Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура вируса штриховатой мозаики ячменя и гигантских бактериофагов EL и Lin68 по данным криолектронной микроскопии

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура вируса штриховатой мозаики ячменя и гигантских бактериофагов EL и Lin68 по данным криолектронной микроскопии"

На правах рукописи

Печникова Евгения Викторовна

СТРУКТУРА ВИРУСА ШТРИХОВАТОЙ МОЗАИКИ ЯЧМЕНЯ И ГИГАНТСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ ЕЬ и 1лп68 ПО ДАННЫМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

03.01.03-молекулярная биология

28 ОКТ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2015

005564042

005564042

Работа выполнена в лаборатории электронной микроскопии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института кристаллографии Российской академии наук (г. Москва) и в отделе биологических наук Биркбек колледжа, Университета Лондона (г. Лондон, Великобритания).

Научные руководители:

доктор биологических наук, доцент

кандидат физико-математических наук, профессор

Орлова Елена Васильевна

Официальные оппоненты:

Завриев Сергей Кириакович, доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии имени академиков М. М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, заведующий лабораторией молекулярной диагностики и отделом международных научных связей.

Клинов Дмитрий Владимирович, кандидат физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки НИИ физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства, лаборатория медицинских нанотехнологий, заведующий.

Ведущая организация:

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского.

Защита диссертации состоится 3 *са-X2015 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 501.001.76 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.bio.msu.ru.

Автореферат разослан рг^Тл 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Соколова Ольга Сергеевна

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Изучение структуры и механизмов функционирования белков является одним из основных предметов молекулярной биологии (A.C. Спирин, 1986). Знание структуры макромолекулярных комплексов дает возможность интерпретировать конформационные изменения в молекулах в процессе их активации и автоингибирования. Признанными методами для изучения структуры белковых молекул являются: рентгеноструктурный анализ, ЯМР, детекция люминисценции, метод спиновых меток и спектроскопические методы. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) является современным, быстро развивающимся методом исследования структуры белковых макромолекул. Электронная криогенная микроскопия позволяет получать изображения макромолекул с высоким разрешением в нативной конформации после моментальной заморозки, при условии использования режимов низкой дозы облучения объекта. Прогресс в этой области в значительной степени объясняется тем, что в последнее десятилетие были сконструированы мощные электронные микроскопы с когерентным пучком электронов, а также разработаны новые методы обработки микроскопических изображений объектов с различной симметрией (Sachse et al., 2007; Clare and Orlova, 2010). Изучение структур вирусных капсидов с икосаэдрической симметрией является наиболее успешным. К настоящему времени методами рентгеноструктурного анализа и крио-электронной микроскопии получены с высоким или средним разрешением данные о трехмерной структуре капсидов многих икосаэдрических вирусов, инфицирующих хозяев, принадлежащим ко всем царствам живого (Lawrence et al., 2009; Wolf et al, 2010; Wommack and Colwell, 2000; Fokine et al, 2005; Fokine et al, 2007).

С другой стороны, неизмеримо меньше информации получено о структурах вирусных капсидов со спиральной симметрией, в частности, спиральных вирусов растений. К настоящему времени опубликованы трехмерные структуры с субнанометровым разрешением только для нескольких представителей рода Tobamovirus, в частности, вируса табачной мозаики (ВТМ), и нитчатого вируса мозаики бамбука (Sachse et al., 2007; Clare and Orlova, 2010; DiMaio et al., 2015). Поэтому определение структуры с субнанометровым разрешением еще одного полноразмерного спирального вириона существенно расширит наши знания о структуре вирусных частиц.

В качестве одного из объектов для исследования был выбран спиральный вирус штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ), принадлежащий к роду Hordeivirus. Палочковидные частицы ВШМЯ имеют внешнее сходство с вирионами ВТМ, однако отличаются от них по параметрам спирали (шаг, внешний диаметр и диаметр внутреннего канала) (Атабеков и Новиков, 1966; Kiselev et al., 1966; Veerisetty, 1978; Atabekov and Novikov, 1989). Сравнение первичной структуры капсидных белков ВШМЯ и ВТМ, ставшее возможным

з

после секвенирования генома ВШМЯ (Gustafson et al., 1986), показало, что белок ВШМЯ отличается от ВТМ наличием дополнительных фрагментов последовательности (Makarov et al. 2013). В настоящее время активно развивается направление нанотехнологии, основанное на использовании вирусных частиц в качестве биоплатформ (носителей). В этой связи необходимо отметить, что частицы ВШМЯ способны образовывать низкомолекулярные агрегаты, которые обладают большой иммуногенностью (Atabekov et al., 1966).

Еще одним объектом для изучения являются гигантские вирусы бактерий, бактериофаги EL, phiKZ, Lin68, относящиеся к классу Myoviridae и инфицирующие патогенные бактерии вида Pseudomonas aeruginosa. Эта бактерия вызывает тяжелые воспалительные заболевания человека и животных (Balcht and Smith, 1994). В связи с устойчивостью бактерии к антибиотикам, встает вопрос об использовании фаговой терапии. Фаги EL и Lin68 обладают широким спектром литической активности (Буркальцева с соавт., 2002). Изучение структуры гигантских фагов является важной задачей для понимания специфичности их взаимодействия с патогенными бактериями.

Таким образом, получение новых данных с высоким разрешением о структуре вирусов с различной симметрией (икосаэдрической и спиральной) является актуальной задачей молекулярной биологии и открывает широкие перспективы для планирования экспериментов по созданию вакцин и фаговой терапии.

Цели и задачи исследования:

Целью данной диссертационной работы является изучение структуры палочковидного вируса ВШМЯ и гигантских бактериофагов с применением криоэлектронной микроскопии (крио-ПЭМ) высокого разрешения.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение трехмерных структур спиральных вирусных частиц ВШМЯ и трехмерных структур капсидов бактериофагов EL и Lin68 с применением крио-ПЭМ и обработки ПЭМ изображений;

2. Разработка методики детекции белковых структур, находящихся в контакте с нуклеиновыми кислотами, с помощью облучения повышенной дозой электронов в сочетании с крио-ПЭМ;

3. Построение молекулярных моделей вирусных белков ВШМЯ на основе моделирования по гомологии и гибкого вписывания и определение контактов субъединиц вирусной частицы ВШМЯ друг с другом и с РНК.

Положения, выносимые на защиту:

1. ВШМЯ способен образовывать две структурные формы вирионов -широкую и узкую.

2. Латеральный гидрофобный контакт в области внешней поверхности

вириона стабилизирует вирион ВШМЯ.

3. В капсиде гигантских phiKZ-подобных бактериофагов EL и Lin68, так же, как у phiKZ, существует белковое внутреннее тело, размеры которого коррелируют с размерами генома этих гигантских бактериофагов.

Научная новизна работы.

В данной диссертационной работе с помощью метода крио-ПЭМ впервые были получены трехмерные структуры вирионов ВШМЯ с субнанометровым разрешением (5,1 Ä и 5,7 А). Впервые обнаружена структурная гетерогенность частиц ВШМЯ и показано наличие двух типов частиц с различными параметрами спирали: широкие (111 субъединиц на период) и узкие (106 субъединиц на период). Открыт новый латеральный гидрофобный контакт между субъединицами белка оболочки (БО) ВШМЯ.

Впервые исследованы с помощью крио-ПЭМ гигантские phiKZ-подобные бактериофаги Р.aeruginosa EL и Lin68. В их капсидах методом облучения повышенной дозой электронов обнаружены белковые внутренние тела, модифицирующие упаковку ДНК. Было показано, что размеры внутреннего тела коррелируют с размерами фагового генома.

Практическая значимость работы заключается в выявлении структурных особенностей гигантских бактериофагов EL, Lin68 и вирионов ВШМЯ, кристаллическая структура которых не была известна. Полученные знания и разработанные подходы в дальнейшем могут быть применены при исследовании других растительных и бактериальных вирусов; для теоретических исследований в области строения белков, белок-белковых комплексов и как структурные предпосылки для моделирования, а также для практической работы по детекции и анализу наночастиц биологического происхождения и при создании вакцин с вирусными частицами в качестве носителя.

Достоверность результатов диссертации обеспечивается корректным использованием современных физических и биоинформатических методов исследования структуры биологических микро- и нанообъектов. Разрешение электронных микроскопов было откалибровано по стандартным образцам. Результаты моделирования пространственной структуры БО ВШМЯ согласуются с экспериментальными данными, полученными методом крио-ПЭМ, что говорит об адекватности построенных моделей. В связи с этим результаты работы являются достоверными, а сделанные на их основе выводы научно обоснованными.

Личный вклад автора состоит в обзоре имеющихся литературных данных; получении негативных и крио-ПЭМ изображений вируса ВШМЯ и бактериофагов EL и Lin68 в нативном и радиационно-поврежденном состоянии; проведении расчетов и построении карт электронной плотности ВШМЯ с разрешением 5,1-5,7Ä; обработке, анализе и систематизации результатов; подготовке статей и докладов на конференциях.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на конференциях: XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов 2012". Секция Биология. Москва, 2012; XXIV Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка, 2012; XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов 2013". Москва, 2013; XXV Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка, 2014; International Microscopic Congress. Prague. 2014.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ - 3, и 6 материалов конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы и благодарностей. Работа содержит 48 рисунков и 1 таблицу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

1.1. Исследование структуры биологических макромолекул методом электронной микроскопии и обработки изображений.

Просвечивающая электронная микроскопия биологических макромолекул (ПЭМ) - активно развивающийся физический метод исследования структуры белков. Преимущество крио-ПЭМ для изучения биологических макромолекул состоит в том, что быстрое замораживание позволяет сохранить водное окружение, характерное для биомолекул в клетке, и получить микрофотографии с высоким разрешением, но со слабым контрастом. Компьютерная обработка полученных в электронном микроскопе проекционных изображений белков, направлена на увеличение соотношения сигнал/шум в изображениях, позволяет определить углы Эйлера полученных проекций и, в итоге, построить 3-х мерную карту электронной плотности (3D модель) исследуемого объекта.

1.2 Крио-ПЭМ и структура вирусов

Структура ВШМЯ ранее исследовалась методом крио-ПЭМ с последующей обработкой изображений. Были определены параметры спирали и рассчитана 3D карта электронной плотности с низким разрешением (18А). Было высказано предположение, что общий план строения БО ВШМЯ должен быть схож с ВТМ (Kendall et al., 2013).

Метод крио-ПЭМ активно применяется в мире для исследования структуры бактериофагов, в том числе, гигантского бактериофага phiKZ (Fokine et al., 2005; 2007). Недавно этим методом была определена 3D структура внутреннего тела фага phiKZ (Wu et al., 2012).

2. Материалы и методы

2.1 Очистка и получение вируса ВШМЯ

Препарат ВШМЯ штамма ND18 получали в НИИФХБ им. А.Н.Белозерского по методу, описанному в (Makarov et al., 2013)1.

Культуру Agrobacterium tumefaciens (штамм GV3101), содержащую вирус, инфильтровали в листья Nicotiana benthamiana для запуска системного заражения вирусом. Зараженные листья гомогенизировали в 3 объемах 0.5М боратного буфера (pH 9,0) с 0.1%ßME. Смесь инкубировали в течение 20 мин с 0.5% Triton Х-100, просветляли V* объемами хлороформа и центрифугировали 20 мин при 10000g. Вирус выделяли из супернатанта, инкубируя 2 часа на холоде с 4% PEG-6000 and 1.2% NaCl, с последующим центрифугированием при 10000 g. Осадок ресуспендировали в 50 мМ боратном буфере (pH 9,0), вирус осаждали путем центрифугирования в течение 2ч при 100000g через подушку из 20%сахарозы. Очищенный вирус ресуспендировали 5 мМ фосфатного буфера (рН7.5) и хранили при 4°С.

2.2. Получение бактериофагов.

Бактериофаги размножали в культуре Р. aeruginosa штамма PAOl, инкубируя ее на поверхности LB агара в чашках Петри в течение ночи при 37°С (Adams and Anderson, 1959) в НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, РАМН2. Далее вирусные частицы очищали путем центрифугирования в градиенте хлорида цезия (Sambrook and Rüssel, 2001).

2.2 Негативное контрастирование

Суспензию вирусов наносили на сетку, покрытую углеродной подложкой, окрашивали 1%-ным водным раствором ацетата урана, высушивали на воздухе. Просматривали на электронном микроскопе Tecnai F20 200kV (FEI) при увеличении х62000.

2.3 Крио-микроскопия

Суспензию вирусов наносили на сетку для криоэлектронной микроскопии: C-flat (r2/2, Protochips Inc., USA), покрытую слоем аморфного углерода, содержащего периодически расположенные круглые отверстия, промакивали излишки жидкости с помощью фильтровальной бумаги и быстро погружали в жидкий этан для образования аморфного льда. ВШМЯ просматривали на крио-электронном микроскопе FEI Polara при увеличении 150000. Фаги EL просматривали в крио-электронном микроскопе Titan Krios (FEI) при увеличении 33000, фаги phiKZ и Lin68 просматривали в крио-электронном микроскопе Tecnai Gl2 Tween (FEI) при увеличении 26000.

2.4 Обработка изображений.

1 Работа проводилась в сотрудничестве с А.Г.Соловьевым и Е.В. Скуратом.

2 Работа проводилась в сотрудничестве с В.Н.Крыловым и О.В.Шабуровой.

Обработку изображений производили с помощью программного обеспечения Imagic, Spider, Bsoft (van Heel et al., 1996; Shaikh et al., 2008; Ludtke et al., 1999). Для каждой микрофотографии определяли параметры частотно-контрастной характеристики (ЧКХ) изображения. Изображения частиц разбивали на квадратные сегменты и для каждого сегмента корректировали влияние ЧКХ.

2.4.1. Икосаэдрическая реконструкция капсидов фагов EL и Lin68.

Для сокращения времени расчётов изображения бактериофагов огрубляли в 2 раза, т.о. размер пикселя для EL стал 5.36 А, для Lin68 и phiKZ - 8.48 А. При помощи программы BOXER (Ludtke et al., 1999) было вырезано 469 отдельных изображений EL, 512 - Lin68 and 315 - phiKZ, которые подвергли процедуре предварительной обработки (полосовой фильтрации, центрирования). Далее изображения частиц разбивали на классы: в один класс определяли изображения, полученные от частиц со сходными углами Эйлера. Все изображения, входящие в один класс суммировали. Лучшие суммы служили эталонами для выравнивания исходного набора данных. Выровненный набор данных разбивали на классы еще раз. Для лучших полученных класс-сумм проводили процедуру восстановления углов (van Heel, 1997). После определения углов для нескольких класс-сумм проводили процедуру обратного проецирования с применением икосаэдрической симметрии. Полученная реконструкция была использована для получения репроекций, и дальше применялась процедура сравнения проекций с получением уточненной реконструкции вирусных капсидов.

2.4.2. Определение параметров спирали ВШМЯ.

Определение параметров спирали производили по изображениям негативно-контрастированного ВШМЯ. Сегменты размером 600x600 пикселей были выровнены относительно вертикального прямоугольника, после чего были проведены несколько раундов расчетов, состоящих из статистического анализа, классификации, выравнивания. После этого все частицы были разбиты на 200 классов (~5 частиц на класс), и для суммарных изображений каждого класса было произведено преобразование Фурье. Лучшими дифракционными картинами считались те, которые имели видимую вторую слоевую линию (Рис. 1). Такие картины были проиндексированы для расчета параметров спирали.

Рис. 1. Индексация дифракционной картины для определения параметров спирали ВШМЯ: цифрами справа указаны номера слоевых линий; слева -расстояния в прямом пространстве, которым соответствуют слоевые линии; рядом со стрелками отмечены порядки Бесселя слоевых линий; черными линиями обозначена обратная решетка.

Были выделены видимые рефлексы, относящиеся к одной стороне решетки. Для каждого рефлекса находили следующие параметры: номер слоевой линии и порядок функции Бесселя, которой описывается распределение интенсивностей вдоль данной слоевой линии.

Найдя эти параметры для нескольких слоевых линий и подставив эти значения в уравнение, описывающее правило отбора спиральной симметрии, можно определить параметры спирали вирусного капсида (Stewart, 1988).

l=t n + u m (1)

где 1 - номер слоевой линии, t - количество оборотов спирали на период, п -порядок функции Бесселя слоевой линии, и - количество субъединиц на период спирали, ш - +/- целое число.

Полученные параметры спирали соответствовали реконструкции с наибольшим стандартным отклонением в карте электронной плотности: 5 оборотов спирали и 111 субъединиц на период и подъем спирали за 1 оборот -26.24Ä, угол между субъединицами составил -16.216°, а подъем спирали между соседними субъединицами ~1.182Ä.

2.4.3. Реконструкция спирального вируса.

Трехмерные карты электронной плотности ВШМЯ получали с применением рассчитанных параметров спирали к крио-ПЭМ изображениям и улучшали посредством сравнения проекций для устранения латеральной невыровненное™. Статистический анализ (MSA) выровненных проекций показал наличие различий по ширине (рис. 2). Оказалось, что определенные

ранее параметры спирали (22.2 субъединицы на оборот и 5 оборотов на период), характеризуют только один класс данных (широкий). Для узких частиц параметры спирали определялись отдельно по вышеописанному алгоритму и составили 21.2 субъединицы на оборот с 5 оборотами на период. Далее частицы, входящие "широкие" и "узкие" наборы данных разделили и использовали независимо для улучшения соответствующих реконструкций (схема на рис. 3).

Рис. 2. Собственные изображения (eigen images) набора

данных сегментов ВШМЯ. Рамками отмечены

собственные изображения, отображающие неоднородность набора данных по ширине.

2.4.4. Получение картин электронно-лучевого повреждения внутреннего тела (СВР) в капсидах бактериофагов.

Для визуализации внутреннего тела в капсидах фагов EL и Lin68, один и тот же замороженный образец снимали 2 раза - сначала с низкой дозой электронов (10-20 e'/Â2), после следующей экспозиции доза достигала 40-60 e"/Â2. При этом в месте расположения внутреннего тела появлялись картины электроннолучевого повреждения (СВР), имевшие на проекционных изображениях прямоугольную или круглую форму (Рис. 5).

Изображения отдельных частиц центрировали и разбивали на классы (van Heel et al, 1996). В один класс входили изображения со сходным положением СВР. Направление проекции СВР в основном соответствует длинной оси внутреннего тела, поэтому она была использована для оценки положения и размеров внутренних тел в капсидах бактериофагов. Электронно-лучевое повреждение зависит от количества полученных электронов, поэтому ко всем фагам применялась одна и та же доза.

2.5. Моделирование по гомологии

Моделирование по гомологии было произведено в программе I-TASSER (Ambrish et al., 2010). Было произведено гибкое вписывание модели по гомологии в отфильтрованные карты электронной плотности узкой и широкой частиц ВШМЯ с помощью Flex-EM (Topf et al., 2008). Начальный фиттинг был исправлен в программе Coot (Emsley & Cowtan, 2004), а затем автоматически программой PHENIX (Adams et al. 2009). Визуализацию карт плотности производили в UCSF Chimera (Goddard et al., 2007).

Сегменты выравнивваю относительно вертикального прямоугольника, проводят статистический анализ и

Выбирают лучшую класс-сумму

Микрофотографии сегментируют, проводят коррекцию ЧХК и предварительную подготовку

Получают репроекции под заданными углами

Узкая структура 106 субъединиц на период

Выравнивают сегменты относительно репроекции сегменты, выровненные относительно одной и той

ммируют все репроекции

Разделение набора данных на широкие и узкие частицы, опираясь на данные статистического анализа

Симметризуют каждую класс-сумму

Получают 3-х мерную реконструкцию

Уточняют параметры спирали, проводят соревновательное выравнивание, улучшают получаемые реконструкции

Широкая структура 111 субъединиц на период

Рис. 3. Схема обработки крио-изображений ВШМЯ.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Морфология и трехмерная организация бактериофагов EL и Lin68.

Крио-условия позволяют белковым частицам оставаться в нативной форме. Мы измерили размеры капсида замороженного фага ЕЬ (Рис. 4а), и показали, что он имеет размеры 145 нм, так же, как и фаг 1лп68.

Рис. 4. Организация бактериофагов EL и Lin68. (А) Крио-электронная микрофотография

частицы фага EL. Реконструкция капсидов (Б) фага EL; (В) фага Lin68. Масш. отрезок - 50 нм.

Капсид соединяется с хвостом посредством "шейки". Шейка фага EL гораздо тоньше, чем у Lin68, и не имеет манжеты. Хвост EL имеет длину примерно 200 нм и 22 нм в диаметре. Капсиды фагов EL и Lin68 сходны друг с другом по размерам, (Рис. 46, в), но хвост у Lin68 немного короче, а базальная пластинка на конце хвоста немного больше (около 60 нм в диаметре и 20 нм толщиной), чем у EL.

Таким образом, размеры и организация капсидов сходны у всех изученных представителей phiKZ-подобных фагов (phiKZ, EL, Lin68). Интерес вызывает то, что бактериофаги вида EL отличаются от фагов phiKZ и Lin68 существенно меньшим размером генома (211 тпн у EL, по сравнению с 280 тпн у Lin68/phiKZ) (Hertveldt et al, 2005). Если принять, что у частиц фагов одинаковый внутренний объем капсида, то, при условии, что в обоих случаях функционирует head-full механизм упаковки генома при созревании, необходимо было найти объяснение тому, как происходит упаковка существенно меньшего по размерам генома фагов вида EL.

3.2 Организация генома внутри капсидов гигантских бактериофагов.

Мы предположили, что внутреннее тело у фага EL может ограничивать пространство, доступное для упаковки генома. Для оценки положения и размеров внутреннего тела (Рис. 5) мы использовали СВР (глава 2.4.4). Показано, что размеры СВР значительно различаются у phiKZ, Lin68, и EL. СВР у EL расположена под большим углом наклона по сравнению с phiKZ (Рис. 5). Проекции СВР в EL никогда не образовывали угол в 22°, характерный для phiKZ, но они часто образовывали большие углы (60-90°). Это дало нам

Рис. 5. Класс-суммы неповреждённых частиц фагов (с низкой дозой электронов, слева) и частиц с СВР (с высокой дозой электронов, справа).

основание предположить, что у ЕЬ, в отличие от рЫК/, внутреннее тело крепится между двумя противоположными вершинами икосаэдра. Проекции СВР у ЕЬ немного шире (-43 нм) и короче (-90 нм) по сравнению с рЫКг (Рис.

а_

Название фага

phiKZ

Lin68

Условия высокой дозы электронов

Условия низкой

Согласно существующим моделям упаковки ДНК в капсиде бактериофага (Petrov and Harvey, 2008; Purohit et al., 2005), ДНК можно считать гибким, но нерастяжимым цилиндрическим стержнем. Это означает, что общая длина ДНК (L), которая может быть размещена в капсиде с объемом (V), должна зависеть от расстояния между упакованными нитями ДНК (ds) так, что

L =V/ds (2)

В соответствии с расчетами Purohit et al. (2005) эффективность упаковки генома

Ppack (^genome /^capsid) (3)

для большинства фагов лежит в диапазоне 0,3-0,4. Мы оценили значения рраск для EL и phiKZ и показали, что оба значения лежат в этом диапазоне, и рраск для EL в 1,2 раза меньше, по сравнению с рраск для phiKZ. Это четко отражает наблюдаемые нами различия в расстояниях между тяжами ДНК (ds): в нашем исследования фага EL, ds =3,09 нм (Рис. 4 г), в то время как расстояние, ранее наблюдаемое для phiKZ, было меньше: ds =2,8 нм (Fokine et al, 2005).

Такие морфологические параметры могут определять значительные различия в упаковке ДНК у EL и Lin68/phiKZ.

3.3 Трехмерная структура вирионов ВШМЯ.

Методом крио-ПЭМ и последующей обработки изображений мы определили структуру палочкообразного вируса растений ВШМЯ (Рис. 6). Разделение широких и узких частиц позволило значительно улучшить разрешение у получаемых карт электронной плотности: у широких частиц до 5.7 А. у узких частиц - до 5.1 А (Рис. 7А). Диаметр широких частиц составил 224А, а узких - 216А. Частицы из узкого класса ВШМЯ имели другие параметры спирали: 106 субъединиц на период, вместо Illy широкого класса.

Рис. 6. Карта электронной плотности узкой частицы ВШМЯ. а) внешняя поверхность частицы, б) вертикальный срез, в) горизонтальный срез.

V \

\ А

ц V

V \

\ \

VV

\ Л

«мхи— m

Рис.7. Разрешение реконструкций ВШМЯ. Графики зависимости корреляции Фурье (ось Y) от пространственной частоты (ось X). а)ВШМЯ дикого типа. Черным отмечен график для широкой частицы, серым — для узкой. За достоверное разрешение принята та частота, где корреляция равна 0.5. Для широкой частицы разрешение составило 5.7Â, для узкой — 5.1 Â. б) Рекомбинантный ВШМЯ, широкая частица. Разрешение 4.1 Â.

Диаметр центрального канала составляет ~60 А. РНК располагается на

расстоянии ~50 А от оси вириона. Полученное разрешение позволяет различать а-спирали, расположенные радиально.

Следует отметить, что наблюдаемые различия по ширине у вирионов не связаны с тем, что вирионы инкапсидируют 3 разные части вирусной РНК. Это было подтверждено путем анализа капсидов рекомбинантного ВШМЯ (рекВШМЯ), содержащего РНК ВТМ и белок оболочки ВШМЯ.

Процедура определения параметров спирали для рекВШМЯ проводилась по описанному выше алгоритму (Главы 2.4.4 и 2.4.3). Статистический анализ выровненного набора данных для рекВШМЯ показал аналогичные различия по ширине вирионов, как и в случае с ВШМЯ дикого типа (дтВШМЯ). Разделение широких и узких частиц позволило улучшить разрешение у получаемых карт электронной плотности рекВШМЯ до 4.1 А (рис. 7Б)3. Совпадение параметров спирали дтВШМЯ и рекВШМЯ говорит о том, что ширина вирионов не зависит от инкапсидированной РНК.

3.4 Характер сворачивания полипептидной цепи БО ВШМЯ.

Для интерпретации полученных реконструкций со спиральной симметрией было проведено моделирование БО ВШМЯ по гомологии с БО ВТМ (АтЬпзИ е1 а1. 2010).

В общих чертах характер сворачивания БО ВШМЯ схож с таковым у представителей рода ТоЬатоу1гш. БО состоит из 4 больших а-спиралей (Рис. 8). В БО ВШМЯ имеются также 3 малые спирали, две из которых расположены во внешней области БО и одна — поблизости к центральному каналу вириона.

Рис. 8. БО ВШМЯ после моделирования и гибкого вписывания, а) Вид сбоку. Стрелками показаны основные спирали: ЛП - левая повернутая, ПП-правая повернутая, ЛР - левая радиальная, ПР-правая радиальная, б) Вид сверху. Стрелкой показана петля, отсутствующая у ВТМ, которая у ВШМЯ образует контактирующую с соседней субъединицей спираль (ЛК);

а

б

ПР спираль

3 Работа проводилась в сотрудничестве с Д.К.Клером (Биркбек колледж, Лондон).

ТоЬато

ТМУ СБММУ ЯМУ Н15У В5МУ

Hordei «IV

и®

Рес1и

11 21 - д д д И У^ е (1 I жп я (1 ) у (I

- -Ць • • - М А

...........М

...........0»

мрМУ31ТАкаебн МРМ I виткввсн мАтситук зеон

РСУ - м Р N I N и6 А I м 1рсл/.|^ МГ Т N I 8ЕУ А Я М' Н 1рс,.0 -МАМ I ЗЕУШ*ОСаН

81 91

I ТТ Р5()РУР I. • - - • 8 8А Р I Т 1 Э К I I А Р • ■ • • в А 1 Т N В N О У О У Р - • • - А А V NLTPLNIIYT.--.SG Г 1Е00»ОТ0УУЕА УРООЙЛ EDLWFSQVVSQ 1УАЕ« ЕООИМЗЫ I I О ЭК У I УСУ, ЕЕ УР ЕС?К ! У ОТ УОБОУ, УЕ ОИНИН I УР?5(?А №А ОУ> I А ЭШЙ N И VIKQNLNHOV!Л НеНх1 И1 101 ш

1у1уг1()ау1гр!!еа11га!Од

31 41 51 61 71

|А О Р I Е 1 ! N I СТ нТТмГокГП^АД? УУфГр!- вЕУЛК ■■ 5 ■ РОУТУЙ УРУВТИНЯУА«?'... АР«г»<}А я:03 Р ЯЕрквАкРЭ 5 V - V О I N Б Й ЛАЕ TPMLNOCVSA LSOSYQTQA!i'ЛтVH:Q^}f•ANl 15Т I - УА N0(5 АРУДУР1Е1 1УК8Я8И51 <}А »ОТШГ^ИИ . I . ■ а N I N П<

;АУЖК Р L О N I Р МВДЕКР LDN|. К -V

188 1 I ((ЙЙ!. В011А01РАУ

Р 5|с|КУ/АОИ АО 1ЯАУ Нейх 15

121 131

ЗрУА'бр I ААЬ О 50У80УУАА1 О НА!А ОI О УК

0С?УАК1 I N ЫУ О

5 ЕУ8А! * N ЯУ Р 5 ЕУАМ I ! N РУ Р

Нейх 1?5

141

• кпР^Еуегрхармаезапа-

"™* Р О 8 О...........РКУ

СОММУ ■ о д............руд

ЯМУ РОТС-. • ........ • Р1?У

н^у рцо- • РУУ

85МУ I ОвРЫУ Ц РДГ К Г

А ,раг 01 Б Р N У V Э А Д1 Г

5ОУИ;ааыуйарр\Р »отюн8оу>»р • р*Р

| VI ЭОТУКЕ ¿Т ( 1 Е1М :51

161

¡У МЛ V 10 LVTALLÍAFDT -И У1КР 1РУ81Л$$ТВТ /МБАУI К у I ЕА1МК8 РОТ / Я N; Т L А г УРЕА11РАТ0Т аОКРГ 1АЕ1ТЯ15К1Т0 : I IV О I ТШ АЯ I ТО ИDSAMRANL I А IАЯМОО ПВАТТЯ РРЕ01УЯ1<О К Е СК ОН Р Ь N I !АААО *У ЕА ! УВЕК Р I .. I I АААО

НеКхЯН 181 191

г Оа а!а( г у е I Ь <1 - - • I ! I ад 1аууйгг5РЁаеГдЬ I з

нага

:А I NN I I УЕ I I Я : э ингз |Е I 0Ы1 1 ЕЭ I 5К ; РОУУОКАЗ О » О С Ь 1'»ГЕ1.8МЗН5УМИЯЛе 1 О N 1 I I ! 10 ! А 7'0Я ТА IV и I О ■ - -\0SAR I Р V УТЙКТ САф1АД У Т УЙЯ ТЭО: Р V Р О Й Я 8

•.ах у губяйк LAVVOQPOQVI 1АЭУТ0Р00У1 НеИх

г Й ■Ор I

И^ТТАВТЮАТ...............Я Я V

О ¡N1 ТА£5!^АУ...............КР

Е ё[;> Й Р $ А Б Е V А N А Т -..............ОРУ

**1»1ТАвТ|.ИАТ...............ОЙУ

1^ВАКЯАТТМР8РРА- ■ - - OAPSENlTLR0V<ЗPL 18НУКК1860РТРРР- - -- 6 -Т ОНОМАI Я ИУдЭ1

IЭРМР Р N Т5Т N........ОО,88МА1УАК0УОР1

1МЙРАА?ТУ SNAQG-TSLAN^lRt:. LSV)RDEOPL У(511РТАРТУТМ8АС;"^<}А1УА01! УХАУРОТОРМ

УСЙР5АеКУЛ8:: НОЛ!V УР УРЛ п

Нейх2 N2 НеВхШ

211 221 231

У¥|ГТАРАТ..............................

«коРТТ Т8ТТТ..........................

»11 I РОАЕЕА............................

и! рурло ОЯО...........................

ШуАРАРСвМА...........................

АЗБвТНРТбТеТвУАТЕТОТТОТСВТбАеемАР- -

р а о р е р.............................

ЕКОА5ТКТТРТА5Т.......NTSPTGVAPGDPSN

Рис. 9. Выравнивание аминокислотных последовательностей БО некоторых палочкообразных вирусов. Овалом отмечена внутренняя петля, отсутствующая у тобамовирусов, которая у ВШМЯ-подобных вирусов образует контакт с соседней субъединицей.

Выравнивание аминокислотных последовательностей БО различных вирусов У1г%т1г1с1ае (Рис. 9) продемонстрировало, что между ними наблюдается небольшой процент идентичности (между аминокислотными последовательностями ВТМ и ВШМЯ 14.6% идентичности). Однако даже при небольшом количестве консервативных аминокислотных остатков сохраняется общий план сворачивания белка оболочки.

Наибольшие отличия между ВШМЯ и ВТМ заключаются в большой а.к. вставке, присутствующей у ВШМЯ и других родственных ему вирусов и отсутствующей у ВТМ (Рис. 9). Моделирование и вписывание в полученные карты электронной плотности полученных моделей БО показали, что две из этих вставок образуют длинные петли: в области внутреннего канала (аминокислотные остатки 141-152) и гидрофобной области около внешней поверхности вириона (остатки 84-94).

3.5 Контакты между субъединицами БО ВШМЯ.

Полученную модель БО ВШМЯ встраивали в электронные плотности широкого и узкого вирионов (Рис. 10). Гибкое вписывание показало, что четвертичная структура мономера БО в широких и узких частицах ВШМЯ практически идентична. Однако значительно отличаются контакты между субъединицами и контакты БО с РНК. В узкой частице имеются два солевых мостика, соединяющих соседние субъединицы (АБр44-А^69, С1и125-Лг»128). У широкой частицы этих контактов выявлено не было.

У обеих частиц ВШМЯ также можно предполагать наличие одного аксиального контакта между субъединицами (ТугбЗ-А^ЮЗ), однако электронная плотность для этого контакта выражена не очень явно. Таким образом, вирион ВШМЯ (особенно, широкая частица) является менее стабильным по сравнению с ВТМ.

Рис. 10. Гибкое вписывание модели БО в электронную плотность, соответствующую двум соседним субъединицам вириона ВШМЯ,

горизонтальный срез. Спиралями показаны модели БО, полученные при моделировании по гомологии с ВТМ. Петля (остатки 84-94),

образующая ЛК с соседней субъединицей вблизи внешней

поверхности вириона указана стрелкой.

3.5.1. Новый латеральный контакт между субъединицами БО ВШМЯ.

Гибкое врисывание модели БО позволило определить расположение петли, образованной остатками 84-94 гидрофобной области (рис. 9). Оказалось, что она формирует новый латеральный контакт (ЛК) с соседней субъединицей вблизи внешней поверхности вириона (Рис. 10). Этот контакт образован взаимодействием как заряженных, так и гидрофобных остатков: Туг91, Не86 из петли ЛК и Asp76, Hisl3 и Lys9 из соседней субъединицы. Следует отметить, что Туг91, 11е86 (или Leu) и Hisl3 являются консервативными у всех вирусов, обладающих подобной вставкой, тогда как Lys9 и Asp76 консервативны только у полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ (PLSV)) и вируса кольцевой пятнистости зорьки (ВКПЗ (LRSV)) (Рис. 9; Lys9 заменен на Arg у индийского вируса розеточности арахиса (ИВРА (IPCV))). Консервативность этих остатков дает предположить, что такой же ЛК в области большого радиуса может существовать у ПЛВМ, ВКПЗ, ИВРА и вируса розеточности арахиса (ВРА (PCV)).

Наличие ЛК с соседней субъединицей около поверхности вириона может приводить к способности таких структур к быстрой перестройке в процессе активации трансляции или межклеточного транспорта. В частности, было показано, что N-конец БО гибкого Х-вируса картофеля участвует в активации трансляции у вируса (Karpova et al., 2006).

Для подтверждения функции ЛК у ВШМЯ, были созданы 2 мутанта по БО: у BSMV-dellO было удалено 10 аминокислот, входящих в состав петли ЛК; у BSMV-IY/GG остатки Ие86 и Туг91, контактирующие с соседней субъединицей, заменили на остатки глицина (Рис. 11а)4.

Рис. 11. Делеционный анализ роли петли ЛК в формировании структуры вириона ВШМЯ. а) Последовательность, соответствующая петле ЛК в ВШМЯ, отмечены удаленные остатки; окрашенные ацетатом урана препараты ВШМЯ: б) контроль; в) BSMV-dellO; r)BSMV -IY/GG масштабный отрезок - 200нм

9 RFAGARGQIGS PNiLPAPKFFR

deM О RFAGARGQ----------KFFR

IY/GG RFAGARGQGGS PNGLPAPKFFR

Рекомбинантные вирусы, несущие мутантные гены БО, развивали системную инфекцию у растений N. Ьешкат1апа и накапливались в тех же

4 Работа проводилась в сотрудничестве с А.Г.Соловьевым и Е.В. Скуратом.

количествах, что и контрольный ВШМЯ. Однако в тканях зараженных растений не были обнаружены вирионы BSMV-dellO и BSMV-IY/GG (Рис. 11 в, г), что говорит о том, что при удалении участка JIK мутанты не способны образовывать стабильный вирион. Следовательно, JIK играет важнейшую роль в образовании и поддержании стабильной структуры вирионов ВШМЯ.

Сходный контакт между субъединицами недавно был обнаружен у вирусов мозаики папайи (PapMV) и бамбука (BaMV), гибких нитчатых вирусов из рода Potexvirus. БО этих вирусов имеет так называемое "лассо", образующее несколько латеральных гидрофобных контактов с соседней субъединицей (Yang et al. 2012; DiMaio et al., 2015). Разница состоит в том, что "лассо" образовано N-концом БО у PapMV и BaMV, а у ВШМЯ ЛК образован внутренней петлей БО. Тем не менее, принцип взаимодействия между субъединицами, открытый нами у ВШМЯ возможно, является общим для некоторых семейств вирусов растений. В пользу этой гипотезы выступает то, что все вирусы из семейства Virgaviridae, за исключением рода Tobamovirus, имеют внутреннюю петлю, которая у ВШМЯ образует ЛК. Можно предположить, что Tobamovirus потеряли петлю ЛК в процессе эволюции, и взамен выработали другие механизмы стабилизации вирионов.

3.5.2. Взаимодействие БО с РНК.

С РНК взаимодействуют сразу несколько аминокислотных остатков БО ВШМЯ. Перечень контактов и их эквиваленты у ВТМ приведен в таблице 1.

Таблица 1. Перечень контактов между БО ВШМЯ и РНК.

Аминокислота, образующая контакт ВШМЯ, узкие частицы ВШМЯ, широкие частицы Эквиваленты у ВТМ

Arg 122 Сильный контакт с нуклеотидом 2 Слабый контакт с нуклеотидом 2 и более сильный с нуклеотидом 3 Агв92

Aspl57 имеет плотный контакт с нуклеотидом 3 АэрПб

Leu160 гидрофобный контакт с азотистым основанием нуклеотида 1

Туг 164 стэкинг с азотистым основанием нуклеотида 2. Этот тип связи не наблюдался ранее у палочкообразных вирусов

3.6. Разборка вирусной частицы ВШМЯ.

Основное различие между широким и узким вирионами ВШМЯ - это наличие у узкой частицы двух латеральных контактов (солевых мостика) между остатками Азр44-А^69 и 01и125-А^128. В этом плане узкая частица более похожа на ВТМ и другие тобамовирусы, т.к. большинство из них имеют два латеральных контакта (Те\уагу е1 а1., 2011). Латеральный контакт с соседней субъединицей является у узкой частицы более сильным, чем у широкой. Аг§122 взаимодействует с РНК по-разному у широкой и узкой структур. У широкой структуры, по-видимому, это взаимодействие слабее. Эти факторы приводят к тому, что узкая частица более стабильна, чем широкая. Можно предполагать, что широкая частица ВШМЯ является промежуточной стадией процесса диссоциации капсида и высвобождения РНК.

Эта гипотеза подтверждается отсутствием так называемых карбоксилатов Каспара (КК) у ВШМЯ. У ВТМ имеется 2 кластера КК в области большого и малого радиусов вириона, которые дестибилизируют вирион в процессе диссоциации капсида (\Vdang е1 а1., 1998). У ВШМЯ отсутствуют КК в районе малого радиуса; нами был обнаружен у широкого вириона только один потенциальный кластер КК в области большого радиуса. Он может образовываться между С1и37 и Аэр70 (расстояние между ними 4.8 А) и между С1и37 и Авр74 (расстояние 5.3 А). Этот потенциальный кластер КК находится в непосредственной близости от солевого мостика А5р44-Ацг69 между двумя соседними субъединицами и может его разрушать.

Таким образом, в процессе эволюции ВШМЯ мог выработать альтернативный механизм высвобождения РНК, который включает образование промежуточной структуры вириона (широкой частицы). Следует отметить, что структурный переход между двумя формами вириона возможен за счет недостатка аксиальных контактов между субъединицами, в то время, когда у ВТМ структура вириона жестко зафиксирована двумя аксиальными солевыми мостиками. Также можно предположить, что одновременное сосуществование двух форм вириона ВШМЯ является адаптивным преимуществом для вируса: одновременно в популяции вируса присутствуют и готовые к высвобождению РНК широкие частицы, и стабильные узкие частицы для выживания в неблагоприятных условиях. Однако требуются последующие исследования для определения того, при каких условиях может происходить переход между двумя формами вирионов ВШМЯ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Крио-электронная микроскопия позволяет получать информацию о структуре биологических объектов в условиях, сохраняющих водное окружение объектов. Это дает возможность получать проекционные изображения макромолекул в состояниях, близких к нативным. Последующая компьютерная обработка изображений позволяет из таких двумерных проекций восстановить трехмерную структуру объекта с высоким разрешением. Более

того, благодаря появлению новых подходов в обработке изображений стало возможным использовать поврежденные электронным пучком объекты для локализации белковых тел и уточнения его трехмерной структуры.

ВЫВОДЫ

1. С помощью крио-ПЭМ и анализа изображений получены трехмерные структуры капсида ВШМЯ с разрешением 5,1-5,7Â; капсидов бактериофагов Lin68 и EL с разрешением 25Â.

2. Впервые показана способность ВШМЯ к образованию двух структурных форм вирионов. Открыт новый латеральный контакт в области внешней поверхности вириона, показана его необходимость для образования стабильных вирионов ВШМЯ.

3. Разработана методика детекции белков в контакте с нуклеиновыми кислотами с помощью облучения повышенной дозой электронов. Детектировано белковое внутреннее тело в капсиде гигантских phiKZ-подобных бактериофагов EL и Lin68. Линейные размеры внутреннего тела коррелируют с размерами генома гигантских бактериофагов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ:

1. Sokolova O.S., Shaburova O.V., Pechnikova E.V., Shaytan A.K., Krylov, N.A. Kiselev S.V., Krylov V.N. Genome packaging in EL and Lin68, two giant phiKZ-like bacteriophages of P. aeruginosa.!! Virology. 2014. V. 470. P. 472-478.

2. Печникова E.B., Кирпичников М.П., Соколова O.C. Радиационное повреждение в криомикроскопии: всегда ли во вред?// Природа. 2015. Т. 3(1195). С 25-29.

3. Clare D., Pechnikova Е., Skurat Е., Makarov V., Sokolova O.S., Solovyev A.G., Orlova E.V. Novel inter-subunit contacts in barley stripe mosaic virus revealed by cryo-EM.// Structure. 2015. V. 23. P. 1-12.

Статьи в прочих журналах:

4. Печникова Е., Станишнева-Коновалова Т., Волох О., Соколова. Повышение контраста изображения при исследовании бионаночастиц.// Наноиндустрия. 2013. Т. 5, № 43. С.18-25.

5. Соколова О.С., Волох О.И., Станишнева-Коновалова Т.Б., Печникова Е.В. Просвечивающая электронная микроскопия для изучения структуры

макромолекул.// Интеграл. Научно-практический межотраслевой журнал. 2012. Т. 5. С.22-25.

Тезисы докладов и материалы конференций:

6. Sokolova О. S., Shaburova О. V., Sedov A., Pechnikova E.V., Krylov V. N. Genome packaging in EL and Lin68, two giant phiKZ-like bacteriophages of P. aeruginosa.// International Microscopic Congress. Proceedings. Prague. 2014.

7. Pechnikova E., Clare D., Skurat E., Makarov V., Solovyev A., Sokolova O., Orlova E.V. Novel lateral contact is essential for structural integrity of helical Barely stripe mosaic virions.// International Microscopic Congress. Proceedings. Prague. 2014.

8. Печникова E.B., Clare D., Скурат E.B., Соловьев А.Г., Соколова О.С., Орлова Е.В. Трехмерная структура вируса штриховатой мозаики ячменя с разрешением 0,55 нм.// XXV Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка. 2014. С. 618-619.

9. Печникова Е.В., Clare D. Структурный анализ вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) по данным электронной крио-микроскопии.// XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов 2013". Москва. 2013. С. 74.

10. Печникова Е.В., Clare D., Орлова Е.В., Соколова О.С., Скурат Е.В., Соловьев А.Г. Трехмерная реконструкция вируса штриховатой мозаики ячменя.// XXIV Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка. 2012. С. 465-466.

11. Печникова Е.В, Clare D.K. Структурный анализ вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) методом электронной микроскопии с последующей обработкой изображений.// XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2012". Секция Биология. Москва. 2012. С. 71.

Заказ № 102-а/09/2015 Подписано в печать 29.09.2015 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 и. /) \v\vw. с/г. ги ; е-таП:гак@с/г. ги