Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Онкосферный секреторный антиген Muiaiceps muiaiceps для профилактики ценуроза овец

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Онкосферный секреторный антиген Muiaiceps muiaiceps для профилактики ценуроза овец"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

БСЕРОССИЙСШЙ НАУЧПО-ИССЛЕДОВАТЕЯЬСККй ИНСТИТУТ ГЕЛКЛШТОЮГНИ •'июни акадошп'д К.И. Cicpnûma

ha правах руволясл СКРЬШНИШЗА Татьягаа Ивановна

ОНКОСФЕРАЛЬНЫЙ СЕКРЕТОРНЫЙ АНТИГЕН ШШГЮЗРЯ IWESICEPS дш ПРОЙШКТМИ ЦЕНУРОЗА ОБЩ

Сиоцдальпость 03.00.20 - гояьтшггологпя

, АВТОРЕФЕРАТ

диссэртпцзта на сойскашэ ученой сгэноня кандидата зетврзнарянх паук

Москва - IS93

Работа выполнена во Всероссийской паутшо-ЕсслвдоватольсЕоа институте гэдььшптологгн ем0нп акадошгш К.И. Скрябгш (ВИП1С).

Научдаа руководители - доктор биологических одук

¡Й.И. Бзнсдаа'ов»

доктор воторякарши шук, профессор Ы.Е. Косьашков

0$шцшв>шо ошоаанги: доктор BosepsEapHuz пауп, профессор Даугаяиога гшщвдат биодогэтеоквх щук O.A. Bojbosceeü

Водуцая организация - НосЕовская всгаораваршш сгэдсиза шош анадешка К.И, Скрябина

/

Згщнта дносортацш состоятся ' ХБЭЗ т.

fj '

в / 7 часов ш сасодашп! сясдкагаацрогшшш) 0020га Д-020.04.02

пра Всероссийской шцгчйо-кссдадовмедьскш шютатута гааианго-üomn слеш окод&щка К.В. СкряЬжш.

Лдрзо: 117259, йооква, Б. Черсьдалашсшя, 28. С диссертацией кошю озхшкошгаься в бл&шотско ЕЮЮ. Автореферат разослав г.

УчешШ секретарь спсдЕалпзЕромхшого совета, доктор ветершшрша шув

C.B. БергзкЕШ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш. Проблема ликвидация ценуроза овец является для юга России, республик Средней Азик и Казахстана на сегодня актуальной. Большинство овцеводческих хозяйств стационарно неблагополучно по данному заболевании в течение многих лет.

Гельминтологическая наука внесла большой вклад в решение данной проблемы: детально изучая цикл развития возбудителя ценуроза и пути взаимного заражения дефинитивного и промежуточного хозяев, установлена зависимость отдельных звеньев эпизоотической цепи этого гельминтоза, разработаны общепрофила-.хические ветер--нарно-санитарныэ правила, основанные на знании биологии паразитов (В.И. Бондарева, 1956, 1963; К.И. Абуладзе, 1957, 1963, 1964; P.C. Щгльц, 1954, 1958; E.S. Щумажозич, 1957, 1958, 1966; В.Ф.Никитин, 1958, 1959, I9SI, 1963; ИЛ. Ирга" та, 1965; Н.М. Матчанов, 1968, 1971, 1972i 1973, 1985; И.И. Зшшченко, 1969; А.К. Еуравец, 1974, 1982» 1987, 1989; В.Т. Рамазанов, 1979; A.C. Бессонов,1981, 1986, 1992; К.В. Шахбазян, 1985; В.М. Шамхалов, 1986, 1988; М. Амивханов, 1988, 1990). Однако правила в условиях производства (особенно на летпих отгонных пастбшцах) нередко нарушаются ** полноценность ах выполнения сомнительна в различных хозяйствах, в результате чего гельминтоз широко распространен, особенно в зонах интенсивно развитого лшвотноводетва.

Одниа нз перспективных направлений борьбы с ценурозом овец является иммунопрофилактика," что доказано возможностью формирования напряженного иммунитета с помощью протшзоцестодозпых вакцин в нашей стране и за рубежом. Научные сообщения последних лет показали, что у сельскохозяйственных аивотшх, действительно, развивается иммунитет к тканевым гельшштозам. Доказано, что центральную роль в защитной иммунитете при цестодозах играют антитела, а иммунизация животных неочищенными антнгенает вызывает шеокуп степень защити ( Olegg J.A., Salth U.A., 1978, KLckard И.С., Williaas J.B., 1982). Идеальная вакцина не только должна предохранять ниботшес от зараяопия, но и'вызывать гибель уаа развитых личинок. Достигнуть этого, по шенив Riefend u.d. п ЗНИеаа J.P. гораздо слоапее, так как пх попытки вакцинации ва-еотшгх онкосфералышмя антигенами оказались безуспеаными а но

привела к гибели личинок. С другой сторода, иммунизация антигенами, полуденными из среда культивирования активированных оико-ефер тений защищала промежуточных хозяев от заражения инвазионными яйцами. Успех по сообщениям U.E. Косминкова (1985) , Eickard M.D., Adolph A.J. (1977), Onamuuni 0.A.,0olssG^IS80), Kajasekariah G.E., Mitchell G.T., Rickard II.D.(1980), Osboru P.J., Heath D.D.(1982), Yeratex A., Tustin R.C. (1987) И Др. был достигнут В отношении ягнят против Taenia ovis.T.hydatigena, liulfelceps multiceps, Echinococcus granule sua t кроликов против Г.pisiformis, шией против T.taeniaeformis (Hydatigera taeniaef oxmis),a телят против Taeniarhynchus oaginatus.

В настоящее время существует дефицит средств специфической и несиецифЕческой профилактики ценуроза овец и разработка альтернативных технологий получения надежных средств иммунопрофилактики является актуальной.

Ивль 2 задачи исследований. Целью наших исследований било получение биопрепарата, обладающего ишуногенной активностью, для профилактики ценуроза овец.

Конкретно в задачи исследований входило:

- разработать технологии получения ошеоаморального секреторного антигена Multiceps multiceps;

- исследовать иммувохшические свойства и провести контроль антигена;

- разработать схемы иммунизации овец онкосферальным секреторный антигеном для профилактика ценуроза;

- определить протективную активность полученного антигена в производственном опыте.

Научная новизна. Разработан способ получения активированных онкосфер М. multiceps, повышавший их выход из оболочек до 60$.

Усовершенствованы среды для культивирования in. vitro онко-сфер М. nuiticepa с целью получения их экскреторно-секреторных продуктов.

Разработана технология получения онкосферального секреторного антигена М.aulticeps.

Методом иммунохшического анализа онкосферального секреторного антигена, вызывающего выработку специфических антител в крови иимунизированных животных, показано наличие специфического

белкового компонента с и. и. 14,4 кД.

Елорвно изучена активность опкосферального секреторного ап-тигопа М. railticopo в реакции пепротой гомагглютииащш па трах Елмушзированных грушах животных.

Па основе онкосфорального сокроторно^о антигена M.multicepa

создана л пешлана в пропзводсгвешшг условиях прогивоцсиу-розпая вакцина, обладающая высоким профилактическим эффектом (99,62 защити) прл спонтанном заражении овьд цопурозом.

Практическая ценность -работ». На основе разработанной типологии получения снкосферальиого секреторного антигена M.uulti-сера создана л испытана в производственных условиях противоце-гтурозная вакцина.

На Способ получения активированиях опкосфер цестод" подала заявка'й 4Э37428Д5/0-11612 от 17.05.1991 г. и получено пологи-гольноз решение ШШИГОЭ от 21.II.1991 г.

Материалц диссертация дол orte ли:

1. На конференции молодше ученых и специалистов (Москва, шгас, 1930).

2. IIa конференции "Экодого-бпологаческло п фаунистпческяо юпокты галжантозов" (г. Ереван, 20-22 шл 19Э1 т.).

3. IIa заседаниях Ученого совета ВНГИС (Москва, 1909-1993гг.).

Основнно полркепия. вшгосшнв па затдитх-.

1. Технология получения овкосфералыюго секреторного антп-ша M.raulticepa.

2. Изучение тмунохшличесгазх свойств отшэофзралъного оекро-оряого антигена М. nultlcopa.

3. ПротектвЕпоэ деЗствив вакцины на основе онкосфарального е-феторного антигена при спонтанном ценурозе овец.

Публшшгшс. По томе диссертации опубликованы три статьи. *

.0ÜK2M а 5ШШХЩ ЕШШШ2Ш' Дпссортатщя азлозэиа на fj7 границах шпшнописного текста. Состоит нз вводетая, обзора лн-эратури, раздела "Материала л метода", посте глав собственных . )следований н их обсуждения, выводов. Рабо-га иллюстрирована 7* ^блицами й '/О рисунками. Список литература содоргят^?^ оте-югвонниг а зарубежных источников.

.г. обзог лит:лти

В литературном сбгоро предстаялоиц сведекг.я о тохиапогакх нолучеиия средств т^гонрофялактпкц ларпалъшх тешэдоэов. Про-аншгизкровшя работы, ь{Уючаящио штоды шимшкроюяия к кулыь-гира:аихя о;:косфс-р, под/чеша! иротекггваых шщошов. Иодросжо иродстоглопи работы, кассжзвгеся проверки лрогектившгс сг.овстп отсссфорачьньа антигенов тееткд и их иййунохшчческого доишзп.

С0ЕСШ1ШЕ КССЛДЦОБ-ЛНИЯ 2,1, Материала и методы

Научные исследования проведена в лаборатории биохикда к бхохохиолопш ВИГИС, па экспорикектальной баз о Еурглово и колхоза "Е^рлшс" Ногайского райопа Дагестана.

Гслы.езл'ш дда арогедекЕЯ исследований получал; ог скспо-рнменггшьно пнваз1грсваннше собак, йганоспособнссгь яид М.ииХИ-сорп игоодоляди по методу Л.Г. Камаяозой (1949), методу Н.Е. Космизпсова и Т.И. СудъииоЙ (Скршшиковой) (1991) с цос-лодуиил подсчетом вихода (в процентах), а таххе зарахехшеи яг-

ш1т .

Для выяснения оптимальных условий освобождения онкосфор М.таХЬ1сера опробованы различные прописи искусственного желудочного (ИКС) к искусственного ниточного соков (¡КС), позволивших найти онтЕмаяыте их варианты, Для поддержания гшзнеспособ-костн опкосфор в искусствекни условиях предложена пропись питательной среды, в которой в течение 2-х суток способны развиваться начальные стадии личиночной форды М,та11;:!.сорз.В результате опытов но культивирования активированных.онкосфор М.пи1Ъ1-серз по разработанной нама методике были яолучени экскротор-по-секреторные продукты - предполагаемой антиген, который впоследствии использовался в этом качестве. В ходе наработки антигена освобоздадЕсь от самих онкосфер путем центрифугирования среда Еульпшировашд и концентрировали его с помощьп полнэтЕленгли-коля (м.м. 6000).

Для нммунохЕмнческого анализа оикосферального секреторного антигена использовали метод электрофореза (Э$) в аолиакрпламвд-г.ом геле (ПЛАТ) с додецилсульфатом натрия (ДСН) ( 1аеп11е о.к., 1970), илдувоалектрофореза, реакщш двойной 1плмунодиффузЕИ по

Ouehboilony О. (IS58). HcTosjoirco сивороток проводила по методу U.E. Еалкад (1974).

Актюшость антигена определяли реакцией. непрямой гекагглп-гжкщви (РИГА) по Kalborg 1С. (1987), сторллъпосгь и бозвродноегь о^зпршттшш мотодает. Концентрацию öcj.ja d свкооХералыюм секреторном пптнгеио определяли по hmirj о.it. ее aj(IS5I).

Статистическая обработка дашш прои^допа по методу Ста»-депта,

2.2, Результаты исследований и шс обсуждение

2.2.1. Эксперименгалхноо зараяепаэ собак ¿кодексами Coenurus cerebralis

С цольв получения исходного материала для изготовления оя-кссфоралшого секреторного антигена (ОСА) - жщ цсстодц М. nulti-cops, собше зар&тали сколсксами с.сегьoralis. Ееого било проведено 8 опытов по зарсяоикл собак. На 3G шшазирсваншвс са:.щов варзяешшмк оказались II гашогашс (30^), нз 15 мшзазировагашх cüüoic - 9 (295). Под coöaic в иаких опытах но влияй решээдш образен на поспрзшгппзость я зарахошхэ. Досюда достигала полосой зрелости, п ере,дно:.?, через 65 дней поело заражения. У отдельных соопг. 1.дгльтицопсц достигая?. половозролостп и начинали видолятъ члегахк ш 53й день поело заражения.

Анализируя пиши результат я дашь» лктера'гурпих источда-коа, пожеи согласиться с t,отешем С.A. Konnodaoua (IS8?) о тс:-,, что сроки преяшигаатаюго ра: лтпя цепня мозгового у собак,как Н другпх ТСЛЯЯД, ОбуСЛЭШПЕЕЮГСЯ рядсм йпзпа'шгзчоекпх, гокзтп-чееппе л пйа факторов, таких как возраст, пол, порода ссйак, созоч эарлкпиш, условия кормления, гсогра^пческоэ полояелио поста, где проводили экспоргагект. В пастах опытах пр-д заражении собак количество сколексоа С.согеЪгаИз но препылало 70-80,при недостатке материала кпвотшг; задшза. i 40-50 сколзксов. Принк-васадссть ларвоцпст составила от 2,5 до 95%. Цопурусн обладали

н0еысск0й устойчивость!) к влопппш воздепстепям, оптш.'лльнсй для

сохранения лз ппвазпониостп была температура +4°С в течение 10 суток. Локалгзацпю ценурусов в козаочко пе наблюдала ни разу, в лобной доле в 35,% случаев, в лобно-теыенной - 14,3£, в ви-

сочно-теменной - 28,6$, в затылочной - 21,4$ случаев. При вскрытии 15 черепных коробок овец обнаружили по 2 пузыря в 8 случаях (53,3$) и ид разу но находшш ценурусов в спинном мозге и в других органах.

2.2.2. Экспериментальное заражение овец ЯЙцаии М.multiceps

Б пашгх опытах яйца Н. multiceps irpn хранении в физиологическом рас-шоре с антибиотиками в точенке длительного времени (64 суток) оставались инвазионными, несмотря на то, что аизио-способность по ыашеыу методу и методу Г.А. Качаловой была выявлена только у 5/Z яиц. Окончательным критерием ишзазигашости онкосфер служил процент заразившихся ишотшх. Заражение проводили такпо для полу тения сывороток крови от больных ценурозом животных, используемых в иммунологических реакциях.

В опыте по зараконкю 6-ти ягнят 3-х месячного возраста использовали 64-х дневнув культуру яиц M.multiceps. Доза зараксния составила 4 тыс. яиц на I голову. Тяжелая форма острой стадкн ценуроза с лэталышм исходом имела место у 2-х ягпят, у других впвотшх отмечалась .стертая форма клинических признаков 1-й стадии ценуроза.

У двух ягнят из 4-х зараженных оставшихся в жзшнх последняя стадия ценуроза проявилась на 40-50 сутки, две предыдущих стадик протекала без вида.™: клинических признаков. На продолжительность скрытого периода,по-видакаду, повлияли ьшояествен-нооть инвазии е своеобразная локализация паразита (В.И. Бондарева, 1963). У остальных ягнят наблюдали о 24-го по 32-й день улучшение общего состояния, по в дальнейшем наступало ухудшение, а с 89-го дня - яркое проявление клинических признаков ценуроза.

2.2.3. Активирование онкосфер М.multiceps

В результате многочисленных опытов удалось добиться последовательного снятия оболочек о онкосфер, в то зхо время оставляя их Eii3Hocnocodirai.nl. С цельэ высвобождения онкосфер из оболочек ыц использовала И2С следующего состава: пепсин - I г, концентрированная соляная стслога - I ид, физиологический рас.твор до 100 мл. Опыт ташай работы показал, что углекислота, образовав-

пале л от взаиподсйотвтш соляной кислоты из НЕС з бикарбоната пат-рая аз ЖС, лвляогся вашгя стюзригаорои активирования сшсосфэр л приводят к значптольпоцууяашгаенип количества подвяяшпе онко-сЗ-ор. Поэтому НЕС поело 1,5-2а часового иш:уб1фовапия выливала, оставляя приблизительно I ш л бистро дс амяли 5 мл ИКС. Всого било использовано 22 вариация ИКС, в результате чего бил найден его оптк'лльпий состав.

Тяблшт К I

Результаты определения активности онкссфор М.геиГЫсерз в различных составах искусственного ниточного сока

!__Нотлорч г-потпороп

Кс'.шонептн ИКС ! j I 1 П ! El ! ! 1У 1 У ! Л 1 га

Панкреатин (г) I I I - I I i

КаПСОз I I I I I I т

2елчь свсжая* Желчь замородонпаяг" (1.У1) 5х 5х 5х 5х 20к 20* 5а

Трплсзи (ш>) - dO -10 40 40 40 -

Лгпааа (иг) - - 30 30 30 30 -

Дистиллированная пода до 100 ид

Активность-{%) 5-7 •1С 30 5 50 35 3

В состсшб MC известной преппел H«ath D.D. и Snyth J.D. (1970) с закороченной гблчьв п концентрация 5% (раствор 5 7) ак-тгашмя бшга только 3% cmcocíop M.tiulticeps. Замена заморогвпной талпя на свеяуп в той ze концентрации (раствор й I) повивала количество октпвировапиих ошсосфор почт л вдвое, обо составляло уг.а 5-7$ от общего miera неелпдуемчх опкосфер. Вводенно в раствор со своквЙ яелчьв трялсина (раствор Гз 2) привело к увэлзтсевнв подвхгг-®а ошсосфер до 10$, а пря добавления лппази п количества 30 иг па 100 мл раствора (раствор Й 3) ективныия билк упо 30 из 100 обработанных онкосфер. С увблнпзнясм концентрация свсаей sarta а

составе ИКС до 20$ выход подвижных онкосфер увеличился до 50$ (раствор И 5), замороженной - до 35% (раствор # 6), а отсутствие панкреатина, компенсированное введением трипсина й липазы (раствор Л 4), вел и к уменьпению количества активированных онкосфер до Ъ%. Содержание бикарбоната натрия оставалось постоянным. Таким образом, факторами, обеспечивающими достаточно высокий выход подвижных онкосфер, оказались: введение в составизвестной прописи липазы, частично, трипсина, и увеличение концентрации свежей хелчи.

При подборе оптимальной концентрации липазы и свежей хелчи крупного рогатого скота процентное содержание других компонентов ИКС оставалось постоянным. Увеличение концентраций аелчи и липазы повышало активирование онкосфер до определенных пределов. Оптимальная концентрация липазы - 0,03-0,4$, хелчи - 20-30%. Использовали свехух хелчь, т.к. замороженная при -20°С, снижала активирование онкосфер почти в два раза. При хранении гелчж при температуре +4°С, она теряла свою активность ухе на 3-й сутки, и процент активированных онкосфер резко падал с 50% до 5-8?. Опыт нашей работы позволил заметить, что хелчь здоровых молодых бычков и телочек оказывала несравненно более сильное воздействие на активирование онкосфер, чем лелчь старого и пораженного фасциолезом, ддасроцелвозоы и эхинококковом крупного рогатого скота. Яйца М.тиИ;1сера в ИКС выдеркивали 15-25 шнуг в термостате при 37-38°С. Хотя концентрация водородных ионов не была решающим фактором, но от нее в конечном счете зависила активность ферментов в составе ИКС, а значит активность онкосфер. Величина рН ЖС составляла 1,0-1,5, ЖС - 8,1-8,4. При.повышении рН до 8,5 - 8,8 количество подвтшых онкосфер снизалось.

Используя описанную технологию обработки яиц М. ти11;1оорв нам удавалось добиться ЮО/?-ного освобождения от оболочек онкосфер. Активность последних составляла в среднем 50-60%. С увеличенном сроков хранения яиц при температуре +4°С в физиологическом растворе с антибиотиками высвобождение онкосфер проходило труднее.

Как показали результата экспериментов, успех активирования онкосфер цсстодо М. пизл^сера зависит прежде всего от сроков хранения яиц, длительности их обработки, качественного и коли-

чоствекаого состава 1ШС я ККС.

2.2.4. Культешроваяие in vitro опкосфер H.nulticopc

Культивировало онкосфер проводили цолъа получения зкскро-торно-сокрогоршк ангигонов. Одновременно наблюдали за развитием онкосфер M.nalticspa в кулътуральпых сро/ах разного состава. Последам, в основном,состояли из искусственной питательной срэда 199 с сывороткой крови телят ш крупного рогатого скота с добавлением антибиотиков - гентамицина или стрептомицина с пенициллином в разных: соотношениях.

Работу проводили в условиях бокса. Посев осуществляли в чаш- . ки Петри в концентрации 4000 онкосфер/мл или 200000 на 50 мл среда. культивирование проводили в течение 48 часов при температуре 37,5-38°С с регулярным контролем культуры на жизнеспособность и отсутствие микрофлоры.

В первые сутки на хвостовом конце онкосфера начинала формироваться небольшая полость, заполненная бесцветной прозрачной падкостью. Через 48 часов онкосферы удваивались в размерах, полость становилась большей по величине л была хорошо заметна. Исследования Ogren R.2. (1952) показали, что личинки тениид на'м-вавт формироваться за счет мультипликации специфических зароды-йезнх клеток внутри онкосферы. Однако следует отметить, что сос-газ сред культивирования опкосфер Ы. multicepa влиял на ах рост и развитие в разной степени. Всего было испытано 10 культуралышх срзд.

Таблица J5 2,

Влияние сывороток крови тавотных на развитие in vitro онкосфер М. aulticeps

Состав среды культивирования j ^кчтаок™

-м-t-

1. Среда 199 + сыворотка кровв телят (1С%)

2. Среда 129 + сыворотка крови телят (20$) н-+

3. Срода 1j9 -»■ сыворотка кровп КРС (103) +

4. Срода 199 + сыворотка кровп КРС (2СЮ ++

п/п! Состав среды культивирования |

Б. Среда 129 . "иммунная сыворотка" ягнят 6. Среда 129

7с,ловшю -обозначения: - нет роста; + незначительное развытио;

■н- почти нормальное развитие; нормальное развитие.

Таблтща Ц 3.

Влияние антибиотиков на развитие онкосфср М. ки1Ь1серз ы рост банальной микрофлоры в культуралышх сродах

I- ' Гт^птгп шпге^гпиттатга ! Рост баиаль- !Оценка раз-

1. Среда 199 + 100 ЕД/мл пенициллина

+ 100 мкг/мл стрептомицина единичные

2. Среда 199 + 200 ЕД/мл пенициллина

+ 200 мкг/мл стрептомицина отсутствие

3. Среда 199 + 40 мкг/мл гентаыиципа отсутствие

4. Среда 199 отдельные

-н-

+

Усиленный рост личинок наблюдался в культуральной среде, обогащенной сывороткой крови телят, т.е. сывороткой молодых гллог/ых. Внесете сыворотки крови телят в концентрации 10% симулировало рост 80$ лич1Ш01с, её удвоенная концентрация - 90-95$. При замене сыворотки крови телят сывороткой крови крупного рогатого скота в концентрации 10$ регистрировали рост 30-35$ онкосфер, внесение 20$ сыворотки крови поддергивало развитие 40-56/5 личинок.

Таким образом, для получения максимального количества раз-в;,зающЕхся личинок М. пи1Ъ1серз лучше использовать сыворотку кро-

- J.J —

пп телят. E'i отсутствие в среде культивирования, вероятно, но обг.спочкр^т рэзштай,дихс.я личинок достаточным количеством ппта-•ioiivaux bcuiOctb, что гедот к замедлении их роста. Высокие концентрации (20/0 глшороткг/ но усиливают рост последних, а приво-;'!ят к появлению балласта и виде сыворогочиих белков в будущем антягепо, но вшолнкгг;нх млуногенной функции. Оптимальной кон-цептгацяс! сивсротки крови телят в кулътуралъпоП среде должна бить Jüy'~vm копцоитрацгл. Следует отиетить, что в скворотко крови гдгоотдах, когорте бшга презде инзазярованы M.roilWcopo, снкосферк не развивались.

Одновременно с выбором онтнмалышх сред культивирования личтгок il.nulticeps издали влияние концентрации аптибиотиксп :;а развитие 0!ГК0сфер. Па основании полученных результатов, иа-im установлено, что уменьшение в среде культивирования содерга-птш пктпбяотпков (пенщтишгша и стрептотшцпна) ведет к появлению колонии банальной микро&тори, а увеличение их содержания ыг— знвоот угнетение развлваэдкхся'личинок. Оптимальная концентрация антибиотиков для культура онкосфер M.malticepo составляет для пенЕциялша л отропгилалша - 100 ЦЦ/ад п 100 гасг/мл среда, гопта>.шцкна - 40 мяг/мл.

Анализ известной литературы ло культивирования онкосфер цестод и предваритолып.'о эксперименты позволили отобрать наиболее приемлшые условия л разработать собственную методику кулъ-тгозироваиия онкосфер М. raul-fciceps. Она отличалась от методики . Rtclcarä U.S. и Boll K.J. (ID7I) составом среда, длительностью культивирования, количеством культивируемых онкосфер в единице обьека среда. В результате оштов по культивированию онкосфер U.multicepo нами были падучолы экскреторио-секреторнне продукты - предполагаемый антиген, который впоследствии использовался в этом качестве. I мл ОСА был эквивалентен экскретам и секретам 20000 онкосфер . М. nultlceps, В ходе 'наработки антигена мы освобождались от самих онкосфер путем центрифугирования ерэды инкубация при 16000 об/гяш в течение 60 минут при теннературе +4°С и концентрировали его с помощью полиэтилеягликоля ы.м. 6000.

2.2.5. Характеристика и контроль оикосферального секреторного антигена М.ьиШсерз

2.2.5.1. Злектрофоретичоскнй анализ онкосфералыюго секреторного антигена М.ши1Ъ1серз

Анализ ОСА, культураяьной среда и компонента среды - выворотки крови телят дозволил заключить, что но количеству белковых компонентов, выявленных методой даскэлактрофореза в полиакрилашдном геле, они отличаются. Первая фракция ОСА, дающая характерную ок • раску на белок н достаточно интенсивно окрашенная, имела низкуи и.м. около 14,4 кД. Эта фракция отсутствовала как в кулътураль-ной среде, так и сыворотке крови телят. Б ОСА при подобранных нама оптимальных режимах электрофореза обнаружено 7 белковых фракций с м.м. около 14,4, 18,0, 25,0, 30,0, 40,0, 43,0, 94,0 кД, в культуральной среде - 6, в сыворотке крови топят - ышмшство. Посколыг- ОСА готовили на основе питательной среды 199, обогащенной 10% сыворотки кровн телят, на элегегрофореграшах проявлялись балки, общие как для антигена, так и для контролей. Это ке отмечали "1с1!ахй и.ю. и КаЪ13аг 1.С. (1976), пытавшиеся очистить "культуральный" антиген Т.р1з1£огш18. Кроме белков сыворотки они обнаружили две слабоокррчюнные полосы, отсутствуйте в сыворотке крови кроликов, о величинах этих белков ке сообщалось.

Использованное нами окрашивание дискэлектрофореграш с ра-Еогнакшаш образцами ОСА на полисахарида йодной ккслотой-нади дало отрицательные результаты. .

2.2.5.2. Анализ иммунных сывороток а онкосфералъного секреторного антигена М.шиШ ;ере в реакции двойной ю,мунода$фузни

Реакцйя двойной иимунодаффузиж использовалась наш для "вы- ' явления специфических преципитинов б сыворотках крови зареванных ценурозом и иммунизированных ОСА животных, а тага® для антигенного анализа экскретов и секретов.

Результаты исследований показали, что в варианте "тройка" ыазду ОСА н иммунными сывороткаш двукратно и однократно кмлуни-зщюваянкх животных форшрсв;. лсь две идентичные полосы прецыш-тацав, свидотельствуидие о присутствии в ОСА, но крайней море.

- Г5 -

двух компонентов, па которые синтезируются антитела у животных. Для вдентг*>икации выявленных полоо преципитации в сыворотках иммунизированных животных воспользовались вариантом "пятерка". В качестве антигенов наряду с ОСА использовали культуральную среду, сыворотку крови телят и цевурусцую жидкость, а в качестве антисыворотки активную иммунную сыворотку. Между антисывороткой и ОСА, антисывороткой и сывороткой крови телят было выявлено 4 полосы преципитации, две из которых давали реакцию идентичности. Две из четырех полос преципитации, образованных между ОСА и антисывороткой, были идентичны аналогичным, выявленным между куль-туральной средой и той не антисывороткой. В то же время только одна из них была идентична линии преципитации, образованной между антисывороткой и сывороткой крови телят. Полосы преципитации меаду антисывороткой и антигеном ценурусной жидкости отсутствовали.

Чтобы подтвердить присутствие специфических компонентов в пшом антигене использовали метод адсорбции гетерологичных антител с последующим контролем полноты истощения реакцией двойной имадунодаффузии. Для этого провели истощение преципитирующих иммунных антисывороток животных, полученных на ОСА, культуральной средой. Истощенные таким образом антисыворотки исследовали в реакции иммунодпффузии с гомологичным (ОСА) и гегерологнчннм (культуралхная среда) антигенами. Отсутствие полос преципитации меяду истощаемой сывороткой и гетерологичным антигеном свидетельствовало о полното гегемония. В результате исследования были получены полосы прецгпптагши только в гомологичных .системах. Мезду ОСА и аптиспвороткой формировались две четко выраженные полосы преципитации. Такую яе картину наблюдали при апализе сывороток крови животных, иммунизированных однократно. Однако, следует отметить, что две полосы преципитации, образованные меаду сывороткой овец и гомологичнкл антигеном, были диффузными и не очень четко выражению,ш. Это свидетельствовало о тот,!, что все компоненты ОСА, участвующие в.синтезе антител, вступали в действие после первой пг/мунизацип, повторная лишь усиливала аптлтэлогенез, но набор антигенных компонентов оставался прежним.

Анализ ОСА и антигена ценурусной эидкости с сыворотками экспериментально зараяенпых ценурозом нтотнцх но дал положитсль-

них результатов. Эти данные б определенной степени, согласуются с сообщением Р.Г. Яраева (1972), которой с целка выявления функциональных антигенов в экстратах имаго М. иш1*;1сорз и сколексов С.сегеЪгаИв также использовал реакцию тамунодаффузиЕ с сыворотками экспериментально зарааешшх ценурозом гшвотиых, но ви-иувдон был от нее отказаться, т.к. даже при 4-5-кратшх концентрациях испытуемых сывороток реакция была слабо положительной.

2.2.5.3. Ищуяо электро^оретич еский анализ • онкосферальюго секреторного антигена

Ишуноэлектрофоретический анализ ОСА с использованием сывороток от тлунизироваиных животных показал наличке 3 дуг преципитации, расположенных на анодном конце электрофореграши. Дугк преципитации выявлены такм при взаимодействии г.сслодуеишс антп-сшзороток с контрояяма - кулыуральной сродой е сывороткой крови телят, "оэыозяо, это обусловлено стимулирование:.! слабого иммунного ответа к естественно нпэкшл уровней специфических антител в сыворотке крови пдмуЕкзировашшх юшопшх.

•^акны образом, тгунопшическиЁ анализ показал ьаличкэ ъ ОСА белкового компонента с м.м. 14,4 кД, отсутствующего-в контроля! - среде культивирования и сыворотке крови телят. Методом двойной иммунодаффузпи доказана возмогшость формирования специфического ответа организма хозяина па введение ОСА.

2.2.5,4, Контроль антигена па сторнльность, безвредность, содержание бел!са и активность

Кавдув приготовленную серию антигена проверяли на отсутствие механических примесей, стер:ш,нс.;ть, безвредность, содержа-белка и активность.

Проверка ка стертштооть,. Посевы ОСА в целях бактериологического контроля на ШБ и ША в течение 10-и дней и на гааокозшй бульон Сабуро с целью проверки па загрязненность грибаш в тече-ша 14 дао2 оставались стерильными.

Проверка па безвредность. Все кшаотико (ишез) оставались клинически здоровыми в течение 10-и дней и ка место внутрибро-еенного введения антигена в 'озе 0,5 ыл не было воспалительных явлений.

~ Г.7 -

Содоряашо белка п концентрированном антигене составило 23,1 мг/мл, в нолопцсптрарованпом - 5,75 ~ 0,46 мг/мл.

Антигенную активность определяли реакцией непрямой гемаг-глготшащш. В олнте использовали 20 ягнят 7-ми месячного возраста породи финский ландрас, которых разделили на 4 группы по 5 голов в каждой: ягнятам 1-й группы ¡зводшш пнутрамышочно I мл актятепа с I мл полного адкосакта Фрейпда (1Ш) двукратно с интервалом 21 день; 2-й группы - I ил. антигена без ПАФ двукратно, 3-й группы - I мл антигена с I мл ПАЯ однократно; 4-я группа служили коптролш. Кровь дал исследования брали до кммушзацип л на 3» 7, 10, 15, 20, 45. G0, 75, 90 и 120-е сутки после повторного введения - у ягнят 1-й к 2-й групп и поело однократного - у ягнят 3-й групп«.

Исходите показатели титров антител, вырахеншэ в логарифмах, составили в 1-й группе - 0,6, в остальных трех группах -- 0,4. .

.Табдшт I й- • Jömajmtn специфически:'антител, в РИГА (logg)

Для исслс- j_____O-iJULa__

Доваляй . ! r i п » и ! ту

0 0,6 ± 0,24, 0,4 * 0,24 0,4 ± 0,40 0,4 ¿ 0,24

3 1,8 ± 0,58 1,4 ± 0,5 0,4 ± 0,40 0,2 ± 0,20

7 2,6 ¿ Г,12 1,2 ± 0,2 2,0 ± 0,63 0,4 ± 0,24

10 2,4 ± 0,40iE 3,0 ± 1,30 7,2 ¿ 0,37я 0,2 ± 0,20

15 5,6 * 1,57® 4,2 ¿ 1,02й 6,8 ± 1,02й 1,4 ± 0,24

20 5,4 ~ 0,93- 3,6 ± 0,81й 3,4 ± 0,87 1,0 ± 0,32

45 8,0 ± 0,95я 3,2 ¿ 0,66 0,0 ± 1,30 1,2 ± 0,49

60 3,8 ± 1,11a 1,0.* 0,86 2,2 ± 1,07 0,6 ± 0,24

75 5,4 - 0,93* 1,8 i 0,80 2,4 ± 0,98 0,6 ± 0,24

90 1,8 ± 1,32 1,8 ± 0,80 1,8 ± 0,58 0,6 ± 0,24

120 6,0 ± 1,14я 2,8 ± 0,92 2,0 - 1,05 1,6 ± 0,4.0

Примечание: к - Р> 0,95 относительно контроля.

— ib —

Концентрация овещфачеоких шшшзл в крови ьжунизировак-щас кгпяг била значительно вшлз, чем у гошотшлс контрольной группы. Нанбальсгаа показатели логарифмов тлтров специфических антител отметили в 1-ой группе животных. Тигры антктол до 10-го для в крови ышотннх нарастали плавно, но, в основном, антитела к ОСА появлялись на 15-20-й день (5, 6-5,4 logg), достигая максимума на 45 суткн после повторной илмушсзацин (8,0 log2 в сроднен но группе). На 60-й донь, судя но показателям I03 ,2 титров антител (3,8), происходило снпяешге их уровня в циркуляцни, которой, однако, вновь повязался на 75 сутки до 5,4 log^. Начиная с S0~:c суток,отметили снижение тигра гуморальных антител овец этой группы по сравнении с предвдугра сроком в 3 раза (I,81052). Новый подъем уровня епецхфических шипел в кровн швотшхх иаб- ■ лздакг на 120 сутки (6,0 1ое9).

В крови sebotkux второй группы концентрация специфически аптктел была шшэ, чем в первой, но ока постепенно нарастала и долго держалась на одном уровна. Ifeyinw,* огвзт на повторное введение антигена проявлялся в увзлячанах сроков выработки антител, хотя tíos действия адьивапта этот процесс происходи! so Tai; внра^енно.

В крови ягнят третьей группы, Елг.^унпзпроЕанних однократно аптпгеноц с адьвЕзнтои, регпстраровавг резкое, но кратковроглоя-поа нова'ленпо титров споцф:ческкх антител. IIocico.rii.Ky ягнята этой группы но получгли повторной антигенной сте^лядни, титр, антител у них значительно енташея. К 90—г.ту даэ окспсрииопта у • епвотшх всох оштшх групп 'регистрировали тевдскцЕЮ к еннло-еню титров антптоЛ, выявляв:,ikx в РНГА. Однако на 120-ii день не-с&одованкй каблодали второй подъем уровня антител у вакх^нкро-вашшх ягнят. Но сравнению с группой контроля концентрация спо-цг^дчооках антител в I-oü группе бала вша в 3,0 раза, во 2-ой - в 1,8 раза, в 3-ей - б 1,3 раза.

Сравнивая результата, получению паин в РНГА поело иьиу-кпзапдг ОСА к дашшо, полученные Р.Г. Яраовш^ (1972) при вкспо-рггдэнтальноы оарахониа ягнят денурозо;.:, ш обнаружили глого общего в данамкко антателогенеза. В наша ояитах наиболее близкд-Ш1 по шиукному ответу к wv. оказались животные I-oS группы.

Схсич мгауютанчч гг.." от них, разработакппо пест п эксперименте, лог"1.'! в ссгтову производственных лсшдаюяЗ ОСА б условиях исолягостолучкого чо гсяурозу хозяйства,

2,2,С. Ирогггпо.тст'сп'ппо Еспнтанкя сякос^орашгого

рстот.7госо ЛГРЯГСПА К. киШсоро

Опят по гт^п-ч-рпя тгплт против поиурога проводил-: л кол-хо-~.о Ног,"цск'ч:о гаЗона ^пгосташ. Колхоз считается по-

блптспо.т/чит по ц<?яурояу, глбояь ятаят от пегуроза ежегодно составляет С-Щь от иогслооья ягнят токущого гоча гюхцчвяя.

В производстосппсг» опьто по проверке иротоктпвпих свойств ОСА било лслользо-л'шо ¡»00 ягнят 2,5 местного возраста грозненской породи. В качество адкззачта всшшооэала паслялий здьм-сапт Всосопзпого лаутао-лс&чодовптельегого ятпуртого института (Всероссийский научдо-кссдедоватольсккй институт пацитн лнвот-шгс).

■ хшт & 5. Результат:! ярогггодстззошсс всгоготпЯ снксс$эралъпого секреторного актотена М. яи1Ысоро в условиях колхоза "Елротк" Ногл"ского района Дагестана

Я' группы !Кол-во 1ЯИВОТ- ! пых ! 1 ! Доза антигена ! ! {кратность и интервал введения адгнгена ( !Кол-во !забо-! левша !яивот-!пнх

I 100 I мл (23 от белка) + . I мл адьеванта двукратно с интервалом 14 дней _

2 100 0,5 мл (11,5 кг белка) + 0,5 мл адагаанта двукратно с интервалом 14 дпей I

3 50 I ш (23 мг белка) + I мл адыэванта двукратно с интервалом 21 день -

4 250 непммунизлровашшй контроль 17

Специальных мероприятий, предусмотренных инструкцией по борьбе с г&лыпштозами, не проводили. Овцы заражались на пастбищах. Общая продолжательность наблюдений за ливотнымя составила 7,5 по-

сяцев. В первой и третьей ошшюй группах не было зарогистркро- ■ вано ни одного случая клинического проявления или падеяа животных от ценуроза. Во. второй опытной группе был вынужденно убит один ягненок при подозрении па ценуроз. При патологоанатомичео-ком вскрытии в головном мозге был обнаружен один пузырь размером 2,5 см в диаметре покрытый налетом фибрина.

В контрольной группе (250 ягнят) было зарегистрировало 17 (6,8$) случаев падежа ж вынужденного убоя животных. Патолого-анатомическое вскрытие подтвердило диагноз "ценуроз". Всо обнаруженные ценурусы были жизнеспособными со сформированными п^ж развивающимися сколвксами.

Согласно нашим расчетам экономический эффект при применении вакцины составил 16 руб. на I рубль затрат.

Производственные испытания протектпвного действия предложенной наш на основе ОСА вакцины показали, что она обладает достаточно высоким профилактическим эффектом (99,6$ защиты).

ВЫВОДЯ

1. Разработан способ получения активированных онкосфер Н. mrtticeps, повышающий их выход из оболочек до 60$. Предложен состав искусственного кишечного сока, содержащий 1% панкреатина, 1% бикарбоната натрия, 0,04$ трипсина, 0,03$ липазы и 20$ свегей. хеячи крупного рогатого скота.

2. Лучшей средой для культивирования in vitro онкосфор М. unilticepc среди испытанных нами оказалась среда, состоящая из питательной среды 199, обогащенной 10-20?! сыворотки крови телят. Оптимальная концентрация антибиотиков для культуры онкосфер H.uulticeps составила для пенициллина и стрептомицина

- 100 ЕД и 100 мкг/мл среды, соответственно, для тенташиина

- 40 мкг/мя.

3. Разработана технология получения онкосферального секреторного антигена на основе культивирования активированных онкосфер М. multlcepB, Контроль антигена показал, что он безвреден, стерилен, I мл содержит 'v 23 иг белка.

4. Реакцией непрямой генагглютинации (РНГА) установлено, что онкосферальшй секреторный антиген обладает достаточной активность». Наиболее силь^лй и продолЕЯтельный пмнушый ответ

регистрировали в ШГА у ягият па двукратное с интервалом 21 день парентеральное введение антигена с полным адьювантомг фрейнда в соотноиепии 1:1.

5. ЗяектрофоретичсскиЗ анализ показал наличие в составе опкосфоральпого секроторного антигена специфического белкового компонента с м.м. около 14,4 кД. Реакцией двойпой иммунодиффу-зии доказано, что у ягнят на введение антигена вырабатывается специфический тэдунннй ответ. Методом адсорбции гетерологичных антител выявленн две четко выраженные полосн преципитации ыезду онкосфералышм секреторным антигеном и сыворотками иммунизированных янвотшх.

S. Производственные испытания онкосферального секреторного антигена М. multicepn в качестве вакцины против ценуроза овец показали его высокие протективнш свойства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Судьина Т.И. (Скршшипова). йммуногенная активность вакцины, полученной на основе культивирования онкосфер Kulticeps nulticcps in vitro при экспериментальном ценурозе овец // Бш-лотепь ВГО1С. - 1990. - Внп. 54. - С. 103-104.

2. Судьина Т.И. (Скрншикова). Получение экскреторно-секреторного антигена для иммунизация ягнят против ценуроза // Бюллетень ВИГИС. - 1991. - Вып. 55. - С. 100-102.

3. Судьина Т.И. (Скрышикова). Пврснептивн профилактики ценуроза овец // Тезисы докладов научной конференции "Эколого-био-логическнэ и фаунистнчсские аспекты 'гельминтоз ов", г. Ереван. -Ереван, 1991. - С. 106-107.