. Stadies on excretory-secretory (ES) antigens of Echinococcus granulosus: the immunogenicity of ES antigens of the protoscolex. // Chin. J. Vet. Sci a Technol., -1991. V.21, №11. - P. 8-10.

Информация о работе

Руднева, Ольга Вячеславовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.19

Диссертация

Иммунохимический анализ, диагностическая эффективность и протективные свойства клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы