Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная диагностическая эффективность клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная диагностическая эффективность клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре"

На правах рукописи

Хангалова Инесса Баторовна

Сравнительная диагностическая эффективность клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.

Специальность 03.00 19 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003171238

Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно - исследовательском институте гельминтологии имени К. И. Скрябина (ВИГИС).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Бережко Вера Кузьминична

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук Курочкина Каринэ Гегамовна Кандидат биологических наук Андреева Галина Николаевна

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии Я. Р. Коваленко

Защита состоится Ltl 2008 г в Щ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006 011 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К И. Скрябина (ВИГИС)

Адрес 11721В, Москва, Б Черемушкинская ул, д 28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС

Автореферат разослан АЗъЛсОЛгш г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

БЕРЕЖКОВ К

Введение

Актуальность проблемы

Культуры клеток животных стали неотъемлемой частью биотехнологии, они используются для решения научных проблем общей биологии, цитологии, генетики, вирусологии, иммунологии и инфекционной патологии. Одной из причин такого интереса специалистов к культивированию клеток из различных органов и тканей животных, человека и растений является возможность использования культуры клеток для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ, для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений

Всемирная организация здравоохранения придает большое значение разработке более совершенных методов культивирования возбудителей зоонозов, к числу которых относятся и эхинококкозы, с целью изучения особенностей развития и роста in vitro, для диагностики, а также для использования их в качестве рациональных моделей испытания новых средств против различных болезней Клеточная технология может с успехом использоваться также для получения биологически активных веществ со свойствами антигенов, имеющих иммунодиагностическое и иммунопрофилактическое значение Изучение антигенных свойств гельминтов на разных стадиях развития и их экскреторно- секреторных продуктов - одна из важнейших задач современной иммунологии. Создание оптимальных условий жизнедеятельности клеток вне организма, выделение продуктов метаболизма гельминтов в чистом виде, свободными от микроорганизмов и антигенов хозяина - насущная проблема современной биотехнологии в гельминтологии, может осуществляться благодаря методам культивирования гельминтов для получения специфических антигенов (В И Тараканов, 1985)

Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в синтетических питательных средах путем их многократного пассирования Однако необходимо при этом учитывать, что антигенность используемых для культивирования органов и тканей паразитов находится в связи с их систематическим положением. Так, у нематод

наибольшую антигенную активность проявляют личинки, особенно в период линьки, что связано с выделением большого количества секретов (Soulsby, 1961, Silverman et al., 1962) В то же время у цестод

антигеноактивные субстанции находятся в субтегументальной области пузыря, на присосках вблизи экскреторного отверстия протосколексов, а

пузыря, на присосках вблизи экскреторного отверстия протосколексов, а в онкосферах - под мембраной крючьев и в клетках гексакантных эмбрионов (МасЬшска, 1974, Алферова, 1978)

Исходя из вышесказанного для культуральной работы, направленной на получение специфических антигенов цестод, можно использовать два объекта - протосколексы из цисты и яйца, содержащие инвазионные онкосферы Однако в целях безопасности и с учетом обеспечения необходимой стерильности использование протосколексов или герминативных оболочек является более предпочтительным

Яйца же с инвазионными онкосферами, хотя и обладают значительной антигенной активностью, для культуры клеток менее применимы Помимо того, что они небезопасны для исследователей, загрязненность их микрофлорой кишечника хозяина требует более тщательной и длительной стерилизации, что также может отразиться на жизнеспособности клеток в культуре

Протосколексы, как источник получения первичной клеточной культуры, являются сложным биологическим объектом, состоящим из клеток различных типов и назначения Неоднородность первичной клеточной культуры влияет на процесс культивирования и на свойства получаемых метаболитов Как правило, в процессе длительного культивирования одни тага клеток могут расти и активно пролиферировать однако, получаемые при этом клеточные метаболиты не всегда могут соответствовать требованиям, предъявляемым им как антигенным препаратам. С этих позиций возникает необходимость как в научном, так и в практическом плане установления типов клеток, обеспечивающих в процессе культивирования выделение в среду обитания антигеноактивных метаболитов иммунодиагностической и иммунопрофилактической направленности.

Исходя из вышеизложенного, считаем целесообразной и актуальной работу по сравнительной оценке диагностической эффективности клеточных метаболитов протосколексов Е тиШЬсЫат в зависимости от типа клеток в культуре

Цели и задачи исследований Основной целью наших исследований было провести культивирование клеток протосколексов Е гпи1и1оси1апз, получить антигеноактивные клеточные метаболита с последующим определением типа клеток в культуре и одновременной оценкой их диагностической эффективности

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1. Получить вторичные ларвоцисты Е т.иМоси1ат, выделить клетки протосколексов, приготовить первичную клеточную культуру и подобрать оптимальные условия их культивирования в синтетических питательных средах для получения клеточных метаболитов

2 Провести отбор антигеноактивных серий клеточных метаболитов иммуноферментной реакцией (ИФР)

3 Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле установить наличие антигенов паразита в выделенных ИФР сериях клеточных метаболитов

4 Подобрать оптимальный режим фиксации и окраски культивируемых клеток протосколексов Е multilocularis, определить типы клеток в культуре.

5 Собрать банк сывороток от животных и людей, инвазированных эхинококками, другими гельминтами и клинически здоровых

6. Провести сравнительную оценку диагностической эффективности клеточных метаболитов с различной степенью антигенной активности при эхинококкозах в соответствии с типом клеток в культуре

Научная новизна Впервые проведена цитологическая

характеристика культуры клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е multilocularis, в процессе культивирования в синтетической питательной среде с последующей сравнительной оценкой диагностической эффективности полученных клеточных метаболитов при цистном и альвеолярном эхинококкозе

Иммунохимическим анализом установлено наличие в клеточных метаболитах протосколексов антигеноактивных компонентов идентичных антигенам соматического экстракта протосколексов Е multilocularis

Впервые установлена зависимость антигенной активности метаболитов культивируемых клеток протосколексов паразита от типа клеток в культуре наибольшую активность в ИФР (ОП с сыворотками зараженных Е multilocularis и Е granulosus соответственно 1,236 - 1,320) регистрировали в клеточных культурах с преобладанием клеток многогранной формы (клетки типа - 4), наименьшую (ОП с теми же сыворотками в пределах 0,350) в клеточных культурах с преобладанием больших округлых клеток (клетки типа - 2 и 3)

Практическая значимость

Материалы диссертационной работы Далаевой И. Б вошли в «Методику идентификации «клеточных» антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и опубликованную в трудах ВИГИС за 2006., т 42, с. 578-585.

По результатам цитологических исследований диссертанта подготовлена «Методика фиксации и окрашивания клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в культуре in vitro», одобренная секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины (сентябрь 2006 года)

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на

1. Заседаниях Ученого совета ВИГИС (2003-200бгг)

2 Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (2004-2006гг)

3. Секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005-2006гг).

Личный вклад соискателя.

Представленная диссертационная работа является результатом 4- летних научных исследований автора Исследования по изучению и получению инвазивного материала Е multilocularis, заражению белых крыс, получению вторичных ларвоцист Е multilocularis, приготовлению первичной клеточной культуры протосколексов, культивированию клеток протосколексов в синтетической питательной среде, а также цитологические исследования фиксация, окрашивание, типирование культивируемых клеток протосколексов аспирантом выполнены лично По результатам этих исследований автором самостоятельно опубликована статья в материалах Всероссийского общества гельминтологов РАН «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», Москва (2006) и две статьи в соавторстве с научным руководителем также в материалах ВОГ «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» за 2005 и 2007гг По материалам исследований по иммунохимической характеристике и диагностической эффективности «клеточных» метаболитов эхинококков опубликованы 4 статьи в соавторстве с научным сотрудником Рудневой OB и Сасиковой М. Р., которые не возражают в использовании результатов совместных исследований диссертантом Хангаловой И Б. (справки имеются в диссертационном совете)

Работа выполнялась под научным руководством д б н В. К. Бережко, которая оказывала научно- методическую помощь в проведении исследований, анализе полученных результатов, обобщения данных исследований

Основные положения, выносимые на защиту

1. Культивирование клеток протосколексов из вторичных ларвоцист Е multilocularis в синтетической питательной среде, получение клеточных метаболитов, их оценка ИФР и приготовление препаратов для цитологических исследований

2. Цитологическая характеристика клеток протосколексов в культуре in vitro в процессе культивирования.

3. Иммунохимический анализ антигеноактивных серий клеточных метаболитов протосколексов, полученных в процессе культивирования и выделенных ИФР

4 Сравнительная диагностическая эффективность при эхинококкозах клеточных метаболитов протосколексов Е multilocularis различной степени антигенной активности в зависимости от типа клеток в культуре

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 3 из них в рекомендуемых ВАК изданиях

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 128 страницах компьютерного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение Список литературы включает 169 источника, в том числе 74 отечественных и 95 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 7 таблицами и 23 рисунками

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен анализ работ по культивированию клеток ларвоцист эхинококков и их клеточной дифференциации, цитологической характеристике ларвоцисты эхинококка, диагностической эффективности и достижениям в области иммунодиагностики

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

Получение инвазивного материала Е. multilocularis, заражение белых крыс. Источником для приготовления первичной клеточной культуры служили протосколексы Е multilocularis, выделенные из вторичных ларвоцист паразита от предварительно зараженных этим инвазионным материалом белых крыс в дозе 4-6 тыс экземпляров на животное внутрибрюшинно в физрастворе с антибиотиками Инвазионный материал для заражения крыс- доноров получали из ИМПиТМ Протосколексы от зараженной крысы-донора выделяли в стерильных условиях Убой экспериментально зараженных крыс проводили в сроки, предусмотренные целью наших дальнейших исследований, а также при необходимости заражения новой партии животных- доноров

Получение вторичных ларвоцист Е. multilocularis, приготовление первичной клеточной культуры протосколексов, культивирование клеток протосколексов в синтетической питательной среде. Работу с инвазионным материалом Echinococcus multilocularis проводили в стерильном боксе в ламинаре с вытяжкой Очищенные от тканей хозяина ларвоцисты измельчали ножницами до гомогенного состояния Каждую порцию гомогената, полученную из ларвоцист эхинококка, промывали

раствором Содержимое цилиндров взбалтывали путем пропускания воздуха из груши и после 10-15 минут отстаивания снова удаляли надосадочную жидкость и заменяли свежим физиологическим раствором. Эту операцию повторяли 5-7 раз, постепенно сокращая срок отстаивания, с целью очистки протосколексов от обрывков выводковых капсул, а также от погибших протосколексов, которые осаждаются с меньшей скоростью, чем живые

Для приготовления первичной клеточной культуры отмытые в физрастворе с антибиотиками (1000 ЕД/мл пенициллина и 0,3 мг/мл гентамицина) протосколексы заливали 0,25%-ным раствором трипсина и ставили на инкубацию в термостат при 1+37°С на 30 минут Затем протосколексы разрушали в гомогенизаторе осторожными поворотами стержня, доливая раствор трипсина в количестве 2 мл. После процедуры гомогенизации в течение 2-5 минут дают осесть крупным кусочкам, крючьям и целым протосколексам

Надосадок с взвесью клеток собирали в центрифужные пробирки и клетки осаждали центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5-7 минут

Процедуру отмывания клеток повторяли не менее 5 раз с последующим ресуспендированием осадка и подсчета клеток

Концентрацию клеток определяли путем подсчета в камере Горяева К 1 мл пробы суспензии клеток добавляли 1 мл раствора краски (0,1% раствор кристаллического фиолетового на 0,1 мл раствора лимонной кислоты) После перемешивания суспензии клеток с раствором красителя, окрашенную суспензию вносили в камеру (клетки окрашиваются в темный цвет)

Жизнеспособность клеток определяли с помощью 0,4% водного раствора трипанового синего Процент жизнеспособных клеток в суспензии определяли по формуле'

Общее число клеток - число мертвых клеток *100 Общее число клеток Культуры, содержащие не менее 85-87% жизнеспособных клеток, использовали в работе Выращивание клеточной культуры проводили в одноразовых стерильных пластиковых панелях для культивирования (24,12, 6 - луночные) Посевная концентрация клеток составляла 600-800тысУмл ростовой среды

В качестве ростовой среды для культивирования клеток использовали синтетическую питательную среду постоянного состава ЮРМ1-1640 с добавлением 2 мл глютамина, 8мг гентамицина (4%), 0,5мл амфотерицина В на 100 мл среды, пенициллина 100 ед/мл, стрептомицина в количестве 100 мкг/мл и 5-7% эмбриональной сыворотки плода крупного рогатого скота.

Схема проведения экспериментальной работы.

Получение вторичных ларвоцнст Е multilocularis

Через 4 месяца^после заражения #

Выделение протосколексов, методы получения клеточной суспензии

Ручная гомогенизация, Трипе^ннзация

Первичная клеточная культура

Культивирование клеток протосколексов Е multilocularis в синтетической пигательной среде

и II

ние .чП(^гочпы> м' I t^cvmtoti __ t V

К ll< I П» ПрОИН f О IU l f OH 1 IV Vi l|\l!(V uf M 1 —' ' i I ( | К Uli Bri (>к f t я

Д К M l OMlUl > » v )f> I yj \

I '(„гМК'ЧЮГММ Ы. f U IPMUbP M( 1 itJdnin Of> J 10> fT 0

ibi'HiiiiiH'1 лини f iiti iKihi iihis ! ( p'»u О шор, (|jjti i «.и 11. t Os|;dJ n

u Trjmtpf.i JUHC » и с i' i к

Сравнительная оценка диагностической эффективности.

Клеточную культуру помещали в CCh-инкубатор с заданными параметрами температуры 37°С и поступления газов (СОг - 5%), при влажности 70%. Процесс роста клеток в питательных средах контролировали под инвертированным микроскопом Поскольку получение полноценной популяции возможно только от культуры, состоящей из жизнеспособных клеток, то перед каждым пассажем проводили просмотр и оценку качества клеток в монослое

Отбор клеточных метаболитов производили на 7-10 день культивирования в период формирования монослоя с помощью автоматической пипетки, причем после каждой манипуляции проводили замену наконечника

Субкультивирование клеток По мере нарастания клетки рассевали на новые планшеты или чашки с коэффициентом рассева не более 1 3, т к первично - перевиваемые культуры обладают слабыми пролиферирующими свойствами. Для этого ростовую среду отбирали в чистые пенициллиновые флаконы, клетки промывали в ФСБ для полного удаления сыворотки, заливали смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версеяа, подогретой до 30-32°С (в соотношении 1 9) на 5 минут до полного открепления клеток от субстрата После тщательного пипетирования одну часть суспензии клеток оставляли для цитологического анализа, а другую использовали для дальнейшего культивирования клеток, получения клеточных метаболитов и оценки их диагностической эффективности

Получение клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis, выделение антигеноактивиых серий иммуноферментной реакцией (ИФР). Наличие специфических антигенных компонентов в метаболитах клеточных культур протосколексов Е multiloculans устанавливали с помощью иммуноферментной реакции (ИФР) типа ELISA (Voller А. et al, 1974) с некоторыми модификациями, применительно к нашим условиям, и методом иммунодиффузии в агаровом геле ИФР осуществляли в микроварианте в полистироловых планшетах для иммунодиагностических исследований одноразового использования отечественного производства Положительным контролем в реакции при отборе антнгеноактивных серий метаболитов клеток служили сыворотки людей, зараженных Е granulosus и Е. multilocularis (диагноз подтвержден хирургически), и сыворотки убойных свиней с подтвержденным диагнозом естественной инвазии Е granulosus, а отрицательным - сыворотки здоровых людей-доноров и сыворотки свиней, у которых при вскрытии гельминтной инвазии не обнаружили

Предварительным титрованием испытуемых клеточных метаболитов кратно двум, начиная с разведения 1.2, определяли оптимальное разведение, позволяющее получить максимальную разницу оптической плотности между положительными и отрицательными контрольными сыворотками

Разведение осуществляли карбонатно-бикарбонатным буфером (БКБ), pH 9,6 Сенсибилизацию планшета проводили при +4°С в течение 18-20

часов с последующим отмыванием несвязавшихся с полистиролом белков 0,05% раствором Т\уееп-20 на дистиллированной воде три раза по 3-5 минут после каждого этапа реакции Сыворотки крови разводили 1 100 в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,2, с добавлением 0,05% Т\уееп-20 и 0,05% бычьего сывороточного альбумина (БСА) В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против ^С сыворотки крови человека и антитела диагностические против ^О сыворотки крови свиньи, меченые пероксидазой Разведение конъюгата проводили тем же буфером, что и сыворотки, увеличив концентрацию БСА в 10 раз Планшеты с сывороткой и конъюгатом инкубировали при +37°С в течение одного часа В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин на цитратном буфере, рН 4,7, с добавлением стабилизированной перекиси водорода Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50% серной кислоты в количестве 50 мкл Опытным путем устанавливали также оптимальный титр видоспецифических конъюгатов, используемых в реакции, на основе максимальной разницы в оптической плотности между отрицательной и положительной контрольными сыворотками и незначительном фоне в реакции конъюгатов с антигеном

Учет реакции проводили на автоматическом анализаторе колориметрическом иммуноферментном 340/АТС фирмы ЗЬТЛаЬБЫетБ (Австрия) при длине волны 492 нм Пробу считали положительной, если ее оптическая плотность превосходила значение оптической плотности отрицательного контроля в два и более раза. Оценку результатов проводили только в том случае, если в лунках с отрицательной контрольной сывороткой и без сыворотки (контроль конъюгата) окраска была слабо-желтая или отсутствовала

Серии метаболитов клеточных культур, показавших хорошую антигенную активность с контрольными сыворотками, использовали в дальнейшей работе

Исследование антигеноактивных серий клеточных метаболитов («клеточных» антигенов) реакцией иммунодиффузни (РИД). Для определения присутствия антигенов Е ти1Ыоси1аш и количества антигенных компонентов в клеточных метаболитах протосколексов этого паразита, мы использовали РИД в 1%-ном агаровом геле (Б^со) в варианте «ряды», «семерка» и «тройка» Реакцию осуществляли по методике Гусева и Цветкова (1961) с некоторыми модификациями, применительно к нашим объектам и условиям Для анализа антигенного спектра исследуемых объектов использовали

а) гипериммунную кроличью сыворотку к антигенам соматического экстракта протосколексов паразита,

Гипериммунную сыворотку получали от 2 кроликов, которых иммунизировали 3-х кратно подкожно с интервалом 2-3 дня возрастающими дозами соматического экстракта протосколексов Е тиМосикпз с последующей внутривенной реиммунизацией, проведенной через 28 дней после последней иммунизирующей дозы антигена В

общей сложности каждый кролик получил по 7,2 мг белка-антигена Через 7-10 дней после реиммунизации у кроликов из ушной вены была взята кровь и приготовлена сыворотка

Активность гипериммунной сыворотки предварительно проверяли ИФР

б) сыворотки пациентов с хирургически подтвержденным диагнозом альвеолярного эхинококкоза, приобретенные из 24-й клинической больницы г. Москвы

с) сыворотки от экспериментально зараженных Е multilocularis белых крыс, предоставленные д м н Коваленко Ф. П

Методы цитологических исследований, типирование культивируемых клеток протосколексов.

а) Фиксация. Фиксаторы и фиксирующие смеси, используемые для фиксации культивируемых клеток протосколексов Е multilocularis •

1 100° спирт

2 Метиловый спирт (метанол)

3 Смесь Карнуа - состоит из 6 мл абсолютного спирта (100°), 3 мл хлороформа и 1мл ледяной уксусной кислоты Ее готовят только перед работой.

4 Смесь Никифорова - 100° абсолютный спирт + хлороформ (М) в равных количествах.

5 Ледяная уксусная кислота-спирт - состоит из 8 мл абсолютного спирта и 2 мл ледяной уксусной кислоты Хорошо фиксирует ядра клеток, но плохо протоплазму

б) Методы окрашивания для определения типа клеток в культуре:

В литературе описано множество методов окрашивания, пригодных для любых целей, однако в наших исследованиях наиболее информативными и простыми по технике выполнения оказались:

Метод №1 Для изучения морфологии клеток в суспензии, полученной после трипсинизации ткани вторичных ларвоцист Е multilocularis и в процессе культивирования, применили методику и технику, используемую при исследовании крови Клеточную взвесь наносили на сухое, обезжиренное предметное стекло, высушивали на воздухе и фиксировали любыми из ниже перечисленных фиксирующих средств (метанол, смесь Карнуа или смесь Никифорова) Затем ждали пока мазок не высохнет от фиксатора. Далее окрашивали в течение 15-30 минут азур II-эозином по Романовскому-Гимза Споласкивали мазки в

дистиллированной воде, высушивали и заключали в канадский бальзам

Метод №2 Для изучения монослоя на покровных стеклах суспензию клеток высевали в чистые, стерильные пенициллиновые флаконы с покровными стеклышками Концентрация клеток в суспензии не менее 600800 тыс /мл, объем суспензии 1,5-2 мл

1 Окраска гематоксилин-эозином. Через определенные промежутки времени (1, 2, 3 и тд сутки культивирования) вынимали покровные стекла тонким пинцетом за края, очень аккуратно промывали в теплом

растворе Хенкса или физиологическом растворе (рН 7,0-7,2), подсушивали фильтровальной бумагой.

а Стекла с клетками фиксировали 15-30 минут в смеси Карнуа

(готовят смесь только перед работой) Ь После фиксации стекла вновь промывали в растворе Хенкса или физиологическом растворе, подсушивали фильтровальной бумагой и красили гематоксилином по Маллори Время окрашивания 20 минут с Затем промывали стекла в аммиачной воде 1-2 мин (к 200 мл дистиллированной воды добавить 1- 2 капли нашатырного спирта) и подсушивали фильтровальной бумагой с! Препараты проводили по спиртам возрастающей концентрации 70°,80°,90°,96° и помещали в 0,1%-ный спиртовой раствор эозина на 1 мин, затем в 100° спирт, ксилол 1, ксилол 2 В каждом из спиртов и ксилолах препараты держали по 1 минуте е Покровные стекла помещали на предметные стекла и заключали в бальзам

2 Окраска азур Н-эозином по Романовскому-Гимза После того как покровные стекла вынимали из флакончиков сразу сушили фильтровальной бумагой по краю стекла, а затем

а Стекла с клетками фиксировали смесью Никифорова или смесью

Карнуа около 15 минут Ь. После фиксации стекла высушивали на воздухе или фильтровальной бумагой и использовали готовый краситель Романовского-Гимза. с Препарат погружали в краску на 45 минут Затем ополаскивали

дистиллированной водой и тщательно высушивали с1 Покровные стекла помещали на предметные стекла и заключали в иммерсионное масло.

3 Окраска монослоя непосредственно в лунках Для клеток, культивируемых на планшетах в лунках, применяли все обычные методы окрашивания при условии, что фиксатор не растворяет пластик, как например, ацетон Прекрасные результаты получали при использовании спирта, метанола, смеси Карнуа Окрашивать клетки можно метиленовым синим, гематоксилин - эозином, азур II-эозином Время фиксации и окраски выбирали как в методе №1 и №2 Фиксацию, окрашивание и отмывку проводили прямо на планшетах, что дает возможность экономить посуду и свести к минимуму потери реактивов В процессе окрашивания клетки обычно обезвоживаются Для того чтобы они восстановили нормальную форму, к ним добавляли каплю иммерсионного масла Окрашенные клетки исследовали с помощью простого микроскопа МБ И при увеличении (х140), положив планшет на столик микроскопа вверх дном В тех случаях, когда исследование проводят при больших увеличениях, иммерсионное масло капают

на наружную поверхность планшета Для работы при больших увеличениях (*400) использовали планшеты с плоским дном, поскольку это уменьшает периферические искажения

в) Типы клеток в неактивных и антигеноактивных сериях клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis.

Зависимость антигенной активности метаболитов культивируемых клеток протосколексов из вторичных ларвоцист альвеолярного эхинококка от типа клеток в культуре устанавливали в 3 сериях клеточных метаболитов, отличающихся по уровню активности и полученных в процессе культивирования через 7-10 дней в течение 3 месяцев пассирования (9-12 пассажей) В эти сроки из каждой серии культуры клеток делали препараты, фиксировали, окрашивали описанными выше методами, подсчитывали не менее 600 клеток в 1 мкл и устанавливали процентное соотношение различных типов В качестве контроля использовали серии клеточных метаболитов, в которых антигенная активность в ИФР была минимальной (незначительное фоновое отличие реакции с отрицательными контрольными сыворотками) Из контрольных серий клеточных метаболитов таким же способом делали препараты, в которых после фиксации и окрашивания определяли типы клеток и сравнивали с данными в антигеноактивных сериях

Диагностическая эффективность «клеточных» антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в ИФР ори эхинококкозах в зависимости от типа клеток в культуре.

Диагностическую эффективность испытуемых клеточных метаболитов (клеточных антигенов) проводили с сыворотками крови людей и свиней

а) сыворотка крови людей

Для анализа использовали 73 пробы сывороток крови людей из банка ВИГИС, приобретенных из 24-й клинической больницы г Москвы и из НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи. В состав сывороток входило 25 проб от пациентов с подтвержденным хирургически диагнозом цистного и 3 - альвеолярного эхинококкоза, 7 -от пациентов с серологически подтвержденной инвазией токсокароза «larva migrans», 3 - трихинеллеза (Т spiralis) и 35 проб сывороток от клинически здоровых доноров

ИФР ставили по стандартной методике Voller et al, (1974), предварительно определив оптимальное разведение «клеточных» антигенов и титр конъюгата на основе максимальной разницы в проявлении реакции (по оптической плотности) между положительной и отрицательной контрольной сывороткой В качестве конъюгата при анализе сывороток свиней использовали антитела диагностические против Ig G сыворотки крови свиней, а при работе с сыворотками людей - антитела диагностические против Ig G сыворотки крови человека, меченые пероксидазой (стр 11)

б) сыворотка крови свиней

Диагностическую эффективность клеточных антигенов

протосколексов Е multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре

устанавливали также с 90 пробами сывороток свиней, в том числе 42 - с подтвержденным при вскрытии диагнозом цистного эхинококкоза и 48-

от инвазиро ванных другими гельминтами и клинически здоровых животных без видимой патологии

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Проведенные исследования позволили в первичной клеточной культуре из протосколексов Е multilocularis и в процессе их дальнейшего культивирования после окраски выделить 4 типа клеток, различающихся по форме, размерам и по количеству

1-ый тип - очень мелкие округлые клетки, размером около 1,1+0,12 мкм, в которых при окраске азур Ii-эозином не всегда ясно дифференцируется ядро, цитоплазма - светло-синяя. Процентное содержание их в первичной клеточной культуре было 30-35 % (в среднем 32,5 %)

2-ой тип - веретеновидные клетки, размером около от 2,5 до 2,8 мкм, обладают удлиненной цитоплазмой, которая окрашивается в голубой цвет, а ядро в фиолетовый Количество этих клеток находится в пределах от 1518 % (в среднем 16,5 %)

3-ий тип - большие округлые клетки, размером 3,4 мкм с выраженным ядром около 2,05 мкм по центру клетки (приблизительное соотношение диаметра ядра и цитоплазмы 2 1) Ядро окрашивается в темно-синий цвет, а цитоплазма в серо-голубой Процентное количество этих клеток сравнительно невелико и составляет не более 4-8 % (в среднем 6 %)

4-ый тип - клетки многогранной или гроздевидной формы с интенсивно базофильной цитоплазмой и не ясно выраженным ядром. Их цитоплазматические отростки образуют синцитиальные связи между телами клеток, между клетками и наружной оболочкой. На мазке клетки этого типа находятся в большем количестве 45-50 % (в среднем 47,5 %)

Анализ данных по культивированию типов клеток протосколексов Echinococcus multilocularis, получение антигеиоактивиых клеточных метаболитов (клеточных» антигенов).

Состав среды RPMI-1640, использованный нами для культивирования клеток протосколексов, качественно проще Это одна из наиболее распространенных сред, которая применяется, в частности, при культивировании гибридом (Moore, Gerner, Franklin, 1967). В ее состав входят незаменимые и заменимые аминокислоты, незаменимые витамины, включая В12, парааминобензойная кислота и глютадион, а также в относительно высокой концентрации глюкоза и инозит Для культивирования клеток в этих средах требуется 5% СОх в атмосфере

При анализе клеточных суспензий, полученных из протосколексов разновозрастных вторичных ларвоцист, установили, что наименьшее

количество клеток было выделено из протосколексов ларвоцист паразита 2-месячного возраста, поскольку и протосколексов было получено меньше, что в конечном итоге отразилось на объеме клеточных метаболитов Поэтому в своих экспериментах мы использовали протосколексы, выделенные из 4 и 6-месячных ларвоцист, из которых готовили первичную клеточную культуру Полученная из них культура включала не менее 85-87% жизнеспособных клеток с типичной морфологией и очерченными границами

Одним из основных моментов в культивировании клеток является правильный выбор метода диспергирования ткани на клетки. Чаще всего взвеси клеток получали путем обработки измельченной ткани раствором трипсина в среде, не содержащей ионов кальция и магния Полученную взвесь клеток фильтровали, центрифугировали, ресуспендировали в питательной среде, подсчитывали число клеток в камере Горяева и переносили в планшеты для культивирования, в которые добавлялось необходимое количество питательной среды Лучший выход клеток получали при обработке ткани в течении 30 минут 0,25%-ным стерильным раствором трипсина, при температуре +37°С, чем при одной механической деза1регации ткани в стерильном физрастворе или в растворе Хенкса. При таком способе выделения клеток образовывалось больше крупных конгломератов Механическая обработка

протосколексов вторичных ларвоцист Е ггш1и1оси1апз при получении клеточной культуры сопровождалась в значительно большей степени гибелью и разрушением клеток.

При культивировании первичных клеток на 5-7 сутки мы наблюдали сохранение их жизнеспособности, хотя количественно нарастание клеток происходило медленно, так как первично-перевиваемые культуры обладают слабыми пролиферирующими свойствами

В процессе культивирования клеток протосколексов Е тиШоаЛапв было получено 27 серий клеточных метаболитов, из которых ИФР на основе показаний ОП с контрольными сыворотками было выделено 23 (85,2%) антигеноактивные серии различной степени активности

Из антигеноактивных клеточных метаболитов были выделены 3 серии (А-1, В-2 и С-3), которые различались по активности в ИФР Цитологический анализ этих серий клеточных метаболитов, представленный в таблице ^свидетельствует о том, что они различаются и по соотношению различных типов клеток Так, наиболее активная в антигенном отношении серия А-1 независимо от времени культивирования содержала в культуре наибольший процент клеток 4 типа (55-59 %) Процентное соотношение этих клеток в двух других сериях В-2 и С-3 со средней и низкой антигенной активностью было в пределах 45-48 и 35-38. Что касается других типов клеток, то их процентное соотношение в период 3-месячного культивирования изменялась незначительно Так, процентное соотношение клеток 1 типа в течение 3-х месяцев культивирования варьировало в пределах 27-30

(серия A-l), 32-35 (серия В-2) и 31-34 (серия С-3), 2-го типа-12-14; 19-21 и 17-24 соответственно

Иммунохимическая характеристика клеточных антигенов протосколексов £. multilocularis.

Предварительный анализ полученной от 2 кроликов гипериммунной сыворотки в гомологичной системе РИД показал незначительные различия в их активности' в одной регистрировали 6 комплексов антиген-антитело, в другой-5 (табл 2) Анализ антигеноактивных серий клеточных метаболитов протосколексов Е multilocularis, проведенный РИД с этими сыворотками, показал не более 2-3 комплексов антиген-антитело, представленных достаточно четкими линиями преципитации. Причем, как правило, полосы преципитации в количественном и качественном отношении более четко проявлялись в РИД с активной гипериммунной сывороткой

Исследования, проведенные в РИД (вариант «ряды») 9 выделенных ИФР серий клеточных метаболитов протосколексов различной степени активности с гипериммунной сывороткой к антигенам соматического экстракта протосколексов показали достаточно четкие различия Наиболее активные в ИФР серии с указанной сывороткой образовывали 23 четкие линии преципитации, менее активные не более одной несколько диффузного характера, а последующие три, активность которых в ИФР была очень низкой, в РИД видимых комплексов антиген-антитело не образовывали Использованные другие варианты РИД («семерка», «тройка») также подтвердили данные ИФР о том, что антигеноактивные серии клеточных метаболитов различаются количественным содержанием специфических антигенов паразита, что влияет на проявление линий преципитации в РИД

Иммунохимический анализ выделенных иммуноферментным тестом антигеноактивных серий клеточных метаболитов показал наличие в них антигенов паразита Последнее свидетельствует о том, что клетки

протосколексов Е multilocularis в искусственно созданных условиях активно растут и выделяют в среду обитания биологически активные вещества — антигены

Таблица 4

Соотношение различных типов клеток в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов Е тиШосЫат различной

степени активности

Серии Типы клеток в культуре

клеточных метаболитов Процентное содержание - Количество клеток каждого типа

1 месяц кучьтивирования 2 месяц культивирования 3 месяц культивирования

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

А-1

(наиболее активная в ИФР) 27% -162 12%-72 6% -36 55 %-330 28,5%-171 13 % - 78 7%-42 57 % -342 30%-180 14%-84 8 % - 48 59 % - 354

В-2

(средней активности) 32%-192 19%-114 8 % - 48 45 %-270 33,5% -201 20 % -120 9,5%-57 46,5% -279 35%-210 21 %-126 11 %-66 48%-288

С-3

(слабой активности) 31 %- 186 17 % -102 15%-90 35%-210 32,5% -195 21 %-126 16%-96 36,5% -219 34 % -204 24%-144 17%-102 38%-228

М±т 180±9,17 (рХ>,99) Высоко достовер на 96±12,49 (р>0,95) Статиста чески достовер на 58±16,37 (р<0,95) Недосто верна 270±34,64 (р>0,95) Статисти чески достоверна 189±9,17 (р>0,99) Высоко достовер на 108±15,10 (р>0,95) Статисти чески достовер на 65± 16,09 (р>0,95) Статисти чески достоверна 280±35,51 (р>0,95) Статисти чески достовер на 198±9,17 (р>0,99) Высоко достовер на 118±17,77 (р>0,95) Статисти чески достовер на 72±15,87 (рХ>,95) Статисти чески достовер на 290±36,38 (р>0,95) Статистиче ски достоверна

Таблица 2

Иммуиохимический анализ «клеточных» антигенов протосколексов Е multilocularis

№ ll/n Сыворотки Число комплексов антиген- антитело в реакции иммунодиффузии

Антигены

Экстракт протосколексов Е multilocularis Антигено- активные серии клеточных метаболитов Серии клеточных метаболитов средней активности Серии клеточных метаболитов слабой антигенной активности

1 Кроличья гипериммунная (а) 5 3 1 -

2 Кроличья гипериммунная (б) 6 2-3 1

3 Альвеолярный эхинококкоз (человек) 1-2 2 1

4 Альвеолярный эхинококкоз (крыса, эксп заражение) 1-2 1-2 1

Сравнительная оценка диагностической эффективности клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.

Анализ результатов ИФР с клеточными метаболитами протосколексов различной степени антигенной активности при эхинококкозе людей, представленных в таблице 3, показал, что наибольшую чувствительность и специфичность проявили антигены серии А-1. Из 25 сывороток с подтвержденным диагнозом цистной формы эхинококкоза только в трех регистрировали отрицательный результат Таким образом,

чувствительность ИФР в этом случае составила 88,0 % Все сыворотки людей с подтвержденной альвеолярной формой эхинококкоза прореагировали положительно, т. е чувствительность была 100%. Что касается специфичности, которую в обоих случаях определяли из расчета 48 проб сывороток людей с гетерологичными инвазиями и клинически

здоровых доноров, то она составила 86,7 % Аналогичный анализ результатов исследований с теми же сыворотками и антигенами двух других серий (В-2, С-3) клеточных метаболитов показал постепенное снижение показателей чувствительности и специфичности иммунотеста' при альвеолярном гидатидозе чувствительность была в пределах 66,7 % и 33,3 %, при цистном - 76,0 % и 56,0 %, а специфичность - 77,8 % и 57,8 % соответственно (табл 3)

Аналогичный анализ результатов ИФР с теми же сериями клеточных метаболитов (А-1, В-2 и С-3), различающихся по антигенной активности, и сыворотками свиней также показали сходную тенденцию (таблица 4)

Наибольшую эффективность и наилучшие показатели чувствительности и специфичности в ИФР регистрировали с серией А-1 Из 42 проб сывороток свиней с подтвержденным диагнозом цистного эхинококкоза только 9 показали отрицательный результат. Таким образом, чувствительность теста в этом случае составила 76,2 % Показатели специфичности, оцененные с 48 пробами сывороток животных, инвазированных другими гельминтами и клинически здоровых, были в пределах 70,8 % В 14 случаях мы регистрировали положительный или сомнительный результат С двумя другими сериями клеточных метаболитов (В-2 и С-3) с меньшей антигенной активностью результаты исследований, судя по показателям чувствительности и специфичности, диагностическая эффективность ИФР была ниже. Так, с серией В-2 чувствительность иммунотеста составила 66,6 %, а специфичность - 62,5 % Что касается серии С-3, отличающейся наименьшей активностью антигенов, чувствительность реакции была не выше 52,4 %, а специфичность - 47,9 %

Судя по цитологической характеристике исследованные серии клеточных метаболитов, отличались между собой количественньм содержанием различных типов клеток в культуре

Так, в наиболее активной в антигеном отношении серии А-1 регистрировали в культуре клеток 27-30 % клеток -1 типа, 12-14 % - 2 типа, 6-8 % - 3 типа и 55-59 % - 4 типа

В серии В-2, активность антигенов в которой была меньше, чем в серии А-1, соотношение клеток в культуре несколько отличалось В этом случае в исследованных мазках из расчета 100 клеток - 32-35 % было клеток 1 типа, 19-21 % - 2 типа; 8-11 % - 3 типа, 45-48 % - 4 типа

Аналогичные расчеты, проведенные при анализе серии С-3, показали следующие результаты 31-34 % клеток-1 типа, 17-24 %- 2 типа, 15-17% - 3 типа; 35-38 % - 4 типа Таким образом, установлено, что активность клеточных метаболитов находится в прямой корреляции с количественным содержанием в культуре клеток 4 типа

Таблица 3

Диагностическая эффективность ИФР * с клеточными метаболитами различной степени антигенной

активности при эхинококкозах (гндатидозах) людей

№ п/п Группы людей, пробы сывороток крови Количество проб Серии клеточных метаболитов протосколексов Е multiloculans.

Результаты ИФР

Серия А-1 Серия В -2 Серия С -3

+ - Ч,% С,% + - Ч,% С,% + - Ч, % с,%

1 Эхинококкоз цистный 25 22 3 88,0 86,7 19 6 76,0 77,8 14 11 56,0 57,8

2 Эхинококкоз альвеолярный 3 3 100 2 1 66,7 1 2 33,3

3 Трихинеллез 3 1 2 1 2 1 2

4 Токсокароз "larva migrans" 7 1 6 2 1 4 3

5 Клинически здоровые доноры 35 4 31 7 28 14 21

Итого 73 31 39 31 42 34 39

Примечание- ИФР - иммуноферментная реакция, «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат, «Ч» - чувствительность, «С» - специфичность

Диагностическая эффективность ИФР * с клеточными метаболитами различной

активности при цистном эхинококкозе свиней

Таблица 4 степени антигенной

№ п/п Пробы сывороток крови свиней Количество проб Серии клеточных метаболитов протосколексов Е тиМоаЛапэ

Результаты ИФР

Серия А-1 Серия В -2 Серия С -3

+ - ч,% С,% + - Ч,% С,% + - ч, % С,%

1 Эхинококки цистный 42 32 9 76,2 70,8 28 14 66,6 62,5 22 20 52,4 47,9

2 Инвазированные другими гельминтами и клинически здоровые животные 48 14 34 18 30 25 23

Итого 90 46 43 46 44 47 43

Примечание ИФР - иммуноферментная реакция,«+» - положительный результат,«-» - отрицательный результат, «Ч» - чувствительность, «С» - специфичность

Выводы.

1 Проведено культивирование клеток протосколекеов Echinococcus multilocularis в синтетической питательной среде RPMI-1640, получено 27 серий клеточных метаболитов, в 23 (85,2 %) иммуноферментной реакцией (ИФР) установлена антигенная активность На основании показателей оптической плотности (ОП) в ИФР с положительными и отрицательными контрольными сыворотками антигеноактивные клеточные метаболиты распределены на 3 серии А-1 (наиболее активная, ОП в ИФР 1,236-1,320, 0,182 -0,191), В-2 (средней активности, ОП в ИФР 0,768 - 0,804, 0,1980,201); С-3 (слабой антигенной активности, ОП в ИФР 0,350 -0,362; 0,219-0,225)

2. Иммунохимическим анализом с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки к антигенам соматического экстракта протосколекеов Е multilocularis в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов выявлено 2-3 идентичных антигенных компонента.

3 Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis с сыворотками людей с подтвержденной хирургически альвеолярной формой эхинококкоза и сыворотками экспериментально зараженных Echinococcus multilocularis крыс определено 1-2 компонента, идентичных функциональным антигенам паразита

4 Проведена цитологическая характеристика и определено 4 типа клеток в первичной клеточной суспензии из протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е multilocularis, различающихся по форме, размерам и по количественному содержанию в культуре (из расчета 600 клеток в 1 мкл): 1 тип -180-210 (среднее 205) - 32,5 %; 2 тип - 90-108 (среднее 99) - 16,5%, 3 тип - 24-48 (среднее 36) - 6%, 4 тип - 270-300 (среднее 285) -47,5%

5 Оценена диагностическая эффективность ИФР с тремя сериями (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов Е multilocularis различной степени антигенной активности при цистном и альвеолярном эхянококкозе (щдатидозе) людей Чувствительность иммунотеста составила 88,0 %, 76,0 % и 56,0 %, специфичность - 86,7%, 77,8 % и 57,8 % соответственно

6 Проведена оценка диагностической эффективности ИФР с теми же сериями (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов Е multilocularis при цистном эхинококкозе свиней. Чувствительность

ИФР составила соответственно 76,2 %, 66,6 % и 52,4 %, специфичность - 70,8 %; 62,5 % и 47,9 %. 7. Определены типы клеток и их процентное соотношение в трех сериях (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов различной степени антигенной активности в процессе культивирования в течение 3 месяцев, в серии А-1 установлено 2730% клеток -1 типа, 12-14 % -2 типа, 6-8 %- 3 типа и 55-58% -4 типа, в серии В-2 - 32-35 % - клеток 1 типа, 19-21 % - 2 типа, 811 % - 3 типа, 45-48 % - 4 типа, в серии С-3 - 31-34 % клеток - 1 типа, 17-24 %-2типа, 15-17%-3 типа, 35-38 %-4типа 8 Установлена зависимость диагностической эффективности ИФР от типа культивируемых клеток протосколексов Е multilocularis -источника получения клеточных метаболитов Наиболее

активными в антигенном отношении были культуры клеток, в которых содержалось больше клеток 4 типа

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертационной работы вошли в «Методику фиксации и окрашивания культивируемых клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в культуре in vitro», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (28 09 2006) и « Методику идентификации клеточных антигенов эхинококков», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и опубликованную в Трудах Всерос ин-та гельминтол им К И Скрябина за 2006 г, т 42

Установленная зависимость диагностической эффективности ИФР от типа клеток протосколексов Е multilocularis в культуре и наибольшая антигенная активность метаболитов клеток 4 типа доказывает целесообразность использования в культуральной работе для получения клеточных антигенов высокой диагностической эффективности первичные клеточные культуры с большим содержанием клеток протосколексов паразита 4 типа

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Бережко В. К, Руднева О. В , Далаева И Б. Иммунохимический анализ метаболитов клеточной культуры протосколексов Echinococcus multilocularis // Материалы докл науч конф «Теория и практика борьбы с паразитарн болезнями» - 2004, выл 5, с 63-65

2 Далаева И. Б, Бережко В. К Методический подход к типированию культивируемых клеток протосколексов Echinococcus multilocularis // Материалы научн конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - 2005.- вып 6 - с 97-99

3 Далаева И Б Антигенная активность клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре // Материалы научн конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями».- 2006 - вып 7 - с 127-130

4 Руднева О В, Далаева И Б, Бережко В К Иммунохимический анализ и диагностическая эффективность «клеточных» антигенов Echinococcus multilocularis при эхинококкозе свиней // Труды Всерос ин-та гельминтол им К И Скрябина - 2006, - т 42 - с 290-299

5 Бережко В. К, Руднева О В , Далаева И Б Методика идентификации клеточных антигенов эхинококков // Труды Всерос ин-та гельминтол им К И Скрябина-2006, -т 42 - с 578-585

6 Бережко В К, Далаева И Б, Сасикова М Р, Диагностическая эффективность метаболитов культивируемых клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типов клеток в культуре // Российский паразитологический журнал - 2007 - № 2-е 30-34

7 Далаева И Б, Бережко В К Типы клеток и их соотношение в первичной суспензии из протосколексов Echinococcus multilocularis // Материалы научн конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - 2007 - вып 8-е 98-101

Подписано в печать 22 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 459 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 млто аШогеГегаг ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хангалова, Инесса Баторовна

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1 Биология клетки: основные понятия, функции клетки, механизмы, контролирующие рост клеток.

1.2 Методы клеточной технологии.

1.3 Характеристика ларвоцисты эхинококка.

1.4 Антигены Echinococcus multilocularis и их эффективность в иммунодиагностике эхинококкозов.

II. Собственные исследования.

2.1 Материалы и методы.

2.1.1 Правила работы в лаборатории с клеточными культурами (в боксе).

2.1.2 Подготовка к опытам лабораторной посуды, резиновых изделий, различных материалов и инструментов.

2.1.3 Получение инвазивного материала Echinococcus multilocularis, заражение белых крыс.

2.1.4 Методика получения вторичных ларвоцист Е. multilocularis, приготовление первичной клеточной культуры протосколексов, культивирование клеток протосколексов в синтетической питательной среде.

2.1.5 Получение клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis, выделение антигеноактивных серий иммуноферментной реакцией (ИФР).

2.1.6 Исследование антигеноактивных серий клеточных метаболитов («клеточных» антигенов) реакцией иммунодиффузии.

2.1.7 Методы цитологических исследований, типирование культивируемых клеток протосколексов.

2.1.7.1 Фиксация.

2.1.7.2 Методы окрашивания для определения типа клеток в культуре.

2.1.7.3 Типы клеток в неактивных и антигеноактивных сериях клеточных метаболитов протосколексов

Е. multilocularis.

2.1.8 Диагностическая эффективность «клеточных» антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в ИФР при эхинококкозах в зависимости от типа клеток в культуре.

2.1.8.1 с сыворотками крови людей.

2.1.8.2 с сыворотками крови свиней.

2.1.9 Статистическая обработка полученных результатов.

III. Результаты исследований.

3.1 Цитологическая характеристика клеток первичной клеточной культуры.

3.2 Анализ данных по культивированию типов клеток протосколексов Echinococcus multilocularis, получение антигеноактивных клеточных метаболитов (клеточных» антигенов).

3.3 Иммунохимическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis.

3.4 Сравнительная оценка диагностической эффективности клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная диагностическая эффективность клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре"

Актуальность темы

Культуры клеток животных стали неотъемлемой частью биотехнологии, они используются для решения научных проблем общей биологии, цитологии, генетики, вирусологии, иммунологии и инфекционной патологии. Одной из причин такого интереса специалистов к культивированию клеток из различных органов и тканей животных, человека и растений является возможность использования культуры клеток для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ, для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.

Всемирная организация здравоохранения придает большое значение разработке более совершенных методов культивирования возбудителей зоонозов, к числу которых относятся и эхинококкозы, с целью изучения особенностей развития и роста in vitro, для диагностики, а также для использования их в качестве рациональных моделей испытания новых средств против различных болезней. Клеточная технология может с успехом использоваться также для получения биологически активных веществ со свойствами антигенов, имеющих иммунодиагностическое и иммунопрофилактическое значение. Изучение антигенных свойств гельминтов на разных стадиях развития и их экскреторно- секреторных продуктов - одна из важнейших задач современной иммунологии. Создание оптимальных условий жизнедеятельности клеток вне организма, выделение продуктов метаболизма гельминтов в чистом виде, свободными от микроорганизмов и антигенов хозяина — насущная проблема современной биотехнологии в гельминтологии, может осуществляться благодаря методам культивирования гельминтов для получения специфических антигенов (Тараканов, 1985).

Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в синтетических питательных средах путем их многократного пассирования. Однако необходимо при этом учитывать, что антигенность используемых для культивирования органов и тканей паразитов находится в связи с их систематическим положением. Так, у нематод наибольшую антигенную активность проявляют личинки, особенно в период линьки, что связано с выделением большого количества секретов (Soulsby, 1961; Silverman et al., 1962). В то же время у цестод антигеноактивные субстанции находятся в субтегументальной области пузыря, на присосках вблизи экскреторного отверстия протосколексов, а в онкосферах — под мембраной крючьев и в клетках гексакантных эмбрионов (Machnicka, 1974; Алферова, 1978).

Исходя из вышесказанного для культуральной работы, направленной на получение специфических антигенов цестод, можно использовать два объекта — протосколексы из цисты и яйца, содержащие инвазионные онкосферы. Однако в целях безопасности и с учетом обеспечения необходимой стерильности использование протосколексов или герминативных оболочек является более предпочтительным.

Яйца же с инвазионными онкосферами, хотя и обладают значительной антигенной активностью, для культуры клеток менее применимы. Помимо того, что они небезопасны для исследователей, загрязненность их микрофлорой кишечника хозяина требует более тщательной и длительной стерилизации, что также может отразиться на жизнеспособности клеток в культуре.

Протосколексы, как источник получения первичной клеточной культуры, являются сложным биологическим объектом, состоящим из клеток различных типов и назначения. Неоднородность первичной клеточной культуры влияет на процесс культивирования и на свойства получаемых метаболитов. Как правило, в процессе длительного культивирования одни типы клеток могут расти и активно пролиферировать однако, получаемые при этом клеточные метаболиты не всегда могут соответствовать требованиям, предъявляемым им как антигенным препаратам. С этих позиций возникает необходимость как в научном, так и в практическом плане, установления типов клеток, обеспечивающих в процессе культивирования выделение в среду обитания антигеноактивных метаболитов иммунодиагностической и иммунопрофилактической направленности.

Исходя из вышеизложенного, считаем целесообразной и актуальной работу по сравнительной оценке диагностической эффективности клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.

Цели и задачи исследований Основной целью наших исследований было провести культивирование клеток протосколексов Е. multilocularis, получить антигеноактивные клеточные метаболиты с последующим определением типа клеток в культуре и одновременной оценкой их диагностической эффективности.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить вторичные ларвоцисты Е. multilocularis, выделить клетки протосколексов, приготовить первичную клеточную культуру и подобрать оптимальные условия их культивирования в синтетических питательных средах для получения клеточных метаболитов.

2. Провести отбор антигеноактивных серий клеточных метаболитов иммуноферментной реакцией (ИФР).

3. Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле установить наличие антигенов паразита в выделенных ИФР сериях клеточных метаболитов.

4. Подобрать оптимальный режим фиксации и окраски культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis, определить типы клеток в культуре.

5. Собрать банк сывороток от животных и людей, инвазированных эхинококками, другими гельминтами и клинически здоровых.

6. Провести сравнительную оценку диагностической эффективности клеточных метаболитов с различной степенью антигенной активности при эхинококкозах в соответствии с типом клеток в культуре.

Научная новизна Впервые проведена цитологическая характеристика культуры клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е. multilocularis, в процессе культивирования в синтетической питательной среде с последующей сравнительной оценкой диагностической эффективности полученных клеточных метаболитов при цистном и альвеолярном эхинококкозе.

Иммунохимическим анализом установлено наличие в клеточных метаболитах протосколексов антигеноактивных компонентов идентичных антигенам соматического экстракта протосколексов Е. multilocularis.

Впервые установлена зависимость антигенной активности метаболитов культивируемых клеток протосколексов паразита от типа клеток в культуре: наибольшую активность в ИФР (ОП с сыворотками зараженных Е. multilocularis и Е. granulosus соответственно 1,236 - 1,320) регистрировали в клеточных культурах с преобладанием клеток многогранной формы (клетки типа - 4), наименьшую (ОП с теми же сыворотками в пределах 0,350) в клеточных культурах с преобладанием больших округлых клеток (клетки типа — 2 и 3). Практическая значимость

Материалы диссертационной работы Далаевой И. Б. вошли в «Методику идентификации «клеточных» антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и опубликованную в трудах ВИГИС за 2006., т. 42, с. 578- 585.

По результатам цитологических исследований диссертанта подготовлена «Методика фиксации и окрашивания клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в культуре in vitro», одобренная секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины (сентябрь 2006 года).

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

1. Заседаниях Ученого совета ВИГИС (2003-2006гг).

2. Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (2004-2006гг).

3. Секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005-2006гг).

Основные положения, выносимые на защиту

• Культивирование клеток протосколексов из вторичных ларвоцист Е. multilocularis в синтетической питательной среде, получение клеточных метаболитов, их оценка ИФР и приготовление препаратов для цитологических исследований.

• Цитологическая характеристика клеток протосколексов в культуре in vitro в процессе культивирования.

• Иммунохимический анализ антигеноактивных серий клеточных метаболитов протосколексов, полученных в процессе культивирования и выделенных ИФР.

• Сравнительная диагностическая эффективность при эхинококкозах клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis различной степени антигенной активности в зависимости от типа клеток в культуре.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 3 из них в рекомендуемых ВАК изданиях.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 169 источников, в том числе 74 отечественных и 95 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 23 рисунками.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Хангалова, Инесса Баторовна

V. Выводы

1. Проведено культивирование клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в синтетической питательной среде RPM3-1640, получено 27 серий клеточных метаболитов; в 23 (85,2 %) иммуноферментной реакцией (ИФР) установлена антигенная активность. На основании показателей оптической плотности (ОП) в ИФР с положительными и отрицательными контрольными сыворотками антигеноактивные клеточные метаболиты распределены на 3 серии: А-1 (наиболее активная, ОП в ИФР 1,236-1,320; 0,182 -0,191); В-2 (средней активности, ОП в ИФР 0,768 - 0,804; 0,1980,201); С-3 (слабой антигенной активности, ОП в ИФР 0,350 — 0,362; 0,219-0,225).

2. Иммунохимическим анализом с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки к антигенам соматического экстракта протосколексов Е. multilocularis в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов выявлено 2-3 идентичных антигенных компонента.

3. Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis с сыворотками людей с подтвержденной хирургически альвеолярной формой эхинококкоза и сыворотками экспериментально зараженных Echinococcus multilocularis крыс определено 1-2 компонента, идентичных функциональным антигенам паразита.

4. Проведена цитологическая характеристика и определено 4 типа клеток в первичной клеточной суспензии из протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е. multilocularis, различающихся по форме, размерам и по количественному содержанию в культуре (из расчета 600 клеток в 1 мкл): 1 тип - 180210 (среднее 205) - 32,5 %; 2 тип - 90-108 (среднее 99) - 16,5%; 3 тип - 24-48 (среднее 36) - 6%; 4 тип - 270-300 (среднее 285) - 47,5%.

5. Оценена диагностическая эффективность ИФР с тремя сериями (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis различной степени антигенной активности при цистном и альвеолярном эхинококкозе (гидатидозе) людей. Чувствительность иммунотеста составила 88,0 %; 76,0 % и 56,0 %, специфичность - 86,7%; 77,8 % и 57,8 % соответственно.

6. Проведена оценка диагностической эффективности ИФР с теми же сериями (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis при цистном эхинококкозе свиней. Чувствительность ИФР составила соответственно 76,2 %; 66,6 % и 52,4 %; специфичность - 70,8 %; 62,5 % и 47,9 %.

7. Определены типы клеток и их процентное соотношение в трех сериях (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов различной степени антигенной активности в процессе культивирования в течение 3 месяцев: в серии А-1 установлено 2730 % клеток - 1 типа, 12-14 % - 2 типа, 6-8 % - 3 типа и 55-58 % -4 типа; в серии В-2 - 32-35 % - клеток 1 типа, 19-21 % - 2 типа, 811 % - 3 типа, 45-48 % - 4 типа; в серии С-3 - 31-34 % клеток - 1 типа, 17-24%-2 типа, 15-17% - 3 типа, 35-38 %-4типа.

8. Установлена зависимость диагностической эффективности ИФР от типа культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis -источника получения клеточных метаболитов. Наиболее активными в антигенном отношении были культуры клеток, в которых содержалось больше клеток 4 типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хангалова, Инесса Баторовна, Москва

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.1983.-264с.

2. Аделыиина Г. Л. Оценка диагностических свойствантигенных комплексов возбудителя альвеококкоза в эксперименте. Волгоград, Автореферат. 1995.

3. Алферова М. Ф. Реакция сколексопреципитации приэкспериментальном цистециркозе крупного рогатого скота // «Болезни с/х животных» труды УзНИВИ, Ташкент. 1978. - Т. 28, ч. 1. - С. 26-28.

4. Анджапаридзе О. Г., Богомолова Н. Н, Моделированиеи исследование хронических форм вирусных инфекций в культурах клеток. — М.: Медицина, 1974. 184 с.

5. Базитов А. А., Поройкова Т. Н. К сравнительнойхарактеристике паренхимы цестод // Паразитология. — 1977.-Вып. 11, № 1.-С. 9-16.

6. Баллад Н. Е., Гаврилова Е. М., Зорихина В. И.

7. Эффективность применения иммуноферментного метода в диагностике эхинококка и альвеококка в зависимости от степени очистки антигена // Мед. паразитол. и паразит, болезни. 1979.— Т. 48., № 2. — С. 70-76.

8. Баллад Н. Е., Лейкина Е. С., Егоров А. М., Гаврилова Е.

9. М., Зорихина В.М. Эффективность различных модификаций иммуноферментного метода сочищенными антигенами альвеококка в диагностике альвеококкоза. Сообщение 1. Микрометод в пробирках // Мед. паразитол. и паразитар. Болезни. -1982а.-№2. С. 15-20.

10. Баллад Н. Е., Лейкина Е. С., Егоров А. М., Гаврилова Е.

11. М., Зорихина В.М. Эффективность различныхмодификаций иммуноферментного метода с очищенными антигенами альвеококка в диагностике альвеококкоза. Сообщение 2. Метод на плашках // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. — 19826. №2. — С. 15-20.

12. Баллад Н. Е., Шамхалов В. М., Белозеров С. Н., Клименко

13. В. В., Шеховцов Н. В., Написанова Л. А. Изучение диагностической эффективности иммуноферментной реакции при эхинококкозе овец // Бюллетень ВИГИС. — 1991.-Вып. 53.-С. 10-15.

14. Бердинских М. С., Султанова 3. Д., Куликова К. С. Овидоспецифических антигенах клеток перевиваемых культур // Вопросы вирусологии. — 1969. № 1. — С. 23-27.

15. Бережко В. К., Кленова И. Ф. Антигенная активностьклеточных метаболитов протосколексов СоепишБcerebralis // Тр. Всес. Инс-та гельминтологии. 1999. -Т. 35. - С. 39-45.

16. Бережко В. К., Бессонов А. С. Использование клеточныхметаболитов Echinococcus multilocularis в качестве диагностических антигенов // Ветеринария. — 2000. № 2.-С. 31-34.

17. Бережко В. К., Кленова И. Ф., Коваленко Ф. П.

18. Иммунопрофилактические свойства антигенов клеточной культуры метацестоды Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном гидатидозе мышей // Тр. ВИГИС. 2001. Т. 37. - С. 34-41.

19. Бережко В. К., Руднева О. В., Далаева И. Б.

20. Иммунохимический анализ метаболитов клеточной культуры протосколексов Е. multilocularis // Материалы докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями». — 2004. — Вып. 5. — С. 63-66.

21. Бессонов А. С. Альвеолярный эхинококкоз и гидатидоз. —1. М. 2003. - С. 50-52.

22. Бахтин Ю. Б., Кроленко С. А., Черногрядская И. А.

23. Руководство по цитологии. — М. Т. 1, 2., Изд-во «Наука», 1966.

24. Бахтин Ю. Б. Генетическая теория клеточныхпопуляций. Л., 1980. С. 168.

25. Гаврилюк Б. К., Сафронов В. П. Органотипическоекультивирование. М.: Наука. — 1983. — 127 с.

26. Гламаздин И. Г. Культивирование отдельных клетокгельминтов и получение диагностических ценных антигенов // Актуальные проблемы ветсанконтроля сельскохозяйственной продукции. М. — МГУПБ. -1997.

27. Гламаздин И. Г., Родина О. В. Первичная клеточнаякультура D. caninum // Сб. к 100-летию со дня рождения И. В. Орлова. МГУПБ. - 1999.

28. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н.

29. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. — Л.: Медицина, 1972. 222 с.

30. Демшин Н. И. Постэмбриональное развитие цестоды

31. Aploparaksis crassikostris (Hymenolepididae)

32. Паразитология. 1984. - Вып. 18, № 1. - С. 40-46.

33. Дьяконов JI. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А.,

34. Денисенко Г. Ф., Панкова Г. Е., Гололобова М. Т., Камыкова Т. Т. Культура клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие // Ставрополь, 1980. -112 с.

35. Дьяконов JI. П., Лобунцова Д. В., Плешакова Г.

36. Ю., Гальнбек Т. В. Методические рекомендации по культивированию первичных культур клеток, субкультур и органных культур из ткани кишечникаплодов крупного рогатого скота и свиней. — М. — 1984. — 8 с.

37. Дьяконов JI. П. Животная клетка в культуре. Методы иприменение в биотехнологии. — М. 2000. — 398 с.

38. Есенгалиев Т. Т. Культивирование неполовозрелых Е.granulosus на искусственных питательных средах. Бюлл. Всес. Инт. Гельминт. 1984. - Вып. 38. - С. 5859.

39. Есенгалиев Т. Т., Андреева Г. Н., Клещинова Е. А.,

40. Тараканов Т. Т. Методические рекомендации по правилам работы с культурами эхинококков. -Уральск, 1986. — 6 с.

41. Залкинд С. Я., Изакова, JI. П. 1959. В сб.: Пластические ивосстановительные процессы. М.: 104-112.

42. Зорихина В. И., Баллад Н. Е., Кишинян А. Ш.

43. Сравнительная эффективность ИФР и РНГА в диагностике эхинококкоза // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. — 1982. №2. — С. 21-24.

44. Зорихина В. И., Баллад Н. Е. Серологические методыдиагностики эхинококкоза // Эхинококкозы. Методы исследования, лечения, профилактика. — М. — 1990. — С. 49-61.

45. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия.1. Будапешт. 1962. -399 с.

46. Кленова И. Ф. Разработка клеточной технологииполучения антигенов цестод (на примере Coenurus cerebralis Е. multilocularis): Дисс. канд. ветер, наук. М. 1999.- 108 с.

47. Краснощекое Г. П. Лярвогенез и морфологическаяизменчивость тегумента высших цестод: Дисс. докт. биол. наук. Магадан, 1982. - Т. 1,2.

48. Красюкова Л. С. Культивирование клеток ларвоцистэхинококка и использование его протосколексов для отбора антгельминтных препаратов: Дисс. канд. биол. наук. М.-1987.-184 с.

49. Леонов Ф. В., Исламбеков Э. С., Байбеков И. М.

50. Ультраструктура ларвоцисты при неосложненных формах эхинококкоза легких // Мед. Уз. 1985. № 10. -С. 30-33.

51. Лукашенко Н. П. Некоторые наблюдения окультивировании А. multilocularis (Lecart, 1863) in vitro // Мат. к научн. конф. Всес. об-ща гельминт. — М. 1964 а. — Ч. 1. — С. 238-242.

52. Лукашенко Н. П. К изучению развития А. multilocularis1.cart, 1863) in vitro // Мед. паразит, и паразит, болезни. 1964 б. - № 3. - С. 271-278.

53. Лукашенко Н. П. Альвеококкоз (альвеолярныйэхинококкоз) животных и человека // Дисс. докт. биол. наук.-М.-1967.-Т. 1,2.

54. Лукашенко Н. П. Альвеококкоз (альвеолярныйэхинококкоз). М.: Медицина, 1975. —327 с.

55. Максимов А. А. Культивирование in vitro соединительнойткани взрослых млекопитающих // Арх. анат. 1916. — I.-C. 105.

56. Максимов А. А. Основы гистологии: в 2ч. 3 сокр. изд. //

57. Под ред. Заварзина. — Л.: Госиздат, 1925. — 316 с.

58. Носик А. Ф. Эхинококкоз жвачных и меры борьбы сним.: Автореф. дисс. докт. ветер, наук. М. 1953. — С. 35.

59. Оленов Ю. М. Новые методы культуры животных тканей.- М.: Мир. 1976.- 255 с.

60. Осидзе Д. Д. Получение культур клеток из тканей и ихиспользование в вирусологии: (обзорная информация).-ВНИИТЭИСХ. М. 1975. - 42 с.

61. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Ленингр.- 1988.-320 с.

62. Подопригора Г. И., Збарский А. И. Перспективыразвития иммунодиагностического и иммунопрофилактического направления в паразитологии // Мед. паразитол. и паразит, болезни. 1990. - № 5. - С. 26-30.

63. Подопригора Г. И., Старкова Т. В., Эккерт Д.,

64. Готстейн Б. Сравнительная эффективностькоммерческих тестов (Российского ишвейцарского производства) иммуноферментного анализа на эхинококкоз // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 1994. - №3. — С. 51-52.

65. Руднева О. В. Диагностическая эффективностьклеточных метаболитов антигенов протосколексов ларвоцист Echinococcus multilocularis при цистном эхинококкозе // Труды Всероссийского НИИ гельминтологии. -2005. - Т. 41. -С.305-311.

66. Руднева О. В., Далаева И. Б., Бережко В. К.

67. Иммунохимический анализ и диагностическаяэффективность «клеточных» антигенов Echinococcus multilocularis при эхинокоюсозе свиней // Труды Всероссийского НИИ гельминтологии. 2006. — Т. 42. -С. 290-291.

68. Савченкова И. П., Зиновьева Н. А., Булла Й., Брэм Г.

69. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных // Успехи соврем. Биологии. 1996. - Т. 116, № 1. - С. 7892.

70. Сергеев В. А Репродукция и выращивание вирусовживотных. — М.: Колос, 1976. 303 с.

71. Сергеев В. А. Размножение вирусов животных вкультуре ткани. — М.: Колос, 1966. — 311 с.

72. Сивкова Т. Н. Диагностическая эффективностьантигенов клеточной культуры протосколексов Е. granulosus при цистном гидатидозе человека // Труды Всероссийского института гельминтологии им. К. И. Скрябина. 2002. - Т. 38. - С. 206-211.

73. Сивкова Т. Н. Диагностическая эффективность ELISA иdot- ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе // Диссер. канд. биол. наук. 2002.

74. Сивкова Т. Н., Бережко В. К. Эффективность антигеновклеточной культуры протосколексов Echinococcus granulosus и Echinococcus multilocularis в диагностике цистного гидатидоза свиней // Ветеринария. — 2002. № 10.-С. 32-34.

75. Скворцов И. П. Наблюдения над жизнью гематов внеорганизма // Тр. Мед. секции о-ва опытных наук при императорском Харьковском ун-те за 1885. — Харьков. — 1986.-С. 128-145.

76. Смирнова JI. В. Жизненный цикл и постэмбриональноеразвитие цестоды Hymenolepis hórrida //

77. Паразитология. 1980. - Вып. 23, № 6. - С. 467-471.

78. Спиера Р. Е., Гриффите Д. Б. Биотехнология клетокживотных. М. - 1989. - Т. 1-2.

79. Тараканов В. И. Культивирование гельминтов вискусственных питательных средах. Диссер. докт. биол. наук. М.- 1979.

80. Тараканов В. И., Андреева Г. Н., Клещинова Е. А. Окультивировании Е. granulosus на искусственных питательных средах. В кн.: Биологические основы борьбы с гельминтами животных и растений // Тез. докл. конф. ВОГ АНССР.-М. 1983.-С. 160-162.

81. Тараканов В. И. Культивирование протосколексовэхинококка на двухфазных питательных средах // Материалы IV Закавказской конференции по паразитологии. Тбилиси, 1986.

82. Твердохлебова Т. И., Васерин Ю. И., Цыбульская М. А.,

83. Трибулев Г. П., Подоплелов И. И., Шарый Н. И., Крюкова

84. Трошин А. С. Биология клетки в культуре. Ленинград,

85. Изд-во «Наука», 1984. 278 с.

86. Уосли Д. Д. Новые методы культуры животных тканей:

87. Перевод, с англ. К. И. Фридлянский. М.: Мир. 1976. — 255 с.

88. Уралов М. Физиология и биохимия цестод икультивирование их в искусственных питательных средах. — М. Автореферат. ВИГИС. 1990.

89. Хаертынов К. С., Гальнбек Т. В., Хазипов Н. 3.

90. Методические рекомендации по ускоренному получению сыворотки крови животных для культивирования клеток и вирусологических исследований методом центрифугирования. — М. 1985.-2 с.

91. Хандуев Ц. Ц., Лукьянова 3. М. Тканевые культуры и ихприменение в вирусологии. — Фрунзе: Илим, 1974. 92 с.

92. ХлопинН. Г. Общебиологические и экспериментальныеосновы гистологии Л., 1946. — 491 с.

93. Цыпкин JI. Б. Изучение морфологии и биологическихсвойств однослойных клеточных культур из трипсинизированных тканей // Дисс. Докт. мед. наук: -Т. 1-2. -М., 1968.

94. Эвранова В. Г., Сергеева П. А. Культивированиеличиночной стадии Echinococcus granulosus вне организма // Тезисы докл. научн. конф. Всесоюзн. О-ва гельминтол. 10-14 дек. 1962. М. -1962. - Ч. 1. - С. 221-222.

95. Ястреб В. Б., Скворцова Ф. К. Ультраструктурафертильных ларвоцист Е. granulosus от овец и свиней // Ветеринария. 1986. - № 8. — С. 50-52.

96. Adams А. М. Growth rates of germinal cells of

97. Echinococcus multilocularis and E. vogeli // Bull. Soc. Fr. Parasitol. 1990. - V.8. - Suppl.l. - P. 148.

98. Ali-Khan Z. Host-parasite relationship in echinococcosis. I.

99. Parasite biomass and antibody response in three strains of inbred mice against graded doses of Echinococcus multilocularis cysts // J. Parasitol. 1974. - V. 60. - P. 231235.

100. Ali-Khan Z., Siboo R. Immune complexes experimentalalveolar hydatidosis // «Tropenmed und Parasitol». -1983. -V. 34, N3.-P. 187-192.

101. Ali-Khan Z., Siboo R. Echinococcus multilocularisimmunoglobulin and antibody response in C57BL/6S mice // «Exp. Parasitol». 1982. -V. 53, N 1. - P. 97- 104.

102. Allintas N., Ozensoy S. Application of biotin- avidin system:determination of antybody response in hydatidosis // 6 th1.t. Helminthol. Simp. The High Tatras CSFR., Progr. and Abst. — 1991. — P. 93.

103. Auer H., Hermentin K., Aspock H. In vitro production of

104. Echinococcus antigens for diagnosis // «Progr. And Abstr. of the V Europ. Multicolloq. of Parasitol., sept. 4-9, Budapest Hungary», 1988. P. 6-10.

105. Auer L., Aspock H. Differential serodiagnosis ofalveolar and cystic echinococcosis // 6-th int. helmintol. Symp., the High Tatras, CSFR, sept. 23-27.-1991.-P. 92.

106. Benex I. Evolution in vitro d1 explants de membraneproliféré d' E. granulosus. Etude de la formation de veiculus secondaires. — Ann. parasitol. Hum. Comp. 1968. — V. 43, № 5. P. 573-578.

107. Berezhko V. K., Bessonov A. S. Cell metabolites of

108. Echinococcus multilocularis: application as diagnostic antigens // Arch. Int. de la hidatidosis. 1999. - V. 33. -P. 286.

109. Bolla R. T., Roberts L. S. Developmental physiology ofcestodes. IX. Cytological characteristics of the germinative region of Hymenolepis diminuta. J. Parasitol. - 1971. - V. 57. - P. 267-277.

110. Born G. Uber Verwachsungsversuche mit Amphibian1.rven // W. Roux' Arch. Entwiklungsmech. Organism. -1897. — V. 7.-P. 517-623.

111. Bretagne S., Beaujean F., Liance M., Houin R. Rapidtechnique for cryopreservation of Echinococcus multilocularis metacesdodes // Bul. Soc. Fr. Parasitol. — 1990. V. 8. - Suppl. 1. - P. 234.

112. Carrel A., Burrows M. T. Cultivation of adult tissues andorgans outside of the body//J. Amer. Med. Ass.— 1910. -V. 55, N 16. -P. 1379-1381.

113. Casado- Escribano N., Rodriguez- Caabeiro F. Cultivo "invitro" de protoscolex de Echinococcus granulosus en direccion vesicular II Estudio de la idoneidad de diberentes medios // Rev. iber. Parasitol. 1988. - V. 48, N 2. - P. 155-163.

114. Condon J., Rausch R. L., Wilson I. F. Application of theavidin-biotin immunohistochemical method for the diagnosis of alveolar hydatid disease from tissue sections // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. and Hyg. — 1988. V. 82, N 5. - P. 731-735.

115. Contreras M. del C., Gallo S., Salinas P., Sapunar S., Sandoval1., Solis F. Evaluation of ELISA Ig G using a purified antigen in the diagnosis of human hydatidosis // Biol. Chileno Parasitol. 1994. - V. 49, N 1/ 2. - P. 24-30.

116. Coutelen F. Histogenese des cellules libres, a glicogene eta graisses, des hydatides echinococciques // Ann. Parasitol. humaine et compare. 1938. - V. 9, N 2. - P. 101- 103.

117. Craig P. S., RicKard M. D., Hocking R. E., Mitchel G. F.

118. Murine hybrodome — derived antibodies in the processing of antigens for the immunodiagnosis of hydatid (Echinococcus granulosus) infection in shepp // Parasitology. 1981. - V. 83, N 2. - P. 303-317.

119. Delaunay P., Petithory J. C. Essai de deux nouvelles irousses

120. ELISA "Echinococcus serology" specifique du genze Echinococcus spp. "Echinococcus multilocularis" de l'espece "Echinococcus multilocularis" // Bull. Soc. Fr. Parasitol. 1994. - V. 12. - Suppl. 1. - P. 23-28.

121. Dieckmann A., Frank W. Isolation of viable germinal cellsfrom Echinococcus multilocularis // Parasitol. Res. — 1988. -V. 74.-P. 297-298.

122. Dieckmann A., Schuppert A., Ruppel A., Burger R., Frank W.

123. Echinococcus multilocularis: in vitro secretion of antigen by hybridomas from metacestode germinal cells and murine tumor cells // Experimental parasitology. — 1989. V. 29.-P. 186-191.

124. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: comparisonbetween antigens in scolices and hydatid fluid // Int. J. Parasitol. 1978. -V. 8. - P. 259-265.

125. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus:characterization of the main antigenic component (Arc5) of hydatid fluid // Exp. Parasitol. 1977. - V. 43, N 2. - P. 307-314.

126. Dumon H. N., Doundou M. V., Mary Ch., Togo J.,

127. Gambarelli F., Franck I., Faugere B., Quilici M. Obtention d' antigens metaboliques d' Echinococcusgranulosus par culture de scolex, resultants preliminaries // Bull. Soc. Fr. Parasitol.-1984.-N3.-P. 123-125.

128. Eckert I. E., Ramp Th. Cryopreservation of Echinococcus multilocularis metacestodes and subsequent proliferation in rodents (Meriones). Zeitschrift fur Parasitenkunde. — 1985.-V. 71.-P. 777-787.

129. Eckert J., Jacquiler P., Baumann D., Raeber P. A. Echinokokkose des Menschen in der Schweiz, 1984 -1992//Schweiz. Med. Wochenschr. 1995. - 125. - N42. -1989-1998.

130. Facon B., Chamekh M., Dissons C., Capron A. Molecular cloning of E. granulosus protein expressing an immunogenetic epitope of antigen 5 // Mol. and Biochem. Parasitol. -1991. -V. 45, N 2. P. 233-240.

131. Feng J. J., Xiao S. H., Yuo H. F., Shen B. Y., Xue H. C. Isolation of germinal cells from the secondary cysts of E. granulosus harbored in mice // Chin. I. Parasitol. and Parasit. Diseases. 1992. - V. 10, N 2. - P. 86-89.

132. Feng J.J., Wang J. Y., Qu J. A., Xiao S. H. ELIB of specific antigens in vitro cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus // Chin. I. Parasitol. and Parasit. Diseases. 1993.-V. 11,N l.-P. 63-65.

133. Fiori P. L., Monaco Y., Scappaticci S., Puqliese A., Canu N.,

134. Cappuccinelli P. Establishment of cell cultures from hydatid cysts of Echinococcus granulosus // Int. J. Parasitol. 1988. - N 18. - P. 297-305.

135. Furuya K. An established cell line of larval Echinococcus multilocularis //Int. J. Parasit.- 1991. V. 21, N 2.-P. 233.

136. Furuya K., Honnra H., Kumagai M. A cell line derived from larval Echinococcus multilocularis. Bull. Soc. Fr. Parasitol. 1990. - 8 Suppl., N 1. - P. 159.

137. Gottstein B., Eckert J., Fey H. Serological différenciation between Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis in man // Z. Parasitenk. 1983. — V. 69, N 3.-P. 347-356.

138. Griffith A. H. International symposium on immunization: Benefit versus risk factors // Dev. Biol. Stand. — 1979. — V. 43.-P.3-13.

139. Gustafsson M. Basic cells types in Echinococcus granulosus (Cestoda, Cyclophylliden) // Acta Zoologica Fennica, -1976.-V. 146.- P. 1-16.

140. Gustafsson M. The histology of the neck region of Echinococcus granulosus // Proc. Ind. Europen Multicolloq. Parasitol. 1-6 sept. 1975.- Trogiz. Yugoslavia. — Belgrad. -1978.-P. 319-320.

141. Hariri M. N., Schvabe C. W., Koussa M. Host- parasite relationships in echinococcosis. XI. The antigens in the indirect hemagglutination test for hydatid disease // Am. J. Trop. Med. 1965. - V. 14. - P. 592- 604.

142. Harrison R. G. Observation on the livpig developing nerve fiber // Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med. 1907. - N 4. -P.140-143.llö.Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains //Exp. Cell Res. 1965.-V. 37.- P. 614-636.

143. Heath D. D., Lawrence S. B. Echinococcus granulosus: Development in vitro from oncosphera to immature hydatid cyst // Parasitology. 1976. - V. 73, N 3. - P. 417423.

144. Heath D. D., Osborn P. J. Formation of Echinococcus granulosus laminated membrane in a defined medium // Int. J. Parasitol. 1976. - V. 6. - P. 474- 471.

145. Hiza P. R., Bahz G. M., Shweiki H. M., Behlehani K. An -enzymelinked immunosorbent assay using an are 5 antigen for the diagnosis of cystic hydatid diseasse // Ann. Trop. Med. And Parasitol. 1990. - V. 84, N 2. - P. 157-162.

146. Hulsmeier A. J., Gehrid P. M., Geyer R., Sack R., Gottstin B., Deplaces P., Kohler P. A major Echinococcus multilocularis antigen is mucin-type glycoprotein // J. Biol. Chem. -2002. V. 277, N 8. - P. 5742-5748.

147. Ito A. Serodiagnosis of echinococcosis in humans and animals // 16th Int. Conf. of the WAAVP. Progr. And Abstr. 10-15 Aug. -1997. Sun. City, South Africa. -1997.-P. 42.

148. Kagan I., Norman L. Antigenic analisis of Echinococcus antigens by agar diffusion techniques. // Amer. J. Trop. Med. a Hyg.- 1961.-V. 10,N. 5.-P. 727-734.

149. Kilejian A., Schinazi L. A., Schwabe C. W. Host- parasite relationships in Echinococcosis. V. Histochemical observations on Echinococcus granulosus // J. Parasitol. — 1961.-V. 47, N2.-P. 181- 185.

150. Knobloch J., Lederer I., Mannweiler E. Species-specific immunodiagnosis of human echinococcosis with crude antigens // Eur. J. Clin. Micrjbiol. 1984. - V. 3, N 6. -P. 554-555.

151. Konigsberg I. R. Clonal analysis of of myogenesis. — Scienc. 1963. - V. 40. - P. 1273-1284.

152. Kruse P. F., Patterson M. K., E. ds. "Tissue Culture Methods and Applications", Academic Press, New York, San Francisco, London, 1973, 868 p.

153. Lascano E. F., Coltorti E. A., Varela-Diaz V. M. Finestructure of the germinal membrane of Echinococcus granulosus cysts // Journal of Parasitology. — 1975. V. 60.-P. 853-860.

154. Leykina E. S., Dalin M. V., Ballad N. E., Tchebyshev N. V., Zorikhina V. I., Poletaeva O. G. Isolation of diagnostical helminth antigens and their use in serodiagnosis // Helmintología. 1981. -V. 18. - P. 273-280.

155. Lightowlers M. W., Roife R., Yanci Ch. Y. Taenia saginata: vaccination against cysticercosis in cattle with recombinant oncosphere antigens // Exp. Parasitol. — 1996. -V. 84, N3.-P. 330-338.

156. Lu J. H., Li D. Ch., Zhang S. Z., Feng D. U., Guo J. M. Иммуногенность и реактогенность экскреторных антигенов из клеточной линии Echinococcus granulosus // Chin. J. Vet. Sei. 1999. - V. 19, N 6. - P. 566-568.

157. Lu J. H., Cheng W. X., You Z. M., Kong Ch. Q., Feng D. H., Li D. Ch., Yuo Y. The cell line establishment of larval Echinococcus granulosus // Chin. J. Vet. Sei. — 1998. — V. 18, N5.- P. 479-482.

158. Lu J. H., Yu X. В., Li D. Ch., Zhan Z. X., You Z. M., Pan X. H. Идентификация клеточной линии эхинококка Echinococcus granulosus // Acad. J. Sun. Yat-Set Univ. Med. Sei. 2000. - V.21, N 4. - P. 3 0-33.

159. Machnicka B. The common antigens of Cysticercus bovis and Taenia saginata // Bull. Acad. Pol. Sei. Ser. Sei. Biol. — 1974.-V. 22, N3.-P. 197-199.

160. Moore G. E., Gerner R. E., Franklin H. A. Culture of normal human leukocytes// J. Amer. Med. Assoc. 1967. — V. 199.-P. 519-524.

161. Morgan J. F., Parker R. C., Morton H. J. Media for animal cell culture// Proc. Soc. exp. Biol. Med.- 1950.-V. 1. -P. 73.

162. Moscona A., Folkman J. Role of cell shape in growth control // Nature. 1978. -V. 273. P. 345-349.

163. Prescott D. M. Reproduction of eukaryotic cells. New York. 1976. P. 177.

164. Queralt R., Madico A., Mercader M., Pardo A., Sanchez F., March F., Coll P., Munoz C. Purification de antigenos a partir de liquido hydatidico. Estudio de su reactividad por "immunoblot" // Rev. iber. Parasitol. -1989. V. 49, N 4. -P. 313-319.

165. Rickard M. D. Vaccination of calves against Taenia saginatainfection using antigens collected in vitro cultivation of larve cestodes // 4-th Intern. Congr. Parasitol. 19-26 Aug. 1978. Warszama. ShortCommun. Sect. -P. 134- 135.

166. Rickard M. D., Harrison Y. B. I., Health D. D., Lightowlers M. W. Taenia ovis recombinant vaccine "quo vadit" // Parasitology. - 1995. - V. 110. - P. 5-9.

167. Rickard M. D., Bell K. J. Successful vaccinationof lambs against infection with Taenia ovis using antigens produced during in vitro culture of the lave stages // Res. Vet. Sci.- 1971.-V. 12.-P. 401-402.

168. Rogan M. T., Craig P. S. Immunological approaches for transmission and epidemiological studies in cestode zoonoses the role of serology in human infection //

169. Cestode Zoonoses: Echinococcus and Cysticercosis //10 S Press.-2002.-P. 135-145.

170. Rozengurt E. Stimulation of DNA synthesis in quiescent cultured cells: exogenous agents, internal signals, and early events. In: Current topics in cellular regulation. New York etc., 1980. - V. 17. - P. 59-88.

171. Sakamoto T. Histochemistry and histoenzymology of

172. Echinococcus. I. Histochemical observation on general structure of Echinococcus multilocularis // Mem. Fac. Agr. Kagoshima Univ. 1982. -V. 18, N 27. - P. 127-139.

173. Sakamoto T., Kotani T. Studies on Echinococcus. XX.

174. Preliminary observations of the in vitro cultivation of larval tissues of Echinococcus multilocularis in culture chamber of porous membrane // Jap. J. Vet. Res. — 1967. — V. 15, N4.-P. 165-170.

175. Sakamoto T., SigimuraM. Studies on echinococcosis. XXIII.

176. Electron microscopical observations on histogenesis of larval Echinococcus multilocularis // Jap. J. Vet. Res. -1970.-V. 18, N. 3. P. 131- 144.

177. Smyth J. D. Studies on tapeworm physiology. X. Axeniccultivation of the hydatid organism, Echinococcus granulosus: establishment of a basic technique // Parasitology. 1962. - V. 52, N 3-4. - P. 441- 457.

178. Smyth J. D. Studies on tapeworm physiology. XI. In vitrocultivation of Echinococcus granulosus from the protoscolex to the Strobilate stage // Parasitology. 1967. -V. 57, N1.- P. 111-133.

179. Smyth J. D., Jha R. K. Echinococcus granulosus:

180. Ultrastructure of microtriches // Exp. Parasitol. — 1969. -V. 25. — P. 232-244.

181. Smyth J. D., Davies Z. In vitro culture of the strobilar stageof Echinococcus granulosus (sheep strain): a review of basic problems and results // Int. J. Parasitol. 1974. - V. 4. - P. 631-644.

182. Thompson R. C. A. The development of Brood Capsules and Protoscolices in Secondary Hydatid Cysts of Echinococcus granulosus. A. Histological Study // Z. Parasitenk. 1976. - V. 51, N 1. - P. 31 -36.

183. Threadgold L. T., Arme C. Electron microscope studies of Fasciola hepatica. XI. Autophagy and parenchymal cell function // Exp. Parasitol. 1974. - V. 35. - P. 389-415.

184. Todaro G. J., Lazar G. K., Grenn H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. — J. Cell. Comp. Physiol., 1965.- V. 66. P. 325-334.

185. Turcecova L., Kolarova L., Dubinsky P., Martinek K. Characteristics of antigens in tapeworms of the genus Echinococcus // Helmintologia. 1997. - V. 34, № 3. - P. 188-189.

186. Vogel H. Wie wachst der Alveolar Echinococcus // Tropenmed Parasitol. 1978. - V. 29. - P. 1-11.

187. Vulpian M. A. Note sur les phenomenes de development qui se manifestent dans la queue de jeunes embryons de Grenouille, après qu' on l'a s'eparee du corps par une section transver sale // C. r. Acad. Sei. 1859. - V. 48. — P. 807-811.

188. Wittelsberger S.C., Kleene K., Penman S. Progressive loss ofshape esponsive metabolic controls in cells with increasingly transformed phenotype. — Cell, 1981. V. 24. -P. 859-866.

189. Yamashita J., Ohbayashi M., Sakamoto T., Orihara M. Studies on Echinococcosis. XIII. Observations on the vesicular development of the scolex of Echinococcus multilocularis in vitro // Jap. J. Vet. Res. — 1962. V. 10. -P. 85-96.