Роль МАР-киназ в стимулируемой урокиназой миграции гладкомышечных клеток человека

Гончарова, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль МАР-киназ в стимулируемой урокиназой миграции гладкомышечных клеток человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль МАР-киназ в стимулируемой урокиназой миграции гладкомышечных клеток человека"

о*

> ч

На правах рукописи

ГОНЧАРОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ МАР-КИНАЗ В СТИМУЛИРУЕМОЙ УРОКИНАЗОЙ МИГРАЦИИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена в лаборатории Клеточной подвижности НИИ Экспериментальной Кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научный руководитель:

кандидат биологических наук А. В. Воротников

Научный консультант:

академик РАМН, член-корреспондент РАН, профессор В.А. Ткачук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

П.В. Авдонин

кандидат биологических наук А.Я. Коц

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 15 июня 2000 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 074.22.02 в РК НИК МЗ РФ (Москва, 121552, 3-я Черепковская ул., д. 15 а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан 13 мая 2000 года

Ученый секретарь диссертационного совет;

к.б.н.

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Миграция клеток является ключевым процессом при эмбриогенезе, заживлении ран и метастазировании злокачественных опухолей. Направленная миграция гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов происходит при ангиогенезе и рестенозе, а также на начальном этапе образования атеросклеротнческих бляшек и ремоделирования стенок поврежденных сосудов (Stary et al, 1989; Forrester et al, 1991). Миграция клеток - комплексный феномен, включающий рецепцию внешнего сигнала и поляризацию клетки по градиенту стимула, активацию внутриклеточных путей передачи сигнала, приводящих к перестройкам цитоскелета, образованию филоподий и ламеллоподий и их адгезии, актомиозш-зависимое перемещение тела клетки, деадгезию и ретракцию (Mitchison and Cramer, 1996). Внешними сигналами могут служить либо субстрат-связанные компоненты внеклеточного матрикса, вызывающие гаптотаксис, либо растворимые факторы, включающие факторы роста, цитокины и активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа), стимулирующие хемотаксис. Выявление активируемых ими внутри клетки сигнальных каскадов и конечных мишеней в сократительном аппарате ГМК представляется важным для понимания механизмов клеточной миграции и ряда сосудистых патологий, включая атеросклероз и рестеноз.

Урокиназа играет ключевую роль в миграции ГМК. Повреждение сосудистой стенки приводит к увеличению секреции урокиназм, которая стимулируют направленную миграцию ГМК в просвет сосуда и образование неоинтимы (Tkachuk et al, 1996). Мигрирующие клетки отличаются повышенным содержанием рецептора урокиназы, представляющего собой гликозилфосфатидилинозитод-заякоренный белок, не имеющий трансмембранного и внутриклеточного доменов. Рецептор урокиназы располагается на переднем крае мигрирующей клетки и обеспечивает локализованное связывание урокиназы, опосредуемую ей активацию плазмина и деструкцию внеклеточного матрикса (Okada et al, 1995). С другой стороны установлено, что урокиназа стимулирует миграцию клеток независимо от ее протеолитической активности (Del Rosso et al, 1993), что предполагает участие адапторных белков в инициации специфических сигнальных путей от рецептора урокиназы внутрь клетки. В то время как природа таких белков пока неизвестна,

предполагается, что их непосредственными мишенями могут являться тирозиновые и серин/треониновые протеинкиназы, а также низкомолекулярные ГТФ-связывающие белки семейств Ras и Rlio (Koshelnik et al, 1999). Активация Ras связана с активацией р42/р44"н'2 МАР-киназного каскада, тогда как Rho инициирует процессы перестройки цитоскелета и активацию р38 МАР-киназного каскада (Hall, 1998; Widmann et al, 1999).

Установлено участие p42/p44erk1-2 в гаптотаксисе трансформированных немышечных клеток (Klemke et al, 1997) и их миграционном ответе на факторы роста (Anand-Apte et al., 1997) и урокиназу (Nguyen et al, 1999). В этих клетках активация р42/р44"к1,2 коррелировала с повышением уровня фосфорилирования как киназы регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина, так и самих РЛЦ (Klemke et al, 1997, Nguyen et al, 1999), а фосфорилирование киназы РЛЦ p42/p44erkU in vitro стимулировало ее активность (Morrison et al., 1996). Было сделано заключите, что опосредуемое р42/р44етк1'2 увеличение уровня фосфорилирования РЛЦ миозина и активация актомиозина является ключевым механизмом активации клеточкой миграции, в том числе и урокиназой.

В то же время, роль p42/p44crt1'2, а также регулируемых Rho МАР-киназных каскадов, в стимуляции миграции ГМК урокиназой остается неясной. Роль р38 МАРК каскада была установлена для хемотаксиса ГМК, стимулируемого факторами роста и цитокинами, тогда как необходимость активации p42/p446rkU была опровергнута (Hedges et al, 1999). Более того, стимулируемая факторами роста миграция других типов клеток зависела от активации р38 МАРК и последующего фосфорилирования основной цитоскелетной мишени этого каскада, низкомолекулярного белка теплового шока HSP27 (Rousseau et al, 1997; Heuertz et al, 1999).

Таким образом, индивидуальная роль МАР-киназных каскадов в стимуляции миграции ГМК урокиназой остается неизвестной. Неясно также, является ли фосфорилирование РЛЦ миозина и HSP27 достаточным для развития миграционного ответа ГМК на урокиназу или необходимо также участие других компонентов цитоскелета. Важным является также установление индивидуальной роли доменов урокиназы в селективной активации тех или иных сигнальных каскадов, приводящих к стимуляции миграции ГМК.

Целью данной работы было исследовать роль МАР-киназных сигнальных каскадов в стимуляции миграции ГМК человека урокиназой и выявить их белки-мишени, ассоциированные с актомиозином. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить индивидуальную роль доменов урокиназы в стимуляции миграции

ГМК.

2. Установить участие МАР-киназных каскадов в миграции ГМК человека и роль доменов урокиназы в активации МАР-киназ.

3. Исследовать участие МАР-киназ в фосфорилировании цитоскелетных белков под действием урокиназы.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что при стимуляции миграции ГМК человека урокиназой происходит активация как р42/р44с,к1'\ так и р38 МАРК. Определены домены урокиназы, необходимые для избирательной активации этих сигнальных каскадов. Активация р42/р44"к|'2 зависит только от протеолитической активности, тогда как активация р38 МАРК зависит от «крингл» и «ростового» доменов урокиназы, но не зависит от ее протеолитической активности. Ингибирование активации как р42/р44сгк1'2, так и р38 МАРК блокирует миграцию ГМК, стимулируемую полноразмерной урокиназой. Обнаружено, что, в отличие от р38 МАРК, активация р42/р44сгк1'2 не обязательна для миграции ГМК в ответ на урокиназу, лишенную протеолитической активности с помощью сайт-направленного мутагенеза. Урокиназа стимулирует фосфорилирование РЛЦ миозина и ке влияет на фосфорилирование Н5Р27, которое максимально в ГМК человека, однако, этого не достаточно для обеспечения миграционного ответа ГМК. Установлено, что фосфорилирование капьдесмона МАР-киназой влияет на его связывание с внутриклеточным актином и выявлен возможный механизм участия этого белка в регуляции архитектуры и динамики цитоскелета.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на межлабораторном семинаре ИЭК РКНПК МЗ РФ (Москва, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 научных работы.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания ¡материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 30 рисунками. Список литературы включает 302 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рекомбинантные формы урокиназы были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории Генной Инженерии Института Экспериментальной Кардиологии КНЦ. В работе были использованы рекомбинантная полноразмерная урокиназа (r-uPA) и ее мутантные производные - урокиназа без «ростового» домена (т.е., лишенная 43 N-концевых аминокислотных остатков, r-uPAAGFD), протеолитически неактивная урокиназа за счет замены Гис204->Глн в активном центре (r-uPAHCJ), протеолитически неактивная урокиназа с заменой Гис204->Глн без «ростового» домена урокиназа с модифицированным «ростовым»

доменом (с заменой первых 24 аминокислот на 13 чужеродных аминокислот, г-uPAmut), а также индивидуальный каталитический домен урокиназы (С-концевыс остатки 136-411, r-LMW).

Бактериальная экспрессия и выделение белков. Клетки Е. coli штамма BL21 (DE3) pLys трансформировали вектором pM\VT7, содержащим кДНК С-концевою (HI) и N-концевого (N152) фрагментов кальдесмона (Vorotnikov et al, 1997). Экспрессию, индуцированную IPTG, и последующий лизис клеток проводили согласно протоколу для рЕТ системы (Novagen, США). Бактериальную суспензию озвучивали, добавляли NaCl до конечной кошвдЕгграцик 400 мМ, кипятили в течение 5 минут и центрифугировали при 18000 х g, 30 мин при 4°С. Очистку белков из надосадочной жидкости проводили ионообменной хроматографией на SP-Sepharose (доя HI) или DEAE-Sephacel (для N-152).

Создание конструкта pFLAG-N152 и транзиторная трансфекция. кДНК, кодирующую последовательность 1-152 кальдесмона гладких мышц курицы, субклонировали из конструкта pMWT7-N 152 (Vorotnikov et al, 1997) в вектор pFLAG CMV2 (Kodak, США) no EcoR 1 и BamH I рестриктным сайтам. Клоны, содержащие вставку, были отобраны с помощью рестрикционного анализа. Конечная конструкция кодировала полипепдид, включающий остатки 1-152 кальдесмона и дополнительную

FLAG-последователыюсть (N-Аеп-Тир-Лиз-Асп-Асп-Асп-Асп-Лиз-С). Трансфекцшо эмбриональных фибробластов курицы конструктом pFLAG-NI52 проводили с помощью набора Maxifectin-21 (Pepline, Россия) по протоколу производителя. В качестве контрольного вектора использовали pFLAG-BAP (Kodak, США). После фиксации через 8-16 часов, трансфипированные клетки выявляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя антитела М2 к FLAG-эпитопу.

Выделение и культивирование клеток. ГМК из мускульного желудка эмбриона курицы выделяли путем диссоциации ткани в 0.25% растворе трипсина в ФСБ без Ca2f и Mg2' при 37°С. Изолированные клетки подсчитывали в камере Горяева, суспензию клеток разводили до требуемой плотности средой роста (ДМЕМ, 2 мМ L-глутамина, 10% ЭТС, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина) и высаживали на чашки Петри, 6-луночные плашки или на покровные стекла. ГМК культивировали в атмосфере 95% воздуха, 5% ССЬ при 37°С. В экспериментах использовали клетки первичной культуры и 1-3 пассажей, используя 0.25% трипсин в растворе Версена для пассирования. Клетки HeLa (АТСС# CCL-2), ГМК из аорты крысы 18-21 пассажей (Neylon et al, 1992) и ГМК из трахеи человека 9-11 пассажей (Panettieri et al, 1989) культивировали в средах DMEM или М-199, содержащих or 0,5% до 10% ЭТС, Ь-глуташт/пеншпшшн/стрептомшшн как указано выше. Клетки пассировали, обрабатывая 0.25% раствором трипсина и 1 мМ ЭДТА в ФСБ, в чашках Петри диаметром 3,5 или 5 см или 6-луночных плашках. Перед проведением большинства экспериментов клетки депривировали 24-48 часов в среде DMEM с заменой ЭТС на 0,1% БСА, либо в среде ДМЕМ с 0,5% ЭТС и добавлением L-глутамина/пенициллина/ стрептомицин как указано выше.

Миграцию ГМК измеряли с использованием микрокамеры Бойдена (Skinner et al, 1994). В нижние ячейки микрокамеры Бойдена помещали различные формы рекомбинантаой урокиназы, в верхние ячейки вносили по 50 мкл суспензии, содержащей 30-50x103 клеток. Верхние и нижние ячейки разделяли полупроницаемой мембраной с размером пор 8 микрон (Neuroprobe, США). Камеру помещали на 2-4 часа в ССЬ-инкубатор. Далее мембрану вынимали и удаляли непромигрировавшие клетки. Клетки, перешедшие на нижнюю сторону мембраны, фиксировали метанолом и окрашивали красителем Dif Quick. Количественную обработку данных проводили как описано для иммуноблотов. В некоторых экспериментах ГМК преинкубировали в

течение 2 часов с 50 мкМ PD 98059 (ингибитор p42/p44c,ku) или 10 мкМ SB 202190 (ингибитор р38 МАРК) (Calbiochem, США), после чего определяли их миграционный ответ в присутствии тех же количеств ингибиторов в обоих ячейках микрокамеры Бойдена. В ряде экспериментов миграцию ГМК исследовали методом «царапин». Клеточный монослой повреждали при помощи скрепера, делая царапины шириной 1,75 мм, инкубировали в среде роста, содержащей рекомбинантную урокиназу или ее мутантные формы и анализировали скорость зарастания царапин по отношению к контрольной, фотографируя места повреждения монослоя на фотомикроскопе Nikon.

Активацию МАР-киназ определяли по изменению их двойного фосфорилирования с помощью специфических антител фирмы New England Biolabs (США). Иммуноблоты лизатов клеток окрашивали антителами, выявляющими только р42/р44сг11'2, дифосфорилированные по остаткам Тре202/Тир204, или антителами, специфичными только для р38 МАРК., дифосфорилированной по остаткам Тре180/Тир182. Идентичные мембраны окрашивали параллельно поликлоналъными антителами к p42/p44trtu и р38 МАРК. Уровень фосфорилирования МАРК рассчитывали после сканирования мембран как отношение фосфо-МАРК к их общему количеству. При использовании ингибиторов МАР-киназ ГМК преипкубировали 2 часа с PD 98059 или SB 202190 до начала стимуляции.

Определение уровня фосфорилирования регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина. Иммуноблоты лизатов клеток окрашивали антисывороткой, специфичной к РЛЦ, фосфорилированным по Сер 19 (любезно предоставленной проф. Д.М. Ваттерсоном, Северо-Западный Университет, Чикаго, США) или антителами к РЛЦ миозина (Sigma, США). Уровень фосфорилирования РЛЦ оценивали по соотношению фосфо-РЛЦ к тотальным РЛЦ.

Определение уровня фосфорилирования HSP27 в ГМК трахеи человека до и после стимуляции урокиназой проводили методом изоэлектрофокусирования (Loktionova et al, 1998) с последующим иммуноблотингом, используя коммерческие поликлональные антитела к HSP27 (StressGen, США).

Анализ связывания эндогенного кальдесмона с цитоскелетом. Клетки HeLa, эмбриональные фибробласты или ГМК курицы промывали холодным ФСБ и демембранировали в течение 15 минут в растворе 10 мМ Трис/HCl (рН 7.0), 60 мМ

KCl, 125 мМ сахарозы, 0,05% Тритона Х-100, 0,1 тМ ЭГТА, 5 mM MgCl2, 1 тМ дитиотреитола и 0,05 шМ PMSF. После двукратной промывки раствором А (10 мМ Трис/HCl (pH 7.0), 30 мМ KCl, 5 мМ MgCh, 1 мМ ДТТ, 0,05 мМ PMSF), клетки инкубировали 15 минут с различными концентрациями фрагментов кальдесмона в буфере А, промывали 4 раза буфером А, лизировали 2-кратным буфером нанесения и подвергали электрофорезу и иммуноблотингу. Нитроцеллюлозные мембраны окрашивали поликлональными кроличьими антителами к кальдесмону (Shirinsky et al., 1989), или их фракцией, специфичной к N-концевому фрагменту кальдесмона, полученной аффинным отделением на иммобилизованном N152. Фосфорилирование С-концевого фрагмента кальдесмона HI рекомбинантной GST-p44erlu МАРК проводили как описано ранее (Krymsky et al., 1999).

Электрофорез проводили в пластинах 7.5-10 % полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия по методу Laemmli (1970).

Иммуноблоттинг проводили при комнатной температуре по методу Towbin et al. (1979), используя нитроцеллюлозную или PVDF мембраны. Электроперенос проводили в стандартном трис-глицин/этанольном буфере, содержащем 0.02 % ДСН, в течение 1 часа при напряжении 100В в камере Miniprotean (Bio-Rad). Далее мембрану блокировали в течение 1 часа раствором 5% обезжиренного молока или раствором 2% БСА в ФСБ, содержащем 0.1% Твин-20. Инкубации с антителами проводили в ТСБ, содержащем 0.1 % Твин-20 и 1 -2 % обезжиренного молока, или 2% БСА в течение 1 часа при комнатной температуре. Были использованы конъюгаты вторых антител с пероксидазой хрена. После отмывки мембран от антител и Твин-20, белковые полосы детектировали 3,3'-диаминобензидином или хемилюминесцентным методом используя набор реактивов фирмы Amersham (Великобритания). Количественную обработку данных проводили после сканирования мембран и люминограмм на сканере HP ScanJet СХ с использованием гтрограмного обеспечения NIH Image 1.58 и Kaleidagraph 3.08 на компьютере Macintosh LC475.

И.ммунофлуоресценция. Все операции проводили при комнатной температуре. Культивированные на покровных стеклах клетки фиксировали 3.7% раствором формальдегида в ФСБ в течение 5-10 мин, обрабатывали 2-10 мин 1 % раствором Тритона Х-100 в ФСБ и отмывали ФСБ. Стекла инкубировали 30 мин с ЭТС и затем

наносили на них первые антитела в ФСБ, содержащем 1 мг/мл БСА. После инкубации в течение 1 часа во влажной камере стекла промывали 3 раза по 2 мин ФСБ, инкубировали 1 час со вторыми антителами, меченными ФИТЦ или Техасским Красным, и отмывали ФСБ. Клетки помещали между предметным и покровным стеклами в заливочную среду Aquapolymount (США) и фотографировали на пленку Kodak Tri-X Pro или T-max под Фотомикроскопом III (Zeiss, Германия).

Концентрацию белков определяли по цветной реакции с Кумасси G-250 при помощи реактива фирмы Bio-Rad (США) согласно протоколу производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние урокиназы и ее мутантных форм на миграцию ГМК. Рекомбинантная урокиназа приблизительно в 2 раза стимулировала хемотаксис ГМК трахеи человека (рис. 1).

Формы урокиназы, содержащие «крингл» домен (r-uPA, r-uPAHQ, г-иРАдс,го и r-uPAltQ' ), стимулировали миграцию ГМК сходным образом. Удаление «ростового» домена (r-uPA->r-uPAÄGFD, r-uPAH/y->r-uPAH'°AGID), а также протеолитической активности (r-uPA->r-uPA1I/Q, r-uI>AiGFD->r-uPAI"',,Ar'Fn) не отражалось на способность этих конструктов стимулировать миграцию. Форма r-LMW, не имеющая «ростового» и «крингл» доменов, но обладающая протеолитической активностью, не вызывала миграционного ответа. r-uPAmut не только не вызывала миграции ГМК человека (рис.1), но и ингибировала миграцию ГМК аорты крысы под действием урокиназы в поврежденном клеточном монослое (данные не приведены). Кроме того, r-uPAmut специфически связывалась с поверхностью клеток и конкурировала с r-uPA за низкоаффинное связывание.

Таким образом, «крингл» домен урокиназы необходим, а протеолитическая активность урокиназы не существенна для стимуляции миграции ГМК. Этот вывод согласуется с результатами, полученными Мухиной и соавт. (Mukhina et al, 2000), которые установили, что специфическое связывание «крингл» домена урокиназы с клеточной поверхностью (Kd~20 нМ), но не высокоаффинное взаимодействие «ростового» домена с рецептором урокиназы (Ка=1,5 нМ), играет ключевую роль в стимуляции клеточной миграции. В то же время, результаты, полученные с r-uPAmut (рис.1), предполагают важность сохранения нативной конформации и/или евзывания

«ростового» домена с рецептором для стимуляции миграции ГМК полноразмерной урокиназой. Нарушение конформации этого домена вследствие мутагенеза не влияет

контроль г-иРА

Г.цРДН/О

/"Уг^т г-иРАдат

г-иРАн,а'Л5|:о фСЭ г-иРАти! В r-LMW

л л £ X,

О 100 200

стимуляция миграции, %

Рисунок 1, Стимуляция миграции ГМК человека урокиназой и ее мутантными формами.

А- формы урокипазы, использованные в работе.

Б - диаграмма стимуляции миграции различными формами урокипазы. Уровень миграции измерят через 4 часа стимуляции ГМК 20 нМ хемоаттрактапта. Представлены средние значения ± стандартная ошибка из 4 независимых экспериментов.

на связывание «крингл» домена с его специфической мишенью, но, по-видимому, препятствует инициации внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих к развитию миграционного ответа ГМК. Мы предполагаем, что г-иРАти! является искусственным антагонистом уроки назы и блокатором г-иРА-зависимой миграции клеток.

Роль МАР-кнназ в активации миграции ГМК урокиназой. Обработка ГМК человека полноразмерной урокиназой приводила к транзигорной активации МАР-киназных каскадов с максимумом через 5-15 мин для р42/р44сгЫ'2 и 5 мин в случае р38 МАРК. Кроме того, активирующий эффект урокиназы был концентрационно-

зависимым, и максимальная стимуляция как р42/р44н •, так и р38 МАРК наблюдалась при добавлении 20 нМ г-иРА.

Для оценки необходимости участия МАР-киназ в обеспечении миграционного ответа ГМК мы исследовали, как ингибирование активации р42/р44еЛи (с помощью 50 мкМ РБ 98059) или р38 МАРК (с помощью 10 мкМ БВ 202190) влияет на миграцию ГМК под действием 20 нМ г-иРА. Преинкубация с любым из ингибиторов приводила к подавлению хемотаксиса ГМК (рис.2). Это означает, что активация как р42/р44"к1'2, так и р38 МАРК необходима для миграции ГМК под действием г-иРА.

200

(0 о.

п; с;

100

20 нМ г-иРА 50 мкМ Рй 98059 10 мкМБВ 202190

Рисунок 2. Влияние ингибиторов МАР-киназ на миграцию ГМК человека под действием г-иРА.

Представлены средние значения ± стандартная ошибка из 4 независимых экспериментов.

Определение доменов урокиназы, необходимых для избирательной активации МАР-киназ. Мы исследовали степень активации МАР-киназ после обработки ГМК трахеи человека г-иРА и ее мутантными формами (рис. 3). Активация р42/р44сгк1,2 наблюдалась при стимуляции клеток формами урокиназы, обладающими протеолитической активностью, но различающихся по наличию «ростового» и «крингл» доменов (г-иРА, г-ЬМ\¥, г-иРАлст° г-иРАшй). В то же время, формы урокиназы, не обладающие протеолитической активностью (г-иРАшз и практически не стимулировали р42/р44егИ'2. Таким образом, для активации

р42/р44ик1'2 МАР -киназного каскада необходима протеолитическая активность урокиназы.

м га

| 200

о. <

о;

I 100

I-

<Я

Рисунок 3, Активация р42/р44сгк1'2 и р38 МАР-кнназ различными формами

урокиназы в ГМК человека.

Уровень активности МАР-киназ определяли после стимуляции ГМК 20 нМ полноразмерпой урокиназы или ее мутантных форм в течение 5 минут Представлены средние значения ± стандартная ошибка из 6 независимых экспериментов.

Мы предполагаем, что опосредуемая урокиназой деградация внеклеточного матрикса приводит к высвобождению связанных с ним факторов роста, которые, воздействуя на свои рецепторы, запускают р42/р44егЫ'2 каскад независимо от связывания «ростового» и «крингл» доменов г-иРА с поверхностью ГМК.

Напротив, активация р38 МАРК происходила при стимуляции ГМК формами урокиназы, содержащими «крингл» домен (г-иРА, г-иРАн/<>, г-иРАЛ0ГО и г-иРАндлога) и не зависела от протеолитической активности урокиназы (форма г-ЬМ\¥) (рис. 3). Кроме того, важная роль нативного «ростового» домена урокиназы следует из

различного активирующего действия r-uPA и r-uPAAGFD, а также неспособности г-uPAmut с поврежденным «ростовым» доменом активировать р38 МАРК.

Таким образом, можно проследить четкую корреляцию между способностью различных форм урокиназы стимулировать миграцию ГМК и активацией р38 МАР-киназного каскада. Сопоставляя эти результаты с данными Mukhina et al. (2000) можно предположить, что связывание «крингл» домена урокиназы с его мишенью на поверхности ГМК является ключевым в стимуляции миграционного ответа ГМК. Однако такое связывание «крингл» домена не является достаточным для стимуляции р38 МАРК и миграции под действием r-uPAimit, что свидетельствует о возможности разобщения связывания и функционального эффекта урокиназы. Мы предполагаем потенциальную возможность использования uPAmut как терапевтического антагониста эндогенной урокиназы.

Поиск цитоскелетных мишеней МАР-киназ, вовлеченных в клеточную миграцию. Наиболее вероятными конечными мишенями МАРК, играющими важную роль в миграции, являются белки, связанные с цитоскелетом - РЛЦ миозина, белок теплового шока HSP27 и кальдесмон.

1. Исследования последних лет показали, что р42/р44егк, :2 МАРК играет ключевую роль в миграции немышечных клеток и постулировали, что РЛЦ миозина являются конечной мишенью этого каскада (Nguyen et al., 1999). В связи с этим мы изучили эффект урокиназы на фосфоршшрование РЛЦ в ГМК человека и исследовали, является ли фосфоршшрование РЛЦ достаточным для генерации миграционного ответа этих клеток.

Уровень фосфорилирования РЛЦ миозина возрастал после стимуляции ГМК 20 нМ r-uPA, r-LMW или г- uPAIIQ (рис. 4), что не было связано с активацией только p42/p44erku сигнального каскада (см. рис. 3). Этот результат указывает на наличие альтернативного пути повышения уровня фосфорилирования РЛЦ в ГМК под действием, в частности, г-иРА1У0. Тот факт, что r-uPAHQ избирательно активирует р38 МАРК каскад, предполагает возможность р38-опосредуемого фосфорилирования РЛЦ. Для проверки этой возможности мы обработали ГМК анизомицином, специфическим активатором р38 МАРК (Hazzalin et al, 1998). При этом мы обнаружили более чем 10-кратную активацию эндогенной р38 МАРК при неизменной активности р42/р44сгЫ'2, однако уровень фосфорилирования РЛЦ также не изменялся

(данные не представлены). Это означает, что в ГМК человека фосфорилирование РЛЦ не опосредуется р38 МАРК или активируемыми ей протеинкииазами. Вероятно,

zr с;

I Л са о

CL 5 <=. S

а.

f о

■е-

i О)

ш о

а. >.

350

300

250

время стимуляции, мин

Рисунок 4, Влияние r-uPA, r-LMW и r-uP.\"/y на эндогенное фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина.

Представлены средние значения ± стандартная ошибка из 4 независимых экспериментов,

повышение уровня фосфорилирования РЛЦ может происходить за счет ингибирования активности фосфатазы РЛЦ миозина под действием Rho-кииазы, как это было показано ранее (Kureishi et al. 1997). Интересно, что активация как Rlio-киназы, так и р38 МАРК каскада находится под общим контролем белка Rho и может, тем самым, происходить параллельно. Более того, важная роль Rho-киназы в обеспечении миграции и метастатической активности опухолевых клеток была продемонстрирована ее специфическим ингибированием in vivo (Somlyo et al., 2000).

Поскольку r-LMW стимулирует фосфорилирование РЛЦ миозина (рис.4), но не влияет на миграцию ГМК (см. рис.1), можно утверждать, что повышение уровня фосфорилирования РЛЦ не является достаточным для развития миграционного ответа ГМК. Это означает, что фосфорилирование других цитоскелетных белков,

наиболее вероятно, р38 МАР-киназой, может участвовать в r-uPA-зависимой миграции ГМК.

2. Было отмечено, что миграция немышечных клеток коррелирует с фосфорилированием и последующим связыванием с актиновым цитоскелетом низкомолекулярного белка теплового шока HSP27 (Piotrowicz et al, 1998). С помощью изоэлектрофокусирования и иммуноблотинга мы исследовали влияние урокиназы на фосфорилирование HSP27 в ГМК человека (данные не представлены). Было обнаружено, что HSP27 находится преимущественно в ди- и три-фосфорилированном состоянии в нестимулированных ГМК и обработка клеток урокиназой не приводит к увеличению степени его фосфорилирования. Таким образом, участие других компонентов цитоскелета необходимо для миграционного ответа ГМК на урокиназу.

Известно, что актин-связанный белок кальдесмон ингибирует активность акгомиозина в гладкомышечных и немышечных клетках (Shirinsky et al, 1999). Было также показано, что кальдесмон является одной из основных мишеней МАР-киназ in vivo, однако, это фосфорилирование не влияет на его ингибиторные свойства, но уменьшает сродство к актину in vitro (Krymsky et al, 1999). Логично предположить, что если этот эффект фосфорилирования кальдесмона реализуется в интактном цигоскелете, то результатом будет диссоциация кальдесмона с актина и активация актомиозина. Для проверки этого предположения мы исследовали вытеснение эндогенного кальдесмона из скицированных клеток рекомбинантным актин-связывающим фрагментом кальдесмона человека HI до и после его фосфорилирования МАР-киназой in vitro. В немышечных клетках линии HeLa большая часть кальдесмона связана только с актином и может быть диссоциирована при добавлении возрастающих концентраций HI (рис. 5). Фосфорилирование HI МАР-киназой значительно снижало его способность вытеснять эндогенный кальдесмон из нативного цитоскелета, вероятнее всего, вследствие ухудшения связывания фосфо-Н1 с актином (рис. 5). Это означает, что фосфорилирование кальдесмона МАР-киназой может приводить к непрямой активации сократительного аппарата клетки. В гладкомышечных клетках другой функцией кальдесмона может быть стабилизация структуры актомиозина. Помимо актин-связывающих участков, расположенных в пределах С-концевой части молекулы и фрагмента HI, N-концевой домен кальдесмона имеет участок связывания с миозином (Ikebe and Reardon, 1988),

однако, возможность взаимодействия кальдеемона с миозином in vivo долгое время была под сомнением.

О 2 4 6 8 10 Н1, мкМ

Рисунок 5. Влияние фосфоршшрования С-концсвого фрагмента кальдеемона III

МАР-киназой на его способность диссоциировать эндогенный

кальдесмон из скннированных клеток линии HeLa.

Представлены средние значения ± стандартная ошибка из 2 независимых экспериментов.

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание эмбриональных фибробластов курицы поликлональными антителами к кальдесмону и РЛЦ миозина выявляет колокализацито кальдеемона и миозина (рис. 6 А, Б), однако, это не дает возможости судить о прямом взаимодействии кальдеемона с миозином из-за существешгой колокализации актина и миозина (данные не представлены). Поэтому мы трансфицировали клетки конструктом, кодирующим 152 N-концевых остатка кальдеемона (N152) и содержащим дополнительную FLAG-последователыюсть. Окрашивание клеток антителами М2 к FLAG-последовательности или к миозину выявило колокализацито этих белков (рис. 6 В, Г), тогда как трансфекция клеток контрольной плазмидой приводила к равномерному распределению BAP-FLAG по всей цитоплазме. Это означает, что кальдесмон связывается с миозином in vivo с помощью своего N-концевого домена.

Используя рекомбинантные М-концевой (N-152) и С-концевой (Н1) фрагменты белка, мы проанализировали взаимодействие кальдесмона с компонентами интактного цитоскелета эмбриональных фибробластов - предшественников ГМК (рис. 7).

Рисунок 6. Внутриклеточная локализация кальдесмона и его N-концевого фрагмента N152 в эмбриональных фибробластах курицы.

A, Б - двойное иммунофлуоресцешпиое окрашивание клеток антителами к 1'ЛЦ миолша (А) и антителами к калъдесмону (Б).

B, Г - двойное иммунофлуоресцснтное окрашивание клеток антителами к кальбасмоиу (R) и антителами М2 к МАСт-посиеОователыюапи, узнающими химерный белок N152-FLAH (Г).

Оказалось, что добавление N152 не приводило к диссоциации эндогенного кальдесмона, что означает отсутствие только миозин-связанной фракции эндогенного кальдесмона. Добавление возрастающих количеств HI приводило к незначительному (не более 30%) вытеснению эндогенного белка, тогда как одновременное добавление ill и N152 вызывало существенную диссоциацию кальдесмона (до 60%, рис. 7).

Таким образом, кальдесмон не только ингибирует активность сократительного аппарата клетки, но и физически связывает филаменты актина и миозина in vivo. Фосфорилирование кальдесмона МАР-киназой ослабляет его связывание с актином, что может приводить к деструктуризации цитоскелета и повышению его динамики. Поскольку кальдесмон может являться субстратом как p42/p44crt1,2 (Adam et al, 1993), так и р38 МАР-киназ (Hedges et al, 1999), мы предполагаем, что его

фосфорилирование вносит существенный вклад в миграцию ГМК под действием хемоатграктантов, стимулирующих МАР-киназные каскады, и определяет необходимость дальнейшего изучения роли фосфорилирования кальдесмона в миграции ГМК, стимулируемой урокиназой.

X I (Я <*> S? о4 100

о; ш О 1- 80

и Q)

С О 60

о Ьй

s О

о О 40

о ч: л 1-S ZS 20

с; о

« ЬЙ

0 5 10 15 20

фрагменты кальдесмона, мкМ

Рисунок 7. Вытеснение эндогенного I-кальдесмона его С-копцевым (Iii) и N-концевым (N152) фрагментами из скицированных эмбриональных фибробластов курицы.

Представлены средние значения ± стандартная ошибка из б независимых экспериментов.

Таким образом, суммируя полученные результаты и данные литературы, мы предполагаем следующую схему участия МАР-киназ в передаче сигнала от урокиназы к белкам - компонентам цитоскелета. Связывание урокиназы с поверхностью ГМК приводит к активации малых ГТФ-связывающих белков Ras и Rho, и к опосредуемой ими активации p42/p44crU-2 и р38 МАР-киназных сигнальных каскадов (рис. 8). Активация р42/р44ик1'2 зависит от протеазной активности урокиназы и может происходить под действием факторов роста, высвобождаемых при стимулируемом урокиназой расщеплении внеклеточного матрикса. Для активации р38 необходимы «крингл» и, в меньшей степени, «ростовой» домены урокиназы, осуществляющие связывание урокиназы с клеточной поверхностью.

Активация р42/р44еЛ|'2 МАР-киназ приводит к повышению уровня фосфорилирования РЛЦ миозина, однако этот эффект может достигаться и без участия р42/р44сг11,2. Вероятно, альтернативный путь реализуется при участии Шю-киназы, активируемой белком Юю. Юю-киназа фосфорилирует и ингибирует фосфатазу легких цепей миозина, что также приводит к увеличению степени фосфорилирования РЛЦ миозина и активации актомиозина. Другой мишенью МАР-киназ является кальдесмон. Фосфорилирование приводит к ослаблению связывания кальдесмона с актином, деингибированию и дестабилизации актомиозина и к повышению динамики цитоскелета, что может играть важную роль в миграции клеток под действием урокиназы.

актомиозин

миграция

Рисунок 8, Предполагаемая роль МАР-киназ в передаче сигнала от урокиназы к компонентам цитоскелета.

ВЫВОДЫ

1. Урокиназа стимулирует миграцию ГМК трахеи человека и активацию p42/p44erU'2 и р38 МАР-киназных каскадов. Селективное илгибирование МАР-киназ подавляет миграцию ГМК, стимулируемую урокиназой.

2. Активация p42/p44crk' 2 зависит от протеолитической активности урокиназы. В активации р38 МАР-киназы участвуют «крингл» и «ростовой» домены урокиназы.

3. Урокиназа стимулирует фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина, однако этого недостаточно для развития миграционного ответа ГМК.

4. Фосфорилирование кальдесмона МАР-киназой ослабляет его связывание с актином. Такая модификация может регулировать способность кальдесмона сшивать актомиозин в цитоскелете и способствовать миграции клеток под действием урокиназы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Stepanova V., Bobik A., Bibilashvily R., Belogurov A., Rybalkin Г., Domogatsky S., Little P.J., Goncharova E., Tkachuk V. (1997) Urokinase plasminogen activator induces smooth muscle cell migration: key role of growth factor-like domain. FEBS Left., 414, 471-474.

2. Степанова В.В., Гончарова Е.А., Бибилашвили Р.Ш., Ткачук В.А. (1997) Роль «ростового» домена урокиназы в миграции гладкомышечных клеток. Российский Физиологический Журнал, 11-12, 158-167.

Работа выполнена при финансовой поддержке ННМ1 (грант 75195-546901), Wellcome

Trust и РФФИ (гранты 95-04-12260а и 96-04-106).

Список используемых сокращений:

СБ - каталитический домен, егк - протеинкиназа, регулируемая внеклеточными сигналами; 01'й - домен, гомологичный эпидермальному фактору роста («ростовой» домен), НБР27 - белок теплового шока с М, 27 кДа; г-иРА - рекомбинантная полноразмерная урокиназа; КО - «крингл» домен, г-ЬММ^ - рекомбинантный каталитический домен урокиназы; г-иРАНД-> - рекомбинантная каталитически неактивная урокиназа; г-иРАЛСР1) - рекомбинантная урокиназа без «ростового» домена; г-иРАн'ч'лого - рекомбинантная каталитически неактивная урокиназа без «ростового» домена; БСА - бычий сывороточный альбумин; ГМК - гладкомышечные клетки; МАРК - митоген-акгивируемая протеинкиназа; РЛЦ - регуляторная легкая цепь; ФСБ - фосфагно-солевой буфер; ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гончарова, Елена Александровна

Список сокращений, встречающихся в тексте диссертации.

Введение.

Обзор литературы.

1. Физиологическая роль и механизмы клеточной подвижности.

1.1 Физиологические аспекты клеточной миграции.

1.2 Механизмы клеточной подвижности.

1.2.1 Морфологическая поляризация клетки.

1.2.2 Образование ламеллоподий и филоподий.

1.2.3 Динамика фокальных контактов в движущейся клетке.

1.2.4 Перемещение клетки вперед за счет актомиозин-зависимого сокращения.

2. Пути передачи миграционных сигналов.

2.1 Пути передачи сигнала, опосредуемые факторами роста.

2.1.1 Факторы роста и их рецепторы.

2.1.2 Сигнальные пути, инициируемые рецепторами факторов роста.

2.2 Передача сигнала внутрь клетки при связывании урокиназы с ее рецептором.

2.2.1 Урокиназа, рецептор урокиназы, их участие в миграции клеток.

2.2.2 Возможные пути передачи сигнала через рецептор урокиназы.

2.3 Проведение сигнала через интегриновый рецептор.

2.3.1 Строение и функции интегринов.

2.3.2 Сигнальные пути, опосредуемые интегринами.

2.4 МАР-киназные сигнальные каскады.

2.4.1 p42/p44akhl каскад.

2.4.2 р38 каскад.

2.4.3 JNK/SAPK каскад.

2.4.4 Взамиодействие между компонентами МАР-киназных каскадов и их пространственная организация.

2.4.5 Цитоскелетные субстраты МАР-киназ.

3. Сократительный аппарат клетки и связанные с ним регуляторные белки.

3.1 Структура сократительного аппарата гладкомышечной и немышечной клеток.

3.2 Регуляция актомиозин-зависимого сокращения.

3.3 Кальдесмон.

3.3.1 Строение и предполагаемая физиологическая роль калъдесмона.

3.3.2 Регуляция активности калъдесмона фосфорилированием.

3.4 Киназа и фосфатаза легких цепей миозина.

3.5 Белки теплового шока (Hsp).

Экспериментальная часть.

Материалы и методы.

1. Материалы.

1.1 Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований.

1.2 Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований

2. Методы.

2.1 Биохимические методы.

2.1.1 Приготовление образцов клеток для электрофореза.

2.1.2 Электрофорез.

2.1.3 Изоэлектрофокусирование.

2.1.4 Фосфорилирование С-концевого фрагмента калъдесмона HI активированной рекомбинантной p44erkI МАР-киназой in vitro.

2.1.5 Определение концентрации белка.

2.2 Иммунохимические методы.

2.2.1 Аффинная очистка антител к N-концевому фрагменту калъдесмона N152.

2.2.2 Иммуноблоттинг.

2.2.3 Иммунофлуоресценция.

2.2.4 Определение уровня фосфорилирования p42/p44erk1,2 и р38 МАР-киназ.

2.2.5 Определение уровня фосфорилирования РЛЦ.

2.2.6 Определение уровня фосфорилирования HSP2 7.

2.3 Молекулярно-биологические методы.

2.3.1 Создание конструктаpFLAG-CMV-2-N152.

2.3.2 Транзиторная трансфекция эмбриональных фибробластов курицы конструктом p^FLAG-CMV-2-N152.

2.3.3 Бактериальная экспрессия и выделение белков.

2.4. Клеточно-биологические методы.

2.4.1 Культивирование клеток

2.4.2 Связывание 1251урокиназы и '25I модифицированной формы урокиназы с рецептором.

2.4.3 Миграция клеток.

2.4.3.1 Миграция клеток в микрокамере Бойдена.

2.4.3.2 Метод "царапин".

2.4.4 Выделение клеток из мускульного желудка куриного эмбриона.

2.4.5 Вытеснение эндогенного калъдесмона его фрагментами из демембранированных клеток.

2.5. Статистический анализ.

Результаты исследования.

1. Влияние урокиназы на миграцию ГМК.

2.Изучениероли МАР-киназ в активации миграции ГМКурокиназой.

2.1 Установление ключевой роли МАР-киназных каскадов в иРА-зависимой миграции ГМК.

2.1.1 Активация МАР-киназ урокиназой в культивируемых ГМК.

2.1.2 Участиер38 иp42/44erkl,2МАР-киназ в миграции под действием г-иРА.

2.2 Определение доменов урокиназы, необходимых для активации МАР-киназ.

2.2.1 Влияние протеолитической активности урокиназы на активацию МАР-киназ.

2.2.2 Влияние «ростового» и «крингл» доменов урокиназы на активацию МАР-киназ.

3. Внутриклеточные мишени МАР-киназ, вовлеченные в клеточную миграцию.

3.1 Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина.

3.1.1 Стимуляция фосфорилирования РЛЦ миозина под действием r-иРА, г-LMW и r-uPA Q.

3.1.2 Активация МАР-киназ и фосфорилирование РЛЦ под действием анизомицина.

3.2 Влияние r-uPA на фосфорилирование HSP27.

3.3 Влияние фосфорилирования кальдесмона МАР-киназой на его способность стабилизировать актомиозин in situ

3.3.1Влияние фосфорилирования калъдесмона МАР-киназой на его связывание с актином in situ.

3.3.2 Колокализация N-концевого домена калъдесмона с миозином in vivo.

3.3.3 Анализ взаимодействия калъдесмона с актомиозином в первичной культуре клеток мускульного желудка эмбриона курицы.

Обсуждение результатов.

Стимуляция миграции гладкомышечных клеток урокиназой: функциональная роль индивидуальных доменов.

Ключевая роль МАР-киназных каскадов в стимуляции миграции ГМК урокиназой.

Индивидуальная роль доменов урокиназы в активации МАР-киназных каскадов и стимуляции миграции ГМК.ЮО

Роль фосфорилирования легких цепей миозина в миграции ГМК, стимулируемой урокиназой.Ю

Роль актин-ассоциированных белков в клеточной миграции.Ю

Выводы.Ц

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль МАР-киназ в стимулируемой урокиназой миграции гладкомышечных клеток человека"

Миграция клеток является важной составляющей многих процессов, протекающих в организме животных и человека. Этот процесс является ключевым в эмбриогенезе, при заживлении ран и метастазировании злокачественных опухолей. Миграция гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов из медии в субинтиму происходит при ангиогенезе, а также на начальном этапе образования атеросклеротических бляшек и ремоделирования стенок поврежденных сосудов. Нарушение целостности сосудистой стенки приводит к высвобождению урокиназного и тканевого активаторов плазминогена, которые активируют протеазу плазмин. Плазмин и активируемые им металлопротеиназы осуществляют деградацию белков внеклеточного матрикса и обеспечивают, тем самым, пространство для мигрирующих клеток.

Миграция клеток - комплексный феномен, требующий координации многих внутриклеточных процессов. Движение клетки можно условно подразделить на несколько стадий - поляризация по градиенту стимула, образование выростов на переднем крае клетки, их прикрепление к субстрату, подтягивание тела клетки за счет актомиозин-зависимого сокращения и диссоциация адгезивных контактов в задней части клетки. Все эти процессы происходят в мигрирующей клетке практически одновременно и находятся под контролем ряда факторов роста, а также активатора плазминогена урокиназного типа и его ингибиторов.

Активатор плазминогена урокиназного типа, или урокиназа, секретируется различными типами клеток и, в отличие от тканевого активатора плазминогена, имеет на клеточной поверхности специфический рецептор. В процессе клеточной миграции рецептор урокиназы локализуется на переднем крае движущейся клетки и определяет места связывания активной урокиназы на поверхности клетки, обеспечивая локальную деструкцию внеклеточного матрикса и, тем самым, направление клеточной миграции. Кроме того, в последнее время появились данные о том, что связывание урокиназы со своим рецептором стимулирует клеточную миграцию и это не зависит от ее протеолитической активности.

Рецептор урокиназы закреплен в клеточной мембране через гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ) и не имеет трансмембранных и внутриклеточных доменов. Однако, было показано, что связывание урокиназы с ее рецептором приводит к запуску ряда внутриклеточных сигнальных каскадов. Для проведения сигнала от рецептора урокиназы внутрь клетки необходимо, по-видимому, участие адапторных белков. Они опосредуют передачу сигнала на белки - компоненты определенных сигнальных путей

10 протеинкиназу С, нерецепторные тирозиновые киназы (НРТК), киназу фокальных контактов (БАК) и митоген-активируемые протеинкиназы (МАР-киназы). Так, в последнее время было обнаружено, что активация р42/р44егк1'2 МАР-киназного каскада играет едва ли не ключевую роль в клеточной миграции, и его ингибирование приводит к подавлению миграционной активности клеток.

Предполагается, что фосфорилирование белков, ассоциированных с актиновым цитоскелетом, под действием активированной МАР-киназы определяет ее роль в процессе миграции. Было высказано предположение, что р42/р44ег1с1'2 МАР-киназы могут фосфорилировать и активировать киназу легких цепей миозина (КЛЦМ). Это сопровождается повышением уровня фосфорилирования регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина и активацией процессов актомиозин-зависимой подвижности. В то же время, роль сигнальных путей, включающих другие подтипы МАР-киназ в клеточной миграции остается в настоящее время недостаточно изученной. Кроме того, неясно, с активацией какого из МАР-киназных каскадов связано усиление миграции клеток под действием урокиназы.

Таким образом, изучение МАР-киназных сигнальных путей, запускаемых при связывании урокиназы с ее рецептором, а также белковых эффекторов этих путей, может внести существенный вклад в установление роли урокиназы в регуляции клеточной миграции и стать важным для понимания таких патологий, как атеросклероз и рестеноз.

Целью настоящей работы было исследование роли МАР-киназных сигнальных каскадов в стимуляции миграции ГМК человека урокиназой и выявление их белков-мишеней, ассоциированных с актомиозином.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить индивидуальную роль доменов урокиназы в стимуляции миграции ГМК.

3. Исследовать участие МАР-киназ в фосфорилировании цитоскелетных белков под действием урокиназы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гончарова, Елена Александровна

Выводы

1. Урокиназа стимулирует миграцию ГМК трахеи человека и активацию р42/р44ег1с1'2 и р38 МАР-киназных каскадов. Селективное ингибирование МАР-киназ подавляет миграцию ГМК, стимулируемую урокиназой.

2. Активация р42/р44егк1'2 зависит от протеолитической активности урокиназы. В активации р38 МАР-киназы участвуют «крингл» и «ростовой» домены урокиназы.

113

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гончарова, Елена Александровна, Москва

1. Белогуров А.А., Р.Ш. Бибилашвили, Л.Е. Горюнова, Е.П. Дельвер, В.В. Домкин, А.Я. Шевелев, А.А. Южаков (1993) Патент SU № 1692151 А1.

2. Воротников А.В., М.А. Крымский, М.В. Чибалина, Д.С. Кудряшов, В.П. Ширинский (2000) различия в форбол-зависимом фосфорилировании регуляторных белков и сокращении фазных и тонических гладких мышц. Цитология, в печати.

3. Adam, L., R. Vadlamudi, S.B. Kondapaka, J. ChernofF, J. Mendelsohn, and R. Kumar (1998) Heregulin regulates cytoskeletal reorganization and cell migration through the p21-activated kinase-1 via phosphatidylinositol-3 kinase. J Biol Chem 273:28238-28246.

4. Adam, L.P., J.R. Haeberle, and D.R. Hathaway (1989) Phosphorylation of caldesmon in arterial smooth muscle. J Biol Chem 264 :7698-7703.

5. Adam, L.P. and D.R. Hathaway (1993) Identification of mitogen-activated protein kinase phosphorylation sequences in mammalian h-Caldesmon. FEBS Lett 322:56-60.

6. Albelda, S.M. and C.A. Buck (1990) Integrins and other cell adhesion molecules. FASEB J 4:2868-2880.

7. Alessi, D R., A. Cuenda, P.Cohen, D.T.Dudley, and A.R. Saltiel (1995) PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen- activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J Biol Chem 270:27489-27494.

8. Amano, M., M. Ito, K. Kimura, Y. Fukata, K. Chihara, T. Nakano, Y. Matsuura, and K. Kaibuchi (1996) Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase). J Biol Chem 271:20246-20249.

9. Andre, E., M. Brink, G. Gerisch, G. Isenberg, A. Noegel, M. Schleicher, J.E. Segall, and E. Wallraff (1989) A Dictyostelium mutant deficient in severin, an F-actin fragmenting protein, shows normal motility and chemotaxis. J Cell Biol 108:985-995.

10. Appella, E., E.A. Robinson, S.J. Ullrich, M.P. Stoppelli, A. Corti, G. Cassani, and F. Blasi (1987) The receptor-binding sequence of urokinase. A biological function for the growth-factor module of proteases. J Biol Chem 262:4437-4440.

11. Aguirre Ghiso J. A., K. Kovalski and L. Ossowski (1999) Tumor indused by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and МАРК signaling. J Cell Biol 147:89-103.

12. Aspenstrom, P. (1999) The Rho GTPases have multiple effects on the actin cytoskeleton. Exp Cell Res 246:20-25.

13. Bagrodia, S., B. Dorijard, R.J. Davis, and R.A. Cerione (1995) Cdc42 and PAK-mediated signaling leads to Jun kinase and p38 mitogen-activated protein kinase activation. J Biol Chem 270:27995-27998.

14. Balzac, F., A.M. Belkin, V.E. Koteliansky, Y.V. Balabanov, F. Altruda, L. Silengo, G. Tarone (1993) Expression and functional analysis of a cytoplasmic domain variant of the beta 1 integrin subunit. J Cell Biol 121:171-178.

15. Behrendt, N., M. Ploug, L. Patthy, G. Houen, F. Blasi, and K. Dano (1991) The ligand-binding domain of the cell surface receptor for urokinase-type plasminogen activator. J Biol Chem 266:7842-7847.

16. Bendeck, M.P., N. Zempo, A.W. Clowes, R E. Galardy, and M.A. Reidy (1994) Smooth muscle cell migration and matrix metalloproteinase expression after arterial injury in the rat. CircRes 75:539-545.

17. Benjamin, I.J. and D.R. McMillan (1998) Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circ Res 83:117-132.

18. Bertagnolli, M.E., S.J. Locke, M.E. Hensler, P.F. Bray, and M.C. Beckerle (1993) Talin distribution and phosphorylation in thrombin-activated platelets. J Cell Sci 106 (Pt 4): 11891199.

19. Birukov, K.G., V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov, and N.B. Gusev (1990) Competitive binding of the troponin T-specific pool of caldesmon antibodies and tropomyosin to skeletal troponin T and smooth muscle caldesmon. FEBS Lett 262:263-265.

20. Black, D.S. and J.B. Bliska (1997) Identification of pl30Cas as a substrate of Yersinia YopH (Yop51), a bacterial protein tyrosine phosphatase that translocates into mammalian cells and targets focal adhesions. EMBO J 76:2730-2744.

21. Blasi, F. (1999) Proteolysis, cell adhesion, chemotaxis, and invasiveness are regulated by the u-PA-u-PAR-PAl-1 system. Tromb and Haemost 82:298-304.

22. Bogatcheva, N.V., A.V. Vorotnikov, K G. Birukov, V.P. Shirinsky, and N.B. Gusev (1993) Phosphorylation by casein kinase II affects the interaction of caldesmon with smooth muscle myosin and tropomyosin. Biochem J 290 (Pt 2^:437-442.115

23. Bretscher, M.S. (1992) Circulating integrins: alpha 5 beta 1, alpha 6 beta 4 and Mac-1, but not alpha 3 beta 1, alpha 4 beta 1 or LFA-1. EMBO J 77:405-410.

24. Burridge, K., C.E. Turner, and L.H. Romer (1992) Tyrosine phosphorylation of paxillin and ppl25FAK accompanies cell adhesion to extracellular matrix: a role in cytoskeletal assembly. J Cell Biol 779:893-903.

25. Burridge, K. and M. Chrzanowska-Wodnicka (1996) Focal adhesions, contractility, and signaling. Annu Rev Cell Dev Biol 72:463-518.

26. Busso, N., S.K. Masur, D. Lazega, S. Waxman, and L. Ossowski (1994) Induction of cell migration by pro-urokinase binding to its receptor: possible mechanism for signal transduction in human epithelial cells. J Cell Biol 72(5:259-270.

27. Calalb, M.B., T.R. Polte, and S.K. Hanks (1995) Tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase at sites in the catalytic domain regulates kinase activity: a role for Src family kinases. Mol Cell Biol 75:954-963.

28. Castellino F., S. Ono, F. Matsumura, and A. Luini (1995) Essential role of caldesmon in the actin filament reorganization induced by glucocorticoids. J Cell Biol 737 (5): 1223-1230.

29. Choi, K.Y., B. Satterberg, D.M. Lyons, and E.A. Elion (1994) Ste5 tethers multiple protein kinases in the MAP kinase cascade required for mating in S. cerevisiae. Cell 75:499-512.

30. Chow, C.W., M. Rincen, J. Cavanagh, M. Dickens, and R.J. Davis (1997) Nuclear accumulation of NFAT4 opposed by the JNK signal transduction pathway. Science 278:1638-1641.

31. Chrzanowska-Wodnicka, M. and K. Burridge (1996) Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. J Cell Biol 733:1403-1415.

32. Chun, J.S. and B.S. Jacobson (1993) Requirement for diacylglycerol and protein kinase C in HeLa cell-substratum adhesion and their feedback amplification of arachidonic acid production for optimum cell spreading. Mol Biol Cell 4:271-281.

33. Clowes, A.W., M M. Clowes, Y.P. Au, M.A. Reidy, and D. Belin (1990) Smooth muscle cells express urokinase during mitogenesis and tissue-type plasminogen activator during migration in injured rat carotid artery. Circ Res 67:61-67.

34. Coates, T.D., R.G. Watts, R. Hartman, and T.H. Howard (1992) Relationship of F-actin distribution to development of polar shape in human polymorphonuclear neutrophils. J Cell Biol 777:765-774.116

35. Condeelis, J. (1993) Life at the leading edge: the formation of cell protrusions. Annu Rev Cell Biol 9:411-444.

36. Condiffe A.M. and T.H. Hawkins (2000) Moving in mysterious ways. Nature ^0^:135-137.

37. Cooper, J.A. (1991) The role of actin polymerization in cell motility. Annu Rev Physiol 53:585-605.

38. Cortese, J.D., B. Schwab, C. Frieden, and E.L. Elson (1989) Actin polymerization induces a shape change in actin-containing vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A 86:5113-5111.

39. Coso, O A., M. Chiariello, J.C. Yu, H. Teramoto, P. Crespo, N. Xu, T. Miki, and J.S. Gutkind (1995) The small GTP-binding proteins Racl and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway. Cell 81:\137-1146.

40. Cox, D., J.A. Ridsdale, J. Condeelis, and J. Hartwig (1995) Genetic deletion of ABP-120 alters the three-dimensional organization of actin filaments in Dictyostelium pseudopods. J Cell Biol 725:819-835.

41. Cubellis, M.V., M L. Nolli, G. Cassani, and F. Blasi (1986) Binding of single-chain prourokinase to the urokinase receptor of human U937 cells. J Biol Chem 267:15819-15822.

42. Cubellis, M.V., T.C. Wun, and F. Blasi (1990) Receptor-mediated internalization and degradation of urokinase is caused by its specific inhibitor PAI-1. EMBO J 9:1079-1085.

43. Del Rosso, M., E. Anichini, N. Pedersen, F. Blasi, G. Fibbi, M. Pucci, and M. Ruggiero (1993) Urokinase-urokinase receptor interaction: non-mitogenic signal transduction in human epidermal cells. Biochem Biophys Res Commun 790:347-352.

44. DePasquale, J. A. and C.S. Izzard (1987) Evidence for an actin-containing cytoplasmic precursor of the focal contact and the timing of incorporation of vinculin at the focal contact. J Cell Biol 705:2803-2809.

45. DePasquale, J. A. and C.S. Izzard (1991) Accumulation of talin in nodes at the edge of the lamellipodium and separate incorporation into adhesion plaques at focal contacts in fibroblasts. J Cell Biol 773:1351-1359.

46. Dingus, J., S. Hwo, and J. Bryan (1986) Identification by monoclonal antibodies and characterization of human platelet caldesmon. J Cell Biol 702:1748-1757.

47. DiNubile, M.J., L. Cassimeris, M. Joyce, and S.H. Zigmond (1995) Actin filament barbed-end capping activity in neutrophil lysates: the role of capping protein-beta 2. Mol Biol Cell 6:1659-1671.

48. Dumler I., F. Hucho and D. Gulba (1997) Signal transduction via urokinase receptor: is a transmembrane adapter molecule really necessary? Fibrinolysis and Proteolysis 77(2): 165169.

49. Dumler, I., A. Weis, O.A. Mayboroda, C. Maasch, U. Jerke, H. Haller, and D.C. Gulba (1998) The Jak/Stat pathway and urokinase receptor signaling in human aortic vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 273:315-321.

50. Elion, E. A. (1998) Routing MAP kinase cascades comment. Science 281:1625-1626.117

51. Erpel, T. and S.A. Courtneidge (1995) Src family protein tyrosine kinases and cellular signal transduction pathways. Curr Opin Cell Biol 7:176-182.

52. Estreicher, A., A. Wohlwend, D. Belin, W.D. Schleuning, and J.D. Vassalli (1989) Characterization of the cellular binding site for the urokinase-type plasminogen activator. J Biol Chem 264:1180-1189.

53. Fanger, G.R., P. Gerwins, C. Widmann, M B. Jarpe, and G.L. Johnson (1997) MEKKs, GCKs, MLKs, PAKs, TAKs, and tpls: upstream regulators of the c-Jun amino-terminal kinases? Curr Opin Genet Dev 7:67-74.

54. Fantl, W.J., D.E. Johnson, L.T.Williams (1993) Signalling by receptor tyrosine kinases. Annu RevBiochem 62:453-481.

55. Fechheimer, M. and S.H. Zigmond (1993) Focusing on unpolymerized actin comment., J Cell Biol/23:1-5.

56. Forrester, J.S., M. Fishbein, R. Helfant, and J. Fagin (1991) A paradigm for restenosis based on cell biology: clues for the development of new preventive therapies. J Am Coll Cardiol 17:758-769.

57. Forst, D.O., R.A. Cross, J. De Mey, and J.V. Small (1986) Caldesmon is an elongated, flexible molecule localized in the actomyosin domains of smooth muscle. EMBO J 5:251257.

58. Frost, J. A., A. Khokhlatchev, S. Stippec, M.A. White, and M.H. Cobb (1998) Differential effects of PAK1-activating mutations reveal activity-dependent and -independent effects on cytoskeletal regulation. J Biol Chem 273:28191-28198.

59. Gale, N.W., S. Kaplan, E.J. Lowenstein, J. Schlessinger, and D. Bar-Sagi (1993) Grb2 mediates the EGF-dependent activation of guanine nucleotide exchange on Ras see comments. Nature 363:88-92.

60. Gartner, A., K. Nasmyth, and G. Ammerer (1992) Signal transduction in Saccharomyces cerevisiae requires tyrosine and threonine phosphorylation of FUS3 and KSS1. Genes Dev 6:1280-1292.

61. Genzler, W.A., G.J. Steffens, F. Otting, S.M. Kim, E. Frankus, and L. Floh? (1982) The primary structure of high molecular mass urokinase from human urine. The complete amino acid sequence of the A chain. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 363:1155-1165.

62. Gerthoffer, W.T., I.A. Yamboliev, J. Pohl, R. Haynes, S. Dang, and J. McHugh (1997) Activation of MAP kinases in airway smooth muscle. Am J Physiol 272\L244-L252

63. Gerwins, P., J.L. Blank, and G.L. Johnson (1997) Cloning of a novel mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MEKK4, that selectively regulates the c-Jun amino terminal kinase pathway. J Biol Chem 272:8288-8295.

64. Ghiso, A. J. A., K. Kovalski, L. Ossowski (1999) Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol /¥7:89-104.118

65. Gilmore, A.P. and K. Burridge (1995) Cell adhesion. Cryptic sites in vinculin news; comment. Nature 375:197-197.

66. Gilmore, A.P. and K. Burridge (1996) Regulation of vinculin binding to talin and actin by phosphatidyl-inositol-4-5-bisphosphate. Nature 381:531-535.

67. Glass, W.F. and J.I. Kreisberg (1993) Regulation of integrin-mediated adhesion at focal contacts by cyclic AMP. J Cell Physiol 757:296-306.

68. Gorodinsky, A. and D. A. Harris (1995) Glycolipid-anchored proteins in neuroblastoma cells form detergent-resistant complexes without caveolin. J Cell Biol 729:619-627.

69. Gould, G.W., T.J. Jess, G.C. Andrews, J.J. Herbst, R.J. Plevin, and E.M. Gibbs (1994) Evidence for a role of phosphatidylinositol 3-kinase in the regulation of glucose transport in Xenopus oocytes. J Biol Chem 269:26622-26625.

70. Gross, J.L., D. Moscatelli, and D.B. Rifkin (1983) Increased capillary endothelial cell protease activity in response to angiogenic stimuli in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 80:2623-2627.

71. Guay J., H. Lambert, G. Gingras-Breton, J.N. Lavoie, J. Huot, and J. Landry (1997) Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J Cell Sci 110 (3):357-368.

72. Gupta, S., D. Campbell, B. Derijard, and R.J. Davis (1995) Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway. Science 2<57:389-3 93.

73. Haas, I.G. (1995) Protein-mediated protein maturation in eukaryotes. FEBS Lett 369:12-15.

74. Haas, T.A. and E.F. Plow (1994) Integrin-ligand interactions: a year in review. Curr Opin Cell Biol 6:656-662.

75. Haeberle, J.R., K.M. Trybus, M.E. Hemric, and D M. Warshaw (1992) The effects of smooth muscle caldesmon on actin filament motility. J Biol Chem 267:23001-23006.

76. Hahn, K., R. DeBiasio, and D.L. Taylor (1992) Patterns of elevated free calcium and calmodulin activation in living cells. Nature 359:736-738.

77. Hall, A. (1998) Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science 279:509-514.

78. Harris, A.K., P. Wild, and D. Stopak (1980) Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science 208:177-179.

79. Hartshorae, D.J. (1998) Myosin phosphatase: subunits and interactions. Acta Physiol Scand 7^:483-493.

80. Hashimoto, Y. and T.R. Soderling (1990) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II: comparative study of the phosphorylation sites. Arch.Biochem.Biophys. 275:41-45.119

81. Hazzalin, C.A., R.Le Panse, E. Cano, and L.C. Mahadevan (1998) Anisomycin selectively desensitizes signalling components involved in stress kinase activation and fos and jun induction. Mol Cell Biol 18 (4): 1844-1854.

82. Hayashi, K., K. Kanda, F. Kimizuka, I. Kato, and K. Sobue (1989) Primary structure and functional expression of h-caldesmon complementary DNA. Biochem Biophys Res Commun 764:503-511.

83. Hedges, J.C., I.A. Yamboliev, M. Ngo, B. Horowitz, L.P. Adam, and W.T. Gerthoffer (1998) p38 mitogen-activated protein kinase expression and activation in smooth muscle. Am J Physiol 275:C527-C534

84. Hedges, J.C., M.A. Dechert, I.A. Yamboliev, J.L. Martin, E. Hickey, L A. Weber, and W.T. Gerthoffer (1999) A role for p38(MAPK)/HSP27 pathway in smooth muscle cell migration. J Biol Chem 274:24211-24219.

85. Hemric, M.E. and J.M. Chalovich (1990) Characterization of caldesmon binding to myosin. J Biol Chem 2(55:19672-19678.

86. Hemric, M.E., P.B. Tracy, and J.R. Haeberle (1994) Caldesmon enhances the binding of myosin to the cytoskeleton during platelet activation. J Biol Chem 269 (6):4125-4128.

87. Herz, J., D.E. Clouthier, and R.E. Hammer (1992) LDL receptor-related protein internalizes and degrades uPA-PAI-1 complexes and is essential for embryo implantation published erratum appears in Cell 1993 May 7;73(3):428., Cell 77:411-421.

88. Heuertz, R.M., S.M. Tricomi, U.R. Ezekiel, and R.O. Webster (1999) C-reactive protein inhibits chemotactic peptide-induced p38 mitogen-activated protein kinase activity and human neutrophil movement. J Biol Chem 274 (25): 17968-17974.

89. Holt, K.H., S.B. Waters, S. Okada, K. Yamauchi, S.J. Decker, A.R. Saltiel, D.G. Motto, G.A. Koretzky, and J.E. Pessin (1996) Epidermal growth factor receptor targeting prevents uncoupling of the Grb2-SOS complex. J Biol Chem 277:8300-8306.

90. Humphrey, M.B.; H. Herrera-Sosa, G. Gonzalez, R. Lee, J.Bryan (1992) Cloning of cDNAs encoding human caldesmons. Gene 772:197-204.120

91. Huot J., F. Houle, D R. Spitz, and J. Landry (1996) HSP27 phosphorylation-mediated resistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress. Cancer Res 56 (2):273-279.

92. Huot J., F. Houle, S. Rousseau, R. G. Deschesnes, G.M. Shah, and J. Landry (1998) SAPK2/p38-dependent F-actin reorganization regulates early membrane blebbing during stress-induced apoptosis. J Cell Biol (5): 1361-1373.

93. Huttenlocher, A, R.R. Sandborg, and A.F. Horwitz (1995) Adhesion in cell migration. Curr Opin Cell Biol 7:697-706.

94. Huxley, H.E. (1973) Muscular contraction and cell motility. Nature 243:445-449.

95. Hynes, R.O. (1992) Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell 69:11-25.

96. Ibitayo A. I., J. Sladick, S. Tuteja, O. Louis-Jacques, H. Yamada, G. Groblewski, M. Welsh, and K.N. Bitar (1999) HSP27 in signal transduction and association with contractile proteins in smooth muscle cells. Am J Physiol 277 (2 Pt 1):G445-G454.

97. Ikebe, M. and D.J. Hartshorne (1985) Phosphorylation of smooth muscle myosin at two distinct sites by myosin light chain kinase. J Biol Chem 260:10027-10031.

98. Ikebe, M. and S. Reardon (1988) Binding of caldesmon to smooth muscle myosin. J Biol Chem 263:3055-3058.

99. Ikebe, M., S. Reardon, G.C. Scott-Woo, Z. Zhou, and Y. Koda (1990) Purification and characterization of calmodulin-dependent multifunctional protein kinase from smooth muscle: isolation of caldesmon kinase. Biochemistry 29:11242-11248.

100. Ikebe, M. and S. Reardon (1990) Phosphorylation of smooth muscle caldesmon by calmodulin-dependent protein kinase II. Identification of the phosphorylation sites. J Biol Chem 265:17607-17612.

101. Izzard, C.S. and L.R. Lochner (1980) Formation of cell-to-substrate contacts during fibroblast motility: an interference-reflexion study. J Cell Sci ¥2:81-116.

102. Izzard, C.S. (1988) A precursor of the focal contact in cultured fibroblasts. Cell Motil Cytoskeleton 70:137-142.

103. Jay, P.Y., P. A. Pham, S. A. Wong, and E.L. Elson (1995) A mechanical function of myosin II in cell motility. J Cell Sci 108 (Pt 7J:387-393.

104. Johnson, R.P. and S.W. Craig (1995) F-actin binding site masked by the intramolecular association of vinculin head and tail domains see comments. Nature 373:261-264.

105. Juliano, R.L. and S. Haskill (1993) Signal transduction from the extracellular matrix. J Cell Biol 720:577-585.121

106. Kaibuchi, K (1999) Regulation of cytoskeleton and cell adhesion by Rho targets. Prog Mol Subcell Biol 22: 23-38.

107. Kahan B.W. and D.C. Kramp (1987) Nerve growth factor stimulation of mouse embryonal carcinoma cell migration. Cancer Res 47 (23):6324-6328.

108. Kasibhatla, S., T. Brunner, L. Genestier, F. Echeverri, A. Mahboubi, and D R. Green (1998) DNA damaging agents induce expression of Fas ligand and subsequent apoptosis in T lymphocytes via the activation of NF-kappa B and AP-1. Mol Cell 7:543-551.

109. Kazlauskas, A. and J. A. Cooper (1989) Autophosphorylation of the PDGF receptor in the kinase insert region regulates interactions with cell proteins. Cell 58:1121-1133.

110. Kazlauskas, A., C. Ellis, T. Pawson, and J. A. Cooper (1990) Binding of GAP to activated PDGF receptors. Science 247:1578-1581.

111. Khwaja, A., P. Rodriguez-Viciana, S. Wennstrom, P.H. Warne, and J. Downward (1997) Matrix adhesion and Ras transformation both activate a phosphoinositide 3-OH kinase and protein kinase B/Akt cellular survival pathway. EMBO J 76:2783-2793.

112. Klemke, R.L., S. Cai, A.L. Giannini, P.J. Gallagher, P. de Lanerolle, and D A. Cheresh (1997) Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase. J Cell Biol 737:481-492.

113. Knaus, U.G., S. Morris, H.J. Dong, J. Chernoff, and G.M. Bokoch (1995) Regulation of human leukocyte p21-activated kinases through G protein—coupled receptors. Science 269:221-223.

114. Koide, H., T. Satoh, M. Nakafuku, and Y. Kaziro (1993) GTP-dependent association of Raf-1 with Ha-Ras: identification of Raf as a target downstream of Ras in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 90:8683-8686.

115. Kolch, W., G. Heidecker, P, Lloyd, and U.R. Rapp (1991) Raf-l protein kinase is required for growth of induced NIH/3T3 cells. Nature 349:426-428.122

116. Konakova, M., F. Hucho, and W.D. Schleuning (1998) Downstream targets of urokinase-type plasminogen-activator-mediated signal transduction. Eur J Biochem 253:421-429.

117. Koshelnick, Y., M. Ehart, H. Stockinger, and B.R. Binder (1999) Mechanisms of signalling through urokinase receptor and the cellular response. Thromb and Haemost #2:305-311.

118. Kozma, R., S. Ahmed, A. Best, and L. Lim (1995) The Ras-related protein Cdc42Hs and bradykinin promote formation of peripheral actin microspikes and filopodia in Swiss 3T3 fibroblasts. Mol Cell Biol 15:1942-1952.

119. Kroemker, M., A.H. Rodiger, B.M. Jockusch, and M. Rodiger (1994) Intramolecular interactions in vinculin control alpha-actinin binding to the vinculin head. FEBS Lett 355:259-262.

120. Kureishi, Y., S. Kobayashi, M. Amano, K. Kimura, H. Kanaide, T. Nakano, K. Kaibuchi, and M. Ito (1997) Rho-associated kinase directly induces smooth muscle contraction through myosin light chain phosphorylation. J Biol Chem 272:12257-12260.

121. Kypta, R.M., Y. Goldberg, E.T. Ulug, and S.A. Courtneidge (1990) Association between the PDGF receptor and members of the src family of tyrosine kinases. Cell 62:481-492.

122. Lamb, N.J.C., A. Fernandez, M. Mezgueldi, J.P. Labbe, R. Kassab, A. Fattoum, and N.J. Lamb (1996) Disruption of the actin cytoskeleton in living nonmuscle cells by microinjection of antibodies to domain-3 of caldesmon. Eur.J.Cell Biol 69 (l):36-44.

123. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

124. Lane, H.A., A. Fernandez, N.J. Lamb, and G. Thomas (1993) p70s6k function is essential for G1 progression. Nature 363:170-172.

125. Lang, P., F. Gesbert, M. Delespine-Carmagnat, R. Stancou, M. Pouchelet, and J. Bertoglio (1996) Protein kinase A phosphorylation of RhoA mediates the morphological and functional effects of cyclic AMP in cytotoxic lymphocytes. EMBO J /5:510-519.

126. Larsen, J.K., I.A. Yamboliev, L.A. Weber, and W.T. Gerthoffer (1997) Phosphorylation of the 27-kDa heat shock protein via p38 MAP kinase and MAPKAP kinase in smooth muscle. Am J Physiol 273:L930-L940.

127. Lassing, I. and U. Lindberg (1985) Specific interaction between phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and profilactin. Nature 314:472-474.123

128. Lauffenburger, D.A. and A.F. Horwitz (1996) Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell 84:359-369.

129. Lawrence, J.C.J, and P.J. Roach (1997) New insights into the role and mechanism of glycogen synthase activation by insulin. Diabetes 46:541-547.

130. Lawson, M.A. and F.R. Maxfield (1995) Ca(2+)- and calcineurin-dependent recycling of an integrin to the front of migrating neutrophils. Nature 577:75-79.

131. Lee, J., M. Leonard, T. Oliver, A. Ishihara, and K. Jacobson (1994) Traction forces generated by locomoting keratocytes. J Cell Biol 727:1957-1964.

132. Lee Y.H., C. Gallant, H. Guo, Y. Li, A. Wang and KG. Morgan (2000) Regulation of vascular smooth muscle tone by N-terminal region of caldesmon. J Biol Chem 275 (5):3213-3220.

133. Leevers, S.J., H.F. Paterson, and C.J. Marshall (1994) Requirement for Ras in Raf activation is overcome by targeting Raf to the plasma membrane. Nature 369:411-414.

134. Leng J., R.L. Klemke, A.C. Reddy, and D.A. Cheresh (1999) Potentiation of cell migration by adhesion-dependent cooperative signals from the GTPase Rac and Raf kinase. J Biol Chem 274(53):37855-37861.

135. Lewis, A.K. and P.C. Bridgman (1992) Nerve growth cone lamellipodia contain two populations of actin filaments that differ in organization and polarity. J Cell Biol 119:12191243.

136. Lim, R. and A. Zaheer (1996) In vitro enhancement of p38 mitogen-activated protein kinase activity by phosphorylated glia maturation factor. J Biol Chem 271:22953-22956.

137. Lin, L.L., M. Wartmann, A.Y. Lin, J.L. Knopf, A. Seth, and R.J. Davis (1993) cPLA2 is phosphorylated and activated by MAP kinase. Cell 72:269-278.

138. Litchfield, D.W. and E.H. Ball (1987) Phosphorylation of caldesmon77 by protein kinase C in vitro and in intact human platelets. J Biol Chem 262:8056-8060.

139. Lo, S.H., E. Weisberg, and L.B. Chen (1994) Tensin: a potential link between the cytoskeleton and signal transduction. Bioessays 76:817-823.

140. Loktionova, S.A., O.P. Ilyinskaya, A.E. Kabakov (1998) Early and delayed tolerance to simulated ischemia in heat-preconditioned endothelial cells: a role for HSP27. Am J Physiol 275:2147-2158.124

141. Lu, W., S. Katz, R. Gupta, and B.J. Mayer (1997) Activation of Pak by membrane localization mediated by an SH3 domain from the adaptor protein Nek. Curr Biol 7:85-94.

142. Lukas, T.J., W.H. Burgess, F.G. Prendergast, W. Lau, and D M. Watterson (1986) Calmodulin binding domains: characterization of a phosphorylation and calmodulin binding site from myosin light chain kinase. Biochemistry 25:1458-1464.

143. Lupu, F., D A. Heim, F. Bachmann, M. Hurni, V.V. Kakkar, and E.K. Kruithof (1995) Plasminogen activator expression in human atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vase Biol 75:1444-1455.

144. Mabuchi, K., Y. Li, T. Tao, and C.L. Wang (1996) Immunocytochemical localization of caldesmon and calponin in chicken gizzard smooth muscle. J Muscle Res Cell Motil 77:243260.

145. Marais, R., Y. Light, H.F. Paterson, and C.J. Marshall (1995) Ras recruits Raf-1 to the plasma membrane for activation by tyrosine phosphorylation. EMBO J 74:3136-3145.

146. Marais, R. and C.J. Marshall (1996) Control of the ERK MAP kinase cascade by Ras and Raf. Cancer Surv 27:101-125.

147. Marcus, S., A. Polverino, M. Barr, and M. Wigler (1994) Complexes between STE5 and components of the pheromone-responsive mitogen-activated protein kinase module. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7762-7766.

148. Marquardt, B., D. Frith, and S. Stabel (1994) Signalling from TPA to MAP kinase requires protein kinase C, raf and MEK: reconstitution of the signalling pathway in vitro. Oncogene 9:3213-3218.

149. Marston, S.B. and C.S. Redwood (1991) The molecular anatomy of caldesmon. Biochem J 279 (Pt l):l-\6.

150. Marston S., K. Pinter and P. Bennet (1991) Caldesmon binds to smooth muscle myosin and myosin rod and crosslinks thick filaments to actin filaments. J Muscl Res and Sell Motil 73:206-218.

151. Marston, S.B., I.D. Fraser, and P. A. Huber (1994) Smooth muscle caldesmon controls the strong binding interaction between actin-tropomyosin and myosin. J Biol Chem 269:3210432109.

152. Marston, S.B., I.D. Fraser, P.A. Huber, K. Pritchard, N.B. Gusev, and K. Torok (1994) Location of two contact sites between human smooth muscle caldesmon and Ca(2+)-calmodulin. J Biol Chem 2(59:8134-8139.

153. Mastick, C.C., M.J. Brady, and A.R. Saltiel (1995) Insulin stimulates the tyrosine phosphorylation of caveolin. J Cell Biol 729:1523-1531.

154. Matsuda, M., B.J. Mayer, Y. Fukui, and H. Hanafusa (1990) Binding of transforming protein, P47gag-crk, to a broad range of phosphotyrosine-containing proteins. Science 248:15371539.

155. Matsuda, M., Y. Hashimoto, K. Muroya, H. Hasegawa, T. Kurata, S. Tanaka, S. Nakamura, and S. Hattori (1994) CRK protein binds to two guanine nucleotide-releasing proteins for the125

156. Ras family and modulates nerve growth factor-induced activation of Ras in PC 12 cells. Mol Cell Biol 74:5495-5500.

157. Matsudaira, P. (1994) Actin crosslinking proteins at the leading edge. Semin Cell Biol 5:165174.

158. Matsumura F., and S. Yamashiro (1993) Caldesmon. Curr Opin Cell Biol 5 (l):70-76.

159. Meade-Tollin, L.C., D. Way, and M.H. Witte (1999) Expression of multiple matrix metalloproteinases and urokinase type plasminogen activator in cultured Kaposi sarcoma cells. Acta Histochem 707:305-316.

160. Medema, R.H. and J.L. Bos (1993) The role of p21ras in receptor tyrosine kinase signaling. Crit Rev Oncog 4:615-661.

161. Meisenhelder, J., P.G. Suh, S.G. Rhee, and T. Hunter (1989) Phospholipase C-gamma is a substrate for the PDGF and EGF receptor protein-tyrosine kinases in vivo and in vitro. Cell 57:1109-1122.

162. Menkel, A.R., M. Kroemker, P. Bubeck, M. Ronsiek, G. Nikolai, and B.M. Jockusch (1994) Characterization of an F-actin-binding domain in the cytoskeletal protein vinculin. J Cell Biol 72(5:1231-1240.

163. Milne, D.M., L.E. Campbell, D.G. Campbell, and D.W. Meek (1995) p53 is phosphorylated in vitro and in vivo by an ultraviolet radiation-induced protein kinase characteristic of the c-Jun kinase, JNK1. J Biol Chem 270:5511-5518.

164. Miltenberger, R.J., J. Cortner, and P.J. Farnham (1993) An inhibitory Raf-1 mutant suppresses expression of a subset of v-raf-activated genes. J Biol Chem 2(55:15674-15680.

165. Mischak, H., T. Seitz, P. Janosch, M. Eulitz, H. Steen, M. Schellerer, A. Philipp, and W. Kolch (1996) Negative regulation of Raf-1 by phosphorylation of serine 621. Mol Cell Biol 7(5:5409-5418.

166. Mitchison, T.J. and L.P. Cramer (1996) Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell 54:371-379.

167. Miura, Y., A. Kikuchi, T. Musha, S. Kuroda, H. Yaku, T. Sasaki, and Y. Takai (1993) Regulation of morphology by rho p21 and its inhibitory GDP/GTP exchange protein (rho GDI) in Swiss 3T3 cells. J Biol Chem 265:510-515.

168. Moon, A. and D.G. Drubin (1995) The ADF/cofilin proteins: stimulus-responsive modulators of actin dynamics. Mol Biol Cell 6 :1423-1431.126

169. Morrison, D.L., J.S. Sanghera, J. Stewart, C. Sutherland, MP Walsh, and S.L. Pelech (1996) Phosphorylation and activation of smooth muscle myosin light chain kinase by MAP kinase and cyclin-dependent kinase-1. Biochem Cell Biol 74:549-557.

170. Mukhina, S., V. Stepanova, D. Traktouev, A. Poliakov, R. Beabealashvilly, Y. Gursky, M. Minashkin, A. Shevelev, and V. Tkachuk. The chemotactic action of urokinase on smooth muscle cells is dependent on its kringle domain. J Biol Chem 275:16450-16458.

171. Nixon, G.F., K. Iizuka, C.M. Haystead, T.A. Haystead, A.P. Somlyo, and A.V. Somlyo (1995) Phosphorylation of caldesmon by mitogen-activated protein kinase with no effect on Ca2+ sensitivity in rabbit smooth muscle. J Physiol (Lond) 487 (Pt 2):283-289.

172. Nobes, C.D. and A. Hall (1995) Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell 57:53-62.127

173. Nusrat, A.R. and H.A.J. Chapman (1991) An autocrine role for urokinase in phorbol estermediated differentiation of myeloid cell lines. J Clin Invest 57:1091-1097.

174. Nykjaer, A., B. Moller, R.F. Todd, T. Christensen, P.A. Andreasen, J. Gliemann, and C.M. Petersen (1994) Urokinase receptor. An activation antigen in human T lymphocytes. J Immunol 752:505-516.

175. Odekon, L.E., Y. Sato, and D.B. Rifkin (1992) Urokinase-type plasminogen activator mediates basic fibroblast growth factor-induced bovine endothelial cell migration independent of its proteolytic activity. J Cell Physiol 750:258-263.

176. Okada, S.S., J.E. Tomaszewski, and E.S. Barnathan (1995) Migrating vascular smooth muscle cells polarize cell surface urokinase receptors after injury in vitro. Exp Cell Res 277:180-187.

177. Ossowski, L. (1992) Invasion of connective tissue by human carcinoma cell lines: requirement for urokinase, urokinase receptor, and interstitial collagenase. Cancer Res 52:6754-6760.

178. Pages, G., P. Lenormand, G. L'Allemain, J.C. Chambard, S. Meloche, and J. Pouyssagur (1993) Mitogen-activated protein kinases p42mapk and p44mapk are required for fibroblast proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A 90:8319-8323.

179. Panettieri, R.A., R.K. Murray, L.R. DePalo, P.A. Yadvish, and M.I. Kotlikoff (1989) A human airway smooth muscle cell line that retains physiological responsiveness. Am J Physiol 256:C329-C335

180. Paterson, H.F., A.J. Self, M.D. Garrett, I. Just, K. Aktories, and A. Hall (1990) Microinjection of recombinant p21rho induces rapid changes in cell morphology. J Cell Biol 111: 1001-1007.

181. Pawson, T. and G.D. Gish (1992) SH2 and SH3 domains: from structure to function. Cell 77:359-362.

182. Pelicci, G., L. Lanfrancone, F. Grignani, J. McGlade, F. Cavallo, G. Forni, I. Nicoletti, T. Pawson, and P.G. Pelicci (1992) A novel transforming protein (SHC) with an SH2 domain is implicated in mitogenic signal transduction. Cell 70:93-104.

183. Peppelenbosch, M.P., R.G. Qiu, AM. de Vries-Smits, L.G. Tertoolen, S.W. de Laat, F. Mccormick, A. Hall, M.H. Symons, and J.L. Bos (1995) Rac mediates growth factor-induced arachidonic acid release. Cell 57:849-856.

184. Perrimon, N. (1993) The torso receptor protein-tyrosine kinase signaling pathway: an endless story. Cell 74:219-222.

185. Peskin, C.S., G.M. Odell, and G.F. Oster (1993) Cellular motions and thermal fluctuations: the Brownian ratchet. Biophys J 65:316-324.

186. Petch, L.A., S.M. Bockholt, A. Bouton, J.T. Parsons, and K. Burridge (1995) Adhesion-induced tyrosine phosphorylation of the pl30 src substrate. J Cell Sci 108 (Pt 4):\31\-\319.

187. Piotrowicz, R.S., E. Hickey, and E.G. Levin (1998) Heat shock protein 27 kDa expression and phosphorylation regulates endothelial cell migration. FASEB J 12 (14): 1481-1490.

188. Plopper, G. and D.E. Ingber (1993) Rapid induction and isolation of focal adhesion complexes. Biochem Biophys Res Commun 193:571-578.

189. Ploug, M., N. Behrendt, D. Lober, and K. Dano (1991) Protein structure and membrane anchorage of the cellular receptor for urokinase-type plasminogen activator. Semin Thromb Hemost 77:183-193.

190. Postlethwaite A.E., J. Keski-Oja, H.L. Moses, and A.H. Kang (1987) Stimulation of the chemotactic migration of human fibroblasts by transforming growth factor beta. J Exp Med 165 (l):251-256.

191. Pritchard, K. and S.B. Marston (1989) Ca2+-calmodulin binding to caldesmon and the caldesmon-actin-tropomyosin complex. Its role in Ca2+ regulation of the activity of synthetic smooth-muscle thin filaments. Biochem J 257:839-843.

192. Qui, M.S. and S.H. Green (1992) PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron 9:705-717.

193. Raghunath, P.N, J.E. Tomaszewski, S.T. Brady, R.J. Caron, S.S. Okada, and E.S. Barnathan (1995) Plasminogen activator system in human coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol 75:1432-1443.

194. Raingeaud, J., A.J. Whitmarsh, T. Barrett, B. Darijard, and R.J. Davis (1996) MKK3- and MKK6-regulated gene expression is mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. Mol Cell Biol 76:1247-1255.

195. Redwood, C.S., and S.B. Marston (1992) Binding and regulatory properties of expressed functional domains of chicken gizzard smooth muscle caldesmon. J Biol Chem 268:1096910976.129

196. Regen, C.M. and A.F. Horwitz (1992) Dynamics of beta 1 integrin-mediated adhesive contacts in motile fibroblasts. J Cell Biol 779:1347-1359.

197. Resnati, M., M. Guttinger, S. Valcamonica, N. Sidenius, F. Blasi, and F. Fazioli (1996) Proteolytic cleavage of the urokinase receptor substitutes for the agonist-induced chemotactic effect. EMBO J 75:1572-1582.

198. Reuning, U. and N.U. Bang (1992) Regulation of the urokinase-type plasminogen activator receptor on vascular smooth muscle cells is under the control of thrombin and other mitogens. Arterioscler Thromb 72:1161-1170.

199. Ridley, A.J., H.F. Paterson, C.L. Johnston, D. Diekmann, and A. Hall (1992) The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell 70:401-410.

200. Ridley, A.J. and A. Hall (1992) The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70:389-399.

201. Ritossa, F. (1996) Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones 7 :97-98.

202. Rousseau, S., F. Houle, J. Landry, and J. Huot (1997) p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells. Oncogene 75:2169-2177.

203. Sakai, R., A. Iwamatsu, N. Hirano, S. Ogawa, T. Tanaka, H. Mano, Y. Yazaki, and H. Hirai (1994) A novel signaling molecule, pl30, forms stable complexes in vivo with v-Crk and v-Src in a tyrosine phosphorylation-dependent manner. EMBO J /3:3748-3756.

204. Sanders, L.C., F. Matsumura, G.M. Bokoch, and P. de Lanerolle (1999) Inhibition of myosin light chain kinase by p21-activated kinase see comments. Science 253:2083-2085.

205. Sanders, L.C., F. Matsumura, G.M. Bokoch, and P. de Lanerolle (1999) Inhibition of myosin light chain kinase by p21-activated kinase see comments. Science 283:2083-2085.

206. Sappino, A.P., R. Madani, J. Huarte, D. Belin, J.Z. Kiss, A. Wohlwend, and J.D. Vassalli (1993) Extracellular proteolysis in the adult murine brain. J Clin Invest 92:679-685.

207. Sargiacomo, M., M. Sudol, Z. Tang, and M.P. Lisanti (1993) Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J Cell Biol 722:789-807.

208. Sastry, S.K. and A.F. Horwitz (1993) Integrin cytoplasmic domains: mediators of cytoskeletal linkages and extra- and intracellular initiated transmembrane signaling. Curr Opin Cell Biol 5:819-831.

209. Schaeffer, H.J., A.D. Catling, S.T. Eblen, L.S. Collier, A. Krauss, and M.J. Weber (1998) MP1: a MEK binding partner that enhances enzymatic activation of the MAP kinase cascade see comments. Science 257:1668-1671.

210. Schafer, D.A. and J.A. Cooper (1995) Control of actin assembly at filament ends. Annu Rev Cell Dev Biol 77:497-518.

211. Schaller, M.D. and J.T. Parsons (1994) Focal adhesion kinase and associated proteins. Curr Opin Cell Biol 6:705-710.

212. Schaller, M.D., J.D. Hildebrand, J.D. Shannon, J.W. Fox, R.R. Vines, and J.T. Parsons (1994) Autophosphorylation of the focal adhesion kinase, ppl25FAK, directs SH2-dependent binding of pp60src. Mol Cell Biol 14:1680-1688.

213. Schaller, M.D. and J.T. Parsons (1995) ppl25FAK-dependent tyrosine phosphorylation of paxillin creates a high-affinity binding site for Crk. Mol Cell Biol 75:2635-2645.

214. Schlaepfer, D.D., S.K. Hanks, T. Hunter, and P. van der Geer (1994) Integrin-mediated signal transduction linked to Ras pathway by GRB2 binding to focal adhesion kinase. Nature372:786-791.

215. Schlessinger, J. (1993) How receptor tyrosine kinases activate Ras. Trends Biochem Sci 75:273-275.

216. Schmidt, C.E., A.F. Horwitz, D.A. Lauffenburger, and M.P. Sheetz (1993) Integrin-cytoskeletal interactions in migrating fibroblasts are dynamic, asymmetric, and regulated. J Cell Biol 725:977-991.

217. Schoenwaelder, S.M. and K. Burridge (1999) Bidirectional signaling between the cytoskeleton and integrins. Curr Opin Cell Biol 77:274-286.

218. Schwartz, M.A., M.D. Schaller, and M.H. Ginsberg (1995) Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annu Rev Cell Dev Biol 77:549-599.

219. Seger, R. and E.G. Krebs (1995) The MAPK signaling cascade. FASEB J 9:726-735.

220. Sells, M.A., U.G. Knaus, S. Bagrodia, D.M. Ambrose, G.M. Bokoch, and J. Chernoff (1997) Human p21-activated kinase (Pakl) regulates actin organization in mammalian cells. Curr Biol 7:202-210.

221. Shaya, S., A.L. Kindzelskii, J. Minor, E.C. Moore, R.F. Todd, and H.R. Petty (1998) Aberrant integrin (CR4; alpha(x)beta2; CD1 lc/CD18) oscillations on neutrophils in a mild form of pyoderma gangrenosum. J Invest Dermatol 777:154-158.

222. Shirinsky,V.P„ K G. Birukov, A.V. Vorotnikov, N.B. Gusev (1989) Caldesmonl50, caldesmon77 and skeletal muscle troponin T share a common antigenic determinant. FEBS Lett 251:65-68.131

223. Shirinsky V.P., A. V. Vorotnikov and N.B. Gusev (1999) Caldesmon phosphorylation and smooth muscle contraction. From: Molecular mechanisms of smooth muscle contraction Kohama K. and Y. Sasaki/ R.G. Landes Company.

224. Skolnik, E.Y., A. Batzer, N. Li, C.H. Lee, E. Lowenstein, M. Mohammadi, B. Margolis, and J. Schlessinger (1993) The function of GRB2 in linking the insulin receptor to Ras signaling pathways. Science 260 :1953-1955.

225. Slack, J.K., A.D. Catling, S.T. Eblen, M.J. Weber, J.T. Parsons (1999) c-Raf-mediated inhibition of epidermal growth factor-stimulated cell migration. J Biol Chem 274:2717727184.

226. Small, J.V. (1988) The actin cytoskeleton. Electron Microsc Rev 7:155-174.

227. Small, J.V., M. Herzog, and K. Anderson (1995) Actin filament organization in the fish keratocyte lamellipodium. J Cell Biol 129:1275-1286.

228. Somlyo A.V., D. Bradshaw, S. Ramos, C. Murphy, C.E. Myers, and and A.P. Somlyo (2000) Rho-kinase ingibitor retards migration and in vivo dissemination of human prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Com 269:652-659.

229. Stary, H.C. (1989) Evolution and progression of atherosclerotic lesions in coronary arteries of children and young adults. Arteriosclerosis 9:119-132

230. Stasek, J.E.J., C.E. Patterson, and J.G. Garcia (1992) Protein kinase C phosphorylates caldesmon77 and vimentin and enhances albumin permeability across cultured bovine pulmonary artery endothelial cell monolayers. J Cell Physiol 753:62-75.

231. Stoker, M. and E. Gherardi (1991) Regulation of cell movement: the motogenic cytokines. Biochim Biophys Acta 7072:81-102.

232. Stossel, T.P. (1993) On the crawling of animal cells. Science 260:1086-1094.

233. Sugden, P.H. and A. Clerk (1998) Stress-responsive mitogen-activated protein kinases (c-Jun N-terminal kinases and p38 mitogen-activated protein kinases) in the myocardium. Circ Res 83:345-352.

234. Sullivan, S .J., G. Daukas, and S.H. Zigmond (1984) Asymmetric distribution of the chemotactic peptide receptor on polymorphonuclear leukocytes. J Cell Biol 99:1461-1467.

235. Sun, H.Q., K. Kwiatkowska, and H.L. Yin (1995) Actin monomer binding proteins. Curr Opin Cell Biol 7:102-110.

236. Symons, M., J.M. Derry, B. Karlak, S. Jiang, V. Lemahieu, F. Mccormick, U. Francke, and A. Abo (1996) Wiskott-Aldrich syndrome protein, a novel effector for the GTPase CDC42Hs, is implicated in actin polymerization. Cell 54:723-734.132

237. Tan J.L., S. Ravid, and J.A. Spudich (1992) Control of nonmuscle myosins by phosphorylation. Annu Rev Biochem 67:721-759.

238. Tanaka, T., H. Ohta, K. Kanda, H. Hidaka, and K. Sobue (1990) Phosphorylation of high-Mr caldesmon by protein kinase C modulates the regulatory function of this protein on the interaction between actin and myosin. Eur J Biochem 755:495-500.

239. Tapon N., and A. Hall (1997) Rho, Rac and Cdc42 GTPases regulste the organization of the actin cytoskeleton. Curr Opin Cell Biol 9:86-92.

240. Taylor, S J. and D. Shalloway (1994) An RNA-binding protein associated with Src through its SH2 and SH3 domains in mitosis. Nature 365:867-871.

241. Theriot, J. A. (1994) Regulation of the actin cytoskeleton in living cells. Semin Cell Biol 5:193-199.

242. Titus, M.A., D. Wessels, J. A. Spudich, and D. Soli (1993) The unconventional myosin encoded by the myo A gene plays a role in Dictyostelium motility. Mol.Biol.Cell 4:233-246.

243. Tkachuk V., V. Stepanova, P.J. Little, and A. Bobik (1996) Regulation and role of urokinase plasminogen activator in vascular remodelling. Clin Exp Pharmacol Physiol 23 (9):759-765.

244. Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76:4350-4354.

245. Turner, C.E. (1994) Paxillin: a cytoskeletal target for tyrosine kinases. Bioessays 76:47-52.

246. Uelci, N, K. Sobue, K. Kanda, T. Hada, and K. Higashino (1987) Expression of high and low molecular weight caldesmons during phenotypic modulation of smooth muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A 54:9049-9053.

247. Ullrich, A., J R. Bell, E.Y. Chen, R. Herrera, L.M. Petruzzelli, T.J. Dull, A. Gray, L. Coussens, Y.C. Liao, and M. Tsubokawa (1985) Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Nature 373:756-761.

248. Ullrich, A., J. Schlessinger (1990) Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. 67:203-12.133

249. Van Aelst, L. and C. D'Souza-Schorey (1997) Rho GTPases and signaling networks. Genes Dev 11:2295-2322.

250. Vassalli, J.D., J.M. Dayer, A. Wohlwend, and D. Belin (1984) Concomitant secretion of prourokinase and of a plasminogen activator-specific inhibitor by cultured human monocytes-macrophages. J Exp Med 159 :1653-1668.

251. Vassalli, J.D., A.P. Sappino, and D. Belin (1991) The plasminogen activator/plasmin system. J Clin Invest 88:1067-1072.

252. Vorotnikov, A.V., N.B. Gusev, S. Hua, J.H. Collins, C.S. Redwood, and S.B. Marston (1993) Identification of casein kinase II as a major endogeneous caldesmon kinase in sheep aorta smooth muscle. FEBS Lett 334:18-22.

253. Vorotnikov, A.V., N.B. Gusev, S. Hua, J.H. Collins, C.S. Redwood, and S.B. Marston (1994) Phosphorylation of aorta caldesmon by endogenous proteolytic fragments of protein kinase C. J Muscle Res Cell Motil 75:37-48.

254. Vorotnikov, A.V., S.B. Marston, and P.A. Huber (1997) Location and functional characterization of myosin contact sites in smooth muscle caldesmon. Biochem J 328 (Pt 1): 211-218.

255. Vossler, M.R., H. Yao, R.D. York, M.G. Pan, C.S. Rim, and P.J. Stork (1997) cAMP activates MAP kinase and Elk-1 through a B-Raf- and Rap 1-dependent pathway. Cell 89:7382.

256. Wang, X.Z. and D. Ron (1996) Stress-induced phosphorylation and activation of the transcription factor CHOP (GADD153) by p38 MAP Kinase. Science 272:1347-1349.

257. Wang P., and K.N. Bitar (1998) Rho A regulates sustained smooth muscle contraction through cytoskeletal reorganization of HSP27. Am J Physiol 275 (6 Pt 1):G1454-G1462.

258. Wartmann, M., P. Hofer, P. Turowski, A.R. Saltiel (1997) Hynes NE Negative modulation of membrane localization of the Raf-1 protein kinase by hyperphosphorylation. J Biol Chem 272:73915-73923.

259. Wei, Y., M. Lukashev, D.I. Simon, S.C. Bodary, S. Rosenberg, M.V. Doyle, and H.A. Chapman (1996) Regulation of integrin function by the urokinase receptor. Science 273:1551-1555.

260. Wessels, D., D.R. Soil, D. Knecht, W.F. Loomis, A. De Lozanne, and J. Spudich (1988) Cell motility and chemotaxis in Dictyostelium amebae lacking myosin heavy chain. Dev Biol 725:164-177.134

261. Wessels, D., D R. Soil, D. Knecht, W.F. Loomis, A. De Lozanne, and J. Spudich (1988) Cell motility and chemotaxis in Dictyostelium amebae lacking myosin heavy chain. Dev Biol 725:164-177.

262. Wessels, D., J. Murray, G. Jung, J. A. Hammer, and D R. Soil (1991) Myosin IB null mutants of Dictyostelium exhibit abnormalities in motility. Cell Motil Cytoskeleton 20:301-315.

263. Whitmarsh, A.J., J. Cavanagh, C. Tournier, J. Yasuda, and R.J. Davis (1998) A mammalian scaffold complex that selectively mediates MAP kinase activation see comments. Science 257:1671-1674.

264. Widmann, C., S. Gibson, M.B. Jarpe, and G.L. Johnson (1999) Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human. Physiol Rev 79:143-180.

265. Wilson, A.K., G. Gorgas, W.D. Claypool, and P. de Lanerolle (1991) An increase or a decrease in myosin II phosphorylation inhibits macrophage motility. J Cell Biol 774:277-283.

266. Witke, W., A.H. Sharpe, J.H. Hartwig, T. Azuma, T.P. Stossel, and D.J. Kwiatkowski (1995) Hemostatic, inflammatory, and fibroblast responses are blunted in mice lacking gelsolin. Cell 57:41-51.

267. Xu, J.Q., J.M. Gillis, and R. Craig (1997) Polymerization of myosin on activation of rat anococcygeus smooth muscle. J Muscle Res Cell Motil 75:381-393.

268. Xu, S. and M.H. Cobb (1997) MEKK1 binds directly to the c-Jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinases. J Biol Chem 272:32056-32060.

269. Yamakita Y., S. Yamashiro, and F. Matsumura (1990) Microinjection of nonmuscle and smooth muscle caldesmon into fibroblasts and muscle cells. J Cell Biol 111 (6 Pt 1):24872498.

270. Yan, M., T. Dai, J.C. Dealc, J.M. Kyriakis, L.I. Zon, J.R. Woodgett, and D.J. Templeton (1994) Activation of stress-activated protein kinase by MEKK1 phosphorylation of its activator SEK1. Nature 372:798-800.

271. Yu, D.H., C.K. Qu, O. Henegariu, X. Lu, and G.S. Feng (1998) Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion. J Biol Chem 273:2112521131.

272. Zaheer, A. and R. Lim (1996) In vitro inhibition of MAP kinase (ERK1/ERK2) activity by phosphorylated glia maturation factor (GMF). Biochemistry 35:6283-6288.

273. Zervos, A.S., L. Faccio, J,P. Gatto, J.M. Kyriakis, and R. Brent (1995) Mxi2, a mitogen-activated protein kinase that recognizes and phosphorylates Max protein. Proc Natl Acad Sci US К 92:10531-10534.

Информация о работе

Гончарова, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль МАР-киназ в стимулируемой урокиназой миграции гладкомышечных клеток человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы