Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецептор-опосредованный эндоцитоз инсулина и даун-регуляция инсулиновых рецепторов в изолированных гепатоцитах холоднокровных животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецептор-опосредованный эндоцитоз инсулина и даун-регуляция инсулиновых рецепторов в изолированных гепатоцитах холоднокровных животных"

ИНСТИТУТ эволюционной ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННЫЙ ЭНДОЦИТОЗ ИНСУЛИНА И ДАУН-РЕГУЛЯЦИЯ ИНСУЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ИЗОЛИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТАХ ХОЛОДНОКРОВНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ: 03.00.04 — БИОХИМИЯ

На правах рукописи

УДК 576.11:612.349

ЛАППОВА

Юлия Львовна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук Б. Н. ЛЕИБУШ

Официальные оппоненты: Лрс^доктор биологических наук В. Г. ШАЛЯПИНА; Прсср, доктор биологических паук Р. Н. ЭТИПГОФ

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН.

заседании специализированного совета К.002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Защита состоится

1994 г. в

час на

Автореферат разослан «

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Л. В. ЗУЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одной из важных прооблем сравнительной эндокринологии является изучение в филогенезе позвоночных рецепторов инсулина - звена, по современным представлениям играющего ключевую роль не только в трансдукщш инсу-линового сигнала, но и в реализации всех разнообразных эффектов инсулина, как метаболических, так и митогенных (01еГ-зку, 1990).

Рецепторы инсулина к настоящему времени изучены у представителей всех классов позвоночных, от круглоротых до млекопитающих. Исследование связывающих характеристик и субъединичной структуры рецептора позволило исследователям сделать заключение о высокой эволюционной консервативности инсулино-вого рецептора в ряду позвоночных (Лейбуш, 1983, 1989). В то зке время ряд вопросов, относящихся к эволюционной истории рецептора остаются неизученными. К таким проблемам в первую очередь относится вопрос об интернализации гормон-рецепторяых комплексов и их внутриклеточном процессинге у низших позвоночных.

Как известно, связывание инсулина с рецептором непосредственно инициирует два ряда событий: активации тирозинкиназы рецептора и интернализации инсулин-рецепторных комплексов. Первое открывает путь для каскада реакций фосфорилирования-дефосфорилирования, которым приписывается важная роль в механизме передачи инсулинового сигнала; второе обеспечивает терминацию сигнала за счет удаления активированных рецепторов с клеточной поверхности и доставки инсулина к местам его внутриклеточной деградации.

В отличие от высших позвоночных, в клетках которых рецептор-опосредованный эндоцитоз рецепторов и связанные с ним клеточные феномены изучены достаточно подробно, исследованию этой проблемы для низших позвоночных посвящены только отдельные публикации. Между тем вопрос этот актуален. Прежде всего, эндоцитоз рецепторов относится к температурозависимым процессам. В клетках млекопитающих скорость эндоцитоза максимальна при 37°С, уменьшается с понижением температуры, а при темпе-

ратуре ниже 15-20°с процесс полностью останавливается. В то же время многие низшие позвоночные живут при температуре ниже указанных. Логично предположить, что это обстоятельство накладывает некоторые ограничения на события, происходящие в клетках холоднокровных животных непосредственно после связывания инсулина.

Другим обстоятельством является своеобразие биологии ряда низших позвоночных. Для жизненного цикла некоторых из них (проходные рыбы, миноги) характерен длительный период полного голодания, сопряженный с перестройкой их клеточного метаболизма. Вопрос о влиянии этого фактора на внутриклеточный про-цессинг инсулин-рецепторных комплексов совершенно не изучен.

Еще одним фактором, придающим актуальность указанным проблемам является неопределенность результатов исследования у некоторых рыб и миног феномена даун-регуляции инсулиновых рецепторов in vivo (Лейбуш и др., 1987, Ablett et.al., 1983, Plisetskaya, Gutierrez, 1991). Известно, что инсулин-идуцируемая даун-регуляция, проявляющаяся в снижении уровня рецепторного связывания при повышении концентрации гормона в крови, также имеет в основе стимуляцию инсулином эндоцитоза рецепторов.

В связи со всем сказанным выше, целью и задачами данного исследования являются: I) изучить на изолированных гепатоци-тах миноги и лягушки при нормальной для этих видов температуре интернализацию [125-1]-инсулина; 2) исследовать судьбу ин-тернализованного [125-1]-инсулина в этих клетках; 3) выявить и охарактеризовать феномен даун-регуляции инсулиновых рецепторов в клетках низших позвоночных, а также исследовать его механизмы.

Научная новизна работы. Впервые исследована интернализа-ция [125-1]-инсулина в изолированных клетках холоднокровных позвоночных. Показана возможность процесса при температурах нормальной жизнедеятельности видов, определены его концентрационные и температурные зависимости. Впервые изучены пути внутриклеточного процессинга интернализованного [ 125-1]-инсу-лина в гепатоцитах миноги и лягушки и показано различие этих

путей в условиях разной биологии видов. Впервые показана воз можность даун-регуляции инсулиновых рецепторов в гепатоцитах при преинкубации клеток с физиологическими концентрациями гормона и при физиологических температурах. Впервые проведено разделение инсулиновых рецепторов в гепатоцитах низших позвоночных на поверхностные и внутриклеточные и исследовано влияние гормона на соотношение между обоими рецепторными пулами.

Апробация работы проходила на заседании секции молекулярных основ эволюции ИЭФиБ им. И.М.Сеченова. Материалы диссертации докладывались на XVI конференции Европейского общества сравнительных эндокринологов (Падуя, Италия, 1992) и на межлабораторном семинаре в Институте цитологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы источников). Материалы диссертации иллюстрированы /2 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Экспериментальные животные. В экспериментах использовали балтийских миног Lampetra fluvlatllls, отловленных в октябре-ноябре в ходе преднерестовой миграции и содержащихся в аквариумах при температуре 4-Ю°С до апреля; летних лягушек Rann ridibunda, выловленных в дельте Волги в мае и содержащихся в вольере при подкормке насекомыми; самцов крыс линии 1Vistar весом 100-150 г.

Получение изолированных клеток. Изолированные гепатоциты миноги и лягушки получали по Берри и Френду (Berry. Friend, 1969) в модификации Плисецкой (Plisetskaya et.al., 1984). В данной модификации перевариванию коллагеназой (0,1%, Sigma) подвергаются кусочки печени in vitro при температуре 20°С. Жизнеспособность клеток, оцениваемая по окрашиванию трипано-вым синим, составляла не менее 90%. Изолированные адипоциты крысы получали по Родбеллу (Rodbell, 1964).

Определение специфического связывания [125-11-инсулина.

Изолированные гепатоциты миноги и лягушки (106-107 клеток/мл) инкубировали в течение ночи при 4°С в Кребс-Рингер Гепес бикарбонатном буфере для холоднокровных с добавлением 0,1 нМ меченого гормона (получаемого хлораминовым методом) и 0,1% альбумина (рН=7,7). По завершении инкубации клетки осаждали центрифугированием ( 100g, 2 мин ), промывали буфером и определяли радиоактивность клеток.

Для определения специфического связывания [125-1]-инсулина изолированными адипоцитами последние (I05 клеток/мл) инкубировали в Кребс-Рингер-Гепес бикарбогзтном буфере с добавлением 0,1% альбумина и 0,1 нМ меченого гормона в течение 2 часов при 16°С. По окончании инкубации клетки отделяли от инкубационной среды центрифугированием а силиконовом масле ( 600 g, 3 мин ) и определяли радиоактивность поверхностного слоя, содержащего адипоциты.

Во всех опытах ставили контроль на неспецифическое связывание (инкубация в присутствии 330 нМ немеченого инсулина). Специфическое связывание рассчитывалось как разность между общим и неспецифическим связыванием С125-1]- инсулина.

Число связывающих мест и их аффинность определяли методом конкурентного анализа, инкубируя клетки в присутствии немеченого инсулина в концентрации 0-1.000 нг/мл. Полученные результаты обрабатывали по-Скэтчарду.

Интернализация инсулина. [125-1]-инсулин связывали с изолированными гепатоцитами при 0°С, клетки промывали буфером и инкубировали при температуре 0, 5 и 20°С для индукции эндо-цитоза. Через 30 мин эндоцитоз останавливали охлаждением клеток до 0°С, добавляли 2,5 М HCl (до рН=3) на 3 мин и осаждали клетки центрифугированием. Остаточная радиоактивность клеток рассматривалась как интернализованный [125-П-илсулин.

Выделение клетками интернализованного [125-11-инсулина. (Sorkin et.al., 1991). Клетки, содержащие интернализованный [125-1]-инсулин (см. выше), инкубировали различное время (до 3 часов) при температуре 0-20°С в буфере, содержащем 10 мкг/мл немеченого инсулина (добавлялся для предотвращения повторного связывания рецепторами покидающего клетку меченого инсулина).

Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты инкубационной смеси (по I мл), клетки отделяли центрифугированием и определяли радиоактивность среды до и после осаждения ТХУ Клетки подвергали обработке кислым буфером (рН=3-4) и определяли их радиоактивность. В совокупности указанные процедуры позволяли оценить динамику"накопления [125-1]-инсулина в инкубационной среде (включая накопление деградированного гормона) и одновременно убыль меченого гормона в клетке в ходе инкубации.

Для оценки внутриклеточной деградации [125-11-инсулина клетки, содержащие интернализованный С125-1]-инсулин солюби-лизировали в 0,5£ Тритоне Х-100 при 4°0 в течение ночи и в солюбилизате определяли долю деградированного [125-1]-инсулина по осаждению 15% ТХУ.

Для оценки участия лизосом в деградации инсулина исследовали влияние хлорохина (ингибитора лизосомального процессин-га) на накопление [125-1]-инсулина в гепатоцитах. Клетки инкубировали с 0,2 нМ меченого гормона в присутствии 0,2мМ хлорохина в течение 90 мин при 20°С. Через каждые 10 мин в али-квотах определяли специфическое связывание [125-1]-инсулина, прирост которого над контролем оценивали как эффект хлорохина. Контролем служили клетки, инкубируемые в аналогичных условиях без хлорохина.

Изучение даун-регуляции инсулиновых рецепторов. Изолированные гепатоциты миноги проинкубировали с немеченым гормоном в концентрации I0-I0-I0-8 М в течение 0-60 мин при температуре 0,15 и 25°С, отмывали от инсулина с помощью HCl и определяли специфическое связывание [125-1]-инсулина как описано выше.

Оценка влияния преинкубации клеток с немеченым инсулином на параметры связывания [125-1]-инсулина. Преинкубацию клеток с немеченым инсулином (16,7 нМ) проводили в течение 30 мин при 37°С (адипоциты крысы) или при 4°С (гепатоциты миноги и лягушки). По окончании преинкубации гормон удаляли с клеточной поверхности кислым буфером (60 мин, рН=7,0, 37°С для ади-поцитов и 3 мин, рН=3, 0°С для гепатоцитов). Для оценки влия-

ния преинкубации на число и аффинность связывающих мест строили кривые конкурентного вытеснения меченого инсулина натив-ным для контрольных клеток и клеток, подвергнутых преинкубации. Кривые преобразовывали для построения графиков в координатах Скэтчарда.

Разделение рецепторов на поверхностные и внутриклеточные. Разделение проводили по методу Маршалла (Marshall, 1935). Клетки обрабатывали трипсином (0,1 мг/мл, 20 мин, 4ЬС), разрушающим поверхностные рецепторы, или оставляли интакткыми. Реакцию останавливали ингибитором трипсина из сои (0,25 мг/мл). Далее клетки солюбилизировали в 0,5% Тритоне Х- 100, осаждали рецепторы 15% полиэтиленгликолем, и определяли специфическое связывание 1125-1]-инсулина с рецепторами, экстрагированными из интактных клеток (общий пул рецепторов) и из трипсинизированных клеток (внутриклеточные рецепторы). Для оценки влияния инсулина на распределение рецепторов часть клеток предварительно преинкубировали с инсулином как описано выше.

Определение молекулярной массы субъединиц инсулинового рецептора методом ковалентной сшивки И25-1)-инсулина с рецептором. Для определения молекулярной массы а-субъедтици использовали грубую фракцию плазматических мембран, получаемую методом дифференциального ценрифугирования (Shemer et.al., 1986). После инкубации печеночных мембран (10 мг/мл) с 6 нМ [125-1]-инсулина в течение ночи и отмывания от несвязавшегося меченого гормона материал ресуспендировали в буфере и добавляли кросс-сшивающий агент дисукцинимидилсуберат (Т мМ). Пробы инкубировали 15 мин на льду, реакцию останавливав 10 мМ ЭДТА в 100 мМ Трис-HGI. Материал после двукратного центрифугирования в буфере для отмывания несвязавшейся метки подвергали электрофорезу в редуцирующих условиях с последующей авторадиографией.

Молекулярную массу (З-оубьеЭгшицы рецептора определяли в опытах по автофосфорилированию рецепторов, солюбилинировашых и частично очищенных на колонке с WGA-агарозой. Матеруьл с колонки элюировали 0,3 М М-ацетил-Д-глюкозамином. Рецепторы

связывали с инсулином (0,1 нМ, 2 часа, 16С), затем добавляли 5 мМ МпС12 и [7-З2 Р1-АТФ (специфическая активность 3.000 мкКи/мкМ). Через 15 мин рецепторы осаждали антителами к фос-фотирозину, прецшштировали пансорбином и подвергала электрофорезу и авторадиографии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Характеристика инсулиновых рецепторов в изолированных гепатоцитах миноги и лягушки.

1.1. Характеристика инсулин-связывающих мест. Связывающие характеристики инсулиновых рецепторов печени миноги и лягушки были получены в опытах по конкурентному вытеснению [125-13-инсулина немеченым гормоном. В обоих случаях на графиках Скэтчарда были получены кривые с переломом, что свидетельствует о наличии на клеточной мембране исследуемых гепатоцитов двух классов связываицих мест - с высоким (Кд порядка Ю-9 М) и с низким (Кд порядка Ю~8 М) сродством к лиганду, причем низкоаффинные сайты количественно заметно преобладают над высокоаффинными. Подобная гетерогенность характерна для инсулиновых рецепторов всех позвоночных. По сродству к лиганду инсулиновые рецепторы миноги и лягушки не отличались сколько-нибудь существенно от инсулиновых рецепторов других изученных видов позвоночных. В то же время число связывающих мест в клетках миноги было ниже, чем в клетках лягушки и у обоих видов значительно ниже по сравнению с адипоцитами крысы (табл.1). Относительно более низкое количество связывающих мест в расчете на клетку у низших прзвоночных в сравнении с высшими было отмечено и ранее при иследовашш других видов и других локализаций рецепторов (Лейбуш, 1992).

1.2. Молекулярная масса субъединиц рецепторов. Молекулярная масса печеночного рецептора инсулина как миноги, так и лягушки , определенная методом кросс-сшивки рецептора с [125-1]--инсулином,составляла 130 кДа, что совпадает с молекулярной

Таблица I.

Характеристика инсулиновых рецепторов клеток экспериментальных животных.

Адипоциты крысы Гепатоциты лягушки Гепатоциты миноги

Общее число сайтов на клетку в том числе высокоаффинных Аффинность рецепторов (Кд,М) высокоа$финных низкоаффинных 300.000 60.000 2,7хЮ~1 3,1x10 100.000 12.500 4,0x10"! 3,1x10 0 70.000 2.100 2,0х10"| 4,0x10 0

массой рецептора у всех изученных видов.

Молекулярная масса (З-субъединицы рецептора, оцененная в опытах по автофосфорилированию частично очищенных на ТСА-агарозе рецепторов под воздействием инсулина, как б случае миноги, так и лягушки составляла 95 кДа, что совпадает с данными литературы для всех изученных видов позвоночных.

Таким образом, инсулиновые рецепторы гепатоцитов миноги и лягушки по своим связывающим параметрам и субъэдиничному составу не отличались от инсулиновых рецепторов других позвоночных. Это соответствует ранее сделанному выводу о высокой консервативности инсулинового рецептора в эволюции позвоночных.

2. Интернализация и внутриклеточный процессинг 1125-1)-инсулина в изолированных гепатоцитах миноги и лягушки.

2.1. Влияние температуры инкубации на интернализацию С125-Т]-инсулина в гепатоцитах миноги и лягушки.

Как следует из рисЛ, интернализация С125-11-инсулина в гепатоцитах обоих видов имеет место даже при 0°С; при этом у лягушки наблюдалась градуальность феномена - при 5 и 20°С интернализация выше, чем при 0°С (32 и 17% соответственно), в то время как у миноги количество интернализованного инсулина (40-45%) было одинаково при всех исследованных температурах. Из опытов следует, что температуры жизнедеятельности миноги и лягушки не препятствуют интернализации инсулина в их клетках.

Рис.1. Влияние температуры инкубации на количество внутриклеточного [125-1]-инсулина в гепатоцитах лягушки (а) и миноги (б). Цифры в основании столбиков - температура инкубации, по оси ординат - доля внутриклеточного [ 125-1] -инсулина от связанного клеткой, %.

а б

2.2. Внутриклеточный процессинг И25-1]-инсулина в изолиро ванных гепатоцитах миноги и лягушки. Исследование судьбы ин-тернэлизованного [125-1]-инсулина показало, что в случае ге-патоцитов лягушки наблюдалось выделение ранее интернализо-вэнного [125-1]-инсулина в среду, причем количество выделенного гормона возрастало с удлинением времени инкубации и повышением температуры: при 0°С не наблюдалось выделения инсулина, при 5°С за 3 часа в инкубационной среде количество [125-1]-инсулина увеличивалось в 1,5 раза по сравнению с началом опыта, при 20°С в 2 раза. Количество

[125-1]-инсулина в среде достигало максимума за 2 часа и далее не изменялось. Процент деградированного инсулина в среде не превышал 12% при 20°С и 2% при 5°С. При ОС выделения продуктов деградации не наблюдалось.

Из опытов следует, что гепатоциты лягушки способны выводить не только продукта деградации интернализованного [125-1]-инсулина, но и интактный лиганд, на долю которого приходится не менее 80% выделяемой за 3 часа радиоактивности. Поскольку интактный [125-1]-инсулин выделяется в составе легких эндосом, будучи связанным с рецептором, полученные данные указывают на наличие рециклирования рецепторов в гепатоцитах лягушки. Существенно, что рециклирование имеет место при физиологичных для лягушки температурах и возрастает с их повышением.

В аналогичных опытах на гепатоцитах миноги не было обнаружено ни выделения [125-1]-инсулина клетками, ни уменьшения внутриклеточной радиоактивности как при 5, так и при 20°С. Это указывает на отсутствие рециклирования

30 20

■1С

Л.

20°

5

20"

рецепторов в этих клетках и на внутриклеточное накопление в них С125-1]-инсулина и/или продуктов его деградации.

2.3. Внутриклеточная деградация [125-1]-инсулина в гепатоцитах миноги и лягушки. Изолированные гепатоциты экспонировали различное время (до 60 мин) с [125-1]-инсулином при температуре 20°С, затем солюбилизировали и в солюбилизате определяли долю осаждаемого 15% ТХУ меченого гормона. Как показано на рис.3, в гепатоцитах лягушки после 60 мин инкубации при 20°С на долю деградированного гормона приходится не более 7% интернализованной радиоактивности, в то время как в гепатоцитах миноги - порядка 25%. Опыты указывают на то, что в отлично от гепатоцитов лягушки, где интернализованный [125-I]-инсулин преимущественно выделяется клеткой в недеградированной форме, в гепатоцитах миноги он в основном деградирует, причем продукты деградации гормона накапливаются в клетке.

Для определения участия лизосом в деградации И 25-1]-инсулина исследовали влияние хлорохина ( ингибитора лизосо-сомального процессинга) на накопление меченого гормона в

100' а *-Ж—±— 100' » л— б

80 " ' ' Т~Т" 80 "

60 ' 60 ' 1

20 чо б о го чо 60

Рис.2. Деградация [125-1]-инсулина в гепатоцитах лягушки (а) и миноги (б). 1-осаждение ТХУ [125-1]-инсулина в солюбилизи-рованных клетках; 2- контроль (осаждение ТХУ [125-1]-инсулина, инкубируемого в аналогичных условиях без клеток). По оси абсцисс - время инкубации, мин; по оси ординат - ТХУ-осаждае-мая радиоактивность, в процентах к общей.

клетках. Эксперименты показали, что в присутствии хлорохина связывание гормона гепатоцитами лягушки повышается вдвое, тогда как на связывание метки гепатоцитами миноги ингибитор не влияет. Это свидетельствует о том, что внутриклеточная деградация [125-1]-инсулина в клетках лягушки происходит в хлорохин-чувствительном (лизосомальном) компартменте, в то

время как деградация гормона в гепатоцитах миноги по-видимому осуществляется без участия лизосом.

Таким образом, исследование показало, что интернализация и внутриклеточный процессинг Г125-1]-инсулина в гепатоцитах миноги и лягушки монет реализоваться при температурах, физиологичных для данных видов. Следовательно, температурный фактор не лимитирует эти процессы в клетках низших позвоночных.

Как показано в работе, внутриклеточный процессинг интер-нализованного [125-1]- инсулина в гепатоцитах лягушки принципиально не отличается от наблюдаемого в клетках теплокровных животных. Интернализованный после связывания с рецептором [12.5-1]-инсулин расходится по двум путям, из которых один заканчивается внутриклеточной деградацией гормона, а второй -выделением в среду интактного инсулина. Есть все основания полагать, что внутриклеточная деградация инсулина в гепатоцитах лягушки по механизму не отличается от таковой в клетках млекопитающих. На это указывает кажущееся повышение специфического связывания [125-1]-инсулина клеткой при воздействии на нее хлорохина. Эффективность ингибитора означает, что игленно лизосомальный компартмент является местом деградации лигавда в данном случае. Вероятно, что и путь, ведущий лиганд в этот компартмент в случае гепатоцитов лягушки аналогичен наблюдаемому в клетках теплокровных. Существенно, однако, то, что в этом случае все события развиваются при температурах ниже 20°С, т.е. когда эти процессы в клетках млекопитающих тормозятся. С другой стороны, возрастание ретроэндоцитоза инсулина (а, следовательно, и рециклирования рецепторов) при повышении температуры позволяет предположить, что роль рециклирования рецепторов в регуляции процессинга гормон-рецептор-них комплексов у холоднокровных менее существенна, чем у теплокровных.

При исследовании судьбы интернализованного инсулина в гепатоцитах миноги наблюдалась принципиально иная ситуация: внелизосомальная деградация лиганда, неспособность клетки выделять как интактный инсулин, так и продукты его деградации. Необычную судьбу интернализованного [125-1]-инсулина можно

связать с трансформацией гепатоцитов миноги в преднерестовый период (Bertol.in1., 1965).. Можно предположить, что функцию деградации инсулина в этом случае выполняют протеазы иито-зольной локализации, участие которых в деградации гормона показано ранее (Кио еиа1., 1993). В то же время следует еще раз подчеркнуть тот факт, что даже в условиях глубокой трансформации гепатоциты миноги сохраняют способность к рецептор-опосредованному эндоцитозу лиганда.

3. Инсулин-индуцируеыая даун-регуляция рецепторов в изолированных гепатоцитах ииногк.

В данной серии экспериментов изучалось влияние преинкубации изолированных гепатоцитов миноги с немеченым инсулином на последующее связывание С125- II-инсулина этими клетками.

3.1. Влияние температуры преинкубации и концентрации немеченого исулина на связывание [125-1]-инсулина гепатоцигзми миноги. Как видно на рис.З, при температурах 4, 15 и 25°С пре-инкубация клеток с Ю"3 М инсулина приводила к снижению ре-цепторного связывания на 35-45%. Эффект преинкубации был до-зозависим: он отсутствовал при концентрации гормона Ю-10 М, отчетлив при Ю-9 М и максимален при 10"® М. Использование в качестве среды для преинкубации буфера на основе Триса (рассматриваемого в качестве ингибитора рециклирования рецепторов инсулина) не влияло на результат. Отсутствие эффекта Триса является дополнительным подтверждением отсутствия рециклирования инсулиновых рецепторов в гепатоцитах миноги. Эффект преинкубации (снижение связывания на 45-55%) был близок к наблюдаемому на адипоиитах крысы (55%). Сравнение динамики процесса в клетках миноги к крысы показало, что в гепатоцитах миноги при 4°С этот эффект развивается даже быстрее, чем в адишцитах крысы при 37°С (выход эффекта на плато за 3 и 10 мин соответственно). Это можно объяснить отсутствием рецикли рования рэцептороЕ в гепатоцитах миноги, которое- противостоит лиганд-индуцирубмому эндоцитозу рецепторов, лежащему в основе даун-регуляции.

%

100 80 60 40 20

I-' | \ ! 1 | и— р-1— ч-

10 \(с № Г) 10* 10* & г Л79 Ю'* К? Ю'*

15Х

2.5" С

У Г

/5 Г

Рис.3. Влияние температуры поеинкубации и концентрации немеченого инсулина на связывание С125-1]-инсулина с гепато-цитамл миноги. Температура преинкубации указана внизу на графике. Цифры в основании столбиков обозначают концентрацию немеченого инсулина, М. По оси ординат - специфическое связы-ьзние [125-; Ьхнсу.тана клетками, в процентах от контроля (преинкубация без инсулина), а,б,в - преинкубация в буфере на основе Гепеса, г,д - на основе Триса.

3.2. Влиь'гП!'.' преинкубации с инсулином на число и аффинность сгж'л.'аших мест з гепатоцитах миноги.

а

Д

Таблица 2.

Влияние ггр.£инкуЗации с инсулином на число и аффинность связнвххцих мест в гепатоцитах минога.

Контроль Преинкубация с инсулином

Обков число са??ор в расчете на клетку Число высокоаффкшшх рецептор;»" Аффинность рецепторов (Кд,М) высокоаффипных .уипкояфф№них 70.000 2.100 1,9хЮ~| 7,3x10 42.000 1.500 6,2x10^! 7,3x10

Слияние свягывавил 1125-1]-инсулина клетками после преинку-бац/и с натявным гормоном может быть обусловлено либо умень-теетек числ? СБЯзкеэнгда мест нз клетке, либо снижением их аффиггности. Методом конкурентного анализа с последующей обработкой дачах гс Схэтчарду показано, что после преинкубации гапэтоцитпв с тлксуликоу количество связывающих мест в них снижается на 4556, причем это снижение относится к связывающим дзотам обои* классов {табл.г). Кроме того, наблюдалось небольшое (в пределах порядка) снижение сродства к лиганду высоко-

аффинных связывающих мест. Понижение уровня связывания [125-I]-инсулина гепатоцитами в результате преинкубации на 50% коррелирует с уменьшением числа связывающих мест на 45%, следовательно, снижение сродства не вносит существенного вклада в эффект преинкубации.

Таким образом, опыты с преинкубацией показали способность инсулина индуцировать убыль числа рецепторов в изолированных гепатоцитах миноги в условиях, близких к физиологическим как в отношении концентрации инсулина и температуры преинкубации, так и в отношении величины эффекта. Полученные данные указывают на возможность инсулин-индуцируемой даун-регуляции у миноги независимо от особенностей внутриклеточного процессинга в ее гепатоцитах.

4. Исследование механизмов инсулин-индуцируемого снижения рецепторного связывания в гепатоцитах миноги и лягушки и в адипоцитах крысы.

Ранним механизмом даун-регуляции является перераспределение рецепторных пулов, вызванное их оккупацией лигандом: интернализация инсулин-рецепторных комплексов приводит к уменьшению числа рецепторов на клеточной поверхности и к увеличению их количества внутри клетки. Продолжительная (многочасовая) экспозиция с инсулином приводит далее к ускорению деградации рецепторов в клетке и к уменьшению их общего числа в расчете на клетку. В данной работе исследовался механизм перераспределения рецепторов.

Как показано на рис.5, в отсутствие инсулиновой стимуляции рецепторы локализуются на плазматической мембране преимущественно, но не исключительно. Некоторая их часть (в адипоцитах крысы 14%, в гепатоцитах лягушки и миноги 30 и 36% соответственно) обнаруживается внутри клетки, что объясняется наличием спонтанного эндоцитоза рецепторов. В гепатоцитах миноги и'лягушки базальный пул внутриклеточных рецепторов в 2-2,5 раза выше, чем в клетках крысы. Это можно объяснить либо более высокой скоростью спонтанного эндоцитоза, либо

100 % 80 60 40 20

20 40 60 80 IOCH

Э~

ШЩ

инс

I И1ЛС

иис

ЩА

Рис.5. Влияние преинкубации с инсулином на соотношение между поверхностными и внутриклеточными рецепторами в одипоцитах крысы (а), гепатоцитах лягушки (0) и миноги (в). Сьетлые столбики - поверхностные рецепторы, заштрихованные столбики - внутриклеточные рецепторы. Строжа обозначает пре-инкубацию с 67нМ инсулина (30 мин при 37°С для адипоцитов или при 4 С для гепатоцитов). По оси ординат - доля данного пула рецепторов от общего количества рецепторов клетки.

относительно низкой скоростью рециклирования. Описанные выше эксперименты по изучению ретроэндоцитоза [125-1]-инсулина и влиянию Триса на даун-регуляцию говорят в пользу второго предположения.

Преинкубация с инсулином увеличивала пул внутриклеточных рецепторов в адипоцитах крысы и гепатоцитах лягушки до 65-70%. Соответственно увеличению внутриклеточных снижалось количество поверхностных рецепторов, при этом уменьшение пула поверхностных рецепторов происходило в той же степени, что и уменьшение связывания клетками [125-1]-инсулина (оба показателя снижались примерно на 50%). Это свидетельствует о том, что перераспределение рецепторов является единственным механизмом даун-регуляции в данных условиях. В случае гепатоцитов миноги не наблюдалось возрастания доли внутриклеточных рецепторов в процентном выражении, соответственно не снижалась и доля поверхностных рецепторов. Однако при пересчете на абсолютные величины (число рецепторов в расчете на клетку) с использованием результатов анализа Скэтчарда (см. табл.2) обнаружилось, что уменьшение поверхностного пула рецепторов с 44.000 до 22.000 (т.е. примерно на 50%, что соответствует снижению связывания

[125-13-инсулина гепатоцитами миноги в результате преинкуСации с инсулином) сочетается с уменьшением внутриклеточного пула рецепторов с 26.000 до 20.000. Наиболее вероятное объяснение этого феномена состоит в том, что в гепатоцитах миноги интернализованные рецепторы инсулина подвергаются интенсивной деградации. Вероятно, в клетках миноги механизм деградации рецепторов включается быстрее, чем в клетках лягушки и крысы, что подтверждается и более высоким уровнем деградации гормона в гепатоцитах миноги в сравнении с клетками лягушки, показанным выше. Полученные данные указывает на то, что внутриклеточная судьба инсулина и рецепторов определяется факторами, зависящими не столько от температуры окружающей среда, сколько от функционального состояния печени, определяемого своеобразной экологией данного вида.

Полученные результаты харатеризуют некоторые пути адаптации инсулиновой регуляции низших позвоночных к температурам их жизнедеятельности. В то же время они не дают прямого ответа на вопрос о причинах отсутствия или слабой выраженности феномена даун-регуляции инсулиновых рецепторов у холоднокровных ln vivo. Тем не менее они позволяют конкретизировать его. В частности, следует подчеркнуть роль таких факторов, как относительно медленное рециклирование рецепторов при низких температурах; возможно, более низкие скорости синтеза рецепторов и в ряде случаев усиление их деградации в клетках печени. Эти, а .возможно, и некоторые другие факторы делают ответ клетки на снижение уровня инсулина более инертным даже при условии сохранения при низких температурах высокой скорости инсулин-стимулируемого эндоцитоза рецепторов.

ВЫВОДЫ

1. В изолированных гепатоцитах миноги и лягушки выявлены рецепторы, которые по своим связывающим характеристикам и субъединичному составу (молекулярная масса а-субъединицы 130 кДа, р-субъединицы - 90 кДа) не отличаются сколько-нибудь существенно от рецепторов других позвоночных.

2. Интернализация [125-1]-инсулина в изолированных гепатоци-

тах миноги и лягушки возможна в диапазоне температур от О до 20°С. Повышение температуры в этих пределах увеличивает ин террнализзпию инсулина в гепатоцитах лягушки с 17 до 32%; в гепатоцитах миноги уровень интернализации (40-45%) одинаков при всех температурах.

3. Интернализованный [125-11-инсулин в гепатоцитах лягушки при температуре 0-20°С частично деградирует в лизосомах и выделяется клеткой как в виде продуктов деградации (7%), так и неизмененном виде (93%). Ретроэндоцитоз не наблюдается при 0°С и увеличивается с повышением температуры от 5 до 20°С.

4. Интернализованный [125-1]-инсулин деградирует в гепатоцитах миноги при температуре 20°С в три раза быстрее, чем в гепатоцитах лягушки, причем эта деградация не связана с лизосо-мальным компартментом. Клетки не выделяют инсулин ни в интак-тном виде, ни в виде продуктов деградации.

5. Рецепторы инсулина в изолированных гепатоцитах миноги подвержены даун-регуляции. Величина феномена (снижение связывания [125-1]-инсулина в результате преиннубации с нативным гормоном на 45%) одинакова при температуре 4; 15 и 25°С и сопоставима с таковой в адипоцитах крысы при 37°С. Даун-регуляция возможна при концентрациях инсулина 10~9-1(Г® М и имеет в основе уменьшение числа рецепторов на поверхности клетки без изменения их аффинности.

6. В изолированных гепатоцитах миноги и лягушки при 4°С, как и в адипоцитах крысы при 37°С, инсулин инициирует уменьшение числа рецепторов на поверхности клетки. В клетках крысы и лягушки соответственно уменьшению пула поверхностных рецепторов увеличивался пул внутриклеточных рецепторов. В гепатоцитах миноги этого не происходит, что указывает на стимуляцию инсулином не только перераспределения рецепторов, но и их быстрой внутриклеточной деградации.

7. Интернализация инсулина и даун-регуляция инсулиновых рецепторов в изолированных гепатоцитах низших позвоночных воспроизводятся при температурах их нормальной жизнедеятельности и имеет в основе те же механизмы, что и у ¡высших животных. Однако, полученные данные позволяют предположить, что

внутриклеточная судьба инсулина и рецепторов в гепатоцитах холоднокровных определяется факторами,зависящими не только от температуры окружающей среды, но и от функционального состояния печени в определенные периода жизненного цикла.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лейбуш Б.Н., Лаппова Ю.Л. Даун-регуляция инсулиновых рецепторов в изолированных гепатоцитах балтийской миноги Lampetra fluvlatllls. //Журн. эвол. биох. физиол.-1994.-т.ЗО, JÖ, в печати.

2. Lelbush В., Shchepklna (Lappova) Y., Pertseva M. The Insulin receptor down regulation and autophosphorylatlon In isolated hepatocytes of lairiprey. / Abstracts of the 16th Conference of European Comparative Endocrinologists. Padova, Italy.-1992.-P.139.

3. Лаппова Ю.Л., Лейбуш Б.Н. Рецептор-опосредуемый эндоцитоз в клетках холоднокровных. I. Интернализация инсулина в гепатоцитах миноги и лягушки. //Цитология.- 1994, в печати.

4. Лаппова Ю.Л., Лейбуш Б.Н. Рецептор-опосредуемый эндоцитоз в клетках холоднокровных. II. Судьба интернализованного 1251-инсулина в изолированных гепатоцитах миноги и лягушки. //Цитология.- 1994, в почати.