Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Межклеточный транспорт рекомбинантных вирусов, полученных на базе генома вируса штриховатой мозаики ячменя

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Межклеточный транспорт рекомбинантных вирусов, полученных на базе генома вируса штриховатой мозаики ячменя"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГРДЗЕЛИШВИЛИ Валерий Зурабович

МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСОВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА БАЗЕ ГЕНОМА ВИРУСА Ш ГРИХОВАТОЙ МОЗАИКИ ЯЧМЕНЯ

03.00.06 - Вирусология

А в т о |) е ф с р а т днсссршнин на соискание ученом степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биолог ического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН, профессор Атабеков И.Г. доктор биологических наук Морозов С.Ю.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Дорохов Ю.Л. кандидат биологических наук Васецкий Н.С.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Зашита состоится вЮчасов • 1 Ф. 1998 года на заседании Диссертационного совета Д 053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан сентября 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Каграманов В.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Имеющиеся на сегодняшний день данные указывают на уществование нескольких механизмов транспорта вирусов в растениях Фитовнрусы сличаются по той транспортной форме, в которой они перемещаются из клетки в клетку , по частию вирусспецифических тубулярных структур в межклеточном транспорте, по овлечению в транспортную функцию дополнительных вирусспецифических детерминант, и, [аконец, по свойствам транспортных белков (ТБ, их количество может быть равным), [грающих основную роль в транспорте вирусов в растениях (Cytovsky et al, 1992, Van Lent et I, 1990, Santa Cmz et al , 1998, Kasteel et al, 1996, 1997)

Тем не менее, для многих пар вирусов была показана возможность комплементации [ефектной транспортной функции одного вируса неродственной транспортной системой ругого. В первых классических экспериментах по комплементации использовалась система и двух вирусов, растения подвергались инокуляции двумя вирусами, один из которьх был .ефектен по транспорту, а другой (вирус-помощник) функционален по нему. Особый интерес |редставлялн случаи, когда при смешанной инфекции вирус-помощник обеспечивал ранспорт второго вируса, для которого данное растение не являлось хозяйским (Malyshenko t al., 1988, 1989, Atabekov and Talyansky, 1990). Способность одного вируса обеспечивать ранспорт другого, неродственного ему вируса, указывало на относительную есиецифичность транспортной системы вируса-помощника к зависимому вирусу Однако, анные классических комплементационных экспериментов не могли исключить участия в ранспорте дефектного вируса иных, кроме ТБ, элементов влруса-помошннка, г е вопрос о |ункциональной автономности ТБ оставался открытым.

Развитие кДНК методик открыло широкие возможности для манипулирования енетическим материалом вирусов растений. В результате появился ряд методических одходов, позволивших интерпретировать результаты классического комплемента!(ионного нализа Одним из данных подходов стало использование рекомбинантных вирусов, несущих етерологичные транспортные гены (ТГ) Современные методы генной инженерии позволяют остаточно легко получить рекомбинантные кДНК копни вирусного генома, в которых ужеродный ТГ располагается на месте исходного, что обеспечивает его экспрессию в составе енома изучаемого вируса.

Данный подход уже показал функциональную взаимозаменяемость ТГ ряда обамовнрусов (Nejidat et al.,1991, Deom et al., 1994), бромовирусов (Mise et al., 1993, M se and

l

Ahlquist, 1995), ТГ тобамо- и бромовируса (De Jong et al., 1992). ТГ вируса табачной мозаи (BTM, тобамовирус) и вируса некротической мозаики красного клевера (ВНМК диантовирус) (Giesman-Cookmeyer et al., 1995). Кроме решения вопроса о функцнонгльн эквивалентности заменяемых генов и функциональной автономности гетерологичного 7 данный подход в ряде случаев позволяет определить, является ли ТГ детерминант хозяйской специфичности (Hilf and Dawson, 1993) или детерминантои хозяйского отвгта вирусную инфекцию, фенотипически проявляемого в форме развития разного ви ца симптом (De Jong et al., 1995, Fujita et al., 1996). Кроме того, on позволяег выявить ТГ среди пирует генов, кодирующих полипептиды с неизвестной функцией, если в составе чужого гено исследуемый ген комплементирует транспортную функцию используемого вируса (Agraiovs et al., 1997, Ryabov et al., 1998).

Целью настоящей работы явилось:

1) получение рекомбинантных вирусных конструкций на базе инфекционной кД1 копии генома вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ, гордеивирус), несущих имес тройного блока транспортных генов ВШМЯ транспортный ген: а) вируса табачной мшаи (ВТМ, тобамовирус), б) вируса некротической мозаики красного клевера (ВНМК диантовирус), в) вируса мозаики костра (ВМК, бромовирус), а также г) тройкой блок п нов вируса картофеля (ХВК, потексвирус).

2) анализ инфекционности полученных рекомбинантных вирусов г. общем д родительских вирусов системном растении-хозяине Nicotiami bcmlliamiaiKi 1ля изучен функциональности гетерологичного транспортного гена в составе генома ВШМЯ отношении функции межклеточного и дальнего транспорта

3) анализ инфекционности рекомбинантных вирусов в общем для родите. 1ьск вирусов некротическом растении-хозяине Clicnopodiiwi amarivrticalor для выявления ро указанных транспортных генов в проявлении некротического ответа данного растения вирусную инфекцию.

4) анализ инфекционности рекомбинантных вирусов в специфических д родительских вирусов растениях-хозяевах для изучения роли транспортных генов указанн вирусов в определении круга их хозяев.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В нашей работе впервые изучалась функциональная взаимозаменяемость тройне блока генов ВШМЯ и транспортных генов неродственных ему вирусов: ВТМ, ВНМКК, IIM1 ХВК. За транспортный ген ВМК и тройной блок генов ХВК оказались нефункциональным!

составе генома ВШМЯ: несущие их химерные вирусы были неинфекционнымп для общих и специфических хозяев ВШМЯ, ВМК и ХВК. В то же время, впервые показана ф> нкцишмльная эквивалентность ЗОК белка ВТМ, 35К белка ВНМКК, с одной стороны, и трех белков, кодируемых тройным блоком генов ВШМЯ, с другой, в функции межклеточного транспорта в общих хозяевах ВТМ, ВНМКК и ВШМЯ - Nicotiana henthamiana (системный xoihih) и Chenopodium amaranticolor (некротический хозяин). Показано, что в процессе р.нмножмпя в NicotmtM benthamicma рекомбинантных вирусов, несущих ТГ ВТМ и ВНМКК. ти- происходит серьезных модификаций в последовательностях гетерологичных транспортных генов Обнаружено, что тип транспортного гена в составе изучаемого рекомбинантного вируса определяет фенотип некрозов на инокулированных этим вирусом листьях ('henopndiiim amaranticolor. Показано, что хотя рекомбинантные вирусы ВШМЯ ß-ЗОК (замена тронного блока генов ВШМЯ на ген ЗОК ВТМ) и ВШМЯ ß-35K (замена на ген 35К ВНМКК') способны к межклеточному транспорту d инокулированных листьях общих хозяев ВШМЯ, ВТМ и ВНМКК, они неинфекционны или способны к крайне слабому межклеточному трат,порту (ВШМЯ ß-35K в ячмене, специфическом хозяине ВШМЯ) в специфических хозяевах этих вирусов.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского. Результаты исследований были представлены на 5 международных конференциях: Vlth International conference "Fronliers in biochemistry and molecular biology. The legaey of Andrey Belozersky", Moscow, Russia. Deiember. 18-22, 1995; Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, August, 11-16. 1(><>о. 5tb International Congress of Plant Molecular Biology, September 21-27, 1997, Singapore. "Molecular. biochemica! and physiological aspects of plant science" INTAS Conference. Moscow. November, 2730, 1997.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ

Структура работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литера гуры",

"Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов" и "Выводы"

СОДЕРЖАНИЕ ГЛКОТЫ

Получение рекомбннантпых вирусой ип оенппе генома ВШМЯ.

Химерные вирусы, несущие ТГ ВТМ, ВНМКК, ВМК или ХВК, были получены i основе полноразмерных инфекционных кДИК копий PlIKa, Р и у ВШМЯ штамма NDI любезно предоставленных проф. АО. Джексоном (University of California Berceley), лаборатории которого эти клоны были получены. Данные кДНК копии геномных РНК ЕШМ (клоны а, Р, и у) находились в транскрипционных векторах pZfl9U под контролем промото[ РНК-полимеразы фага Т7, что позволяет получать путем транскрипции in vitro ннфекционнь транскрипты (Petty et al„ 1988, 1989).

ВШМЯ а

А

Ял II I

fib

+

Mcol

ßc

ßd

Bglll

вшмяр

-Ж.

л

ВШМЯ Y

Sali

+

Ncol

-СГЕ

ßd

Р-Д58

А

Bglll

БО 30K

I I llllllllllllll1

р-зок

35K

P-35K

3a

ß-3a

»__Г ж

25K ^ 25K ^ ß-XBKl P-XBK2

Рис.1 Схема устройства геномов рекомбинантных вирусов, полученных путем ¡амсны ТБГ ВШМЯ наТГ ВТМ (ген ЗОК). ВНМКК (ген 35К), ВМК (ген За) и ХВК (ТБГ).

Тройной блок генов (ТБГ) ВШМЯ вырезался из клона PHKß по сайтам рестрикции Ncol и Bglll. По этим сайтам вставлялся транспортный ген (или тройной блок генов н ;лучае ХВК) одного из указанных выше вирусов, фланкированный, как правило, искусственно введенными путем ПЦР сайтами рестрикции Ncol и BamHI. Использование сайта Bglll. находящегося в З'-концевой части гена ßc ВШМЯ, приводило к тому, чго в сплаве рекомбинантных геномов оставался небольшой фрагмент геиа ßc. Однако, клонирование производилось таким образом, что последовательность этого фрагмента оказывалась i иной рамке считывания по отношению к последовательности гена гетерологично! о ТБ Таким образом, даже в случае проскока терминаторного кодона ТГ, экспрессия фрагмента ßc не могла произойти, и он, таким образом, не мог оказать влияния на свойства геперологичного ТБ. В качестве дополнительного контроля в опытах по анализу инфекшюнности рекомбинантных вирусов использовался мутантный ВШМЯ ß-A58, неспособный к межклеточному транспорту (Petty and Jackson, 1990). Соответствующий РНК ß-\58 кж н был получен посредством делегирования в клоне ß 5'-концевого учаегка гена 58К бетка по сайтам рестрикции Ncol и Sali.

На рис.1 показаны схемы рекомбинантных PHKß полученных вирусов П случае ХВК (штамм ХЗ) было получено две конструкции: ß-XBKl с простой заменой ТБГ ВШМЯ i а ТПГ ХВК, и ß-XBK2, которая обеспечивала экспрессию двух маленьких белков (I2K и 8К) ТБГ ХВК в составе PHKß ВШМЯ с субгеномного промотора PHKß ВШМЯ (обеспечивает экспрессию 14К и 17К генов тройного блока генов этого вируса). .

Анализ ипфекциопностп рекомбинантных вирусов.

Полученные рекомбинантные клоны ß-30K, ß-35K, ß-3a, ß-XBKI, ß-XRK2. а также клоны РНКа, ß, у и ß-A58 ВШМЯ после превращения в линейную форму использовали для транскрипции in vitro РНК-полимеразой фага Т7. Полученными химерными ß-транскртттами. вместе с транскриптами а и у ВШМЯ, заражали ряд растений В случае каждого рекомбпнанта тестировались растения-хозяева, общие для двух родительских вирусов, а также специфические для каждого из них (см таб.1).

Инокулированные растения ежедневно осматривались на предмет появления и развития вирусспецнфических симптомов. Через 2 недели после инок>ляции инокулированные и верхние (системные) листья используемых растений тестировались с помощью иммуноблоттинга с антпсывороткон к белку оболочки ВШМЯ и посредством

гибридизации препарата тотальной РНК инокулпрованпых растений с ВШМЯ-сисцифп1 сскп зондом (зонд к участку гена БО ВШМЯ). В случае положительного ответа препарат тотгльно РНК дополнительно гибрндизовали с 58К-спец»фическим зондом и зондом, специфи' ески по отношению к гетерологнчному транспортному гену. Это позволяло подтверди-! соответствие сигнала рекомбннантному вирусу и исключало возможность "<агрязненн; опыта РНКр ВШМЯ дикого типа (далее будет обозначаться

Таблица 1

Тестовые растении, используемые для анализа инфекциошюсти химерных

вирусов.

Тестовые растения

Химерный вирус: Общие хозяева Специфические хозяева для ВШМЯ Специфические хозяева для вируса-источника TT

ß-30K Chcnopodiurn amaranticolor, Nicotiana benthamiana H.vulgare (ячмень, сорт"В1аск Huiles") Nicotiana tuhacum (табак, сорт Samsun)

ß-35K C.amaranticolor N. benthamiana H.vulgare (ячмень, сорт"В1аск Huiles") Nicotiana clevelainlii

ß-3a C.amaranticolor N.henthamiana Hordeum vulgare (ячмень, сорт "Black Huiles") не использовались не использовались

ß-XBKl ß-XBK2 C.amaranticolor N.henthamiana H.vulgare ('ячмень, сорт"В1аск Huiles") не использовались

Прежде всего, нами была подтверждена необходимость 58К гена для межклеточног транспорта ВШМЯ (Petty and Jackson, 1990, Petty et al., 1990, 1994) : в то время как РНК транскрипты а, ß, и у дикого типа ВШМЯ вызывали типичные некротические повреждени (см. рис. 6а) на листьях C.amaranticolor и системно инфицировали растения N.henthamiana ячменя (Hordeum vulgare, сорт "Black Huiles"), смесь РНК а. у и ß-A58 оказалась неспособно к заражению этих растений (см. рис. 2-5). Данный опыт являлся дополнительным контроле» исключающим возможность транспорта ВШМЯ в наших экспериментальных условшх 6s участия транспортных белков этого вируса.

Ипфекциопность рекомбинантов р-ЗОК и Р-35К.

Рекомбинантный вирус Р-ЗОК вызывал появление слабых хлоротпческпх пянп на инокулированных листьях N.Ьеп/Ьаппана. Симптомы были сходными с наб иодасмыми в случае ВШМЯ дикого типа (Р-\у1), однако появлялись позже на несколько дней Кроме > ого. в случае Р-ЗОК не наблюдалось появления симптомов на верхних (системных) и и м.ях МЬеп/Ьштапа. Эти данные согласуются с данными иммуноблоттинга (рис Г), слот-блот

Р-№1 тогк Р-Д58 Р-ЗОК

и си си си с

Рис.2 Иммуноблот анализ инокулированных (и) и системных (с) .шстьси МЬеШИаткта, инокулированного ВШМЯ N018 дикого типа (Р-\\1). рекомбннан гным вирусом ВШМЯ Р-ЗОК и делецнонным мутантом ВШМЯ Р-Д58. Для приготоитсния тоск-пробы использовались листья N Ье^Иатзапа. натертые буфером для заражения без добавления вирусной РНК. Использовалась антисывороткп к БО ВШМЯ

гибридизации (рис.За) и нозерн-блот гибридизации (рис.Зб) На рис 2 видно, чп хотя >0 не детектируется в веркнем листе И.ЬаиЬаптша, в имокулированним листе он ткапливается в случае Р-ЗОК и Р-\у1 в сходных количествах. Для аналтировамия ттгльной >НК из инокулированных и системных листьев N.ЬетИатшпа использовались специфические онды к гену БО ВШМЯ. к гену 58К ВШМЯ и гену ЗОК белка ВТМ Результаты слот-блот ибридизации (рис.За) подтвердили данные иммуноблоттинга вирусная 141К ккумулировалась только в инокулированных листьях. Параллельная гибридизация с зоилами : гену 58К белка и гену ЗОК белка показала, что инфекция связана исключительно с ибридным вирусом, но не вирусом дикого типа. Данный опыт также демонстрировал ггсутствие перекрестной гибридизации между используемыми зондами (см слоты с 1Ч1К(1-\М I РНКР-ЗОК на рис.За). Данные слот-блот гибридизации были подтверждены нозер т-блот ибридизацией (рис.Зб): зонд к гену БО ВШМЯ отжигался в случае тотальной РНК из нокулированных Р-ЗОК листьев N.Ьеп!Ьат1апа только на один тип РНК, соотвектвуюшии по азмеру РНК р-ЗОК, но не Р-\\*.

(а) ЗОНД ЗОНД

58К ЗОК

N.b

P-Wt с

Р-Д58 и Р-ЗОК и Р-ЗОК с

РНКР wt

рнкр-зок

Р-ЗОК и P-wt с

(б) N.b. 12 3 4

Рис.3 Слот-блот (а) и нозсрн-блот (б) гибридизация тотальной РНК in инокулированных (и) и системных (с) листьев N.benlhamiana (N.b.) и ячмени (H.v ). инокулированных ВШМЯ NDI8 дикою типа (P-\vt). рскомбннаитным вирусом ВШМЯ р-ЗОК и делеционным мутантом ВШМЯ р-Д58. Для приготовления пюск-пробы использовались листья N.benlhamiana, натертые буфером для заражения без лобэнления вирусной РНК. В случае слот-блота пробы параллельно гибридизовалн с зондом, специфичным к гену 58К белка ВШМЯ и с зондом, специфичным к гену ЗОК белка В'ГМ. В случае нозерн-блота использовался зонд, специфичный к послидипатслмюсш гена БО ВШМЯ. На нозерн-блотс (б) прнумерованные дорожки соответствую! РНК из листьев N.benlhamiana, инокулнрованных : (2) - ВШМЯ р-ЗОК. (3) - ВШМЯ p-ut. на дорожку (1) нанесен РНК-транскрипт р-ЗОК. (4) - mock-проба.

Вирус Р-35К, как и р-ЗОК, оказался способным к межклеточному, но не системном) траспорту в растениях N.benlhamiana, вызывая сходные с ВШМЯ NDI8 симптомы ш инокулированных (но не системных) листьях. Неожиданным оказался более высокий уровеш накопления БО ВШМЯ в листьях, инокулированных Р-35К, по сравнению с лиегьями инокулированными p-wt (рис.4). Эти данные подтвердились данными но слог-бло" гибридизации РНК из инокулированных листьев N.benlhamiana: в растениях, инфицированные Р-35К: сигнал был сильнее по сравнению с растениями, инфицированными P-wt (рис.5).

Способность Р-ЗОК и Р-35К гибридных вирусов к эффективному межклеточном; транспорту в инокулированных листьях N. benthamiana свидетельствует о функцион;jibiioi эквивалентности тройного блока генов ВШМЯ и моногенных транспортных модулей BTN (ген ЗОК) и ВНМКК (ген 35К) в функции выполнения межклеточного транспорта Данньп результат еще раз подтверждает данные De Jong et al., 1992 и Giesman-Cookmeyei et al . IJ95 oi

к

относительном функциональной независимости ЗОК и 35К белков от лру| их продуктов вирусных геномов в процессе выполнения функции межклеточного транспорта и ряде хозяев.

Р-Д58 ß-wt Р-35К БО p-wt (1-А58 Ц-35К mock

N.henthamiaiia ячмень

Рис.4 Иммуноблот анализ инокулированных (н) и системных (с) листьев pnriemiii N.hemhamiana и ячменя, инокулированных ВШМЯ NDIX дикого типа (|i-v\tl рекомбннантным в1фусом ВШМЯ ß-ЗОК и делеционным мутантом ВШМЯ f'-Л^Х Для приготовления mock-пробы использовались листья N.hcnlhamiana п ячменя, н;псрм.1с буфером для заражения без добавления вирусной РНК. Использовалась антисынорткп к БО ВШМЯ

Неспособность к системному транспорту химер скорее всего спя «на с фундаментальными отличиями ВШМЯ, с одной стороны, и ВТМ с ВНМКК с дрм он. и механизме дальнего транспорта. Так, например, ВТМ и ВНМКК нуждаются в Ь<) л ля 'ноет дальнего транспорта (Dawson and Hilf, 1992, Xiong et al. 1993), в то время как п; пьний транспорт ВШМЯ происходит и в отсутствие БО (Jackson et al., 1901) Возможно lame. чти дальний транспорт ВШМЯ требует взаимодействия белков, кодируемых ГИГ. с дополнительными детерминантами системного транспорта этого вируса (Pettv el л I . I WO, Petty and Jackson, 1990b). Невозможность такого взаимодействия в случае химерных вирусов ß-ЗОК и ß-35K могла бы стать причиной неспособности этих вирусов системно инфицировать N. benlhamiana. Следует отметить, что это не могло быть результатом шпкого еровня аккумуляции вирусов в инокулированных листьях растении - химерные вирусы накапливались не в меньших по сравнению с ВШМЯ дикого типа количествах (рис.2,4)

Для проверки того, не подвергается ли последовательность чужеродного 'ГГ в слставе генома ВШМЯ модификациям в процессе вирусной инфекции, из инфицированных рекомбинантными вирусами ß-ЗОК и ß-35K листьев N.benthamicma, дающих сильный енгнал по БО ВШМЯ при иммуноблоттинге, выделялась тотальная РНК, на которой приводилась реакция обратной транскрипции и последующая ПЦР. ПЦР продукты, соответстпмошие ЗОК и 35К генам рекомбинантных вирусов, клонировали в прокариотические векторы Поипенные клоны далее использовались для секвенирования. В случае гена ЗОК в составе (МОК было зарегистрировано 2 нуклеотидные замены, ведущие к двум заменам в ампнокнепшюй

ч

последовательности ЗОК белка: в положении 18 ('Г Ьг ->Яег) и в положении 222 (/\sn-KSei) Об! аминокислоты расположены в неконсервативных районах ЗОК белка (Ме1с1\е! <й а1. 1940) Хотя в случае Р-35К было зарегистрировано 8 нуклеотидных замен, ни одна из них не привел; к аминокислотным заменам в последовательности 35К белка (данные не представлены) Такии образом, можно сделать вывод о том, что в процессе инфекции исследуемых нам! рекомбинантных вирусов (З-ЗОК и р-35К не имеет место какая-либо адаитацш последовательности гетерологичного транспортного гена к чужеродному вирусному геному

ЗОНД зонд

58К 35К

H.v.

N.b.

|J-35K «— mock <— (5-wt

PHKfl-llK

•*- РНК [!-wl P-35K

Р-Д58

mock

p-wt

Рис.5 Слот-блот гибридизация тотальной РНК из ннокулированных (и) и системных (с) листьев И.Ьсткаппапа (Ы.Ь.) и ячменя (Н у ), ннокулнрованных ВШМЯ N018 дикого типа ф-\и), рскомбннантным вирусом ВШМЯ р-ЗЖ и делеционным м\ г.штом ВШМЯ Р-Д58. Для приготовления шоск-пробы использовались листья Ы ЬстЬитнша. натертые буфером для заражения без добавления вирусной РНК. Пробы параллельно гибридизовали с зондом, специфичным к гену 58К белка ВШМЯ и с зондом, специфичным к гену 35К белка ВНМКК.

Так же, как ВШМЯ и ВТМ, Р-ЗОК вызывал некротические поражения листьев С.атагапИсо1ог (рис.66). Однако, время появления и морфология некрозов, вышваеыых Р-ЗОК, отличалась от таковых у ВШМЯ и ВТМ. Некрозы ВШМЯ N018 появляются через 4 дня после инокуляции (д.п.и.), имеют характерные размер и форму (рис.6а) Через 7-9 д.п.и. происходит полное увядание ннокулированных листьев В случае ВТМ некрозы вгервые появляются через 2-3 д.п.и. и увеличиваются в размере в течение следующих 4 дней В :лучае

III

же р-ЗОК некроты появлялись только на 10 д.п и. и имели морфологию, сходную с некр 1зами. вызываемыми ВТМ на ранней стадии заражения. Однако, при этом не найлюлалссь ни последующее скорое увядание инокулированных листьев, как в случае с ВШМЯ, ни увеличения размера некрозов, как в случае с ВТМ.

? (А)

ВШМЯ \D18ivt, 4 д. п. и.

(В)

ВШМЯ Р-35К, 4 .(.пл.

Рнс.6 Фенотип некрозов, вызываемых ВШМЯ N018 дикого тппз (а) и рскомбинантными ви псами ВШМЯ Р-ЗОК (б) и ВШМЯ р-35К (в) на инокулированных листьях ('Исп'>р<к1пт1 (/»шт> и,сп!>>/- Г|истья сфотографированы через разное число д п и - "дней после инокуляции"

Подобно ß-ЗОК, ß-35K вызывал некротическую реакцию на листьях C.nmaraniicoh Некрозы по морфологии были схожи с вызываемыми на этом растении ПНМК'К. ВТМ и | ЗОК, но не ВШМЯ (рнс.бв). Однако, в отличие от ß-ЗОК, в данном случае некремы возник значительно быстрее - уже на 3 д.п.и Неожиданным оказалось отсутствие дегек i ируемого Б ВШМЯ в зараженных ß-ЗОК и ß-35K вирусом листьях ('.amaranticolor. Сигнал на слот-бло-при гибридизации с зондом к гену БО ВШМЯ был на несколько порядков слаСее г сравнению с сигналом в случае ВШМЯ (данные не представлены)

Данные результаты оказались достаточно неожиданными, так как проведенное Fetty al, 1994 картирование в геноме ВШМЯ детерминант, определяющих некротический отвггт в ( amaranticolor, показало, что эти детерминанты локализованы в PIIKy Иными словам транспортные белки, кодируемые ТБГ ВШМЯ, не определяли некротический о гнет расти С. amaranticolor. Можно предположить, что вирусные детерминанты, определяют! е ti некротического ответа С. amaranticolor на инфекцию ВШМЯ, являются еще Счии комплексными, чем предполагалось ранее (Petty et al., 1994). Сходство симптомов на < amaranticolor, вызываемых рекомбпнантнымн вирусами ß-ЗОК и [1-351С с вьиывагмымп |!ТМ ВНМКК, соответственно, может говорить о существовании двух соотавляощи определяющих тип некротического ответа. Ряд вирусных детерминант необходим >i л. индукции в зараженном листе некротического ответа как такового, тогда как нрпра транспортного гена, вероятно, определяет фенотип некрозов. Такая роль ТБ в нроя! лет симптомов может быть связана, например, с различиями в эффективности выполнения tin транспортной функции в данном растении-хозяине, или, например, с различным хараттерг взаимодействия ТБ с предполагаемыми клеточными факторами и/или дополнительны!! детерминантами транспорта ВШМЯ. Следует отметить, что, несмотря на крайне низк! уровень накопления рекомбинантных вирусов ß-ЗОК и ß-35K в инокулированнмх листьях amaranticolor, этих количеств оказалось достаточно для межклеточного транспорта хнмерш вирусов и вызова ВТМ-подобного и ВНМКК-подобного хозяйского ответа на инфгкци (рис.66, 6в).

В то время, как ß-ЗОК способен к межклеточному транспорту в общих хо <яевах Е III1V и ВТМ - N.benlhamiana и С.amaranticolor, данный рекомбинантный вирус оказал неинфекционным для ячменя (Hordeum vulgare, сорт «Black Huiles») и табака (N tabacuni. со «Samsun») - специфических хозяев ВШМЯ п ВТМ, соответственно Ни \ одного анализируемых растений табака и ячменя (продилось не менее трех незави;нм1 экспериментов, в которых анализировалось не менее трех растений каждого вида)

12

йблюдались симптомы, характерные для ВШМЯ (на ячмене) и ВТМ (на Iабаке) 1еспособность к распространению Р-ЗОК в этих растениях была подтверждена результатами 1ммуноблоттинга и слот-блот гибридизации РНК (данные для ячменя на рис 2 и !, лчя габака [анные не представлены).

Р-35К оказался неспособным инфицировать Ы.скгекинШ, специфическою системного :озяина ВНМКК. В трех независимых экспериментах было иноку.пнроиано 36 л юьев 1ск'ге1ансШ, но не в одном из них не был найден ни белок оболочки НШМЯ путем (ммуноблогтинга, ни РНК р-35К путем слот-блот гибридизации (данные не презстаиле |ы) В о же время, п отличие от Р-ЗОК, рекомбинант Р-35К оказался способным к межклеючному ранспорту в ннокулированных (но не системных) листьях ячменя. При ном. котичество БО Н11МЯ оказалось на порядки более низким по сравнению с контрольным растением ячменя, араженным р-\у( (рис.4). Эти данные подтвердились данными слот-блот гибридизации рис.5). Как и в случае с Р-ЗОК, в данном эксперименте использовалась параллельная ибридизация с зондами, специфичными последовательности гена БО ВШМЯ, гена 58К 1ШМЯ и гену 35К ВНМКК. На рис.5 видно, что в ннокулированных листьях ячменя РНКР-ил [е детектируется, в то же время выявляются малые количества РНК Р-35К

'Гяблнця 2

Способность ВШМЯ Р-ЗОК и родительских вирусов к юраженню нстпыусмыг растений (и - инокулированный лист, с - системный лист)

1 Общие хозяева Специфические хозяева ]

С ататапбсо1ог М.ЬеШЬагшапа и с ячмень табак

ВТМ + + + - +

ВШМЯ + + + + -

р-зок + + - - -

Неспособность Р-ЗОК инфицировать табак согласуется с данными, согласно которым :омплементация вирусом табачной мозаики транспортной функции зависимого вируса в абаке требует дополнительного участия каких-то других, кроме ЗОК белок, детерминант, аудированных в геноме ВТМ (Та1уап51и е1 а1., 1991). При этом, правда, не треЗуется заимодействия этих неизвестных детерминант с ЗОК белком, так как рекомбпнангнын ВТМ с аменой гена ЗОК белка на ген 35К белка ВНМКК успешно системно инфицировал растения абака (Отезшап-Соостеуег е1 а1., 1995). Интересно, что табак не является хозяином для

ВНМКК, из чего следует, что ЗОК не является детермннантой хозяйской специфичности ВТМ в этом растении (01е5шап-Соостеуег е1 а1„ 1995) Наши результаты хорошо югласуптся с этим, так как ЗОК белок ВТМ, экспрессирующийся в составе рекомбинантною генома ВШМЯ, неспособен измеггить круг хозяев последнего. Хотя данные, касающиеся роли 35К б;лка в определении круга хозяев ВНМКК, отсутствуют, неспособность [5-35К заражай. N. ск-у/ши/п позволяет предположить, что ген 35К не является единственной детерминант ой хон йской специфичности ВНМКК в данном растении.

Таблица 3

Способность ВШМЯ ß-35K и родительских вирусов к заражению иатлыусмых растении (и - инокулировапньш лист, с - системный лист) _

Общие хозяева Специфические хогяева

C.amaranticolor N.benthamiana и с ячмень и с Nxlevelandii

ВНМКК + + + - - +

ВШМЯ + + + + + -

ß-35K + + - + - -

Неспособность ß-ЗОК к заражению ячменя, возможно, связана с тем. что транспорт ВШМЯ в ячмене требует взаимодействия дополнительных детерминант транспорта ЕШМЯ (Petty et al., 1994, Petty et a!., 1990, Weiland and Edwards, 1994) не только с предполагаемыми хозяскими факторами, но и с продуктами тройного блока генов Несовместимость детерминант с ЗОК белком ВТМ могла бы в таком случае привести к невозможности транспорта рекомбинантного вируса в ячмене. С другой стороны, причина неинфекцнопности ß-ЗОК может заключаться в нефункциональности ЗОК белка в однодольном растении, не являющемся хозяином для ВТМ Вторая гипотеза более вероятна, так как в случае |!-!5К наблюдается, хоть и крайне слабый, но детектируемый межклеточный транспорт химерного вируса в инокулированных листьях ячменя (рис.4,5). Функциональность (хоть и неэффективная) 35К белка ВНМКК в ячмене согласуется с данными о гомологии л; иного белка и транспортного белка фуровируса soil-born wheat mosaic virus, естественными хозяевами которого, как и для ВШМЯ, являются злаковые (Shirako and Wilson, 1993) Отсутствие необходимого уровня адаптации 35К ВНМКК к хозяйским факторам ячменя и определяет, вероятно, низкую эффективность транспорта ß-35K в ячмене.

Данные по инфекционности ß-ЗОК и ß-35K даны в таблицах 2 и 3

Инфекцитшость рекомбитттов ß-3a, ß-XliKl и ß-Xl\K2.

В то время, как ЗОК ВТМ и 35К ВНМКК показали зависимую от хозяина функциональную взаимозаменяемость с ТБГ ВШМЯ, рекомбинантные вирусы с <амепон ТБГ ВШМЯ на ген За ВМК (ß-За) и на ТБГ ХВК (ß-XBKI и ß-XBK2) оказались Гчкчкч пческн неактивными ни в одном из использованных хозяйских растений (см таб I) В с ¡\чае каждого из этих вирусов проводилось не менее трех независимых экспериментов и в ка-клом m них анализировалось не менее пяти растений каждого вида Ни в одном и; случаен не детектировались ни БО ВШМЯ, ни РНК рекомбинантного вируса (данные не прелсшвиенн) Эти результаты согласуются с последними данными, свидетельствующими о коренных отличиях в механизмах транспорта, используемых ВТМ, ВНМКК и ВШМЯ, с одной стороны, и ХВК и ВМК, с другой. Так, в отличие от ВТМ, ВНМКК и ВШМЯ, межклеточный (и дальний) транспорт ХВК требует участия БО (Chapman et al., 1992), при этом гранст ртной формой ХВК, скорее всего, являются вирионы (Santa Cruz et al., 1998) Можно предположить, что транспортные белки ХВК, адаптированные к используемому этим вирчсом особому механизму транспорта, обладают более серьезными требованиями к природе транспортируемого вирусного материала. Эта гипотеза хорошо согласуется с крайне неустойчивым характером взаимодействия 25К белка с РНК. показанным Kalinina et al. 1996 В использованных экспериментальных условиях Karpova et al., 1997 вообще не нмявнлн 1'НК-связывающей активности у этого белка. Межклеточный транспорт ВМК также rieoyeT обязательного участия БО этого вируса (Rao and Grantham, 1996). Более того, в недавней работе Kasteel et al., 1997b было показано участие в межклеточном транспорте ВМК вирусспецифических тубулярных структур, что указывает на кореное отличие мех; ниша транспорта этого вируса от такового в случае указанных трех вирусов (и в первую о 1ередь ВШМЯ), что, возможно, и объясняет нефункциональность ß-3a

Результаты данной работы свидетельствуют о сложности функционирования транспортных систем изучаемых вирусов растений. В качестве источников ТГ иитлыоиались вирусы, транспортные системы которых отличаются не только по типу транспортного белка/белков, но также и по предполагаемой стратегии транспорта, использующей в качестве транспортируемой формы вРНП или вирионы. В последних работах именно по последнему признаку проводят классификацию механизмов транспорта фитовирусов (Sama Cruz et al. 1998, Blackman et al., 1998, Jansen et al., 1998, Fujita et al., 1998). Результаты данной работы хорошо согласуются с этой классификацией: биологически активными оказались химеры с ТГ вирусов (ВТМ и ВНМКК), которые вместе с ВШМЯ относят к группе, использую лей в

качестве транспортируемой формы вРНП и не требующих участия ПО в межклеточнои транспорте. В то же время, ни ВМК (имеющий, как и ВШМЯ, три РНК компонента и общи) естесственных хозяев - злаковые), ни ХВК (имеющий общее с ВШМЯ устройство и механик экспрессии транспортных генов) не смогли комплементировать транспортную фу ткцик ВШМЯ. При этом, оба вируса (ВМК и ХВК) требуют для своего межклеточного транспорт; белок оболочки и относятся к группе вирусов с предположительным механизмеж межклеточного транспорта в форме вирионов (Santa Cruz et а!. 1998, Kasteel et al. 1997hl

Выводы

1. На основе инфекционных кДНК клонов ВШМЯ получены рекомбинантные геномы, несущие вместо тройного блока генов ВШМЯ гены транспортных белков ВТМ, ВНМКК, ВМК и ХВК.

2. Показано, что рекомбинантные вирусы, несущие транспортные гены ВТМ или ВНМКК (ВШМЯ ß-ЗОК и ВШМЯ ß-35K, соответственно), способны к межклеточному транспорту в инокулированных листьях Nimliami benthamiana и Chenopodium amaranlicolor, общих хозяевах родительских вирусов, однако не заражают системные листья

3. Рекомбинантный вирус ВШМЯ ß-ЗОК и ВШМЯ ß-35K оказались неинфекционными или слабо инфекционными в специфических хо 1яева\ родительских вирусов.

4. Показано, что в процессе размножения двух указанных рекомбннантных вирусов в инокулированных листьях Nicoliatia henthamicuui не происходит серьезных модификаций в последовательности тегеролопппых транспортных генов.

5. Установлено, что при заражении инокулированных листьев Сlicno/u nimm amaranlicolor рекомбинантные вирусы ВШМЯ ß-ЗОК и ВШМЯ fi-35K вызывают симптомы, сходные по фенотипу с вызываемыми на листьях »того растения ВТМ и ВНМКК, соответственно.

6. Показано, что рекомбинантные вирусы, несущие транспортные гены ВМК или ХВК, неинфекционны ни в одном из использованных общих или специфических хозяев родительских вирусов.