Роль структуры ростового домена урокиназы во взаимодействии с урокиназным рецептором uPAR/CD87

Белоглазова, Ирина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль структуры ростового домена урокиназы во взаимодействии с урокиназным рецептором uPAR/CD87
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль структуры ростового домена урокиназы во взаимодействии с урокиназным рецептором uPAR/CD87"

На правах рукописи

БЕЛОГЛАЗОВА ИРИНА БОРИСОВНА

РОЛЬ СТРУКТУРЫ РОСТОВОГО ДОМЕНА УРОКИНАЗЫ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С УРОКИНАЗНЫМ РЕЦЕПТОРОМ

иРАКУС087

03.00.04 - Биохимия 03.00.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009 г. 0 й ......

003462838

Работа выполнена в отделе Биохимии НИИ ЭК ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Росмедтехнологий

Научные руководители:

доктор биологических наук, академик РАМН и РАН

кандидат физико-математических наук

Ткачук Всеволод Арсеньевич Бибилашвили Роберт Шалвович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович

доктор физико-математических наук, профессор Туманян Владимир Гаевич

Ведущая организация:

Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 2 алрелл. ¿ОРЗг.ъ 13-30 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени доктора и кандидата биологических наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Росмедтехнологий (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Автореферат разослан 4&<реврал&,2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

В. Е. Сшгацын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Направленная миграция клеток является ключевым звеном тканевого ремоделирования, происходящего при многих физиологических и патологических процессах, таких как эмбриогенез, ангиогенез, атеросклероз, ранозаживление и репаративные процессы, рост опухоли и мегастазирование. Миграция гладкоммшечнмх клеток в направлении просвета сосудов происходит при развитии рестенозов после ангиопластики и в процессе формирования атеросклеротической бляшки. Одним из ключевых факторов, обеспечивающих направленную миграцию клеток, является активатор плазминогена урокиназного типа или урокиназа -внеклеточная протеаза, которая активно синтезируется и секретируется клетками сосуда в момент его растяжения или повреждения. При этом молекула урокиназы секретируется клетками в виде профермента и концентрируется на клеточной поверхности за счет связывания с урокиназным рецептором, УКР (uPAR/CD87) (Apella et al., 1987). Это связывание делает доступным молекулу урокиназы для протеолиза плазмином и другими внеклеточными протеазами, необратимо активирующими ее, переводя из одноцепочечной в двухцепочечную форму. Обе формы урокиназы MOiyr связываться с рецептором за счет N-концевого домена, имеющего структурную гомологию с энидермальным фактором роста и называющимся ростовым доменом. На мигрирующих клетках урокпназный рецептор концентрируется на лидирующем крае, обеспечивая поляризацию урокиназы (Estreicher et al.. 1990), которая, благодаря протеолитической активности С-концевого домена, специфически расщепляет плазминоген с образованием плазмина, что запускает процесс поляризованной деградации внеклеточного матрикса, освобождающей пространство для перемещения мигрирующей клетки. Уникальная роль урокиназы в ремодслировании сосудов подтверждается тем, что нокаут гена урокиназы у мыши подавляет развитие неоинтимы при повреждении сосудов (Carmeliet et al., 1997). Помимо обеспечения поляризованного внеклеточного протеолиза, связывание урокиназы с рецептором приводит к запуску сигнальных каскадов внутри клетки, приводящих к перестройке цитоскелета, перераспределению адгезивных контактов, и влияющих на адгезию, миграцию и пролиферацию клеток (Nguyen et al, 1999; Степанова и Ткачук, 2002; Binder et al., 2007). Урокиназный рецептор не имеет трансмембранного и цитоплазматического доменов, являясь поверхностным гликозилфосфатидилинозитол-заякоренным белком, и поэтому он не способен передавать сигнал внутрь клетки без помощи трансмембранных белков-партнеров, в качестве которых могут выступать интегрины и ряд других поверхностных рецепторов (Concsc et al., 1995; Simon et al., 2000). Было показано, что крингл- и протеазный домены урокиназы имеют специфические участки связывания на мембране (Mukhina et al., 2000; Степанова и Ткачук,

2002). Эти данные позволили предположить, что при связывании урокиназы с высокоаффинным рецептором в ее крингл-домене экспонируются участки для взаимодействия с другими мишенями на поверхности клетки и запуска миграции (Степанова и др., 2008). Показано также, что при взаимодействии урокиназы с урокиназным рецептором экспонируются участки, отвечающие за сигнальные функции рецептора, а также образуются общие места связывания с белками внеклеточного матрикса и интегринами, образованные и урокиназой и рецептором (Kjaergaard et al., 2008).

Таким образом, связывание урокиназы с рецептором индуцирует изменения рецепторного белка важные для реализации ряда физиологических процессов, а рецептор, связываясь с урокиназой, изменяет ее свойства. Эти сведения получены путем измерения функциональной активности этих белков, но структурные основы, определяющие эти изменения, не охарактеризованы.

Недавно был расшифрован кристалл комплекса урокиназного рецептора и аминоконцевого фрагмента урокиназы (АКФ), лишенной протеолитического домена (Barinka et al., 2006). Как было показано, при взаимодействии с урокиназой, первый и третий домены рецептора сближаются таким образом, что рецептор смыкается в кольцо, образованное тремя доменами. При этом происходит экспонирование активного участка между первым и вторым доменами рецептора. Однако, метод кристаллографии не дал достоверной информации о взаимодействии урокиназы с урокиназным рецептором, потому что исследованная законсервированная структура белков не соответствует физиологическим условиям образования комплекса. Для установления изменений в структуре урокиназы при ее взаимодействии с рецептором более информативным является метод ядерного магнитного резонанса.

Детальное изучение структуры ростового домена урокиназы, отвечающего за взаимодействие с урокиназным рецептором, может способствовать разработке ингибиторов эффектов урокиназы, опосредованных ее взаимодействием с урокиназным рецептором. Известно, что гиперэкспрессия урокиназы и урокиназного рецептора коррелирует с плохим прогнозом при многих онкологических заболеваниях (Kathleen et al., 2008). Именно поэтому создание ингибиторов, блокирующих взаимодействие урокиназы с рецептором, является важной задачей в проблеме лечения рака. Помимо этого блокирование взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором позволит контролировать процессы ремоделирования тканей и роста сосудов, устраняя негативные эффекты эндогенной урокиназы.

Целью работы было изучение структуры ростового домена урокиназы и ее изменения при взаимодействии с урокиназным рецептором. Для достижение цели решались следующие задачи: 1. Синтезировать в Escherichia coli, очистить и охарактеризовать рекомбинантные формы урокиназы человека.

2. Сравнить полученные формы с урокипазой, экспрессированной в эукариотических клетках, rio способности к связыванию с урокиназным рецептором.

3. Изучить пространственную структуру ростового домена урокиназы.

4. Получить стабильный препарат аминоконцевого фрагмента с изотопным замещением l5N и 13С, и комплекса аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором, стабильный и растворимый в высоких концентрациях в растворе с минимальным содержанием солей.

5. Методом ЯМР изучить изменения в структуре ростового домена аминоконцевого фрагмента урокиназы при взаимодействии с урокиназным рецептором.

Научная новизна н практическая значимость работы. В

представленной работе впервые исследована структура аминоконцевого фрагмента урокиназы человека, синтезированного в клетках Escherichia coli. Полученные данные указывают на возможность альтернативного механизма взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором, в котором наличие четкой вторичной структуры в ростовом домене не является необходимым условием для взаимодействия с рецептором. Результаты работы позволяют проводить направленный поиск новых лигандов урокиназного рецептора путем конструирования белков, в которых ключевым является сохранение не бета-структурной организации, а наличие fi-петли в составе ростового домена. Блокирование взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором позволит контролировать процессы ремодслирования тканей, роста сосудов, препятствовать росту и метастазированию опухолей.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на научных конференциях: XLIV Научная конференция Московского Физико-технического Института (Долгопрудный, 2001), Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), IX International workshop on «Molecular & Cellular Biology of Plasminogen Activation», (Capri, Italy, 2003), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2003) и на межлабораторном семинаре в Институте экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава 12 декабря 2008 года.

Публикации. Результаты работы представлены в 1 статье и 4 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 46 рисунков и I таблицу. Список литературы включает 247 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Очистка рекомбинантных форм белков. Для работы были синтезированы в Escherichia coli и очищены следующие формы урокиназы: АКФ — аминоконцевой фрагмент урокиназы - урокиназа, лишенная протеолитического домена; АКФ(ОЮ) — аминоконцевой фрагмент урокиназы с заменой Gly16 на Asp16; КД — крингл-домен урокиназы (43-156 аминокислотные остатки (а.о.)); УКДРД — урокиназа, лишенная ростового домена (43-411 а.о.); УКдт — урокиназа, имеющая структуру дикого типа (1— 411 а.о.); YK(H/Q) — каталитически неактивная урокиназа с заменой His204 на Gin204 в активном центре; ЦСД - целлюлозо-связывшощий домен фермента эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum; РД-ЦСД — химерный белок, состоящий из ростового домена и целлюлозо-связывающего домена. Очистку белков проводили по методике, описанной ранее (Mukhina et al., 2000) с небольшими изменениями и дополнениями.

Растворимость телец включения в гуанидине. Тельца включения, соответствующие 250 мкл культуры, растворяли в 1 мл смеси растворов: 1-5 М гуанидин + 100 мМ Трис рН8.3. Затем образцы центрифугировали 10 мин на 11000 оборотов/мин (центрифуга 5415R, Eppendorf). Осадок отмывали водой и растворяли в 20 мкл буфера О: 200 мМ Трис/HCl pH 6.8 + 4% SDS + 0.01% бромфеноловый синий + 40% глицерин. Надосадочную жидкость высаживали 10% ТХУ (трихлоруксусная кислота), осадок отмывали 3 раза в 1 мл 80% ацетона, затем 1 раз в 1 мл дистиллированной воды и растворяли в 20 мкл буфера О.

Очистка ростового домена. Белок РД-ЦСД переводили в фосфатно-солевой буфер. Затем белок инкубировали 1 ч при 37°С с тромбином. Ростовой домен отделяли от ЦСД домена с помощью центрикона 20kDA при 3000 g. Чистоту полученного препарата оценивали по электрофорезу.

Изменение флуоресценции триптофана при температурной денатурации белка. Белки переводили в фосфатно-солевой буфер pH 7.0 и разводили до оптической плотности ОП (280 нм) ~ 0.1. Измерения проводили на флуориметре Shimadzu (Япония). В качестве относительной величины флуоресценции брали отношение флуоресценции при 360 нм к флуоресценции при 320 нм.

Круговой дихроизм. Измерения кругового дихроизма проводили на приборе Jasco 850 (Япония) в 10 мМ фосфатном буфере pH 7.2. РД с2М = 7700 М-W1.

Флуоресценция белков, меченых с помощью Флуоресцеин-5-малеимид. Белки предварительно переводили в фосфатно-солевой буфер рН7.0 (или 6.5, 7.1) и инкубировали с меткой. Затем на колонке PD10 с сефадексом G-25 (Amersham Pharmacia, США) отделяли белок от не связавшейся метки, переводя белок в фосфатно-солевой буфер pH 7.0.

Количество связавшейся метки оценивали путем измерения флуоресценции на флуорнметре Shimadzu или нанося белки на электрофорез и фотографируя полученные гели на Kodak Digital Camera (Kodak, США) с использованием специального фильтра sybcr green и ультрафиолетового источника возбуждения с длинной волны соответствующей флуоресцеину. Сфотографированные гели окрашивали кумаси R250 для соотнесения количества связавшейся метки.

Иммобилизация белков. Для иммобилизации белков использовали сорбент CNBr-activated sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Швеция).

Получение клеточного лизата. Все процедуры проводили при 0°С. Клетки осаждали при 1000 g, охлаждали в течение 20-30 мин во льду и промывали 3 раза фосфатно-солевым буфером. Затем к клеткам добавляли лизис-буфер (100 мМ Трис/HCi, рН 8.1, 1% тритон X-114, 5 мМ CHAPS, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ, 10 мкг/мл лейпептин, 10 мкг/мл пепстатин А, 100 Ед/мл апротшшн) (0.1-0.2 мл на 10 млн. клеток). Клетки лизировапи 15 мин при периодическом перемешивании. Для удаления нерастворимых компонентов полученный лизат центрифугировали 30 мин при 30000 g. В экспериментах использовали свежеприготовленные клеточные лизаты.

Иммуноблоттннг. Белки разделяли с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза (Laemmli, 1970). Электролсрснос осуществляли на ПВДФ-мембрану. Мембрану инкубировали в блокирующем буфере I (фосфатно-солевой буфер, содержащий 5% сухое обезжиренное молоко, 0.05% Tween-20). В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к человеческому урокипазному рецептору (Monozyme, Дания) или мышиные моноклональные антитела к урокиназе человека в концентрации 0.2 мкг/мл («UNG», «UIG», Россия), вторичных: антитела козы к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена AffmiPure (Н + L) (Jackson ImmunoResearch, США). Детекцию белков осуществляли с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL™, Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences, США). Полученное на пленке изображение сканировали с помощью сканера Epson или цифровой камеры Kodak Digital Camera (Kodak, США). Полученные данные обсчитывали с помощью программы Scion image.

Иммупофсрмситный анализ. 96-луночные пластиковые планшеты для ИФА ( Nunc, США) инкубировали в течение 1 часа с урокиназным рецептором (0.11 нмоль в буфере 0.1 М NaHC03, рН9.5) здесь и далее при 37°С при постоянном перемешивании, параллельно с лунками с рецептором белки-лиганды наносились в чистые лунки для контроля качества раститровки системы. Промывку и блокирование неспецифических участков связывания здесь и далее проводили блокирующим буфером: 50 мМ Трис/HCl рН 7.5, содержащий 10 мг/мл БСА + 20 мг/мл желатина + 0.02% Tween-20. Затем добавляли формы урокиназы в количестве, соответствующем иммунохимическому эквиваленту: 0-0.014 нмоль и инкубировали в течение

часа. После промывки (4 раза по 5 минут на 37°С при перемешивании в блокирующем буфере) в лунки вносили биотинилированные поликлональные антитела козы к урокиназе человека («GAHUK», Россия) в концентрации 2 мкг/мл в блокирующем буфере. После промывки (4 раза по 5 минут на 37°С при перемешивании в блокирующем буфере) вносили нейтравидин, коньюгированный с полипероксидазой хрена (Pierce, США), специфически узнающий остатки биотина. После промывки (4 раза по 5 минут на 37°С при перемешивании в блокирующем буфере) проводили инкубацию с субстратом — орто-фенилендиамином (0.1 мг/мл) до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением 0.5 объема 10% H2S04. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре (Labsystems, Финляндия) при длине волны 492 нм.

М9 среда. На 1л: 50 мл 20Х М9 солей, 20 мл 20% глюкозы, 1 мл 1 М MgS04, 0.5 г NaCl, 930 мл автоклавированной Н20. Также в среду добавляли: 0.01% витамина В1, 50мкМ ZnS04 и 1мМ FeS04. В качестве источника аминокислот использовался пептон.

Очистка белка меченного изотопами 1SN и 13С. Схема роста в расчете на 1 л культуры: клетки ночь растили в 20 мл среды Silantes: OD2 CN |3С l5N labeled rich growth media (Silantes, Германия) при интенсивной аэрации (150 об/мин). Затем инокулировали в 1л среды Silantes, и клетки растили (~2.5 часа) до ОП (600 нм)=0.6, добавляли 0.5 мМ IPTG, и клетки растили дополнительно 4часа. Затем клетки осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин. Лизирование клеток и рефолдинг белков проводили по методике, описанной ранее (Mukhina et al., 2000) с небольшими изменениями. Во время рефолдинга добавляли 0.5 мМ ЭДТА и 0.25 мМ ФМСФ. Затем к смеси рефолдинга добавлялся раствор сульфата аммония рН 8.5 до 15% от насыщения, и инкубировали ночь при +4°С, далее центрифугировали 6000 g 30 мин. К надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония до 70% от насыщения, и инкубировали ночь при +4°С и центрифугировали 6000 g 30 мин. Осадок растворяли в 1 л 0.8 М гуанидин-С1 + 100 мМ Трис + 0.4 М NaCI рН 7.4 + 0.1 мМ ЭДТА и центрифугировали 6000 g, 30 мин. Смесь растворившихся белков наносили на сефарозу с иммобилизироваными антителами к крингл-домену НЮ (Россия). Колонку последовательно промывали 3 объемами 100 мМ Трис с 200 мМ NaCl рН 7.5, 3 объемами колонки 100 мМ Трис + 200 мМ NaCl рН 7.5 с 0.05% Tween-20, 6 объемами колонки буфера А (10 мМ Трис, 20 мМ NaCl рН 7.4), 6 объемами колонки буфера А с 5% МеОН, 6 объемами колонки Н20. Элюировали 3% уксусной кислотой и нейтрализовали до рН 6.0 аммиаком. Затем белок частично концентрировали с помощью вакуумного насоса speed-vvac, и переводили на колонке PD10 с сефадексом G-25 (Amersham Pharmacia, США) в 200 мМ Pipes рН 6.0 + 1 мМ ФМСФ + 0.02% NaN3. Конечная концентрация 5 мг/мл (0.25 мМ). Немеченные белки, используемые для подбора условий ЯМР, чистили аналогично.

Очистка комплекса урокиназа-урокнназный рецептор.

Аминокоицевой фрагмент урокиназы и рецептор инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, затем наносили на носитель с антителами к крингл-домену НЮ, носитель промывали 3 объемами колонки 100 мМ Трис+200 мМ NaCl pH 7.5, 3 объемами колонки 100 мМ Трис+200 мМ NaCl pH 7.5+0.05% Tween-20, 6 объемами колонки буфера А (10 мМ 'Грис, 20 мМ NaCl pH 7.4), 6 объемами колонки буфера А + 5% МеОН, 6 объемами колонки Н20. Элюировали 3% уксусной кислотой и нейтрализовали до рНб.О аммиаком.

Спектроскопия ЯМР. Работа посвященная изучению структуры аминоконцевого фрагмента методом ЯМР была выполнена в сотрудничестве с лабораторией Биомолекулярной спектроскопии ЯМР в институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и IO.A. Овчинникова Российской академии наук. В ЯМР исследовании использовали 0.25 мМ 15N / 13С-меченого АКФ(СЮ) в 200 мМ Pipes+ЮОмкМ ß-циклодекстрип (95% Н20, 5% D20, 1 мМ ФМСФ, 0.02% NaN3) с pH 6.0 при 36°С, что ниже температуры плавления доменов АКФ, а для изучения взаимодействия рекомбинантного фрагмента урокиназы с рецептором получали смесь 0.25 мМ I5N / НС-меченого АКФ(ОЛЗ) и немеченого 0.3 мМ УКР при тех же условиях. Для проведения структурных исследований аминоконцевого фрагмента в свободном состоянии и в составе комплекса с урокиназным рецептором применяли методики гетероядерной спектроскопии ЯМР (Cavanagh et al., 2006) с использованием спектрометра AVANCE (BRÖKER, Германия) с рабочей частотой па протонах 700 МГц, оснащенного высокочувствительным крио-датчиком. ЯМР-спектры были накоплены и обработаны с помощью программы TOPSPIN (BRUKER), а затем проанализированы в программе CARA (http://www.nmr.ch).

Клеточные культуры. Культуру клеток СНО (карцинома яичника китайского хомячка), СНО LRP-/-, гладкомышечные клетки из аорты человека (ГМК) культивировали на DMEM среде, содержащей 10% FBS, пенициллин и стрептомицин (100 Ед/мл и 100 мкг/мл) и 2мМ L-глутамин. Клетки линии U937 (лимфома человека) растили в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, пенициллин и стрептомицин (100 Ед/мл и 100 мкг/мл, соответсвенно) (Gibco, Invitrogen Corp., США).

Получение, белков из эукариотических клеток. Для получения рекомбинантных белков из эукариотических клеток использовали СНО клетки, трансфицированные плазмидной ДНК кодирующей полноразмерную урокиназу человека, соответствующую последовательности УКдт (E.CoIi). Вторым источником послужила трансгенная мышь, у которой экспрессировалась урокиназа человека под регуляцией ß-казсинового промотора и секретировалась в молоко. Урокиназный рецептор, используемый в работе, был любезно предоставлен лабораторией L.L.C. (США). Рецептор был

экспрессирован в клетках Drosophila Schneider S2 (DES system, Invitrogen) согласно рекомендуемой методике. Рецептор был очищен с использованием иммуноафинной хроматографии и гель-фильтрации. Чистоту препарата рецептора оценивали электрофоретически и методом иммуноблотинга с использованием моноклональных антител к урокиназному рецептору («Monozyme», Дания).

Связывание йодированных рекомбинантных форм урокиназы человека с клетками. Клетки, выращенные в 48-луночных плашках до состояния конфлуэнтности, дважды промывали PBS, pH 7.4, содержавшим 0.1% БСА. После предынкубации с 0.5 мл среды связывания (DMEM, содержавший 0.1% БСА и 100 Ед/мл апротинин) в течение 1 ч при комнатной температуре и последующего удаления среды, к клеткам добавляли по 100 мкл йодированной формы урокиназы в концентрации 3 нМ и 100 мкл буфера или немеченого конкурента в разных концентрациях. Инкубацию с йодированными формами урокиназы проводили 2 ч при 4°. Затем среду отбирали, клетки промывали 3 раза ФСБ, содержавшим 0.1% БСА, и лизировали путем добавления 500 мкл 1% Ds-Na в 0.5 M NaOH. Радиоактивность в клеточных лизатах измеряли в у-счетчикс CompuGamma («LKB Wallac», Финляндия) в единицах срт.

Миграция клеток. Миграцию клеток исследовали с помощью камеры Бойдена («Neuroprobe Inc.», США) как описано ранее (Stepanova et al., 1997). Перед экспериментом клетки, достигшие конфлуэнтного состояния, культивировали в среде без сыворотки DMEM/ 0.1% БСА в течение 24 ч. В качестве хемоаттрактантов использовали различные формы урокиназы человека, которые помещали в нижние ячейки камеры Бойдена. Хемоаттрактант и клетки были разделены поликарбонатным пористым фильтром с диаметром пор 8 мкм («Nucleopore Corp.», США), покрытым коллагеном I типа (100 нг/мл) (Vitrogen 100, «Celtrix Pharmaceuticals Inc.», США). В верхние ячейки камеры вносили по 50 мкл суспензии клеток (в среде без сыворотки DMEM /0.1% БСА), полученной при обработке монослоя клеток раствором трипсина и ЭДТА (0.05/0.02%). Число клеток, добавляемых в лунку, варьировало в зависимости от типа клеток и составляло 35 000-130 000 клеток на ячейку. Клетки инкубировали в СО2 инкубаторе 3 ч при 37°. Клетки, которые не промигрировали через мембрану, счищали с верхней поверхности фильтра, а клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали красителем DiffQuick («Baxter», США). Мембрану с окрашенными клетками сканировали на сканере ScanJet II СХ с использованием программ Deskscan и NIH Image. Интенсивность миграции оценивали по площади пиков, полученных сканированием поля окрашенных клеток. Результаты были представлены в виде отношения полученных площадей к контрольной площади, полученной для клеток прошедших через фильтр в отсутствие хемоаттрактанта.

Статистическая обработка результатов. Приведены средние значения (± стандартная ошибка) параметров из трех независимых экспериментов, каждый из которых был проведен трижды, если не указано иначе. Для оценки достоверности различий результатов использовали критерий Стьюдента при р <0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Очистка рекомбинантных форм урокиназы. Путем экспрессии в Escherichia coli были получены следующие формы урокиназы человека: ЛКФ— амино концевой фрагмент урокиназы - урокиназа, лишенная нротеолитического домена; ЛKO(G/D) — аминоконцевой фрагмент урокиназы с заменой аминокислотного остатка Gly16 на Asp16; КД - крингл-домен; УКДРД — урокиназа, лишенная ростового домена; УКдт —урокиназа, имеющая структуру дикого типа; YK(H/Q) — каталитически неактивная урокиназа с заменой His204 11а Gin204 в активном центре; РД-ЦСД — химерный белок, состоящий из РД и целлюлозо-связывающий домена фермента эндоглюконазы CelD (ЦСД), между которыми был встроен специфический сайт для активации тромбином. Химерный белок РД-ЦСД пришлось сконструировать из-за невозможности синтезировать ростовой домен отдельно, так как экспрессия таких коротких белков в Escherichia coli затруднена. Таким образом, ростовой домен был очищен биохимическим образом.

Функциональность очищенных белков. В Лаборатории молекулярной эндокринологии и лаборатории генной инженерии ИЭК ФГУ PKHI1K накоплен большой опыт успешного использования рекомбинантных форм урокиназы, синтезированных в Escherichia coli (Stepanova et al., 1999; Mukhina et al., 2000; Poliakov et al„ 2001; Plekhanova et al., 2001; Goncharova et al., 2002; Parfyonova et a!.,2004). Функциональность крингл- и ростового доменов рекомбинантных форм урокиназы была ранее доказана на клеточных моделях. Полноразмерная урокиназа связывалась с рецептором на поверхности клеток с константой 1.5 нМ, что сопоставимо с природной урокиназой, а формы, имеющие в своем составе крингл домен, стимулировали миграцию гладкомышечных клеток трахеи человека (ГМК) в той же степени, что и урокиназа, выделенная из эукариотических клеток (Mukhina et al., 2000). Перечисленные выше рекомбинантные формы урокинзы были исследованы на способность связываться с урокиназным рецептором на клеточных моделях и in vitro.

Клеточные модели. В данной работе мы решили провести проверку функциональности ростового и крингл- доменов в очищенных рекомбинантных формах урокиназы на клеточных моделях и in vitro. В Лаборатории молекулярной эндокринологии ИЭК ФГУ РКНПК ранее было установлено, что урокиназа способна связываться не только с урокиназным рецептором, но и с другими участками на поверхности ряда клеток, таких как ГМК, НЕК293, СНО

Рисунок 1. а) Конкуренция различных форм урокиназы с 1251-УКдт. Клетки СНО ЬЯР-/- инкубировали с ,251-УКдт (3 нМ) и немечеными УКдт, УКАРД, РАБ (300 нМ). Данные, приведенные на рисунке, представляют собой средние значения девяти экспериментов. 6) Хемотаксическое действие разных форм урокиназы на миграцию ГМК человека. К клеткам добавляли УКдт, УКАРД в концентрации 10 нМ. Данные, приведенные на рисунке, представляют собой средние значения девяти экспериментов.

(МикЫпа й а1., 2000). Этот дополнительный участок, крингл-связывающий белок (КСБ), отличается от интегринов (Р1шко1а е1 а1., 2004; Ку/ак ег а1., 2005) и связывает крингл домен урокиназы (МикЫпа й а1., 2000). В данной работе в качестве первой клеточной модели исследования функциональной активности крингл- и ростового доменов урокиназы использовали клетки СНО, которые не экспрессируют ЬЯР (белок, родственный рецептору липопротеидов низкой плотности) (СНО Ы1Р-/-). Эти клетки были выбраны для того, чтобы исключить связывание урокиназы с ЬИР (Ыук]аег е! а1., 1994) (рис. 1а). Избыток УКдт, как и ожидалось, ингибировал специфическое связывание полноразмерной урокиназы, меченой радиактивным йодом (1251-УКдт). Рецептор-ассоциированный белок (РАБ) - универсальный ингибитор связывания урокиназы с рецепторам ЬКР/а2-М11 - не ингибировал специфическое связывание, что подтверждается отсутствием связывания урокиназы с ЬЯР на данном типе клеток (Ыук^аег е1 а1., 1994). УКДРД, которая не связывается с урокиназным рецептором (РоНакоу е1 а!., 1999), ингибировала связывание 1251-УКдт лишь на 40%. Это свидетельствует в пользу того, что связывание 1251-УКдт с поверхностью клеток осуществляется как за счет ростового, так и за счет крингл- домена, и что оба этих домена функционально активны. В качестве второй клеточной модели использовали гладкомышечные клетки аорты человека (ГМК). При сравнении хемотаксических свойств форм

урокиназы мы выяснили, что УКдг, УКДРД проявляют хемотаксическую активность, взаимодействуя или только с КСБ, или с урокиназным рецептором и КСБ (рис. 16).

Специфичность связывания. Для проверки специфичности связывания очищенных рекомбинантных форм урокиназы с природным урокиназным рецептором in vitro, AKO(G/D), РД-ЦСД, yK(H/Q), УКДРД, КД

3 аффинная хроматография

иммуноблотиш

* L » ш !:;1.IUU

Рисунок 2. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы, иммобилизованных на ВгСМ-сефарозе с урокиназным рецептором из клеток 11937. а) Формы урокиназы: АКФ(вЮ), РД-ЦСД, УЩН/О), УКАРД, КД иммобилизовали на ВгСИ-сефарозе. В качестве контроля использовали пустую сефарозу, свободные места в которой были блокированы этаноламином, сефарозу с иммобилизованным БСА и СБД. б) Лизат клеток 1/937, содержавший рецептор, инкубировапи с аффинными матриксами. Связавшиеся белки элюировали с матрикса, разделяли с помощью Вя-Ма-ПААГ-электрофореза, переносили на ПВДФ-мембрану и детектировали с помощью моноклональных антител к урокиназному рег^ептору («Мопо^уте», Дания).

S 1,

11 пмольУКР на лунку

о^гнпсгоа-^ойо-мг)'; иг,юль добавленного белка

—*—Kcwpcrs •••»•• УК(г.?)1 —*-У?чм}2

y'Ki.cf>o>1 -о-УК^сЬс за

11 пмольУКР на лунку

пмоль добавленного белка

Укдг —»г-ТрЗГ:

ЖСН.Ю:

— МчМ/СМ

--■14W 02

— Hfcr2

11 пмоль УКР на лунку

Рисунок 3. Изучение взаимодействия форм урокиназы с урокиназным рецептором методом ИФА. 96-луночные пластиковые планшеты для ИФА (фирма Nunc) инкубировали в течение 1 часа с урокиназным рецептором (Ппмолъ). Не связавшиеся места блокировали буфером 50 мМ Tpuc/HCl рН 7.5 + 10 мг/мл БСА + 20мг/мл желатина + 0.02% Tween-20. Затем добавляли формы урокиназы в количестве, соответствующем иммунохимическому эквиваленту: 0-0.014 пмоль, — и инкубировали в течение 1 часа: а) УК(М) — урокиназа, экспрессированная в молоко мыши, УК (cho) — урокиназа, экспрессированная клетками СНО; б) АКФ — аминоконцевой фрагмент урокиназы, AKO(G/D) — аминоконцевой фрагмент урокиназы с заменой G/D, AKO(G/D)* — белок с изотопным замещением 13С и ,SN; в) УЩН/Q) — полноразмерная неактивная урокиназа, УКдт — полноразмерная урокиназа дикого типа. Параллельно с лунками с рецептором белки-лиганды наносились в чистые лунки для контроля качества раститровки системы. Окрашивание связавшихся форм урокиназы проводили с помощью биотинилированных поликлоначьных антител козы курокиназе человека (GAHUK).

иммобилизовали на BrCN-сефарозе для получения аффинных носителей, которые впоследствии были проинкубированы с образцами лизатов из клеток U937, послуживших источником природного рецептора урокиназы. В качестве контрольных сорбентов использовали пустую BrCN-сефарозу, активные группы, которой были блокированы этаноламином и BrCN-ссфарозу с иммобилизованным БСА и целлюлозо-связывающим доменом. На рисунке 2 видно, что AKO(G/D), РД-ЦСД, YK(H/Q), в составе которых имеется ростовой домен, связывают рецептор урокиназы, тогда как УКДРД, крингл домен, целлюлозо-связывающий домен и БСА — нет. Как видно из приведенных данных (рис. 2), все формы урокиназы, содержащие ростовой домен, специфически связывают урокиназный рецептор.

Стехиометрия связывания. Для сравнения стехиометрии связывания урокиназного рецептора с формами урокиназы, синтезированными в E.coli и в эукариотических клетках, был использован метод иммуноферментного анализа (рис. 3). В качестве источника эукариотических клеток использовали клетки СНО, трансфицированныс плазмидой, кодирующей полноразмерную урокиназу человека, и трансгенных мышей, у которых урокиназа человека экспрессировалась и секретировалась в молоко. Как видно из рисунка 3 исследуемые рекомбинантные белки обладали одинаковой в сравнении с формами урокиназы, полученными в эукариотических клетках, стехиометрией связывания с урокиназным рецептором.

Представленные данные показывают, что полученные в E.coli и очищенные рекомбинантные формы урокиназы человека функционально активны и обладают сходной с урокиназой, полученной в эукариотических клетках, стехиометрией связывания с урокиназным рецептором, что позволяет использовать эти формы для дальнейшего изучения структуры ростового домена урокиназы.

Изучение структуры ростового домена методом кругового дихроизма. Метод кругового дихроизма является наилучшим из известных на сегодняшний день методов определения в составе структуры участков а-спиралей и р-слоев. На рисунке 4 представлен спектр ростового домена. При сравнении с характерными видами кривых, представленных справа, хорошо видно, что структура ростового домена представляет собой неупорядоченный клубок. Ранее методом кристаллографии и ЯМР было показано наличие двух участков Р-слоев в ростовом домене аминоконцевого фрагмента урокиназы, полученного в эукариотических клетка (Hansen et al., 1994; Barinka et al., 2006). Однако в данной работе этого не было обнаружено, несмотря на функциональную активность рекомбинантных форм урокиназы. Возможно, крингл-домен урокиназы влияет на правильное формирование структуры ростового домена во время рефолдинга.

ростовой домен

2 -кюо

5 -нню х

е- .iKao

— —

\ J

"V V ■ i .■ ! 1 1

-»¡гет §

■■■■»и» 1

■" fr'illly*! 1

-МЙ ¡O'v I

.•жткжт!

1 fl »X - J 220 2® 2« 1Ш Ж 23B 233 5Ш 3® длина ваяпы, нм

190 200 210 220 230 240 250 ДЛИЛИ воппы, им

Рисунок 4. Изучение структуры ростового домена методом кругового дихроизма. На графиках по оси абсцисс изменение температуры, а по оси ординат отношение значений флуоресценции при 380 и 320 нм. а) Измеряемые образцы различаются по концентрации и наличию TFE: 10 — 4.8247 х Ю 5 М, 11 — 3.0552 х Ю-5М, 12 — 3.3539 х 10'1 М, 13 — 2.7727 х Iff5М, 10+20%TFE — 3.85976 х 10 s М. б) Характерные формы спектров КД для полилизина в форме а-спирали (а), (¡-структуры ф) и неупорядоченного клубка (r)(Creighton Т.Е., 1991).

Изучение структуры ростового и крингл- доменов методом изменения флуоресценции триптофанов при температурной денатурации белка. Для проверки этого предположения было проведено сравнение вторичных структур аминоконцевого фрагмента урокиназы, аминоконцевого фрагмента с заменой в ростовом домене, ростового домена и крингл-домена методом измерения изменений флуоресценции триптофана при температурной денатурации белка. В структуре обоих доменов урокиназы и ростового- и крингл-домена присутствуют триптофаны. При повышении температуры в

ростовой домен

аминоконцевой фрагмент (С/Г))

Вё 6

за 4

№ Р

Р< £ о а 2

£ А!

0-й

20 40 60 80 теииецитурд, *С

100

4 2

о» С*

•е-

к о

л-

20 40 60 температура, "С

го юо

крипга-домен

аминоконцевой фрагмент

Рисунок 5. Изменение флуоресценции триптофанов при температурной денатурации белка. Измерения проводили на флуориметре БЫтаски. В качестве относительной величины флуоресценции брали отношение флуоресценции при 360 нм к флуоресценции при 320 нм.

момент денатурация белка происходит характерное изменение флуоресценции триптофанов, так как меняется их аминокислотное окружение. На рисунке 5 видно, что кривая плавления ростового домена представляет собой прямую. Принимая во внимание отсутствие у данного домена гидрофобного ядра, это говорит о неструктурированности ростового домена. В то же время крингл-домен и аминоконцевые фрагменты обладают вторичной структурой. Обращает на себя внимание одинаковый характер кривых плавления крингл-домена и аминоконцевых фрагментов (на рисунке 5 структурный переход отмечен стрелкой). Это говорит о том, что в аминоконцевых фрагментах ростовой домен не структурирован, следовательно, на рефолдинг ростового домена наличие крингл-домена не оказало влияния.

Изучение наличия неспаренных цистеинов в ростовом домене,

проводили с помошыо метки флуоресцеин-5-малеимида, которая специфически взаимодействует с сульфгидрильными группами в белке. В качестве положительного контроля использовали крингл-домен и аминоконцевой фрагмент урокиназы с одним неспаренным иистеином на М-конце. а в качестве отрицательного контроля, РНКазу с отсутствием свободных цистеинов.На рисунке ба-б представлены электрофорез и электрофлуорограмма одного и того же геля соответственно, показывающая специфичность связывания метки.

яД*.

43 tv» i

29 I '

lMBHHB

143 ШвШШшшш К Ш^ШЯЯН^^^^М Ч

вл Ш , í

РД КД РПКаиаАКФ ШШШШШ^Ш^ЩШШШШ

43 29 38,4 143

cwf--,

' Л '

Рисунок 6. Оценка наличия неспаренных цистеинов в ростовом домене.

Tpuijuu-SDS-PAGE-электрофорез 16% + 1 см 10% + 6 A4 мочевины + 6МЭ: РД -ростовой домен (6мкг), КД - крингл-домен (1 мкг), РНКаза (4мкг), АКФ -аминоконцевой фрагмент (Змкг). Полученные гели а) фотографировали на камеру Kodak с использованием фильтра siber green, а затем б) белки окрашивали кумасси R250; в) отношение количества молей метки, связанных с молем белков: РД. РНКазы, АКФ и КД, измеренные на флуориыетре Shimadzu.

Слепа представлен график количественной оценки молей метки связавшихся с молем белка. Видно, что ростовой домен связал метки даже меньше, чем отрицательный контроль - РНКаза, что указывает на отсутствие свободных цистеинов в этом домене. Полученные данные говорят о том, что в ростовом домене отсутствуют свободные цистеины. Принимая во внимание, что рекомбинантные формы урокиназы, содержащие ростовой домен, обладают физиологической активностью, сравнимой с природной урокиназой (стимулируют миграцию ГМК), имеют аналогичную с урокиназой, полученной из эукариотических клеток, стехиометрию связывания с рецептором, и тот факт, что сокращение длины П-петли приводит к неспособности ростового домена взаимодействовать с урокиназным рецептором (Масёо1сп й а1., 1996), можно заключить, что О-петля в ростовом домене сформировалась правильно.

Изучение структуры ростового домена методом ЯМР. Все использованные ранее методы позволяют получить информацию о структуре всей молекулы белка. Метод ЯМР позволяет следить за каждой аминокислотой в отдельности. Учитывая возможность того, что при взаимодействии с рецептором ростовой домен может стать более упорядоченным, его структура была исследована методом ЯМР как в комплексе с рецептором, так и отдельно. Для этого была проведена очистка аминоконцевого фрагмента урокиназы с изотопным замещением азота на 15Ы и углерода на ,3С. Работа проводилась с аминоконцевым фрагментом, имеющим замену в ростовом домене - АКФ(ОЯ)), так как ранее мы показали, что эта замена никак не повлияла на стехиометрию связывания (рис. Зв).

Отнесение 'Н, 13С и химических сдвигов рекомбинантного АКФ(СЯ)). При наиболее приближенных к физиологичным и оптимально-возможных для измерений на крио-датчике условиях качество гетеро ядерных ЯМР-спектров для 0.5 мМ образца рекомбинантного 15Ы/13С-меченого аминоконцевого фрагмента оказалось удовлетворительным. В спектре 15Ы-Н8(ЗС (рис. 7а) были идентифицированы все возможные 'НК/'5Н кросс-пики, соответствующие сигналам от N1-1 и МН2 групп аминоконцевого фрагмента. Затем, на основе полученных химических сдвигов ядер азота и ковалентно связанных с ними протонов в трехмерных гстероядерных спектрах 151\Т/13С-КЫСА, 15К/°С-Н1\'СО, |5М/пС-НК(СО)СА, |5Ы/пС-НК(СА)СО, 15Ы/13С-СВСА(СО)ЫН, 15М/13С-НЫСАСВ, 15М-ТОС8У-Н8(ЗС и '5Ш\'ОЕ8У-Н80С были

ЬтИ 13/^а 15-К, 1т ГЫ 13/-., хг П^а^В 15-кт „ 1,тЫ 1тт 15.Т

сделаны двумерные срезы Н - С - И, Н - С -Ы Н - С С - N и Н - Н- N (рис. 7, б-г).

Из анализа ЯМР-спектров был сделан вывод о возможном разделении всех спиновых систем протонов на остатки, соответствующие регионам ростового домена и крингл- домена, а также Ы- и С-концевым участкам. Остаткам из региона ростового домена соответствуют более широкие и менее интенсивные сигналы, часто с несколькими минорными сигналами, которые можно легко отличить уже в спектре |51\Т-ШС)С (рис. 7а). Остаткам из региона

Рисунок 7. а) Спектр 2D ,sN-HSQC 0,5 мМ 15Ы/13С-меченого АКФ(ОЮ) в 200 мМ буфере Pipes при рН 6.0 и 36 'С; б) фрагменты 'if'-13C'3(f-'5N срезов в спектре 3D ,3N/'3C-HNCACB. Пунктирными стрелками показаны последовательные корреляции Cfi-lj-HNfij-Cfi) и С? (i-l)-HN(i)-Cf (i); в) и г) фрагменты 1 if-Н-5N срезов в спектре 3D J,N-NOESY-HSQC для крингл-и ростового домена АКФ(С/В), соответственно. Пунктирными стрелками показаны последовательные контакты ЯЭО между остатками белка. Интенсивность сигналов для ростового домена намного ниже вследствие неструктурированности.

крингл-домена принадлежат интенсивные сигналы с наибольшей дисперсией химических сдвигов. В то же время для высокоподвижных К1- и С-концевых участков рекомбинантного аминоконцевого фрагмента характерны наиболее узкие сигналы с малой дисперсией химических сдвигов.

В результате анализа всего набора гетероядерных ЯМР-спектров для каждой спиновой системы были по возможности получены химические сдвиги ядер Нк, На, С', Са, и С1'. Сначала было проведено последовательное

отнесение сигн&пов атомов основной цепи белка с использованием цепочек контактов С'0-/)-НЩ)-С'0). Са0-1)-НН0)-Са0), СY/-/>HN(/>CIY'A Нф(/-1)-НМ(/)-Нв'1(У (индекс -1 означает, что ядро принадлежит к предыдущему остатку в аминокислотной последовательности). В качестве стартовых спиновых систем были идентифицированы кросс-пики остатков глицинов, у

которых химический сдвиг |5Ы значительно меньше (< 112м.д.), чем у остальных остатков. Это позволило идентифицировать фрагменты из нескольких последовательных спиновых систем, которые затем были соотнесены с аминокислотной последовательностью аминоконцевого

ростовой V*- Л

домен ' í( \ 1 ) Тф30 30

\ ™ X § 1 к р

1 о я 20-1

и ч \ . к" \ 1 м — 1

КрИБГЛ- ' ^

домен

¿1

ю-?

Да 1 М

О 40

нлв

.-1

120

160

ростовой домен крингл-домен

ашшокнсиотнаж последовэтельность

Рисунок 8. а) Пространственная топология АКФ(С/0). На рисунке отмечен ход основной цепи белка. Также в ростовом домене изображены боковые цепи остатков, ответственных за взаимодействие с рецептором; б) распределение внуриостаточных, последовательных, средних и дальних контактов ЯЭО для АКФ(в/й), полученных из спектров ЗО '5Ы-ЫОЕ8У-Н$()С и ЗО 13С-А'ОЕБУ-НБОС. Из гистограммы видно, что, в отличии крингл-домена. ростовой домен не имеет жесткой структуры.

фрагмента. Полное отнесение основной цепи и боковых цепей было завершено с помощью трехмерных гетероядерных спектров bC-HCCH-TOCSY и ЬС-NOESY-HSQC, в которых на основе !Н/13С кросс-пиков в спектре bC-HSQC аналогично были сделаны двумерные срезы, соответствующие сигналам от СН, СН2 и СН3 групп аминоконцевого фрагмента. Таким образом, несмотря на многокомпонентность широких сигналов и их существенное перекрывание с узкими интенсивными сигналами в ЯМР-спектрах, было получено отнесение 74% и 43% химических сдвигов основной и боковых цепей белка, соответственно. Основная часть остатков с наиболее полным отнесением 'Н, 13С и 15N химических сдвигов принадлежит крингл-домену.

Конформация рекомбинантного фрагмента урокиназы в свободном состоянии и в комплексе с рецептором. Описание пространственной структуры рекомбинантного аминоконцевого фрагмента по данным гетероядерной спектроскопии ЯМР включало в себя три последовательных этапа: (1) анализ локальной структуры с помощью так называемого вторичного химического сдвига (разница химического сдвига для атомов белка и пептида в конформации неупорядоченный кубок); (2) поиск паттернов ближних и дальних контактов ЯЭО (Ядерный эффект Оверхаузера), характерных для определенной вторичной структуры белка; (3) расчет пространственной структуры белка методом молекулярной динамики в пространстве торсионных углов.

Анализ локальной и вторичной структуры на основе значений HN, 1Г, 1 Са, Ср, С' химических сдвигов и распределения контактов ЯЭО показал, что жестко структурированным является только участок Lys61 - Lys136, соответствующий крингл-домену, в составе которого преобладает р-структура и изгибы, а также имеются два коротких спиральных участка Ala77-Gln82 и Asp90-Leu94. В итоге анализа спектров 3D 15N-NOESY-HSQC и 3D 13C-NOESY-HSQC был идентифицирован 691 контакт ЯЭО, сосредоточенный преимущественно в крингл-доменс (рис. 86) в сравнении с равномерно распределенными 884 контактами ЯЭО, указанными в работе (Hansen et al., 1994).

Последующий расчет структуры (рис. 8а) показал пространственную гомологию крингл-домена из рекомбинантного аминоконцевого фрагмента, экспрессированного в бактериальной культуре, с пространственной структурой, ранее определенной с помощью методов ЯМР (Hansen et al., 1994) и рентгеноструктурного анализа (Barinka et al., 2006) для белка, выделенного из эукариотических клеток. При этом, как указывалось выше, ростовой домен рекомбинантного аминоконцевого фрагмента в спектрах ЯМР имел уширенные сигналы с заметным расщеплением на минорные компоненты, что указывает на присутствие промежуточных и медленных (во временной шкале ЯМР: микро-миллисскундный диапазон) конформационных переходов. Полученные данные указывают на то, что крингл- и ростовой домены рекомбинантного

Рисунок 9. а) Спектр 2D lsN-TROSY 0,25 мМ '5Ы/'3С-меченого АКФ (G/D) в комплексе с урокиназным рецептором(УКР) в 200 мМ буфере PIPES при рН 6.0 и Зб°С. На спектре подписано отнесение кросс-пика от боковых индолъных Hlf групп остатков триптофана. Фрагмент спектра (б) 2D 'SN-HSQC АКФ (G/D) (см. Рис. 7), а также фрагменты спектров (в) 2D I5N-HSQC и (г) 2D ,5N-TROSY комплекса АКФ (G/DJ-УКР с кросс-пиками HN* группы остатка Тгр30 из ростового домена. Из сравнения спектров видно, что с рецептором взаимодействует, видимо, только ростовой домен АКФ (G/D).

аминоконцевого фрагмента структурно независимы для белка, находящегося в свободном состоянии, причем подвижность ростового домена существенно выше. Это, тем не менее, не исключает возможность временных взаимодействий двух доменов, подвижных относительно друг друга (Hansen et al., 1994; Barinkaet al., 2006).

При связывании рекомбинантного фрагмента урокиназы с урокиназным рецептором (УКР) происходило изменение формы и количества минорных компонент у кросс-пика от индольной HNE группы Trpj0 в спектре bN-HSQC и

,5N-TROSY ,5N/'3C-AK<J>(G/D)-yKP (рис. 9 а, в, г). Помимо этого, у кросс-пиков остатков ростового домена существенно растет полуширина сигналов вплоть до их исчезновения из спектров ЯМР (например, в спектре lsN-HSQC для сигнала от HN' группы Тгр30 39 и 62 Гц в свободном состоянии и в комплексе с урокиназным рецептором, соответственно), в то же время данный параметр практически не изменяется для остатков из крингл-домена (например, в спектре l5N-HSQC для сигнала от HN группы Leu122 26 и 29 Гц в свободном состоянии и в комплексе с урокиназным рецептором, соответственно), то есть сигналы ЯМР от крингл-домена в отличие от ростового домена практически не изменяются при связывании аминоконцевого фрагмента с рецептором. Следует отметить, что по данным рентгеноструктурного анализа в связывании с рецептором участвуют остатки ростового домена из подвижной петли Asn22, Val20, Phe25, lie28, и Тгр30. Эти результаты свидетельствуют о том, что в связывании с рецептором в растворе участвует главным образом ростовой домен аминоконцевого фрагмента урокиназы, а именно его активная петля с остатком

™ 30

1Ф , в то же время крингл-домен, по-видимому, практически не задействован в формировании комплекса, оставаясь подвижным относительно взаимодействующих ростового домена и рецептора.

Полученные в работе данные показывают, что для специфического взаимодействия ростового домена с урокиназным рецептором наличие ß-структуры в ростовом домене не является обязательным. Это указывает на возможность альтернативного механизма взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором, механизма, в котором наличие четкой вторичной структуры в ростовом домене не является необходимым условием для взаимодействия с рецептором, а достаточным является наличие в составе ростового домена fí-петли, определяющей взаимодействие с рецептором.

выводы

1. Синтезировании, очищены и охарактеризованы рекомбинантные формы урокиназы человека в клетках Escherichia coli.

2. Изучено связывание этих белков с природным рецептором урокиназы (uPAR/CD87) из клеток U937, а также с рекомбинантным рецептором полученным в клетках Drosophila Schneider S2. Физиологические эффекты этих форм белка, кинетика, а также стехиометрия связывания свидетельствуют о том, что структура ростового домена сходна со структурой этого домена в урокиназе из эукариотических клеток.

3. Методами кругового дихроизма, измерения флуоресценции триптофана при плавлении белка, а также двумерного ЯМР в рекомбинангных формах урокиназы при физиологических значениях рН не удалось выявить вторичной структуры у ростового домена, в то время как в крингл-домене все перечисленные методы обнаруживают выраженную вторичную структуру.

4. Методом ЯМР показано, что во взаимодействии аминоконцевого фрагмента урокиназы с урокиназным рецептором принимает участие только ростовой домен. При взаимодействии аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором, структура ростового домена не приобретала упорядоченности, характерной для кристаллической структуры комплекса аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором.

5. Предложен новый механизм взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором, согласно которому р-слои в ростовом домене не являются необходимым элементом для взаимодействия с урокиназным рецептором, а обязательным и достаточным условием для взаимодействия с рецептором является наличие П-петли в ростовом домене.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белоглазова И.Б., Поляков А.А., Торосян Н.А., Степанова В.В., «Использование поликлональных антител к пептидным последовательностям из урокиназиого рецептора с целью картирования участков связывания урокиназы в его структуре», XLIV Научная конференция Московского Физико-технического Института, Долгопрудный, 23-30 ноября 2001 г., стр. 39.

2. Белоглазова И.Б., Торосян Н. А., Поляков А. А., Степанова В.В., «Взаимодействие ростового и крингл доменов урокиназы», Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 16-18 июня 2003 г., стр. 30.

3. V. Stepanova, R. Beabealashvilly., I. Beloglazova, N. Torosyan, V. Tkachuk, «Growth factor-like domain of urokinase controls its chemotactic activity mediated by the kringle domain: putative GFD-Kringle interactions», IX International workshop on «Molecular & Cellular Biology of Plasminogen Activation», Capri, Italy, 19-23 october 2003.

4. Белоглазова И.Б., Торосян H.A., Поляков A.A., Степанова В.В., «Нековалентное взаимодействие ростового и крингл доменов урокиназы», Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», Москва, 15-18 апреля 2003 г.

5. Степанова В.В., Белоглазова И.Б., Гурский Я.Г., Бибилашвили Р.Ш., Парфенова Е.В.. Ткачук В.А., Взаимодействия между крингл и ростовым доменами в молекуле урокиназы: возможная роль в стимуляции хемотаксиса клеток, Биохимия, 2008,73(3), 311 - 321.

Подписано в печать:

22.01.2009

Заказ № 1480 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белоглазова, Ирина Борисовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Урокиназа.

1.1. Структура урокиназы.

1.2. Структура доменов урокиназы.

2. Взаимодействие с рецептором.

2.1. Структура урокиназного рецептора.

2.2. Комплекс АКФ -УКР.

3. Урокиназа и гепарин.

4. Ограниченный протеолиз урокиназы.

5. Посттрансляционные модификации урокиназы.

6. Регуляция экспрессии урокиназы.:.

7. Ингибирование урокиназы: ПАИ-1, ПАИ-2, PN-1.

8. Эндоцитоз урокиназы.

9. Витронектин.

10. Интегрины.

11. Функции урокиназы.

11.1. Протеолитическая функция комплекса УК - УКР.

11.2. Адгезия и миграция.

11.2.1. Протеолиз.

11.2.2. Крингл-зависимая миграция.

11.2.3. Разрушение фокальных контактов.

11.2.4. Сигналинг через GPCR.

11.2.5. Витронектин.

11.2.6. LDL-опосредованная миграция.

11.3. Пролиферация.

11.4. Апоптоз.

12. Участие урокиназы в ремоделировании тканей.

12.1. Рестеноз.

12.2. Ангиогенез.

12.3. Рост и метастазирование опухолей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Химические реактивы.

2. Антитела.

3. Культу рал ьные среды и пластик.

4. Очистка рекомбинантных форм белков.

5. Определение концентрации белка в пробах.

6. ДСН-электрофорез.

7. Изучение растворимости телец включения в гуанидине.

8. Очистка ростового домена.

9. Изменение флуоресценции Тгр при температурной денатурации белка

10. Круговой дихроизм.

11. Флуроресценция белков, меченых с помощью Флуоресцеин-5-малеимид

12. Иммобилизация белков.

13. Получение общего клеточного лизата.

14. Иммуноблоттинг.

15. Иммуноферментный анализ.

16. М9 среда.

17. Получение и очистка белка с изотопным замещением Nh С.

18. Очистка комплекса УК - УКР.

19. Спектроскопия ЯМР.

20. Клеточные культуры.

21. Получение белков из эукариотических клеток.

22. Связывание йодированных рекомбинантных форм урокиназы человека с клетками.

23. Миграция клеток.

24. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Очистка рекомбинантных форм урокиназы человека.

2. Очистка ростового домена урокиназы.

3. Изучение вторичной структуры РД, КД, АКФ.

4. Изучение наличия неспаренных цистеинов в ростовом домене.

5. Изучение функциональности крингл- и ростового доменов рекомбинантных форм урокиназы.

5.1. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором на поверхности клеток СНО.

5.2. Хемотактическое действие рекомбинантных форм урокиназы на миграцию гладкомышечных клеток человека.

5.3. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором из клеток U937.

5.4. Сравнение рекомбинантных форм урокиназы, полученных в E.Coli с -формами урокиназы , экспрессируемыми в эукариотических клетках.

6. ЯМР.

6.1. Подбор условий для ЯМР.

6.1.1. Подбор среды.

6.1.2. Подбор условий роста Е. coli в среде Sinantes.

6.1.3. Подбор условий очистки белка.

6.2. Получение комплекса AKO(G/D) - УКР в максимально возможной концентрации.

6.2.1. Очистка комплекса AKO(G/D) - УКР.

6.2.2. Определение стехиометрии связывания УКР с AK<I>(G/D).

6.2.3. Повышение концентрации комплекса AKO(G/D) - УКР.

6.2.4. Подбор буфера для ЯМР.

6.3. Приготовление образцов для ЯМР.

6.3.1. Урокиназный рецептор.

6.3.2. АКФ (G/D).

6.3.3. Смесь AKO(G/D)+yKP.

6.3.4. Стабильность белков и комплекса.

6.4. Спектры ЯМР.

6.4.1. Отнесение 'Н, 13С и 15N химических сдвигов рекомбинантного

АКФ (G/D).

6.4.2. Конформация рекомбинантного фрагмента урокиназы в свободном состоянии и в комплексе с рецептором.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль структуры ростового домена урокиназы во взаимодействии с урокиназным рецептором uPAR/CD87"

Активатор плазминогена урокиназного типа — урокиназа (УК) — принадлежит к семейству сериновых протеаз. Основной функцией урокиназы считается ее участие, наряду с «тканевым» активатором плазминогена в тромболизисе [147]. Урокиназа состоит из трех доменов, каждый из которых обладает физиологической значимостью. Ростовой домен, гомологичный по структуре эпидермальному фактору роста, отвечает за связывание урокиназы с урокиназным рецептором (УКР) [17; 180], и это связывание обуславливает изменение конфигурации рецептора и переводит УКР в «сигнальное» состояние. Крингл-домен стабилизирует связывание урокиназы с УКР и способен связываться с гипотетическим рецептором, отличным от УКР, и активировать миграцию клеток [158]. Протеолитический домен отвечает за протеолиз плазминогена с переводом его в плазмин, а также принимает участие в целом ряде регуляторных процессов обуславливающих ремоделирование тканей, дифференцировку клеток, ангиогенез и др. [3; 37; 163].

Урокиназный рецептор является самым значительным партнером урокиназы на поверхности клеток [17]. Он представляет собой трехдоменный гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ) заякоренный белок, все три домена которого являются гомологичными по структуре. Считается, что за связывание с урокинзой отвечает первый домен, в то время как два других повышают сродство к урокиназе. Имеющиеся данные позволяют предположить, что при связывании урокиназы с высокоаффинным рецептором экспонируются участки в крингл-домене для взаимодействия с другими мишенями на поверхности клетки и запуска миграции [4]. Показано также, что при взаимодействии урокиназы с урокиназным рецептором экспонируются участки, отвечающие за сигнальные функции рецептора, а также образуются общие места связывания с белками внеклеточного матрикса и интегринами, образованные и урокиназой и рецептором [126].

Таким образом, связывание урокиназы с рецептором индуцирует изменения рецепторного белка важные для реализации ряда физиологических процессов, а рецептор, связываясь с урокиназой, изменяет ее свойства. Эти сведенья получены путем измерения функциональной активности этих белков, но структурные основы, определяющие эти изменения, не охарактеризованы.

Недавно был расшифрован кристалл комплекса урокиназного рецептора и аминоконцевого фрагмента урокиназы (АКФ), лишенной протеолитического домена [22]. Как было показано, при взаимодействии с урокиназой первый и третий домены рецептора сближаются таким образом, что рецептор смыкается в кольцо, образованное тремя доменами. При этом происходит экспонирование активного участка между первым и вторым доменами рецептора. Однако метод кристаллографии не дал достоверной информации о взаимодействии урокиназы с урокиназным рецептором, потому что исследованная законсервированная структура белков не соответствует физиологическим условиям образования комплекса. Для установления изменений в структуре урокиназы при ее взаимодействии с рецептором более информативным является метод ядерного магнитного резонанса.

Детальное изучение структуры ростового домена урокиназы, отвечающей за взаимодействие с урокиназным рецептором, внесет вклад в разработку результативных ингибиторов эффектов урокиназы, опосредованных ее взаимодействием с урокиназным рецептором. Известно, что суперэкспрессия урокиназы и урокиназного рецептора коррелирует с плохим прогнозом в ряде онкологических заболеваний [68]. Именно поэтому создание ингибиторов, блокирующих взаимодействие урокиназы с рецептором, является важной задачей в проблеме лечения рака. Помимо этого, блокирование взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором позволит контролировать процессы ремоделирования тканей, роста сосудов, устраняя негативные эффекты урокиназы. Именно поэтому мы заинтересовались исследованием ростового домена урокиназы. Таким образом, целью нашей работы было изучение структуры ростового домена урокиназы и ее изменения при взаимодействии с урокиназным рецептором.

Для этого мы поставили перед собой следующие задачи:

1. Синтезировать в Escherichia coli, очистить и охарактеризовать рекомбинантные формы урокиназы человека.

2. Сравнить полученные формы с урокиназой, экспрессированной в эукариотических клетках, по способности к связыванию с урокиназным рецептором.

3. Изучить пространственную структуру ростового домена урокиназы.

4. Получить стабильный препарат аминоконцевого фрагмента с изотопным

15 13 замещением N и С, и комплекса аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором, стабильный и растворимый в высоких концентрациях в растворе с минимальным содержанием солей.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Урокиназа

Активатор плазминогена урокиназного типа УК (урокиназа) является внеклеточной'протеазой; принадлежащей к семейству сериновых протеаз[202]. Урокиназа с высокой специфичностью расщепляет плазминоген, переводя' его тем. самым в плазмин. В организме человекам урокиназа1 секретируется различными; типами; клеток — моноцитами/макрофагами: [199], опухолевыми клетками [226]; фибробластами: [74], гладкомышечными клетками: [59] и эндотелиальными клетками [175]. Среднее содержание урокиназы в плазме* человека составляет 5-10 мкг/л [241].

1.1; Структура урокиназы

Урокиназа секретируется; в виде гликозилированного малоактивного* одноцепочечного белка (оцУК), состоящего из 411 аминокислотных остатков. ВI ее структуре выделяют три домена: ростовой; домен, гомологичный по структуре эпидермальному фактору роста РД (1-48, а.о.), крингл-домен КД (49131, а.о.), конекшен пептид КП (132-158, а.о.) и протеолитический домен ПД (Рис. 1). Исторически' РД-КД-КП принято называть аминоконцевым фрагментом (АКФ).

Трехмерная: структура аминоконцевого фрагмента урокиназы (АКФ) была, определена; с помощью ЯМР [100]; и методом ренгеноструктурного анализа [22] (Рис. 2)1 По данным ЯМР во вторичной структуре ростового домена выделяют две области, состоящие: из (З-слоев, и три: из (З-изгибов. |3-изгибы: тип Г изгиб Leu14-Gln17, тип 1 изгиб Pro34-F37, тип II '|3-изгиб Gly39-Cys42. Один двухнитевой (3-слой сформирован остатками: Thr18-Ser21 и His29-Asn32,

Ч « ' Ч Л i I I * второй небольшой сформирован остатками? Phe -Gly и lie -Asp . Несмотря

18 на то, что у ростового домена нет гидрофобной; сердцевины; остатки Thr , Val" , Trp , и Asn" сгруппированы на одной- стороне |3-слоя. Еще один ключевой контакт находится: между Gin40 и Leu14. Gin40 формирует выступ между концом крингл-домен

Р dTmgr р

С кл LC WVH > QQt TIЕ N Q170

Т S eot; U0Kp ПО RR Y GEF F

О \ \ D < \

B H NKYFS " E г™' ■ 190 SG RY

О о J NN MC-YJ00 oLA^ tQ T LSGd,VYTVSG RR - V 2v GG I Gr v ,Q R J ^ R H1fm s N t D С ■( PS 2704 PC \ in c u С T ' м F Ar-XCW S Y

Д К К pcN SK Y '«KEN CRc Vfa» « N L y> м >си "WV

H TH SHF V J lh. VTM L Ev ,K Vs G CDSG Sh 33 MYVGs I N g"EE RtVv Rc ° R OP E В Lim li°A 390 c 4L»c-t .» EcQ V HN T

340 250L Y протеолитический домен r°AS о

Рисунок 1. Структура урокиназы. Урокиназа представлена в виде последовательности а.о., состоящей из ростового домена (1-48 аминокислотные остатки (а.о.)), обозначен синем цветом, крингл-домена (49-131 а.о.), обозначен оранжевым цветом; конекшен пептид (132-158 а.о.), обозначен желтым цветом; и протеолитического домена (136-411 а.о.), обозначен зеленым цветом. Красным обозначены His204/Asp~'5/Ser35f> а.о. активного центра протеолитического домена. обратного изгиба и второй нитью меньшего (3-слоя. Это взаимодействие с Leu1 способствует закреплению ориентации С-конца, района двойного изгиба по отношению к большему р-слою. Отличительным структурным элементом в ростовом домене является П-петля, состоящая из семи остатков, соединяющая две нити большего р-слоя. В этой петле боковые цепи Asn , Phe" и Пе~ обращены внутрь и сгруппированы к центру петли, а боковые цепи

Lys23, Туг24,

Ser" и Asn наружу.

Крингл-домен состоит из одного анти параллельного (3-слоя, двух небольших участков, подобных р-слою, двух коротких спиралей и нескольких

РД

КД - .о5Ь

О—'

4 \ v

Ф ь рд лЖл

Рисунок 2. Структура АКФ. Ленточная модель в виде набора стрелок ф-слои), указывающих на карбокси-терминальны и конец цепи, а, б) структура, полученная с помощью Я MP (pdb 1URK); в, г) структура, полученная методом рентгеноструктурного анализа (pdb 219А). обратных изгибов. Двухнитевой (3-слой сформирован остатками Proni-Val"7 и Lysl20-Cys126, соединенными обратным изгибом. Участки, подобные [З-слою сформированы участками: первый Thr^-Asp65 и Arg69-Pro70, второй Рго73-Тгр74 и

99 100 77 Й?

His -Asn . а-спираль образована основаниями Ala -Gin . В этой спирали

77 7Й W1 * 79

Ala , Thr , Gin и Gin ~ ориентированы к растворителю, в то время как Val и ол

Leu' от растворителя и скомпонованы против гидрофобной сердцевины крингл-домена. Это гидрофобная сердцевина образована рядом ароматических и алифатических боковых цепей, включающих: Тгр74, Туг84, Leu94, Leu96, Tip112, и Туг114. Второй спиральный участок представлен остатками Asp90-Leu94. Изгиб

I типа образован остатками Pro73-Ser76 и Asn,04-Asn107. Нерегулярно образованный изгиб включает пентапептид Asp65-Arg69. Две центральные

1 J -J I ПЛ « О/" дисульфидные связи Cys -Cys и Cys "-Cys " расположены ортогонально друг к другу на вершине гидрофобной сердцевины. Кроме того, по данным ЯМР[100] ростовой и кринг- домены структурно независимы. При изучении динамики поведения аминоконцевого фрагмента урокиназы в растворе было получено[99], что упорядоченность ростового домена несколько ниже, чем у большинства хорошо структурированных доменов, это может объясняться отсутствием гидрофобной сердцевины, которая поддерживает отдельные элементы вторичной структуры в определенном положении. Причем структурный элемент, ответственный за взаимодействие с урокиназным рецептором, Q-петля (Asrf~-Ile~ ), испытывает большое количество внутреннего движения, которое должно уменьшаться при взаимодействии с рецептором. По данным рентгеноструктурного анализа между доменами наблюдалось взаимодействие. Боковые цепи Leu14 и Leu92 вовлечены в близкие гидрофобные контакты, а боковая цепь Не44 заполняет гидрофобный карман, образованный Lys61, His99 и Туг101. Кроме того, карбонильная группа основной цепи Arg формирует короткую водородную связь с амидной группой Asp45 (2.88 A), Asp45 (3-карбоксильная группа вовлечена в систему водородных связей с амидной группой основной цепи Ser47 (3.39 А) и Lys48 (3.22 А). Ввиду того, что эти связи сохраняются и при взаимодействии АКФ с урокиназным рецептором, и относительная ориентация доменов АКФ при взаимодействии с рецептором не изменяется, авторы пришли к выводу, что молекула АКФ менее подвижна, чем было получено методом ЯМР. Однако, вероятнее всего, молекула АКФ находится в динамическом равновесии между несколькими состояниями: 1 — домены независимы друг от друга и 2 — кратковременное взаимодействие доменов, запечатленное в кристалле. Тем более что структура белка в растворе более физиологична, чем законсервированная структура белка в кристалле.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Белоглазова, Ирина Борисовна

ВЫВОДЫ

Синтезированы, очищены и охарактеризованы рекомбинантные формы урокиназы человека в клетках Escherichia coli. Изучено связывание этих белков с природным рецептором урокиназы (uPAR/CD87) из клеток U937, а также с рекомбинантным рецептором полученным в клетках Drosophila Schneider S2. Физиологические эффекты этих форм белка, кинетика, а также стехиометрия связывания свидетельствуют о том, что структура ростового домена сходна со структурой этого домена в урокиназе из эукариотических клеток. Методами кругового дихроизма, измерения флуоресценции триптофана при плавлении белка, а также двумерного ЯМР в рекомбинантных формах урокиназы при физиологических значениях рН не удалось выявить вторичной структуры у ростового домена, в то время как в крингл-домене все перечисленные методы обнаруживают выраженную вторичную структуру.

Методом ЯМР показано, что во взаимодействии аминоконцевого фрагмента урокиназы с урокиназным рецептором принимает участие только ростовой домен. При взаимодействии аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором, структура ростового домена не приобретала упорядоченности, характерной для кристаллической структуры комплекса аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором.

Предложен новый механизм взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором, согласно которому р-слои в ростовом домене не являются необходимым элементом для взаимодействия с урокиназным рецептором, а обязательным и достаточным условием для взаимодействия с рецептором является наличие Q-петли в ростовом домене.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоглазова, Ирина Борисовна, Москва

1. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Калинина Н.И., Бибилашвили Р.Ш., Бобик А., Ткачук В.А. Урокиназный активатор плазминогена стимулирует развитие экспериментального рестеноза// Кардиология -2000. №. 9. - С. 69-77.

2. Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Перспективы генной терапии сердечнососудистых заболеваний// Вопросы медицинской химии 2000 - № 3.

3. Степанова В.В. и Ткачук В.А. Урокиназа как мультидоменный белок и полифункциональный регулятор клеток// Биохимия 2002. - № 67. — С. 127-138.

4. Степанова В.В., Белоглазова И.Б., Гурский Я.Г., Бибилашвили Р.Ш., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Взаимодействия между крингл и ростовым доменами в молекуле урокиназы: возможная роль в стимуляции хемотаксиса клеток// Биохимия 2008. - № 73. - С. 311 - 321.

5. Aguirre Ghiso J.A. Inhibition of FAK signaling activatedby urokinase receptor induces dormancy in human carcinomacells in vivo// Oncogene — 2002. V.21. - P. 2513-2524.

6. Alfano D., Franco P., Vocca I., Gambi N., Pisa V., Macini A., Caputi M., Cariro M.V., Iaccarino I., Stoppelli M.P. The urokinase plasminogen activatorand its receptor: role in cell growth and apoptosis// Thromb. Haemost. 2005. -V.93.-P. 205-211.

7. Alfano D., Iaccarino I., Stoppelli M.P. Urokinase signaling through its receptor protects against anoikis by increasing BCL-xL expression levels// J. Biol. Chem. 2006. - V.281. - P. 17758-17767.

8. Almholt K., Lund L.R., Rygaard J., Nielsen B.S., Dan0 K., Rjamer J., Johnsen M. Reduced metastasis of transgenic mammary cancer in urokinase-deficient mice//Int. J. Cancer-2005.-V.l 13. P. 525-532.

9. Andrade-Gordon P., Strickland S. Interaction of heparin with plasminogen activators and plasminogen: effects on the activation of plasminogen// Biochemistry 1986. - V.25. - P. 4033-4040.

10. Andreasen P.A., Egelund R., Petersen H.H. The plasminogen activation system in tumor growth, invasion, and metastasis// Cell Mol. Life Sci. 2000. -V.57.-P. 25-40.

11. Andreasen P.A., Kjoller L., Christensen L., Duffy MJ. The urokinase-type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review// Int. J. Cancer — 1997.-V.72.-P. 1-22.

12. Apella E., Robinson E.A., Ullrich S.J. The receptor-binding sequence of urokinase: a biological function for the growth factor module of proteases// J. Biol. Chem. 1987. - V. 262 - P. 4437-4440.

13. Appella E., Weber I.T., Blasi F. Structure and function of epidermal growth factor-like regions in proteins// FEBS Lett. 1988. - V.231. - P. 1-4.

14. Arens N., Gandhari M., Bleyl U. and Hildenbrand R. In vitro supression of urokinase plasminogen activator in breast cancer cells a comparison of two antisense strategies// Int. J. Oncol. - 2005. - V.26. - P. 113- 119.

15. Barinka С., Рапу G., Callahan J., Shaw D.E., Kuo A., Bdeir K., Cines D.B., Mazar A. Lubkowski J. Structural Basis of Interaction between Urokinase-type Plasminogen Activator and its Receptor// J. Mol. Biol. 2006. - V. 363. -P. 482-495.

16. Barlati S., De Petro G., Bona C., Paracini F., Tonelli M. Phosphorylation of human plasminogen activators and plasminogen// FEBS Lett. 1995. —V.363. -P. 170-174.

17. Barlow G.H., Francis C.W., Marder V.J. On the conversion of high molecular weight urokinase to the low molecular weight form by plasmin// Thromb. Res. 1981. - V.23. - P. 541-547.

18. Barnhart B.C., Legembre P., Pietras E., Bubici C., Franzoso G., Peter M.E. CD95 ligand induces motility and invasiveness of apoptosis-resistant tumor cells// EMBO J. 2004. - V.23. - P. 3175-3185.

19. Bdeir K., Kuo A., Sachais B.S., Rux A.H., Bdeir Y., Mazar A., Higazi A.A., Cines D.B. The kringle stabilizes urokinase binding to the urokinase receptor// Blood 2003. - V. 15. - P. 3600-3608.

20. Beck J.M., Preston A.M., Gyetko M.R. Urokinase-type plasminogen activator in inflammatory cell recruitment and host defense against Pneumocystis carinii in mice// Infect. Immun. 1999. - V.67. - P. 879-884.

21. Behrendt N., Dano K. Effect of purified, soluble urokinase receptor on the plasminogen-prourokinase activation system// FEBS Lett. - 1996. - V.393. -P. 31-36.

22. Behrendt N., Ploug M., Patthy L., Houen G., Blasi F., Dano K. The ligand-binding domain of the cell surface receptor for urokinase-type plasminogen activator// J. Biol. Chem. 1991. - V.266. - P. 7842-7847.

23. Behrendt N., Ronne E., Ploug M., Petri Т., Lober D.,Nielsen L. S. The human receptor for urokinase plasminogen activator. NH2-terminal amino acid sequence and glycosylation variants// J. Biol. Chem. — 1990. -V. 265. P. 6453-6460.

24. Berjanskii M.V., Neal S., Wishart D.S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints// Nucleic Acids Res. — 2006. -V.34. P. 63-69.

25. Besser D., Presta M., Nagamine Y. Elucidation of a signalling pathway induced by FGF-2 leading to uPA gene expression in NIH 3T3 fibroblasts// Cell Growth Differ. 1995. - V.6. - P. 1009-1017.

26. Besser D., Verde P., Nagamine Y., Blasi F. Signal transduction and the u-PA/u-PAR system// Fibrinolysis 1996. - V.10. - P . 215-237.

27. Binder B.R., Mihaly J., Prager G.W. uPAR-uPA-PAI-1 interactions and signaling: a vascular biologist's view//Thromb. Haemost. 2007. - V. 97. — P. 336-42.

28. Bogusky M.J., Dobson C.M., Smith A.G. Reversible Independent Unfolding of the Domains of Urokinase Monitored by 'H NMR// Biochemistry — 1989. -V.28.-P. 6728-6735.

29. Bonni A., Brunet A., West A.E., Datta S.R., Taksu M.A., Greenberg M.E. Cell survival promoted by the ras-MAPK signaling pathway bytranscriptiondependent and -independent mechanisms// Science 1999. - V.286. - P. 1358-1362.

30. Buko A.M., Kentzer E.J., Petros A., Menon G., Zuiderweg E.R., Sarin V.K. Characterization of a posttranslational fucosylation in the growth factor domain of urinary plasminogen activator// Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1991.-V.88. P. 3992-3996.

31. Busso N., Masur S.K., Lazega D., Waxman S., Ossowski L. Induction of cell migration by pro-urokinase binding to its receptor: possible mechanism for signal transduction in human epithelial cells// J. Cell Biol. 1994. - V.126. -P. 259-270.

32. Carlin S.M., Resink T.J., Taram M., Roth M. Urokinase signal transduction and its role in cell migration// FASEB J. 2005. - V. 19. - P. 195-202.

33. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease// Nat. Med. 2003. - V.9. -P. 653-660.

34. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis// Nat. Med. -2000.-V.6.-P. 389-395.

35. Carmeliet P. VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer// Oncology — 2005.-V.69.-P. 4-10.

36. Carmeliet P., Collen D. Genetic analysis of the plasminogen and coagulation system in mice// Haemost 1996 - V.26. - P. 132.

37. Carmeliet P., Moons L., Hebert J.-M., Crawley J., Lupu F., Lijnen R., Collen R. Urokinase but not tissue plasminogen activator mediates arterial neointima formation in mice// Circulation Research 1997. - V.81. - P. 829-839.

38. Carmeliet P., Schoonjans L., Kieckens L., Ream В., Degen J., Bronson R., De Vos R., van den Oord J.J., Collen D., Mulligan R.C. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice// Nature 1994.-V.368.-P. 419-424.

39. Cavanagh J., Fairbrother W.J., Palmer A.G., Skelton N.J. Protein NMR spectroscopy: principles and practice// Academic Press.2nd ed. San Diego, USA.-2006.

40. Chambers A.F., Matrisian L.M. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis// J. Natl. Cancer Inst. 1997. - V.89. - P. 1260-1270.

41. Chandrasekar N., Mohanam S., Gujrati M., Olivero W.C., Dinh D.H., Rao J.S. Downregulation of uPA inhibits migration and PI3k/Akt signaling in glioblastoma cells// Oncogene 2003. - V.22. - P. 392-400.

42. Chang A.W., Kuo A., Barnathan E.S., Okada S.S. Urokinase receptor-dependent upregulation of smooth muscle cell adhesion to vitronectin by urokinase// Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1998. - V.18. -P. 1855-1860.

43. Chang J.Y., Schindler P., Ramseier U., Lai P.H. The disulfide folding pathway of human epidermal growth factor// J. Biol. Chem. 1995. -V.270. -P. 9207-9216.

44. Chapman H.A. Plasminogen activators, integrins, and the coordinated regulation of cell adhesion and migration// Curr. Opin. Cell Biol. 1997. — V.9.-P. 714-724.

45. Clowes A.W., Clowes M.M., Au Y.P., Reidy M.A., Belin D. Smooth muscle cells express urokinase during mitogenesis and tissue-type plasminogen activator during migration in injured rat carotid artery// Circ. Res. — 1990. -V. 67.-P. 61-67.

46. Conese M., Olson D., Blasi F. Protease nexin-1-urokinase complexes are internalized and degraded through a mechanism that requires both urokinase receptor and alpha 2-macroglobulin receptor// J. Biol. Chem. 1994. - V.269. -P. 17886-17892.

47. Cubellis M.V., Nolli M.L., Cassani G., Blasi F. Binding of single-chain pro-urokinase to the urokinase receptor of human U937 cells// J. Biol. Chem. -1986.-V.261.-P. 15819-15822.

48. Cubellis M.V., Wun T.C., Blasi F. Receptor-mediated internalization and degradation of urokinase is caused by its specific inhibitor PAI-1// EMBO J. -1990.-V.9.-P. 1079-1085.

49. Cunningham O., Andolfo A., Santovito M.L., Iuzzolinol L., Blasi F., Sidenius N. Dimerization controls the lipid raft partitioning of uPAR/CD87 and regulates its biological functions// The EMBO Journal — 2003. V.22. — P. 5994-6003.

50. Dano K., Andreasen P.A., Grondahl-Hansen J., Kristensen P., Nielsen L.S., Skriver L. Plasminogen activators, tissue degradation, and cancer// Adv. Cancer Res. 1985. - V.44. - P. 139-266.

51. Dan0 К., Behrendt N., Bru'nner N., Ellis V., Ploug M., Руке С. The urokinase receptor: protein structure and role in plasminogen activation and cancer invasion// Fibrinolysis 1994. - V.8. - P. 189.

52. Dan0 K., R^mer J., Nielsen B.S., Bj0rn S., Руке С., Rygaard J., Lund L.R. Cancer invasion and tissue remodeling — cooperation of protease systems and cell types//APMIS 1999. - V.107. - P. 120-127.

53. Dass K., Ahmad A., Azmi A.S., Sarkar S.H., Sarkar F.H. Evolving role of uPA/uPAR system in human cancers// Cancer Treatment Reviews 2008. -V. 34.-P. 122- 136.

54. Degen J.L., Estensen R.D., Nagamine Y., Reich R. Induction and desensitization of plasminogen activator gene expression by tumor promoters//J. Biol. Chem. 1985. - V.260. - P. 12426-12433.

55. Deng G., Curriden S.A., Wang S., Rosenberg S., Loskutoff D.J. Is plasminogen activator inhibitor-1 the molecular switch that governs urokinase receptor-mediated cell adhesion and release?// J. Cell Biol. 1996. — V.134. -P. 1563-1571.

56. Deng G., Royle G., Seiffert D., Loskutoff D.J. The PAI-1/vitronectin interaction: two cats in a bag?// Thromb. Haemost. — 1995. —V.74. — P. 66-70.

57. Dumler I., Kopmann A., Weis A., Mayboroda O.A., Wagner K., Gulba D.C., Haller H. Urokinase activates the Jak/Stat signal transduction pathway in human vascular endothelial cells// Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999. — V.19.-P. 290-297.

58. Dumler I., Weis A., Mayboroda O.A., Maasch C., Jerke U., Haller H., Gulba D.C. The Jak/Stat pathway and urokinase receptor signaling in human aortic vascular smooth muscle cells//J. Biol. Chem. 1998. - V.273. - P. 315-321.

59. Eaton D.L., Scott R.W., Baker J.B. Purification of human fibroblast urokinase proenzyme and analysis of its regulation by proteases and protease nexin// J. Biol. Chem. 1984. - V. 259. - P. 6241-6247.

60. Ehrlich H.J., Keijer J., Preissner K.T., Gebbink R.K., Pannekoek H. Functional interaction of plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) and heparin// Biochemistry 1991. - V.30. - P. 1021-1028.

61. Ellis V., Wun T.C., Behrendt N., Ronne E., Dano K. Inhibition of receptor-bound urokinase by plasminogen-activator inhibitors// J. Biol. Chem. 1990. -V.265.-P. 9904-9908.

62. Estreicher A., Wohlwend A., Belin D., Schleuning W.D., Vassalli J.D. Characterization of the cellular binding site for the urokinase-type plasminogen activator// J. Biol. Chem. 1989. - V.264. - P. 1180-1189.

63. Fazioli F., Resnati M., Sidenius N., Higashimoto Y., Appella E., Blasi F. A urokinase-sensitive region of the human urokinase receptor is responsible for its chemotactic activity// EMBO J. 1997. - V.l6. - P. 7279-7286.

64. Felez J. Plasminogen binding to cell surfaces// Fibrinolysis Proteolysis — 1998.-V.12.-P. 183-189.

65. Fidler I.J., Ellis L.M. The implication of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis// Cell 1994. - V.79. - P. 185-188.

66. Frame M.C., Fincham V.J., Carragher N.O., Wyke J.A. v-Src's hold over actin and cell adhesions// Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. - V.3. - P. 233245.

67. Furlan F., Orlando S., Laudanna C., Resnati M., Basso V., Blasi F., Mondino A. The soluble D2D3(88-274) fragment of the urokinase receptor inhibits monocyte chemotaxis and integrin-dependent cell adhesion// J. Cell Sci. — 2004.-V.117.-P. 2909-2916.

68. Galis Z.S., Johnson C., Godin D., Magid R., Shipley J.M., Senior R.M., Ivan E. Targeted disruption of the matrix metalloproteinase-9 gene impairs smooth muscle cell migration and geometrical arterial remodeling// Circ. Res. 2002. -V.91.-P. 852-859.

69. Gandhari M., Arens N., Majety M., Dorn-Beineke A., Hildenbrand R. Urokinase-type plasminogen activator induces proliferation in breast cancer cells// Int. J. Oncol. 2006. - V.28. - P. 1463-1470.

70. Goldberg G.I., Frisch S.M., He C., Wilhelm S.M., Reich R., Collier I.E. Secreted proteases. Regulation of their activity and their possible role in metastasis// Ann. NY Acad. Sci. 1990. -V.580. - P. 375-384.

71. Gonias S.L., Wu L., Salicioni A.M. Low density lipoprotein receptor-related protein: regulation of the plasma membrane proteome// Thromb. Haemostasis -2004.-V.91.-P. 1056-1064.

72. Goretzki L., Mueller B.M. Low-density-lipoprotein-receptor-related protein (LRP) interacts with a GTP-binding protein// Biochem. J. 1998. - V.336. -P. 381-386.

73. Giintert P. Automated NMR protein structure calculation// Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2003. - V.43. - P. 105-125.

74. Gyetko M.R., Sitrin R.G., Fuller J.A., Todd R.F. 3rd, Petty H., Standiford T.J. Function of the urokinase receptor (CD87) in neutrophil chemotaxis// J. Leukoc. Biol. 1995. - V.58. - P. 533-538.

75. Hansen A.P., Petros A.M., Meadows R.P., Fesik S.W. Backbone dynamics of a two-domain protein: 15N relaxation studies of the amino-terminal fragment of urokinase-type plasminogen activator// Biochemistry — 1994. -V.33.-P. 15418-15424.

76. Herz J., Clouthier D.E., Hammer R.E. LDL receptor-related protein internalizes and degrades uPA-PAI-1 complexes and is essential for embryo implantation//Cell 1992.-V.71.-P. 411-421.

77. Herz J., Strickland D.K. LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor// J. Clin. Invest. 2001. - V.108. - P. 779-784.

78. Higazi A.A., Bdeir K., Hiss E., Arad S., Kuo A., Barghouti I., Cines D.B. Lysis of plasma clots by urokinase-soluble urokinase receptor complexes// Blood 1998. - V.92. - P. 2075-2083.

79. Horrevoets A.J., Smilde A., de Vries C., Pannekoek H. The specific roles of finger and kringle 2 domains of tissue-type plasminogen activator during in vitro fibrinolysis// J. Biol. Chem. 1994. -V.269. -P. 12639-12644.

80. Howell B.W., Gertler F.B., Cooper J.A. Mouse disabled (mDabl): a Src binding protein implicated in neuronal development// EMBO J. 1997. -V.16. - P. 121-132.

81. Hoyer-Hansen G., Ploug M., Behrendt N., Ronne E., Dano K. Cell-surface acceleration of urokinase-catalyzed receptor cleavage// Eur. J. Biochem. — 1997.-V.243.-P. 21-26.

82. Hoyer-Hansen G., Ronne E., Solberg H., Behrendt N., Ploug M., Lund L.R., Ellis V., Dano K. Urokinase plasminogen activator cleaves its cell surface receptor releasing the ligand-binding domain// J. Biol. Chem. 1992. — V.267.-P. 18224-18229.

83. Huai Q., Mazar A.P., Kuo A., Parry G.C., Shaw D.E., Callahan J. Structure of human urokinase plasminogen activator in complex with its receptor// Science 2006. - V.311. - P. 656-659.

84. Huai Q., Zhou A., Lin L., Mazar A.P., Parry G.C., Callahan J., Shaw D.E., Furie В., Furie B.C., Huang M. Crystal structures of two human vitronectin, urokinase and urokinase receptor complexes// Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. -V.15.-P. 422-423.

85. Ichinose A., Fujikawa K., Suyama T. The activation of pro-urokinase by plasma kallikrein and its inactivation by thrombin// J. Biol. Chem.- 1986.-V.261.-P. 3486-3489.

86. Irigoyen J.P., Munoz-Canoves P., Montero L., Koziczak M., Nagamine Y. The plasminogen activator system: biology and regulation// Cell Mol. Life Sci. 1999. - V.56. - P. 104-132.

87. Jo M., Thomas K.S., O'Donnell D.M., Gonias S.L. Epidermal growth factor receptor-dependent and -independent cell-signaling pathways originating from the urokinase receptor// J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P. 1642-1646.

88. Johnsen M., Lund L.R., Romer J., Almholt K., Dano K. Cancer invasion and tissue remodeling: Common themes in proteolytic matrix degradation// Curr. Opin. Cell Biol. 1998.-V.10.-P. 667-671.

89. Kanse S.M., Kost C., Wilhelm O.G., Andreasen P.A., Preissner K.T. The urokinase receptor is a majorvitronectin-binding protein on endothelial cells// Exp. Cell Res. 1996. - V.224. - P. 344-53.

90. Kasai S., Arimura H., Nishida M., Suyama T. Primary structure of single-chain pro-urokinase// J. Biol. Chem. 1985b. - V. 260. - P. 12382-12389.

91. Khwaja A., Rodriguez-Viciana P., Wennstrom S., Warne P.H., Downward J. Matrix adhesion and Ras transformation both activate a phosphoinositide 3-OH kinase and protein kinase B/Akt cellular survival pathway// EMBO J. -1997. V.l6. - P. 2783-2793.

92. Kirchheimer J.C., Wojta J., Christ G., Binder B.R. Functional inhibition of endogenously produced urokinase decreases cell proliferation in a human melanoma cell line// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. - V.86. - P. 54245428.

93. Kirchheimer J.C., Wojta J., Christ G., Hienert G. and Binder B.R. Mitogenic effect of urokinase on malignant and unaffected adjacent human renal cells// Carcinogenesis 1988. - V.9. - P. 2121-2123.

94. Kiyan J., Kiyan R., Haller H., Dumler I. Urokinase-induced signaling in human vascular smooth muscle cells is mediated by PDGFR-b// The EMBO Journal -2005.-V.24.-P. 1787-1797.

95. Kjaergaard M., Hansen L.V., Jacobsen В., Gardsvoll H., Ploug Structure and ligand interactions of the urokinase receptor (uPAR)// Frontiers in Bioscience 2008. - V. 13-P. 5441-61.

96. Kj0ller L., Hall A. Rac Mediates Cytoskeletal Rearrangements and Increased Cell Motilitylnduced by Urokinase-type Plasminogen Activator Receptor Bindingto Vitronectin//J. Cell Biol. 2001. - V. 152.-P. 1145-1157.

97. Kline T.P., Brown F.K., Brown S.C., Jeffs P.W., Kopple K.D., Mueller L. Solution structures of human transforming growth factor alpha derived from 1HNMR data//Biochemistry 1990.-V.29.-P. 7805-7813.

98. Koopman J.L., Slomp J., Anton C.W., de Bart W, Quax P.H.A., Verheijen J.H. Mitogenic effects of urokinase on melanoma cells are independent of high affinity binding to the urokinase receptor// J. Biol. Chem. 1998. -V.273.-P. 33267-33272.

99. Kounnas M.Z., Henkin J., Argraves W.S., Strickland D.K. Low density lipoprotein receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor mediates cellular uptake of pro-urokinase// J. Biol. Chem. 1993. - V.268. - P. 21862-21867.

100. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature 1970. - V.227. - P. 680-685.

101. Lenich C., Pannell R., Henkin J., Gurewich V. The influence of glycosylation on the catalytic and fibrinolytic properties of pro-urokinase// Thromb. Haemost. 1992. - V.68. - P. 539-544.

102. Letunic I., Copley R.R., Schmidt S., Ciccarelli F.D.,Doerks Т., Schultz J., Ponting C.P., Bork P. SMART 4.0: towards genomic data integration// Nucleic Acids Res. 2004. - V.32. - P. 142-144.

103. Lijnen H.R., Lupu F., Moons L., Carmeliet P., Goulding D., Collen D. Temporal and topographic matrix metalloproteinase expression after vascular injury in mice// Thromb. Haemost. 1999. - V.81. - P. 799-807.

104. Lijnen H.R., Maquoi E., Hansen L.B., Van Hoef В., Frederix L., Collen D. Matrix metalloproteinase inhibition impairs adipose tissue development in mice// Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002. - V.22. - P. 374-379.

105. Llinas P., Le Du M.H., Gardsvoll H., Dano K., Ploug M., Gilquin В., Stura E.A., Menez A. Crystal structure of the human urokinase plasminogen activator receptor bound to an antagonist peptide// EMBO J. 2005. - V.24. -P.1655-1663.

106. Ma Z., Thomas K.S., Webb D.J., Moravec R., Salicioni A.M., Mars W.M., Gonias S.L. Regulation of Racl activation by the low density lipoprotein receptor-related protein//J. Cell Biol. 2002. - V. 159. - P. 1061-1070.

107. Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.J., Sambrook J.F. Serpin-resistant mutants of human tissue-type plasminogen activator// Nature 1989. - V.339. - P. 721-724.

108. Madsen C.D., Ferraris G.M., Andolfo A., Cunningham O., Sidenius N. uPAR-induced cell adhesion and migration: vitronectin provides the key// J. Cell Biol. 2007. - V. 177. - P. 927-939.

109. Maksimenko A.V. and Tishenko E.G. Macromolecular ensembles of internal and external fibrinolysis: the resources for enhancement of thrombolysis efficacy// Current Medical Chemistry 2006. - V.l3. - P. 1617-1625.

110. Markotte P.A., Kozan I.M., Dorwin S.A., Ryna J.M. The matrix metalloproteinase pump-1 catalyzes the formation of low molecular weigth (pro)urokinase in cultures of human kidney cells// J. Biol. Chem. 1992. -V.267. - P. 13803-13806.

111. Mazar A.P., Buko A., Petros A., Barnathan E.S., Henkin J. Domain analysis of urokinase plasminogen activator (u-PA): preparation and characterization of intact A-chain molecules// Fibrinolysis 1992. - V.6. - P. 49-55.

112. McLean J.W., Tomlinson J.E., Kuang W.-J., Eaton D.L., Chen E.Y., Fless G.M., Scanu A.M., Lawn R.M. cDNA sequence of human apolipoprotein(a) is homologous to plasminogen// Nature 1987. - V.230 - P. 132-137.

113. Miles L.A., Dahlberg C.M., Levin E.G., Plow E.F. Gangliosides interact directly with plasminogen and urokinase and may mediate binding of these fibrinolytic components to cells// Biochemistry 1989. - V.28. - P. 93379343.

114. Mimuro J., Kaneko M., Murakami Т., Matsuda M., Sakata Y. Reversible interactions between plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1// Biochemica et Biophysica Acta.- 1992. V.l 160. - P. 325-334.

115. Moller L.B., Pollanen J., Ronne E., Pedersen N., Blasi F. N-linked glycosylation of the ligand binding domain of the human urokinase receptor contributes to the affinity for its ligand// J. Biol. Chem. 1993. -V.268. - P. 11152-11159.

116. Mottonen J., Strand A., Symersky J., Sweet R.M., Danley D.E., Geoghegan K.F., Gerard R.D., Goldsmith E.J. Structural basis of latency in plasminogen activator inhibitor-. // Nature 1992. - V.355. - P.270-273.

117. Nagamine Y., Sudol M., Reich E. Hormonal regulation of plasminogen activator mRNA production in porcine kidney cells// Cell 1983. - V.32. - P. 1181-1190.

118. Nanbu R., Menoud P.-A., Nagamine Y. Multiple instability-regulating sites in the 3'untraslated region of the urokinase-type plasminogen activator mRNA// Mol. Cell. Biol. 1994. - V.14. - P. 4920-4928.

119. Nykjaer A., Conese M., Christensen E.I., Olson D., Cremona O., Gliemann J., Blasi F. Recycling of the urokinase receptor upon internalization of the uPA:serpin complexes// EMBO J. 1997. - V.l6. - P. 2610-2620.

120. Oda M., Shiraishi A., Hasegawa M. Analysis of the ternary complex formation of human urokinase with the separated two domains of its receptor// Eur. J. Biochem. 1998. - V.256. - P. 411-418.

121. Odekon L.E., Blasi F., Rifkin D.B. Requirement for receptor-bound urokinase in plasmin-dependent cellular conversion of latent TGF-beta to TGF-beta// J. Cell. Physiol. 1994. - V.158. - P. 398-407.

122. Odekon L.E., Sato Y., Rifkin D.B. Urokinase-type plasminogen activator mediates basic fibroblast growth factor-induced bovine endothelial cell migration independent of its proteolytic activity// J. Cell Physiol. — 1992. -V.l50.-P. 258-263.

123. Okada S.S., Grobmyer S.R., Barnathan E.S. Contrasting effects of plasminogen activators, urokinase receptor, and LDL receptor-related protein on smooth muscle cell migration and invasion// Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.- 1996. V.l 6.-P. 1269-1276.

124. Okada S.S., Tomaszewski J.E., Barnathan E.S. Migrating vascular smooth muscle cells polarize cell surface urokinase receptors after injury in vitro// Exp. Cell Res. 1995. - V.217. - P. 180-187.

125. Ossowski L., Aguirre Ghiso J., Liu D., Yu W., Kovalski K. The role of plasminogen activator receptor in cancer invasion and dormancy. Medicina// 1999. V.59.-P. 547-552.

126. Parsons J.T., Martin K.H., Slack J.K., Taylor J.M., Weed S.A. Focal adhesion kinase: a regulator of focal adhesiondynamics and cell movement// Oncogene -2000.-V. 19.-P. 5606-5613.

127. Pendurthi U.R., Tran T.T., Post M.5 Rao L.V. Proteolysis of CCN1 by Plasmin: Functional Implications// Cancer Res. 2005. - V.65. - P. 97059711.

128. Pepper M.S., Vassalli J.D., Montesano R., Orci L. Urokinase-type plasminogen activator is induced in migrating capillary endothelial cells// J. Cell Biol. 1987. - V.105 -P. 2535-2541.

129. Petersen L.C., Lund L.R., Nielsen L.S., Dano K., Skriver L. One-chain urokinase-type plasminogen activator from human sarcoma cells is a proenzyme with little or no intrinsic activity// J. Biol. Chem. 1988. - V.263. -P. 11189-11195.

130. Pluskota E., Soloviev D.A., Bdeir K., Cines D.B., Plow E.F. Integrin alphaMbeta2 orchestrates and accelerates plasminogen activation and fibrinolysis by neutrophils// J. Biol. Chem. 2004. - V.279. - P. 18063-72.

131. Poliakov A., Tkachuk V., Ovchinnikova Т., Potapenko N., Bagryantsev S., Stepanova V. Plasmin-dependent elimination of the growth-factor-like domain in urokinase causes its rapid cellular uptake and degradation// Biochem. 2001. - V.355. - P. 639-645.

132. Prager GW, Breuss J.M., Steurer S., Mihaly J., Binder B.R. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces rapid prourokinase (pro-uPA) activation on the surface of endothelial cells// Blood 2004. - V. 103. - P. 955-962.

133. Preissner K.T., Seiffert D. Role of vitronectin and its receptors in haemostasis and vascular remodeling// Thromb. Res. 1998. - V.89. - P. 1-21.

134. Rabbani S.A., Mazar A.P., Bernier S.M., Haq M., Bolivar I., Henkin J., Goltzman D. Structural requirements for the growth factor activity of the amino-terminal domain of urokinase// J. Biol. Chem. 1992. - V.267. — P. 14151-14156.

135. Ragno P. The urokinase receptor: a ligand or a receptor? Story of a sociable molecule// Cell. Mol. Life Sci. 2006. - V.63. - P. 1028-103 7.

136. Reidy M.A., Irvin C., Lindner V. Migration of arterial wall cells. Expression of plasminogen activators and inhibitors in injured rat arteries// Circ. Res. -1996.-V.78.-P. 405-414.

137. Reinartz J., Schafer В., Batrla R., Klein C.E., Kramer M.D. Plasmin abrogates av b5-mediated adhesion of a human keratinocyte cell line (HaCaT) to vitronectin// Exp. Cell Res. 1995. - V.220. - P. 274-282.

138. Resnati M., Guttinger M., Valcamonica S., Sidenius N., Blasi F., Fazioli F. Proteolytic cleavage of the urokinase receptor substitutes for the agonist-induced chemotactic effect//EMBO J. 1996. - V.15. -P. 1572-1582.

139. Resnati M., Pallavicini I., Wang J.M., Oppenheim J., Serhan C.N., Romano M., Blasi F. The fibrinolytic receptor for urokinase activates the Gproteincoupled chemotactic receptor FPRL1/LXA4R// PNAS 2002. - V.99. - P. 1359-1364.

140. Ried S., Jager C, Jeffers M., Vande Woude G.F., Graeff H., Schmitt M., Lengyel E. Activation mechanisms of the urokinase-type plasminogen activator promoter by hepatocyte growth factor/scatter factor// J. Biol. Chem.- 1999. V.274. - P. 16377-16386.

141. Rothberg K.G., Heuser J.E., Donzell W.C., Ying Y.S., Glenney J.R., Anderson R.G. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats// Cell 1992.- V.68. - P. 673-682.

142. Roztocil E., Nicholl S.M., Davies M.G. Mechanisms of kringle fragment of urokinase induced vascular smooth muscle cell migration// J. Surg. Res. — 2007.-V.141.-P. 83-90.

143. Saksela O., Hovi Т., Vaheri A. Urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor secreted by cultured human monocyte-macrophages// J. Cell Physiol.- 1985. -V. 122.-P. 125-32.

144. Saksela O., Rifkin D.B. Release of basic fibroblast growth factor-heparan sulfate complexes from endothelial cells by plasminogen activator-mediated proteolytic activity// J. Cell Biol. 1990. - V.l 10. - P. 767-775.

145. Salerno G., Verde P., Nolli M.L., Corti A., Szots H., Meo Т., Johnson J., Bullock S., Cassani G., Blasi F. Monoclonal antibodies to human urokinase identify the single-chain pro-urokinase precursor// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984.-V. 81.-P. 110-114.

146. Sato Y., Rifkin D.B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture// J. Cell Biol. 1989. - V.l09. -P. 309-315.

147. Schagger H. Nature protocols 2006. - V. 1 - P. 1.

148. Sidenius N., Andolfo A., Fesce R., Blasi F. Urokinase Regulates Vitronectin Binding by ControllingUrokinase Receptor Oligomerization// J. Biol. Chem. 2002 - V.277. - P. 27982-27990.

149. Sidenius N., Blasi F. Domain 1 of the urokinase receptor (uPAR) is required for uPAR-mediated cell binding to vitronectin// FEBS Lett. 2000. - V.470. -P. 40-46.

150. Simon D.I., Wei Y., Zhang L., Rao N.K., Xu H., Chen Z., Liu Q., Rosenberg S., Chapman H.A. Identification of a urokinase receptor-integrin interaction site. Promiscuous regulator of integrin function// J. Biol. Chem. 2000. — V.275.-P. 10228-10234.

151. Singh S., Singh U.P., Stiles J.K., Grizzle W.E., Lillard J.W. Jr. Expression and functional role of CCR9 in prostate cancer cell migration and invasion// Clin. Cancer Res. 2004. - V.l0. - P. 8743-8750.

152. Spraggonl G., Phillips C., Nowak U.K., Ponting C.P., Saunders D., Dobson C.M., Stuart D.I., Jones E.Y. The crystal structure of the catalytic domain of human urokinase-type plasminogen activator// Structure 1995. - V.3 - P. 681-691

153. Sprengers E.D., Kluft C. Plasminogen Activator Inhibitors// Blood. 1987. -V.69. - P. 381-387.

154. Stahl A. and Mueller B.M. The Urokinase-Type Plasminogen Activator Receptor, a GPI-linked Protein, Is Localized in Caveolae// The Journal of Cell Biology V. 129. - P. 335-344.

155. Stenflo J., Ohlin A.K., Owen W.G., Schneider W.J. beta-Hydroxyaspartic acid or beta-hydroxyasparagine in bovine low density lipoprotein receptor and in bovine thrombomodulin// J. Biol. Chem. 1988. - V.263. - P. 21-24.

156. Stephens R.W., Bokman A.M., Myohanen H.T., Reisberg Т., Tapiovaara H., Pedersen N., Grondahl-Hansen J., Llinas M., Vaheri, A. Heparin binding to the urokinase kringle domain// Biochemistry 1992. - V.31. - P. 7572-7579.

157. Stief T.W., Radtke K.P., Heimburger N. Inhibition of urokinase by protein C-inhibitor (PCI). Evidence for identity of PCI and plasminogen activator inhibitor 3// Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1987. - V.368. - P. 1427-1433.

158. Strickland D.K., Gonias S.L., Argraves W.S. Diverse roles for the LDL receptor family// Trends Endocrinol. Metab. 2002. - V. 13. - P. 66-74.

159. Stump D.C., Thienpont M., Collen D. Purification and characterization of a novel inhibitor of urokinase from human urine. Quantitation and preliminarycharacterization in plasma// J. Biol. Chem. 1986. - V.261. - P. 1275912766.

160. Swiercz R., Skrzypczak-Jankun E., Merrell M.M., Selman S.H., Jankun J. Angiostatic activity of synthetic inhibitors of urokinase type plasminogen activator// Oncol. Rep. 1999. - V.6. - P. 523-526.

161. Takahashi K., Kwaan H.C., Ikeo K., Koh E. Phosphorylation of a surface receptor bound urokinase-type plasminogen activator in a human metastatic carcinomatous cell line// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V.182. -P. 1466-1472.

162. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. -V.60.-P. 523-33.

163. Tkachuk V., Stepanova V., Little P.J., Bobik A. Regulation and role of urokinase plasminogen activator in vascular remodelling// Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1996. - V.23. - P. 759-765.

164. Todd R.F., Mizukami I.F., Vinjamuri S.D., Trochelman R.D., Hancock W.W., Liu D.Y. Human mononuclear phagocyte activation antigens// Blood Cells 1990.-V.16.-P. 167.

165. Ugwu F., Van Hoef В., Bini A., Collen D., Lijnen H.R. Proteolytic cleavage of urokinase-type plasminogen activator by stromelysin-1 (MMP-3)// Biochemistry 1998. - V.37. - P. 7231-7236.

166. Vassalli J.D., Baccino D., Belin D. A cellular binding site for the Mr 55,000 form of the human plasminogen activator, urokinase// J. Cell Biol. 1985. -V.00. - P. 86-92.

167. Wang Q., Shaltiel S. Distal hinge of plasminogen activator inhibitor-1 involves its latency transition and specificities toward serine proteases// BMC Biochem. 2003. - V.4. - P. 5.

168. Webb D.J., Nguyen D. H.D., Sankovic M., Gonias S.L. The very low density lipoprotein receptor regulates urokinase receptor catabolism and breast cancer cell motility in vitro// J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - P. 7412-7420.

169. Wei Y., Eble J.A., Wang Z., Kreidberg J.A., Chapman H.A. Urokinase receptors promote betal integrin function through interactions with integrin alpha3betal// Mol. Biol. Cell 2001. - V. 12. - P. 2975-2986.

170. Wei Y., Lukashev M., Simon D.I., Bodary S.C., Rosenberg S., Doyle M.V., Chapman H.A. Regulation of integrin function by the urokinase receptor// Science 1996.- V.273.-P.1551-1555.

171. Wei Y., Waltz D.A., Rao N., Drummond R.J., Rosenberg S., Chapman H.A. Identification of the urokinase receptor as an adhesion receptor for vitronectin//J. Biol. Chem. 1994. - V.269. - P. 32380-32388.

172. Wick W., Wagner S., Kerkau S., Dichgans J., Tonn J.C., Weller M. Bcl-2 promotes migration and invasivesness of human glioma cells// FEBS lett. -1998.-V.440.-P. 419-424.

173. Willnow Т.Е., Nykjaer A., Herz J. Lipoprotein receptors: new roles for ancient proteins//Nat. Cell Biol. 1999. - V.l. - P. 157-162.

174. Wun T.C., Schleuning W.D., Reich E. Isolation and characterization of urokinase from human plasma// J. Biol. Chem. 1982. - V.57. - P. 32763283.

175. Xue W., Kindzelskii A.L., Todd R.F. 3rd, Petty H.R. Physical association of complement receptor type 3 and urokinase- type plasminogen activator receptor in neutrophil membranes// J. Immunol. 1994. - V.152. - P. 46304640.

176. Xue W., Mizukami I., Todd R.F. 3rd, Petty H.R. Urokinase-type plasminogen activator receptors associate with betal and beta3 integrins of fibrosarcoma cells: dependence on extracellular matrix components// Cancer Res. — 1997. -V.57.-P. 1682-1689.

177. Yebra M., Goretzki L., Pfeifer M., Mueller B.M. Urokinase-type plasminogen activator binding to its receptor stimulates tumor cell migration by enhancing integrin-mediated signal transduction// Exp. Cell Res. 1999. - V.250. - P. 231-240.

178. Zhang F., Tom C.C., Kugler M.C., Ching T.T., Kreidberg J.A., Wei Y., Chapman H.A. Distinct ligand binding sites in integrin alpha3betal regulate matrix adhesion and cell-cell contact// J. Cell Biol. 2003. - V.l63. - P. 177188.

179. Ziegler A., Hagmann J., Kiefer В., Nagamine Y. Ca2+ potentiates cAMP-dependent expression of urokinase-type plasminogen activator gene through a calmodulin- and protein kinase C-independent mechanism// J. Biol. Chem. -1990. V.265. - P. 21194-21201.

180. Zini J.M., Murray S.C., Graham C.H., Lala P.K., Kariko K., Barnathan E.S., Mazar A., Henkin J., Cines D.B., McCrae K.R. Characterization of urokinase receptor expression by human placental trophoblasts// Blood 1992. - V.79. -P. 2917-2929.

Информация о работе

Белоглазова, Ирина Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль структуры ростового домена урокиназы во взаимодействии с урокиназным рецептором uPAR/CD87 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы