Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологические изменения скелетной мышечной ткани при экспериментальной патологии и воздействии повышенной гравитации

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфологические изменения скелетной мышечной ткани при экспериментальной патологии и воздействии повышенной гравитации"

На правах рукописи

Федячкин Александр Николаевич

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ВОЗДЕЙСТВИИ ПОВЫШЕННОЙ ГРАВИТАЦИИ

03 00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 14.00.27 - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

иис) 1Ь Г544

Саранск 2008

003167544

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава»

Научные руководители Заслуженный работник высшей школы

РФ, доктор медицинских наук, профессор ЕВ. Ямщиков доктор медицинских наук И.В. Макаров

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор ПЛ. Кругляков

доктор медицинских наук, профессор НА. Окунев

Ведущая организация: Оренбургский государственный медицинский университет

Защита состоится «_23_»_мая_2008 г в 10_часов на заседании диссертационного совета Д

212 117 01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им НП Огарева» по адресу 430000, Республика Мордовия, г Саранск, ул Большевистская, 68

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им Н П Огарева»

Автореферат разослан « » апреля _2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

профессор В.П. Балашов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Посттравматическая регенерация скелетных мышц продолжает оставаться в центре внимания исследователей и практических врачей Это обусловлено частым повреждением скелетных мышц в результате травм, а также проведением различных реконструктивных операций на сухожильно-мышечной системе (Студитский А Н, 1959; Клишов А А., 1984, Данилов Р К, 1986, 1994, Шмерлинг М В , Веряскин ВВ, Филюшина ЕЕ., 1990, Булякова НВ с соавт, 1998, Данилов РК, Мурзабаев X X, 2002, Ямщиков Н В , Суворова Г Н, 2003; Тулаева О Н, 2003, Carlson D М, 1983, 1997, Sloper J С, Partnge Т А, 1980, Grounds М D, 1991, Arnngton E.D, Miller М D, 1995, Minamoto V В eL al, 1999)

Для стимуляции репаративной регенерации скелетной мышечной ткани применяются различные лечебные средства, улучшающие кровообращение, нормализующие микроциркуляцию и метаболизм поврежденных тканей (Ратнер Г JI с соавт, 1977, Давыдкин Н Ф, 1994, Краснов А Ф, Котельников Г П, 1997) Однако добиться хорошего функционального результата удается не всегда

Экспериментально-морфологические и клинические исследования сотрудников Самарского государственного медицинского университета убедительно свидетельствуют о положительном влиянии повышенной гравитации с вектором действия центробежных сил краниокаудального направления на репаративный остеогенез нижних конечностей Экспериментальные данные показывают, что под влиянием повышенной гравитации более активно идет формирование костного регенерата и его перестройка, наблюдается интенсивный рост сосудов микроциркуляторного русла (Яшков А В , Котельников Г П, Махова А Н, 1998, Котельников Г П, Яшков А В, 2003) Ускоряются все стадии процесса репаративной регенерации тканей, составляющих мышечно-сухожильное соединение (ТулаеваОН., 2003)

Проведенные экспериментальные исследования на здоровых животных, а также на человеке свидетельствуют, что умеренные величины повышенной гравитации вызывают в скелетно-мышечной системе положительные изменения, обеспечивающие более интенсивное ее функционирование и не оказывают отрицательного действия на организм (Газенко ОГ, Кальвин М, 1975, Котовская АР, Краснов ИБ, Шипов А А, 1985, Суворов П М, Сидорова К А, 1995)

Хронические артериопатии нижних конечностей составляют среди населения стран мира, в зависимости от возраста больных, от 0,6 до 15 % (Кошкин В М, 1999, Кохан Е П и соавт, 2003, Hiatt WR etal, 1995) В России хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей страдает 2-3 % населения При этом в 82 %

случаев это облитерирующий атеросклероз, а в 2 % - облитерирующий эндартериит (Савельев B.C. и соавт, 1990, Вачев А Н ,1998, Комаров A.JI и соавт., 2000, Азизов Г А, Козлов В И , 2004)

Лечение облитерирукяцих заболеваний артерий нижних конечностей по-прежнему остается актуальной проблемой Частота появления рестенозов и окклюзии в течение двух лет после бедренно-подколенной реконструкции составляет 30-50 % (Затевахин ИИи соавт, 1993, Чернышов В Н и соавт, 1996, Покровский А В, Зотиков А Е„ 1996, Ратнер Г Л и соавт, 1999, Осипов Б С, 2000) Среди основных причин неудачных исходов артериальных реконструкций, помимо технических погрешностей, является прогрессирование атеросклероза (Восканян Ю Э и соавт, 2002, Нерр W, Ebert Ch, 1996) Единственной возможностью профилактики развития болезни является стимуляция коллатерального кровообращения (Дадвани С А и соавт, 2000, Макаров И В, 2004)

Поэтому заслуживает внимание возможность применения в лечении больных с хронической артериальной ишемией нижних конечностей гравитационных перегрузок направления голова - таз (направление +Gz) (Левашов Н В, 1986) Возникающий при этом дополнительный приток к ногам крови стимулирует коллатеральный и регионарный кровоток, активизирует обменные процессы и снижает степень ишемии (Галкин РА и соавт, 1997, Опарин А Н , 2002, Котельников Г П, Яшков А В , 2000, 2003, Галкин Р.А, Макаров И В, 2006)

Имеющиеся клинические и экспериментальные сведения позволяют высказать предположение о целесообразности использования гравитационного фактора при повреждение вследствие раздавливания скелетных мышц нижних конечностей и у животных с моделированным атеросклерозом Однако до настоящего времени сведений экспериментального характера по целенаправленному изучению влияния гравитационной терапии на процессы репаративной регенерации после раздавливания скелетной мышечной ткани, а также на регионарный кровоток и микроциркуляцию у животных с моделированным атеросклерозом очень мало и они носят противоречивый характер. Важность практического решения перечисленных выше проблем в эксперименте и возможность обоснования применения гравитационной терапии в клинической практике явилось основанием для выполнения данного исследования

Цель исследования - морфологический анализ особенностей структурной организации и репаративной регенерации поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани в условиях механического повреждения, экспериментального атеросклероза и воздействии повышенной гравитации краниокаудального направления

Задачи исследования:

1 Изучить характер репаративных процессов и состояние мшфоциркуляторного русла в раздавленной скелетной мышце

2 Дать сравнительную морфометрическую и электронно-микроскопическую оценку процессов регенерации скелетной мышечной ткани без воздействия и с воздействием повышенной гравитации краниокаудального направления

3 Выявить реактивные изменения, возникающие в поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани при раздавливании

4 Провести морфофункциональную оценку изменений регионарного кровотока и микроциркуляции, состояния скелетной мышечной ткани нижних конечностей кроликов при экспериментальном атеросклерозе

5 Изучить в экспериментах на кроликах влияние повышенной навигации на состояние регионарного кровотока, микроциркуляторного русла и скелетной мышечной ткани нижних конечностей и провести сравнительное рандомизированное исследование этого воздействия в группе интактных животных и у кроликов с моделированным атеросклерозом.

6 Провести сравнительную оценку влияния применяемых режимов повышенной гравитации на морфологические изменения в скелетной мышечной ткани и сосудах микроциркуляторного русла икроножных мышц кроликов при экспериментальном атеросклерозе и обосновать перспективы гравитационной терапии в клинической практике

Научная новизна полученных данных

С использованием современных морфологических и электронно-микроскопических методов изучены реактивные изменения, наблюдаемые в скелетной мышце белых крыс при раздавливании, прослежены особенности течения раневого процесса на разных этапах репаративной регенерации

Впервые предложено устройство для изучения влияния повышенных нагрузок на лабораторных животных и определены оптимальные режимы воздействия гипергравитации на скелетную мышечную ткань и регионарный кровоток (патент РФ №69738 от 10 01 2008)

Изучены особенности восстановительных процессов в скелетной мышце при её механическом повреждении в условиях воздействия повышенной гравитации краниокаудального направления

В сравнительном аспекте проведено комплексное морфологическое исследование воздействия гравитационных перегрузок краниокаудального направления на состояние регионарного кровотока, микроциркуляторного русла и скелетной мышечной ткани нижних конечностей у интактных животных и у животных с моделированным атеросклерозом

Установлено стимулирующее влияние гипергравитации на развитие элементов микроциркуляторного русла, увеличение числа функционирующих капилляров и, таким образом, на оптимизацию репаративных процессов

Практическая значимость работы

Экспериментально установленные режимы повышенной гравитации краниокаудального направления, оптимизируют регенерацию скелетной мышечной ткани и могут быть применены у больных с повреждениями мышц нижних конечностей

Примененная в данной работе модель раздавливания может быть использована в экспериментальной практике при изучении репаративных процессов в органах и тканях

Предложенная экспериментальная центрифуга может быть использована для изучения влияния гипергравитации на лабораторных животных

Применение гравитационной терапии в клинической практике значительно повышает эффективность лечения и качество жизни больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей

Основные положения, выносимые на защиту

1 В скелетной мышце с нанесенной травмой, раздавливанием, выявляются выраженные реактивные изменения, переходящие в некроз Распад структурных компонентов ткани происходит одновременно и прослеживается на всех уровнях структурной организации

2 Восстановительные процессы в поврежденной скелетной мышце в условиях воздействия повышенной гравитации краниокаудального направления коррелируют с изменениями микроциркуляторного русла и характеризуются ускорением всех этапов репаративного гистогенеза

3 Гравитационные перегрузки при многократном воздействии приводят в эксперименте к повышению емкости сосудистой сети и, прежде всего, микроциркуляторного русла, проявляющегося увеличением его общей площади Это улучшает морфофункциональное состояние скелетной мышечной ткани и

кровообращение нижних конечностей как у интакгных животных, так и у животных с экспериментальной патологией

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 1 в центральной печати Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (г Курган, 2004), на заседании Самарского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре гистологии и эмбриологии Самарского государственного медицинского университета при чтении лекций и проведении практических занятий по темам «Мышечные ткани» и на кафедре курортологии и физиотерапии СамГМУ при чтении лекций и проведении практических занятий по темам «Физиотерапевтические факторы» и «Физиотерапия в травматологии и ортопедии», на хирургических кафедрах по теме «Хирургические заболевания периферических артерий»

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 166 источников, из которых 117 - отечественные Иллюстрационный материал представлен 5 таблицами, 3 рисунками, 64 микрофотографиями и 4 гистограммами

Материал и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена на кафедре гистологии и эмбриологии Самарского государственного медицинского университета Росздрава и на базе центральной научно-исследовательской лаборатории Самарского государственного медицинского университета Росздрава. Выражаем благодарность за возможность осуществления экспериментальной части работы заведующей центральной научно-

исследовательской лабораторией СамГМУ доктору медицинских наук, профессору JIТ Воловой

В соответствии с поставленными задачами было проведено 4 серии экспериментов на 20 белых крысах, весом 180 - 200 г, которых содержали в стандартных условиях вивария на равноценном пищевом рационе и на 30 кроликах породы шиншилла в возрасте от 1 до 2 лет, массой от 2,7 до 3,2 кг

Распределение экспериментального материала по сериям, группам, срокам воздействия и наблюдения приведены в таблице 1

В первой серии изучали особенности репаративной регенерации икроножной мышцы после нанесения механического повреждения, путем раздавливания Забор экспериментального материала производили на 3, 7,14,21 сутки эксперимента.

Во второй серии эксперимента изучали морфологические изменения при длительном ежедневном применении гипергравитации на процесс регенерации поврежденных мышц Животные были разделены на две группы подопытную и контрольную Подопытная группа подвергалась воздействию повышенной гравитации краниокаудального направления величиной + 1,1 Gz со второго дня после травмы ежедневно по 40 минут в течение 20 дней К контрольной группе гравитационные перегрузки применены не были Взятие материала производили на 5, 7, 10,14, 21 сутки эксперимента

В третьей серии эксперимента изучали морфологические изменения в скелетных мышцах и сосудах микроциркуляторного русла кроликов с экспериментальным атеросклерозом

В четвертой серии эксперимента изучали влияние гравитационных перегрузок на регионарный кровоток, микроциркуляцию и состояние скелетной мышечной ткани нижних конечностей кроликов при различных режимах вращения При этом в течение 6 месяцев 30 кроликам моделировали атеросклероз, после чего у 12 животных были изучены морфологические изменения, возникающие в аорте, периферических артериях, скелетных мышцах и микроциркуляторном русле на фоне атеросклероза и воздействия повышенной гравитации + 0,78 Cz (подгруппа 1), а у 12 кроликов с атеросклерозом морфологические исследования были проведены после воздействия на них повышенной гравитации + 0,97 Cz (подгруппа 2)

Исследование мышц задних конечностей было обусловлено тем, что они, вследствие расположения животных в клетках центрифуги головой к центру, задними

Таблица 1

Общая структура экспериментального материала

Номер серии эксперимента Исследуемые группы Режим воздейст вия Методы исследования Кол-во животных

1 Контрольная повреждение мышц без 1рименения ювышенной гравитации - общегистологические, электронно-микроскопический,инъекцион-ный, статистический крысы 10

2 1 группа контрольная товреждение мышц без ювышенной гравитации, 2 группа жсперименгальная -товреждение мышц в ¡очетаниис ювышенной Т) агитацией Ежедневное 45 об/мин-40 минут 20 сеансов общегистологические, электронно-микроскопический, инъекционный, статистический крысы 10

3 Контрольная без ювреждения мышц с жспериментальным гееросклерозом. - общегистологические, электронно-микроскопический, инъекционный, статистический кролики 6

Экспериментальная 1 под1руппа -без повреждения мышц в сочетании с атеросклерозом и воздействием повышенной 40 об/мин-ЗОмин (+0,78 Сг) 10 сеансов общегистологические, электронно- кролики 12

4 гравитацией 2 подгруппа- без повреждения мышц в сочетании с атеросклерозом и воздействием повышенной гравитацией 45 об/мин ЗОмин (+0,97 Сг) 10 сеансов микроскопический, инъекционный, статистический кролики 12

конечностями к периферии, испытывали наибольшее воздействие гравитационных перегрузок при вращении центрифуги

Раздавливание было моделировано путем нанесения сдавления следующим образом Подопытных животных вводили в эфирный наркоз, после этого наносили повреждение на икроножную мышцу в средней ее трети Зона повреждения соответствовала ширине поверхности травмирующего предмета и равнялась 0,4 см Сила сдавления соответствовала -76,5 кг Забор материала для исследования проводили из места наибольших изменений и на границе с неизмененной тканью

Моделирование данного вида повреждения проводилось с помощью иглодержателя

Для стандартизации проведения опыта был проведен расчет силы сдавления по формуле, где-

Fi - сила сдавления, действующая на часть тела и вызывающая повреждение, F2 - сила, приложенная на иглодержатель до фиксации последнего в ограничитель,

Li - длина коротких браншей, L2- длина длинных браншей F2 = 8,5 кг Li = 18 см L2 = 2 см

В работе использованы общегистологические, морфометрический, электронно-микроскопический методы и метод импрегнации (наливки) сосудистого русла крыс раствором берлинской лазури (водный раствор Ранвье)

Экспериментальный атеросклероз воспроизводили у кроликов путем скармливания им свиных мозгов, перемешанных с комбикормом (Краснопольский А В, 1997) В 100 г свиных мозгов содержится 2 г холестерина По методу Н.Н Аничкова (1913) атеросклероз у кроликов развивается при пероральном введении 0,2 г холестерина на 1 кг массы животного В перерасчете получается 10 г свиных мозгов на 1 кг массы кролика. Свиные мозги доставлялись с свинокомплекса в свежезамороженном виде и хранились в морозильной камере.

Кролики получали атеросклеротическую диету в течение 6 месяцев (180 суток), в результате чего создавалась модель атеросклероза На атерогенной диете находились 30 кроликов После 180 суток атеросклеротической диеты 6 кроликов были выведены из эксперимента чтобы проследить с помощью морфологических исследований степень развития атеросклеротических поражений и возникающих патологических изменений в

аорте, артериях, микроциркуляторном русле и скелетных мышцах нижних конечностей. Далее производили забор экспериментального материала у 12 кроликов после курса гравитационной терапии с перегрузкой +0,78 Cz (первая подгруппа), а у второй подгруппы кроликов после гравитационной терапии с перегрузкой +0,97 Cz.

Экспериментальное исследование было проведено на специальной электроцентрифуге (патент РФ на полезную модель №69738 от 10.01.2008г) На рисунке 1 показан внешний вид экспериментальной центрифуги.

Независимо от выбранного режима гравитационных перегрузок ( 40 об/мин - 0,78 Cz, 45 об/мин - 0,97 Cz) во всех сериях экспериментов единой была величина градиента ее нарастания (0,08 ед/с). При выборе этих величин исходили из литературных данных, указывающих на отсутствие их вредного и разрушительного действия на жизненно важные системы организма (Котовская А.Р., Краснов И.Б., Шипов A.A., 1985). По мнению этих авторов умеренные величины повышенной гравитации при хроническом применении способствуют повышению устойчивости организма к гипоксии и активизации метаболических реакций.

Рис.1. Экспериментальная электроцентрифуга

Гистологический метод. Материал, полученный от подопытных животных фиксировали в 12 % растворе нейтрального формалина и в растворе Шабадаша. Серийные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон,

орсеином и железным гематоксилином по Ясвоину Полученные срезы изучали на световом микроскопе фирмы «Биолам»

Морфометрическый метод Морфометрический анализ проводили с помощью точечного метода (шаблон Вейбеля) Определяли процентное соотношение поврежденных и неповрежденных мышечных волокон, мышечных ядер, межуточного отека, элементов микроциркуляторного русла и соединительной ткани

Электронно-мпкроскоптесшй метод Материал для электронно-микроскопического исследования подвергали префиксации в течение 2 часов в 2,5 растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере с pH - 7,4 (Milloning G, 1961), затем фиксировали в 1% растворе тетраокиси осмия на таком же фосфатном буфере при температуре 0-4° С в течение часа (Pallade G Е, 1962)

После этого материал промывали в растворе фосфатного буфера, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заливали в аралдиты по методике Glauert А М, Glauert R Н (1958) и эпонаралдитовую смесь Для прицельного электронно-микроскопического анализа со всех блоков получали полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего Ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм готовили на ультрамикротоме LKB 4804, контрастировали 2,5 % раствором уранилацетата и 0,3% раствором цитрата свинца по Reynolds ES. (1963) Срезы просматривали и фотографировали на электронном микроскопе ЭВМ-100 Б

Инъекционный метод выявления кровеносного русла с последующей гистологической обработкой материала (ЭА Адыишрин-Заде, ПА. Геяашвили и соавт 1984) Для изучения микроциркуляторного русла икроножной мышцы наркотизированным животным производили предварительную перфузионную фиксацию 1,5 % раствором формальдегида Для этого вскрывали левую половину грудной клетки и в грудную аорту вводили стеклянную канюлю, которую фиксировали лигатурой Для свободного оттока перфузата вскрывали заднюю полую вену у сердца После произведенной префиксации в ту же канюлю медленно вводили 0,5 % взвесь берлинской лазури в 1,5 % растворе формальдегида на фосфатном буфере (pH 7,3) до получения равномерной окраски нижних конечностей Последующую дофиксацию трупа животного производили в 10 % нейтральном формалине в течение 14 дней После чего забирали материал и доводили его до парафиновых блоков с последующим приготовлением гистологических препаратов в окраске гематоксилином и эозином

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В первые сутки после нанесения повреждения возникают выраженные дистрофические изменения в скелетной мышечной ткани Между мышечными волокнами происходит значительное накопление экссудата, что выражается в отеке эндомизия Внутри волокон появляются вакуоли различной формы и размеров, однако структурная целостность сарколеммы при этом сохранена Такие же изменения выявляются у части волоков в периферической части области повреждения

На фоне деструктивных изменений мышечных волокон в области повреждения возникает выраженное кровоизлияние со значительным содержанием эритроцитов, лейкоцитов и макрофагов Значительное количество макрофагов определяется в области альтерации, где они активно контактируют с поврежденными мышечными волокнами

На 5-е сутки эксперимента в дистальных участках мышцы выявляется выраженное застойное полнокровие кровеносных сосудов Некоторые из них объединяются с областью раздавливания Средний диаметр сосуда составлял 19,92±1,28 мкм

При электронно-микроскопическом исследовании на 7-е сутки повреждения в области раздавливания мышечные волокна претерпевают выраженные изменения Ядра поврежденных мышечных волокон имеют резко измененные контуры и расширенное перинуклеарное пространство Некоторые ядра мышечных волокон фрагментируются с образованием вакуольных образований

При раздавливании особенно значительно нарушается структура сократительного аппарата. Это проявляется в нарушении пространственного расположения миофибрилл Они располагаются хаотично, в отдельных участках происходит их объединение в общий конгломерат На значительных участках наблюдается фрагментация миофибрилл, деструкция 2-линий Цитоплазма таких мышечных волокон не имеет нормальной структуры, в ней обнаруживаются деструктивно измененные митохондрии, ЭПС, а сама она полиостью заполнена вакуольными образованиями

На 14-е сутки эксперимента в области регенерата появляются единичные миосимпластические образования Одновременно на 14-е сутки в центральной области раздавленной мышцы продолжается деструкция мышечных волокон, от которых остаются сарколемные чехлы Наличие таких образований в области повреждения приводит в дальнейшем к замедлению элиминации из раны тканевого детрита, который является одним из катализаторов репаративного процесса По-видимому, эта особенность связана с характером травмы, при котором локальное воздействие вызывает значительные трофические (нейро-васкулярные) изменения, которые приводят к

распространенности некротических изменений и вовлечении в воспалительный процесс всей мышцы

В целом на 14-е сутки процентное соотношение миогенных и соединительнотканных элементов составляло 32,94±1,01 % и 67,06*2,04 % (табл2) В периферическом отделе регенерата выявлялись сосуды микроциркуляторного русла с явлениями отека стенки Сосуды спазмированы и прерывисты, в мышечной ткани мало капиллярных анастомозов Выявляется по данным морфометрии незначительный рост среднего числа сосудов до 2,32*0,28 и уменьшение диаметра сосудов до 19,43±2,75 мкм Общая площадь сосудистого русла составляла 846,59±103,89 мкм3

На 21-е сутки эксперимента в области регенерата появляются единичные мышечные трубочки Одновременно в периферических участках мышцы наблюдается массивное разволокнение мышечных волокон.

Таблица 2

Мышечно-соединительнотканные отношения в регенерате (в %) при раздавливании икроножной мышцы (Х±8х при Р <0,05)

Мышечная ткань

Сроки наблюдения 7-е сутки 10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки

Контрольная Группа 24,35± 1,21 29,11 ±0,93 32,94+ 1,01 44,01 ±0,75*

Соединительная ткань

Контрольная Группа 75,65 ±2,32 70,89± 1,04 б7,06± 2,04* 55,99± 1,67

Знаком (*) отмечены показатели, разница между которыми статистически достоверна.

При электронно-микроскопическом исследовании в удаленных мышечных волокнах продолжается деструктивный процесс Он выражается во фрагментации и вакуолизации ядер В цитоплазме усугубляется дезорганизация и фрагментация миофибрилл В цитоплазме таких волокон наблюдаются митохондрии с потерей типичного строения (дезорганизация крист), также содержатся темные апоптозные тельца и липидные капли На фоне затянувшегося регенераторного процесса активизируются

фибробласты, которые по мере очищения области раздавливания замещают образовавшийся дефект В области активного регенерационного процесса формируется мышечно-соединительиотканный рубец, в котором процентное соотношение мышечной и соединительной ткани составляло 44,01±0,75 % и 55,99±1,67 % соответственно (табл 2) Наличие мышечно-соединительнотканного рубца состоящего преимущественно из соединительной ткани не может обеспечить полноценного функционирования мышцы как органа

Формирование функционально несостоятельного рубца и затягивание процесса резорбции некротических масс в процессе регенерации при механическом повреждении путем раздавливания говорит о значительных альтерирующих свойствах данного фактора. Исход восстановительного процесса после механического повреждения путем раздавливания скелетной мышцы заставляет применять факторы, оптимизирующие все стадии репаративного миогенеза с целью создания физиологических отношений между нейро-трофическими и тканевыми элементами скелетной мышцы

Под влиянием повышенной гравитации в условиях раздавливания появляются изменения в первые сутки регенераторного процесса Деструктивные изменения и лейкоцитарная инфильтрация сосредоточены преимущественно в области раздавливания, дисталыше отделы мышцы не содержат этих изменений Область раздавливания имеет вид полосы в центре которой сохраняются фрагменты сарколемных оболочек, а по периферии располагается раневой детрит в котором содержатся эритроциты, лейкоциты, макрофаги и фрагменты гибнущих мышечных волокон

Постепенно к 5-м суткам эксперимента в области повреждения я прираневой зоне продолжается резорбция некротических масс и нарастает интерстициальный отек Межуточный отек достаточно выражен и переходит на стенку сосудов, как артерий, так и вен В венах наблюдается картина полнокровия Средний диаметр сосудов составлял 18,80±1,58 мкм, что незначительно отличается от контроля Средняя площадь сосудов -302,72 ± 48,96мкм* Показатель среднего количества сосудов снизился до 1,84±0,21, что повлекло за собой снижение показателя общей площади сосудистого русла до 570,01±63,17 мкм2, что несколько ниже контрольных значений Это, возможно, говорит об отсроченном действии и суммировании эффекта воздействия повышенной гравитации кранио-каудального направления

На 7-е сутки после травмы в области регенерата происходят процессы резорбции и восстановления скелетной мышечной ткани В регенерате наряду с лейкоцитами и гибнущими мышечными волокнами появляются первые миосимпласты и единичные миотубы, которые не имеют четкой пространственной ориентации В

дистальных участках мышцы симпласты не имеют грубых деструктивных изменений. Они выражены в некотором нарушении пространственного расположения миофибрилл и отсутствии межфибриллярных пространств Доля мышечной ткани в составе регенерата составляла 36,76±0,98 %, что выше контрольных значений В сосудах микроциркуляторного русла исчезают явления отека сосудистой стенки В скелетной мышечной ткани большинство сосудов расширяются, в связи с чем возрастает общая площадь сосудистого русла более чем в 2 раза по сравнению с контролем 2443,31±199,88 мкм2 и 1066,52±135,81 мкм2 соответственно, а также имеется тенденция к увеличению числа сосудов до 2,75±0,22 (табл 3)

Таблица 3

Динамика изменения морфометрических показателей сосудов микроциркуляторного

русла мышечно-соединительнотканного регенерата икроножной мышцы при механическом повреждении путем раздавливания в условиях применения повышенной гравитации (Х±5х при Р<0,05)

Срок наблюдения 5супси 7сугки Юсутки 14супси 21 сутки

Диаметр сосуда (мкм)

Контрольная группа 19,92*1,28 23,90*2,84 18,84*1,40 19,43*2,75 15Д8*1,56

Подопытная группа 18,80*1,58 31,48*5,44 21,03±1,36 24,87±1,88 2737*2,66*

Площадь сосуда (мкм кв )

Конгропь-ная группа 294,78*40,23 531,01±151,26 295,85*47,65 366,52*112,54 216,45*56,49

Подопытная группа 302,72*48,96 924,74±394,35 340,78*40,65 534,06±73,15 667,88*145,52*

Число сосудов в поле зрения

Кошроль-ная группа 3,30*0,37 2,05*0,25 2,65*0,30 2,32*0,28 2,70*0,26

Подопытная группа 1,84±0Д1* 2,75*0,22* 3,35+0,32 4,05*0,40* 3,55*0,33

Общая площадь сосудистого русла (мкм кв)

Контроль-ная группа 988,85±107,41 1066,52*135,81 767,27*89,55 846,59*103,89 577,06*53,16

Подопытная группа 570,01±63Д7* >443,31*199,88» 1064,09*108,60* 2076,24*211,68* 2448,13*218,21*

Знаком (*) отмечены показатели, разница между которыми статистически достоверна

Таблица 4

Мышечно-соединительнотканные отношения в регенерате (в %) при раздавливании икроножной мышцы в условиях применения повышенной гравитации кранио-каудального направления ( Х±8х при Р <0,05)

Мышечная ткань

Сроки наблюдения 7сутки 10 сутки 14 сутки 21 сутки

Контрольная группа 24,35±1,21 29,11 ±0,93 32,94±1,01 44,01±0,75*

Подопытная группа 36,76±0,98* 49,31±2,61* 55,48±3,21* 62,72±2,74

Соединительная ткань

Контрольная группа 75,65±2,32 70,89±1,04 67,06±2,04* 55,99±1,67

Подопытная группа 63,24±0,88* 50,69±2,62* 44,52±1,87 37,28±2,04*

ЗнакомО<™ечамшкаатажразнищккжпу которыми ста

На 14-е сутки эксперимента в области раздавливания активно идет построение мышечно-соединительнотканного регенерата. В периферической части регенерата присутствуют многочисленные мышечные почки и мышечные трубочки

В центральной части регенерата имеются фрагменты с хаотичным расположением дифференцирующихся мышечных элементов - миотуб и молодых мышечных волокон Наряду с такими участками присутствуют фрагменты регенерата ориентированные в краниокаудальном направлении В них мышечные трубочки и молодые мышечные волокна располагаются параллельно, также в краниокаудальном направлении Формирование и дифференцировка молодых волокон проходит вблизи расширенных 1фовеносных сосудов Сосуды микроциркуляторного русла полнокровны, расширены, имеют петлистый рисунок, часто выявляются между ними функционирующие анастомозы

Показатель общей площади сосудистого русла был достоверно выше (2076,24 ±211,68 мкм2), чем в контрольной группе и обусловлен в основном ростом среднего числа сосудов в единице площади - 4,05±0,40 (табл.3) Полученные результаты согласуются с данными Е А Дыскина.1976, И А Патласа, 1979, А В Яшкова,1999, 2000, М Г Котельникова, 2000, Д А Коновалова, 2002, О Н Тулаевой,2003

При электронно-микроскопическом исследовании на 14-е сутки эксперимента выявляются дифференцирующие мышечные волокна В саркоплазме такого волокна определяется много митохондрий и неразвитый, неупорядоченно расположенный

сократительный аппарат Дифференцировка мышечных волокон проходит в тесном контакте с гемокапиллярами

В дистальных участках икроножной мышцы в основном выявляются мышечные волокна с процессами внутрисимпластической перестройки В таких мышечных волокнах миофибриллы имеют нормальное расположение, однако структура саркомера выражена не четко В их саркоплазме имеется множество гипертрофированных митохондрий, расширенные терминала саркоплазматического ретикуллума и значительное количество включений гликогена

К 21-м суткам эксперимента формирование мышечно-соединительнотканного рубца в целом завершается В области раздавливания формируется мышечно-соединительнотканный регенерат с преобладанием доли поперечнополосатой скелетной мышечной ткани до 62,72±2,74 % (табл №4) с наличием хорошо развитой сети сосудов микроциркуляторного русла В центральной части регенерата формировался мышечно-соединительнотканный рубец с преобладанием миогенных элементов, которые активно взаимодействовали с клетками соединительной ткани В дистальных отделах икроножной мышцы измененные миосимпласгы полностью восстанавливают исходную структуру, что согласуется с данными Г П Котельникова, А В Яшкова, А.Н Маховой А Н, 2000, ОН Тулаевой,2003

В целом, оценивая данные эксперимента, следует отметить оптимизирующее влияние повышенной гравитации краниокаудального направления на репаративную регенерацию скелетной мышечной ткани в условиях ее раздавливания Применение в эксперименте гравитационного фактора позволяет пролонгировать регенерационный миогенез, что приводит к формированию физиологически более полноценного регенерата. Формирование рубцовой ткани в условиях эксперимента характеризуется ранним и активным функционированием сосудов микроциркуляторного русла Развитие сосудистой сети в икроножной мышце происходит за счет увеличения числа и диаметра функционирующих сосудов Следовательно, повышенная гравитация краниокаудального направления оказывает комплексное и многофакторное воздействие на процессы репаративного гистогенеза скелетной мышечной ткани Полученные данные согласуются с исследованиями о том, что гравитационные перегрузки должны применяться длительно в интервале 1-14 суток, так как в данные сроки не подавляются регенераторные возможности поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани (Ильина-Какуева ЕИ., Португалов В В , 1979, Позднякова О.М, 1988; Коновалов Д А., 2002, Тулаева О Н, 2003)

У животных с экспериментальным атеросклерозом атеросклеротические изменения наблюдали в крупных артериях, в том числе сосудах конечностей. Примером может

служить бедренная артерия При этом атеросклеротические бляшки распространялись на интиму и среднюю мышечную оболочки, с повреждением гладхомышечных клеток и эластических мембран, развитием коллагеновых волокон Фиброзные бляшки, располагались циркулярно, выступали в просвет сосуда, резко сужая его В составе бляшек отмечали снижение клеточных элементов и увеличение коллагеновых волокон При этом наблюдали изъязвление и распад бляшек, образование тромбов, что характерно для следующей стадии атеросклероза - стадии изъязвлений и атерокальциноза. В некоторых случаях бляшки практически полностью перекрывали просвет сосуда, вызывая характерные изменения в мышцах и сосудистом русле, особенно, его микроциркулярного звена

При этом в бедренной артерии отмечали наличие тромбов в просвете сосуда, что в значительной степени влияло и на изменения в скелетной мышечной ткани

При экспериментальном атеросклерозе, с локализацией бляшки в бедренной артерии в мышцах бедра и голени задних конечностей крыс были выявлены следующие морфологические изменения. В сохраненных участках скелетной мышцы волокна отличаются по диаметру, размерам, степени повреждения, реактивным изменениям Наряду с широкими мышечными волокнами, встречаются волокна с резко суженным диаметром В таких волокнах хорошо выражена поперечная и продольная исчерченность миофибрилл, ядра располагаются под сарколеммой Во многих мышечных волокнах ядра образуют цепочки, состоящие из 10 и более ядер, расположенные как в центре волокна, так и под сарколеммой Отмечается выраженный межуточный отек Наряду с такими волокнами в скелетной мышце встречаются участки, где преобладают деструктивные изменения Во многих мышечных волокнах выражены явления миоцитолизиса. Иногда эти явления завершаются некрозом мышечного волокна с поперечной фрагментацией его на отдельные части В зонах, расположенных ниже локализации атеросклеротической бляшки, отмечаются явления распада скелетных мышечных волокон, межуточного отека и залустевания просвета капилляров в эндомизии Межуточные пространства эндомизия, перимизия расширены за счет отека Количество элементов микроциркуляторного русла капилляров, венул, артериол на большинстве участков снижено, отмечается распад капилляров, запустевание просвета, отек стенок

Наблюдаются капилляры и венулы как с суженным, так и с расширенным просветом, что хорошо заметно при наливке сосудистого русла раствором берлинской лазури, отмечается прерывистость и извилистость капилляров На некоторых участках капилляры образуют сеть и связывают между собой продольные ветви, расположенные вдоль мышечных волокон На некоторых участках эндо- и перимизия наблюдаются

обширные скопления соединительнотканных клеток гистиоцитов, фибробластов, единичных лимфоцитов В эпимизии и перимизии имеются жировая ткань и крупные сосуды вены, артерии мышечного типа и элементы микроциркуляторного русла

На продольных срезах просвет резко сужен, встречаются склерозированные сосуды с периваскулярными инфильтратами В некоторых сосудах имеют место атеросклеротические изменения в субэндотелии и медии с замещением гладких миоцитов пенистыми клетками. Таким образом, в скелетной

мышечной ткани отмечаются 2 типа изменений. На одних участках - деструктивные, с явлениями миоцитолизиса, поперечным распадом мышечных волокон, развитием восковидного и зернистого некроза На других участках преобладают компенсаторно-приспособительные изменения, с реактивными изменениями мышечных волокон, их гипертрофией и увеличением количества ядер, образующих цепочки под сарколеммой и в центре волокна В соединительной ткани эндо- и перимизия также отмечаются реактивные изменения кровоизлияния, появление участков с развитием соединительнотканных клеток, следов кровоизлияний в виде фибриновых сгустков, атеросклеротические изменения артерий с сужением их просвета и, вместе с тем, наблюдается увеличение количества и диаметра элементов микроциркуляторного русла, особенно капилляров, венул с венозным полнокровием и их соустий

При экспериментальном атеросклерозе развитие атеросклеротических изменений носит системный характер При этом в 75% случаев отмечали развитие атеросклеротических бляшек в бедренной артерии, которые, располагаясь циркулярно, суживали просвет от 2/3 его диаметра до полной облитерации При этом возникали ишемические расстройства в мышцах нижних конечностей. Стадии и структура атеросклеротических бляшек были идентичными таковым у человека

При изучении в эксперименте влияния гравитационных перегрузок на регионарный кровоток нижних конечностей и состояние микроциркуляторного русла было выявлено значительное увеличение его общей площади как за счет роста числа функционирующих элементов мшфоциркуляторного русла, так и их регенерации (табл 5) Это подтверждалось увеличением их объемной плотности по данным морфометрии почти в 2 раза (р < 0,05 ), по сравнению с количеством элементов микроциркуляторного русла у крыс с экспериментальным атеросклерозом, не подвергавшихся воздействию гипергравитации В связи с этим применение гравитационной терапии как метода стимуляции коллатерального кровотока и микроциркуляции является патогенетически обоснованным

Степень развития деструктивных (ишемических) повреждений волокон скелетной мышечной ткани и микроциркуляторного русла определялась степенью развития атеросклеротических бляшек в аорте и бедренной артерии и уровнем развития коллатерального кровотока. В условиях гапергравитации у кроликов с экспериментальным атеросклерозом, в отличие от животных, не подвергавшихся воздействию гравитационных перегрузок, значительно улучшалось морфофункциональное состояние сохраненных скелетных мышечных волокон, и развивались процессы регенерации в участках их повреждения Свидетельством этого явилось статистически достоверное увеличение объемной плотности жизнеспособной скелетной мышечной ткани, количества ядер в ней и снижение объемной плотности деструктивноизмененной скелетной мышечной ткани, межуточного отека и соединительнотканного компонента по данным морфометрии, что согласуется с данными И В Макарова (2004) Морфометрическую оценку тканевых компонентов мышц нижних конечностей кроликов можно оценить в таблице 5

Таблица 5

Морфометрическая оценка тканевых компонентов (объемная плотность в %) мышц нижних конечностей кроликов (Х±ах, при р > 0,05)

Тканевой Деструк- Межуточ- Соедини- Элементы

компонент/ тивно- ный тельно- микро-

/ измененная отек в тканный циркуля-

/Название мышечная эндомизии компонент торного

и номер ткань и эндо- и русла

эксперимента перимизии перимизия

Кролики с экспе-

риментальным 14,7 25,4 9,7 5,3

атеросклерозом ± ± ± ±

Контрольная 0,94 1,91 1,16 0,67

группа

Эксперименталь-

ный 5,4 8,0 4,9 9,6

атеросклероз и ± ± + ±

воздействие 0,48* 1,15* 0,38* 0,43*

гипергравитации

40 об/мин

Эксперименталь-

ный 5,9 8,7 5,4 9,5

атеросклероз и ± ± ± ±

воздействие 0,35* 0,9* 0,48* 0,96*

гипергравитации

45 об/мин

* достоверные значения при р < 0,05, по сравнению с контрольной группой

Полученные результаты морфофункционального исследования свидетельствовали о благоприятном воздействии гравитационной терапии в указанных режимах на морфофункциональное состояние скелетной мышечной ткани и микроциркуляторного русла экспериментальных животных При этом, на микроциркуляторное русло гравитационные перегрузки оказывали положительное влияние во всех случаях, как у животных с моделированным атеросклерозом, так и у интактных животных В случаях ишемического повреждения скелетной мышцы, под воздействием гипергравкгции значительно снижался межуточный отек, увеличивалась объемная плотность жизнеспособной скелетной мышечной ткани, в волокнах которой возрастало число ядер, уменьшалась объемная плотность деструктивно измененных волокон, таким образом, активно развивались процессы регенерации

Выводы

1 При повреждении скелетной мышечной ткани путем раздавливания в области травмы определяются выраженные деструктивные изменения, которые выражаются в некротическом изменении ткани, в виде вакуолизации ядер мышечных волокон, фрагментации, склеивании миофибрилл в общий конгломерат, распада Ъ - линий Значительная деструкция тканей в области повреждения приводит к формированию функционально несостоятельного регенерата с преобладанием соединительной ткани, в котором снижена функциональная активность сосудов микроциркуляторного русла

2 Применение повышенной гравитации краниокаудального направления сокращает выраженность некротических проявлений в скелетной мышечной ткани и стимулирует реяаративный миогенез В процессе воздействия происходит активное развитие сети сосудистых анастомозов и коллатералей в скелетной мышечной ткани, что способствует формированию регенерата с преобладанием миогенных элементов

3 При экспериментальном атеросклерозе возникают необратимые деструктивные изменения скелетных мышц и сосудов микроциркуляторного русла В скелетной мышечной ткани выявляются два типа изменений некроз мышечных волокон и их гипертрофия Со стороны элементов микроциркуляторного русла выявляется сужение просвета артерий и аргериол и полнокровие вен

4 Воздействие повышенной гравитации на фоне экспериментального атеросклероза приводит к увеличению более чем в 2 раза числа функционирующих

элементов микроциркуляторного русла, улучшению морфофункционального состояния сохраненных скелетных мышечных волокон и стимуляции процессов регенерации в участках их повреждения

3 С помощью различных режимов повышенной гравитации краниокаудального направления на модели посттравматического повреждения икроножной мышцы и атеросклеротического поражения артерий голени показана возможность оптимизации репаративных процессов в поврежденной скелетной мышечной ткани

6 Экспериментальное изучение состояния регионарного кровотока и микроциркуляторного русла нижних конечностей убедительно свидетельствуют о положительном влиянии разработанных режимов гравитационной терапии и целесообразности её применения в комплексном лечении больных с травмой мышц нижних конечностей в виде раздавливания мышечной ткани и при облитерирующем атеросклерозе"

Практические рекомендации

1 При изучении влияния гравитационных перегрузок на течение репаративных процессов в скелетной мышечной ткани необходимо использовать экспериментальную модель центрифуги и разработанные режимы вращения

2. Примененная в данной работе модель раздавливания может быть использована в экспериментальной практике при изучении репаративных процессов в органах и тканях.

3 В лечении больных с механической травмой и облитерирующим атеросклерозом в комплексе с общепринятыми методиками рекомендуется использование нового неинвазивного физического фактора - гравитационной терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Ямщиков, Н.В Репаративная регенерация склетных мышц в области мышечно-сухожильного перехода при рассечении и раздавливании в условиях воздействия повышенной гравитации краниокаудального направления / Н В Ямщиков,

О Н Тулаева, А Н Федячкин // Бабухинские чтения в Орле Альманах, выпуск 17 -Москва,2004 - С 63

2 Ямщиков, HB Особенности репаративного миогенеза при воздействии гравитационных перегрузок в условиях рассечения и раздавливания / HB Ямщиков, ОН Тулаева, АН Федячкин // Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий Материалы международной научно-практической конференции - Курган 2004 - С 398-399

3 Макаров, И В Морфологические изменения скелетной мышечной ткани и микроциркуляторного русла в условиях экспериментального атеросклероза и воздействия гравитационных перегрузок / ИВ Макаров, НВ Ямщиков, НВ Макарова, А Н Федячкин, О.Н Тулаева // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины Сборник научных трудов, - Чебоксары, 2007 - С 136-141

4 Макаров И В Морфологические изменения скелетной мышечной ткани нижних конечностей и микроциркуляторного русла в условиях экспериментального атеросклероза и воздействия гравитационных перегрузок /ИВ Макаров, Н В Ямщиков, Н В Макарова, А Н Федячкин // Морфологические ведомости - 2007 - №1-2 - С 76-80

5 Макаров И В Экспериментально-клиническое обоснование применения гравитационной терапии в комплексном лечении больных облитерирующим атеросклерозом /ИВ Макаров, Н В Ямщиков, А Н Федячкин // Ремедиум Приволжье -октябрь2007 -С37-38

6 Федячкин, А Н Влияние повышенной гравитации на состояние скелетной мышечной ткани и микроциркуляторного русла в условиях экспериментального атеросклероза / А.Н Федячкин, Н В Макаров, Н В Ямщиков, О.Н Тулаева // Здоровье и образование в XXI веке Научные труды VIII международного конгресса 14-17 ноября 2007 г. - Москва, 2007 -С 643-644

7 Патент Устройство для изучения влияния повышенных нагрузок на лаболаторных животных / Патент РФ на полезную модель №69738 по заявке №2007108581 от 07 03 2007, приоритет от 07.03 2007, зарегистрировано 10.01.2008 г, бюллетень Xsl (в соавт И В Макаров, Н В Ямщиков, Н В Макарова, А Н Федячкин)

Подписано в печать 2 04 2009 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Усл. печ л 1 39 Тираж 100 экз Заказ 272

Отпечатано в типографии ООО «Офорт» 443080, г Самара, ул Революционная, 70, литера П Тел 372-00-56,372-00-57