Ключевая роль крингл-домена в хемотактическом действии урокиназы

Мухина, Светлана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ключевая роль крингл-домена в хемотактическом действии урокиназы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ключевая роль крингл-домена в хемотактическом действии урокиназы"

РГб од

1 8 ДЕК

На правах рукописи

МУХИНА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

КЛЮЧЕВАЯ РОЛЬ КРИНГЛ-ДОМЕНА В ХЕМОТАКТИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ УРОКИНАЗЫ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена в лаборатории Молекулярной эндокринологии Института Экспериментальной Кардиологии / Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научный руководитель:

кандидат биологических наук В.В. Степанова

Научный консультант:

член-корреспондент РАН, профессор В.А. Ткачук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.М. Струкова

кандидат биологических наук А.В. Воротников

Ведущая организация:

НИИ Биологической и Медицинской Химии РАМН

Защита состоится 27 декабря 2000 года в 11 часов на заседании

-дцссертацион1шкхховши107422.02 в РК НПК МЗ РФ (Москва, 121552, Зи

Черепковская ул., д. 15 а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан 27 ноября 2000 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.б.н.

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Миграция клеток играет ключевую роль в таких физиологических процессах, как ангиогенез, ремоделирование сосудов, эмбриональное развитие, проникновение клеток крови в стенку сосуда, заживление ран, рост и метастазирование злокачественных опухолей. Миграция клеток - это сложный многоступенчатый процесс, регулируемый гормонами, факторами роста, цитокинами и промоторами опухолей через различные пути внутриклеточной сигнализации. Важную роль в миграции клеток играет также система активаторов плазминогена. Активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа) и тканевый активатор плазминогена (tPA) с высокой специфичностью расщепляют плазминоген и превращают его в плазмин -протеазу широкой субстратной специфичности. Помимо гидролиза фибринового сгустка [Панченко и Добровольский, 1999], плазмин принимает участие в деградации многих компонентов внеклеточного матрикса и базальной мембраны [Mignatti et al., 1986], «расчищая путь» мигрирующим клеткам. Кроме того, он высвобождает из внеклеточного матрикса и активирует факторы роста [Saksela et al., 1990; Odekon et al., 1994; Pedrozo et al., 1999], стимулирующие миграцию клеток [Kumar et al., 1998; Cavallaro et al., 1998; Olsson et al., 2000]. Широкий набор экспериментальных и клинических данных свидетельствует о том, что tPA вовлечен в основном в процессы фибринолиза, в то время как урокиназа принимает участие в таких физиологических и патологических процессах, как ангиогенез [Swiercz et al., 1999, Carmeliet et al, 2000], ремоделирование сосудов [Tkachuk et al„ 1996; Carmeliet et al,, 1997; Strauss et al., 1999; Plekhanova et al., 2000], воспаление [Gyetko et al., 1996; Beck et al., 1999], рост и метастазирование злокачественных опухолей [Mohanam et al., 1999].

Урокиназа синтезируется и сскретируется разными типами клеток в виде одноцепочечного полипептида, обладающего низкой каталитической активностью и состоящего из трех доменов - каталитического, крингл- и «ростового» доменов. После протеолитического расщепления образуется двухцепочечпая форма урокиназы, осуществляющая протеолиз пептидной связи по механизму серюювых протеаз. На поверхности клетки урокиназа через «ростовой» домен связывается со специфическим рецептором uPAR/CD87; при этом происходит фокусирование протеолитической активности на лидирующем крае мигрирующих клеток [Estreicher, et al., 1990; Okada et al., 1995]. Появившиеся в последнее время данные позволяют предположить, что помимо протеазной активности урокиназа обладает также гормоноподобными свойствами и при взаимодействии с UPAR/CD87 активирует процессы внутриклеточной сигнализации

[Bohuslav et al., 1995; Resnati et al., 1996; Dumler et al., 1998; Nguyen et al., 1998], что приводит к стимуляции миграции клеток [Busso et al., 1994; Anichini et al., 1994; Dumler, 1998; Nguyen et al., 1998].

Рецептор урокиназы uPAR/CD87 является гликозшгфосфагидилинозитол (ГФИ)-заякоренным белком [Ploug et al., 1991], не имеющим трансмембранного и цитоплазматического доменов. Таким образом, для передачи сигнала внутрь клетки необходимо взаимодействие UPAR/CD87 с трансмембранным партнером [Resnati et al., 1996; Dumler et al., 1997). К настоящему времени уже было найдено несколько партнеров UPAR/CD87, принимающих участие в передаче сигнала от урокиназы внутрь клетки: gpl30 [Koshelnick et al., 1997], интегрины [Petty et al., 1996; Kindzelskii et al., 1997; Xue et al., 1997; May et al., 1998; Nguyen ei al., 1999], комплексы pi-шггегринов с кавволниом [Wei et al., 1996]. Однако, точный механизм передачи сигнала, партнеры uPAR/CD87 и их взаимодействие с UPAR/CD87 нуждаются в дальнейшем изучении. Имеющиеся в настоящее время данные о роли различных доменов урокиназы - протеазного и «ростового» - в миграции и пролиферации клеток также противоречивы. Кроме того, имеются данные о существовании дополнительных механизмов хемотактического действия урокиназы, не связанных с ее каталитической активностью и взаимодействием с

UPAR/CD87 [Carmeliet et al., 1997а; Carmeliet et at T99S]t~ Поскольку урокиназа-

представляет собой мультидоменный бедок, обладающий способностью связываться с разными мишенями, физиологические ответы различных типов клеток под действием урокиназы могут отражать интегративные эффекты ее доменов.

Целью данной работы являлось выяснение механизма хемотактического действия урокиназы, а также характеристика участков связывания урокиназы на поверхности клеток, опосредующих эти эффекты. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Выяснить роль «ростового», крингл-, и каталитического доменов урокиназы в стимуляции миграции клеток.

2. Охарактеризовать участки связывания урокиназы на поверхности клеток.

3. Найти мишень, при взаимодействии с которой урокиназа стимулирует миграцию клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что крингл-домен урокиназы специфично стимулирует миграцию клеток. На поверхности клеток ГМК трахеи человека, эмбриональных клеток почек человека (I1EK 293), а также клеток яичников китайского хомяка (СНО) найдены схожие высокоаффинные участки

связывания (Kj ~ 12-20 нМ), взаимодействующие с крингл-доменом урокиназы (крингл-связываюшая мишень, КСМ) и опосредующие его влияние на миграцию клеток. Установлено, что КСМ отличается от уже известных мишеней связывания урокиназы: UPAR/CD87, рецепторов эндоцитоза - LRP/a2-MR, gp330/megalin и VLDLR, а также гепарина. Связывание с КСМ является специфичным для урокиназы: другие крингл-содержащие белки (tPA и плазминоген) не взаимодействуют с КСМ. Хотя связывание «ростового» домена с uPAR/CD87 играет роль в хемотакгическом эффекте полноразмерной урокиназы, оно не является необходимым, в то время как взаимодействие крингл-домена с КСМ необходимо и достаточно для стимуляции миграции клеток. Таким образом, КСМ может служить функциональной мишенью, через которую урокиназа влияет на миграцию ГМК при ремоделировании сосудов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на межлабораторном семинаре ИЭК PK НПК МЗ РФ (Москва, ноябрь 2000), а также на конференции XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Hamamatsu, Япония, июнь 2000).

Публикации. По материалам диссертации бьио опубликовано 6 статей и 4 тезиса. Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками. Список литературы включает 298 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Рекомбинантные формы урокиназы были получены методом трансформации клеток Е. coli плазмидами, кодирующими нативную урокиназу и формы урокиназы с различными модификациями. Нативная и модифицированные формы урокиназы были сконструированы и экспрессированы руководителем лаборатории Генной инженерии ИЭК КНЦ Р. Ш. Бибилашвили и его сотрудниками. В работе были использованы следующие формы урокиназы (Рис. 1А): урокиназа «дикого типа» r-uPAwt (аа 1-411); каталитически неактивная урокиназа с заменой His204 на Gin204 в активном центре r-uPAH/Q; урокиназа, лишенная «ростового» домена r-uPA-AGFD (аа 43-411); каталитически неактивная урокиназа, лишенная также «ростового» домена r-uPAIMJ-AGFD; каталитический домен г-LMW (аа 136-411) и крингл-домен урокиназы r-KD (аа 43-156). Очистку полученных рекомбинантных форм урокиназы проводили хроматографическими методами. Первичную очистку проводили методом металлохелатной хроматографии на колонках,

заряженных ионами CuJ+, либо Ni24". Дальнейшую очистку проводили с использованием аффинной хроматографии на колонках Sepharose 4В с иммобилизованными моноклональными антителами к урокиназе (к крингл-домену или к каталитическому домену), которые были любезно предоставлены С.П. Домогатским, руководителем лаборатории Инженерной Иммунологии ИЭК КНЦ. Антитела UNG-5 к крингл-домену были конформационно-специфическими, и таким образом, в процессе очистки методом аффинной хроматографии выделялась только фракция молекул с природной конформацией. Характеристика полученных форм урокиназы включала: 1), установление степени чистоты полученных препаратов урокиназы методом электрофореза по Леммли в восстанавливающих и невостанавливаювцих условиях; 2). иммуноблоттинг препаратов с использованием моноклояалышх антител на каталитический (UIG-1) и на крингл-домен (UNG-5); 3). определение соответствия структуры полученных препаратов рекомбинантных форм урокиназы структуре нативной урокиназы методом ИФА с использованием четырех моноклональных антител, полученными на природную гликозилированную урокиназу человека; 4). определение каталитической активности рекомбинантных форм урокиназы по расщеплению специфичного субстрата урокиназы S-2444 (pyroGlu-Gly-Arg-pNA:HCl) фирмы Chromogenix. Каталитическая активность форм урокиназы uPA-glyc, r-uPAwt, r-uPA-ÄGFD и r-LMW составляла около 5UUU ед/нмоль, в то* время как г-иРАвд, r-uPA^-AGFD и r-KD были каталитически не активны.

В данной работе также были использованы формы урокиназы человека, полученные методом экспрессии в клетках дрозофилы (Schneider S2): полноразмерная урокиназа uPA(S2) и урокиназа, лишенная крингл-домена (аминокислотной последовательности 47-135) uPA-AKD47'133(S2), которые были любезно предоставлены доктором Д. Сиисом (Факультет Патологии и Лабораторной Медицины, Университет Пенсильвании, Филадельфия, США). Кроме того, использовали также гликозилированную нативную урокиназу человека uPA-glyc. фирмы Medac (Германия).

Электрофорез и иммуноблоттинг белков. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия проводили в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях по методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Перенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли методом элекгроблоггинга [Towbin et al., 1979] в стандартном Трис-глицин/этанольном буфере, содержащем 0.02% SDS. После переноса мембрану блокировали 3% раствором BSA в буфере PBS pH 7.4, содержащем 0.1% Tween-20, в течение ночи при +4°С. Инкубации с антителами проводили в PBS, содержащем 3% DSA и 0.1% Tween-20, в течение 1 часа при комнатной

температуре. Мембраны отмывали PBS с 0.1% Tween-20. В качестве первых антител использовали антитела к уроюшазе (UIG-1 и UNG-5) и антитела к UPAR/CD87, а в качестве вторых - конъюгаты антител с иероксидазой хрена. Для выявления белковых полос использовали 3,3'-диаминобензидин фирмы Sigma (США) или хемилюминесцентную детекцию с помощью набора реактивов фирмы Pierce (США).

Восстановление и алкилирование рекомбинантного крингл-домена урокиназы проводили как описано ранее (Ji et al., 1998а). Дисульфидные связи r-KD (110 мкг, 1 мл) восстанавливали путем инкубации с 15 мкл 0,5 M дитиотреитола в течение 15 минут при 20°С. Восстановленный r-KD был затем алкилирован путем инкубации с 120 мкл 0,25 M иодацетамида в течение 1 часа при 4°С. После ингибирования избытка иодацетамида 2-меркаптоэтанолом реакционную смесь диализовали против PBS, рН 7.4. Восстановленный и алкилированный r-KD анализировали методом электрофореза по Леммли и методом иммуноблотгинга, используя моноклональные антитела к криигл-домену урокиназы.

Культивирование клеток. Клетки культуры рабдомиосаркомы человека А 204 и эмбрионов почек человека НЕК 293 были любезно предоставлены А. Шевелевым (ИЭК КНЦ). ГМК клетки трахеи человека были выделены В. Крымской и охарактеризованы, как описано ранее [Panettieri et al., 1989]. Клетки выращивали в пластиковых чашках Петри в инкубаторе при 37°С и концентрации ССЬ 5% в среде DMEM, содержащей 4 мМ глутамин, 20 мМ HEPES (рН 7.3), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 ед/мл) и 10% эмбриональную сыворотку быка (FBS). Клетки пассировали, обрабатывая раствором 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА.

Приготовление лизатов клеток для определения экспрессии uPAR/CD87. Клетки собирали в 10 мл буфера HEPES 10 мМ, рН 7.2, содержащего 150 мМ NaCI, 1мМ ЭДТА, 10 мкг/мл леупсптин, 10 мкг/мл пепстатин, 1 мМ метилфенилсульфонилфторид (PMSF), и центрифугировали при 1500 g в течение 3 минут при +4°С. Осадок ресуспендировали в 10 мМ буфере Трис-HCl, рН 8, содержащем 150 мМ NaCI, 2мМ ЭДТА, 10 мкг/мл леупсптин, 10 мкг/мл пепстатин, 1 мМ PMSF, инкубировали 20 минут при +4°С и центрифугировали при 5000 g в течение 15 минут при +4°С. Белки в супернатанте смешивали с буфером для образцов, содержащим SDS, и подвергали электрофорезу в ПААГ и иммуноблоттингу, как описано выше.

Миграцию клеток изучали согласно ранее описанному методу [Stepanova et al., 1997], используя камеру Бойдена (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD, USA). Перед экспериментом клетки, достигшие конфлуентного состояния, культивировали в бессывороточной среде DMEM/0.1% BSA в течение 24 часов. В качестве

хемоатграктантов использовали различные формы урокиназы человека, которые помещали в нижние ячейки камеры Бойдена. Хемоатгракгант и клетки были разделены поликарбонатным пористым фильтром с диаметром пор 5 микрон (Nucleopore Corp., Palo Alto, CA, USA), покрытым коллагеном I типа (100 мг/мл) (Vitrogen 100, Celtrix Pharmaceuticals Inc., Santa Clara, CA, USA). В верхние ячейки камеры вносили по 50 мкл суспезии клеток в бессывороточной среде DMEM/0.1% BSA, полученной при обработке монослоя клеток раствором трипсина и ЭДТА (0,05% / 0,02%). Количество клеток, добавляемых в лунку, варьировало в зависимости от типа клеток и составляло 30 000 - 120

000 клеток на ячейку. В экспериментах по изучению роли крингл-домена в миграции клеток, формы урокиназы перед внесением в нижиюю камеру преинкубировали в течение

1 часа с моноклональными антителами к крингл-домену урокиназы UNG-5 (20 мкг/мл) или с неспецифичными иммуноглобулинами мыши IgG (20 мкг/мл), используемыми в качестве отрицательного контроля. Для определения роли uPAR/CD87 в миграции клеток, суспензию клеток предварительно инкубировали с моноклональными антителами R3 к UPAR/CD87 (50 мкг/мл), препятствующими взаимодействию рецептора со своим лигандом, либо с неспецифичными иммуноглобулинами мыши IgG в той же концентрации. Клетки инкубировали в С02-инкубаторе при 37°С 2,5 - 12 ч. в зависимости от культуры клеток. Непромигрировавшие клетки очищали с верхней поверхности фильтра, а клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Dif Quick (Baxter). Мембрану с окрашенными клетками сканировали на сканере ScanJet II СХ с использованием программ "Deskscan" и "NIH Image". Интенсивность миграции оценивали по площади пиков, полученных сканированием поля окрашенных клеток. Данные представляли как отношение площади пика к контрольной величине, полученной для клеток, прошедших через фильтр в отсутствие хемоапрактанта.

Иодирование рекомбинантных форм урокиназы человека проводили, используя Na125I и IODO-GEN (Pierce, USA), как описано ранее [Stepanova et al., 1997]. 60 мкг урокиназы инкубировали с 1 мКи NalísI и 0,1 мг иодогена в течение 8 мин. при температуре +4°С. Реакцию останавливали добавлением избытка L-тирозина. Иодированную урокиназу очищали методом гель-фильтрации с использованием колонки PD-10 (Amersham Pharmacia Biothech, USA), уравновешенной фосфатно-солевым буфером, pH 7,4. Элюированный иодированный белок на 95-98% осаждался трихлоруксусной кислотой и имел специфическую активность 3-4 х 105 ерт/пмоль.

Изучение связывания иодированных рекомбинантных форм урокиназы человека с клетками. Клетки, выращенные в 48-луночных плашках до состояния

конфлуентности, дважды промывали PDS, рН 7.4, содержащим 0,1% BSA. После преинкубации с 0,5 мл среды связывания (DMEM, содержащий 0,1% BSA и 100 KIU/мл апротинии) в течение 1 часа при комнатной температуре и последующего удаления среды, к клеткам добавляли по 100 мкл раствора иодированных форм урокиназы в разных концентрациях, разбавленных средой связывания. Для определения общего связывания к клеткам одновременно с иодированной урокиназой добавляли 100 миг среды связывания, а для определения неспецифического связывания -100 мкл немеченой формы урокиназы в 50-кратном избытке. В случае проведения конкурентного анализа, к клеткам добавляли 100 мкл иодинированной формы урокиназы в концентрации 3 нМ, и 100 мкл буфера или немеченного конкурента в разных концентрациях. Для определения вклада UPAR/CD87 в связывание урокиназы с ГМК, клетки преинкубировали с моноклональными антителами к рецептору (50 мкг/мл) в течении 1 часа. Инкубацию с иодированными формами урокиназы проводили 2 ч при +4°С. Затем среду отбирали, клетки промывали 3 раза PBS, содержащим 0,1% BSA, и солюбилизировали путем добавления 500 мкл 1% SDS в 0,5 M NaOH. Радиоактивность клеточных лизатов измеряли в гамма-счетчике.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Роль доменов урокиназы в миграции клеток.

При изучении влияния урокиназы на миграцию ГМК трахеи человека было установлено, что рекомбинантная урокиназа "дикого типа" r-uPAwt стимулирует миграцию так же, как и природная гликозилированная урокиназа человека uPA-glyc. с ЕС50 около 2 нМ и максимальным эффектом 5-10 нМ (Рис. 1Б). Для исследования роли индивидуальных доменов урокиназы в миграции клеток были использованы различные модифицированные формы рекомбинантной урокиназы. Каталитически неактивная урокиназа (r-uPA1170) и каталитически неактивная урокиназа, лишенная "ростового домена" (r-uPA^-AGFD) стимулировали миграцию клеток в диапазоне концентраций 0,540 нМ с характеристиками, сходными с r-uPAwt: максимальным эффектом при 5-10 нМ и ЕС50 ~ 2 нМ (Рис. 1Б). Рекомбинаигные формы урокиназы: r-uPAwt, r-uPA-AGFD и г-uPAH,q-AGFD стимулировали также миграцию клеток рабдомиосаркомы человека (данные не приведены). Полученные данные свидетельствуют о том, что ни каталитическая активность урокиназы, ни связывание ее с рецептором через «ростовой» домен не являются критическими для стимулирования миграции ГМК трахеи человека.

I "ростовой" | крингл протелзный |н1|) |

I "ростовой" |крингл протелзный (с|п) |

I крингл протелзный (н1.) |

I крингл протелзный (оп) |

протелзный (н|.) |

1 крингл

▲ А

I "ростовой" 1 крингл протелзиыя ок») |

▲ А

I "ростовой" протелзный (шя) |

I* шГА-0ус. и ира(52)

е-

X §

га аз

1,!

1,0

0 1 10 формы рекомбинантной урокиназы, нМ

Рисунок 1, Стимуляция миграции ГМК человека нативной урокиназой и ее модифицированными формами.

А - формы урокиназы, использованные в работе. Прямоугольниками обозначены домены урокиназы, треугольниками - гликозилирование.

Б - для стимуляции миграции ГМК использовали нативную гликозилированную урокиназу человека иРА^1ус. (Н), и рекомбинаитные формы урокиназы,

-и г-пРА^-ЛГ.ГП (О). Степень

активации миграции выражена как отношение величины миграции клеток в присутствии урокиназы к контрольной величине, полученной при миграции клеток в отсутствие хемоаттракганта.

Рекомбинантная форма урокиназы, лишенная каталитической активности и «ростового» домена, и не способная связываться с рецептором урокиназы [Арре11а е1 а1., 1987], тем не менее стимулировала миграцию клеток рабдомиосаркомы человека А 204 и ГМК трахеи человека. Для изучения вопроса, какой из доменов урокиназы - неактивный каталитический домен или крингл-домен - может опосредовать хемотакгический эффект этой формы урокиназы, были использованы индивидуальные рекомбинаитные крингл-домен г-КО (аа 43-156) и каталитический домен урокиназы г-ЬМШ (аа 136-411). г-КО стимулировал миграцию ГМК трахеи человека в диапазоне концентраций 1-30 нМ с максимальным эффектом при 20 нМ и ЕС50 ~ 6 нМ, в то время как г-1А№ не влияла на миграцию клеток (Рис. 2А). г-КО также стимулировал миграцию клеток рабдомиосаркомы человека А 204 (данные не приведены). Для дальнейшего изучения роли крингл-домена урокиназы в миграции клеток была использована урокиназа, лишенная крингл-домена, экспрессированная в клетках дрозофилы - иРА-ДКО47"'35 (82), а также урокиназа с нативной структурой, экспрессированная в той же системе иРА (82).

Несмотря на наличие интактного «ростового» домена и возможности взаимодействовать с иРАК/С087 [На)-УеЫа е! а1., 2000], форма урокиназы иРА-ДКЕ»47'135 (52) была не способна стимулировать миграцию ГМК трахеи человека, в то время как полноразмерная урокиназа иРА (52) стимулировала миграцию клеток так же, как г-иРАМ (Рис. 2Б). Таким образом, эти результаты подтверждают необходимость крингл-домена урокиназы для стимулирования миграции клеток.

2,5

X S

2,0

1,5

1,0

14,4-

0,1 1 10 урокиназа, нМ

контроль r-uPAwt uPA (32) uPA-AKD

40 нМ 40 HM (S2), 40 иМ

Рисунок 2. Влияние доменов урокиназы на миграцию ГМК человека.

А - в качестве хемоаттрактантов использовали индивидуальные крингл-домен урокиназы r-KD (А), каталитический домен r-uPALMW (□) и денатурированный крингл-домен r-KD(d) (V). *Р < 0.05 по сравнению с контролем.

А, вставка - иммуноблотгинг рекомбинантного крингл-домена r-KD и денатурированного кгрингл-домена r-KD(d). Дисульфидные связи крингл-домена восстанавливали дитиотреитолом и затем алкилировали иодацетамидом. Равные количества r-KD и r-KD(d) (I мкг белка на лунку) подвергали электрофорезу и электроблотгингу. Детекцию проводили, используя конформационно-специфичные антитела к крингл-домену урокиназы.

Б - в качестве хемоаттрактантов использовали полноразмерные формы урокиназы, экспрессированные в Е. coli и клетках дрозофилы (52) и урокиназу, лишенную крингл-домена. Степень активации миграции выражена как отношение величины миграции клеток в присутствии урокиназы к контрольной величине, полученной при миграции клеток в отсутствие хемоатграктанта. *Р < 0.05 по сравнению с контролем.

Для изучения роли интактной структуры крингл-домена в миграции клеток использовали денатурированный г-КО(й), у которого дисульфидные связи были восстановлены, а затем алкилированы дня предотвращения рефолдинга. Практически полное денатурирование было подтверждено методом иммуноблотгинга. г-КО^) не взаимодействовал с моноклональными антителами №10-5 (Рис. 2А, вставка) и не

стимулировал миграцию клеток ГМК трахеи человека (Рис. 2А), а также клеток рабдомиосаркомы человека А 204 (данные не приведены).

Хемотактический эффект г-ЮЭ был специфичным, т.к. моноклональные антитела против крингл-домена урокиназы ЩЮ-5 ингибировали миграцию ГМК трахеи (Рис. ЗА), стимулированную рекомбинантными формами урокиназы, содержащими крингл-домен.

2.5

2,0 1.5 1.0

0,0

контроль r-uPAwl r-uPA • r-KD •GFD

J без антител I ♦ UNG-5 (20 мкг/мп) J ♦ ««специфичные IgG мыши 120 мкг/мл^

контроль r-uPAwt r-KD

1 б«» антител 1 + R3 (50 мм-/мл) s + неспецифичные igG мыши (50 мкг/мл)

Рисунок 3. Роль крингл-домена урокиназы и рецептора урокиназы в миграции ГМК

А - влияние антител к крингп-домену урокиназы на миграцию ГМК человека, стимулированную r-uPAwt (10 иМ), r-uPA^-AGFD (10 нМ) и r-KD (10 нМ). К клеткам добавляли: формы урокиназы в указанной концентрации; или формы урокиназы, преинкубированные в течение 1 часа с антителами к крингл-домену урокиназы UNG-5 (20 мкг/мл); или формы урокиназы, преинкубированные с неспецифичными иммуноглобулинами мыши IgG (20 мкг/мл). */><0,001.

Б - Перед добавлением хемотактических агентов клетки преинкубировали в течении 1 часа со средой DMEM, содержащей 0.1% BSA; либо с моноклональными антителами R3 к uPAR/CD87 (50 мкг/мл), препятствующими связыванию рецептора с урокиназой; либо с неспецифичными иммуноглобулинами мыши IgG (50 мкг/мл). Затем к клеткам добавляли DMEM/BSA (контроль), r-uPAwt (10 нМ), или r-KD (10 нМ). *р<0.001; #р<0.05 по сравнению с контролем.

Таким образом, было показано, что крингл-домен урокиназы специфично стимулирует миграцию ГМК человека, и для этого необходима нативная структура крингл-домена. Кроме того, хемотактический эффект полноразмерной урокиназы также опосредуется крингл-доменом, т.к.: 1). нейтрализация крингл-домена специфичными антителами ингибирует хемотактический эффект полноразмерной урокиназы, 2).

урокиназа, лишенная крингл-домена, не стимулирует миграцию клеток.

Известно, что для миграции некоторых типов клеток необходимо взаимодействие урокиназы с рецептором uPAR/CD87 [Fibbi et al., 1988; Anichini et al, 1994; Resnati et al, 1996; Nguyen et al, 1998]. Для определения роли рецептора урокиназы в миграции ГМК трахеи человека было изучено влияние антител к рецептору урокиназы R3, предотвращающих взаимодействие с лигандом, на миграцию, стимулированную рекомбинантными формами урокиназы. Антитела к рецептору урокиназы значительно подавляли миграцию, вызванную полноразмерной урокиназой r-uPAwt, но не влияли на миграцию, стимулированную r-KD (Рис. ЗБ).

Таким образом, крингл-домен играет ключевую роль в хемотактическом эффекте полноразмерной урокиназы на ГМК трахеи человека. «Ростовой» домен урокиназы не является необходимым для миграции клеток, однако может участвовать в этом процессе.

Мишени связывания урокиназы

Для изучения рецепторов, опосредующих связывание урокиназы с поверхностью клеток, и поиска мишени, связывающей крингл-домен урокиназы (крингл-связывающей мишени, КСМ) были использованы меченные 1251 рекомбинантные формы урокиназы: 1251-r-uPAwt и 12S[-r-uPAH/Q-AGFD. Как показано на Рис. 4, на поверхности ГМК трахеи человека присутствуют участки специфического связывания урокиназы. При анализе связывания l25I-r-uPAwt в координатах Скэтчарда был получен нелинейный график, позволяющий предположить наличие более чем одного участка связывания (Рис. 4А). Высокоаффинный участок связывания имел константу диссоциации Кл ~ 1,4 нМ и количество Bma,i ~ 120 ООО участков на одну клетку. Участки связывания урокиназы второго типа имели более низкую аффинность Kd2 ~ 20,3 нМ при более высоком количестве Втах2 - 780 ООО. Связывание урокиназы, лишенной "ростового" домена, с клетками характеризовалось линейным графиком Скэтчарда, и таким образом, было опосредовано единственным классом участков связывания (Рис. 4Б). Характеристики этого типа участков связывания были сходны с характеристиками низкоаффинного участка связывания полноразмерной урокиназы: Kd ~ 16,8 нМ и Втах - 770 ООО. Среднее значение трех экспериментов для каждого типа урокиназы было следующим: для полноразмерной урокиназы Kdi = 1.51 ± 0.06 нМ и Bm,x i = 140 000 ± И 000 участков связывания на клетку, и К,ц = 20.27 ± 1.01 нМ и Вта1<2 = 815 000 ± 133 000; для урокиназы, лишенной "ростового" домена IQ = 20.29 ± 2.22 нМ и Вгах = 1 028 000 ± 129 000.

А Б

связ. (пмопь на 10е клеток) связ. (пмоль на 106 клеток)

Рисунок 4. Обработка данных специфического связывания 125I-r-uPAwt (А) и 125I-uPA№Q-AGFD (Б) с ГМК человека в координатах Скэтчарда.

По оси абсцисс отложены количества специфически связанных форм урокиназы, по оси ординат - отношения количества специфически связанных форм урокиназы к

Рис. 4А, вставка и 4Б, вставка. Изотермы связывания I-r-uPAwt (А) и

> лт.п -г г f . __________________ 1_________ _____________ /л с Л1\__

лиги (t>). пнкуиацию клсюк с иодированными фирмами урилпна^ы '

проводили в течение 2 часов при 4°С. Неспецифическое связывание (Ж) определяли в присутствие 50-кратного избытка немеченного лиганда. Специфическое связывание рассчитывали, вычитая из величин общего связывания (■) значения неспецифического связывания.

Параметры связывания высокоаффинного участка (IQ и Втах) близки к характеристикам "классического" рецептора урокиназы uPAR/CD87 [Haddock et al., 1991; Sillaber et al., 1997]. Для проверки предположения, что высокоаффинный участок связывания представляет собой UPAR/CD87, было изучено связывание 125I-r-uPAwt с ГМК трахеи человека в присутствии антител против uPAR/CD87, блокирующих связывание рецептора с лигандом. Анализ данных связывания в координатах Скэтчарда показал, что антитела против UPAR/CD87 полностью блокируют высокоаффинный участок связывания и не влияют на низкоаффинный (Рис. 5А). Вместе с данными об экспрессии uPA_R/CD87 на мембране ГМК трахеи человека (Рис. 7Б, вставка) эти результаты свидетельствуют о том, что высокоаффинный участок связывания представляет собой uPAR/CD87.

Для изучения низкоаффинного участка связывания изучалось влияние антител против крингл-домена урокиназы UNG-5 на связывание урокиназы с ГМК трахеи человека. Антитела UNG-5 дозозависимо снижали связывание полноразмерной урокиназы с клетками, в то время как неспецифичные иммуноглобулины мыши не влияли на

связывание. Анализ данных связывания в координатах Скэтчарда показал, что антитела против крингл-домена урокиназы полностью блокируют низкоаффинный участок связывания и не влияют на высокоаффинный (Рис. 5Б).

X ?

ю о,»

0.« 0.2 0,4 0,1 0,1 1.0 1,2 1.«

0,0 0,2 0,4 1,8 0,8 1,0 1,2 1,4

с вяз. (пмоль на 10 клеток)

связ. (пмоль на 10 клеток)

Рисунок 5. Влияние антител к UPAR/CD87 и антител к крингл-домену урокиназы на связывание 12SI-r-uPAwt с ГМК человека.

А - перед добавлением урокиназы 125I-r-uPAwt клетки преинкубировали 1 час с антителами R3 к uPAR/CD87 (50 мкг/мл). Б - перед добавлением к клеткам урокиназу преинкубировали 1 час с антителами UNG-5 к крингл-домену урокиназы (40 мкг/мл). Обработка данных специфического связывания 125I-r-uPAwt с ГМК человека в координатах Скэтчарда. По оси абсцисс отложены количества специфически связанных форм урокиназы, по оси ординат - отношения количества специфически связанной урокиназы к количеству свободной урокиназы. Неспецифическое связывание определяли в присутствие 50-кратного избытка немеченного л и ганда. Специфическое связывание рассчитывали, вычитая из величин общего связывания значения неспецифического связывания.

Для дальнейшего изучения участков связывания урокиназы на поверхности культивируемых ГМК трахеи человека проводили конкурентный анализ. При использовании 125I-r-uPAwt в концентрации 0,5 нМ, достаточной для взаимодействия только с высокоаффинным участком связывания, конкурентное вытеснение наблюдалось только для полноразмерной немеченой урокиназы, в то время как урокиназа, лишенная "ростового" домена, была не способна конкурировать за связывание (Рис. 6А). Этот результат подтверждает, что высокоаффинный участок связывания представляет собой UPAR/CD87, для взаимодействия с которым необходим «ростовой» домен урокиназы. При использовании uPAwt в концентрации 3 нМ, достаточной для ее взаимодействия с двумя типами участков связывания, конкурентное вытеснение наблюдалось как для

полноразмерной немеченой урокиназы, так и для урокиназы, лишенной "ростового" домена, а также для индивидуального крингл-домена урокиназы (Рис. 6Б). Немеченные формы урокиназы г-uPAwt and r-uPAH/^-AGFD конкурировали за связывание с 1251-г-uPA^-AGFD сходным образом (Рис. 6В), что свидетельствует о том, что r-uPAwt и г-uPA^-AGFD связываются с одной низкоаффинной мишенью на поверхности клеток, г-KD также был способен конкурировать за связывание с I-r-uPAwt и '^I-r-uPA^-AGFD, однако с более низкой аффинностью по сравнению с r-uPAwt и г- uPAH/Q-AGFD (Рис. 6, Б и В). Пи денатурированный крингл-домен r-KD(d), ни r-uPALMW не бьши способны конкурировать с 125I-r-uPAwt или I25l-r-uPAHQ-AGFD за связывание с поверхностью ГМК трахеи человека (Рис. 6, Б и В). Гликозшшрованная урокиназа конкурировала за связывание с 12SI-r-uPAHA3-GFD с крингл-связывающей мишенью, в то же время, несмотря на высокую гомологию крингл-доменов различных сериновых протеаз, tPA и Pig практически не влияли на связывание '"i-r-uPA^-GFD (Рис. 6Г). Таким образом, связывание с крингл-связывающей мишенью характерно для природной гликозилированной урокиназы и является специфичным.

контроль r-uPAwt r-UPA""5.

GFD

0,1

1 10 100 1000 конкурент, нМ

Рисунок 6. Анализ конкурентного связывания между рекомбинантными формами урокиназы с ГМК человека.

А - конкурентное связывание между 12SI-r-uPAwt (0,5 нМ) и немечеными r-uPAwt (2 нМ) и r-uPAH/r3-AGFD (2 нМ). Специфическое связывание определяли как разницу между тотальным связыванием и иеспецифическим связыванием в присутствии r-uPAwt (50 нМ).

Б и В - конкурентное связывание между I-r-uPAwt (3 нМ) (Б) или AGFD (3 нМ) (В) и немечеными формами урокиназы: r-uPAwt (•), r-uPAK/Q-GFD (О), г-uPALMW(0), r-KD (А), и денатурированным r-KD (V).

Г - конкурентное связывание между '251-r-uPA1 ,/Q-AGFD (3 нМ) и немечеными нативной гликозилированной урокиназой uPA-glyc. (1 мкМ), tPA (1 мкМ), и плазминогеном Pig (1 мкМ). Специфическое связывание определяли как разницу между тотальным связыванием и неспецифическим связыванием в присутствии г-

uPA^-AGFD

(1 мкМ),

Нелинейный характер графика Скэтчарда связывания ,25I-r-uPAwt с клетками может отражать как наличие двух классов участков связывания, так и отрицательную кооперативность для одного класса участков. Приведенные выше данные по ингибированию антителами против uPAR/CD87 взаимодействия ,25I-r-uPAwt только с одним типом участков связывания свидетельствуют в пользу существования двух независимых типов участков. Для дополнительного подтверждения этого предположения было изучено связывание 125I-r-uPAwt и l25I-r-uPA,I/Q-AGFD с клетками, не экспрессирующими UPAR/CD87 - клетками почек эмбриона человека FIEK 293, а также с клетками НЕК 293, трансфецированными рецептором урокиназы (HEK-uPAR). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, трансфецированные плазмидой,

содержащей фрагмент гена ß-галактозидазы Е. coli, вставленного в обратной ориентации (клетки HEK-control). Обе формы урокиназы - полноразмерная и лишенная «ростового» домена - взаимодействовали с контрольно-трансфецированными клетками HEK-control со сходными параметрами (Ка - 12,5 нМ и BmaJ1 ~ 50 600 участков связывания на клетку для 12SI-r-uPAwt и K<j ~ 11,2 нМ и В™* ~ 45 800 для l25I-r-uPAII/0-AGFD) (Рис. 7А). HEK-uPAR экспрессировали рецептор (Рис. 7Б, вставка) н связывали l25I-r-uPAwt через два класса участков связывания 2,0 нМ и Bmxi ~ 14 500, и К^ ~ 14,1 нМ и Bm„x2 ~ 49 400) (Рис. 7Б), Однако, параметры связывания 125I-r-uPAH/Q-AGFD с клетками HEK-uPAR не изменились по сравнению с HEK-control (Kd - 15,2 нМ и Втач ~ 46 400) (Рис. 7Б). Эти результаты свидетельствуют о том, что для связывания с клетками урокиназы, лишенной "ростового" домена, рецептор урокиназы не является необходимым, и, таким образом, мишень, связывающая ее крингл-домен, не является рецептором UPAR/CD87.

А Б

связ. (пмоль на 106 клеток) связ. (пмоль на 106 клеток)

Рисунок 7. Анализ специфического связывания I-r-uPAwt (9) и '»I-uPA«'0-GFD (О) с культивируемыми клетками HEK-control (А) и клетками HEK-uPAR (Б) в координатах Скэтчарда. По оси абсцисс отложены количества специфически связанных форм урокиназы, по оси ординат - отношения количества специфически связанных форм урокиназы к количеству свободных форм урокиназы.

Рис. 7Б, вставка. Экспрессия ÜPAR/CD87 гладкомышечными клетками человека (1), клетками HEK-control (2) и клетками HEK-uPAR (3). Лизаты клеток подвергали электрофорезу в 10% ПААГ с использованием SDS и электроблоттингу. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в присутствии моноклональных антител к UPAR/CD87.

Известно, что кроме uPAR/CD87, в связывании урокиназы на поверхности клеток принимают участие представители семейства рецепторов LDL - LRP/ot2-MR [Herz et al., 1992; Conese et al., 1994; Conese et al., 1995], gp330/megalin [Stefansson et al., 1995] и

VLDLR [Argraves et al, 1995]. Помимо их роли в шггернализации и деграции как свободной урокиназы, так и комплексов урокиназа/ингибитор, в последнее время появились данные, позволяющие предположить участие этих рецепторов в передаче сигнала внутрь клетки для активации миграции клеток [Goretzki et al, 1998; Willnow et al, 1999], и, кроме того, было показано связывание LRP/ot2-MR с участком на крингл-домене урокиназы [Nykjaer et al, 1994]. Для определения того, является ли крингл-связывающая мишень представителем семейства рецепторов LDL, использовали 2 линии клеток яичников китайского хомяка - экспрессирутощие LRP/ctrMR (CHO-LRP+) и лишенные LRP/0C2-MR (CHO-LRP). RAP - универсальный ингибитор связывания урокиназы и комплекса uPA/PAI с рецепторами LRP/arMR, gp330/megalin и VLDLR - ингибировал связывание 12SI-r-uPAwt с клетками CHO-LRP4, но не влиял на связывание I25I-r-uPAwt с CHO-LRP'. Таким образом, полноразмерная урокипаза может взаимодействовать с LRP/0C2-MR, экспрессированным на поверхности клетки. Однако, 125I-r-uPAfI/Q-AGFD была способна специфически связываться с поверхностью клеток CHO-LRP" (Рис. 8А), что свидетельствует о том, что это связывание не было опосредовано LRP/a2-MR. Кроме того, немеченые формы урокиназы r-uPAwt и r-uPA^-AGFD конкурировали с ,251-г-иРЛн'°-AGFD (3 нМ) за связывание с поверхностью клеток CHO-LRP", в то время как RAP, препятствующий связыванию урокиназы не только с LRP/«2-MR, но и другими рецепторами семейства LDL, не влиял на связывание (Рис. 8Б).

А Б

40 нМ 20 нМ контроль г-uPAwt RAP

300 кМ 300 нМ

Рисунок 8. Связывание 1251-г- и РЛ'^-С FD с клетками яичников китайского хомяка, не экспрессирующими LRP/ob-MR (CHO-LRP").

А - связывание ,25I-r-uPAHQ-GFD (20 нМ) с клетками - общее и неспецифическое (в присутствии 50-кратного избытка немеченной r-uPA^-GFD).

Б - конкурентное связывание между '"i-r-uPA^-GFD (3 нМ) и немечеными г-uPAwt (300 нМ) и RAP (300 нМ). Специфическое связывание определяли как разницу между общим связыванием и неспецифическим связыванием в присутствии r-uPAH/Q-GFD (300 нМ).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что r-uPA^-AGFD взаимодейсвует с мишенью, экспрессированной на поверхности CHO-LRP" и отличающейся от LRP/ot2-MR, gp330/megalin и VLDLR. Полноразмерная урокиназа также способна взаимодействовать через крингл-домен с КСМ, которая отличается от представителей семейства рецепторов LDL, т.к. немеченые r-uPAII/Q-AGFD, r-uPAwt и г-KD, но не RAP, конкурировали за связывание с ,2Sl-r-uPAwt с клетками CHO-LRP".

Ранее было показано, что крингл-домен урокиназы через участок Arg108-ArgH°-Arg110 может взаимодействовать с полианионами, например, гепарином [Stephens et al., 1992]. Для выяснения вопроса, может ли связывание крингл-домена с клетками быть опосредовано гепарином, было исследовано влияние гепарина на связывание полноразмернои урокиназы I-r-uPAwx с клетками ПЕК 293, лилф^ьл-ицующими, ь основном, КСМ, но не рецепторы семейства LDL и UPAR/CD87. Гепарин не ингибиповал связывание урокиназы с клетками (Рис. 9), что свидетельствует о том, что КСМ не представлен полианионами.

контроль r-uPAwt гепарин 300 нМ 20мкМ

Рисунок 9. Влияние гепарина на связывание 1251-г-иРАлу1 с клетками НЕК293.

К клеткам одновременно добавляли 1251-г-иРА^1 (3 нМ) и среду ОМЕМ/ВБА (контроль), а также немеченные г-иРАл\1 в конечной концентрации 300 нМ, либо гепарин в конечной концентрации 20 мкМ. *Р<0,001.

На основании полученных данных можно предположить, что полноразмерная урокиназа может связываться на поверхности клеток с тремя мишенями: UPAR/CD87, LRP/ctî-MR и КСМ. Можно предположить, что КСМ отличен от уже известных мишеней связывания урокиназы: UPAR/CD87, рецепторов семейства LDL, или гепарином. КСМ специфично взаимодействует с крингл-доменом нативной гликозилированной урокиназы, и для этого необходима интактная структура крингл-домена.

Роль рецепторов урокиназы в хемотактическом эффекте урокиназы

Для выяснения роли uPAR/CD87 и КСМ в миграции, стимулированной урокиназой, исследовали миграцию клеток HEK-conirol и HEK-uPAR. В отличие от r-LMW, каталитически неактивная форма урокиназы, лишенная "ростового" домена r-uPAH/Q-GFD, стимулировала миграцию клеток HEK-contol (Рис. 10А), что свидетельствует о том, что взаимодействие крингл-домена урокиназы с КСМ является достаточным для стимуляции миграции клеток. r-uPA™3 и r-uPAHQ-GFD, но не r-LMW также стимулировали хемотаксис HEK-uPAR (Рис. 10Б). uPAR/CD87 не является необходимым для миграции, стимулированной урокиназой, т.к. форма урокиназы без крингл-домена r-uPA-AKD47"135 (S2) не стимулировала миграцию HEK-uPAR (Рис. 10Б) и ГМК трахеи человека (Рис. 2Б), несмотря на наличие «ростового» домена и связывание с uPAR/CD87, экспрессированным на мембране этих клеток. В то же время полноразмерная урокиназа uPA (S2), используемая в качестве положительного контроля, стимулировал миграцию как HEK-uPAR (Рис. 10Б), так и ГМК трахеи человека (Рис. 2Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие крингл-домена урокиназы с КСМ является необходимым и достаточным условием для стимуляции миграции клеток. UPAR/CD87 не является необходимым для миграции, однако, на основании полученных данных нельзя отрицать его роль в регулировании миграции, стимулированной полноразмерной урокиназой.

Таким образом, в данной работе впервые было показано, что крингл-домен урокиназы является функционально значимым доменом, и также, как и крингл-домены других крингл-содержащих белков [Hartmann et al., 1992; Itakura et al., 1994; Bussolino et al., 1992; Ji et al., 1998a; Ji et al., 1998b; Walter et al., 1999], взаимодействует с мишенями на поверхности клетки и влияет на миграцию клеток. Полученные нами данные подтверждают сведения о существовании дополнительных механизмов хсмотактического эффекта урокиназы, не связанных с ее каталитической активностью и взаимодействием с UPAR/CD87 [Carmeliet et al., 1997а; Carmcliet et al. 1998]. Возможно, найденный нами феномен миграции клеток под действием крингл-домена, поможет объяснить

противоречивость имеющихся в настоящее время литературных данных о роли различных доменов урокиназы в миграции клеток. Можно предположить, что найденная крипгл-связывающая мишень представляет собой трансмембрашшй компонент рецепторного комплекса, образующегося при участии ГФИ-заякоренного UPAR/CD87, который после активации урокиназой передает сигнал внутрь клетки. Образование аналогичных рецепторных комплексов с трансмембранным компонентом было уже показано для ряда ГФИ-заякоренных белков [Treanor et al., 1996; Jing et al„ 1996; Trupp et al., 1998; Stahl et al., 1993; Kleinetal., 1997].

А Б

Рисунок 10. Хемотактическое действие разных форм рекомбинантной урокиназы человека на миграцию клеток HEK-control, не экспреесирующих UPAR/CD87 (А) и клеток, трансфецированных рецептором урокиназы HEK-uPAR (Б). К клеткам добавляли разные формы урокиназы человека в концентрации 20 нМ. *Р < 0,001.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано действие рекомбинантных форм урокиназы человека, экспрессированных в Е. coli, на миграцию ГМК человека и клеток линий НЕК 293 и СНО. Установлено, что «ростовой» домен урокиназы участвует в миграции клеток, однако его отсутствие не приводит к потере хемотактических свойств этого белка.

2. Обнаружено, что для хемотакгического действия обязательным является наличие крингл-домена в структуре урокиназы. Хемотакгический эффект урокиназы реализуется при ее взаимодействии с высокоаффинными участками связывания (Kd ~ 12-20 нМ), локализованными на плазматической мембране клетки. Мишень, при взаимодействии с

которой урокиназа стимулирует миграцию клеток, отличается от других белков, связывающих урокиназу: UPAR/CD87 и представителей семейства рецепторов Л1Ш.

3. Установлено, что белок, связывающий крингл-домен урокиназы (крингл-связывающая мишень, КСМ), не взаимодействует с тканевым активатором плазминогена и плазминогеном. Поскольку структура крингл-доменов у плазминогена и его активаторов разная, эти данные свидетельствует о высокой специфичности взаимодействия КСМ с урокиназой.

4. Сделано заключение, что КСМ может быть новым рецептором урокиназы или адаптерным белком, сопрягающим рецептор урокиназы с эффекторными системами клетки, опосредующими стимулирующее действие урокиназы на миграцию клеток.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.А. Мухина, В.В. Степанова, М.Ю. Матвеев, С.П. Домогатский, В.А. Ткачук. Влияние факторов роста (bFGF и PDGF) на секрецию урокиназы гладкомышечными клетками. Вопросы медицинской химии, 44:84-90. 1998.

2. Т.Н. Арефьева, С.А. Мухина, А.А. Поляков, В.В. Степанова, М.М. Минашкин, Я.Г. Гурский, С.П. Домогатский, Т.Л. Красникова. Урокиназа вызывает адгезию моноцитарных клеток на фибриногене. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 84:1432-1437.1998.

3. В.В. Степанова, А. Бобик, С.П. Домогатский, С.А. Мухина, В.А. Ткачук. Участие урокиназы в миграции клеток, вызванной факторами роста. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 127:285-287. 1999.

4. V. Stepanova, S. Mukhina, Е. Kohler, TJ. Resink, P. Erne, V.A. Tkachuk. Urokinase plasminogen activator induces human smooth muscle cell migration and proliferation via distinct receptor-dependent and proteolysis-dependent mechanisms. Mol. Cell. Biochem., 195:199-206. 1999.

5. Poliakov A.A., Mukhina S.A., Traktouev D.O., Bibilashvily R.Sh., Gursky Y.G., Minashkin M.M., Stepanova V.V., and Tkachuk V.A. Chemotactic effect of urokinase plasminogen activator: a major role for mechanisms independent of its proteolytic or growth factor domains. J. Recept. Signal Transduct. Res., 19:939-951. 1999.

6. Stepanova V., Mukhina S., Traktuev D., Polyakov A., Gursky Ya., Minashkin M., Bibilashvily R., Tkachuk V. Chemotactic effect of urokinase: mechanisms distinct from its proteolytic activity and binding to uPAR via growth factor-like domain. Abstracts of Vllth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation, p. 49. 1999.

7. Mukhina S, Stepanova V, Traktouev D, Folyakov A., Bibilashvily R., Tkachuk V. Urokinase (uPA) domain specificity for smooth muscle cell migration. Abstracts of XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, p. 35. 2000.

8. Poliakov A, Stepanova V, Beloglazova I, Ragozin S, Mukhina S., Traktouev D., Tkachuk V. Cell-associated proteolytic cleavage of urokinase between growth-factor like and kringle domains commits it for rapid internalization by LRP/CD91-dependent mechanism. Abstracts of XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, p. 17. 2000.

9. Tkachuk V, Mukhina S, Traktouev D., Stepanova V. Urokinase kringle-mediated smooth muscle cell migration. Abstract of XI International Vascular Biology Meeting, Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 32:336. 2000.

10. Mukhina S, Stepanova V, Traktouev D., Poliakov A, Beabealashvilly R., Gursky Ya, Minashkin M, Shevelev A, and Tkachuk V. The chemotactic action of urokinase on smooth muscle cells is dependent on its kringle domain. Characterization of interactions and contribution to chemotaxis. J. Biol. Chcm., 275:16450-16458. 2000.

48699).

Список используемых сокращений:

uPA - активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа); r-uPAwt -рекомбииантная полноразмерная урокиназа «дикого типа»; г-иРАн<3 - рекомбинантная каталитически неактивная урокиназа с заменой His204 на Gin в активном центре; r-uPA-AGFD - рекомбинантная урокиназа, лишенная ростового домена"; r-uPAH/t3AGFD -рекомбинантная каталитически неактивная урокиназа, лишенная "ростового домена"; г-LMW - рекомбинантный каталитический домен урокиназы; r-KD - рекомбинантный крингл-домен урокиназы; uPAR/CD87 - рецептор урокиназы; LRP/(X2-MR - белок, родственный рецептору липопротеидов низкой плотности/рецептор аг-макроглобулина; tPA - тканевой активатор плазминогена; ГФИ - гликозилфосфатидилинозитол; ГМК -гладкомышечные клетки; PBS - фосфатно-солсвой буфер; BSA - бычий сывороточный альбумин; НЕК 293 - линия эмбриональных клеток почек человека; СНО - линия клеток яичников китайского хомяка; КСМ - криигл-связывающая мишень.

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж¿0 экз. Заказ № 99

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мухина, Светлана Александровна

Список сокращений, встречающихся в тексте диссертации

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура и функции урокиназы

1.1. Структура урокиназы, регуляция ее экспрессии и активности

1.1.1. Регуляция синтеза урокиназы

1.1.2. Структура урокиназы

1.1.3. Регуляция активности урокиназы

1.2. Мишени связывания урокиназы

1.2.1. Рецептор урокиназы (uPAR/CD87) и белок, связывающий урокиназу 15 (UBP)

1.2.2. Рецепторы клиренса урокиназы

1.3. Функции урокиназы

1.3.1. Протеолитические функции урокиназы

1.3.2. Влияние урокиназы на внутриклеточную сигнализацию

2. Молекулярные механизмы действия урокиназы на клетку

2.1. Влияние урокиназы на миграцию клеток

2.2. Механизмы митогенного действия урокиназы

3. Роль урокиназы в морфогенезе тканей

3.1. Роль урокиназы в физиологии и патологии сосудов

3.1.1. Рестеноз

3.1.2. Ангиогенез

3.2. Роль урокиназы в росте и метастазировании раковых опухолей 36 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Выделение и очистка рекомбинантных форм урокиназы человека

1.2. Определение концентрации белков

1.3. Электрофорез белков и иммуноблоттинг

1.4. Определение каталитической активности рекомбинантных форм 42 урокиназы человека

1.5. Иммуноферментный анализ

1.6. Восстановление и алкилирование рекомбинантного крингл-домена 44 урокиназы

1.7. Культивирование клеток

1.8. Приготовление лизатов клеток для определения экспрессии 45 UPAR/CD87 и LRP/ot2-MR

1.9. Изучение миграции клеток 45 1.10 Иодирование рекомбинантных форм урокиназы человека

1.11. Изучение связывания иодированных рекомбинантных форм 47 урокиназы человека с клетками

1.12. Статистическая обработка результатов

1.13. Материалы 4 8 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика рекомбинантных форм урокиназы человека

2.2. Оценка содержания урокиназы в культивируемых клетках

2.3. Хемотактическое действие урокиназы

2.3.1. Роль доменов урокиназы в миграции клеток

2.3.2. Мишени связывания урокиназы на поверхности клеток

2.3.3. Роль рецепторов урокиназы в хемотактическом эффекте урокиназы 69 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 72 Ключевая роль крингл-домена в миграции клеток, стимулированной 72 урокиназой

Мишени связывания урокиназы

Мишени связывания и функции других белков, содержащих крингл- 75 домены

Предполагаемый механизм хемотактического действия урокиназы

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ключевая роль крингл-домена в хемотактическом действии урокиназы"

Активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа) относится к семейству сериновых протеаз. Урокиназа, а также тканевой активатор плазминогена (tPA) с высокой специфичностью расщепляют плазминоген и превращают его в плазмин -протеазу широкой субстратной специфичности, осуществляющую лизис фибрина [Панченко и Добровольский, 1999], протеолиз белков внеклеточного матрикса [Mignatti et al., 1986], а также активирующую металлопротеиназы [Mignatti et al., 1986] и ряд факторов роста, секретируемых в латентной форме [Saksela et al., 1990; Odekon et al., 1994; Pedrozo et al., 1999]. Широкий набор экспериментальных и клинических данных свидетельствует о том, что tPA вовлечен в основном в процессы фибринолиза, в то время как урокиназа принимает участие в таких физиологических и патологических процессах, как ангиогенез [Swiercz et al., 1999, Carmeliet et al, 2000], ремоделирование сосудов [Tkachuk et al., 1996; Carmeliet et al., 1997; Strauss et al., 1999; Plekhanova et al., 2000], воспаление [Gyetko et al., 1996; Beck et al., 1999], рост и метастазирование злокачественных опухолей [Mohanam et al., 1999]. Урокиназа синтезируется и секретируется разными типами клеток в виде одноцепочечного полипептида, обладающего низкой каталитической активностью и состоящего из трех доменов - каталитического, крингл- и «ростового» доменов. После протеолитического расщепления образуется двухцепочечная форма урокиназы, осуществляющая катализ по механизму сериновых протеаз. На поверхности клетки урокиназа через «ростовой» домен связывается со специфическим рецептором UPAR/CD87; при этом происходит фокусирование протеолитической активности на лидирующем крае мигрирующих клеток [Estreicher, et al., 1990; Okada et al., 1995]. Появившиеся в последнее время данные позволяют предположить, что помимо протеазной активности урокиназа обладает также гормоноподобными свойствами и при взаимодействии с uPAR/CD87 активирует процессы внутриклеточной сигнализации [Bohuslav et al., 1995; Resnati et al., 1996; Dumler et al., 1998; Nguyen et al., 1998], что приводит к стимуляции миграции [Busso et al., 1994; Anichini et al., 1994; Dumler, 1998; Nguyen et al., 1998], адгезии [Waltz et al., 1993; Chang et al., 1998] и пролиферации клеток [Rabbani et al., 1992; Stepanova et aï, 1998; Fishman et al., 1999; Dumler et al, 1999].

Рецептор урокиназы uPAR/CD87 является гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ)-заякоренным белком [Ploug et al., 1991], не имеющим трансмембранного и цитоплазматического доменов. Таким образом, для передачи сигнала внутрь клетки необходимо взаимодействие uPAR/CD87 с трансмембранным партнером [Resnati et al., 1996; Dumler et al., 1997]. К настоящему времени уже было найдено несколько партнеров UPAR/CD87, принимающих участие в передаче сигнала от урокиназы внутрь клетки: gpl30 [Koshelnick et al., 1997], интегрины [Petty et al., 1996; Kindzelskii et al., 1997; Xue et al., 1997; May et al., 1998; Nguyen et al., 1999], комплексы pl-интегринов с кавеолином [Wei et al., 1996]. Однако, точный механизм передачи сигнала, партнеры uPAR/CD87 и их взаимодействие с UPAR/CD87 нуждаются в дальнейшем изучении. Имеющиеся в настоящее время данные о роли различных доменов урокиназы - протеазного и «ростового» - в миграции и пролиферации клеток также противоречивы. Кроме того, имеются данные о существовании дополнительных механизмов хемотактического и митогенного эффектов урокиназы, не связанных с каталитической активностью урокиназы или ее взаимодействием с uPAR/CD87 [Carmeliet et al., 1997a; Carmeliet et al. 1998; Koopman et al., 1998]. Поскольку урокиназа представляет собой мультидоменный белок, обладающий способностью связываться с разными мишенями, физиологические ответы различных типов клеток под действием урокиназы могут отражать интегративные эффекты ее доменов.

Целью данной работы являлось выяснение механизма хемотактического действия урокиназы, а также характеристика участков связывания урокиназы на поверхности клеток, опосредующих ее действие. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Выяснить роль «ростового», крингл- и каталитического доменов урокиназы в стимуляции миграции клеток.

2. Охарактеризовать участки связывания урокиназы на поверхности клеток.

3. Найти мишень, при взаимодействии с которой урокиназа стимулирует миграцию клеток.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мухина, Светлана Александровна

выводы

2. Обнаружено, что для хемотактического действия обязательным является наличие крингл-домена в структуре урокиназы. Хемотактический эффект урокиназы реализуется при ее взаимодействии с высокоаффинными участками связывания (Kd ~ 12-20 нМ), локализованными на плазматической мембране клетки. Мишень, при взаимодействии с которой урокиназа стимулирует миграцию клеток, отличается от других белков, связывающих урокиназу: uPAR/CD87 и представителей семейства рецепторов ЛНП.

4. Сделано заключение, что КСМ может быть новым рецептором урокиназы или адалтерным белком, сопрягающим рецептор урокиназы с эффекторными системами клетки, опосредующими стимулирующее действие урокиназы на миграцию клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухина, Светлана Александровна, Москва

1. Мухина С.А., Степанова В.В., Матвеев М.Ю., Домогатский С.П., Ткачук В.А. Влияние факторов роста (bFGF и PDGF) на секрецию урокиназы гладкомышечными клетками. Вопр. Мед. Химии. 1998. Т. 44. С. 84-90.

2. Кратасюк Г .А., Якубов Л.З., Синицын В.В., Домогатский С.П., Рохлин О.В., Кольцова С.В., Быняева Н.А., Федорова З.Д., Самсонов Г.В. Биополимеры и клетка. 1989. Т. 5. С. 95-101.

3. Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможности терапии. М.: Изд-во "Спорт и культура". 1999.

4. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Калинина Н.И., Бибилашвили Р.Ш., Бобик А., Ткачук В.А. Урокиназный активатор плазминогена стимулирует развитие экспериментального рестеноза. Кардиология. 2000. Т. 9. С. 69-77.

5. Плеханова О.С., Калинина Н.И., Волынская Е.А., Парфенова Е.В. Экспрессия урокиназы и ее рецептора коррелирует с пролиферацией гладкомышечных клеток в поврежденных артериях. Рос. Физиол. Журнал им. И.М. Сеченова. 2000. Т. 86. С. 18-27.

6. Степанова В.В., Гончарова Е.А., Бибилашвили Р.Ш., Ткачук В.А. Роль «ростового» домена урокиназы в миграции гладкомышечных клеток. Рос. Физиол. Журнал им. И.М. Сеченова. 1997. Т. 83. С. 158-167.

7. Ткачук В.А., Степанова В.В., Волынская Е.А. Урокиназа и ее рецептор как участники структурной перестройки тканей в норме и при патологии. Вестник Росс. Акад. Мед. Наук. 1998. Т. 8. С. 36-41.

8. Филиппова М.П., Бочков В.Н., Ткачук В.А. Рецепторы липопротеидов, липопротеид-связывающие белки и активация систем вторичных посредников. Успехи биол. Химии. 1998. Т. 38. С. 115-141.

9. Якубов JI.3., Кратасюк Г.А., Синицын В.В., Домогатский С.П., Рохлин О.В., Смирнов В.Н. Патент СССР No. 12384614 А1.

10. Agrotis A., Bobik A. Vascular remodelling and molecular biology: new concepts and therapeutic possibilities. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1996. V. 23. P. 363-368.

11. Altus M., NagamineY. Protein synthesis inhibition stabilizes urokinase-type plasminogen activator mRNA. Studies in vivo and in cell-free decay reactions. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 21190-21196.

12. Appella E., Robinson E.A., Ullrich S.J., Stoppelli M.P., Corti A., Cassani G., Blasi F. The receptor-binding sequence of urokinase. A biological function for the growth-factor module of proteases. J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 4437-4440.

13. Barlow G. H., Francis C. W., Marder V. J. On the conversion of high molecular weight urokinase to the low molecular weight form by plasmin. Thromb. Res. 1981. V. 23. P. 541-547.

14. Beck J. M., Preston A. M., Gyetko M. R. Urokinase-type plasminogen activator in inflammatory cell recruitment and host defense against Pneumocystis carinii in mice. Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 879-884.

15. Besser D., Presta M., Nagamine Y. Elucidation of a signalling pathway induced by FGF-2 leading to uPA gene expression in NIH 3T3 fibroblasts. Cell Growth Differ. 1995. V. 6. P. 1009-1017.

16. Besser D., Verde P., Nagamine Y., Blasi F. Signal transduction and the u-PA/u-PAR system. Fibrinolysis. 1996. V. 10. P . 215-237.

17. Bhat G.J., Gunaje J.J., Idell S. Urokinase-type plasminogen activator induces tyrosine phosphorilation of a 78-kDa protein in H-157 cells. Am. J. Phisiol. 1999. V. 277. P. L301-L309.

18. Bianchi E., Ferrero E., Fazioli F., Mangili F., Wang J., Bender J.R., Blasi F., Pardi R. Integrin-dependent induction of functional urokinase receptors in primary T lymphocytes. J. Clin. Invest. 1996. V. 98. P. 1133-1141.

19. Blasi F. uPA, uPAR, PAI-1: key intersection of proteolytic, adhesive and chemotactic highways? Trends Immunol. Today. 1997. V. 18. P. 415-417.

20. Bochaton-Piallat M.L., Gabbiani G., Pepper M.S. Plasminogen activator expression in rat arterial smooth muscle cells depends on their phenotype and is modulated by cytokines. Circ. Res. 1998. V. 82. P. 1086-1093.

21. Braat E.A., Levi M., Bos R., Haverkate F., Lassen M.R., de Maat M.P., Rijken D.C. Inactivation of single-chain urokinase-type plasminogen activator by thrombin in human subjects. J. Lab. Clin. Med. 1999. V. 134. P. 161-167.

22. Busso N., Masur S.K., LazegaD., Waxman S., Ossowski L. Induction of cell migration by pro-urokinase binding to its receptor: possible mechanism for signal transduction in human epithelial cells. J. Cell Biol. 1994. V. 126. P. 259-270.

23. Cannio R., Rennie P.S., Blasi F. A cell-type specific and enhancer-dependent silencer in the regulation of the expression of the human urokinase plasminogen activator gene. Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 2303-2308.

24. Cao Y., Chen A., An S.S.A., Ji R.W., Davidson D., and Llinas M. Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P.22924-22928.

25. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat. Med. 2000. V. 6. P. 389-395.

26. Carmeliet P., Moons L., Herbert J.M., Crawley J., Lupu F., Lijnen R., Collen D. Urokinase but not tissue plasminogen activator mediates arterial neointima formation in mice. Circ. Res. 1997a. V. 81. P. 829-839.

27. Carmeliet P., Moons L., Stassen J.M., Van Vlaenderen I., Declercq C., Kockx M., Collen D. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular injury in mice. Am. J. Pathol. 1997b. V. 150. P. 761-776.

28. Castellino F. J., McCance S. G. The kringle domains of human plasminogen. Ciba Found. Symp. 1997. V. 212. P. 46-60.

29. Cavallaro U., Wu Z., Di Palo A., Montesano R., Pepper M. S., Maier J. A., Soria M. R. FGF-2 stimulates migration of Kaposi's sarcoma-like vascular cells by HGF-dependent relocalization of the urokinase receptor. FASEB J. 1998. V. 12. P. 1027-1034.

30. Chang A. W., Kuo A., Barnathan E. S., Okada S. S. Urokinase receptor-dependent upregulation of smooth mucle cell adhesion to vitronectin by urokinase. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1998. V. 18. P. 1855-1860.

31. Chapman H.A. Plasminogen activators, integrins, and the coordinated regulation of cell adhesion and migration. Curr. Opin. Cell Biol. 1997. V. 9. P. 714-724.

32. Chapman H.A., Wei Y., Simon D.I., Waltz D.A. Role of urokinase recptor and caveolin in regulation of integrin signalling. Thromb. Haemost. 1999. V. 82. P. 291-297.

33. Christow S.P., Bychkov R., Schroeder C., Dietz R., Haller H., Dumler I., Gulba D.C. Urokinase activates calcium-dependent potassium channels in U937 cells via calcium release from intracellular stores. Eur. J. Biochem. 1999. V. 265. P. 264-272.

34. Clowes A.W., Clowes M.M., Au Y.P.T., Reidy M.A., Belin D. Smooth muscle cells express urokinase during mitogenesis and tissue-type plasminogen activator during migration in injured rat carotid artery. Circ. Res. 1990. V. 67. P. 61-67.

35. Collen D., Lijnen H.R. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombosis. Blood. 1991. V. 78. P. 3114-3124.

36. Collen D., Lijnen H.R. New approaches to thrombolytic therapy. Arteriosclerosis. 1984. V. 4. P. 579-585.

37. Collen D., Lijnen H.R. Recent developments in thrombolytic therapy. Fibrinol. Proteol. 2000. V. 14. P. 66-72.

38. Collen D., Zamarron C., Lijnen H.R., Hoylaerts M. Activation of plasminogen by pro-urokinase. Part II. Kinatics. J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1259-1266.

39. Conese M., Olson D., Blasi F. Protease Nexin-1-urokinase complexes are internalized and degraded through a mechanism that requires both urokinase receptor and a2-macroglobulin receptor. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 17886-17892.

40. Creemers E., Cleutjens J., Smits J., Heymans S., Moons L., Collen D., Daemen M., Carmeliet P. Disruption of the plasminogen gene in mice abolishes wound healing after myocardial infarction. Am. J. Pathol. 2000. V. 156. P. 1865-1873.

41. Cubellis M.V., Nolli M.L., Cassani G., Blasi F. Binding of single-chain prourokinase to the urokinase receptor of human U937 cells. J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1581915822.

42. Cubellis M. V., Wun T.-C., Blasi F. Receptor-mediated internalization and degradation of urokinase is caused by its specific inhibitor PAI-1. EMBO J. 1990. V. 9. P. 1079-1085.

43. Dano K., Romer J., Nielsen B.S., Bjom S., Pyke C., Rygaard J., Lund L.R. Cancer invasion and tissue remodeling cooperation of protease systems and cell types. APMIS. 1999. V. 107. P. 120-127.

44. De Petro G., Copeta A., Barlati S. Urokinase-type and tissue-type plasminogen activators as growth factors of human fibroblasts. Exp. Cell Res. 1994. V. 213. P. 286294.

45. Degen J.L., Estensen R.D., Nagamine Y., Reich R. Induction and desensitization of plasminogen activator gene expression by tumor promoters. J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 12426-12433.

46. Del Rosso M., Anichini E., Pedersen N., Blasi F., Fibbi G., Pucci M., Ruggiero M. Urokinase-urokinase receptor interaction: non-mitogenic signal transduction in human epidermal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 190. P. 347-352.

47. Dudani A.K. and Ganz P.R. Endothelial cell surface actin serves as a binding site for plasminogen, tissue plasminogen activator and lipoprotein(a). British J. Haemat. 1996. V. 95. P. 168-178.

48. Dudani A.K., Hashemi S., Aye M. T., Ganz P. R. Identification of an endothelial cell surface protein that binds plasminogen. Mol. Cel. Biochem. 1991. V. 108. P. 133-139.

49. Dudani A.K., Pluskota A., Ganz P.R. Interaction of tissue plasminogen activator with a human endothelial cell 45-kilodalton plasminogen receptor. Biochem. Cell Biol. 1994. V.72.P. 126-131.

50. Duffy M.J., Maguire T.M., McDermott E.W., O'Higgins N. Urokinase plasminogen activator: a prognostic marker in multiple types of cancer. J. Surg. Oncol. 1999. V. 71. P. 130-135.

51. Dumler I., Hucho F., Gulba D. Signal transduction via urokinase receptor: is a transmembrane adapter molecule really necessary? Fibrinol. Proteol. 1997. V. 11. P. 165-169.

52. Dumler I., Kopmann A., Weis A., Mayboroda O. A., Wagner K., Gulba D. C., Haller H. Urokinase activates the Jak/Stat signal transduction pathway in human vascular endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999a. V. 19. P. 290-297.

53. Dumler I., Petri T., Schleuning W. D. Induction of c-fos gene expression by urokinase-type plasminogen activator in human ovarian cancer cells. FEBS Lett. 1994. V. 343. P. 103-106.

54. Dumler I., Petri T., Schleuning W.-D. Interaction of urokinase-type plasminogen activator (u-PA) with its cellular receptor induces phosphorylation on tyrosine of a 38 kDaProtein. FEBS Lett. 1993. V. 322. P. 37-40.

55. Dumler I., Stepanova V., Jerke U., Mayboroda O.A., Vogel F., Bouvet P., Tkachuk V., Haller H., Gulba D.C. Urokinase-induced mitogenesis is mediated by casein kinase 2 and nucleolin. Current Biol. 1999. V. 9. P. 1468-1476.

56. Dumler I., Weis A., Mayboroda O. A., Maasch C., Jerke U., Haller H., Gulba D. C. The Jak/Stat pathway and urokinase signalling in human aortic vascular smooth muscle cells. J.Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 315-321.

57. Duval-Jobe C., Parmely M.J. Regulation of plasminogen activatoin by human U937 promonocytic cells. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 21353-21357.

58. Ellis V., Scully M.F., Kakkar V.V. Plasminogen Activation Initiated by Single-chain Urokinase-type Plasminogen Activator. Potentiation by U937 Monocytes. J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 2185-2188.

59. Epshtein S.E., Speir E., Unger E.F., Guzman R.J., Finkel T. The basis of molecular strategies for treating coronary restenosis after angioplasty. J. Am. Coll. Cardiol. 1994. V. 23. P. 1278-1288.

60. Estreicher A., Wohlwend A., Belin D., Schleuning W.-D., Vassali, J.-D. Characterization of the cellular binding site for the urokinase-type plasminogen activator. J. Biol. Chem. 1989 V. 264. P. 1180-1189.

61. Fazioli F., Resnati M., Sidenius N., Higashimoto Y., Appelle E., Blasi F. A urokinase-sensitive region of the human urokinase receptor is responsible for its chemotactic activity. EMBO J. 1997. V. 16. P. 7279-7286.

62. Fibbi G., Ziche M., Morbidelli L., Magnelli L., Del Rosso M. Interaction of urokinase with specific receptors stimulates mobilization of bovine adrenal capillary endothelial cells. Exp. Cell Res. 1988. V. 179. P. 385-395.

63. Fidler I.J., Ellis L.M. The implication of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell. 1994. V. 79. P. 185-188.

64. Fless G. M., Snyder M. L., Furbee J. W. Jr., Garcia-Hedo M. T., Mora R. Subunit composition of lipoprotein(a) protein. Biochemistry. 1994. V. 33. P. 13492-13501.

65. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, reumatoid and other disease. Nat. Medicine. 1995. V. 1. P. 27-31.

66. Gherardi E., Sharpe M., Lane K. Properties and structure-function relationship of HGF-SF. Exper. Suppl. 1993. V. 65. P. 31-48.

67. Goretzki L., Mueller B.M. Low-density-lipoprotein-receptor-related protein (LRP) interacts with a GTF-binding protein. Biochem. J. 1998. V. 336. P. 381-386.

68. Graham C.H., Fitzpatrick T.E., McCrae K.R. Hypoxia Stimulates Urokinase Receptor Expression Through a Heme Protein-Dependent Pathway. Blood. 1998. V. 91. P. 33003307.

69. Gualandris A., Presta M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of urokinase-type plasminogen activator expression in endotelial cells by basic fibroblast growth factor. J. Cell. Physiol. 1995. V. 162. P. 400-409.

70. Gunzler W.A., Steffens G.J., Otting F., Kim S.M., Frankus E., Flohe L. The promary structure of high molecular urokinase from human urine. The complete amino acid sequence of the A chain. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982. V. 363. P. 1155-1165.

71. Gyetko M. R., Sitrin R. G., Fuller J. A., Todd R. F. 3rd, Petty H. R., Standiford T. J. Function of the urokinase urokinase receptor (CD87) in neutrophil chemotaxis. J. Leukoc. Biol. 1995. V. 58. P. 533-538.

72. Gyetko M. R., Todd R. F. 3rd, Wilkinson C. C., Sitrin R. G. The urokinase receptor is required for human monocyte chemotaxis in vitro. J. Clin. Invest. 1994. V. 93. P. 13801387.

73. Hfoyer-Hansen G., Ploug M., Behrendt N., Ramie E., Dan0 K. Cell-surface acceleration of urokinase-catalyzed receptor cleavage. Eur. J. Biochem. 1997. V. 243. P. 21-26.

74. Ffoyer-Hansen G., R0nne E., Solberg H., Behrendt N., Ploug M., Lund L.R., Ellis V., Dan0 K. Urokinase plasminogen activator cleaves its cell surfase receptor releasing the ligand-binding domain. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 18224-18229.

75. Haddock R. C., Spell M. L., Baker 3rd C. D., Grammer J. R., Parks J. M., Speidel M., Booyse F. M. Urokinase binding and receptor identification in cultured endothelial cells. J.Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 21466-21473.

76. Hajjar K.A. The endothelial cell tissue plasminogen activator receptor. Specific interaction with plasminogen. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 21962-21970.

77. Hajjar K.A., Jacovina A.T., and Chacko J. An endothelial cell receptor for plasminogen/tissue plasminogen activator. I. Identity with annexin II. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 21191-21197.

78. Haj-Yehia A., Nassar T., Sachais B., Kuo A., Bdeir K., Al-Mehdi A.B., Mazar A., Cines D., Higazi A. A.-R. Urokinase-derived peptides regulate vascular smooth muscle contraction in vitro and in vivo. FASEB J. 2000. V. 14. P. 1411-1422.

79. Hamada J., Cavanaugh P.G., Lotan 0.,Nicolson G. Separable growth and migration factors for large-cell lymphoma cells secreted by microvascular endothelial cells derived from target organs for metastasis. Br. J. Cancer. 1992. V. 66. P. 349-354.

80. Harlos K., Boys,C. W., Holland S. K., Esnouf M. P., Blake C. C. Structure and order of the protein and carbohydrate domains of prothrombin fragment 1. FEBS Lett. 1987. V. 224. P. 97-103.

81. He C.J., Rebibou J.M., Peraldi M.N., Meulders Q., Rondeau E. Growth factor-like effect of urokinase type plasminogen activator in human renal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176. P. 1408-1416.

82. Herz J., Clouthier D.E., Hammer R.E. LDL receptor-related protein internalizes and degrades uPA-PAI-1 complexes and is essential for embryo implantation. Cell. 1992. V. 71. P. 411-421.

83. Herz J., Goldstein J.L., Strickland D.K., Ho Y.K., Brown M.S. 39-kDa protein modulates binding of ligands to low density lipoprotein receptor-related protein/a2-macroglobulin receptor. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 21232-21238.

84. Herz J., Kowal R C., Goldstein J.L., Brown M.S. Proteolytic processing of the 600 kd low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) occurs in a trans-Golgi compartment. EMBO J. 1990. V. 9. P. 1769-1776.

85. Higazi A.A.-R., Aceto J.F., Kniss D., Upson R., Cohen R., Dichek D.A., Cines, D. Unesterified long chain fatty acids inhibit the binding of single chain urokinase to the urokinase receptor. Biochemistry. 1996a. V. 35. P. 6884-6890.

86. Higazi A.A.-R., Cohen R.L., Henkin J., Kniss D., Schwartz B.S., Cines, D.B. Enhancement of the enzymatic activity of single-chain urokinase plasminogen activator by soluble urokinase receptor. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 17375-17380.

87. Higazi A.A.-R., Mayer M. In vitro inhibition of urokinase by penicillins. Thromb. Haemost. 1988. V. 60. P. 305-307.

88. Hofmann R., Lehmer A., Buresh M., Härtung R., Ulm K. Clinical relevance of urokinase plasminogen activator, its receptor, and its inhibitor in patients with renal carcinoma. Cancer Res. 1996. V. 78. P. 487-492.

89. Holst-Hansen C., Johannessen B., Hoyer-Hansen G., Romer J., Ellis V., Brunner N. Urokinase-type plasminogen activation in three human breast cancer cell lines correlates with their in vitro invasiveness. Clin. Exp. Metastasis. 1996. V. 14. P. 297-307

90. Howell B.W., Gertler F.B., Cooper J.A. Mouse disabled (mDabl): a Src binding protein implicated in neuronal development. EMBO J. 1997. V. 16. P. 121-132.

91. Kasai S., Arimura H., Nishida M., Suyama T. Primary structure of single-chain pro-urokinase. J. Biol. Chem. 1985b. V. 260. P. 12382-12389.

92. Kielberg V., Andreasen P.A., Grondahl-Hansen J., Nielsen L.S., Skriver L., Dano K. Proenzyme to urokinase-type plasminogen activator in the mouse in vivo. FEBS Lett. 1995. V. 182. P. 441-445.

93. Kim H., Baumann H. Transmembrane domain of gpl30 contributes to intracellular signal transduction in hepatic cells. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 30741-30747.

94. Kindzelskii A. L., Eszes M. M., Todd R. F. 3rd, Petty H. R. Proximity oscillations of complement type 4 (axP2) and urokinase receptors on migrating neutrophils. Biophys. J. 1997. V. 73. P. 1777-1784.

95. Kindzelskii A. L., Laska Z.O., Todd R. F. 3rd, Petty H. R. Urokinase-type plasminogen activator receptor reversibly dissociates from complement receptor type 3 (CD1 lb/CD 18) during neutrophil polarization. J. Immunol. 1996. V. 156. P. 297-309.

96. Koopman J.L., Slomp J., de Bart A.C.W., Quax P.H.A., Verheijen J.H. Mitogenic effects of urokinase on melanoma cells are independent of high affinity binding to the urokinase receptor. J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 33267-33272.

97. Kounnas M.Z., Henkin J., Argraves W.S., Strikland D.K. Low density lipoprotein receptor-related protein/oc2-macroglobulin receptor mediates cellular uptake of pro-urokinase. J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 21862-21867.

98. Krieger M., Herz J. Structures and functions of multiligand lipoprotein receptors: macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein (LRP). Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 601-637.

99. Kumar R., Yoneda J., Bucana C. D., Fidler I. J. Regulation of distinct steps of angiogenesis by different angiogenic molecules. Int. J. Oncol. 1998. V. 12. P. 749-757.

100. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

101. Lee J.S., Favre B., Hemmings B.A., Kiefer B., Nagamine,Y. Ocadaic acid-dependent induction of the urokinase-type plasminogen activator gene associated with stabilization and autoregulation of c-Jun. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 2887-2894.

102. Lee J.S., von der Ahe D., Kiefer B., Nagamine Y. Cytosceletal reorganization and TPA differently modify AP-1 to induce the urokinase-type plasminogen activator gene in LLC-PKi cells. Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 3365-3372.

103. Lee T. H., Rhim T., Kim S. S. Prothrombin kringle-2 domain has a growth inhibitory activity against basic fibroblast growth factor-stimulated capillary endothelial cells. J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 28805-28812.

104. Lijnen H.R, Lupu F., Moons L., Carmeliet P., Goulding D., Collen D. Temporal and topographic matrix metalloproteinase expression after vascular injury in mice. Thromb. Haemost. 1999. V. 81. P. 799-807.

105. Liu J.-N., Tang W., Sun Z.Y., Kung W., Pannell R., Sarmientos P., Gurevich V. A site-directed mutagenesis of pro-urokinase which substantially reduces its intrinsic activity. Biochem. 1996. V. 35. P. 14070-14076.

106. Liu M. W., Roubin G.S., King IE S.B. Restenosis after coronary angioplasty. Potential biologic determinants and role of intimal hyperplasia. Circulation. 1989. V. 79. P. 13741387.

107. MacDonald T. J., DeClerck Y. A., Laug W. E. Urokinase induces receptor mediated brain tumor cell migration and invasion. J. Neurooncol. 1998. V. 40. P. 215-226.

108. Manchanda N., Schwartz B.S. Interaction of single-chain urokinase and plasminogen activator inhibitor type 1. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 20032-20035.

109. Manchanda N., Schwartz B.S. Single chain urokinase. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 14580-14584.

110. Mandriota S.J., Seghezzi G., Vassali J.-D., FerraraN., Wasi S., Mazzieri R., Mignatti P., Pepper M.S. Vascular endothelial growth factor increases urokinase receptor expressiom in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 9709-9716.

111. Marchina E., Barlati S. Degradation of human plasma and extracellular matrix fibronectin by tissue type plasminogen activator and urokinase. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1996. V.28.P. 1141-1150.

112. Markotte P.A., Kozan I.M., Dorwin S.A., Ryna J.M. The matrix metalloproteinase pump-1 catalyzes the formation of low molecular weigth (pro)urokinase in cultures of human kidney cells. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 13803-13806.

113. May A. E., Kanse S. M., Lund L. R., Gisler R. H., Imhof B. A., Preissner K. T. Urokinase recptor (CD87) regulates leukocyte recruitment via beta 2 integrins in vivo. J. Exp. Med. 1998. V. 188. P. 1029-1037.

114. Mazar A. P., Buko A., Petros A., Barnathan E. S., Henkin J. Domain analysis of urokinase plasminogen activator (u-PA): preparation and characterization of intact A-chain molecules. Fibrinolysis. 1992. V. 6 (Suppl. 1). P. 49-55

115. Mignatti P., Mazzieri R., Rifkin D.B. Expression of the urokinase receptor in vascular endothelial cells is stimulated by basic fibroblast growth factor. J. Cell Biol. 1991. V. 113. P. 1193-1201.

116. Mignatti P., Robbins E., Rifkin D.B. Tumor invasion through the human amniotic membrane: requirement for a proteinase cascade. Cell. 1986. V. 47. P. 487-498.

117. Mimuro J., Kaneko M., Murakami T., Matsuda M., and Sakata Y. Reversible interactions between plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1. Biochem. Biophys. Acta. 1992. V. 1160. P. 325-334.

118. Morioka S., Lazarus G.S., Baird J.L., Jensen P.J. Migrating keratinocytes express urokinase-type plasminogen activator. J. Invest. Dermatol. 1987. V. 88. P. 418-423.

119. Moser T.L., Stack M.Sh., Asplin I., Enghild J.J., Hojrup P., Everitt L., Hubchak S., Schnaper H.W., Pizzo S.V. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 2811-2816.

120. Myohanen H.T., Stephens R.W., Hedman K., Tapiovaara H., R0nne E., Ftoyer-Hansen G., Dano K., Vaheri A. Distribution and lateral mobility of the urokinase-receptor complex at the cell surface. J. Histochem. Cytochem. 1993. V. 41. P. 1291-1301.

121. Nagamine Y., Sudol M., Reich E. Hormonal regulation of plasminogen activator mRNA production in porcine kidney cells. Cell. 1983. V. 32. P. 1181-1190.

122. Naldini L., Vigna E., Bardelli A., Follenzi A., Galimi F., Comoglio P. M. Biological activation of pro-HGF (Hepatocyte Growth Factor) by urokinase is controlled by a stoichiometric reaction. J. Biol. Chem. 1994. V. 270. P. 603-611.

123. Nanbu R., Menoud P.-A., Nagamine Y. Multiple instability-regulating sites in the 3'untraslated region of the urokinase-type plasminogen activator mRNA. Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 4920-4928.

124. Nicosia R.F., Tchao R., Leighton J. Interactions between newly formed endothelial channels and carcinoma cells in plasma clot culture. Clin. Exp. Metastasis. 1986. V. 4. P. 91-104.

125. Nykjaer A., Conese M., Christensen E.I., Olson D., Cremona O., Gliemann J., Blasi F. Recycling of the urokinase receptor upon internalization of the uPA:serpin complexes. EMBO J. 1997. V. 16., P. 2610-2620.

126. Panettieri R. A., Murray R. K., DePalo L. R., Yadvish P. A., Kotlikoff M. I. A human airway smooth muscle cell line that retains physiological responsiveness. Am. J. Physiol. 1989. V. 256. P. C329-C355.

127. Pannel R., Gurewich V. Activation of plasminogen by single-chain urokinase ot by two-chain urokinase a demonstration that single-chain urokinase has a low catalytic activity (pro-urokinase). Blood. 1987. V. 69. P. 22-26.

128. Pearson D., Altus M.S., Horiuchi A., Nagamine Y. Dexamethasone coordinately inhibits plasminogen activator gene expression and enzyme activity in porcine kidney cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 143. P. 329-336.

129. Pepper M.S., Sappino A.-P., Montesano R., Orci L., Vassalli J.-D. Plasminogen activator inhibitor-1 is induced in migrating endothelial cells. J. Cell Physiol. 1992. V. 153. P. 129-139.

130. Pepper M.S., Sappino A.-P., Stöcklin R., Montesano R., Orci L., Vassalli J.-D. Upregulation of urokinase receptor on migrating endothelial cells. J. Cell Biol. 1993. V. 122. P. 673-684.

131. Pepper M.S., Vassalli J.-D., Montesano R., Orci L. Urokinase-type plasminogen activator is induced in migrating capillary endothelial cells. J. Cell Biol. 1987. V. 105. P. 2535-2541.

132. Petersen L. C., Lund L. R., Nielsen L. S., Dano K., Skriver L. One-chain urokinase-type plasminogen activator from human sarcoma cells is a proenzyme with little or no intrinsic activity. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 11189-11195.

133. Piguet P.F., Vesin C., Donati Y., Tacchini-Cottier F., Belin D., Barazzone C. Urokinase receptor (uPAR, CD87) is a platelet receptor important for kinetics and TNF-induced endothelial adhesion in mice. Circulation. 1999. V. 99. P. 3315-3321.

134. Plouet J., Moro F., Bertagnolli S., Coldeboeuf N, Mazarguil H., Clamens S., Bayard F. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 13390-13396.

135. Ploug M., Ellis V., Dano K. Biochemistry. 1994. V. 33. P. 8991-8997.

136. Ploug M., Ranne E., Behrendt N., Jensen A.L., Blasi F., Dan0 K. Cellular receptor for urokinase plasminogen activator. Carboxyl-terminal processing and membrane anchoring by glycosyl-phosphatidylinositol. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 1926-1933.

137. Poliakov A.A., Mukhina S.A., Traktouev D.O., Bibilashvily R.Sh., Gursky Y.G., Minashkin M.M., Stepanova V.V., Tkachuk V.A. J. Recept. Signal Transd. Res. 1999. V. 19. P. 939-951.

138. Potempa J., Korzus E., Travis J. The serpin superfamily of proteinase inhibitors: structure, function, and regulation. J. Biol. Chem. 1994. V. 15957-15960.

139. Rabbani S. A., Mazar A. P., Bernier S. M., Haq M., Bolivar I., Henkin J., Goltzman D. Structural requirements for the growth factor activity of the aminoterminal domain of urokinase. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 14151-14156.

140. Rajput B., Degen S.F., Reich E., Waller E.K., Axelrod J., Eddy R.L., Shows T.B. Chromosomal locations of human tissue plasminogen activator and urokinase genes. Science. 1985. V. 230. P. 672-674.

141. Reidy M.A., Irvin C., Lindner V. Migration of arterial wall cells. Expression of plasminogen activators and inhibitors in injured rat arteries. Circ. Res. 1996. V. 87. P. 405-414.

142. Reilly C.F., McFall R.C. Platelet-derived growth factor and transforming growth factor-P regulate plasminogen activator inhibitor-1 synthesis in vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 9419-9427.

143. Resnati M., Guttinger, M., Valcamonica, S., Sidenius, N., Blasi, F., Fazioli, F. Proteolytic cleavage of the urokinase receptor substitutes for the agonist-induced chemotactic effect. The EMBO J. 1996. V. 15. P. 1572-1582.

144. Reuning U., Bang N.U. Regulation of the urokinase-type plasminogen activator receptor on vascular smooth muscle cells is under the control of thrombin and other mitogens. Arterioscler. Thromb. 1992. V. 12. P. 1161-1170.

145. Rhim T. Y., Park C. S., Kim E., Kim, S. S. Biochem. Boiphys. Res. Commun. 1998. V. 252. P. 513-516.

146. Ribatti D., Leali D., Vacca A., Giuliani R., Gualandris A., Roncali L., Nolli M.L., Presta M. In vivo angiogenic activity of urokinase:role of endogenous fibroblast growth factor-2. J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 4213-4221.

147. Riccio A., Grimaldi G., Verde P., Sebastio G., Boast S., Blasi F. The human urokinase-plasminogen activator gene and its promote. Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 27592771.

148. Rickles R.J., Strickland S. Tissue plasminogen activator mRNA in murine tissues. FEBS Lett. 1988. V. 229. P. 100-106.

149. Ried S., Jager C., Jeffers M., Vande Woude G.F., Graeff H., Schmitt M., Lengyel E. Activation mechanisms of the urokinase-type plasminogen activator promoter by hepatocyte growth factor/scatter factor. J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 16377-16386.

150. Thromb. Haemost. V. 54. P. 893. 238.Sappino A.P., Huarte J., Belin D., Vassalli J.D. Plasminogen activators in tissue remodeling and invasion: mRNA localization in mouse ovaries and implanting embryos. J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 2471-2479.

151. Sawa H, Lundgren CH, Brown SL, Fujii S. Dependence of human vascular cell surface proteolysis on expression of the urokinase receptor. J. Thromb. Thrombolysis. 1996. V. 3. P. 331-336.

152. Schwartz B.S. Differential inhibition of soluble and cell surface receptor-bound single-chain urokinase by plasminogen activator inhibitor type 2. A potential regulatory mechanism. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 8319-8323.

153. Schwartz B.S., Espafla F. Two distinct urokinase-serpin interactions regulate the initiation of cell surface-associated plasminogen activation. J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 15278-15283.

154. Shetty S., Kumar A., Johnson A.R., Idell S. Regulation of mesothelial cell mitogenesis by antisense oligonucleotides for the urokinase receptor. Antisense Res. Dev. 1995. V. 5. P. 307-314.

155. Sidenius N., Blasi F. Domain 1 of the urokinase receptor (uPAR) is required for uPAR-mediated cell binding to vitronectin. FEBS Lett. 2000. V. 470. P. 40-46.

156. Simon D.I., Rao N.K., Xu H., Wei Y., Majdic O., Ronne E., Kobzik L., Chapman H A. Mac-1 (CDllb/CD18) and the urokinase receptor (CD87) form a functional unit on monocytic cells. Blood. 1996. V. 99. P. 3185-3194.

157. Simon D.I., Wei Y., Zhang L., Rao N.K., Xu H., Chen Z., Liu Q., Rosenberg S., Chapman H.A. Identification of a urokinase receptor-integrin interaction site. Promiscuous regulator of integrin function. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 1022810234.

158. Siren V., Myohanen H., Vaheri A., Immonen I. Transforming growth factor beta induces urokinase receptor expression in cultured retinal pigment epithelial cells. Ophthalmic Res. 1999. V.31.P. 184-191.

159. Sitrin R.G., Pan P.M., Harper H.A., Todd R.F. 3rd, Harsh D.M., Blackwood R.A. Clustering of urokinase receptors (uPAR; CD87) induces proinflammatory signaling in human polymorphonuclear neutrophils. J. Immunol. 2000. V. 165. P. 3341-3349.

160. Solberg H., Romer J., Brunner N., Holm A., Sidenius N., Dano K., Hoyer-Hansen G. A cleaved form of the receptor for urokinase-type plasminogen activator in invasive transplanted human and murine tumors. Int. J. Cancer. 1994. V. 58. P. 877-881.

161. Sprengers E.D., Kluft C. Plasminogen Activator Inhibitors. Blood. 1987. V. 69. P. 381387.

162. Stahl N. Yancopoulos G. D. The alphas, betas, and kinases of cytokine receptor complexes. Cell. 1993. V. 74. P. 587-590.

163. Steffens G.J., Gunzler W.A., Otting F., Frankus E., Flohe L. The complete amino acis sequence of low molecular mass urokinase from human urine. 1982. V. 363. P. 10431058.

164. Stephens R.W., Bokman A.M., Myohanen H.T., Reisberg T., Tapiovaara H., Pedersen N., Grondahl-Hansen J., Llinas M., Vaheri, A. (1992) Heparin binding to the urokinase kringle domain. Biochemistry. 1992. V. 31. P. 7572-7579.

165. Stief T.W., Radtke K.P., Heimburger N. Inhibition of urokinase by protein C-inhibitor (PCI). Evidence for identity of PCI and plasminogen activator inhibitor 3. Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1987. V. 368. P. 1427-1433.

166. Chem. 1986a. V. 261. P. 1267-1273. 267.Swiercz R., Skrzypczak-Jankun E., Merrell M.M., Selman S.H., Jankun J. Angiostatic activity of synthetic inhibitors of urokinase type plasminogen activator. Oncol. Rep. 1999. V. 6. P. 523-526.

167. Takahashi K., Kwaan H.C., Ikeo K., Koh E. Phosphorylation of a surface receptor bound urokinase-type plasminogen activator in a human metastatic carcinomatous cell line. Biochem. Biophys. Res .Commun. 1992. V. 182. P. 1466-1472.

168. Takahashi K., Kwaan H.C., Koh E., Tanabe M, Enzymatic properties of the phosphorylated urokinase-type plasminogen activator isolated from a human carcinomatous cell line. Biochim. Biophys. Res. Commun. 1992b. V. 182. P. 1473-1481.

169. Tkachuk V., Stepanova V., Little P.J., Bobik A. Regulation and role of urokinase plasminogen activator in vascular remodelling. Clin. Exp. Pharmac. Physiol. 1996. V. 23. P. 759-765.

170. Towbin H., Staehelin T., Gordon G. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. V. 76. P. 4350-4354.

171. Trupp M., Raynoschek C., Belluardo N., Ibanez C.F. Multiple GPI-anchored receptors control GDNF-dependent and independent activation of the c-Ret receptor tyrosine kinase. Mol. Cell Neurosci. 1998. V. 11. P. 47-63.

172. Ueshima S., Matsumoto H., Izaki S., Mitsui Y., Fukao H., Okada K., Matsuo O. Co-localization of urokinase and its receptor on established human umbilical vein endothelial cell. Cell Struct. Funct. 1999. V. 24. P. 71-78.

173. Ugwu F., Van Hoef B., Bini A., Collen D., Lijnen H.R. Proteolytic cleavage of urokinase-type plasminogen activator by stromelysin-1 (MMP-3). Biochemistry. 1998. V. 37. P. 7231-7236.

174. Utermann G. The Mysteries of Lipoprotein(a). Science. 1989. V. 246. P. 904-910.

175. Van Zonneveld A.J., Veerman H., MacDonald M.E., van Mourik J.A., Pannekoek H. Structure and function of human tissue-type plasminogen activator (t-PA). J. Cell. Biochem. 1986. V. 32. P. 169-178.

176. Vassali J.-D., Baccino D., Belin D. A cellular binding site for the Mr 55,000 form of the human plaminogen activator, urokinase. J. Cell Biol. 1985. V. 100. P. 86-92.

177. Vassalli J.-D., Belin D. Amiloride selectively inhibits the urokinase-type plasminogen activator. FEBS Lett. 1987. V. 214. P. 187-191.

178. Vassalli J.-D., Dayer J.-M., Wohlwend A., Belin D. Concomitant secretion of prourokinase and of a plasminogen activator inhibitor by cultured human monocytes-macrophages. J. Exp. Med. 1984. V. 159. P. 1653-1668.

179. Verde P., Stoppelli M.P., Galeffi P., Di Nocera P., Blasi F. Identification and primary sequence of an unspliced human urokinase poly(A)+ RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 4727-4731.

180. Von der Ahe D., Pearson D., Nagamine Y. Macromolecular interaction on a cAMP responsive region in the urokinase-type plasminogen activator gene: a role of protein phosphorylation. Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 1991-1999.

181. Wahlberg K., Hoyer-Hansen G., Casslen B. Soluble receptor for urokinase plasminogen activator in both full-length and a cleaved form is present in high concentration in cystic fluid from ovarian cancer. Cancer Res. 1998. V. 58. P. 3294-3298.

182. Walter J.J., Sane D.C. Angiostatin binds to smooth muscle cells in the coronary artery and inhibits smooth muscle cell proliferation and migration in vitro. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999 V. 19. P. 2041-2048.

183. Waltz D. A., Chapman H. A. Reversible cellular adhesion to vitronectin linked to urokinase receptor occupancy. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 14746-14750.

184. Waltz, D. A., Sailor, L. Z., and Chapman, H. A. (1993) J. Clin. Invest. 91,1541-1552

185. Wang W., Chen H. J., Gieddi K. N., Schwartz A., Cannon P. J. (1995) Circ. Res. 77, 1095-1106

186. Wang Y., Dang J., Johnson L.K., Selhamer J.J., Doe W. Structure of the human urokinase receptor gene and its similarity to CD59 and the Ly-6 family. Eur. J. Biochem. 1995. V. 227. P. 116-122.

187. Webb D.J., Nguyen D.H., Sankovic M., Gonias S.L. The very low density lipoprotein receptor regulates urokinase receptor catabolism and breast cancer cell motility in vitro. J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 7412-7420.

188. Webber M.M., Waghray A. Urokinase-mediated extracellular matrix degradation by human prostatic carcinoma cells and its inhibition by retinoic acid. Clin. Cancer. Res. 1995. V. l.P. 755-761.

189. Wei Y., Lukashev M., Simon D. I., Bodary S. C., Rosenberg S., Doyle M. V., Chapman H. A. Regulation of integrin function by the urokinase receptor. Science. 1996. V. 273. P. 1551-1555.

190. Wei Y., Waltz D.A., Rao N., Drummond R.J., Rosenberg S., Chapman H.A. Identification of the urokinase receptor as an adhesion receptor for vitronectin. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 32380-32388.

191. Wijnberg M J., Nieuwenbroek N.M.E., Slomp J., Quax P.N.A., Verheijen J.H. Urokinase and tissue-type plasminogen activator stimulate human vascular smooth muscle cell migration. Fibrinolysis. 1996. V. 10. Suppl. 2. P.75-78.

192. Willnow T., Rohlmann A., Horton J., Otani H., Braun J.R., Hammer R.E., Herz J. RAP, a specialized chaperone, prevents ligand-induced ER retention and degradation of LDL receptor-related endocytic receptors. EMBO J. 1996. V. 15. P. 2632-2639.

193. Willnow T.E., Hilpert J., Armstrong S.A., Rohlmann A., Hammer R.E., Burns D.K., Herz J. Defective forebrain development in mice lacking gp330/megalin. Proc. natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8460-8464.

194. Willnow T.E., Nykjaer A., Herz J. Lipoprotein receptors: new roles for ancient proteins. Nat. Cell Biol. 1999. V. 1. P. E157-E162.

195. Wolf B.B., Brown M.D. Epidermal growth factor-binding protein activates soluble and receptor-bound single chain urokinase-type plasminogen activator. FEBS Lett. 1995. V. 376. P. 177-180.

196. Wun T.C., Schleuning W.D., Reich E. Isolation and characterization of urokinase from human plasma. J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 3276-3283.

197. Yebra M., Goretzki L., Pfeifer M., Mueller B.M. Urokinase-type plasminogen activator binding to its receptor stimulates tumor cell migration by enhancing integrin-mediated signal transduction. Exp. Cell Res. 1999. V. 250. P. 231-240.

198. Zhang L., Strickland D.K., Cines D.B., Higazi A.A. Regulation of single chain urokinase binding, internalization, and degradation by a plasminogen activator inhibitor 1-derived peptide. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 27053-27057.

Информация о работе

Мухина, Светлана Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Ключевая роль крингл-домена в хемотактическом действии урокиназы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы