Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РУБЦОВ Александр Михайлович

КАЛЬЦИЙ-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА, 2003

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, академик РАМН, доктор биологических наук, профессор В.А. Ткачук

доктор физико-математических наук, профессор В. А. Твердислов

доктор биологических наук, профессор Н.Н. Чернов

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится " 20 " октября 2003 года в 15 ч 30 мин на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 19 " сентября 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук

2оозИ\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что практически во всех типах клеток животных наблюдаются периодические изменения уровня цитоплазматического Са2+ от 10"8-10"7 М до 10'6-10"5 М, причем эти изменения индуцируются различными физиологически активными агентами и обеспечивают, регулируют или, по крайней мере, сопровождают проявление основных функций клеток данного типа. Обычно эти изменения концентрации цитоплазматического Са2+ кратковременны, и после прекращения действия физиологически активного агента клетка быстро возвращается в состояние функционального покоя. Эти процессы обеспечиваются специальными клеточными системами, которые в покое поддерживают внутриклеточную концентрацию Са2+ на низком уровне и обеспечивают его быстрое удаление из цитоплазмы после прекращения действия внешнего сигнала, системами, которые в ответ на этот сигнал обеспечивают вход в клетку Са2+ из окружающей среды или его освобождение из внутриклеточных источников, а также системами, которые отвечают на изменение внутриклеточной концентрации Са2+ изменением своей функциональной активности. Первые два типа систем представлены мембранными белками - Са-насосами, Са-каналами и Са-переносчиками, тогда как последняя система функционирует благодаря существованию в цитоплазме специальных Са-связывающих белков. В настоящее время эти системы хорошо известны, причем, несмотря на огромное разнообразие клеток и выполняемых ими функций, эти системы достаточно универсальны (Ог1оу е1 а!., 1995). Поддержание низкой концентрации Са2+ в цитоплазме обеспечивается работой специальных мембранных ферментов - Са-АТФаз (Са-насосов) плазматической мембраны и сарко(эндо)плазматического ретикулума, а также работой системы элекгрогенного Ка/Са-обмена. В цитоплазму клеток Са2+ поступает либо из окружающей среды через Са-каналы плазматической мембраны, либо из внутриклеточных Са-депо - различных компартментов ретикулума, мембраны которого содержат специфические Са-каналы: рианодиновые рецепторы (ЯуЯ) и рецепторы инозитол-1,4,5-трифосфата (ТпзРзЯ). Настоящая работа посвящена исследованию особенностей регуляции активности Са-каналов и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума мышечной ткани.

Саркоплазматический ретикулум (СР) представляет собой систему сообщающихся цистерн и трубочек, пронизывающих цитоплазму мышечной клетки в непосредственной близости от миофибрилл. В ответ на деполяризацию сарколеммы, возникающую при проведении нервного импульса, в цитоплазму из СР через Са-каналы по градиенту концентрации выходит Са2+, который инициирует образование актомиозинового комплекса, что приводит к мышечному сокращению (Майошк!, 1984). Увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме, в свою очередь, активирует Са-АТФазу, которая обеспечивает аккумуляцию Са2+ против его градиента во внутреннее пространство СР, в результате чего происходит снижение концентрации Са2+ в цитоплазме и наступает расслабление мышцы (1пез1,1985).

Са-канал (рианодиновый рецептор) СР - это тетрамерный белок, состоящий из четырех идентичных субъединиц с молекулярной массой около 560 кДа каждая, т.е. функционально активный Са-канал имеет молекулярную массу более 2-103 кДа. В тканях млекопитающих ЯуТ1 представлен тремя епенью

гомологии (65-70%) и близкими свойствами.

СПетев! 09

Согласно современным представлениям, каждый полипепгид RyR имеет в своем составе 12 трансмембранных a-спиральных доменов, формирующих канал, по которому из CP выходит Са2+, и большого цитоплазматического домена, образованного N-концевой частью молекулы и петлями, соединяющими трансмембранные a-спирали (Chen et al., 1998). По данным криоэлектронной микроскопии с высоким разрешением, тетрамерный комплекс RyR напоминает по форме гриб с квадратными «шляпкой» (27x27x11 нм) и «ножкой» (12x12x6,5 нм) (Wagenknecht et al., 1997; Sorrentino, Reggiani, 1999). «Ножка» (гидрофобный домен RyR, формирующий трансмембранный канал) погружена в мембрану CP, а «шляпка» (гидрофильный домен) соединяет CP с Т-трубочками плазматической мембраны и взаимодействует с потенциал-чувствительными Са-каналами плазматической мембраны (дигидропиридиновыми рецепторами, ДГПР). В скелетных мышцах изменение конформации ДГПР при деполяризации плазматической мембраны обеспечивает активацию Са-каналов CP за счет непосредственного «механического» контакта молекул двух каналов (Ogawa et al., 1999). В сердце активация Са-каналов CP обеспечивается Са2+, который входит в цитоплазму из внеклеточной среды через ДГПР (так называемый Са-индуцируемый выход Са2+ из CP). Переход Са-каналов CP в открытое состояние сопровождается значительными конформационными изменениями, затрагивающими как гидрофильную, так и гидрофобную части молекулы RyR.

Са-канал CP представляет собой ион-селекгивный канал с необычайно высокой проводимостью для одновалентных (приблизительно 600 и 750 pS с симметричным 500 мМ Na+ и 250 мМ К1" соответственно) и двухвалентных (примерно 100-150 pS в 50 мМ Са2+ с &шю-стороны) катионов.

Установлено, что активность Са-каналов CP регулируется за счет их взаимодействия с рядом белков, как цитоплазматических, так и локализованных в мембранах или внутри полостей СР. Важную роль в регуляции Са-каналов играют триадин и Са-связывающие белки кальмодулин, кальсеквестрин, саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок, причем многие из этих белков, как и сам Са-канал CP, могут фосфорилироваться различными протеинкиназами, что приводит к изменению активности Са-каналов. Среди низкомолекулярных соединений, способных активировать Са-каналы CP, наиболее известны Са2+ (в микромолярных концентрациях), адениловые нуклеотиды, кофеин, рианодин (в наномолярных концентрациях), доксорубицин, а также ионы тяжелых металлов и другие модификаторы SH-групп. Ингибиторами Са-каналов CP являются Са2+ и Mg2+ (в миллимолярных концентрациях), рутениевый красный, рианодин (в микромолярных концентрациях), лакгат, ряд локальных анестетиков и вещества, разрывающие в белках дисульфидные связи, однако особенности взаимодействия Са-каналов с регуляторами их активности пока до конца не выяснены (Favero, 1999; Ogawa et al., 1999).

Среди причин резкого снижения сократительной активности скелетных мышц при интенсивной работе и развитии утомления основную, хотя и не единственную роль играет изменение свойств Са-каналов CP, приводящее к нарушению нормального процесса обмена Са2+ (Favero, 1999). В частности, сократительная активность утомленных мышечных волокон в значительной степени восстанавливается таким известным активатором Са-каналов CP, как кофеин (Lannergren, Westerblad, 1989). Аналогичным действием обладает эндогенное соединение, в значительных количествах содержащееся в скелетной мускулатуре - гистидинсодержащий дипептид карнозин (Северин и др., 1953).

Этот дипептид не только предотвращает развитие утомления сокращающихся мышечных препаратов, но и восстанавливает сократительную активность утомленных волокон. Это позволяет предполагать, что карнозин может являться эндогенным регулятором функциональной активности Са-каналов CP, однако данные о его взаимодействии с RyR в литературе отсутствуют.

Са-АТФаза CP относится к обширному семейству ион-транспортирующих АТФаз Р-типа (или Е1-Е2-типа), к которому принадлежат Са-АТФаза, Na,K-АТФаза и Н,К-АТФаза плазматических мембран клеток животных, Н-АТФазы 1рибов и растений и некоторые АТФазы бактерий, играющие важную роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности разных клеток (Moller et al., 1996). Эти ферменты обеспечивают трансмембранный перенос катионов против электрохимического градиента за счет энергии, освобождающейся при гидролизе АТФ. При этом происходит образование промежуточного фосфорилированного интермедиата фермента вследствие переноса терминального фосфорильного остатка АТФ на остаток аспарагиновой кислоты активного центра АТФазы.

Са-АТФаза CP, или SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium-transporting ATPase) в разных тканях млекопитающих представлена несколькими изоформами: SERCA1 - в быстрых скелетных мышцах, SERCA2a - в сердце и медленных скелетных мышцах, SERCA2b - в разных типах клеток (гладкие мышцы, мозг, почки и др.) и SERCA3 - в клетках крови и в различных типах эпителия. SERCA1 образована 994 аминокислотными остатками, расположенными в мембране асимметрично: 70% аминокислотных остатков обращено в цитоплазму, 25% находится в мембране и 5% обращены внутрь СР. Согласно рентгеноструктурному анализу Са-АТФазы CP, проведенному с разрешением в 2,6А, цитоплазматическая часть Са-АТФазы состоит из трех доменов: N-домена (нуклеотидсвязывающего), Р-домена (фосфорилируемого) и адапторного домена А (Toyoshima et al., 2000). Участок фосфорилирования (Asp351) находится на расстоянии 25 А от нуклеотидсвязывающего участка, т. е. домены N и Р в процессе гидролиза АТФ должны приближаться друг к другу. Действительно, в отсутствие Са2+ N-домен находится в фиксированном состоянии, но становится подвижным в его присутствии, а в результате конформационных изменений, индуцируемых связыванием АТФ, N-домен приближается к Р-домену. Постулируется, что во время работы фермента А-домен также способен перемещаться и приводить в движение или заякоривать N-домен. Трансмембранная часть фермента (М) состоит из десяти а-спиралей (М1-М10). Два участка связывания Са2+ находятся в непосредственной близости друг от друга в гидрофобном домене Са-АТФазы и образованы четырьмя спиралями - М4, М5, Мб, М8.

Реакционный цикл Са-АТФазы начинается с того, что фермент, находящийся в конформационном состоянии Е1, связывает два иона Са2+ (с цитоплазматической стороны мембраны) и АТФ. Связывание ионов кальция происходит кооперативно с кажущейся константой связывания 2,3-106 М"'. После связывания кальция фермент фосфорилируется; при этом у-фосфорильный остаток переносится от АТФ на остаток аспарагиновой кислоты (Degani, Boyer, 1973). После фосфорилирования Са-АТФазы АДФ освобождается из активного центра фермента, а фосфат и Mg2+ остаются связанными с ним. Фосфорилирование индуцирует конформационные изменения Са-АТФазы и фермент переходит в состояние Е2. Изомеризация фермента со связанным кальцием приводит сначала к окклюзии ионов кальция внутри гидрофобного домена молекулы фермента, а затем к переносу кальция во внутреннее пространство ретикулума. Вследствие

информационного перехода фермента из состояния El в Е2 сродство Са-АТФазы к ионам Са2+ понижается и они выходят во внутреннее пространство СР. Цикл транспорта Са2+ завершается изомеризацией фермента из конформации Е2 в El после Mg-зависимого гидролиза фосфофермента с освобождением Фн в цитоплазму.

Как и в случае других АТФаз Р-типа, зависимость активности Са-АТФазы CP от концентрации АТФ не описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, так как в области высоких концентраций субстрата наблюдается дополнительная активация фермента (Yamamoto, Tonomura, 1967). Это явление получило название аллостерического эффекта АТФ и для его объяснения было предложено несколько моделей функционирования АТФаз Р-типа, ни одна из которых не дает исчерпывающего объяснения имеющихся экспериментальных фактов.

В частности, дополнительная активация Са-АТФазы высокими концентрациями АТФ может быть связана с присутствием в мембранах CP олигомерных комплексов фермента, взаимодействие мономеров в которых и приводит к нарушению нормальной Михаэлисовской кинетики. О возможности существования Са-АТФазы в мембранах CP в виде олигомерных комплексов разного состава говорят многочисленные данные, однако функциональная роль таких комплексов пока не ясна (Murphy, 1976; Andersen, 1989; Maguire, Ohlendieck, 1996).

Установлено, что активность Са-АТФазы CP может регулироваться посредством белок-белковых взаимодействий. Так, активность Са-АТФазы гладких мышц (SERCA2b) ингибируется Са-связывающим белком кальретикулином (Krause, Michalak, 1997), изоформа SERCA2a ингибируется присутствующим в мембранах CP белком фосфоламбаном, фосфорилирование которого цАТФ-зависимой и Са/СаМ-зависимой протеинкиназами снимает это ингибирование (Simmerman, Jones, 1998), а изоформа SERCA1 взаимодействует с белком сарколипином, который в присутствии низких концентраций Са2+ ингибирует, а высоких - активирует фермент (Odermatt et al., 1998). Активность Са-АТФазы CP может модулироваться протеинкиназами и напрямую. Так, фосфорилирование SERCA2a изоформы Са-АТФазы Са/СаМ-зависимой протеинкиназой типа II по остатку Ser38 почти в два раза увеличивает активность фермента (Hawkins et al., 1994). Фосфорилирование Са-АТФазы по этому остатку обнаружено и в нативном работающем сердце, где около 20% белка Са-АТФазы CP находится в фосфорилированном состоянии (Xu et al., 1999).

Интересной моделью для исследования механизмов регуляции обмена Са2+ в разных типах мышц являются животные-гибернаторы, проводящие зиму в состоянии глубокого оцепенения. Они обладают удивительной способностью выживать при температуре тела близкой к 0°С, в то время как понижение температуры тела большинства млекопитающих всего на несколько градусов Цельсия сопровождается изменениями, приводящими к смерти. При гибернации большая часть мышц находится в неактивном состоянии. Исключением является сердце, а также диафрагма и межреберные мышцы, обеспечивающие дыхательные движения, и мышцы, поддерживающие характерную позу животного во время спячки. Кроме того, при периодических зимних пробуждениях гибернаторов скелетные мышцы начинают сокращаться уже при низких температурах тела и обеспечивают наибольший вклад в теплопродукцию организма за счет так называемого несократительного и сократительного термогенеза (Lyman et al., 1982; Пантелеев, 1983).

В сердце животных-гибернаторов обнаружены сезонные изменения, затрагивающие функционирование Са-каналов и Са-АТФазы СР (Копёо, 1986; 1988; Коког е1 а1., 1997). При гибернации резко возрастает роль СР в обмене внутриклеточного Са2+, так как вход Са2+ в клетки сердца из внеклеточного пространства блокируется в результате фосфорилирования Са-каналов (ДГПР) плазматической мембраны эндогенными протеинкиназами. Вопрос о том, какие сезонные изменения происходят в СР скелетных мышц, до последнего времени был практически не изучен.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение механизмов регуляции активности Са-каналов (рианодиновых рецепторов) и Са-АТФазы мембран саркоплазматического ретикулума с особым вниманием к возможности их регуляции эндогенными соединениями, регуляторными белками, а также к той роли, которую может играть олигомерная организация Са-пасоса в реализации этих путей регуляции. В связи с этим при выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать кофеин-индуцируемый выход Са2+ из СР и провести поиск кофеинсвязывающих белков.

2. Проанализировать возможность регуляции активности Са-каналов СР гистидинсодержащими дипептидами и оценить их влияние на ингибирование Са-каналов факторами, возникающими в процессе развития мышечного утомления.

3. Исследовать связывание нуклеотидов с Са-каналами и Са-АТФазой СР с использованием биохимических, физико-химических и физических методов.

4. Определить олигомерную структуру Са-АТФазы в мембранах ретикулума и выяснить, как влияет изменение олигомерной организации Са-АТФазы на активность фермента.

5. Для выявления потенциальных белков, регулирующих активность ион-транспортирующих АТФаз Р-типа, исследовать характер ингибирования Са-АТФазы СР мелитгином, получить в очищенном виде белки, имеющие мелитган-подобные детерминанты, и охарактеризовать их влияние на активность Са-АТФазы.

6. Исследовать сезонные изменения, происходящие в мембранах СР скелетных мышц сусликов 8регторЫ1и.ч ипсМ-Мт.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые показано, что производные 1,4-дигидропиридина - блокаторы и активаторы Са-каналов плазматической мембраны, в концентрациях <10"6 М не влияют на параметры работы Са-каналов (рианодиновых рецепторов) СР. Установлено, что кофеин, адениловые нуклеотиды, гистидинсодержащие дипептиды и ионы Са2+ активируют Са-каналы СР, взаимодействуя со специфическими насыщаемыми центрами связывания. Обнаружено, что богатый гистидином Са-связывающий белок с молекулярной массой 170 кДа, участвующий в регуляции Са-каналов СР, способен связывать кофеин.

Впервые показано, что гистидинсодержащий дипептид карнозин и родственные ему соединения активируют Са-каналы СР. Они повышают чувствительность Са-каналов к активирующему действию кофеина, адениловых нуклеотидов и низких концентраций Са2+ и снижают ингибирующее действие низких концентраций высоких концентраций Са2+ и закисления среды. В модельной системе они демонстрируют способность связывать гидроксилрадикал. Поскольку действие гистидинсодержащих дипептидов направлено на снижение влияния факторов, возникающих при интенсивной мышечной работе и

повреждающих Са-каналы, предполагается, что феномен Северина - защита карнозином мышц от утомления при высоких нагрузках, может объясняться, по крайней мере, частично, взаимодействием гистидинсодержащих дипептидов с Са-канапами ретикулума.

Впервые детально исследовано взаимодействие разных нуклеотидов с центрами их связывания Са-каналов СР. Показано, что в нуклеотид-связывающих центрах связываются как адениловые, так и неадениловые нуклеотиды, причем они конкурируют за эти центры. Связывание адениловых нуклеотидов активируют Са-каналы СР, повышая их чувствительность к Са2+, тогда как неадениловые нуклеотиды такой способностью не обладают.

С помощью химической модификации БН-групп Са-АТФазы СР НБД-хлоридом и анализа флуоресценции меченой Са-АТФазы установлено, что молекула фермента обладает высокой конформационной подвижностью. Зарегистрированы специфические изменения конформации Са-АТФазы при связывании Са2+ и адениловых нуклеотидов и показано, что связывание с ферментом неадениловых нуклеотидов не оказывает влияния на его конформацию. Впервые установлено, что в мембранных препаратах СР одновременно присутствуют принадлежащие Са-АТФазе участки связывания АТФ с высоким и низким сродством.

Подтверждены литературные данные, согласно которым гидролиз АТФ Са-АТФазой СР не подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, так как при высоких концентрациях АТФ наблюдается дополнительная активация фермента. Показано, что зависимость скорости гидролиза АТФ от концентрации субстрата можно удовлетворительно описать суммой уравнений Михаэлиса (гипербола) и уравнения Хилла (сигмоида). Выдвинута гипотеза, согласно которой Са-АТФаза присутствует в мембранах СР в виде мономеров с высоким сродством к АТФ, гидролизующих субстрат согласно кинетике Михаэлиса, и олигомеров, имеющих низкое сродство к АТФ и связывающих субстрат кооперативно, работа которых описывается уравнением Хилла. Гидролиз ГТФ, пНФФ и гидролиз АТФ солюбилизированной неионным детергентом С12Е9 Са-АТФазой описывается уравнением Михаэлиса.

С помощью электронной микроскопии, анализа затухания анизотропии фосфоресценции меченой производными эозина" Са-АТФазы и с использованием сшивающих агентов установлено, что в мембранах СР одновременно присутствуют как мономеры, так и олигомеры Са-АТФазы, причем наличие олигомеров характерно и для Е1, и для Е2 конформеров фермента. Олигомеризация Са-АТФазы в мембранах СР, индуцируемая температурной обработкой и добавлением мелиттина в определенных условиях не приводит к ингибированию фермента, но может увеличивать проницаемость мембраны СР для Са2+.

Показано, что мелитгин является необратимым ингибитором Са-АТФазы, причем его взаимодействие с ферментом удовлетворительно описывается в рамках выдвинутой гипотезы о присутствии в мембранах СР мономеров и олигомеров Са-АТФазы. С помощью антимелитгиновых антител выделен в очищенном виде мелитгин-подобный белок с молекулярной массой 67 кДа, и установлено, что он активирует Са-АТФазу СР.

Впервые детально исследованы сезонные изменения активности Са-АТФазы в мембранах СР скелетных мышц гибернирующего суслика 5.ипйиШш. В мембранных препаратах СР суслика обнаружена высокая эндогенная протеинкиназная активность и продемонстрировано, что сезонные изменения

активности Са-АТФазы могут быть связаны с изменением уровня фосфорилирования ре1уляторных белков мембран ретикулума.

Апробадяя работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзных конференциях по транспортным АТФазам (Тбилиси, 1978; Тарту, 1980; Карадаг, 1981; Иркутск, 1987), на 1П, IV и VI Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1978; Ленинград, 1981; Тбилиси, 1989), на Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1981), на VIII Всесоюзной конференции «Биофизика и биохимия мышечной подвижности» (Пущино, 1987), на Международном симпозиуме «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989), на Британско-Российском симпозиуме по биоэнергетике (Саутхэмптон, Великобритания, 1992), на VII, IX и X Международных конференциях, посвященных №,К-АТФазе и АТФазам Р-типа (Тодсмус, Германия, 1993; Саппоро, Япония, 1999; Эльсинор, Дания, 2002), на 39 Ежегодном симпозиуме биофизического общества США (Сан-Франциско, 1995), на Международной конференции «Мембранная биоэнергетика» (Москва, 1995), на II Съезде Российского биохимического общества РАН (Москва, 1997), на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), на VI Съезде Европейского кальциевого общества (Париж, 2000), Гордоновской конференции «Мышцы: электромеханическое сопряжение» (Нью-Хэмпшир, США, 2003). Результаты работы ежегодно обсуждались на научных семинарах кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Публикации. Автором опубликовано 92 печатные работы. Выносимые на защиту положения наиболее полно представлены в 55 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (464 ссылки). Объем работы составляет 330 страниц, включая 247 страниц машинописного текста, 57 рисунков и 27 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

Препараты легкой и тяжелой фракций CP, обогащенные Са-АТФазой и Са-каналами соответственно, получали из скелетных мышц кроликов, крыс и сусликов S.undulatus и сердца утки методом дифференциального центрифугирования (Ритов и др., 1977; Moni et al., 1985; Meissner, Henderson, 1987). Протеолипосомы с различным содержанием белка Са-АТФазы в мембране получали методом разведения белка липидом (Арчаков и др., 1979), используя очищенный с помощью дезоксихолата натрия фермент (Ритов, Щербакова, 1982). Концентрацию белка в препаратах CP определяли по методу Лоури в присутствии 1% дезоксихолата натрия (Lowiy et al., 1951) или по методу Спектора (Spector, 1978). Для измерения содержания фосфолипидов в препаратах CP использовали метод минерализации с последующим определением неорганического фосфора (Bartlett, 1959).

Белковый состав препаратов анализировали методом ЭФ в ПААГ в присутствии ДДС-Na (Laemmli, 1970). Для выявления Са-связывающих белков использовали карбоцианиновый краситель Stains All, окрашивающий эти белки в синий цвет (Campbeil et al., 1983). При проведении Вестерн-блот анализа белки, разделенные с помощью ЭФ в ПААГ, переносили путем электроблоттинга на

нитроцеллюлозные мембраны и обрабатывали специфическими антителами и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (Towbin et al., 1992). В качестве субстрата пероксидазы использовали диаминобензидин.

Для получения антимелитгиновых антител пептид «сшивали» с использованием 0,6% глутарового альдегида. Образующиеся конъюгаты вводили кролику совместно с полным адъювантом Фройнда (Clark et al., 1987). Титр антител контролировали с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Метод выделения мелитгин-подобного белка был разработан совместно с профессором Д. Купполетги в Университете г. Цинциннати (Огайо, США). Белок получали методом аффинной хроматографии из цитоплазматической фракции слизистой желудка кролика. Сыворотку кролика, иммунизированного коньюгатами мелиттина, прогревали 1 ч при 56°С для инактивации комплемента. Очистку антител проводили высаливанием, а затем на колонке с протеином А, после чего антитела иммобилизовали на колонке с Affigel-10. Цитоплазматическую фракцию наносили на колонку с иммобилизованными антителами, промывали раствором NaCl и элюировали связавшиеся с антителами белки 0,1 М раствором глицина (pH 3,1).

АТФ-зависимую аккумуляцию и выход Са2+ из везикул тяжелого CP регистрировали, используя металлохромный Са-индикатор антипирилазо III (Morii et al., 1985), на спектрофотометре Hitachi-557 в двухволновом режиме, регистрируя разницу в оптической плотности раствора при 720 и 790 нм (максимум и минимум поглощения комплекса антипирилазо Ш с Са2+ соответственно). Выход 45Са2+ из пассивно нагруженных везикул CP измеряли с использованием метода фильтрации проб на фильтрах "Synpore" (диаметр пор 0,45 мкм) (Kim et al., 1983).

Для определения активности Са-АТФазы использовали метод непрерывной спектрофотометрической регистрации в системе сопряженных ферментативных реакций (пируваткиназа + лакгатдегидрогеназа) (Anderson, Murphy, 1983). В ряде экспериментов АТФазную активность препаратов CP определяли по нарастанию в среде количества неорганического фосфата (Rathbun, Betlach, 1969). Определение гидролитической и Са-аккумулирующей активности Са-АТФазы при использовании в качестве субстратов АТФ, ГТФ и других неадениловых нуклеотидов проводили с помощью рН-метрической установки, состоящей из термостатируемой ячейки для комбинированного электрода, потенциометра и самописца (Болдырев и др., 1969).

Для определения характера ингибирующего действия мелиттина на Са-АТФазу препараты CP преинкубировали с 5-30-кратным избытком мелиттина, после чего аликвоты смеси вносили в среду для определения активности фермента; концентрация мелиттина при этом снижалась в 30-50 раз. Термообработку везикул CP проводили при 37-55°С. Для этого препарат CP разводили средой хранения до концентрации белка, равной 5 мг/мл, инкубировали в течение 5 мин на водяной бане при заданной температуре, а затем охлаждали во льду.

Модификацию Са-АТФазы НБД-хлоридом для определения кинетических характеристик SH-групп фермента проводили в присутствии 50-100-кратного молярного избытка реагента. При определении значений кажущихся Кд для нуклеотидов, обеспечивающих защиту Са-АТФазы от инактивации НБД-хлоридом, фермент преинкубировали с SH-реагентом в течение 1-30 мин в присутствии заданной концентрации нуклеотида, после чего аликвоты смеси вносили в среду для определения активности фермента (Eckert et al., 1977).

Для флуоресцентных исследований проводили избирательное включение НБД-хлорида в остаток Cys344 Са-АТФазы (Wakabayashi et al., 1990). Обработку Са-АТФазы флуоресцеин- (ФИТЦ) и эозинизотиоцианатом (ЭИТЦ) проводили в условиях, позволяющих избирательно модифицировать остаток Lys515 (Muiphy, 1988). Включение в Са-АТФазу йодацетамидоэозина (ИАЭ) проводили в условиях, позволяющих избирательно модифицировать остатки Cys670 и Cys674 (Squier et al., 1987).

Для анализа олигомерной организации Са-АТФазы в мембранах CP проводили электронномикроскопические исследования сколов замороженных структур с использованием сканирующего микроскопа JEM-100CX (Япония) при увеличении х75000. Работы проводились в Лаборатории электронной микроскопии Кинг'с Колледжа Лондонского университета совместно с доктором А. Брайеном. С этой же целью использовали метод ковалентной "сшивки"; в качестве агента, индуцирующего образование ковалентных S-S-мостиков, применяли о-фенантролин в присутствии ионов меди (Murphy, 1976).

Анализ вращательной подвижности Са-АТФазы в мембранах CP проводили с помощью регистрации затухания анизотропии фосфоресценции ЭИТЦ и ИАЭ, ковалентно связанных с ферментом, с высоким временным разрешением (Burkli, Cherry, 1981). Анизотропию фосфоресценции регистрировали, используя лазерный фосфориметр, сконструированный в Кинг'с Колледже Лондонского университета (работы проводились совместно с профессором П. Куинном). Фосфориметр состоял из Nd:YAG-na3epa (длина волны 532 нм, длительность импульса 5 не), соответствующих поляризаторов и фильтров, термостатируемого иоветного отделения, двух фотоумножителей и осциллоскопа-накопителя, соединенного с персональным компьютером, с помощью которого проводилась регистрация и анализ полученных результатов. Освещение осуществлялось вертикально поляризованным светом, вертикально и горизонтально поляризованные компоненты фосфоресценции регистрировались с помощью двух фотоумножителей, расположенных перпендикулярно к возбуждающему лучу лазера. Каждая кривая затухания анизотропии фосфоресценции была получена в результате 256 измерений во временном интервале 5-500 мкс.

Поверхностный электрический потенциал мембран CP измеряли с использованием рН-индикатора нейтрального красного (Van Walraven et al., 1984). Структурное состояние липидной фазы мембран CP анализировали с помощью флуоресцентных зондов пирена и AI 1С стандартными методами (Добрецов, Владимиров, 1980) и методом ЭПР-спектроскопии, используя в качестве зондов спин-меченые производные стеариновой и пальмитиновой жирных кислот и их метиловые эфиры. Работы выполнялись совместно с Г.Б. Хомутовым (Физический факультет МГУ). Гидроксилрадикал-связывающую активность гистидин-содержащих дипептидов исследовали методом спиновых ловушек, используя а-фенил-№-терт-бутил-нитрон (PBN) и 5,5-диметилпирролин-1-оксид (DMPO). Работы проводились совместно с профессором М. Шара в Отделе биофизики Института Йожеф Стефан Университета им. Е. Карделя (Любляна, Югославия).

Уровень включения [32Р] из у[32Р]ЛТФ в белки CP эндогенными протеинкиназами измеряли методом гетерогенного счета после нанесения меченых образцов на бумажные фильтры и отмывания несвязанной метки ТХУ. Спектр фосфорилируемых белков анализировали методом авторадиографии после разделения белков ЭФ в ПААГ.

Результаты н их обсуждение

1. Характеристика используемых в работе препаратов тяжелой и легкой фракций СР. Для исследования свойств Са-каналов использовалась тяжелая фракция CP, представленная фрагментами терминальных цистерн ретикулума. В состав этой фракции входит большое количество белков (рис. 1, дорожки 2-4), в том числе белок с молекулярной массой 450 кДа, электрофоретическая подвижность которого соответствует подвижности Са-канала (Inui, Fleischer, 1988). Присутствие в полученных препаратах CP этого белка с высокой молекулярной массой коррелирует с наличием в них активных Са-каналов, что определялось по их способности обеспечивать выброс Са2+ при внесении известных активаторов Са-каналов. Са-каналы CP сердца утки, представляющие собой сердечную изоформу RyR позвоночных (гомолог RyR2 изоформы млекопитающих), имеют более высокую электрофоретическую подвижность, чем Са-каналы скелетных мышц млекопитающих. В препаратах легкой фракции CP, полученных из скелетных мышц млекопитающих и представленных фрагментами продолговатых трубочек ретикулума (рис. 1, дорожки 6-8), основными белковыми компонентами являются Са-АТФаза (молекулярная масса 105 кДа), Са-связывающий белок кальсеквестрин (бЗкДа) и белки с молекулярными массами от 55 до 30 кДа. Содержание низкомолекулярных белков в препаратах легкой фракции CP скелетных мышц крысы и суслика S.undulatus выше, чем в препаратах кролика.

2. Характеристика СО1*- и кофеин-индуцируемого выброса Со2* из препаратов тяжелого СР и поиск кофеинсвязывающих белков. Для исследования параметров работы Са-каналов CP изменения концентрации свободного Са2+ в среде регистрировали с помощью металлохромного индикатора антипирилазо III в присутствии АТФ-регенерирующей системы (рис. 2). При добавлении 0,5 мМ АТФ к инкубационной среде, содержащей везикулы тяжелого CP и все необходимые для работы Са-АТФазы компоненты, происходит резкое уменьшение уровня свободного Са2+ вследствие его связывания с АТФ. Последующая аккумуляция Са2+ Са-АТФазой происходит в две стадии. В течение первой стадии Са-каналы находятся в открытом состоянии, в результате чего аккумуляция Са2+ происходит сравнительно медленно. На второй стадии Са-каналы закрываются и накопление Са2+ происходит гораздо быстрее. Закрывание Са-каналов, вероятнее всего, связано со снижением в среде уровня свободного Са2+, однако определенный вклад в переход Са-каналов в закрытое состояние могут вносить увеличение концентрации

Рис. 1. Электрофореграммы препаратов тяжелой фракции СР, выделенных из сердца утки (2), скелетных мышц крысы (3) и кролика (4) и препаратов легкой фракции СР, выделенных из скелетных мышц кролика (6), крысы (7) и суслика (8). На дорожки 1 и 5 нанесены белки-стандарты.

2 3 4

6 7 8

внутривезикулярного Са2+ и фосфорилирование белков СР эндогенными протеинкиназами (Моги й а1., 1985). В конце быстрой фазы концентрация свободного Са2+ в среде снижается примерно до 0,1 мкМ и наступает равновесное состояние, когда скорость аккумуляции Са + равна скорости его утечки. Оно длится до тех пор, пока не израсходуется весь креатинфосфат, обеспечивающий регенерацию АТФ, после чего Са2+ начинает вытекать из везикул СР (не показано). Если на стадии равновесия добавить в среду кофеин или Са2\ происходит быстрый выброс Са2+ из СР в среду, сменяющийся затем его реаккумуляцией, также двухфазной. Двухфазный характер аккумуляции Са2+ и индуцируемый кофеином и Са2+ выброс Са + из СР полностью блокируются рутениевым красным (10 -10"7 М), что свидетельствует об участии в этих процессах Са-каналов СР.

I

Рис. 2. АТФ-зависимая аккумуляция Са2+ (стрелка 1 показывает момент внесения в среду 0,5 мМ АТФ) и выброс Са2* из везикул тяжелой фракции СР скелетных мышц кролика, индуцируемый 10 мкМ Са2+ (стрелка 2) или 2 мМ кофеина (стрелка 3).

Поскольку выделяемые нами препараты тяжелой фракции СР представлены в основном триадами (терминальые цистерны СР, связанные с фрагментами трубочек Т-системы), в которых Са-каналы СР непосредственно контактируют с Са-каналами Т-трубочек плазматических мембран (ДГПР) и могут активироваться при изменении их конформации (Ме1ззпег, Ьи, 1995; Бийсо, Акеу, 1996), при анализе влияния различных веществ на функционирование Са-каналов СР необходимо было выяснить, не опосредовано ли их действие влиянием на ДГПР. Для этой цели мы использовали ряд производных 1,4-дигидропиридина (ДТП) -антагонистов и агонистов ДГПР, и производных, не влияющих на Са-каналы плазматической мембраны. Все исследуемые соединения в концентрациях Ю'МО"6 М не влияли на скорость аккумуляции Са2+ препаратами тяжелого СР в медленной фазе аккумуляции и на величину Са-индуцируемого выброса Са2+ (составляет во всех случаях 20 ± 4 нмоль/мг белка СР), т.е. ни блокирование ДГПР антагонистами, ни их активация агонистами, не влияет на функционирование Са-каналов мембран СР.

Как показано на рис. 2, внесение в среду инкубации на стадии стационарного состояния, когда концентрация Са2+ в среде поддерживается на низком уровне (примерно 0,1 мкМ), 10 мкМ свободного Са2+ индуцирует быстрый ингибируемый рутениевым красным выход из везикул СР еще 20 + 4 нмоль Са2+/мг белка СР. Количество освобождаемого Са2+ практически не зависит от конечной концентрации внесенного Са2+ (в пределах от 1 до 10 мкМ), т.е. вероятно, при некоторой пороговой концентрации Са2+ в среде Са-каналы, или по крайней мере часть из них, переходят в открытое состояние. Освобожденный Са2+ поглощается везикулами СР за счет работы Са-насоса, наступает состояние равновесия, после чего можно опять индуцировать его выброс внесением в среду Са2+ или кофеина. При повторных добавках Са2+ (3-5 добавок) в используемых нами условиях количество освобождаемого Са2+ практически не увеличивалось несмотря на

повышающуюся «нагрузку» везикул ретикулума кальцием (не показано). По-видимому, емкости везикул тяжелого CP достаточно для эффективного связывания всего поглощенного Са2+, а при каждом последующем цикле переходов Са-каналов в открытое состояние из ретикулума выходит определенное количество запасенного Са2+.

Быстрый ингибируемый рутениевым красным выход Са2+ из везикул тяжелого CP можно индуцировать и внесением в среду инкубации на стадии равновесия кофеина (рис. 2). Как видно из рисунка, в этом случае скорость реаккумуляции Са2+ примерно вдвое ниже, чем скорость аккумуляции после Са-индуцируемого выброса. Это говорит о том, что в присутствии кофеина Са-каналы CP переходят в закрытое состояние значительно медленнее. Кроме того, количество освобождаемого из везикул CP Са2+ гиперболически зависит от концентрации вносимого в среду кофеина в диапазоне 0,1-5 мМ с К0г5 = 0,3 ± 0,01 мМ, т.е. Са-каналы CP имеют в своем составе насыщаемые центры связывания кофеина. Максимальное количество освобождаемого из CP Са2+ составляет, как и в случае Са-индуцируемого выброса Са2+, около 20 нмоль/мг белка СР. По-видимому, связывание кофеина в соответствующих центрах на молекулах Са-каналов увеличивает чувствительность этих молекул к Са2+ и они переходят в открытое состояние. Остальные Са-каналы, центры которых не насыщены кофеином, остаются закрытыми. Этим объясняется наблюдаемая нами гиперболическая зависимость количества освобождаемого Са2+ от концентрации кофеина. С повышенной чувствительностью Са-каналов CP к Са2+ в присутствии кофеина связана низкая скорость поглощения Са2+ в медленной фазе аккумуляции в присутствии кофеина, т. е. более медленный переход Са-каналов в закрытое состояние.

Для выявления кофеинсвязывающих белков мембраны тяжелого CP солюбилизировали неионным детергентом С12Е9, наносили солюбилизат на колонку с Reactive Red 120-агарозой и проводили элюцию кофеином. Содержание в элюате белка с молекулярной массой 170 кДа значительно увеличивалось (в 25-30 раз) при повышении концентрации кофеина в элюирующем растворе с 5 до 20 мМ. Кофеин элюировал с колонки и другие белки (RyR и белки с молекулярными массами около 70 и 50 кДа), однако их количество практически не зависело от концентрации кофеина в элюирующем растворе. Белок с молекулярной массой 170 кДа был идентифицирован нами как богатый гистидином Са-связывающий белок, так как он окрашивался в синий цвет карбоцианиновым красителем Stains АН. Интересно отметить, что этот белок способен связывать активатор Са-каналов CP доксорубицин, причем связывание с ним доксорубицина блокируется кофеином (Zorzato et al., 1986). Поскольку сами Са-каналы CP содержат участки связывания кофеина, можно заключить, что их активация кофеином обеспечивается его связыванием в соответствующих центрах на молекуле Са-канала (Favero, 1999). Тем не менее, можно полагать, что белок с молекулярной массой 170 кДа может принимать участие в регуляции Са-каналов CP кофеином, тем более, что для максимальной активации Са-каналов CP требуются относительно высокие (>10 мМ) концентрации кофеина (Ogawa et al., 1999).

3. Регуляция Са-каналов CP гистидинсодержащими дипептидами. При

исследовании влияния карнозина на АТФ-зависимую аккумуляцию Са2+ везикулами CP скелетных мышц и на кофеин- и Са-индуцируемый выброс Са2+ препаратами тяжелого CP скелетных мышц кролика в среде с АТФ-регенерирующей системой

было обнаружено, что в присутствии карнозина наблюдается картина, включающая все показанные на рис. 2 стадии, однако начальная скорость аккумуляции Са2+ Са-АТФазой и скорости его реаккумуляции после Са- или кофеин-индуцируемого выброса значительно снижаются. Так, при увеличении концентрации карнозина в инкубационной среде до 40 мМ начальная скорость аккумуляции Са2+ (в медленной фазе) снижается на 40%. Поскольку из литературных данных известно, что карнозин не ингибирует Са-АТФазу СР (Лопина, Болдырев, 1975), мы предположили, что снижение скорости аккумуляции Са2+ может быть связано с тем, что карнозин активирует Са-каналы СР или препятствует их закрытию. Мы обнаружили, что при внесении карнозина в инкубационную среду на стадии равновесия происходит быстрый выброс Са2+, ингибируемый рутениевым красным. Зависимость количества освобождаемого из СР Са2+ от концентрации карнозина имела гиперболический характер, что позволяет говорить о существовании насыщаемых участков связывания карнозина на молекулах Са-каналов. Расчеты показали, что для карнозина = 8,7 ± 0,2 мМ и Амшсс = 27,5 ± 2,7 нмоль Са2+/мг белка СР. По-видимому, карнозин, как и кофеин, увеличивает сродство Са-каналов к Са2+, поэтому после его связывания в соответствующих центрах часть Са-каналов переходит в открытое состояние.

Внесение Са2+ в среду инкубации после карнозин-индуцируемого выброса вызывает Са-индуцируемый выброс Са2+ (не показано). Это означает, что Са2+ и карнозин связываются с разными участками канала, и оккупация одного из них соответствующим лигандом не препятствует действию второго. Сказанное справедливо и для участков связывания карнозина и кофеина, так как после карнозин-индуцируемого выброса Са2+ можно наблюдать кофеин-индуцируемый выброс Са2+, и наоборот; кроме того, как Са2+-, так и кофеин-индуцируемый выброс Са2+ наблюдаются в присутствии высоких концентраций карнозина. Таким образом, Са-каналы СР имеют участки связывания карнозина, которые отличаются от участков связывания кофеина и Са2+.

Таблица 1. Параметры, характеризующие лиганд-индуцируемый выброс Са2+ из СР скелетных мышц кролика и крысы (Ко,5 - мМ, Амакс - нмоль Са2+/мг белка)

Лиганд I Ко.5 1 Амк

СР скелетных мышц кролика

кофеин 0,32 + 0,01 20,3 ± 0,1

карнозин 8,7 ±0,2 27,5 ±2,7

анзерин 2,7 ±0,1 37,2 ±4,0

СР скелетных мышц крысы

кофеин 0,33 ±0,1 17,2 ±0,5

карнозин 30,4 ±0,2 18,2 ±0,2

анзерин 25,1 ±0,2 55,5 ±2,3

Анзерин (метилирование производне карнозина) также вызывает быстрый выброс Са2+ из ретикулума, причем сродство к нему Са-каналов примерно в 3 раза выше, чем к карнозину, а величина максимального выброса существенно выше, чем для карнозина и кофеина (Таблица 1). Увеличение максимального выброса Са2+, индуцируемого карнозином и анзерином, свидетельствует, по-видимому, о том, что по сравнению с кофеином эти дипептиды в большей степени увеличивают либо вероятность перехода Са-каналов в открытое состояние, либо время жизни открытого состояния канала. Кроме того, в их присутствии может увеличиваться количество Са2+, освобождаемого внутривезикулярными Са-связывающими

белками и способного выйти через Са-каналы в момент их открытия. Чтобы выяснить, не является ли их действие специфичным именно для Са-каналов CP кролика, был проанализирован эффект карнозина и анзерина на Са-каналы CP скелетных мышц крысы, RyR которых имеет несколько отличающуюся первичную структуру. Как и в случае CP скелетных мышц кролика, карнозин и анзерин вызывают выброс Са2+ из CP скелетных мышц крысы, однако в данном случае сродство Са-каналов к ним существенно ниже (Таблица 1). Необходимо отметить, что в отличие от параметров карнозин- и анзерин-индуцируемого выброса Са2+, параметры кофеин-индуцируемого выброса Са2+ для CP скелетных мышц кролика и крысы практически одинаковы. По-видимому, участки связывания кофеина на Са-каналах CP скелетных мышц кролика и крысы близки по своим свойствам, чего нельзя сказать об участках связывания гистидинсодержащих дипептидов.

Анализ влияния ряда производных карнозина и гистидина на Са-каналы CP скелетных мышц кролика показал, что близким действием обладает гомокарнозин, т.е. замена р-аланина на у-аминомасляную кисло iy не оказывает существенного влияния на взаимодействие дипептида с Са-каналами (рис. 3). Наибольший выброс Са2+ из всех исследованных гистидинсодержащих соединений индуцирует карцинин; метилирование по 1 атому азота в имидазольном кольце также значительно увеличивает лиганд-индуцируемый выброс Са2+ (анзерин вызывает примерно в 2 раза больший лиганд-индуцируемый выброс Са2+ по сравнению с карнозином). Более того, 1 -метил-Ь-гистидин, в отличие от самого гистидина, также индуцирует выброс Са2+. Перемещение метальной группы от первого атома азота к третьему снижает способность дипептидов активировать Са-каналы (количество Са2+, освобождаемое под действием офидина, примерно в 2 раза меньше, чем в случае карнозина, и почти в 4 раза меньше, чем для анзерина). При этом З-метил-L-гистидин, в отличие от 1 -мстил-Ь-гистидина, не способен активировать Са-каналы. Снижение количества Са2+, освобождаемого из CP скелетных мышц кролика, наблюдается также при ацетилировании концевой аминогруппы остатка Р-аланина в молекуле карнозина. При этом ацетилгистидин не вызывает выброса Са2+ из CP

Рис. 3. Количество Са2+, освобождаемое из везикул тяжелой фракции CP скелетных мышц кролика при выбросе, индуцируемом 25 мМ карнозина или родственных ему соединений (за 100% принято количество Са2+, освобождаемое под действием карнозина). Везикулы CP нагружали Са2+ при использовании АТФ и АТФ-регенерирующей системы. Обозначения: 1 -карнозин; 2 - гомокарнозин; 3 -ацетилкарнозин; 4 - анзерин; 5 - офидин (баленин); 6 - карцинин; 7 - 1-метил-Ь-гистидин; 8 - З-мегил-Ь-гистидин; 9 — ацетилгистидин; 10 - L-гистидин; 11-0-аланин.

Представляется маловероятным, что карнозин- или анзерин-индуцируемый выброс Са2+ имеют место /и vivo, поскольку концентрация этих дипептидов в мышечных клетках высока и поддерживается на относительно постоянном уровне

скелетных мышц кролика.

I

I

I 3 3 4 5

7 8 6 10 11

(Crush, 1970; Abe, 1995). Поэтому необходимо было выяснить, как дипептиды влияют на взаимодействие Са-каналов с другими модуляторами их активности. Анализ кофеин-индуцируемого выброса Са+ в присутствии 30 мМ карнозина показал, что карнозин увеличивает сродство Са-каналов к кофеину (Таблица 2). Возможность влияния карнозина на взаимодействие Са-каналов с адениловыми нуклеотидами была проанализирована в условиях, когда аккумуляцию Са2+ внутрь везикул CP обеспечивали за счет гидролиза неаденилового нуклеотида ГТФ. При добавлении неадениловых нуклеотидов в среду, содержащую все необходимые для транспорта Са2+ компоненты, наблюдается уменьшение концентрации свободного Са2+ в среде инкубации вследствие его аккумуляции внутрь везикул ретикулума, после чего наступает стадия равновесия. Добавление на стадии равновесия кофеина, Са2+ или карнозина не вызывает выброса Са2+, однако внесение 0,05-1 мМ адениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ или Р,у-СНг-АТФ) вызывает быстрый дозозависимый выброс Са2+ (рис. 4). Анализ показал, что величины Ко,5 и Амакс для АМФ-индуцируемого выброса Са2+ (при ГТФ-зависимой аккумуляции Са2+) существенно различаются в контроле и в присутствии 30 мМ карнозина: К0_5 для АМФ в присутствии карнозина снижается примерно в 2,5 раза (Таблица 2). Таким образом, карнозин увеличивает сродство Са-каналов CP к их активаторам -кофеину и АМФ.

Таблица 2. Влияние карнозина на параметры, характеризующие кофеин- и АМФ-индуцируемый выброс Са2+ из CP скелетных мышц кролика (Ко,5 - мМ, Амакс - нмоль

Са2+/мг белка)

Лиганд-активатор Контроль 30 мМ карнозин

Ко.5 Амакс Ко.5 Амакс

кофеин 0,32 ±0,01 20,3 ±0,1 0,19 ±0,01 20,4 ±0,1

АМФ 0,10 ±0,01 20,1 ±0,1 0,04 ±0,01 12,4 ±0,1

Рис. 4. Аккумуляция Са везикулами тяжелого СР скелетных мышц кролика при использовании в качестве субстрата 0,5 мМ ГТФ (стрелка а) и его пассивный выход (1) или выброс, индуцируемый 0,3 мМ АМФ (стрелка б) в контроле (2) или в присутствии 30 мМ карнозина (3).

Анализ влияния карнозина на взаимодействие Са-каналов СР скелетных мышц кролика с их ингибиторами с использованием метода пассивной нагрузки везикул 45Са2+ показал, что в присутствии 1 мкМ рутениевого красного или 1 мМ Mg2+ Са-каналы полностью блокируются как в контроле, так и в присутствии карнозина. Однако в присутствии 50 мкМ Mg2+ наблюдается лишь частичное ингибирование Са-каналов. В этом случае 30 мМ карнозин не только устранял ингибирующее действие Mg2+, но и обеспечивал активацию Са-каналов (не показано). Известно, что полумаксимальное ингибирование выброса Са2+ в отсутствие других модуляторов активности Са-каналов наблюдается в присутствии 50-70 мкМ Mg2+ (Meissner et al., 1986; Ogawa et al., 1999). Устранение карнозином

ингибирующего действия низких концентраций Mg + позволяет предположить, что карнозин снижает сродство к Mg2+ тех участков Са-каналов, связывание с которыми обеспечивает ингибиторный эффект.

Анализ влияния карнозина на чувствительность Са-каналов к Са2+ показал, что при всех исследованных концентрациях Са2+ карнозин увеличивает скорость выхода Са2+ из везикул CP, усиливая активирующее действие низких и оптимальных концентраций Са2+ и снижая ингибирующий эффект высоких (рис. 5, А). При этом активирующий эффект карнозина наиболее выражен в случае минимальных и максимальных концентраций Са2+. Характер изменений чувствительности Са-каналов к Са2+ под действием карнозина позволяет предположить, что карнозин увеличивает сродство к Са2+ в акгиваторных участках и снижает сродство в ингибиторных. Активность Са-каналов CP скелетных мышц кролика снижается при закислении среды и возрастает при защелачивании (рис. 5, Б), что хорошо согласуется с литературными данными (Laver et al., 2000). При исследовании активирующего действия карнозина на Са-каналы в интервале рН от 6,0 до 8,0 было установлено, что при рН 7,5-8,0 карнозин практически не влияет на количество освобождаемого из везикул CP Са2+, так как Са-каналы находятся, по-видимому, в максимально активном состоянии. Активирующее действие карнозина возрастает при закислении, и той рН 6,0 карнозин увеличивает количество освобождаемого из везикул CP Са + по сравнению с контролем более, чем в 5 раз. Таким образом, карнозин снижает ингибирующее действие низких рН. Этот защитный механизм может фцнкционировать in vivo при закислении, возникающем в ходе работы мышц.

:

г »

i

Ь 70

iI «

г «

Рис. 5. Зависимость количества Са2+, освобождаемого из везикул тяжелого СР скелетных мышц кролика за первые 15 с выхода, от концентрации ионизированного Са2+ при рН 7,0 (А) и от рН среды инкубации при рСа 6,5 (Б). Белые столбики - контроль, черные столбики - в присутствии 30 мМ карнозина.

Данные о влиянии карнозина и родственных ему соединений на работу Са-каналов CP в разных условиях говорят о том, что эти соединения могут препятствовать инактивации Са-каналов под воздействием факторов, возникающих в скелетной мускулатуре при интенсивной мышечной работе и развитии утомления мышц (Favero, 1999). Поскольку развитие утомления при интенсивной мышечной работе в определенной степени связано с повреждающим действием на Са-каналы свободных радикалов, продукция которых в мышечных волокнах в этих условиях резко возрастает, мы оценили способность карнозина взаимодействовать со свободными радикалами в модельной системе. Для этого был использован метод

спиновых ловушек - соединений, связывающих короткоживущие свободные радикалы с образованием сравнительно долгоживущих аддуктов, обладающих парамагнитными свойствами. В качестве спиновых ловушек были использованы БМРО и РВИ, а продукцию гидроксил-радикала индуцировали УФ-облучением раствора Н202 или в реакции Фентона (взаимодействие Н202 с Ре2+).

При УФ-облучении контрольной пробы интенсивность сигнала ЭПР (высота пиков на спектре) быстро возрастает, тогда как в присутствии карнозина БМРО/ОН' радикальный аддукт образуется значительно медленнее и его уровень через 20 с достигает примерно трети от уровня, который наблюдается в контроле (рис. 6, Б). Такая картина может быть связана с двумя процессами: с прямым взаимодействием карнозина с гидроксил-радикалом и/или с его взаимодействием с БМРО/ОН' радикальным аддукгом. Как показали контрольные эксперименты, время жизни БМРО/ОН' радикального аддукга в присутствии карнозина действительно снижается - скорость распада адцукта в присутствии 50 мМ карнозина увеличивается в 5 раз. Однако решение системы уравнений, описывающих генерацию гидроксил-радикала и образование и распад аддукта спиновой ловушки, показало, что экспериментальные кривые не мо1уг быть удовлетворительно описаны с учетом влияния карнозина только на время жизни ОМРО/ОН' радикального аддукта. Хорошее совпадение расчетных кривых с экспериментальными точками было получено при решении системы уравнений с учетом того, что скорость «исчезновения» из среды свободного гидроксил-радикала в присутствии 50 мМ карнозина в три раза выше, чем в контрольных условиях. Аналогичные результаты были получены при генерации гидроксил-радикала в реакции Фентона, с использованием в качестве спиновой ловушки РВЫ, а также в экспериментах с гомокарнозином, анзерином и ацетилкарнозином (данные не представлены).

Рис. 6. Спектр ЭПР ОМРО/ОН радикального аддукта, полученный при УФ-облучении раствора Н202 в течение 5 с (А), и скорость накопления ОМРО/ОН' радикального аддукта при УФ-облучении раствора Н202 в отсутствие (1) и в присутствии (2) 50 мМ карнозина (Б). Пунктирная линия показывает расчетную кривую, построенную с учетом взаимодействия карнозина только с ОМРО/ОН радикальным аддуктом.

Таким образом, карнозин и родственные ему соединения способны эффективно реагировать с короткоживущими свободными радикалами (по крайней мере, с гидроксил-радикалом), убирая их из среды, а также способны значительно уменьшать время жизни долгоживущих радикальных аддуктов. Это свойство

о в а я

А

Б

гистидинсодержащих дипептидов может вносить свой вклад в защиту Са-каналов СР от инактивации в процессе интенсивной мышечной работы.

4. Нуклеотидсвязывающие свойства Са-каналов и альтернативные пути выхода Са2+ из везикул саркоплазматического ретикулума. Для активной нагрузки везикул тяжелого СР кальцием можно использовать не только АТФ, но и другие нуклеотиды, так как они утилизируются Са-АТФазой СР в качестве субстратов и обеспечивают аккумуляцию Са . Как видно из рис. 7, внесение в среду 0,5 мМ АТФ или ЦТФ приводит к быстрому поглощению имеющегося в среде Са2+ внутрь везикул СР за счет работы Са-насоса. Низкая концентрация свободного Са2+ в среде поддерживается в течение нескольких минут, после чего наблюдается его утечка, связанная с исчерпанием субстрата Са-АТФазы (АТФ или ЦТФ). Повторное добавление субстрата приводит к новому циклу аккумуляция Са2+ - поддержание в среде низкой концентрации Са2+ - медленная утечка Са2+, а добавление в среду микромолярных концентраций рутениевого красного при использовании в качестве субстрата Са-АТФазы АТФ (но не других нуклеотидов) существенно (в 3-5 раз) увеличивает время поддержания низкой концентрации Са2+, но практически не влияет на скорость утечки Са2+ из везикул СР после исчерпания субстрата (не показано). При использовании в качестве субстратов Са-насоса неадениловых нуклеотидов добавление рутениевого красного практически не влияет ни на время удержания Са2+ внутри СР, ни на скорость его утечки после исчерпания субстрата. Можно заключить, что в присутствии АТФ в среде инкубации часть Са-каналов СР находится в открытом состоянии и постоянная утечка Са2+ через эти каналы ускоряет исчерпание субстрата. В то же время, при наличии в среде неадениловых нуклеотидов Са-каналы СР находятся преимущественно в закрытом состоянии, т.е. неадениловые нуклеотиды не способны активировать Са-каналы СР.

При использовании АТФ в качестве субстрата Са-АТФазы можно индуцировать быстрый выброс Са2+ из везикул СР через Са-каналы, добавив на стадии поддержания низкой концентрации Са2+ кальций или кофеин, т.е. в этих условиях Са-каналы способны осуществлять как Са-индуцируемый, так и кофеин-индуцируемый выброс Са2+ (рис. 7, а и б). При использовании для аккумуляции Са2+ неадениловых нуклеотидов нам не удалось зарегистрировать ни Са-индуцируемый, ни кофеин-индуцируемый выброс Са2+ (рис. 7, г). Это говорит о том, что в присутствии этих нуклеотидов (т.е. в отсутствие АТФ) Са-каналы СР находятся в неактивном состоянии; более того, в отсутствие АТФ Са-каналы СР теряют чувствительность к активирующему действию Са2+ и кофеина. Можно

Рис. 7. АТФ-зависимая (а - в) и ЦТФ-зависимая (г) аккумуляция Са2+ везикулами тяжелого СР скелетных мышц кролика и выход Са2+ из СР после истощения субстрата в отсутствие АТФ-регенерирующей системы. Стрелками показано добавление 0,5 мМ АТФ (1) или ЦТФ (2), 5 мкМ Са2+ (3) и 5 мМ кофеина (4).

предположить, что неадениловые нуклеотиды не связываются в АТФ-связывающих участках Са-каналов CP, или же их связывание не обеспечивает поддержания активной конформации Са-каналов.

Для проверки этих предположений мы исследовали активацию Са-каналов CP адениловыми нуклеотидами при наличии в среде инкубации неадениловых нуклеотидов. При использовании в качестве субстратов Са-АТФазы ГТФ, ЦТФ, ИТФ или УТФ, внесение АТФ, АДФ, АМФ или р,у-СН2-АТФ на стадии поддержания в среде низкой концентрации Са2+ индуцирует быстрый выброс Са2+ из CP, который полностью блокируется рутениевым красным, т.е. адениловые нуклеотиды в этих условиях переводят Са-каналы в активное состояние. Действие адениловых нуклеотидов было дозозависимым, что говорит об их связывании с насыщаемыми участками в молекулах Са-каналов. По-видимому, связывание адениловых нуклеотидов с Са-каналами резко увеличивает их сродство к Са2+, концентрация которого в среде на стадии равновесия составляет несколько микромолей, вследствие чего каналы переходят в открытое состояние. Способность адениловых нуклеотидов активировать Са-каналы CP уменьшалась в ряду АТФ»ру-СН2-АТФ>АДФ>АМФ. Следует заметить, что недавно зависимость активирующего действия Са2+ на Са-каналы CP от концентрации АТФ в среде была продемонстрирована и для изоформ RyR2 (Yang, Steele, 2000) и RyR3 (Manuta et al., 2000).

Таблица 3. Значения Ko,s (мМ) для АМФ- и р.у-СНг-АТФ-индудирусмого выброса Са2+ из везикул тяжелого CP скелетных мышц кролика и максимальное количество освобождаемого Са2+ (Амакс, нмоль/мг белка), полученные при использовании неадениловых нуклеотидов для активной нагрузки везикул CP кальцием

Индуктор выброса Ca2* Используемый в качестве субстрата Са-АТФазы нуклеотид

ГТФ УТФ ИТФ ЦТФ

ЬСо.5 Амакс К0.5 Амакс Ко.5 Амакс Ко.5

АМФ 0,10 20 0,47 24 0,52 28 0,80 32

В,у-СНГАТФ неопр. 0,21 23 0,32 30 0,52 35

При исследовании выброса Са2+, индуцируемого Ру-СН2-АТФ и АМФ было установлено, что параметры выброса Са2+ из СР зависят от того, какой неадениловый нуклеотид был использован в качестве субстрата для аккумуляции Са2+. Так, значения К0,5 для АМФ при использовании в качестве субстратов Са-насоса ГТФ и УТФ различались в 8 раз, а максимальное количество освобождаемого из СР Са2+ различалось в 1,5 раза (Таблица 3). Во всех случаях зависимость величины Амакс от концентрации Ру-СН2-АТФ или АМФ имела сигмоидальный характер (коэффициент Хилла 1,8-2), т.е. связывание адениловых нуклеотидов с Са-каналами СР характеризуется положительной кооперативностью, что отражает кооперативные взаимодействия между отдельными субъединицами в олигомерном комплексе Са-канала СР, каждая из которых имеет нуклеотидсвязывающий участок. По-видимому, обнаруженные различия в величинах К0,5 для Ру,-СП2-АТФ и АМФ отражают конкуренцию адениловых и неадениловых нуклеотидов за участки связывания на молекуле Са-каналов. Исходя из полученных нами данных, сродство нуклеотидсвязывающих центров Са-каналов СР к неадениловым нуклеотидам уменьшается в следующем ряду: ЦТФ>ИТФ>УТФ>ГТФ, так как значения К0>5 для АМФ и ру-СН2-АТФ в этом ряду

также уменьшаются. Различия в количестве освобождаемого из СР Са2+, по-видимому, отражают различия в количестве аккумулируемого везикулами СР Са2+ при работе Са-АТФазы с разными нуклеотидами. При использовании в качестве субстратов Са-насоса разных нуклеотидов величина Амшсс составляет 55-60% от общего количества Са накопленного везикулами СР к моменту внесения в среду Ру-СН2-АТФ или АМФ.

Полученные результаты позволяют заключить, что с Са-каналами СР связываются как адениловые, так и неадениловые нуклеотиды, но только связывание адениловых нуклеотидов обеспечивает поддержание активной конформации Са-каналов. Именно поэтому Са-индуцируемый и кофеин-индуцируемый выброс Са2+ из СР удается получить только при использовании АТФ для активной нагрузки везикул СР кальцием. Тот факт, что утечка Са2+ из везикул СР после истощения субстрата не ингибируется рутениевым красным, позволяет заключить, что Са-каналы СР не вовлечены в этот процесс. По-видимому, в мембранах СР существует другой, альтернативный путь для облегченного выхода Са2+ из ретикулума. Интересно отметить, что скорость выхода Са2+ из СР по этому пути зависит от типа присутствующего нуклеотида: в среде с АТФ (точнее, в присутствии продуктов его гидролиза) скорость утечки Са2+ примерно в 2 раза выше, чем в среде с ГТФ или ЦТФ и в 5 раз выше, чем в среде с УТФ (Таблица 3). Поскольку основным белковым компонентом мембран тяжелой фракции СР, используемой в наших экспериментах, является Са-АТФаза, естественно предположить, что именно она создает этот путь для облегченного выхода Са2+, тем более что Са-АТФаза способна связывать все используемые нами нуклеотиды. Можно также предположить, что связывание с этим ферментом разных нуклеотидов индуцирует разные конформационные состояния его молекулы и/или влияет на характер взаимодействия мономеров в олигомерных комплексах фермента (Andersen, 1989), что и обеспечивает разную скорость утечки Са2+ из СР.

Для проверки этих предположений необходимо было выяснить, как влияет связывание разных нуклеотидов на конформационное состояние молекулы Са-АТФазы, действительно ли фермент присутствует в мембранах СР в виде олигомерных комплексов и влияет ли образование олигомерных комплексов Са-АТФазы на проницаемость мембран СР для Са2+.

5. Нутеотидсвязывающие свойства Са-АТФазы СР и влияние лигандов на конформационное состояние молекулы фермента. Анализ модификации SH-групп Са-АТФазы препаратов легкой фракции СР арилирующим агентом 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом (НБД-хлоридом) показал, что при нейтральных значениях рН НБД-хлорид избирательно модифицирует SH-группы фермента. После разделения меченых НБД-хлоридом белков СР с помощью ЭФ в ПААГ в денатурирующих условиях метка была обнаружена только в белковой полосе Са-АТФазы. Процесс модификации SH-ipynn Са-АТФазы не описывается одной экспонентой, что говорит о наличии в молекуле фермента более чем одного кинетического типа SH-групп. В используемых условиях для НБД-хлорида доступно 11-12 молей SH-групп на моль фермента (расчет проводили с учетом содержания белка Са-АТФазы в мембранах СР) из 24, имеющихся в его молекуле. Эти группы примерно поровну делятся на 2 кинетических типа, скорость модификации которых различается в 7-8 раз (Таблица 4). Добавление различных лигандов, связывание которых с Са-АТФазой стабилизирует фермент в одном из

промежуточных конформационных состояний реакционного цикла, не изменяет общего количества доступных для модифицирующего агента вН-групп, но оказывает значительное влияние как на количество быстрых и медленных БН-групп, так и на скорость их модификации НБД-хлоридом.

Добавление Са2+ (конформация Е1-Са2+) приводит к увеличению количества быстрых БН-групп и скорости их модификации НБД-хлоридом и к соответствующему уменьшению количества медленных ЙН-групп без изменения скорости их модификации. Эти изменения индуцируются Са2+ при его связывании во взаимодействующих центрах Са-АТФазы с высоким сродством (К0>5» 5-10"7 М и пн = 1,9); близкие изменения обнаруживаются в присутствии ионов М^.

Таблица 4. Влияние лигандов на кинетические характеристики БН-групп Са-АТФазы (п; и пг - количество ЭН-групп быстрого и медленного типа соответственно (моль/моль Са-АТФазы), к] и кг- константы скорости модификации быстрых и меделнных БН-групп НБД-хлоридом соответственно (мин"1))

Состав среды П1 к, п2 к,

Без добавок 5,9 0,114 5,1 0,017

+ 3 мМ АТФ 2,6 0,074 8,4 0,016

+ 3 мМ АДФ 3,1 0,078 8,0 0,016

+ ЗмМГТФ* 5,9 0,118 5.4 0,017

+ 3 мМ МкСЬ 7,6 0,122 3,9 0,021

+ 3 мМ МйС12 +3 мМ АТФ 2,5 0,065 8,6 0,018

+ 3 мМ МйС12 +3 мМ АДФ 3,3 0,073 7,9 0,017

+ 3 мМ МйС12 + 3 мМ ГТФ 8,1 0,124 3,6 0,022

+ 0,5 мМ СаС12 7,5 0,183 3,8 0,016

+ 0,5 мМ СаС12 + 3 мМ АТФ - . 11,3 0,011

+ 0,5 мМ СаС12 + 3 мМ АДФ - - 11,4 0,011

+ 0,5 мМ СаС12 + 3 мМ ГТФ 7,4 0,154 4,0 0,019

Примечание: В Таблице представлены данные о влиянии ГТФ на кинетические параметры БН-групп Са-АТФазы СР. При использовании ИТФ, УТФ, ЦТФ, ацетилфосфата и пНФФ были получены близкие значения, характеризующие кинетические параметры ЭН-групп.

Добавление в среду неадениловых нуклеотидов и субстратов фермента ненуклеотидной природы - ацетилфосфата и пНФФ (как в отсутствие, так и в присутствии ионов Са2+ и 1^2+) практически не влияет на кинетические характеристики БН-групп, хотя связывание этих соединений также должно стабилизировать Е1-конформацию молекулы фермента. В то же время, связывание с ферментом АТФ или АДФ в отсутствие двухвалентных катионов и в присутствии ионов М82+ значительно снижает количество быстрых БН-групп Са-АТФазы и уменьшает константу скорости их модификации, а в присутствии Са2+ все доступные для НБД-хлорида БН-группы переходят в медленный тип (Таблица 4). Связывание Са2+, АТФ и АДФ индуцирует значительные конформационные перестройки молекулы фермента. Несмотря на то, что эти лиганды стабилизируют фермент в конформации Е1, кинетические характеристики доступных для НБД-хлорида БН-групп в присутствии двухвалентных катионов и адениловых нуклеотидов существенно различаются. Поэтому можно говорить о специфическом влиянии лигандов на конформационное состояние Е1-конформера Са-АТФазы, выражающемся в изменении кинетических параметров его вН-групп. Следует подчеркнуть, что связывание только АТФ или АДФ, но не других субстратов Са-

АТФазы, индуцирует значительные изменения конформации молекулы фермента, особенно в присутствии ионов Са2+, т.е. только адениловые нуклеотиды обладают способностью индуцировать эти конформационные изменения. Важно также отметить, что для изменения конформации достаточно связывания АТФ или АДФ в соответствующих центрах молекулы фермента.

Подробный анализ влияния АТФ на кинетические характеристики SH-групп Са-АТФазы показал, что значительное изменение конформации молекулы фермента индуцируют относительно высокие концентрации нуклеотида. В присутствии низких концентраций АТФ (до 100 мкМ) количество медленных SH-групп увеличивалось незначительно, а при дальнейшем росте концентрации нуклеотида наблюдался резкий рост количества медленных групп с Ко,5« 345 ± 35 мкМ и Пн = 3,1 ± 0,1. Это говорит о том, что АТФ вызывает значительные перестройки конформации Са-АТФазы, связываясь с центрами с относительно низким сродством, причем это связывание характеризуется положительной кооперативностью.

Модификация SH-групп Са-АТФазы НБД-хлоридом приводит к инактивации фермента, причем скорость инактивации значительно (в 3-5 раз) превышает скорость модификации зарегистрированных нами быстрых SH-групп Са-АТФазы (константа скорости инактивации составила 0,4-0,6 мин"1 в разных условиях). Если предположить, что Са-АТФаза функционирует в мембранах CP в виде олигомерных комплексов, такая скорость инактивации фермента может свидетельствовать о «выключении» из работы всего олигомерного комплекса фермента (например, тетрамера) при инактивации одной из субъединиц после модификации ее SH-групп НБД-хлоридом. Аналогичные результаты были получены при анализе инактивации Са-АТФазы CP дициклогексилкарбодиимидом (Pick, Racker, 1979) и при исследовании модификации фермента N-пиренил-малеимидом (Ludi, Hasselbach, 1982). С другой стороны, нельзя исключить, что среди быстрых SH-групп имеется одна «гиперреактивная» группа с высокой скоростью модификации, параметры которой мы не можем четко зарегистрировать в наших условиях.

Анализ влияния лигандов на скорость инактивации Са-АТФазы НБД-хлоридом показал, что ни двухвалентные катионы, ни неадениловые нуклеотиды или субстраты ненуклеотидной природы не препятствуют инактивации фермента. Таким образом, изменение конформации Са-АТФазы в присутствии Са2+ или Mg2* не «защищает» фермент от инактивации НБД-хлоридом. Снижение скорости инактивации Са-АТФазы при модификации SH-групп фермента НБД-хлоридом наблюдалось только в присутствии АТФ и АДФ, причем скорость инактивации фермента прогрессивно падала при увеличении концентрации адениловых нуклеотидов. Это позволило нам рассчитать значения кажущихся Кд для тех центров, связывание АТФ и АДФ в которых защищает фермент от инактивации НБД-хлоридом согласно кинетической модели, предложенной Eckert et al. (1977). Как видно из рис. 8, графики зависимости k;/kjL (соотношение констант скоростей инактивации фермента в отсутствие и в присутствии нуклеотида) от концентрации АТФ и АДФ не описываются одной прямой. Это говорит о гетерогенности нуклеотидсвязывающих участков фермента в препаратах легкой фракции СР. На графиках можно выделить две популяции точек - в области низких (примерно до 100 мкМ) и высоких (более 100 мкМ) концентраций АТФ и АДФ. Расчеты показали, что в области низких концентраций адениловых нуклеотидов защита Са-АТФазы от инактивации НБД-хлоридом обеспечивается при связывании

нуклеотидов в участках с кажущимися значениями Кд в диапазоне 30-50 мкМ для АТФ и 40-60 мкМ для АДФ, причем эти значения практически не зависят от температуры в диапазоне 5-37°С (Таблица 5). В области высоких концентраций нуклеотидов их защитное действие проявляется при взаимодействии с центрами, сродство которых для АТФ и АДФ существенно ниже.

Рис. 8. Графики зависимости кД,1* от концентрации нуклеотида для АТФ (а) и АДФ (б), используемые для расчета значений кажущихся Кд нуклеотидсвязываю-щих центров Са-АТФазы, связывание АТФ и АДФ в которых защищает фермент от инактивации НБД-хлоридом.

Таблица 5. Значения кажущихся Ка для АТФ и АДФ, рассчитанные по защите Са-АТФазы нуклеотидами от инактивации НБД-хлоридом

Нуклеотид Температура, °С Кд', мкМ Кд, мкМ

АТФ 5 49 ±11 673 + 42

25 32 ±13 290 ±21

37 35 ±15 223 ±29

АДФ 5 55 + 16 388 ±54

25 60+12 270 ±35

37 45 ±19 195 + 28

Анализ инактивации Са-АТФазы НБД-хлоридом показал, что из всех используемых нами лигандов только АТФ и АДФ способны защищать фермент от инактивации этим сульфгидрильным агентом. Кроме того, в мембранных препаратах Са-АТФазы присутствуют два типа нуклеотидсвязывающих участков с разным сродством к нуклеотидам. Важно подчеркнуть, что эти центры существуют одновременно и принадлежат, вероятно, Е1-конформеру фермента, так как эти опыты проводились в условиях, исключающих работу Са-АТФазы (отсутствие двухвалентных катионов, использование АДФ). Как говорилось выше, связывание АТФ и АДФ в центре с низким сродством индуцирует значительные изменения конформации молекулы Са-АТФазы.

НБД-хлорид позволяет не только определять кинетические характеристики SH-ipynn Са-АТФазы, но и исследовать флуоресценцию меченого фермента, так как S-НБД-производное обладает выраженной флуоресценцией с максимумом в области 525 нм (Bailin, Huang, 1990). Для включения метки был использован подход, позволяющий избирательно модифицировать единственный остаток цистеина (Cys344) в молекуле Са-АТФазы (Wakabayashi et al., 1990). Уровень включения НБД-хлорида в Са-АТФазу в наших условиях составил 0,75±0,04 моль/моль Са-АТФазы; при этом сохранялось около 90% активности фермента. Как видно из рис. 9, флуоресценция меченых НБД-хлоридом препаратов Са-АТФазы обладает высокой чувствительностью к конформационному состоянию фермента, что хорошо согласуется с литературными данными (Wakabayashi et al.,

1990). Так, увеличение рН среды от 6,0 (Са-АТФаза находится преимущественно в Е2-конформации) до 8,0 (Са-АТФаза находится преимущественно в Е1-конформации) приводит к почти двукратному увеличению интенсивности флуоресценции.

+ЛТФ

(of)

+ЛТФ +ЛТФ (Oil (Of)

'JT

Рис. 9. Изменение флуоресценции Са-АТФазы СР, избирательно меченой НБД-хлоридом, при связывании Са2+, АТФ и ортованадата при рН среды 6,0 (а), 7,0 (б) и 8,0 (в).

При всех значениях рН среды Е2-конформацию фермента с низким уровнем флуоресценции можно стабилизировать, добавив известный ингибитор АТФаз Р-типа ортованадат (Dux, Martonosi, 1983). Переход фермента в конформацию Е1 с высоким уровнем флуоресценции можно индуцировать как увеличением рН среды, так и добавлением в среду микромолярных концентраций ионов Са2+, АТФ или АДФ. Ионы Mg2+ также сдвигают равновесие между конформерами Са-АТФазы в сторону Е1-конформации, однако уровень флуоресценции при этом изменяется не так значительно (не показано).

Анализ концентрационной зависимости влияния АТФ на интенсивность флуоресценции НБД-меченой Са-АТФазы показал, что АТФ индуцирует изменение конформации фермента при связывании в центре с высоким сродством (Таблица 6). Важно подчеркнуть, что сродство этого участка к АТФ практически не зависит от конформационного состояния молекулы фермента: АТФ связывается с высоким сродством как с Е1-, так и с Е2-конформерами Са-АТФазы. Высокие концентрации АТФ в наших условиях не вызывают каких-либо заметных изменений интенсивности флуоресценции меченого фермента. Можно предположить, что изменение конформации определенных доменов молекулы Са-АТФазы при Е1-Е2 переходе оказывает максимальное влияние на микроокружение НБД-хлорида, связанного с остатком Cys-344. В то же время, обнаруженные нами ранее изменения конформации Са-АТФазы, индуцируемые связыванием АТФ в участках с низким сродством, практически не затрагивают микроокружения этого остатка цистеина.

Таблица 6. Значения кажущихся Кд для АТФ, рассчитанные с использованием мембранных препаратов Са-АТФазы, специфически меченных НБД-хлоридом

Условия Конформадия Са-АТФазы Кд, мкМ AF (%)

рН6,0 Е2 13,9 ±2,3 81,6 ±4,2

рН 6,0 + СаСЬ Е1 23,7 ±12,6 14,7 + 1,9

рН6,0 + МйС12 Е1 32,7 ± 13,3 60,6 ±3,9

рН 8,0 Е1 9,1 ±2,8 13,5 ±3,5

В отличие от связывания АТФ, связывание с Са-АТФазой ГТФ, ЦТФ, ИТФ и УТФ как в отсутствие, так и в присутствии двухвалентных катионов практически

не влияет на интенсивность флуоресценции НБД-меченых препаратов фермента (не показано). По-видимому, связывание неадениловых нуклеотидов либо не сдвигает равновесия между Е2- и Е1-конформерами Са-АТФазы, либо конформации, которые принимает фермент при связывании адениловых и неадениловых нуклеотидов, различаются между собой, хотя обе эти конформации можно отнести к состоянию Е1 (высокое сродство к Са2+ и доступность Са-связывающих центров с цитоплазматической стороны мембраны СР). Как говорилось выше, реакционная способность вН-групп Са-АТФазы в присутствии Са2+ или АТФ существенно различается (Таблица 4), хотя и в этом случае конформация молекулы фермента может быть отнесена к Е1 состоянию.

Полученные результаты позволяют сделать несколько заключений. Во, первых, АТФ и АДФ обладают специфическим влиянием на конформационное состояние Са-АТФазы, которым не обладают неадениловые нуклеотиды. Во-вторых, конформация Са-АТФазы изменяется уже при связывании АТФ и для проявления этого эффекта не требуется гидролиза нуклеотида. В-третьих, центры с высоким сродством к АТФ (вероятно, активный центр фермента) в конформационных состояниях Е1 и Е2 обладают близкими характеристиками. В-четвертых, в препаратах СР одновременно присутствуют принадлежащие Са-АТФазе центры с высоким и низким сродством к АТФ, что указывает на гетерогенность молекул фермента в мембранах ретикулума.

6. Гидролиз разных субстратов Са-АТФазой СР. Мы установили, что из всех нуклеотидов и субстратов ненуклеотидной природы, которые могут использоваться Са-АТФазой СР, только АТФ обладает способностью оказывать специфическое влияние на конформационное состояние молекулы фермента. Было также показано, что в препаратах СР Са-АТФаза имеет участки связывания АТФ как с высоким, так и с низким сродством. Анализ работы фермента при использовании субстратов разной природы показал, что скорость гидролиза Са-АТФазой пНФФ и ГТФ гиперболически зависит от концентрации субстрата, что позволяет рассчитать кинетические параметры гидролиза этих соединений с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен (Таблица 7). В то же время гидролиз АТФ характеризуется наличием промежуточного плато на графике зависимости активности фермента от концентрации субстрата и последующим значительным увеличением активности (рис. 10), что хорошо согласуется с известными из литературы данными (Уататои», Топотига, 1967; Бе Ме1в, 1пез1, 1982). Это подтверждает наш вывод о том, что в мембранах СР Са-АТФаза может одновременно существовать в двух . разных состояниях (формах), различающихся по сродству АТФ-связывакмцего (активного) центра к этому субстрату, и эти формы имеют разные кинетические параметры гидролиза АТФ.

Известно, что в СР быстрых скелетных мышц млекопитающих присутствует единственная изоформа Са-АТФазы - 8ЕЯСА1 (Мо11ег й а1., 1996). Поскольку с молекулой Са-АТФазы связывается только одна молекула АТФ (Бе Ме1з, Шее!, 1982), кажется маловероятным существование второго (аллостерического) АТФ-связывающего центра, взаимодействие АТФ с которым приводит к дополнительной активации фермента; эти выводы подтверждаются данными рентгсноструктурного анализа (ТоуовЫта е1 а1., 2000). Поскольку гетерогенность АТФ-связывающих участков обнаружена нами в условиях, исключающих гидролиз АТФ, ее нельзя объяснить взаимодействием субстрата с промежуточными интермедиатами (например, с Е2 конформером фермента), возникающими только в

ходе реакционного цикла Са-АТФазы (White, Dewey, 1987; Champeil et al., 1988), АТФ-связывающие центры которых имеют низкое сродство к АТФ. Более того, согласно нашим данным, сродство Е1- и Е2-конформсров Са-АТФазы к АТФ практически не различается (Таблица 6).

14

- \

VmaxM з 4 М su"*^ «7ДЗ

Km - 7,8 ыкМ Jra Кн 822 мхМ

пи»3,в7

гр

I } . я. .......

[АТФ]. мМ • среде измерения активности

0.0 0,5 1.0 1,5 2,0 2,5 3.0 [АТФ). мМ е ФОДв изменения «амеивсти

Рис. 10. Зависимость скорости гидролиза АТФ мембранными препаратами Са-АТФазы легкой фракции CP (А) и Са-АТФазой, солюбилизированной СпЕ$ (Б) от концентрации субстрата. Сплошные и пунктирные линии на графиках представляют собой оптимальные расчетные кривые, параметры которых указаны на графиках (на графике А сплошная линия 1 является суммой пунктирных линий 2 (гипербола) и 3 (сигмоида)).

Все сказанное позволяет заключить, что в мембранах CP одновременно Присутствуют две популяции молекул одной изоформы фермента, разлетающиеся АТФ-связывающими свойствами и кинетическими параметрами, характеризующими гидролиз этого субстрата. Наиболее вероятным объяснением такой гетерогенности Са-АТФазы является существование в мембранах CP ее разных олигомерных форм, о чем говорят многочисленные литературные данные (Maguire, Ohlendieck, 1996; Lennon et al., 1999; Harmon et al., 2001). В таком случае модель, с помощью которой можно было бы описать функционирование Са-АТФазы в мембранах CP, выглядит следующим образом. В мембранах ретикулума Са-АТФаза присутствует в двух состояниях: в виде мономеров, связывающих АТФ с высоким сродством (первыедесятки микромолей) й гидролизутощих его согласно кинетике Михаэлиса-Ментен, и в виде олигомерных комплексов, кооперативно связывающих АТФ с низким сродством (сотни микромолей). В таком случае гидролиз АТФ мембранными препаратами Са-АТФазы CP можно описать суммой уравнений Михаэлиса-Ментен (мономер) и Хилла (олигомер). Действительно, наши экспериментальные данные хорошо описываются суммой этих двух уравнений с коэффициентом корреляции г2 = 0,95-0,98. Исходя из полученных значений коэффициента Хилла, можно заключить, что олигомерные комплексы Са-АТФазы являются, скорее всего, тетрамерами. Другие субстраты Са-АТФазы (неадениловые нуклеотиды и субстраты ненуклеотидной природы, в частности, ГТФ и пНФФ) гидролизуются либо только мономерной формой фермента, либо и мономерной и олигомерной формами. Поскольку связывание этих субстратов не оказывает влияния на конформационнос состояние молекулы фермента, кооперативные взаимодействия между мономерами в составе олигомерных комплексов не проявляются, т.е. параметры гидролиза этих субстратов мономерной и олигомерной формами фермента одинаковы (Таблица 7).

Обработка мембранных препаратов Са-АТФазы СР еолюбилизирующими концентрациями неионного детергента С12Е9 приводит к резкому изменению кинетических параметров гидролиза АТФ: промежуточное плато на графике зависимости активности фермента от концентрации субстрата исчезает и эта зависимость хорошо описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (рис. 10, Б; Таблица 7). Активность Са-АТФазы при этом практически не изменяется, а значение Км для АТФ несколько возрастает, но, тем не менее, хорошо соответствует таковому для мономерной формы фермента. Таким образом, обработка С12Е9 в наших условиях разрушает олигомерные комплексы фермента, переводя всю Са-АТФазу в мономерное состояние, что подтверждает высказанную нами гипотезу.

Предложенная модель функционирования Са-АТФазы в мембранах СР позволяет адекватно описать кинетическое поведение фермента и подвергается экспериментальной проверке. Для ее подтверждения необходимо показать присутствие в мембранах нативных препаратов СР как олигомеров, так и мономеров Са-АТФазы и попытаться найти агенты, избирательно взаимодействующие с каждой из форм фермента.

Таблица 7. Кинетические параметры гидролиза разных субстратов Са-АТФазой

Температура Субстрат к„ ^макс К0.5 VH nH

37°С пНФФ 3,3 ± 0,1 145 ±9 -

ГТФ 211 ±18 4,2 ±0,4 - - -

АТФ + С[2Е9 26,3 ±4,8 10,1 ±0,5 -

АТФ 12,4 ±1,7 4,9 ±0,1 529 ±26 7,3 ±0,1 3,2 ±0,3

25°С АТФ 17,5 ±2,3 2,1 ±0,2 522 ±34 3,8 ±0,1 3,9 ±0,3

15°С АТФ 25,5 ±6,1 0,7 ±0,1 845 ±41 1,6 ±0,1 3,3 ±0,2

Примечание: Параметры гидролиза пНФФ и ГТФ мембранными препаратами Са-АТФазы и гидролиза АТФ солюбилизированной С12Е9 Са-АТФазой были рассчитаны по уравнению Михаэлиса-Ментен; параметры гидролиза АТФ мембранными препаратами Са-АТФазы рассчитывали согласно модели «мономер + олигомер» (уравнение Михаэлиса-Ментен + уравнение Хилла). Значения Км и Vuaa для гидролиза пНФФ выражены в мМ и нмоль/мин на мг белка соответственно, а для гидролиза ГТФ и АТФ - в мкМ и мкмоль/мин на мг белка соответственно.

7. Олигомерная организация Са-АТФазы СР. Одним из широко используемых методов исследования олигомерной организации мембранных белков является электронная микроскопия (Castellani et al., 1985; Franzini-Armstrong, Ferguson, 1985; Taylor et al., 1986). Один из вариантов этого метода - скол замороженных образцов в вакууме - был использован в наших экспериментах. При этом, используя среды с разным ионным составом, фермент переводили в одно из его основных конформационных состояний (El или Е2), инкубировали образцы при 37°С и быстро замораживали в токе жидкого азота, фиксируя Са-АТФазу в нужном конформационном состоянии.

Как видно из рис. 11, А, при фиксировании Са-АТФазы в конформационном состоянии El в мембранах СР, особенно на вогнутых поверхностях сколов, соответствующих наружному монослою мембраны, отчетливо видны достаточно крупные частицы диаметром около 10 нм и плотностью около 5000/мкм2, что полностью соответствует данным литературы (Baskin, Kawamoto, 1984). Аналогичная в качественном и количественном плане картина наблюдается и для препаратов СР при фиксировании Са-АТФазы в Е2 конформационном состоянии

(не показано). Таким образом, в мембранах CP действительно присутствуют стабильные олигомерные комплексы Са-АТФазы, скорее всего, тетрамеры, поскольку число молекул фермента на единицу поверхности мембраны CP (в расчете на мономер) составляет от 17000 до 25000/мю»г (Scales, Inesi, 1976), что в 3-5 раз превышает число обнаруженных нами мембранных частиц. По-видимому, переходы молекулы фермента из конформационного состояния El в состояние Е2 не сопровождаются заметным изменением олигомерной организации Са-АТФазы, поэтому предположения ряда авторов об образовании временных олигомерных комплексов Са-АТФазы только на определенных стадиях реакционного цикла кажутся маловероятными (Andersen, 1989; Kijima et al., 1990). Анализ влияния на олигомерную организацию Са-АТФазы несолюбилизирующих концентраций неионного детергента CuEj показал (рис. 11, Б), что в мембранах CP, обработанных детергентом, практически отсутствуют мембранные частицы диаметром 10 нм, обнаруженные в нативных препаратах.

А Б

Рис. 11. Электронные микрофотографии препаратов нативных мембран CP, в которых Са-АТФаза зафиксирована в конформационном состоянии El (А), и препаратов CP, обработанных неионным детергентом С12Е9 в концентрации 0,5% (Б).

Итак, в нативных мембранах CP присутствуют стабильные олигомерные комплексы Са-АТФазы, количество которых не зависит от конформационного состояния молекулы „ фермента. _ Эти.. олигомерные - комплексы - разрушаются в присутствии низких (несолюбилизирующих) концентраций неионного детергента С12Е9.

Сшивающие агенты, катализирующие образование S-S-связей между входящими в состав олигомерных комплексов молекулами белков, также широко используются для анализа олигомерной организации мембранных ферментов, в том числе Са-АТФазы CP (Murphy, 1976; Baskin, Hanna, 1979; Napier et al., 1987). В качестве такого агента мы использовали о-фенантролин в присутствии ионов меди. Как видно из рис. 12, инкубация мембранных препаратов CP с о-фенантролином приводит к значительному уменьшению площади белковой полосы Са-АТФазы (пик 1 на рис. 12, Б и В) и к появлению новых полос высокомолекулярных белковых агрегатов с массами около 240, 300, 400 и 500 ¡Да (пики 2-5 соответственно на рис. 12, Б и В), которые представляют собой ковалентно сшитые димеры, тримеры, тетрамеры и пентамеры Са-АТФазы.

Процесс убыли белка в полосе Са-АТФазы удовлетворительно описывается суммой двух экспоненгг. Скорость «сшивания» для быстрой (40-50% белка) и медленной (50-60% белка) составляющих различается в 8-10 раз. Это хорошо согласуется с нашим предположением о присутствии в мембранах CP двух

популяций Са-АТФазы - мономеров, ковалентные сшивки между которыми образуются более медленно, и олигомеров, которые сшиваются быстрее. Введение в пробы органических растворителей - этанола или диэтилового эфира, увеличивает скорость образования ковалентных сшивок как для быстрой, так и для медленной составляющих. Низкие концентрации С12Е9 наоборот, замедляют процесс образования сшивок, причем это происходит главным образом за счет увеличения доли медленной составляющей (до 80-90%). Это хорошо согласуется с данными электронной микроскопии, согласно которым С12Е9 ' в несолюбилизирующих концентрациях разрушает олигомерные комплексы в мембранах СР. Локальные анестетики лидокаин и тетракаин резко увеличивают скорость образования ковалентных сшивок, индуцируя агрегацию Са-АТФазы в мембранах СР.

В

г m

I ill

Рис. 12. Электрофореграммы СР до (1) и после инкубации с о-фенантролином в присутствии ионов меди в течение 10 (2), 20 (3), 30 (4), 40 (5), 50 (6) и 60 (7) мин; белки-стандарты нанесены на дорожку 8, стрелками показаны высокомолекулярные белковые полосы, появляющиеся в результате ковалентного сшивания Са-АТФазы (А). Денситограммы дорожек 1 (Б) и 7 (В) (объяснения в тексте).

Анализ кинетики затухания анизотропии фосфоресценции триплетных меток, ковалентно связанных с функциональными группами белков, в микросекундном временном интервале после импульсного возбуждения лазерной вспышкой, является одним из наиболее адекватных методов изучения вращательной подвижности белковых молекул в биологических мембранах (Burkli, Cherry, 1981; Birmachu, Thomas, 1990). Поскольку этот метод позволяет оценить размер вращающихся в мембране частиц, с его помощью можно анализировать олигомерную организацию мембранных белков, в частности, Са-АТФазы. Кроме того, имеется целый ряд фосфоресцентных меток, позволяющих избирательно модифицировать молекулу Са-АТФазы по определенным аминокислотным остаткам (Squier et al., 1987; Murphy, 1988; Bigelow, Inesi, 1992).

В качестве таких меток были выбраны ЭИТЦ и ИАЭ. В наших условиях ЭИТЦ избирательно модифицировал остаток Lys515 в молекуле Са-АТФазы, находящийся в АТФ-связывающем домене фермента. Йодацетамид и его производные, используемые для химической модификации Са-АТФазы, взаимодействуют главным образом с остатками Cys670 и Cys674, причем модификация этих остатков не затрагивает активности фермента (Squier et al., 1987; Bigelow, Inesi, 1992). Для измерения анизотропии фосфоресценции использовались препараты фермента, меченые как ЭИТЦ, так и ИАЭ, причем условия

модификации подбирались таким образом, чтобы уровень включения метки в белок не превышал 0,5-1,0 моль/моль Са-АТФазы. В случае с ЭИТЦ это позволяло работать с ферментом, сохранившим около 50% активности, когда половина молекул была немодифицированной и сохраняла способность связывать АТФ. Величина начальной анизотропии фосфоресценции в наших экспериментах составила 0,11 ± 0,1 для ЭИТЦ-меченой Са-АТФазы и 0,13 ± 0,1 для ИАЭ-меченой Са-АТФазы, что хорошо согласуется с величинами, характерными для Са-АТФазы, меченой производными эритрозина (Birmachu, Thomas, 1990).

Полученные в наших экспериментах кривые затухания фосфоресценции наилучшим образом описывались двухэкспоненциальной функцией с остаточным членом. Такой многоэкспоненциальный характер затухания фосфоресценции объясняется присутствием в мембране нескольких популяций меченых молекул -мономеров, олигомеров разного состава (димеров, тетрамеров и т.д.) и крупных белковых агрегатов (Burkli, Cherry, 1981; Birmachu, Thomas, 1990). Поскольку вращение даже крупных белковых молекул в растворе и сегментальная подвижность отдельных доменов растворимых и интегральных мембранных белков происходит в наносекундном временном интервале, наблюдаемые в микросекундном интервале времена вращательной корреляции относят обычно к вращению мономеров и олигомеров мембранных белков вокруг оси, перпендикулярной плоскости мембраны.

Для оценки состояния Са-АТФазы в мембранах CP проанализировали влияние на параметры анизотропии меченого белка ряда соединений, изменяющих подвижность мембранных белков. Так, глицерин в высоких концентрациях индуцирует агрегацию мембранных белков, а диэтиловый эфир и неионные детергенты, наоборот, снижают микровязкость липидного бислоя мембран и разрушают олигомерные комплексы, увеличивая подвижность белковых молекул (Birmachu, Thomas, 1990). Увеличение концентрации глицерина в среде приводило к снижению вклада быстро и медленно вращающихся компонент в общую анизотропию при параллельном росте остаточной анизотропии. Диэтиловый эфир, напротив, значительно снижал величину остаточной анизотропии и увеличивал анизотропию вращающихся компонент. Введение в среду низких концентраций неионного детергента Q2E9 резко „меняло картину: затухание анизотропии становилось одноэкспоненциальным (Таблица 8).

Таблица 8. Влияние лигандов на параметры анизотропии фосфоресценции ЭИТЦ-меченой

Са-АТФазы CP (Ai и А2 - нормализованное значение анизотропии быстро и медленно вращающихся компонент соответственно, А» - нормализованная остаточная анизотропия (общая анизотропия принята за единицу), (pi и ср2 - время вращательной корреляции быстро и медленно вращающихся компонент соответственно (мкс))

Состав среды Конформация Са-АТФазы At ф! А2 <Р2 Асе

Без добавок Е2 0,38 17 0,28 174 0,34

+ 60% глицерин Е2 0,32 19 0,18 314 0,50

+ 6% эфир Е2 0,53 14 0,33 220 0,14

+ 0,5% С12Е9 Е2 0,73 10 - - 0,27

+ 5 мМ Ф„ Е2 0,48 15 0,23 284 0,29

+1 мМ СаС12 El 0,48 13 0,31 140 0,21

+ 1 мМ СаСЬ + 3 мМАТФ El 0,48 14 0,33 148 0,19

Полученные данные позволяют заключить, что в мембранах CP Са-АТФаза представлена несколькими популяциями молекул, каждая из которых вносит свой вклад в общую анизотропию. На долю быстро вращающейся компоненты (время вращательной корреляции <pi в разных условиях от 10 до 19 мкс) приходится 4045% от величины общей анизотропии. Считая, что пронизывающая мембрану часть молекулы Са-АТФазы представляет собой правильный цилиндр, вращающийся вокруг оси, перпендикулярной плоскости мембраны, и что вращение этого цилиндра зависит только от вязкости липидного бислоя мембраны CP, можно рассчитать диаметр этого цилиндра, который составляет от 4,4 до 6,5 нм. Диаметр медленно вращающейся частицы, рассчитанный исходя из значения времени вращательной корреляции (р2, составляет в разных условиях от 10,2 до 16,8 нм.

Согласно литературным данным, диаметр мономера Са-АТФазы, измеренный с помощью дифракции нейтронов или рентгеновских лучей, составляет около 5,5 нм (Herbette et al., 1985). Размер димеров Са-АТФазы, являющихся минимальной единицей индуцированных ванадатом двумерных кристаллов фермента, был определен с помощью электронной микроскопии и составил 6,6 х 11,4 нм (Taylor et al., 1984). И, наконец, диаметр внутримембранных частиц, предположительно тетрамеров Са-АТФазы, определенный с помощью электронной микроскопии, составляет от 9,0 до 13,3 нм (Baskin, Kawamoto, 1984; Franzini-Armstrong, Ferguson, 1985). Исходя из рассчитанных нами размеров вращающихся частиц, можно заключить, что быстрая компонента затухания анизотропии отражает вращение в мембране мономеров Са-АТФазы. Медленная компонента, скорее всего, отражает вращение в мембране димеров или тетрамеров фермента. Поскольку и димер, и тетрамер Са-АТФазы не являются истинными цилиндрами, и поскольку конформация гидрофобного домена молекулы Са-АТФазы может изменяться в присутствии разных лигандов, определенный разброс во времени вращательной корреляции медленной компоненты вполне объясним. Остаточная анизотропия отражает присутствие в мембранах CP крупных белковых агрегатов, движение которых происходит слишком медленно, чтобы быть зарегистрированным в используемом временном интервале. Нельзя исключить, что эти агрегаты образуются в процессе инкубации мембран CP с фосфоресцентными метками. Поскольку они не разрушаются в присутствии низких концентраций неионного детергента (Таблица 8), можно полагать, что молекулы Са-АТФазы в таких агрегатах прочно (возможно, ковалентно) связаны друг с другом. Близкие значения параметров вращения мономеров и олигомеров Са-АТФазы были получены при использовании второй фосфоресцентной метки (ИАЭ), локализованной в других доменах молекулы фермента, что подтверждает сделанные выводы (не показано).

Как видно из Таблицы 8, стабилизация фермента в Е2- или в Е1-конформации не оказывает значительного влияния на параметры затухания анизотропии фосфоресценции. И в том, и в другом случае в мембранах CP присутствуют в примерно постоянных количествах и мономеры Са-АТФазы, и ее олигомерные комплексы, и крупные агрегаты молекул фермента. Вращение мономеров фермента в мембране слабо зависит от конформационного состояния его молекулы. Скорость вращательной корреляции медленной компоненты варьирует в достаточно широких пределах, что, как нам кажется, связано с влиянием разных лигандов на структуру гидрофобного домена молекулы Са-АТФазы. Известно, что связывание Са2+ или фосфорилирование фермента изменяет взаимное расположение пронизывающих мембрану CP гидрофобных а-

спиральных участков его молекулы (MacLennan et al., 1997; Toyoshima et al., 2000). Таким образом, анализ затухания анизотропии фосфоресценции позволяет нам заключить, что в мембранах СР одновременно существуют как мономерная, так и олигомерная формы Са-АТФазы, что хорошо согласуется с предложенной нами гипотезой.

Поскольку в литературе высказывалось предположение, что образование олигомерных комплексов Са-АТФазы в мембранах СР приводит к инактивации фермента (Birmachu, Thomas, 1990; Voss et al., 1991; 1994; 1995), необходимо было найти условия или агенты, вызывающие олигомеризацию Са-АТФазы, и выяснить, как изменение олигомерного состояния фермента влияет на его активность. Для этого мы использовали кратковременную термообработку мембран СР и мелиттин - полипептидный токсин из яда пчелы, способный в определенных условиях индуцировать агрегацию и инактивацию Са-АТФазы СР (Voss et al., 1991; 1995). В присутствии в среде ионов Са2+ (конформационное состояние El) инкубация везикул СР при температурах до 48-49°С в течение 5 мин практически не влияет на скорость гидролиза АТФ и скорость транспорта Са2+ Са-АТФазой, а при более высоких температурах оба параметра резко падают (до нуля при температуре 51°С), что отражает термоденатурацию белка Са-АТФазы. В то же время, при инкубации препаратов СР в среде с ЭГТА (Е2-конформация Са-АТФазы), скорость гидролиза АТФ также практически не изменялась при температурах до 48-49°С, тогда как скорость аккумуляции Са2+ везикулами СР прогрессивно снижалась, начиная с температур выше 38-39°С. Опыты с использованием 45Са2+ показали, что снижение скорости аккумуляции Са2+ связано с резким увеличением проницаемости мембран СР для этого катиона. Таким образом, кратковременная термообработка препаратов СР приводит к разобщению Са-насоса: скорость гидролиза АТФ Са-АТФазой не изменяется, однако везикулы СР теряют способность накапливать Са2+.

Анализ олигомерного состояния Са-АТФазы в мембранах нативных и термообработанных препаратов СР с помощью о-фенантролина в присутствии меди показал, что термообработка приводит к резкому увеличению скорости образования ковалентно сшитых агрегатов Са-АТФазы и количества таких агрегатов, т.е. .терморазобщение_ сопровождается значительной олигомеризацией Са-АТФазы. Важно отметить, что, несмотря на высокую степень агрегированности Са-АТФазы в термообработанных препаратах, конформационная подвижность отдельных доменов молекулы фермента, необходимая для нормальной работы Са-насоса (Toyoshima et al., 2000), не нарушается, т.е. Са-АТФаза может функционировать как в мономерном состоянии, так и в составе олигомерных комплексов.

Анализ влияния мелиттина - полипептидного токсина из яда пчелы - на активность Са-АТФазы СР показал, что при рН 6,0 мелштин не ингибирует фермент, а по мере защелачивания среды преинкубации происходит развитие ингибирующего эффекта. Наиболее значительные изменения происходят в интервале рН 6,0-7,0, а в диапазоне рН 7,0-8,5 ингибирующее действие мелиттина практически одинаково. Тот факт, что при рН 6,0 Са-АТФаза не ингибируется мелитгином, может говорить о том, что в этих условиях пептид не взаимодействует с мембранами СР. Однако детальный анализ активности фермента после его инкубации с мелитгином показал, что в этих условиях мелштин увеличивает активность Са-АТФазы в отсутствие Са-ионофора А23187 до уровня, измеряемого в присутствии ионофора. Это говорит о том, что мелиттин взаимодействует с

мембранами ретикулума и при этом увеличивается проницаемость мембран для ионов кальция, но в данных условиях (рН 6,0) это не приводит к ингибированию Са-АТФазы.

Для того, чтобы проанализировать агрегацию Са-АТФазы в присутствии мелитгина, фермент преинкубировали с пептидом в разных соотношениях при различных значениях рН, после чего проводили кратковременную обработку (в течение 2 мин) препаратов о-фенантролином в присутствии меди. Такого времени инкубации со сшивающим агентом вполне достаточно для того, чтобы ковалентно сшить все устойчивые агрегаты Са-АТФазы. Мы обнаружили, что при электрофореггическом разделении белков CP между контрольными препаратами и препаратами после инкубации с мелиттином наблюдаются значительные различия. В препаратах, обработанных мелиттином, появляются белковые агрегаты с молекулярными массами около 240, 300, 400 и 500 кДа, причем их количество растет с увеличением времени преинкубации Са-АТФазы с мелиттином, а количество мономерной формы Са-АТФазы (105 кДа), уменьшается.

xi 20 -

"1

10 16 20 2S SO

15 20 25 30

Рис. 13. Зависимость активности фермента (А) и площади пика мономера Са-АТФазы (Б) от времени преинкубации с мелиттином в разных условиях: рН 7,0, соотношение Са-АТФаза:мелитгин 1:5 (1); соотношение Са-АТФаза:мелиттин 1:10 (2) соотношение Са-АТФаза:мелитган 1:30 (3); рН 6,0, соотношение Са-АТФаза:мелиттин 1:30 (4).

На рис. 13 представлены зависимости активности фермента и количества мономерной формы Са-АТФазы от времени инкубации с мелиттином в разных условиях. Как видно из рисунка, взаимодействие мелитгина с мембраной и вызываемая им агрегация не являются причиной инактивации фермента, так как существуют условия, при которых происходит агрегация Са-АТФазы, но фермент не теряет активности (преинкубация с мелиттином при рН 6,0). С другой стороны, при соотношении мелиттин:Са-АТФаза 5:1 фермент инактивируется, но его агрегации не наблюдается. Следовательно, опыты с использованием мелитгина, как и опыты с термообработкой мембран СР, позволяют заключить, что агрегация. Са-АТФазы в мембранах СР в не приводит к снижению гидролитической активности фермента, т.е. фермент может эффективно функционировать и в составе олигомерных комплексов. Возможно, агрегация Са-АТФазы создает облегченный путь для выхода Са2+ из везикул СР.

8. Ингибирование Са-АТФазы мелиттином и влияние мелиттин-подобного белка на активность фермента. Анализ кпивых-ингибнровшшя" -Са-АТФазы мелиттином в полулогарифмических координат! рН, кроме рН 6,0, когда ингибирования Са-

09 Я*

оисх{>дит.

шачениях они

Í

описываются суммой двух пересекающихся прямых (данные не представлены), то есть процесс ингибирования описывается суммой двух экспонент. Константы скорости псевдопервого порядка быстрой и медленной фаз инактивации при рН 7,0 различались в 10 раз (Таблица 9). Ингибирующий эффект мелиттина развивался во времени, активность Са-АТФазы не увеличивалась во время измерения активности фермента (после разведения смеси мелиттин-мембраны СР средой для измерения активности), т.е. мелитган является необратимым ингибитором Са-АТФазы СР. Он обеспечивает двухфазное ингибирование ферментативной активности, причем ее падение как в быстрой, так и в медленной фазах инактивации составляет 40-50%. Это подтверждает наши представления о том, что в мембранах СР присутствуют разные формы Са-АТФазы.

В Таблице 9 представлены кинетические параметры ингибирования Са-АТФазы мелитгином в разных условиях. Вицно, что при введении в среду преинкубации 3 мМ АТФ практически полностью исчезает быстрая фаза инактивации фермента и ингибирование Са-АТФазы можно описать одной экспонентой с константой скорости, характерной для медленной фазы. Таким образом, АТФ уменьшает процент ингибирования Са-АТФазы мелиттином в быстрой фазе инактивации, защищая одну из форм фермента от инактивирующего действия мелиттина. Концентрация АТФ, обеспечивающая полумаксимальную защиту Са-АТФазы, составляет около 500 мкМ, т.е. быстрая фаза ингибирования Са-АТФазы отражает взаимодействие мелиттина с олигомерной формой фермента, имеющей центры связывания АТФ с низким сродством. В отличие от АТФ, ГТФ не влияет на ингибирование Са-АТФазы мелиттином (Таблица 9).

Таблица 9. Кинетические параметры ингибирования мелиттином Са-АТФазы нативного и обработанного С12Е9 препаратов СР

Концентрация АТФ в среде измерения активности Аь% А2,% Ао,% к], мин"1 кг, мин'1

Нативный п репарат СР

ЗмМ 49,4+4,3 41,7+4,5 8,9±2,2 1,2+0,15 0,12±0,02

ЗмМ + З мМАТФв среде преинкубации 5,0±0,4 - 46,4+3,8 48,62:3,5 1,1+0,12 0,15+0,02

ЗмМ + ЗмМГТФв среде преинкубации 49,4±4,3 40,6±5,1 10±2,7 1,3±0,12 0,11+0,03

100 мкМ 20,5±12 76,5+5,6 3,0+2,0 0,89±0,11 0,08+0,02

50 мкМ - 91,0+4,7 9,0±4,0 - 0,11+0,02

25 мкМ - 93,0±б,0 7,0±4,0 - 0,13±0,04

Обработанный С] 2Е9 препарат СР

ЗмМ - 97,5±3,4 2,5+1,3 - 0,13±0,030

ЗмМ + ЗмМАТФв среде преинкубации - 98,7±2,6 1,3±1,1 - 0,12+0,011

100 мкМ 100,0+5,7 0,0+3,4 - 0,12+0,03

50мкМ - 97,7±4,3 2,3+1,2 - 0,10±0,01

25 мкМ - 98,3±3,7 1,7±1,0 - 0,11+0,02

В рамках предлагаемой нами модели, согласно которой Са-АТФаза существует в: мембранах СР в мономерной и олигомерной формах, можно предположить, что дв,е.фазы ингибирования Са-АТФазы мелиттином отражают

взаимодействие пептида с разными олигомерными формами фермента: быстрая - с олигомерами, а медленная - с мономерами. Согласно этой модели, при низких концентрациях АТФ насыщается только мономерная форма фермента, т.е. измеряя активность фермента в присутствии низких концентраций АТФ, можно зарегистрировать активность мономерной формы Са-АТФазы, что позволяет оценить скорость инактивации этой формы фермента мелиттином.

При измерении активности в присутствии 100 мкМ АТФ инактивация Са-АТФазы мелиттином, как и в присутствии 3 мМ АТФ, имеет двухфазный характер (Таблица 9), однако вклад быстрой фазы инактивации в общее ингибирование фермента снижается до 20%, а вклад медленной фазы увеличивается до 80%. Согласно расчетам в рамках используемой нами модели (гипербола + сигмоида) при концентрации АТФ 100 мкМ общая активность Са-АТФазы обеспечивается работой мономерной и олигомерной форм фермента примерно на 70% и 30% соответственно, что хорошо согласуется с данными по ингибированию АТФазной активности мелиттином. При использовании более низких концентраций АТФ для определения активности Са-АТФазы (50 и 25 мкМ) ингибирование фермента мелиттином становится однофазным и характеризуется константой скорости, соответствующей константе скорости ингибирования фермента в медленной фазе инактивации (Таблица 9). Это подтверждает наше предположение о том, что медленная фаза ингибирования Са-АТФазы мелиттином отражает взаимодействие пептида с мономерной формой фермента.

Как было показано выше, перевести Са-АТФазу в мономерное состояние можно с помощью обработки мембранных препаратов СР неионным детергентом С12Е9. Из Таблицы 9 видно, что и при высоких, и при низких концентрациях АТФ в среде измерения активности фермент, обработанный СцЕ?, ингибируется мелиттином медленно, а константы скорости инактивации в этом случае сравнимы с константой скорости инактивации в медленной фазе ингибирования нативного фермента. Введение АТФ в среду преинкубации Са-АТФазы с мелиттином не защищает фермент от ингибирования. Это подтверждает наше предположение, согласно которому медленная фаза ингибирования Са-АТФазы мелиттином обеспечивается взаимодействием пептида с мономерной формой фермента. Анализ ингибирования мелиттином Са-АТФазы препаратов СР после их кратковременной термообработки или в присутствии высоких концентраций глицерина (условия, индуцирующие агрегацию фермента) показал, что в этом случае ингибирование является однофазным процессом (данные не представлены). Константа скорости ингибирования фермента в таких препаратах соответствует константе скорости быстрой фазы инактивации нативной Са-АТФазы, т.е. эта фаза ингибирования отражает взаимодействие мелитгина с олигомерами фермента.

Рис. 14. Иммуноблоттинг препаратов цитозольной фракции слизистой оболочки желудка (1), цитозольной (2) и мембранной (3) фракций скелетных мышц. Блот прокрашен с использованием антимелиттиновых антител.

Белок с молекулярной массой 67 кДа, взаимодействующий с антителами на мелигшн, был обнаружен в слизистой оболочке желудка кролика и очищен с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием антимелиттиновых антител. Было показано, что этот белок, получивший название «мелиттин-подобный белою>, активирует транспорт протона Н,К-АТФазой (Сирро1еШ й а1., 1993). Для выявления мелитгин-подобных белков в скелетной мускулатуре кролика после получения сыворотки с высоким титром антимелиттиновых антител (1:40000) мы протестировали препараты цитозольной и мембранной фракций этой ткани методом иммуноблотганга. Как видно из рис. 14, белки с молекулярной массой 67 кДа, реагирующие с антителами на мелитгин, есть в цитозольной фракции слизистой оболочки желудка, а также в цитозольной и мембранной фракциях скелетной мышцы, но в мышечных препаратах этот белок присутствует в гораздо меньших количествах. Так как его содержание в скелетных мышцах было невелико, мелитган-подобный белок был очищен из цитозольной фракции слизистой желудка кролика с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием антимелиттиновых антител. Для оценки влияния полученного белка на активность Са-АТФазы СР он добавлялся непосредственно в пробу для определения активности фермента. Как видно из рис. 15, в присутствии 1,0 и 2,0 мкМ мелиттин-подобного белка активность фермента возрастает в 1,3 и 2,0 раза соответственно.

Рис. 15. Скорость гидролиза АТФ препаратами СР скелетных мышц в контроле (1), в присутствии 0,5 мкМ (2), 1 мкМ (3) и 2 мкМ (4) очищенного мелиттин-подобного белка (звездочками отмечены значения, величины которых достоверно отличаются от контрольных (р < 0,05)).

Таким образом, мелитгин-подобный белок с молекулярной массой 67 кДа из слизистой оболочки желудка активирует Са-АТФазу СР скелетных мышц кролика. Возможно, мелитгин имитирует белковый модуль, участвующий в белок-белковых взаимодействиях. Белки, содержащие в своей последовательности участок, узнаваемый антимелитгиновыми антителами, присутствуют в разных тканях, имеют близкие свойства, а транспортные АТФазы Р-типа являются мишенью (или, по крайней мере, одной из мишеней) их действия.

9. Сезонные изменения активности Са-АТФазы СР скелетных мышц сусликов Б.ипйиШив. Детальный анализ кинетических характеристик Са-АТФазы СР скелетных мышц летних активных сусликов показал, что зависимость активности фермента от концентрации АТФ имеет вид кривой с промежуточным плато, которая характерна для препаратов СР скелетных мышц кроликов и может быть удовлетворительно описана суммой гиперболы и сигмоиды (рис. 16). В то же время, в препаратах СР зимних животных зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ имеет форму гиперболы и описывается уравнением Михаэлиса-Ментен.

Рис. 16. Зависимость активности Са-АТФазы СР скелетных мышц летних активных (1) и зимних спящих (2) сусликов от концентрации АТФ.

Необходимо отметить, что такая зависимость была характерна для всех зимних сусликов, как находящихся в состоянии спячки, так и пробудившихся или содержащихся в течение зимы при комнатной температуре, т.е. наблюдаемые изменения кинетических характеристик Са-АТФазы СР имеют сезонный характер. Удельная активность фермента в препаратах зимних животных по сравнению с препаратами летних сусликов ниже в 1,5-2 раза. Поскольку в зимний период происходит значительное снижение двигательной активности животного, можно предположить, что в скелетных мышцах в этот период работает в основном мономерная форма Са-АТФазы, обладающая меньшей активностью.

Рис. 17. Зависимость активности Са-АТФазы СР скелетных мышц летних активных (1) и зимних спящих (2) сусликов от времени инкубации мембран СР в условиях, стимулирующих активность эндогенных протеинкиназ.

Так как активность разных изоформ Са-АТФазы СР может регулироваться протеинкиназами, мы оценили эндогенную протеинкиназную активность в препаратах СР скелетных мышц сусликов. Эти препараты обладают высокой протеинкиназной активностью: в условиях стимуляции эндогенных протеинкиназ максимальное включение фосфата из у[32Р]АТФ в препараты СР составляет ~1 нмоль фосфата/мг белка СР и достигается уже через 30 с инкубации. Включение фосфата в белки СР зимних спящих сусликов на 10-15% выше, чем в белки СР летних активных животных. Уровень включения фосфата в белки СР снижается через 1-2 мин инкубации препаратов СР и на десятой минуте инкубации составляет -85-90% от максимального значения, что, вероятно, связано с работой протеинфосфатаз, присутствующих в исследуемых препаратах. Инкубация препаратов СР в условиях, стимулирующих протеинкиназную активность, приводит через 30-60 с к увеличению в 2-3 раза активности Са-АТФазы СР зимних спящих животных, но практически не влияет на фермент из скелетных мышц летних активных животных (рис. 17). Увеличение активности Са-АТФазы носит кратковременный характер, что, возможно, связано с работой протеинфосфатаз, в

частности PP-1G протеинфосфатазы, связанной с мембранами СР скелетных мышц (Cohen, 1989).

Спектр фосфорилируемых эндогенными протеинкиназами белков мембран СР анализировали методом авторадиографии. После проведения ЭФ в ПААГ было обнаружено, что включение фосфата происходит в целый ряд белков СР, но Са-АТФаза не является субстратом эндогенных протеинкиназ (рис. 18). Таким образом, активация Са-АТФазы препаратов СР скелетных мышц зимних спящих сусликов при инкубации этих препаратов в условиях, стимулирующих эндогенные протеинкиназы, происходит в результате фосфорилирования не самого фермента, а других белков СР. Как видно из рис. 18, спектр фосфорилируемых белков в препаратах СР летних активных и зимних спящих животных практически совпадает, однако в уровне включения фосфата в индивидуальные белки наблюдаются существенные различия. В препаратах СР скелетных мышц летних сусликов выше уровень фосфорилирования высокомолекулярных белков (130 и 125 кДа) и белков с молекулярными массами 66 и 40 кДа, а в препаратах СР зимних животных - низкомолекулярных белков (14, 25 и 30 кДа). Поскольку даже незначительные изменения уровня фосфорилирования регуляторных белков могут приводить к существенному изменению скорости модулируемых ими процессов (дефосфорилирование всего 1% Са-связывающего белка кальсеквестрина достаточно для полумаксимальной активации Са-каналов СР (Szegedi et al., 1999; Herzog et al., 2000)), можно предположить, что сезонные изменения активности эндогенных протеинкиназ и протеинфосфатаз могут играть существенную роль в регуляции активности Са-АТФазы СР скелетных мышц сусликов.

Рис. 18. Фосфорилирование белков СР скелетных мышц летних активных (А) и зимних спящих (Б) сусликов. Дорожки 1 и 3 - электрофореграмма, полученная после прокрашивания геля Кумасси 13.-250; дорожки 2 и 4 - авторадиограмма этого геля. На каждую дорожку было нанесено 30 мкг белка СР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Завершая анализ полученных в настоящем исследовании результатов, можно заключить, что функциональная активность Са-каналов и Са-АТФазы СР находится под контролем многочисленных и разнообразных регуляторных механизмов. Принципиальное значение для нормального функционирования Са-каналов играет концентрация ряда внутриклеточных соединений. Так, нами продемонстрировано, что в отсутствие в среде адениловых нуклеотидов (но в присутствии ионов М^*) Са-каналы теряют чувствительность к активирующему действию Са2* и кофеина. Неадениловые нуклеотиды способны связываться в

нуклеотидсвязывающих центрах Са-каналов, однако это не приводит к активации каналов. Можно заключить, что нормальная работа Са-каналов СР возможна только при определенной комбинации в клетке оптимальных для их работы концентраций АТФ, Са2*, М§г+, и, как было впервые показано в этой работе, еще одного эндогенного соединения - гистидинсодержащего дипептида карнозина. Тот факт, что кофеин способен взаимодействовать с богатым гистидином Са-связывающим белком, позволяет думать, что как экзогенные, так и эндогенные модуляторы активности Са-каналов СР могут осуществлять свое влияние не только за счет прямого связывания в соответствующих участках Са-каналов, но и через взаимодействие с многочисленными белками ретикулума, участвующими в регуляции их функциональной активности.

Особый интерес с нашей точки зрения представляет обнаруженная нами способность карнозина и ряда его производных активировать Са-каналы СР скелетных мышц и сердца за счет связывания в насыщаемых участках и, что более важно, модулировать влияние на Са-каналы других регуляторов их активности. Так, карнозин в физиологических концентрациях повышает чувствительность Са-каналов к активирующему действию низких концентраций Са2+, адениловых нуклеотидов и кофеина и снижает ингибирующее действие низких концентраций

высоких концентраций Са2* и закисления среды. Кроме того, карнозин обладает выраженной способностью реагировать со свободными радикалами. Все это позволяет думать, что защита карнозином мышечных препаратов от развития утомления при интенсивной работе связана не только с уникальными буферными свойствами этого дипептида, но и с его специфическим влиянием на Са-каналы СР, так как он снижает негативное влияние на Са-каналы факторов, возникающих при такой работе (повышение внутриклеточной концентрации Са2* и М^, рост уровня свободных радикалов, снижение рН, падение уровня АТФ).

Следует заметить, что, как и в случае Са-каналов СР, взаимодействие АТФ (в отличие от неадениловых нуклеотидов) с Са-АТФазой СР характеризуется рядом уникальных особенностей. Во-первых, связывание этого нуклеотида с ферментом оказывает специфическое влияние на конформацгао молекулы Са-АТФазы. Во-вторых, гидролиз этого нуклеотида, в отличие от гидролиза других субстратов, не подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен: зависимость скорости гидролиза АТФ от его концентрации имеет вид кривой с промежуточным плато. И, наконец, нами обнаружена гетерогенность АТФ-связывающих центров, принадлежащих Са-АТФазе СР.

Анализ собственных экспериментальных наблюдений и данных литературы позволил нам предложить гипотетическую модель, согласно которой Са-АТФаза находится в мембранах СР в двух формах - в виде мономеров и олигомерных комплексов. Мономеры имеют высокое сродство к АТФ и гидролизуют этот субстрат согласно кинетике Михаэлиса-Ментен. Входящие в состав олигомерных комплексов протомеры имеют низкое сродство к АТФ, связывают этот субстрат кооперативно, и их работу можно удовлетворительно описать уравнением Хилла. Присутствие в мембранах СР олигомерных комплексов Са-АТФазы мы подтвердили с помощью электронной микроскопии, с использованием сшивающих агентов и с помощью анализа вращательной подвижности фермента в мембране. Разрушение олигомерных комплексов при обработке мембран СР неионным детергентом С12Е9 приводит к изменению кинетических характеристик Са-АТФазы: гидролиз АТФ такими препаратами подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Анализ ингибирования Са-АТФазы пептидом из яда пчелы мелитгином

полностью подтвердил предложенную модель: ингибирование этим пептидом мономерной и олигомерной форм фермента протекает с разной скоростью, причем АТФ защищает от ингибирования только олигомерную форму Са-АТФазы.

С помощью антимелиттиновых антител из слизистой желудка кролика нами был выделен белок с молекулярной массой 67 кДа (мелитгин-подобный белок), который активирует Са-АТФазу СР, т.е. активность этого фермента может регулироваться и за счет белок-белковых взаимодействий. Если предположить, что, как и в случае с мелитгином, АТФ препятствует взаимодействию этого белка с олигомерами Са-АТФазы, то его активирующее действие направлено только на мономерную форму фермента. Таким образом, регуляторы белковой природы или низкомолекулярные соединения могут по-разному модулировать активность мономерной и олигомерной форм Са-АТФазы.

Интересным объектом для исследования особенностей регуляции активности Са-АТФазы являются препараты СР скелетных мышц типичного гибернатора - суслика Б.ипс1и1аШ. Зависимость скорости гидролиза • АТФ Са-АТФазой препаратов СР летних активных животных от концентрации субстрата имеет характерный вид кривой с промежуточным плато. Однако в зимний период кинетические параметры работы Са-АТФазы изменяются: активность фермента резко падает, при этом гидролиз АТФ описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Так как солюбилизация мембранных препаратов СР (перевод Са-АТФазы в мономерную форму) не приводит к снижению активности фермента, можно полагать, что в зимний период в СР скелетных мышц сусликов из работы полностью «выключаются» олигомеры Са-АТФазы. Обнаруженная нами активация Са-АТФазы препаратов СР зимних животных при стимуляции эндогенных протеинкиназ позволяет полагать, что в регуляцию активности этого фермента, по крайней мере его олигомерной формы, вовлечены протеинкиназы и протеинфосфатазы. Поскольку сама Са-АТФаза не является мишенью для эндогенных протеинкиназ, следует признать, что ее активность в ретикулуме животных-гибернаторов регулируется уровнем фосфорилирования/дефосфорили-рования регуляторных белков ретикулума, не идентифицированных в настоящее время.

ВЫВОДЫ

1. Активность Са-каналов СР регулируется ионами Са2+, кофеином, адениловыми нуклеотидами и гистидинсодержагцими дипептидами при их связывании в специфических насыщаемых участках.

2. Карнозин и его производные повышают чувствительность Са-каналов СР к активирующему действию кофеина, адениловых нуклеотидов и низких концентраций Са2+ и снижают ингибирующее действие низких концентраций М§2+, высоких концентраций Са2+ и закисления среды. Защита карнозином Са-каналов от повреждающего действия факторов, возникающих при интенсивной мышечной работе, может быть одной из причин феномена Северина.

3. Адсниловые и неадениловые нуклеотиды взаимодействуют с нуклсотид-связываюгцими центрами Са-каналов СР, но только связывание адениловых нуклеотидов активирует Са-каналы, повышая их чувствительность к Са2+. Эффективность активирующего действия падает в ряду АТФ«р,у-СН2-АТФ>АДФ>АМФ; сродство Са-каналов к неадениловым нуклеотидам снижается в ряду ЦТФ>ИТФ»УТФ>ГТФ.

4. В мембранных препаратах СР присутствуют два типа АТФ-связывающих участков, принадлежащих Са-АТФазе, с высоким и низким сродством. Параметры связывания АТФ в участках с высоким сродством не изменяются при переходе фермента из El в Е2 конформацию.

5. Зависимость активности Са-АТФазы мембранных препаратов СР от концентрации АТФ имеет вид кривой с промежуточным плато, которая удовлетворительно описывается суммой уравнений Михаэлиса-Ментен (гипербола) и Хилла (сигмоида). Гидролиз ГТФ и пНФФ мембранными препаратами фермента и гидролиз АТФ Са-АТФазой, солюбилизированной С12Е9, описываются уравнением Михаэлиса-Ментен.

6. Са-АТФаза присутствует в мембранах СР как в виде мономеров, так и в виде олигомерных комплексов. Олигомерное состояние фермента не изменяется при переходе Са-АТФазы из El в Е2 конформацию. Гидролиз АТФ мономерной формой фермента описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, а олигомерной -уравнением Хилла.

7. Мелиттин необратимо ингибирует Са-АТФазу СР. Ингибирование представляет собой двухфазный процесс и удовлетворительно описывается в рамках модели «мономер + олигомер»: связывание мелитгина с олигомерами фермента обеспечивает быструю, а с мономерами - медленную фазу инактивации Са-АТФазы. Высокие концентрации АТФ устраняют быструю фазу интибирования Са-АТФазы мелитгином.

8. С использованием антимелиттиновых антител в скелетных мышцах кролика обнаружен мелитгин-подобный белок, идентичный по электрофоретической подвижности мелитгин-подобному белку из слизистой желудка кролика. Мелитгин-подобный белок из слизистой желудка, очищенный с помощью иммуноаффинной хроматографии, активирует Са-АТФазу СР.

9. Зависимость активности Са-АТФазы препаратов СР летних активных сусликов от концентрации АТФ имеет вид кривой с промежуточным плато, а препаратов СР зимних животных - гиперболы, независимо от их физиологического состояния. Активность фермента в зимний период снижается в 2-2,5 раза.

10. В препаратах СР скелетных мышц сусликов присутствуют эндогенные протеинкиназы, стимуляция которых приводит к активации в 2-3 раза Са-АТФазы в препаратах СР зимних спящих животных и не влияет на активность фермента препаратов СР летних сусликов. Поскольку Са-АТФаза не фосфорилируется эндогенными протеинкиназами, ее активация может быть результатом фосфорилирования неидентифицированных регуляторных белков СР.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лопина О.Д., Рубцов А.М., Болдырев A.A., Прокопьева В.Д., Швец В.И. (1978) Влияние термотропных перестроек липидов на свойства мембранной Са-АТРазы. Тез. докл. III Всесоюзн. Симп. «Структура, биосинтез и превращения липидов в организме животного и человека», Ленинград, 52.

2. Лопина О.Д., Рубцов А.М., Болдырев A.A. (1979) Исследование SH-rpynn саркоплазматического ретикулума. Биохимия, 44,306-316.

3. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Рубцов А.М. (1979) Влияние липидного окружения на кооперативные свойства транспортных АТРаз. Тез. докл. IVВсесоюзн. Биохимического съезда, Москва, Наука, 180-181.

4. Болдырев А.А., Рубцов A.M. (1981) Кооперативные свойства транспортных АТРаз. В кн. "Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции" (Под ред. С.Е.Северина и Г.А.Кочетова), Москва, МГУ, 82-96.

5. Рубцов A.M., Болдырев А.А. (1981) АТР как субстрат и регулятор Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума. Тез. докл. IV Всесоюзн. Конф. по биохимии мышц, Ленинград, 95-96.

6. Rubtsov A.M., Lopina O.D., Boldyrev A.A. (1982) Effects of divalent cations and ATP on the kinetic properties of the sulfhydryl groups of sarcoplasmic reticulum membranes and purified Ca-ATPase. Gen. Physiol. Biophys., 1,161-173.

7. Рубцов A.M. (1982) Влияние субстратов Са-АТРазы на кинетические свойства SH-групп саркоплазматического ретикулума. Биохимия, 47, 1045-1054.

8. Болдырев А.А., Лопина О.Д., Рубцов А.М., Свинухова И.А. (1983) Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы. Москва, МГУ, 126 стр.

9. Лущак В.И., Рубцов A.M., Болдырев А.А. (1983) Взаимодействие АТР с Са-АТРазой саркоплазматического ретикулума: влияние на конформационное состояние фермента. Укр. биохим. журнал, 55,507-512.

10. Rubtsov А.М., Sentjurc М., Schara М. (1986) Effect of temperature on Ca-ATPase from sarcoplasmic reticulum membrane: ESR study. Gen. Physiol. Biophys., 5,551-562.

11. Рубцов A.M., Болдырев A.A. (1987) Характеристика путей выхода кальция из везикул саркоплазматического ретикулума. В сб. "Ионный гомеостаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки. Материалы XII Всесоюзн. Симп. "ТранспортныеАТРазы", Иркутск, 17.

12. Успаяова Ж.К., Рубцов A.M., Вигалок И.В., Болдырев А.А. (1988) Влияние вердазильных радикалов на обмен Са2+ в препаратах тяжелого саркоплазматического ретикулума. Укр. биохим. журнал, 60,62-67.

13. Rubtsov А.М., Quinn P.J., Boldyrev А.А. (1988) Pathways of calcium release from heavy sarcoplasmic reticulum vesicles isolated from rabbit skeletal muscles. FEBS Lett., 238, 240244.

14. Rubtsov A.M., Smirnova M.B., Boldyrev A.A. (1988) Interaction of different nucleotides with Ca-release channels from heavy sarcoplasmic reticulum. Biochem. Int., 17, 629-636.

15. Rubtsov A.M., Murphy A.J. (1988) Caffeine interaction with the Ca-release channels of heavy sarcoplasmic reticulum. Evidence that 170 kD Ca-binding protein is a caffeine receptor of the Ca-channels. Biochem. Biophys. Res. Commun., 154,462-468.

16. Рубцов A.M., Баркалая H.3., Болдырев A.A., Улдрикис Я.Т., Кастрон В.В., Скрастинып Н.П., Бисениекс ЭЛ., Тирзит Г.Д., Дубур Г.Я. (1989) Влияние производных 1,4-дигидропиридина на потоки Са2+ через мембраны саркоплазматического ретикулума. Биол. мембраны, 6,18-25.

17. Rubtsov A.M., Boldyrev A.A. (1989) Regulation of the Ca-release channels from heavy sarcoplasmic reticulum by nucleotides and caffeine. Abstr. Intern. Symp. "Molecular Organization of Biological Structures", Moscow, 1,154.

18. Смирнова М.Б., Рубцов A.M., Болдырев A.A. (1989) Выход кальция из везикул тяжелого саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика. Укр. биохим. журнал, 61,57-64.

19. Рубцов A.M. (1989) Системы выхода кальция из саркоплазматического ретикулума. Тез. Межд. Симп. "Транспорт ионов и механизмы его регуляции", Тбилиси, 64-65.

20. Рубцов A.M., Шентюрц М., Шара М., Болдырев А.А. (1990) Исследование взаимодействия карнозина со свободными радикалами с использованием спиновых зондов и спиновых ловушек. Тез. докл. VIII Всесоюзн. Конф. «Магнитный резонанс в биологии и медицине», Звенигород, 100.

21.Баргутх С.А., Хомутов Г.Б., Рубцов A.M. (1990) Изучение электростатических характеристик поверхности мембран липосом методами спиновых и флуоресцентных зондов. Тез. докл. VIII Всесоюзн. Конф. «Магнитный резонанс в биологии и медицине», Звенигород, 114.

22. Batrukova M.A., Rubtsov A.M., Alvarez C., Gomez Т., Lanio M. (1991) The effect of toxic polypeptide fraction from Stoichactls helianthus on sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase. J. Chem. Biochem. Kinetics, 1,27-30.

23. Альварес К., Гомес Т., Пасос Ф., Техука М., Ланио М., Рубцов A.M., Болдырев А.А.

(1991) Взаимодействие полипептидной фракции, полученной из анемоны Stoichactis helianthus, с мембранными препаратами саркоплазматического ретикулума. Вести. Моск. Университета, сер. Биология, 16(4), 70-73.

24. Rubtsov A.M., Schara М., Sentjurc М., Boldyrev А.А. (1991) Hydroxyl radical-scavenging activity of camosine: a spin trapping study. Acta Pharm. Jugosl., 41,401-407.

25. Батрукова M.A., Рубцов A.M., Болдырев A.A. (1992) Влияние карнозина на Са-каналы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц. Биохимия, 57,904-910.

26. Болдырев А.А., Курелла Е.Г., Рубцов А.А., Тюлина О.В., Шара М., Шентюрц М.

(1992) Прямое измерение взаимодействия карнозина и его аналогов со свободными радикалами. Биохимия, 57, 1360-1365.

27. Геймонен Э.Р., Рубцов A.M., Болдырев А.А. (1993) Механизм температурного разобщения Са-насоса саркоплазматического ретикулума: изменение функциональных свойств и структурного состояния молекулы фермента. Биохимия, 58,1296-1306.

28. Geimonen Е., Rubtsov А. (1993) Study of membrane surface potential of sarcoplasmic reticulum vesicles using pH-sensitive dye and paramagnetic probe. Proc. Estonian Acad. Sci. Chem., 42,153-157.

29. Geimonen E., Rubtsov A., Batrukova M. (1993) Influence of short-term heating on the arrangement of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase. Proc. Estonian Acad. Sci. Chem., 42, 158-161.

30. Geimonen E., Batrukova M.A., Rubtsov A.M. (1994) Thermal uncoupling of the Ca-transporting ATPase in sarcoplasmic reticulum. Changes in surface properties of light vesicles. Eur. J. Biochem., 225, 347-354.

31. Рубцов A.M., Болдырев A.A., Личунь Янг, МакСтей Д., Куинн П.Дж. (1994) Исследование вращательной подвижности Е1- и Е2-конформеров Са-АТРазы в мембранах саркоплазматического ретикулума с использованием метода анизотропии фосфоресценции с высоким временным разрешением. Биохимия, 59,1698-1706.

32. Yang L., Rubtsov A.M., McStay D., Boldyrev A.A., Quinn P.J. (1994) Measurement of conformeric states of Ca2+-ATPase in sarcoplasmic reticulum using phosphorescence anisotropy. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng., 2083,41-48.

33. Quinn P.J., Yang L., McStay D., Lopina O.D., Rubtsov A.M., Boldyrev A.A. (1994) Time-resolved phosphorescence anisotropy as a tool to study the conformation and oligomeric structure of ion-transport ATPases. Biochem. Soc. Trans., 22, 383S.

34. Yang L., McStay D„ Quinn P.J., Rubtsov A., Boldyrev A.A. (1995) Phosphorometric monitoring of different enzymic conformeric states. In: "Sensors and their applications". VII (Augousti A.T., ed.). IOP Publishing, Bristol, 337-342.

35. Yang L., Rubtsov A., McStay D., Boldyrev A.A., Quinn P.J. (1995) Rotational dinamics of Ca-ATPase in different conformeric states measured by time-resolved phosphorescence depolarization. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng., 2137,114-119.

36. Cuppoletti J., Rubtsov A.M., Behbehani G., Lopina O.D. (1995) Interaction of potential regulatory protein with the gastric H+/K+-ATPase. Biophys. J., 68(2), A235.

37. Quinn P.J., Rubtsov A.M., Lopina O.D., Boldyrev A.A. (1996) Conformational coupling in cation translocating ATPases. Нейрохимия, 13,297-304.

38. Лопина О.Д., Рубцов A.M. (1997) Возможные пути регуляции активности ион-транспортирующих АТРаз. Тез. симп. докл. II Съезда Биохимического общества РАН, Пущино, 65.

39. Рубцов A.M. (1997) Особенности регуляции активности Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц аденозинтрифосфатом. Тез. докл. II Съезда Биохимического общества РАН, Пущино, 353-354.

40. Муртазина Д.А., Мает Н.В., Рубцов А.М., Лопина О.Д. (1997) Механизм ингибирования АТРаз Е1-Е2-типа мелитганом. Биохимия, 62, 66-74.

41. Рубцов А.М., Батрукова М.А. (1997) Кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства. Биохимия, 62,1091-1105.

42. Batrukova М.А., Rubtsov А.М. (1997) Histidine-containing dipeptides as endogenous regulators of sarcoplasmic reticulum Ca-release channels. Biochim. Biophys. Acta, 1324,

43. Shorina E.A., Mast N.V., Lopina O.D., Rubtsov A.M. (1997) Melittin-induced inhibition and aggregation of Ca-ATPase in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum: a comparative study. Biochemistry, 36, 13455-13460.

44. Rubtsov A.M., Shutova A.N., Storey K.B., Lopina O.D. (1998) Changes in the functional activity and protein composition of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum of ground squirrel Citellus undulatus during hibernation. Abstr. 6th Intern. Conf. "Rodens & Spatium (The Rodent & Its Environment) ", Acre, Israel, 86.

45. Шорина E.A., Мает H.B., Стори К.Б., Лопина О.Д., Рубцов A.M. (1999) Особенности взаимодействия мелиттина с мембранами саркоплазматического ретикулума. Биохимия, 64, 843-852.

46. Шутова А.Н., Стори К.Б., Лопина О.Д., Рубцов A.M. (1999) Сравнительная характеристика препаратов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus, крыс и кроликов. Биохимия, 64,1480-1488.

47. Rubtsov A., McStay D., Lopina О., Boldyrev A., Quinn P. (1999) Surface second harmonic generation - a new approach for the study of conformation state of ion-motive ATPases. Abstr. IX Intern. Conf. on the Na/K-ATPase & Related ATPases, Sapporo, Japan, PS-22

48. Рубцов A.M., Куинн П.Дж., МакСтей Д., Лопина О.Д. (1999) Исследование конформационных переходов ион-транспортирующих АТРаз Р-типа с использованием оптических методов (флуоресцентная спектроскопия, генерация вторых гармоник и анизотропия фосфоресценции с высоким временным разрешением). Тез. дот. II Съезда Биофизиков России, Москва, 556-557.

49. Mast N.V., Rubtsov A.M. (2000) Analysis of melittin-induced inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase. Abstr. VI European Symp. on Calcium Binding Proteins in Normal and Transformed Cells, Paris, P63.

50. Rubtsov A.M. (2000) Ca-release channels and role of carnosine in muscle cell calcium homeostasis. Abstr. Intern. Workshop "Signaling Neuropeptides and Conformation of Macromolecules" Dedicated to 10(fh Annyversary of Carnosine Discovery, Moscow, 15.

51. Rubtsov A.M. (2001) Hibernation: protein adaptations. In:"Cell and Molecular responses to stress. Vol. 2. Protein adaptations and signal transduction " (K.B. Storey and J.M. Storey, eds.). Elsevier Science, Amsterdam, 57-71.

52. Малышева АН., Стори К.Б., Зигашшш P.X., Лопина О.Д., Рубцов А.М. (2001) Характеристика мембранных препаратов саркоплазматического ретикулума, выделенных из скелетных мышц активных и гибернирующих сусликов Spermophilus undulatus. Биохимия, 66,1128-1136.

53. Рубцов A.M. (2001) Молекулярные механизмы регуляции активности Са-каналов саркоплазматического ретикулума, утомление мышц и феномен Северина. Биохимия, 66,1401-1414.

54. Malysheva A.N., Storey К.В., Lopina O.D., Rubtsov A.M. (2001) Ca-ATPase activity and protein composition of sarcoplasmic reticulum membranes isolated from skeletal muscles of typical hibernator, the ground squirrel Spermophilus undulatus. Biosci. Rep. 6, 831-838.

55. Kondrashev-Lugovskii A.S., Malyshea A.N., Storey K.B., Lopina O.D., Rubtsov A.M. (2003) Seasonal changes of Ca-ATPase activity in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum of the ground squirrel Spermophilus undulatus. Ann. N.Y. Acad. Sci. 986, 550-551.

142-150.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 19.09.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 2,75. Тираж 100 экз. Заказ 751. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

2ОО5-А

е ? о 9

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Рубцов, Александр Михайлович

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Строение и функции саркоплазматического ретикулума

1.1. Общие аспекты

1.2. Са-связывающие белки саркоплазматического ретикулума

Глава 2. Са-каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума

2.1. Виды внутриклеточных Са-каналов

2.2. Идентификация и выделение Са-каналов СР (рианодиновых рецепторов)

2.3. Структура Са-каналов саркоплазматического ретикулума

2.4. Проводимость Са-каналов СР для одновалентных и двухвалентных катионов

2.5. Изоформы рианодинового рецептора и особенности электромеханического сопряжения в разных типах мышц

2.6. Взаимодействие рианодинового рецептора с белками саркоплазматического ретикулума

2.7. Регуляция активности Са-каналов СР эндогенными и экзогенными соединениями

2.8. Участие протеинкиназ в регуляции функциональной активности рианодинового рецептора

2.9. Возможные механизмы нарушения работы Са-каналов при мышечном утомлении

Глава 3. Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума

3.1. Молекулярная организация Са-АТФазы

3.2. Механизм функционирования Са-АТФазы

3.3. Регуляция активности Са-АТФазы

3.4. Олигомерная организация Са-АТФазы в мембранах СР

Глава 4. Гистидинсодержащие дипептиды и их возможные физиологические функции

4.1. Участие карнозина в процессах мышечного сокращения

4.2. Буферные свойства карнозина

Глава 5. Использование мелиттина для исследования биологических мембран и мембранных ион-транспортирующих АТФаз Р-типа

5.1. Структура молекулы мелиттина

5.2. Взаимодействие мелиттина с мембранами и мембранными ферментами

5.3. Мелитгин-подобные белки

Глава 6. Гибернация млекопитающих

6.1. Общие аспекты

6.2. Особенности энергетического обмена в сердце и скелетных мышцах при гибернации

6.3. Адаптационные изменения сократительных белков при гибернации

6.4. Изменения метаболизма Са в сердце и скелетных мышцах при гибернации

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ III. 1. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

1.1. Выделение препаратов легкого саркоплазматического ретикулума

1.2. Выделение препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума из скелетных мышц

1.3. Выделение препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума из сердца утки

1.4. Получение мембранных и цитозольных фракций из слизистой оболочки желудка и скелетных мышц кролика

1.5. Получение липосом и протеолипосом с различным содержанием белка Са-АТФазы в мембране

1.6. Иммунизация кроликов мелиттином и получение антимелиттиновых антител

1.7. Выделение мелиттин-подобного белка методом аффинной хроматографии

1.8. Получение имидазольной соли АТФ и ГТФ

1.9. Получение декаванадата и Е2-кристаллов Са-АТФазы 91 Ш.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

2.1. Определение концентрации белка по методу Лоури

2.2. Определение концентрации белка по методу Спектора

2.3. Определение количества фосфолипидов по неорганическому фосфору

2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.5. Определение активности Са-АТФазы с использованием системы сопряженных ферментативных реакций

2.6. Определение активности Са-АТФазы по нарастанию неорганического фосфата

2.7. Определение активности Са-АТФазы методом непрерывной регистрации рН в слабозабуференной среде

2.8. Определение пара-нитрофенилфосфатазной активности Са-АТФазы

2.9. Регистрация АТФ-зависимой аккумуляции Са и лиганд-индуцируемого выброса Са2+

2.10. Регистрация выхода Са из пассивно нагруженных везикул СР с использованием 45Са2+

2.11. Ингибирование активности Са-АТФазы мелиттином

2.12. Температурная обработка мембран саркоплазматического ретикулума

2.13. Определение количества БН-групп и их кинетических параметров с помощью НБД-хлорида

2.14. Анализ инактивации Са-АТФазы препаратов СР НБД-хлоридом

2.15. Определение значений кажущихся Кд для нуклеотидов, обеспечивающих защиту Са-АТФазы от инактивации НБД-хлоридом

2.16. Получение НБД-меченых препаратов Са-АТФазы для флуоресцентных исследований

2.17. Электронная микроскопия

2.18. Включение ФИТЦ, ЭИТЦ и ИАЭ в Са-АТФазу

2.19. Регистрация анизотропии фосфоресценции меченых ЭИТЦ и ИАЭ препаратов Са-АТФазы

2.20. Регистрация генерации вторых гармоник поверхностью мембран СР

2.21. Исследование свойств липидной фазы мембран саркоплазматического ретикулума с использованием флуоресцентных зондов

2.22. Анализ тушения собственной флуоресценции Са-АТФазы гидрофобными и гидрофильными соединениями

2.23. Исследование структурного состояния липидной фазы мембран методом ЭПР

2.24. Анализ гидроксил-радикал связывающей способности карнозина и родственных ему соединений с использованием метода спиновых ловушек

2.25. Измерение поверхностного потенциала мембран СР с помощью рН-чувствительного индикатора нейтрального красного

2.26. Определение титра сыворотки с помощью твердофазного иммуноферментного анализа

2.27. Иммуноблоттинг

2.28. Анализ олигомеризации белка Са-АТФазы в присутствии о фенантролина и ионов меди

2.29. Определение уровня включения фосфата в белки саркоплазматического ретикулума

2.30. Авторадиография 1 Ш.З. ЖИВОТНЫЕ

Ш.4. МАТЕРИАЛЫ

III.5. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Характеристика используемых в работе препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума и методических подходов для исследования выхода Са2+

Глава 2. Влияние производных 1,4-дигидропиридина на свойства Са-каналов ретикулума

Глава 3. Характеристика Са2+- и кофеин-индуцируемого выброса Са2+ из препаратов тяжелого СР и поиск кофеинсвязывающих белков

Глава 4. Регуляция Са-каналов СР карнозином и родственными соединениями

4.1. Активация Са-каналов гистидинсодержащими соединениями

4.2. Влияние карнозина на взаимодействие Са-каналов с регуляторами их функциональной активности

4.3. Гидроксилрадикал-связывающая активность карнозина

Глава 5. Анализ нуклеотидсвязывающих свойств Са-каналов и альтернативные пути выхода Са2+ из везикул саркоплазматического ретикулума

Глава 6. Анализ нуклеотид-связывающих свойств Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума и влияние лигандов на конформационное состояние молекулы фермента

6.1. Химическая модификация БН-групп Са-АТФазы НБД-хлоридом

6.2. Защита адениловыми нуклеотидами Са-АТФазы СР от инактивации НБД-хлоридом

6.3. Анализ флуоресценции НБД-меченой Са-АТФазы

6.4. Генерация вторых гармоник мембранными препаратами CP

6.5. Гидролиз разных субстратов Са-АТФазой CP

Глава 7. Олигомерная организация Са-АТФазы в мембранах CP

7.1. Электронная микроскопия

7.2. Сшивающие агенты

7.3. Анизотропия фосфоресценции

Глава 8. Влияние агрегации Са-АТФазы в мембранах ретикулума на активность фермента

8.1. Терморазобщение Са-насоса

8.2. Агрегация Са-АТФазы, индуцируемая мелиттином

Глава 9. Мелиттин как инструмент для исследования Са-АТФазы

9.1. Взаимодействие мелиттина с мембранами CP

9.2. Особенности ингибирования Са-АТФазы CP мелиттином

9.3. Влияние АТФ и ГТФ на ингибирование Са-АТФазы мелиттином

9.4. Ингибирование Са-АТФазы мелиттином при низких концентрациях АТФ в среде измерения активности

9.5. Ингибирование мелиттином гидролиза пНФФ Са-АТФазой CP

9.6. Ингибирование мелиттином солюбилизированной С|2Е9 Са-АТФазы и термообработанного и обработанного глицерином препаратов CP

9.7. Идентификация мелиттин-подобных белков в разных тканях кролика

9.8. Очистка мелиттин-подобного белка и его влияние на активность Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума

Глава 10. Регуляция активности Са-АТФазы CP при гибернации сусликов Spermophilns undulatus

10.1. Сравнительная характеристика препаратов CP скелетных мышц сусликов, крыс и кроликов

10.2. Сезонные изменения белкового состава мембран CP сусликов

10.3. Сезонные изменения активности Са-АТФазы CP скелетных мышц сусликов

10.4. Роль протеинкиназ в сезонной регуляции активности Са-АТФазы CP скелетных мышц суслика S. undulatus

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума"

Еще 15-20 лет назад имело смысл составлять список клеток, основные функции которых регулируются изменением уровня свободного кальция в цитоплазме. В настоящее время этот перечень настолько велик, что он занял бы несколько страниц, поэтому можно ограничиться следующим заключением: практически во всех известных типах животных клеток наблюдаются периодические изменения концентрации цитоплазматического Са2+ от 10'8-10'7 М до 10*6-10"5 М, причем эти изменения индуцируются различными физиологически активными агентами и обеспечивают, регулируют или, по крайней мере, сопровождают проявление основных функций клеток данного типа. Обычно эти изменения уровня цитоплазматического Са2+ кратковременны, и после прекращения действия физиологически активного агента клетка быстро возвращается в состояние функционального покоя. Это позволяет сделать вывод, что подавляющее большинство клеток имеет специальные системы, которые в покое поддерживают внутриклеточную концентрацию Са2+ на низком уровне и обеспечивают его быстрое удаление из клетки после прекращения действия внешнего сигнала, системы, которые в ответ на этот сигнал обеспечивают вход Са в клетку из окружающей среды или его освобождение из внутриклеточных источников, а также системы, которые отвечают на изменение внутриклеточной концентрации Са изменением своей функциональной активности. Первые два типа систем должны быть представлены мембранными белками - Са-йаналами или переносчиками, тогда как последняя система подразумевает существование в

•у . цитоплазме специальных Са-связывающих белков, которые в присутствии Са и будут регулировать различные внутриклеточные процессы. Действительно, в настоящее время такие системы хорошо известны, причем, несмотря на огромное разнообразие клеток и выполняемых ими функций, эти системы достаточно универсальны и имеют много общих свойств.

•у.

Поддержание низкой концентрации Са в цитоплазме клеток разных типов обеспечивается работой специальных мембранных ферментов - Са-АТФаз или Са-насосов плазматической мембраны и сарко(эндо)плазматического ретикулума,

•у, которые способны переносить через мембрану 2 иона Са против градиента его концентрации за счет гидролиза 1 молекулы АТФ, а также работой системы электрогенного Ыа/Са-обмена. В некоторых случаях, особенно при развитии патологических состояний, в удалении Са2+ из цитоплазмы могут принимать участие митохондрии.

Са-АТФаза плазматических мембран относится к обширному семейству ион-транспортирующих АТФаз Р-типа (или Е1-Е2-типа), к которому относятся также Ыа,К-АТФаза плазматических мембран клеток животных, Н,К-АТФаза слизистой оболочки желудка, Са-АТФаза сарко(эндо)плазматического ретикулума, Н-АТФазы грибов и растений, а также некоторые АТФазы бактерий (Carafoli, 1991; Moller et al., 1996). Все ион-транспортирующие АТФазы Р-типа в процессе гидролиза АТФ подвергаются циклическому фосфорилированию-дефосфорилированию по остатку аспарагиновой кислоты в активном центре фермента с образованием ацилфосфата. Кроме этого, характерной особенностью АТФаз Р-типа является наличие двух основных конформаций фермента, Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым ионам и последовательно сменяют друг друга.

Са-АТФаза плазматических мембран состоит из одной полипептидной цепи и представлена 4 изоформами, РМСА1 - РМСА4 (аббревиатура "plasma membrane calcium-transporting ATPase"). Каждая изоформа РМСА кодируется своим геном, причем продукты каждого гена могут подвергаться альтернативному сплайсингу (например, известно по крайней мере 5 вариантов альтернативного сплайсинга для изоформы РМСА1 и 4 варианта для изоформы РМСА2). Таким образом, общее число различных форм фермента не менее 12. Наиболее широко распространены в разных тканях изоформы РМСА1 и РМСА4, изоформа РМСА2 обнаружена в нервных клетках, а изоформа РМСАЗ - в клетках мозга и скелетной мускулатуры. Разные изоформы РМСА состоят из 1080-1220 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу 120-140 кДа (Carafoli, 1991).

Как и большинство АТФаз Р-типа, молекула РМСА имеет в своем составе 10 трансмембранных а-спиральных участков, а ее N- и С-концевые участки находятся в цитоплазме. Активный центр фермента (участки связывания АТФ и фосфорилирования) расположен в большой цитоплазматической петле между 4 и 5 трансмембранными сегментами. Активность фермента может стимулироваться кислыми фосфолипидами (в первую очередь различными фосфоинозитидами), кальмодулином (СаМ) и, по-видимому, фосфорилированием РМСА цАМФ-зависимой протеинкиназой (ПКА). Участок связывания кислых фосфолипидов расположен в N-концевой части молекулы РМСА, а СаМ-связывающий центр и участок фосфорилирования ПКА локализованы в длинной С-концевой части молекулы. Именно эти участки в молекуле фермента наиболее вариабельны, что приводит к различной чувствительности разных изоформ РМСА к эндогенным регуляторам.

РМСА активируется низкими концентрациями Са2+ (Кд для Са2+ в отсутствие СаМ составляет ~1 цМ). Взаимодействие с ферментом СаМ приводит к увеличению

Л 1 сродства к Са в 5-10 раз и к увеличению максимальной скорости фермента в 2-4 раза. Предполагается, что С-концевой СаМ-связывающий участок РМСА выполняет роль "внутримолекулярного ингибитора", который связывается с активным центром фермента, ингибируя его. Связывание с этим участком СаМ в л . присутствии Са снимает это ингибирование и вызывает активацию фермента. Предполагается также, что определенную роль в снятии ингибирования играет и связывание ионов Са2+с отрицательно заряженными аминокислотными остатками С-концевого участка. Таким образом, в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ активность РМСА возрастает, что приводит к ускорению удаления Са2+ из клетки и ее переходу в состояние покоя (Carafoli, 1991).

В элеюровозбудимых тканях (мышцы разных типов, мозг, нервные клетки), а также в почках обнаружена система Na/Са-обмена, способная к электрогенному обмену 3 ионов Na+ на 1 ион Са2+ и удаляющая в состоянии покоя Са2+ из цитоплазмы клетки за счет направленного внутрь трансмембранного градиента Na+ (Левицкий, 1990; Orlov et al., 1995). При деполяризации плазматической мембраны и при увеличении уровня внутриклеточного Na+ обменник может работать в

Л 1 обратном направлении, обеспечивая ток Са в цитоплазму. Сродство Na/Ca-обменника к Са2+ в ~10-100 раз ниже, а максимальная активность в 10 раз выше, чем таковые для РМСА. Обнаружено 2 изоформы обменника (NCX1 и NCX2), состоящие из 921-970 аминокислотных остатков и имеющие молекулярную массу ~100-110 кДа. Кроме этого, обнаружены продукты альтернативного сплайсинга этих изоформ, т.е. число разных форм Na/Са-обменника, отличающихся по своим кинетическим параметрам и особенностям регуляции, достаточно велико.

Молекула Ка,Са-обменника пронизывает мембрану 11 раз, ее N-конец экспонирован во внеклеточное пространство и способен гликозилироваться, а С-конец расположен в цитоплазме. Большой цитоплазматический домен, расположенный между 5 и 6 трансмембранными а-спиральными сегментами, содержит участок связывания СаМ и регуляторный Са-связывающий центр. Расположение участков связывания транспортируемых через мембрану ионов Са2+ и Na+ пока не установлено. По-видимому, они расположены в трансмембранных сегментах, поскольку полная делеция цитоплазматического домена приводит к* потере только 50% транспортной активности обменника (Orlov et al., 1995).

Са-АТФаза внутриклеточных органелл или SERCA (аббревиатура "sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium-transporting ATPase") также представлена в разных тканях несколькими изоформами: SERCA1 обнаружена в быстрых скелетных мышцах, SERCA2a — в сердце, медленных скелетных и гладких мышцах, SERCA2b - в разных типах клеток и SERCA3 — в клетках крови и во многих эндотелиальных и эпителиальных клетках (Pozzan et al., 1994; Moller et al., 1996). Фермент состоит из 994-1042 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 110-115 кДа.

Как и РМСА, SERCA переносит через мембрану внутрь полостей ретикулума 2 иона Са2+ за счет гидролиза 1 молекулы АТФ. Молекула фермента также имеет 10 трансмембранных а-спиральных сегментов и большой цитоплазматический домен, содержащий АТФ-связывающий центр и участок фосфорилирования. В отличие от РМСА, С-концевой участок SERCA короткий и не содержит участка связывания СаМ, т.е. активность этого фермента СаМ прямо не регулируется. Однако СаМ-зависимые пути регуляции активности некоторых изоформ SERCA существуют и мы познакомимся с ними далее более подробно.

Среди клеточных органелл именно митохондрии обладают максимальной емкостью для ионов Са2+, однако в отличие от других клеточных органелл они транспортируют Са2+ не за счет энергии гидролиза АТФ, а за счет трансмембранного электрического потенциала (около -180 мВ), генерируемого на внутренней митохондриальной мембране системой переноса электронов в ходе окисления субстратов дыхания (Левицкий, 1990; Pozzan et al., 1994). До настоящего времени не установлено, какой белок (или белки) принимает участие в формировании Са-поры в митохондриальной мембране, хотя свойства этого канала интенсивно исследуются. Так, установлено, что поглощение Са2+ митохондриями полностью блокируется рутениевым красным, что указывает на участие гликопротеинов в образовании поры. Сродство канала к Са2+ сравнительно низкое (Кд >10 !~1М), а максимальная скорость транспорта Са2+ сигмоидально зависит от его концентрации и увеличивается в десятки раз при повышении концентрации Са2+ от 1 до 5 цМ. Предполагается, что митохондрии принимают участие в удалении Са2+ из цитоплазмы клеток только в экстремальных условиях, например при повреждении плазматической мембраны, когда его уровень в цитоплазме резко увеличивается. При этом поступающий в митохондрии Са2+ взаимодействует с субстратами цикла трикарбоновых кислот, ингибирует АТФ/АДФ-обмен и АТФ-синтетазу, и даже выпадает в матриксе в осадок в виде кристаллов фосфата кальция. Таким образом, вместо выполнения своей основной функции -производства энергии - митохондрии выключаются из метаболизма, спасая клетку от гибели. Учитывая крайне низкую скорость транспорта Са2+ в митохондрии в нормальных условиях, можно заключить, что они не принимают участия в регуляции быстрых изменений его концентрации в цитоплазме.

В цитоплазму клеток Са2+ поступает либо из окружающей среды через специфические Са-каналы плазматической мембраны, либо из внутриклеточных Са-депо - различных компартментов эндоплазматического ретикулума и кальцисом, мембраны которых также содержат специфические Са-каналы. Структура и особенности функционирования и регуляции этих каналов очень разнообразны и пока не до конца выяснены, хотя некоторые Са-каналы охарактеризованы достаточно хорошо.

Са-каналы плазматических мембран можно условно разделить на 4 группы: потенциалчувствительные Са-каналы, активирующиеся при деполяризации мембраны, рецепторуправляемые Са-каналы, Са-каналы, активируемые вторичными посредниками, и Са-каналы, активируемые в-белками (Авдонин, Ткачук, 1994). Хорошо изучены представители первой группы Са-каналов, тогда как представители остальных трех групп зарегистрированы, главным образом, в электрофизиологических экспериментах, поэтому их молекулярная организация практически неизвестна.

Потенциалчувствительные Са-каналы обнаружены во всех электровозбудимых тканях и, в свою очередь, также разделяются на несколько типов по кинетическим свойствам и чувствительности к мембранному потенциалу, агонистам и антагонистам. Са-каналы L-типа представляют собой гетероолигомеры и состоят из 5 разных типов субъединиц: al (155-200 кДа), а2 (130-150 кДа), которая ковалентно связана с 5-субъединицей (24-33 кДа) S-S-мостиками, р (52-56 кДа) и у (30-33 кДа). Са-пору формирует al-субъединица, она же является сенсором напряжения и связывает дигидропиридины (нифедипин, нитрендипин), фенилалкиламины (верапамил, D600) и бензотиазепины (дилтиазем). Эта субъединица состоит из четырех гомологичных трансмембранных доменов (I-IV), каждый из которых представлен шестью a-спиральными сегментами. В каждом домене четвертый трансмембранный сегмент обогащен остатками Lys и Arg (каждая третья аминокислота) и заряжен положительно. Именно эти сегменты и являются "сенсорами напряжения": при изменении мембранного потенциала они перемещаются в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, и индуцируют изменение конформации молекулы Са-канала, которое приводит к его открыванию. Проводящая Са2+ пора образована, вероятно, четырьмя мембранными петлями, расположенными между 5 и 6 a-спиральными сегментами в каждом трансмембранном домене молекулы канала. Интересно отметить, что практически идентичную al-субъединице Са-канала структуру имеет потенциалчувствительный Na-канал, а потенциалчувствительный К-канал состоит из 4 субъединиц, каждая из которых содержит 6 трансмембранных a-спиральных сегментов.

К рецепторуправляемым Са-каналам можно отнести никотиновый холинорецептор (Ыа-канал), который помимо Na+ может переносить и Са2+ (его селективность к Са2+ всего в 3-5 раз ниже, чем к одновалентным катионам), а также Са-каналы, управляемые подклассом глутаматных рецепторов - NMDA-рецепторами, и Р2-пуринорецепторами, активируемыми АТФ и АДФ. К активируемым вторичными посредниками каналам относят Са-каналы плазматической мембраны, активируемые инозитол-1,4,5-трисфосфатом (InsP3), л . инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфатом, ионами Са и циклическими нуклеотидами (цАМФ и цГМФ). Имеются также многочисленные данные о существовании Са-каналов, управляемых через G-белки, а также каналов, которые открываются после опустошения внутриклеточных Са-депо (Авдонин, Ткачук, 1994; Ткачук, 1998). Однако, как отмечалось выше, эти каналы были зарегистрированы в электрофизиологических экспериментах; особенности их молекулярной организации и регуляции изучены пока недостаточно.

К Са-каналам внутриклеточных органелл относят так называемые рианодиновые рецепторы (ЯуЯ) и рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (ЫбРэЯ), встроенные в мембраны разных компартментов эндоплазматического ретикулума и кальцисом (Вегпс^е, 1993; Ogawa е! а1., 1999). Рианодиновые рецепторы найдены к настоящему времени у млекопитающих в скелетных мышцах (изоформа ЯуЮ), сердце (изоформа Яу112), а также в мозге, почках, печени, поджелудочной железе, тонком и толстом кишечнике и во многих других тканях (изоформа ЯуЯЗ). Разные изоформы КуИ. состоят из 4872-5037 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу ~550-560 кДа. Кроме того, известно, что функциональный Са-канал представляет собой гомотетрамер. Предполагается, что 1Ч-концевая часть молекулы ЯуЯ формирует большой цитоплазматический домен, а на С-конце расположено несколько трансмембранных а-спиральных сегментов (от 4 до 10-12), формирующих Са-пору. Са-каналы 11уЯ активируются низкими (микромолярными) л , и ингибируются высокими (миллимолярными) концентрациями Са , активируются адениловыми нуклеотидами и кофеином, а также за счет взаимодействия ЯуЯ с Са-связывающими белками Б-100А и аннексином VI.

В скелетных мышцах образует прочный комплекс с а 1-субъединицей потенциалчувствительного Са-канала плазматической мембраны Ь-типа. В формировании этого комплекса принимает участие целый ряд белков ретикулума: триадин, Са-связывающие белки - СаМ, кальсеквестрин и кальретикулин. Кроме того, активность Са-каналов ЯуЯ регулируется протеинкиназами, причем не только за счет прямого фосфорилирования самого ЯуЯ, но и за счет фосфорилирования Са-связывающих белков ретикулума - кальсеквестрина, саркалюменина и богатого гистидином Са-связывающего белка. В физиологических условиях активация ЯуЮ происходит, вероятно, за счет прямой "механической" передачи конформационного сигнала от а 1-субъединицы потенциалчувствительного Са-канала при деполяризации плазматического мембраны. В сердце имеет место так называемый "Са-индуцируемый выброс Са2+": входящий в клетку из внешней среды Са2+ активирует ЯуЯ2 и вызывает выброс Са2+ из полостей ретикулума. Основным лигандом, активирующим ЯуЮ, является, по-видимому, циклическая АДФ-рибоза (сАБРЯ), которая образуется из НАД+ специальным ферментом СБ38 под влиянием различных внешних факторов ^оссЫ е1 а1., 1999). Кроме того, возможен и Са-индуцируемый выброс Са через ЯуЯЗ при повышении концентрации цитоплазматического Са2+ за счет его входа в клетки через Са-каналы плазматической мембраны или освобождения из внутриклеточных депо через ГпзРзЯ. Более подробно с рианодиновыми рецепторами мы познакомимся ниже.

Практически во всех типах клеток обнаружены 1п5Р311 (как минимум 5 изоформ, являющихся как продуктами разных генов, так и образующихся в результате альтернативного сплайсинга). Молекулярная масса 1пзР311 примерно вдвое меньше, чем ЯуЯ (~260-280 кДа, 2701-2749 аминокислотных остатков), однако его структура близка к таковой ЯуЯ. ЫэРзЯ также представляет собой гомотетрамер. Большой И-концевой цитоплазматический домен содержит участок связывания 1пэРз, а С-конец содержит трансмембранные а-спиральные участки и формирует Са-пору (Вегпс^е, 1993). В отличие от ЯуЯ ГпэРзЯ ингибируется гепарином и не активируется кофеином. По-видимому, ЯуЯ и 1шРзК локализованы в разных внутриклеточных Са-депо, между которыми возможен обмен Са2+.

1пзР3 образуется из фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата под действием специфической к фосфоинозитидам фосфолипазы С. Этот фермент активируется либо в-белками, либо за счет фосфорилирования протеинкиназами при активации целого ряда рецепторов плазматической мембраны: некоторых мускариновых холинорецепторов, Р2-пуриноцецепторов, Вг-рецепторов брадикинина, гастриновых, холецистокининовых, гистаминовых, серотониновых рецепторов, рецепторов вазопрессина, ангиотензина II, эпидермального фактора роста и других (Авдонин, Ткачук, 1994). Вторым продуктом фосфолипазы С является диацилглицерол - известный активатор протеинкиназы С.

Итак, легко видеть, что Са-каналы и Са-АТФаза сарко(эндо)плазматического ретикулума широко распространены и играют важную роль в обмене кальция в разных тканях. В мускулатуре разных типов, функциональная активность которой регулируется циклическими изменениями уровня Са2+ в цитоплазме, именно этим мембранным системам принадлежит ключевая роль в регуляции процессов сокращения и расслабления. Поскольку настоящая работа посвящена исследованию некоторых особенностей регуляции этих систем, а именно Са-каналов (рианодиновых рецепторов) и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц, познакомимся с ними более подробно.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рубцов, Александр Михайлович

выводы

1. Активность Са-каналов СР регулируется ионами Са2+, кофеином, адениловыми нуклеотидами и гистидинсодержащими дипептидами при их связывании в специфических насыщаемых участках.

2. Карнозин и его производные повышают чувствительность Са-каналов СР к активирующему действию кофеина, адениловых нуклеотидов и низких концентраций Са2+ и снижают ингибирующее действие низких концентраций М§2+, высоких концентраций Са2+ и закисления среды. Защита карнозином Са-каналов от повреждающего действия факторов, возникающих при интенсивной мышечной работе, может быть одной из причин феномена Северина.

3. Адениловые и неадениловые нуклеотиды взаимодействуют с нуклеотид-связывающими центрами Са-каналов СР, но только связывание адениловых нуклеотидов активирует Са-каналы, повышая их чувствительность к Са2+. Эффективность активирующего действия падает в ряду АТФ « (5,у-СН2-АТФ > АДФ > АМФ; сродство Са-каналов к неадениловым нуклеотидам снижается в ряду ЦТФ > ИТФ » УТФ > ГТФ.

4. В мембранных препаратах СР присутствуют два типа АТФ-связывающих участков, принадлежащих Са-АТФазе, с высоким и низким сродством. Параметры связывания АТФ в участках с высоким сродством не изменяются при переходе фермента из Е1 в Е2 конформацию.

5. Зависимость активности Са-АТФазы мембранных препаратов СР от концентрации АТФ имеет вид кривой с промежуточным плато, которая удовлетворительно описывается суммой уравнений Михаэлиса-Ментен (гипербола) и Хилла (сигмоида). Гидролиз ГТФ и пНФФ мембранными препаратами фермента и гидролиз АТФ Са-АТФазой, солюбилизированной С12Е9, описываются уравнением Михаэлиса-Ментен.

6. Са-АТФаза присутствует в мембранах СР как в виде мономеров, так и в виде олигомерных комплексов. Олигомерное состояние фермента не изменяется при переходе Са-АТФазы из Е1 в Е2 конформацию. Гидролиз АТФ мономерной формой фермента описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, а олигомерной - уравнением Хилла.

7. Мелитгин необратимо ингибирует Са-АТФазу СР. Ингибирование представляет собой двухфазный процесс и удовлетворительно описывается в рамках модели «мономер + олигомер»: связывание мелиттина с олигомерами фермента обеспечивает быструю, а с мономерами - медленную фазу инактивации Са-АТФазы. Высокие концентрации АТФ устраняют быструю фазу ингибирования Са-АТФазы мелитгином.

8. С использованием антимелиттиновых антител в скелетных мышцах кролика обнаружен мелитгин-подобный белок, идентичный по электрофоретической подвижности мелиттин-подобному белку из слизистой желудка кролика. Мелиттин-подобный белок из слизистой желудка, очищенный с помощью иммуноаффинной хроматографии, активирует Са-АТФазу СР.

9. Зависимость активности Са-АТФазы препаратов СР летних активных сусликов от концентрации АТФ имеет вид кривой с промежуточным плато, а препаратов СР зимних животных - гиперболы, независимо от их физиологического состояния. Активность фермента в зимний период снижается в 2-2,5 раза.

10. В препаратах СР скелетных мышц сусликов присутствуют эндогенные протеинкиназы, стимуляция которых приводит к активации в 2-3 раза Са-АТФазы в препаратах СР зимних спящих животных и не влияет на активность фермента препаратов СР летних сусликов. Поскольку Са-АТФаза не фосфорилируется эндогенными протеинкиназами, ее активация может быть результатом фосфорилирования неидентифицированных регуляторных белков СР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Завершая анализ полученных в настоящем исследовании результатов, можно заключить, что функциональная активность Са-каналов и Са-АТФазы СР находится под контролем многочисленных и разнообразных регуляторгых механизмов. К таким механизмам следует отнести взаимодействие этих Са-транспортирующих систем с низкомолекулярными соединениями - ионами (активаторами и ингибиторами), нуклеотидами и другими веществами, модулирующими их активность (например, гистидинсодержащими дипептидами), белок-белковые взаимодействия, как между молекулами самих Са-каналов и Са-АТФазы, так и их взаимодействие с другими регуляторными белками (например, с мелиттин-подобным белком), а также механизмы, в которые вовлечены связанные с мембранами ретикулума протеинкиназы и протеинфосфатазы.

Принципиальное значение для нормального функционирования Са-каналов играет уровень ряда внутриклеточных соединений. Так, нами продемонстрировано, что в отсутствие в среде адениловых нуклеотидов (но в присутствии ионов М§2+) Са-каналы теряют чувствительность к активирующему действию Са2+ и кофеина. Неадениловые нуклеотиды способны связываться в нуклеотидсвязывающих центрах Са-каналов, однако это не приводит к активации каналов. Можно заключить, что нормальная работа Са-каналов СР возможна только при определенной комбинации в клетке оптимальных для их работы концентраций АТФ, Са2+, М§ 2+, и, как было впервые показано в этой работе, еще одного эндогенного соединения - гистидинсодержащего дипептида карнозина. Обнаруженный нами факт, что кофеин способен взаимодействовать с богатым гистидином Са-связывающим белком, позволяет думать, что как экзогенные, так и эндогенные модуляторы активности Са-каналов СР разной природы могут осуществлять свое влияние не только за счет прямого связывания в соответствующих участках Са-каналов, но и через взаимодействие с многочисленными белками ретикулума, участвующими в регуляции их функциональной активности.

Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет обнаруженная нами способность карнозина и ряда его производных активировать Са-каналы СР скелетных мышц и сердца за счет связывания в насыщаемых участках и, что даже более важно, модулировать влияние на Са-каналы других регуляторов их активности. Так, карнозин в физиологических концентрациях повышает чувствительность Са-каналов к активирующему действию низких концентраций Са2+, адениловых нуклеотидов, кофеина и снижает ингибирущее действие низких концентраций высоких концентраций Са2+ и закисления среды. Кроме того, карнозин обладает выраженной способностью реагировать со свободными радикалами. Все это позволяет думать, что защита карнозином мышечных препаратов от развития утомления при интенсивной работе связана не только с уникальными буферными свойствами этого дипептида, но и с его специфическим влиянием на Са-каналы СР, так как он снижает негативное влияние на Са-каналы факторов, возникающих при такой работе (повышение внутриклеточной концентрации Са2+ и М§2+, рост уровня свободных радикалов, снижение рН, падение уровня АТФ).

Необходимо добавить, что на Са-каналы СР способны оказывать влияние не только водорастворимые лиганды, имеющие соответствующие участки связывания в гидрофильном домене молекулы канала, но и растворимые в мембране гидрофобные вещества. Об этом говорит обнаруженное нами неспецифическое изменение параметров работы Са-каналов в присутствии ряда производных 1,4-дигидропиридина и вердазильных радикалов гидрофобной природы. Это позволяет думать, что изменение физико-химических свойств липидного бислоя, например, при сезонном изменении фосфолипидного состава мембран СР скелетных мышц сусликов, также является одним из способов регуляции функциональной активности Са-каналов ретикулума.

Следует заметить, что, как и в случае Са-каналов СР, взаимодействие АТФ (в отличие от неадениловых нуклеотидов) с Са-АТФазой СР характеризуется рядом уникальных особенностей. Во-первых, связывание этого нуклеотида с ферментом оказывает специфическое влияние на конформацию молекулы Са-АТФазы. Во-вторых, гидролиз этого нуклеотида, в отличие от гидролиза других субстратов, не подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен: зависимость скорости гидролиза АТФ от его концентрации имеет вид кривой с промежуточным плато. И, наконец, нами обнаружена гетерогенность АТФ-связывающих центров, принадлежащих Са-АТФазе СР. В этой связи можно особо подчеркнуть высокую конформационную лабильность молекулы Са-АТФазы: конформация гидрофильного домена молекулы фермента значительно изменяется при связывании с ним АТФ, АДФ, ионов Са2+ или Мя2+, т.е. в присутствии разных лигандов могут экспонироваться или экранироваться разные участки молекулы Са-АТФазы. Такие изменения конформации могут облегчать взаимоействие или, наоборот, препятствовать взаимодействию фермента с другими регуляторами их активности, например, белковой природы, или изменять характер взаимодействия протомеров в олигомерных комплексах Са-АТФазы.

Анализ собственных экспериментальных наблюдений и данных литературы позволил нам предложить гипотетическую модель, согласно которой Са-АТФаза находится в мембранах СР в двух формах - в виде мономеров и в виде олигомерных комплексов, предположительно тетрамеров. Мономеры имеют высокое сродство к АТФ и гидролизуют этот субстрат согласно кинетике Михаэлиса-Ментен. Входящие в состав олигомерных комплексов протомеры имеют низкое сродство к АТФ, связывают этот субстрат кооперативно, и их работу можно удовлетворительно описать уравнением Хилла. Присутствие в мембранах СР олигомерных комплексов Са-АТФазы мы подтвердили с помощью электронной микроскопии, с использованием сшивающих агентов и с помощью анализа вращательной подвижности фермента в мембране. Разрушение олигомерных комплексов фермента при обработке мембран СР неионным детергентом С12Е9 приводит к изменению кинетических характеристик Са-АТФазы: гидролиз АТФ такими препаратами подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Анализ ингибирования Са-АТФазы пептидом из яда пчелы мелштином полностью подтвердил предложенную модель: ингибирование этим пептидом мономерной и олигомерной форм фермента протекает с разной скоростью, причем АТФ защищает от ингибирования только олигомерную форму Са-АТФазы. Это подтверждает наш вывод, что связывание АТФ индуцирует разные изменения конформации мономеров Са-АТФазы и молекул фермента, входящих в состав олигомерных комплексов. При связывании АТФ участок связывания мелиттина становится недоступным для этого пептида только в молекулах Са-АТФазы, входящих в состав олигомерных комплексов.

С помощью антимелитгиновых антител из слизистой желудка кролика нами был выделен белок с молекулярной массой 67 кДа (мелиттин-подобный белок), который активирует Са-АТФазу СР, т.е. активность этого фермента может регулироваться и за счет белок-белковых взаимодействий. Если предположить, что, как и в случае с мелиттином, АТФ препятствует взаимодействию этого белка с олигомерами Са-АТФазы, то его активирующее действие направлено только на мономерную форму фермента. Таким образом, регуляторы белковой природы или низкомолекулярные соединения могут по-разному модулировать активность мономерной и олигомерной форм Са-АТФазы.

Важно подчеркнуть, что соотношение мономерюлигомер Са-АТФазы в мембранах СР не изменяется при изменении основного конформационного состояния молекулы фермента (Е1 или Е2), при связывании лигандов или при изменении температуры (в пределах от 15 до 37°С). Разрушить олигомерные комплексы Са-АТФазы можно обработкой детергентами, а индуцировать олигомеризацию можно достаточно сильным воздействием на мембраны СР (термообработка в присутствии ЭГТА, добавление мелиттина, добавление локальных анестетиков). Возможно, определенную роль в поддержании устойчивости олигомерных комплексов Са-АТФазы в мембранах СР играют пока не известные нам регуляторные белки.

Интересным объектом для исследования особенностей регуляции активности Са-АТФазы являются препараты СР скелетных мышц типичного гибернатора - суслика Б.ипйиШш. Зависимость скорости гидролиза АТФ Са-АТФазой препаратов СР летних активных животных от концентрации субстрата имеет характерный вид кривой с промежуточным плато. Однако в зимний период кинетические параметры работы Са-АТФазы изменяются: активность фермента резко падает, при этом гидролиз АТФ описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Так как солюбилизация мембранных препаратов СР (перевод Са-АТФазы в мономерную форму) не приводит к снижению активности фермента, можно полагать, что в зимний период в СР скелетных мышц сусликов из работы полностью «выключаются» олигомеры Са-АТФазы. Обнаруженная нами активация Са-АТФазы препаратов СР зимних животных при стимуляции эндогенных протеинкиназ позволяет полагать, что в регуляцию активности этого фермента, по крайней мере его олигомерной формы, вовлечены протеинкиназы (и протеинфосфатазы). Поскольку сама Са-АТФаза не является мишенью для эндогенных протеинкиназ, следует признать, что ее активность в ретикулуме животных-гибернаторов в разные сезоны регулируется посредством изменения уровня фосфорилирования/дефосфорилирования регуляторных белков ретикулума, не идентифицированных на настоящий момент.

Следует отметить, что в зимний период значительно измененяется белковый состав мембран СР: содержание Са-связывающих белков снижается в 3-4 раза. Эти изменения могут играть определенную роль в регуляции активности Са-АТФазы СР скелетных мышц сусликов в зимний период Если в поддержании устойчивости и активного состояния олигомерных комплексов молекул фермента участвуют регуляторные белки мембран СР, то снижение их количества (или увеличение содержания других регуляторных белков), или же изменение уровня их фосфорилирования (или дефосфорилирования) эндогенными протеинкиназами может запускать механизм, который приводит к выключению из работы олигомерных комплексов Са-АТФазы, приводя к снижению активности этого фермента и, как следствие, к снижению общих энергозатрат животных гибернаторов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Рубцов, Александр Михайлович, Москва

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. (1994) Рецепторы и внутриклеточный кальций. М., Наука. 288 с.

2. Арчаков А.И., Канаева И.П., Хайтина С.З. (1979) Реконструкция мембран эндоплазматического ретикулума печени из солюбилизированных белков и липидов при удалении детергента сорбцией. Биохимия 44, 490-496.

3. Белоусов А.Б. (1993) Роль центральной нервной системы в контроле зимней спячки. Успехи физиол. наук 24, 109-127.

4. Болдырев A.A. (1998) Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М., МГУ, 320 с.

5. Болдырев A.A., Лебедев A.B. (1967) О влиянии имидазола и карнозина на работоспособность тетанической мышцы при ее непосредственном раздражении. Биохимия 32, 600-607.

6. Болдырев A.A., Лебедев A.B., Ритов В.Б. (1969) Об аденозинтрифосфатазной активности и поглощении Ca фрагментами саркоплазматического ретикулума. Биохимия 34, 119-123.

7. Векшин Н.Я. (1987) Об использовании пирена в качестве люминесцентного индикатора вязкости модельных и биологических мембран. Биол. науки, 11, 59-66.

8. Владимиров Ю.А, Добрецов Г.Е (1980) Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., Наука, 267 с.

9. Добрынина О.В. (1967) Изучение биосинтеза анз'ерина и карнозина в грудной мышце цыпленка. Биохимия 32, 612-618.

10. Иванов К.П. (1984) Физиология терморегуляции. Ленинград, Наука, 157 с.

11. Калабухов Н.И. (1985) Спячка млекопитающих. М., Наука, 258 с.

12. Кокоз Ю.М., Гриченко A.C., Корыстова А.Ф., Ланкина Д.А., Маркевич Н.И. (2000) Регуляция Са2+"каналов L-типа в кардиоцитах зимоспящих животных. Биол. мембраны 17, 217-222.

13. Кэтти Р.П. (1991) Антитела Методы. М., Мир, 269 с.

14. Лакович Дж. (1986) Основы флуоресцентной спектроскопии. М., Мир, 496 с.

15. Левицкий Д.О. (1990) Кальций и биологические мембраны. М., Высшая школа. 124 с.

16. Лопина О.Д., Болдырев A.A. (1975) Влияние дипептидов карнозина и анзерина на аккумуляцию Ca фрагментами саркоплазматического ретикулума. Докл. АН СССР 220, 1218-1223.

17. Лукоянова H.A., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. (1997а) Изучение АТФазных и регуляторных свойств миозина скелетных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки. Биофизика 42, 343-347.

18. Львова С.П., Чубуркова С.С. (1983) Содержание гликогена и фосфорилазная активность в различных мышцах крыс и сусликов при гипотермии, самосогревании и зимней спячке. Укр. биохим. журн. 55,39-44.

19. Мешкова Н.П. (1964) Дипептиды скелетной мускулатуры карнозин и анзерин. Усп. биол. химии 6, 86-107.

20. Наградова Н.К. (1958) Влияние карнозина на реакцию гликолитической оксидоредукции, сопряженной с фосфорилированием. Биохимия 23, 511-521.

21. Пантелеев П.А. (1983) Биоэнергетика мелких млекопитающих: адаптация грызунов и насекомоядных к температурным условиям окружающей среды. М., Наука, 271 с.

22. Пелози M., Донелла-Деана А. (2000) Локализация, очистка и характеристика кальмодулин-зависимой протеинкиназы, связанной с саркоплазматическим ретикулумом кролика. Биохимия 65, 309-320.

23. Петухов В.Б., Гусев Н.Б., Болдырев A.A. (1976) Влияние карнозина и анзерина на возбуждение и сокращение утомленной скелетной мышцы. Укр. биохим. журн. 48, 477-484.

24. Подлубная З.А. (1992) Ферменты в толстых нитях поперечно-полосатых мышц позвоночных. Биохимия 57, 1785-1814.

25. Ритов В.Б., Мельгунов В.И., Комаров П.Г., Алексеева О.Н., Акимова Е.И. (1977) Интегральные белки мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и карпа. Докл. АН СССР 233, 727-733.

26. Ритов В.Б., Щербакова Н.С. (1982) Транспорт Са2+ мембраносвязанной мономерной формой Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума. Бюлл. эксперим. биол. мед. 4, 21-23.

27. Рэкер Э. ( 1979) Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. М.: Мир, 216с.

28. Северин С.Е., Глемжа A.A. (1964) Влияние производных имидазола на пируватдегидрогеназу мышечной ткани. Биохимия 29,1170-1176.

29. Северин С.Е., Иванов В.И., Карузина Н.П., Юделевич Р.Я. (1948) Влияние карнозина на углеродно-фосфорный обмен мышц. Биохимия 3, 158-169.

30. Северин С.Е., Кирзон М.В., Кафтанова Т.М. (1953) Влияние карнозина и ансерина на работу изолированной мышцы лягушки. Докл. АН СССР 91, 691694.

31. Северин С.Е., Шестаков C.B., Воробьев O.E. (1961) Влияние карнозина, анзерина, гистидина и некоторых аминокислот на активность дегидразы пировиноградной кислоты из грудных мышц голубя. ДАН СССР 138, 462-465.

32. Северин С.Е., Юй Шу-юй (1958) Влияние дипептидов карнозина и анзерина на окислительное фосфорилирование в изолированных митохондриях грудной мыщцы голубя. Биохимия 23, 862-868.

33. Северин, С.Е. (1954) Распространение, превращение в организме и биологическое значение карнозина и анзерина. Yen. биол. химии 2, 355-376.

34. Скулачев В.П. (1992) Карнозин и анзерин как специализированные рН-буферы — переносчики ионов водорода. Биохимия 57, 1311-1316.

35. Соколов В.Е., Сухов В.П., Сухова Г.С., Игнатьев Д.А. (1995) Суточные и сезонные изменения температуры и сердечного ритма длиннохвостого суслика Citellus undulatus. Докл. Акад. Наук 344, 282-286.

36. Ткачук В.А. (1998) Фосфоинозитидный обмен и осцилляции ионов Са . Биохимия 63, 47-56.

37. Эмирбеков Э.З., Львова С.П. (1991) Энергетический метаболизм при гибернации у представителей разных филогенетических групп. Успехи физиол. наук 22, 97-111.

38. Abe, Н. (1983) Distribution of free L-histamine and related dipeptides in the muscle of fresh-water fishes. Сотр. Biochem. Physiol. 79B, 35-39.

39. Abe, H. (1995) Histidine-related dipeptides: distribution, metabolism, and physiological function. Metabolic Biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes. (Hochachka, P. W., and Mommsen, T. P., eds.). 4, 309-333.

40. Abe, H., and Ohmama, S. (1987) Effect of starvation and sea-water acclimation on the concentration of free L-histidine and related dipeptides in the muscle of eel, rainbow trout and Japanese dace. Сотр. Biochem. Physiol. 88B, 507-511.

41. Abe, H., and Okuma, E. (1991) Effect of temperature on the buffering capacities of histidine-containing compounds in fish skeletal muscle. Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 57,2101-2107.

42. Abe, H., Dobson, G., Hoeger, U., and Parkhouse, W. (1986) Role of histidine-related compounds to intracellular buffering in fish skeletal muscle. Am. J. Physiol. 249,449-454.

43. Abramson, J. J., and Salama, G. (1989) Critical sulfhydrils regulate calcium release from sarcoplasmic reticulum. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 283-294.

44. Ackerman, D., Timpe, O., and Poller, K. (1929) Uber das Anserine, einen Neuen Bestandtieil der Vogelmuskulatur. H.-S. Zeitschr. Physiol. Chem. 183, 1-10.

45. Agostini, В., De Martino, L., Soltau, В., and Hasselbach, W. (1991) The modulation of calcium transport by skeletal muscles sarcoplasmic reticulum in the hibernating European hamster. Z Naturforsch. 46c, 1109-1126.

46. Alekseev, A. E., Markevich, N. I., Korystova, A. F., Lankina, D. A., and Kokoz Yu. M. (1997) The kinetic characteristics of the L-type calcium channels in cardyocytes of hibernators. 1. Development of kinetic model. Membr. Cell Biol. 11, 31-44.

47. Alekseev, A. E., Markevich, N. I., Korystova, A. F., Terzic, A., and Kokoz, Y. M. (1996) Comparative analysis of the kinetic characteristics of L-type calcium channels in cardiac cells of hibernators. Biophys. J. 70, 786-797.

48. Allen, D. G., Lannergren, J., and Westerblad, H. (1995) Muscle cell function during prolonged activity: cellular mechanisms of fatigue. Exp. Physiol. 80,497-527.

49. Andersen, J. P. (1989) Monomer-oligomer equilibrium of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase and the role of subunit interaction in the Ca pump mechanism. Biochim. Biophys. Acta 988, 47, 1-72.

50. Andersen, J. P., and Moller, J. V. (1985) The role of Mg2+ and Ca2+ in the simultaneous binding of vanadate and ATP at the phosphorylation site of1. S|sarcoplasmic reticulum Ca -ATPase. Biochim. Biophys. Acta 815, 9-15.

51. Andersen, J. P., and Vilsen, B. (1985) Equilibrium between monomers and oligomers of soluble Ca2+-ATPase during the functional cycle. FEBS Lett. 189, 1317.

52. Anderson, K. W., and Murphy, A. J. (1983) Alterations in the structure of the ribose moiety of ATP reduce its effectiveness as a substrate for the sarcoplasmic reticulum ATPase. J. Biol. Chem. 258, 14276-14278.

53. Ashley, R. H., and Williams, A. J. (1990) Divalent cation activation and inhibition of single calcium release channels from sheep cardiac sarcoplasmic reticulum. J. Gen. Physiol. 95, 981-1005.

54. Bailin, G., and Huang, J. R. (1990) Fluorescence properties of the Ca2+,Mg2+-ATPase protein of sarcoplasmic reticulum labelled with 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole. FEBS Lett., 259, 254-256.

55. Baker, K. J., East, J. M., and Lee, A. G. (1995) Mechanism of inhibition of the Ca2+-ATPase by melittin. Biochemistry 34, 3596-3604.

56. Barnes, B. (1989) Freeze avoidance in mammal body temperatures below 0°C in arctic hibernator. Science 244, 1593-1595.

57. Bartlett, G. R. (1959) Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234, 466-468.

58. Baskin, R. J., and Hanna, S. (1979) Cross-linking of the (Ca2+ + Mg2+)-ATPase protein. Biochim. Biophys. Acta 576, 61-70.

59. Baskin, R. J., and Kawamoto, R. (1984) Stereological analysis of transverse tubules and sarcoplasmic reticulum isolated from normal and dystrophic skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta 771, 109-118.

60. Bastide, B., Conti, A., Sorrentino, V., and Mounier, Y. (2000) Properties of ryanodine receptor in rat muscles submitted to unloaded conditions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 270, 442-447.

61. Bate-Smith, E. S. (1938) The buffering of muscle in rigor: protein, phosphate, and carnosine. J. Physiol. 92, 336-343.

62. Bayer, K. U., Harbers, K., and Schulman, H. (1998) AlphaKAP is an anchoring protein for a novel CaM kinase II isoform in skeletal muscle. EMBO J. 17, 55985605.

63. Bazzo, R., Tappin, M. J., Pastore, A., Harvey, T. S., Carver, J. A., and Campbell, I. D. (1988) The structure of melittin. A 'H-NMR study in methanol. Eur. J. Biochem. 173, 139-146.

64. Beeler, T., and Keffer, J. (1984) The rate of Ca translocation by sarcoplasmic reticulum (Ca2+ + Mg2+)-ATPase measured with intravesicular arsenazo III. Biochim. Biophys. Acta 773, 99-105.

65. Belcastro, A. N. (1993) Skeletal muscle calcium-activated neutral protease (calpain) with exercise. J. Appl. Physiol. 74, 1381-1386.

66. Belke, D. D., Pehowich, D. J., and Wang, L. C. H. (1987) Seasonal variation in calcium uptake by cardiac sarcoplasmic reticulum in a hibernator, the Richardson's ground squirrel. J. Therm. Biol. 12, 53-56.

67. Berridge, M. J. (1993) Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature 361, 315-325.

68. Bertocchini, F., Ovitt, C.E., Conti, A., Barone, V., Scholer, H.R., Bottinelli, R., Reggiani, C., and Sorrentino, V. (1997) Requirement for the ryanodine receptor type 3 for efficient contraction in neonatal skeletal muscles. EMBO J. 16, 69566963.

69. Bigelow, D. J., and Inesi, G. (1992) Contributions of chemical derivatization and spectroscopic studies to the characterization of the Ca2+ transport ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1113, 323-338.

70. Birmachu, W., and Thomas, D. (1990) Rotational dinamics of the Ca-ATPase in sarcoplasmic reticulum studied by time resolved phosphorescence anisotropy. Biochemistry 29,3904-3914.

71. Block, B. A. (1994) Thermogenesis in muscle. Ann. Rev. Physiol. 56, 535-577.

72. Boldyrev, A. A., and Petukhov, V. B. (1978) Localization of carnosine effect on the fatigued muscle preparation. Gen. Pharmacol. 9, 17-20.

73. Boldyrev, A. A., and Severin, S. E. (1990) The histidine-containing dipeptides, carnosine and asnserine: distribution, properties and biological significance. Adv. Enzyme Regul. 30, 175-193.

74. Brandi, C. J., Green, N. M., Korczak, B., and MacLennan, D. H. (1986) Two Ca2+ ATPase genes: homologies and mechanistic implications of deduced amino acid sequences. Cell 44, 597-607.

75. Brandt, N.R., Caswell, A.H., Brunschwig, J.-P., Kang, J.-J., Antoniu, B., and Ikemoto, M. (1992) Effects of anti-triadm antibody on Ca release from sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett. 299, 57-59.

76. Brandt, N.R., Caswell, A.H., Wen, S.-R., and Talvenheimo, J.A. (1990) Molecular interactions of the junctional foot protein and dihydropyridine receptor in skeletal muscle triads. J. Membr. Biol. 113, 237-251.

77. Buettner, G. R. (1987) Spin trapping: ESR parameters of spin adducts. Free Rad. Biol. Med., 3,259-303.

78. Burkli A., and Cherry R. J., (1981) Rotational motion and flexibility of Ca, Mg-dependent adenosine 5'-triphosphatase in sarcoplasmic reticulum membranes. Biochemistry 20,138-145.

79. Burns, K., and Michalak, M. (1993) Interactions of calreticulin with proteins of the endoplasmic and sarcoplasmic reticulum membranes. FEBS Lett. 318, 181-185.

80. Cala, S. E., and Jonez, L. R. (1991) Phosphoiylation of cardiac and skeletal muscle calsequestrin isoforms by casein kinase II. Demonstration of cluster of unique rapidly phosphorylated sites in cardiac calsequestrin. J. Biol. Chem. 266, 391-398.

81. Campagnola, P. J., Wei, M. D., Lewis, A., and Loew, L. M. (1999) High-resolution nonlinear optical imaging of live cells by second harmonic generation. Biophys. J. 77,3341-3349.

82. Campbell, K. P., MacLennan, D. H., and Jorgensen, A. O. (1983) Staining of the Ca2+-binding proteins, calsequestrin, calmodulin, troponin C, and S-100, with the cationic carbocyanine dye "Stains-all". J. Biol. Chem. 258, 11267-11273.

83. Carafoli, E. (1991) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev. 71, 129153.

84. Carvalho-Alves, P. C., Oliveira, C. R., and Verjovski-Almeida, S. (1985) Stoichiometric photolabeling of two distinct low and high affinity nucleotide sites in sarcoplasmic reticulum ATPase. J. Biol. Chem. 260, 4282-4287.

85. Castellani, L., Hardwicke, P. M. D., and Vibert, P. (1985) Dimer ribbons in the three-dimensional structure of sarcoplasmic reticulum. J. Mol. Biol. 185, 579-594.

86. Caswell, A. H., and Brandt, N. R. (1981) Ion-induced release of calcium from isolated sarcoplasmic reticulum. J. Membr. Biol. 58, 21-33.

87. Chen, S.R.W., Ebisawa, K., Li, X., and Zhang, L. (1998) Molecular identification of the ryanodine receptor Ca2+ sensor. J. Biol. Chem. 273, 14675-14678.

88. Chen, Z., Sheves, M., Lewis, A., and Boulevich, O. (1994) A comparison of second harmonic generation from light-adapted, dark adapted, blue, and purple membrane. Biophys.J. 67, 1155-1160.

89. Chu, A., Diaz-Munoz, M., Hawkes, M. J., Brush, K., Hamilton, S. L. (1990) Ryanodine as a probe for the functional state of the skeletal muscle sarcoplasmic reticulum calcium release channel. Mol. Pharmacol. 37, 735-741.

90. Chu, A., Sumbilla, C., Inesi, G., Jay, S. D., and Campbell, K. P. (1990a) Specific association of calmodulin-dependent protein kinase and related substrates with the junctional sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Biochemistry 29, 5899-5905.

91. Coan, C., Scales, D. J., and Murphy, A. (1986) Oligovanadate binding to sarcoplasmic reticulum ATPase. Evidence for substrate analogue behavior. J. Biol. Chem. 261, 10394-10403.

92. Cohen, P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Ann. Rev. Biochem. 58, 453-508.

93. Coll, R. J., and Murphy, A. J. (1985) Sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase: product inhibition suggests an allosteric site for ATP activation. FEBS Lett., 187, N1, 131134.

94. Coll, R. J., and Murphy, A. J. (1991) Kinetic evidence for two nucleotide binding site on the Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochemistry, 30, N6, 14561461.

95. Collins, J. H., Tarcsafalvi, A., and Ikemoto, N. (1990) Identification of a region of calsequestrin that binds to the junctional face membrane of sarcoplasmic reticulum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 167, 189-193.

96. Coppolino, M. G., and Dedhar, S. (1998) Molecules in focus. Calreticulin. Int. J. Biochem. Cell Biol 30, 553-558.

97. Crush, K. (1970) Carnosine and related substances in animal tissues. Comp. Biochem. Physiol., 34, 3-30.

98. Cuppoletti, J. (1989) Melittin inhibition of the gastric (H'-K'^-ATPase and photoaffinity labeling with I. Asidosalicylil melittin. Arch. Biochem. Biophys. 275, 263-270.

99. Cuppoletti, J. (1990) I25 I. Asidosalicylil melittin binding domains: evidence for a polypeptide receptor on the gastric (H+-K+)-ATPase. Arch. Biochem. Biophys. 278, 409-415.

100. Cuppoletti, J., and Abbott, A. J. (1990) Interaction of melittin with the (Na+-K+)ATPase: evidence for a melittin induced conformational change. Arch. Biochem. Biophys. 283 249-257.

101. Cuppoletti, J., Huang, P., Kaetzel, M. A., and Malinowska, D. H. (1993) Stimulus-associated protein in gastric parietal cell detected using antimelittin antibody. Am. J. Physiol. 264, G637-G644.

102. Dalton, K. A., Pilot, J. D., Mall, S., East, J. M., and Lee, A. G. (1999) Anionic phospholipids decrease the rate of slippage on the Ca(2+)-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 342, 431-438.

103. Damiani, E., Sacchetto, S., and Margreth, A. (2000a) Phosphoiylation of anchoring protein by calmodulin protein kinase associated to the sarcoplasmic reticulum of rabbit fast-twitch muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 181-189.

104. Dawson, C. R., Drake, A. F., Hellivell, J., and Hider, R. C. (1978) The interaction of bee melittin with lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta 510, 75-86.

105. De Foresta, B., Chapeil, P., and Le Maire, M. (1990) Different classes of tryptophan residues involved in conformational changes characteristic of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase cycle. Eur. J. Biochem. 194, 383-288.

106. De Grado, W. F„ Musso, G. F., Lieber, M., Kaiser, E. T., and Kezdy, F. J. (1982) Kinetics and mechanism of hemolysis induced by melittin and by synthetic melittin analogue. Biophys. J. 37, 329-338.

107. De Meis L., and Inesi G. (1982) The transport of calcium by sarcoplasmic reticulum and various microsomal preparations. In: Membrane transport of calcium (Carafoli E., ed.). Academic Press, London, 22-226.

108. De Meis, L., and Vianna, A. L. (1979) Energy interconversion by the Ca2+-transport ATPase of sarcoplasmic reticulum. Ann. Rev. Biochem. 48, 272-292.

109. Dean, W. L., and Tanford, C. (1978) Properties of a delipidated, detergent-activated Ca2+-ATPase. Biochemistry 17, 1683-1690.

110. Degani, C., and Boyer, P. D. (1973) A borohydride reduction method for characterization of the acyl phosphate linkage in proteins and its application to sarcoplasmic reticulum adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem. 248, 8222-8226.

111. Dempsey, C. E. (1990) The actions of melittin on membranes. Biochim. Biophys. ¿eta 1031, 143-161.

112. Denborough, M. (1998) Malignant hyperthermia. Lancet 352, 1131-1136.

113. Dode, L., Van Baelen, K., Wuytack, F., and Dean, W. L. (2001) Low temperature molecular adaptation of the skeletal muscle sarco(endo)plasmic reticulum Ca

114. ATPase 1 (SERCA 1) in the wood frog (Rana sylvatica). J. Biol. Chem. 276, 39113919.

115. Drake, A. F., and Hider, R. C. (1979) The structure of melittin in lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta 555, 371-373.

116. Dufourcq, J., and Faucon, J.-F. (1977) Intrinsic fluorescence stude of lipid-protein interactions in membrane models: Binding of melittin, an amphipathic peptide, to phospholipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta 467, 1-11.

117. Dumonteil, E., Barre, H., and Meissner, G. (1993) Potential role of palmitoylLcarnitine modulation of the avian Ca release channel in muscular nonshivering thermogenesis. Biophys. J. 64, A304.

118. Dupont, Y., and Le Maire, M. (1980) Fluorometric study of the solubilized Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett. 115, 247-252.

119. Dupont, Y., Pougeoois, R., Ronjat, M., and Verjovsky-Almeida, S. (1985) Two distinct classes of nucleotide binding sites in sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase revealed by 2',3'-0-(2,4,6-trinitrocyclohexadienylidene)-ATP. J. Biol. Chem. 260, 7241-7249.

120. Dux, L., and Martonosi, A. (1983) Two-dimensional arrays of proteins in sarcoplasmic reticulum and purified Ca -ATPase vesicles treated with vanadate. J. Biol. Chem. 258, 2599-2603.

121. Dux, L., Tailor, K. A., Ting-Beal, H. P., and Martonosi, A. (1985) Crystallization of the Ca -ATPase of sarcoplasmic reticulum by calcium and lanthanide ions. J. Biol. Chem. 260, 11730-11743.

122. Ebasi, S. (1958) A granule-bound relaxation factor in skeletal muscle. Arch. Biochem. Biophys., 76, 410-423.

123. Eberstein, A., and Sandow, A. (1976) Fatigue mechanisms in muscle fibers. In: The Effects of Use and Disuse in Neuromuscular Function (Guttman, E., and Hink, P., eds.). Amsterdam, Elsevier, 515-526.

124. Eckert, K., Grosse, R., Levitsky, D. O., Kusmin, A. V., Smirnov, V. N., and Repke, K. R. H. (1977) Determination and functional significance of low affinity nucleotide sites of Ca +Mg -dependent ATPase. Acta Biol. Med. Germ., 36, Kl-K10.

125. Eisenberg, D. (1984) Three-dimensional structure of membrane and surface proteins. Ann. Rev. Biochem. 53, 595-623.

126. El Hachimi Z., Tijuane M., Boissonnet G., Benjouad A., Desmadril M., and Yon J. M. (1990) Regulation of the skeletal muscle metabolism during hibernation of Jaculus orientalis. Comp. Biochem. Physiol. 96B, 457-459.

127. El-Hayek, R., Valdivia, C., Valdivia, H. H., Hogan, K., and Coronado, R. (1993)i

128. Palmitoyl carnitine: activation of the Ca release channel of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum by palmitoyl carnitine and related long chain fatty acid derivatives. Biophys. J. 65, 779-789.

129. Engvall, E., and Perlman, P. (1971) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8, 871-874.

130. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stalmer, J. S., and Meissner, G. (2000) The skeletal muscle calcium release channel: coupled 02 sensor and NO signaling functions. Cell 102, 499-509.

131. Fabiato, A. (1988) Computer programs for calculating total from specified free or free from specified total ionic concentrations in aqueous solutions containing multiple metals and ligands. Methods Enzymol. 157, 378-416.

132. Fahlman, A., Storey, J. M., and Storey, K. B. (2000) Gene up-regulation in heart during mammalian hibernation. Cryobiology 40, 332-342.

133. Fano, G., Marsili, V., Angelella, P., Aisa, M. C., Giambanko, I., and Donato, R. (1989) S-100ao protein stimulates Ca2+-induced Ca2+ release from isolatedsarcoplasmic reticulum vesicles. FEBSLett. 255, 381-384.i

134. Favero, G. F. (1999) Sarcoplasmic reticulum Ca release and muscle fatigue. J. Appl. Physiol 87,471-483.

135. Feng, W., Liu, G., Allen, P. D., and Pessah, I. N. (2000) Transmembrane redox sensor of ryanodine receptor complex. J. Biol. Chem. 275, 35902-35907.

136. Ferris, C.D., Huganir, R.L., Supattapone, S., and Snyder, S.H. (1992) Purified IP3 receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature 342, 87-89.

137. Fiehn, W., and Hasselbach, W. (1970) The effect of phospholipase A on the calcium transport and the role of unsaturated fatty acids in ATPase activity of sarcoplasmic vesicles. Eur. J. Biochem. 154, 7-14.

138. Fink, R. H. A., and Veigel, C. (1996) Calcium uptake and release modulated by counter-ion conductances in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Acta Physiol. Scand. 156, 387-396.

139. Fleischer, S., and Inui, M. (1989) Biochemistry and biophysics of excitation-contraction coupling. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18, 333-364.

140. Fortea, M.-I., Soler, F., and Fernandes-Belda, F. (2000) Insight into the uncoupling mechanism of sarcoplasmic reticulum ATPase using the phosphorylating substrate UTP.J. Biol. Chem. 275, 12521-12529.

141. Franzini-Armstrong, C., and Ferguson, D. G. (1985) Density and disposition ofy I

142. Ca -ATPase in sarcoplasmic reticulum membrane as determined by shadowing technique. Biophys. J. 48, 607-615

143. Franzini-Armstrong, C., and Protasi, F. (1997) Ryanodine receptors of striated muscles: a complex channel capable of multiple interactions. Physiol. Rev. 77, 699729.

144. Franzini-Armstrong, C., Kenney, L. J., and Varriano-Marston, E. (1987) The structure of calsequestrin in triads of vertebrate skeletal muscle: a deep-etch study. J. Cell. Biol 105,49-56.

145. Franzini-Armstrong, C., Protasi, F., and Ramesh, V. (1999) Shape, size, and distribution of Ca2+ release units and couplons in skeletal and cardiac muscles. Biophys. J. 77, 1528-1539.

146. Freedman, R. B., and Radda, G. K. (1968) The reaction of 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid with amino acids, peptides, and proteins. Biochem. J., 108,383-391.

147. Froemming, G. R., and Ohlendieck, K. (1998) Oligomerisation of Ca -regulatory membrane components involved in the excitation-contraction-relaxation cycle during postnatal development of rabbit skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta 1387, 226-238.

148. Froemming, G.R., Pette, D., and Ohlendieck K. (1999) The 90-kDa junctional sarcoplasmic reticulum protein forms an integral part of a supramolecular triad complex in skeletal muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261, 603-609.

149. Fruen, B.R., Bardy, J.M., Byrem, T.M., Strasburg, G.M., and Louis, C.F. (2000) Differential Ca(2+) sensitivity of skeletal and cardiac muscle ryanodine receptors in the presence of calmodulin. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, C724-C733.

150. Fukushima, N., Kohno, M., Kato, T., Kawamoto, S., Okuda, K., Misuk, Y., and Ueda, H. (1998) Melittin, a metabostatic peptide inhibiting Gs activity. Peptides 19, 811-819.

151. Fung, L. W.-M., and Johnson, M. E. (1984) Recent developments in spin label EPR methodology for biomembrane studies. Curr. Top. Bioenerg. 13, 107-15.

152. Galione, A., Lee, H. C., and Busa, W. B. (1991) Ca2+-induced Ca2+ release in sea urchin egg homogenates: modulation by cyclic ADP-ribose. Science 253, 11431146.

153. Gao, L., Tripathy, A., and Meissner, G. (1997) Evidence for a role of C-terminal amino acid residues in skeletal muscle Ca release channel (iyanodine receptor) function. FEBSLett. 412, 223-226.

154. Geiser, F. (1988) Reduction of metabolism during hibernation and daily torpor in mammals and birds: temperature effect or physiological inhibition? J. Comp. Physiol. 158B, 25-37.

155. Geiser, F., and Ruf, T. (1995) Hibernation versus daily torpor in mammals and birds. Physiological variables and classification of torpor patterns. Physiol. Zool. 68, 935-966.

156. Georghiou, S., Thompson, M., and Mukhopadhyay, A. K. (1981) Melittin-phospholipid interaction: Evidence for melittin aggregation. Biochim. Biophys. Acta 642, 429-432.

157. Georghiou, S., Thompson, M., and Mukhopadhyay, A. K. (1982) Melittin-phospholipid interaction studied by employing the single tryptophan residue as an intrinsic fluorescent probe. Biochim. Biophys. Acta 688, 441-452.

158. Gulevitch, V. S. (1911) Zur Kennetnis der Extractstoffe der Muskulen. Uber die Konstitution des Carnosine. Zisch. Pgysiol. Chem., 73, 434-443.

159. Gulevitch, V. S., and Amiradgibi, S. (1900) Uber das Carnosine, eine Neue Organische Base des Fleischeextreacten. Ber. Dtsch. Ges., 33, 1902-1903.

160. Guo, W., Jorgensen, A. O., Jones, L. R., and Campbell, K. P. (1996) Biochemical characterization and molecular cloning of cardiac triadin. J. Biol. Chem. 271, 458465.

161. Haberman, E. (1972) Bee and wasp venoms. Science 177, 314-322.

162. Han, J.W., Thieleczek, R., Varsanyi, M., and Heilmeyer, L. M. G. (1992) Compartmentalized ATP synthesis in skeletal muscle triads. Biochemistry 31, 377384.

163. Harmon, S., Froemmig, G. R., Leisner, E., Pette, D., and Ohlendieck, K. (2001) Selected contribution: Low-frequency stimulation of fast muscle affects abundance of Ca -ATPase but not its oligomenc status. J. Appl. Physiol. 90, 371-379.

164. Harrison, S. M., Lamont, C., and Miller, D. J. (1985) Carnosine and other natural imidazoles enhance muscle Ca sensitivity and are mimicked by caffeine and AR-L 115BS. J. Physiol. 371, 197P.

165. Hasselbach, W. (1978) The reversibility of the sarcoplasmic calcium pump. Biochim. Biophys. Acta 515, 23-53.

166. Hasselbach, W., and Makinose, M. (1962) ATP and active transport. Biochem. Biophys. Res. Commun. 7, 132-136.

167. Hazarika, P., Kaetzel, M. A., Sheldon, A., Karin, N. J., Fleischer, S., Nelson, T. E., and Dedman, J. R. (1991a) Annexin VI is associated with calcium-sequestering organelles. J. Cell. Biochem. 46, 78-85.

168. Hazarika, P., Sheldon, A., Kaetzel, M. A., Diaz-Munoz, M., Hamilton, S. L., and Dedman, J. R. (1991b) Regulation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-release channel requires intact annexin VI. J. Cell. Biochem. 46, 86-93.

169. Heldmaier, G., and Ruf, T. (1992) Body temperature and metabolic rate during natural hypothermia in endoterms. J. Comp. Physiol. 162B, 696-706.

170. Heller, H. C. (1979) In hibernation: neural aspects. Ann. Rev. Physiol. 41, 305-321.

171. Hermann-Frank, A., and Varsanyi, M. (1993) Enhancement of Ca2+ release channel activity by phosphorylation of the skeletal muscle ryanodine receptor. FEBS Lett. 332,237-242.

172. Hermann-Frank, A., Darling, E., and Meissner, G. (1991) Functional characterization of the Ca -gated Ca release channel of vascular smooth muscle sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett. 221, 119-123.

173. Hidalgo, C., Thomas, D. D., and Ikemoto, N. (1978) Effect of the lipid environment on protein motion and enzymatic activity of sarcoplasmic reticulum calcium ATPase. J. Biol. Chem. 253, 6879-6887.

174. Hider, R. C., Khader, F., and Tatham, A. S. (1983) Lytic activity of monomeric and oligomeric melittin. Biochim. Biophys. Acta 728, 206-214.

175. Highsmith, S., Barker, D., and Scales, D. J. (1985) High-affinity and low-affinityivanadate binding to sarcoplasmic reticulum Ca -ATPase labeled with fluorescein isothiocyanate. Biochim. Biophys. Acta 817, 123-133.

176. Hymel, L., Maurer, A., Berenski, C., Jung, C. Y., and Fleischer, S. (1984) Target size of calcium pump protein from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 259,4890-4895.

177. Ikeda, J., Kimura, T., and Tanaki, N. (1980) Activation of rabbit muscle fructose-1,6-bisphosphatase by histidine and carnosine. J. Biochem. 87, 179-185.

178. Ikemoto, N., and Nelson, R. W. (1984) Oligomeric regulation of the later reaction steps of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase. J. Biol. Chem. 259, 1179011797.

179. Ikemoto, N., Antoniu, В., Kang, J. J., Meszaros, L. G., and Ronjat, M. (1991) Intravesicular calcium transient during calcium release from sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 30, 5230-5237.

180. Ikemoto, N., Komazaki, S., Takeshima, H., Nishi, M., Noda, Т., lino, M., and Endo, M. (1997) Functional and morphological features of skeletal muscle from mutant mice lacking both type 1 and type 3 ryanodine receptors. J. Physiol. 501, 305-312.

181. Ikemoto, N., Ronjat, M., Meszaros, L. G., and Koshita, M. (1989) Postulated role of calsequestrin in the regulation of calcium release from sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 28, 6764-6771.

182. Imagawa, Т., Smith, J., Coronado, R., and Campbell, K. (1987) Purified ryanodineл ,receptor from muscle sarcoplasmic reticulum is the Ca -permeable pore of the calcium release channel. J. Biol. Chem., 262, 16636-16643.

183. Imamura, H. (1939) Chemie der Schlange. 1. Uber die N-Haltigen Extractivstoffe der Schlangenmusceln. J. Biochem. (Tokyo) 30, 479-490.

184. Inesi, G. (1971) P-nitrophenyl phosphate hydrolysis and calcium ion transport in fragmented sarcoplasmic reticulum. Science 171, 901-903.

185. Inesi, G. (1972) Active transport of calcium ion in sarcoplasmic membranes. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1, 191-210.

186. Inesi, G. (1985) Mechanism of calcium transport. Ann. Rev. Physiol., 47, 573-601.

187. Inui, M., and Fleischer, S. (1988) Purification of Ca2+ release channel (ryanodine receptor) from heart and skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Methods Enzymol. 157, 490-504.

188. Inui, M., Saito, A., and Fleischer, S. (1987) Purification of the ryanodine receptor and identity with feet structures of junctional terminal cisternae of sarcoplasmic reticulum from fast skeletal muscles. J. Biol. Chem. 262, 1740-1747.

189. James, P., Maeda, M., Fisher, R., Verma, A. K., Krebs, J., Penniston, J. Т., and Carafoli, E. (1988) Identification and primary structure of a calmodulin binding domain of the Ca2+ pump of human erythrocytes. J. Biol. Chem. 263, 2905-2910.

190. Jansky, L. (1990) Neuropeptides and the central regulation of body temperature during fever and hibernation. J Therm. Biol. 15, 329-347

191. Jenks, W. P. (1989) How does a calcium pump pump calcium? J. Biol. Chem. 264, 18855-18858.

192. Jenks, W. P. (1995) The mechanism of coupling chemical and physical reactions by the calcium ATPase of sarcoplasmic reticulum and other coupled vectorial systems. Biosci. Rep. 15, 283-287.

193. Jenks, W. P., and Hyatt, M. (1959) Effect of carnosine on glycolysis. Biochim. Biophys. Acta 31, 262-263.

194. Jenks, W. P., Yang, T., Peisach, D., and Myung, J. (1993) Calcium ATPase of sarcoplasmic reticulum has four binding sites for calcium. Biochemistry 32, 70307034.

195. Jilka, R. L., Martonosi, A. N., and Tillack, T. W. (1975) Effect of the purified (Mg +Ca )-activated ATPase of sarcoplasmic reticulum upon the passive Ca permeability and ultrastructure of phospholipid vesicles. J. Biol. Chem. 250, 75117524.

196. John, L. M., Lechleiter, J. D., and Camacho, P. (1998) Differential modulation of SERCA2 isoform by calreticulin. J. Cell Biol. 142,963-973.

197. Johnson, P., and Aldstack, J. (1984) Effect of carnosine and anserine on muscle and nonmuscle phosphorylase. Comp. Biochem. Physiol. 78B, 331-333.

198. Jona, I., Matko, J., and Martonosi, A. (1990) Structural dynamics of the Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Temperature profiles of fluorescence polarization and intramolecular energy transfer. Biochim. Biophys. Acta 1028, 183-199.

199. Jorgensen, A.O., Shen, A. C. Y., Campbell, K. P., and MacLennan, D. H. (1983) Ultrastructural localization of calsequestrin in rat skeletal muscle by immunoferritin labeling of ultrathin frozen sections. J. Cell Biol. 97, 1573-1581.

200. Junge, W., Schonknecht, G., and Forster, V. (1986) Neutral Red as an indicator of pH transients in the lumen of thylakoids some answers to criticism. Biochim. Biophys. Acta 852, 93-99.

201. Kagari, T., Yamaguchi, N., and Kasai, M (1996) Biochemical characterization of calsequestrin-binding 30-kDa protein in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 700-706.

202. Kaiser, E. T., and Kezdy, F. J. (1984) Amphiphilic secondary structure: design of peptide hormones. Science 223, 249-255.

203. Karon, B. S., Geddis, L. M., Kutchai, H., and Thomas, D. D. (1995) Anesthetics alter the physical and functional properties of the Ca-ATPase in cardiac sarcoplasmic reticulum. Biophys. J. 68, 936-945.

204. Karon, B. S., Mahaney, J. E., and Thomas, D. D. (1994) Halothane and cyclopiazonic acid modulate Ca-ATPase oligomeric state and function in sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 33, 13928-13937.

205. Kawasaki, T., and Kasai, M. (1994) Regulation of calcium channel in sarcoplasmic reticulum by calsequestrin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199, 1120-1127.

206. Kempner, E. S., and Fleisher, S. (1989) Radiation inactivation of membrane components and molecular mass determination by target analysis. Methods Enzymol. 172,410-439.

207. Kielley, W. W., and Meyerhof, O. (1948) Studies on adenosinetriphosphatase of muscle. II. A new magnesium-activated adenosinetriphosphatase. J. Biol. Chem. 176, 591-601.

208. Kim, D.H., Ohnishi, S.T., and Ikemoto, N. (1983) Kinetic studies of calcium release from sarcoplasmic reticulum in vitro. J. Biol. Chem. 258, 9662-9668.

209. King, T. P., Sobotka, A. K., Kochoumian, I., and Lichtenstein, L. M. (1976) Allergens of honey bee venom. Arch. Biochem. Biophys. 172, 661-671.

210. Knudson, C.M., Stand, K.K., Moomaw, C.R., Slaudhter, C., and Campbell, K.P. (1993) Primary structure and topological analysis of a skeletal muscle-specific junctional sarcoplasmic reticulum glycoprotein (triadin). J. Biol. Chem. 268, 1264612654.

211. Kokoz, Yu. M., Grichenko, A. S., Korystova, A. F., Lankina, D. A., and Markevich, N. I. (1999) Effect of isoproterenol on the L-type Ca2+ current in cardiac cell from rats and hibernating ground squirrels. Biosci. Rep. 19,17-25.

212. Kokoz, Yu. M., Markevich, N. I., Korystova, A. F., Lankina, D. A., and Alekseev, A. E. (1997) The kinetic characteristics of the L-type calcium channels in cardiaccells of hibernators. 2. Analysis of the kinetic model. Membr. Cell. Biol. 11, 213234.

213. Kondo, N. (1986) Excitation-contraction coupling in the myocardium of hibernating chipmunks. Experientia 42, 1220-1222.

214. Kondo, N. (1987) Identification of a pre-hibernating state in myocardium from nonhibernating chipmunks. Experientia 43, 873-875.

215. Kondo, N. (1988) Comparison between effects of caffeine and ryanodine on electromechanical coupling in myocardium of hibernating chipmunks: role of internal Ca2+ stores. Br. Pharmacol. 95, 1287-1291.

216. Kondo, N., and Shibata, S. (1984) Calcium source for excitation-contraction coupling in myocardium of nonhibernating and hibernating chipmunks. Science 225, 641-643.

217. Kourie, J.I. (1998) Interaction of reactive oxygen species with ion transport mechanisms. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 275, C1-C24.

218. Koyabu, S., Imanaka-Yoshida, K., Ioshi, S. O., Nakano, T., and Yoshida. T. (1994) Switching of the dominant calcium sequestering protein during skeletal muscle differentiation. Cell Motility & Cytoskeleton 29, 259-270.

219. Kracke, G. R., and Martonosi, A. (1984) Fluorescence studies of ATPase interactions in sarcoplasmic reticulum. Biophys. J. 45, 190a.

220. Krause, K., and Michalak, M. (1997) Calreticulin. Cell 88,439-443.

221. Kutchai, H., Mahaney, J. E., Geddis, L. M., and Thomas, D. D. (1994) Hexanol and lidocaine affect the oligomeric state of the Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 33, 13208-13222.

222. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

223. Lai, F., and Meissner, G. (1989) The muscle ryanodine receptor and its intrinsic Ca channel activity. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 227-246.

224. Lai, F., Erickson, H., Rousseau, E., Liu, Q.-Y., and Meissner, G. (1988) Purification and reconstitution of the calcium release channel from skeletal muscle. Nature 331, 315-319.

225. Lamb, G. D. (2000) Excitation-contraction coupling in skeletal muscle: comparison with cardiac muscle. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27, 216-224.

226. Lannergren, J., and Westerblad, H. (1989) Caffeine induces a marked tension increase in fatigued single fibres isolated from a mouse foot muscle. J. Physiol. 415, 119P.

227. Lannergren, J., and Westerblad, H. (1989) Maximum tension and force-velocity properties of fatigued single Xenopus muscle fibers studied by caffeine and high K+. J. Physiol., 409,473-490.

228. Laver, D. R., Eager, K. R., Taoube, L., and Lamb, G. D. (2000) Effects of cytoplasmic and luminal pH on Ca release channel from rabbit skeletal muscle. Biophys. J. 78, 1835-1851.

229. Le Maire, M., Jorgensen, K. E., Roigaard-Petersen, H., and Moller, J. V. (1976) Properties of deoxycholate solubilized sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Biochemistry 15, 5805-5812.

230. Lee, A. G. (1998) How lipids interact with an intrinsic membrane protein: the case of the calcium pump. Biochim. Biophys. Acta 1376, 381-390.

231. Lee, A. G., Dalton. K. A., Duggleby. R. C., East. J. M., and Starling. A. P. (1995) Lipid structure and Ca -ATPase function. Biosci. Rep. 15, 289-298.

232. Lee, H.C. (1997) Mechanisms of calcium signaling by cyclyc ADP-ribose and NAADP. Physiol. Rev. 77, 1133-1164.

233. Lennon, N. J., Harmon, S., Mackey, A., and Ohlendieck, K (1999) Oligomerization of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase SERCA2 in cardiac muscle. Molec. Cell Biol. Res. Commun. 1, 182-187.

234. Leong, P., and MacLennan, D. H. (1998) A 37-amino acid sequence in the skeletal muscle ryanodine receptor interacts with the cytoplasmic loop between domains II and III in the skeletal muscle dihydropyridine receptor. J. Biol. Chem. 273, 77917794.

235. Lepock, J. R., Rodahl, A. M., Zhang, C., Heynen, M. L., Waters, B., and Cheng, K. H. (1990) Thermal denaturation of the Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum reveal two thermodinamically independent domains. Biochemistry 29, 681-689.

236. Ligari, G., Stefani, M., Berti, A., Nassi, P., and Ramponi, G. (1980) Effect of acylphosphates on Ca2+ uptake by sarcoplasmic reticulum vesicles. Arch. Biochem. Biophys. 200,357-363.

237. Liu, Q.-Y., Lai, F.A., Rousseau, E., Jones, R.V., and Meissner, G. (1989) Multiple conductance states of the purified calcium release channel complex from skeletal sarcoplasmic reticulum. Biophys. J. 55, 415-424.

238. Lokuta, A. J., Meyers, M. B., Sander, P. R., Fishmen, G. I., and Valdivia, H. H. (1997) Modulation of cardiac ryanodine receptors by sorcin. J. Biol. Chem. 272, 25333-25338.

239. Lowry, O. H., Rosebrough, N. G., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-272.

240. Ludi, H., and Hasselbach, W. (1982) Fluorescence studies on N-(3-pyrene)maleinimide-labeled sarcoplasmic reticulum ATPase in native and solubilized membranes. Z. Naturforsch. 37, 1170-1179.

241. Lyman, C. P., Willis, J. S., Malan, A., and Wang, L. C. H. (1982) Hibernation and Torpor in Mammals and Birds. Academic Press, New York, XXX p.

242. Ma, J., and Coronado, R. (1988) Heterogeneity of conductance states in calcium channels of skeletal muscle. Biophys. J. 53, 387-395.

243. Ma, J., and Zhao, J. (1994) Highly cooperative and hysteretic response of the skeletal muscle ryanodine receptor to changes in proton concentrations. Biophys. J. 67,626-633.

244. MacDonald, J. A., and Storey, K. B. (1999) Regulation of ground squirrel Na,K-ATPase activity by reversible phosphorylation during hibernation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 254,424-429.

245. Mackrill, J.J. (1999) Protein-protein interactions in intracellular Ca -release mechanism. Biochem. J. 337, 345-361.

246. MacLennan, D. H., Brandl, C. J., Korczak, B., and Green, N. M. (1985) Amino-acid sequence of a Ca2++Mg2+-dependent ATPase from rabbit muscle sarcoplasmic reticulum, deduced from its complementary DNA sequence. Nature 316, 696-700.

247. MacLennan, D. H., Campbell, K. P., and Reithmeier, R. A. F. (1983) Calsequestrin. Calcium Cell Function 4, 151-173.

248. MacLennan, D. H., Ostwald, T. J., and Stewart, P. S. (1974) Structural components of the sarcoplasmic reticulum membrane. Ann. N. Y. Acad. Sei. 227, 527-536.

249. MacLennan, D. H., Rice, W. J., and Green, N. M. (1997) The mechanism of Ca2+ transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca -ATPase. J. Biol. Chem. 246, 27022710.

250. Maguire, P. B., and Ohlendieck K. (1996) Oligomerization of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase from rabbit skeletal muscle. FEBS Lett. 396, 115-118.

251. Mahaney, J. E., and Thomas, D. D. (1991) Effects of melittin on molecular dynamics and Ca -ATPase activity in sarcoplasmic reticulum membranes: electron paramagnetic resonance. Biochemistry 30, 7171-7180.

252. Mahaney, J. E., Kleinschmidt, J., Marsh, D., Thomas, D. D. (1992) Effects of melittin on lipid protein interactions in sarcoplasmic reticulum membranes. Biophys. J. 63, 1513-1522.

253. Mannon, A., Jakerman, P., Dunnet, M., Harris, R., and Willan, T. (1990) The contribution of carnosine to skeletal muscle buffering in man. J. Physiol. 429, 6876.

254. Manuta, M., Rossi, D., Simeoni, I., Butelli, E., Romanin, C., Sorrentino, V., and Schindler, H. (2000) ATP-induced activation of expressed RyR3 at low free calcium. FEBS Lett. 471, 256-260.

255. Marks, A.R. (1996) Cellular functions of immunophillins. Physiol. Rev. 76, 631649.

256. Marsh, D. (1981) Electron spin resonance: Spin Labels. In: Membrane Spectroscopy (Grell, E., ed.). Springer Verlag, Berlin, 76-81.

257. Martonosi, A. (1984) Mechanism of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Physiol. Rev. 64, 1240-1320.

258. Martonosi, A. (1996) Structure-function relationship in the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum: facts, speculations and questions for the future. Biochim. Biophys. Acta 1275, 111-117.

259. Martonosi, A. N., and Feretos, R. (1964) Sarcoplasmic reticulum. I. The uptake of Ca2+ by sarcoplasmic reticulum fragments. J. Biol. Chem., 239, 659-668.

260. Marx, S.O., Ondrias, K., and Marks, A. R. (1998) Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science 281, 818-821.

261. Maulet, J., Mathey-Prevot, B., Kaiser, G., Ruegg, U. T, and Fulpius B. W. (1980) Purification and chemical characterization of melittin and acetylated derivatives. Biochim. Biophys. Acta 625, 274-280.

262. Maurer, A., and Fleischer, S. (1984) Decavanadate is responsible for vanadate-induced two dimentional crystals in sarcoplasmic reticulum. J. Bioenerg. Biomembr. 16,491-505.

263. McPherson, P. S., and Campbell, K. P. (1993a) The ryanodine receptor/Ca release channel. J. Biol. Chem. 268, 13765-13768.

264. McPherson, P.S., and Campbell, K.P. (1993b) Characterization of the major braini.form of the ryanodine receptor/Ca release channel. J. Biol. Chem. 268, 1978519790.

265. Meissner, G. (1975) Isolation and characterization of two types of sarcoplasmic reticulum vesicles. Biochim. Biophys. Acta, 389, 51-68.

266. Meissner, G. (1986) Evidence of a role for calmodulin in the regulation of calcium release from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 25, 244-251.

267. Meissner, G. (1994) Ryanodine receptor/Ca release channels and their regulation by endogenous effectors. Ann. Rev. Physiol. 56, 485-508.

268. Meissner, G., and Henderson, J.S. (1987) Rapid calcium release from cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles is dependent on1. Ca'T andis modulated by Mg , adenine nucleotide, and calmoduline. J. Biol. Chem. 262, 3065-3073.

269. Meissner, G., and Lu, X. (1995) Dihydropyridine receptor-ryanodine receptor interactions in skeletal muscle excitation-contraction coupling. Biosci. Rep. 15, 399408.

270. Meissner, G., Conner, G. E., and Fleischer, S. (1973) Isolation of sarcoplasmic reticulum by zonal centrifugation and purification of Ca2+-pump and Ca2+-binding proteins. Biochim. Biophys. Acta 298, 246-269.

271. Meissner, G., Darling, E., and Eveleth, J. (1986) Kinetics of rapid Ca release by1.^ isarcoplasmic reticulum. Effects of Ca , Mg , and adenine nucleotides. Biochemistry 25, 236-244.

272. Meldolesi, J., Krause, K. H., and Michalak, M. (1996) Calreticulin: how many functions in how many cellular compartments? Cell Calcium 20, 83-86.

273. Melgunov, V. I., and Akimova, E. I. (1980a) On subunit structure of Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum. FEBSLett. Ill, 197-200.

274. Melgunov, V. I., and Akimova, E. I. (1980b) The dependence for reactivation ofIlipid-depleted Ca -ATPase of sarcoplasmic reticulum by non-ionic detergents on their hydrophile-lipophile balance. FEBSLett. 121,235-238.

275. Merino, J. M., Gutierrez-Merino, C., and Henao, F. (1999) Plausible stoichiometry of the interacting nucleotide-binding sites in the Ca -ATPase from sarcoplasmic reticulum. Arch. Biochem. Biophys. 368, 298-302.

276. Mersol, J. V., Kutchai, H., Mahaney, J. E., and Thomas, D. D. (1995) Self-association accompanies inhibition of Ca-ATPase by thapsigargin. Biophys. J. 68, 208-215.

277. Meszaros, L. G., Bak, J., and Chu, A. (1993) Cyclic ADP-ribose as an endogenousIregulator of the non-skeletal type ryanodine receptor Ca channel. Nature 364, 7679.

278. Meyers, M. B., Pickel, V. M., Sheu, S. S., Sharma, V. K., Scotto, K. W., and Fishman, G. I. (1995) Association of sorcin with the cardiac ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 270, 26411-26418.

279. Michalak, M., Dupraz, P., and Soshan-Barmatz, V. (1988) Ryanodine binding to sarcoplasmic reticulum membranes: comparison between cardiac and skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta 939, 587-594.

280. Milner, R.E., Michalak, M., and Wang, L.C.H. (1991) Altered properties of calsequestrin and the ryanodine receptor in the cardiac sarcoplasmic reticulum of hibernating mammals. Biochim. Biophys. Acta 1063, 120-128.

281. Mintz E., and Guillain F. (1997) Ca transport by sarcoplasmic reticulum ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1318, 52-70.

282. Mintz E., Lacapere J. J., Guillain F. (1990) Reversal of the sarcoplasmic reticulum ATPase cycle by substituting various cations for magnesium. Phosphorylation and ATP synthesis when Ca2+ replaces Mg2+. J. Biol. Chem. 265, 18762-18768.

283. Missiaen, L., Taylor, C. W., and Berridge, M. J. (1992) Luminal Ca2+ promoting spontaneous Ca2+ release from inositol trisphosphate-sensitive stores in rat hepatocytes. J. Physiol. 455, 623-640.

284. Mollay, C., and Kreil, G. (1973) Fluorometric measurement on the interaction of melittin with lecithin. Biochim. Biophys. Acta 316, 196-203.

285. Mollay, C., Kreil, G., and Berger, H. (1976) Action of phospholipases on the cytoplasmic membrane of E.coli. Stimulation by melittin. Biochim. Biophys. Acta 426,317-324.

286. Moller, J. V., Andersen, J. P., and Le Maire, M. (1982) The sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Mol. Cell. Biochem. 42, 83-107.

287. Moller, J. V., Juul, B., and Le Maire, M. (1996) Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta 1286, 1-51.

288. Moller, J. V., Lind, K. E., and Andersen, J. P. (1980) Enzyme kinetics and substrate stabilization of detergent-solubilized and membraneous (Ca2++Mg2+)-activated ATPase from sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 255, 1912-1920.

289. Morgan, C. G., Williamson, H, Fuller, S, and Hudson, B. (1983) Melittin inducesfusion of unilamellar phospholipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta 732, 668-674. .

290. Morii, H., Takisawa, H., and Yamamoto, T. (1985) Inactivation of a Ca -induced

291. Ca release channel from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum during active Ca2+ transport. J. Biol Chem. 260, 11536-11541.

292. Morrissette, J., Heisermann, G., Cleary, J., Ruoho, A., and Coronado, R. (1993) Cyclic ADP-ribose induced Ca release in rabbit skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett. 330, 270-274.

293. Moutin, M. J., and Dupont, Y. (1988) Rapid filtration of Ca2+-induced Ca2+ release from skeletal sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 263, 4228-4235.

294. Murphy, A. J. (1976) Cross-linking of the sarcoplasmic reticulum ATPase protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 70, 160-166.

295. Murphy, A. J. (1978) Effects of divalent cations and nucleotides on the reactivity of the sulfhydryl groups of sarcoplasmic reticulum membranes. Evidence for structural changes occuring during the calcium transport cycle. J. Biol Chem., 253, 385-389.

296. Murphy, A. J. (1988) Affinity labeling of the active site of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 946, 57-65.

297. Murray, B. E., and Ohlendieck, K. (1998) Complex formation between calsequestrin and the ryanodine receptor in fast- and slow-twitch rabbit skeletal muscle. FEBS Lett. 429, 317-322.

298. Nakamura, J., Tajima, G., and Sato, C. (2002b) Substrate regulation of calciumbinding in Ca -ATPase molecules of sarcoplasmic reticulum. II. Effect of CTP,

299. GTP, ITP, and UTP. J. Biol. Chem. 277, 24191-24196.

300. Nakamura, J., Tajima, G., Sato, C., Furukohri, T., and Konishi, K. (2002a)• I

301. Substrate regulation of calcium binding in Ca -ATPase molecules of sarcoplasmic reticulum. I. Effect of ATP. J. Biol Chem. 277,24180-24190.

302. Nakamura, Y., and Tonomura, Y. (1978) Reaction mechanism of p-nitrophenylphosphatase of sarcoplasmic reticulum. Evidence for two kinds of phosphorylated intermediate with and without bound p-nitrophenol. J. Biochem. 83, 571-583.

303. Napier, R. M., East, J. M., and Lee, A. G. (1987) State of aggregation of the (Ca2+ + Mg2+)-ATPase studied using chemical cross-linking. Biochim. Biophys. Acta 903, 374-380.

304. Napolitano, C. A., Cooke, P., Segalman, K., and Herbette, L. (1983) Organization of calcium pump protein dimers in the isolated sarcoplasmic reticulum membrane. Biophys. J. 42, 119-125.

305. Nassar-Gentina, V., Passonneau, J. V., and Rapoport, S. I. (1981) Fatigue and metabolism of frog muscle fibers during stimulation and in response to caffeine. Am. J: Physiol., 241, C160-C166.

306. Noguchi, N., Takasawa, S., Nata, K., Tohgo, A., Kato, I., Ikehata, F., Yonekura, H., and Okamoto, H. (1997) Cyclic ADP-ribose binds to FK506-binding protein 12.6 to release Ca2+ from islet microsomes. J. Biol. Chem. 272, 3133-3136.

307. O'Brian, C.A., and Ward, N.,E. (1989) ATP-sensitive binding domain of melittin to the catalytic domain of protein kinase C. Mol. Pharmacol. 36, 355-359.

308. O'Dowd, A., O'Dowd, J. J., O'Dowd, J. J. M., MacFarlane, N., Abe, H., and Miller, D. (1992) Analysis of novel imidazoles from isolated perfused rabbit heart by two high-performance liquid chromatography methods. J. Chromatography 577, 347353.

309. Ogawa, Y., and Ebashi, S. (1976) Ca-releasing action of (iy-methylene adenosine triphosphate on fragmented sarcoplasmic reticulum. J. Biochem. (Tokyo) 80, 11491157.

310. Ogawa, Y., Kurebayashi, N., and Murayama, T. (1999) Ryanodine receptor isoforms in excitation-contraction coupling. Adv. Biophys. 36, 27-64.

311. Orlov, S. N., Li, J.-M., Tremblay, J., and Hamet, P. (1995) Genes of intracellular calcium metabolism and blood pressure control in primary hypertension. Semin. Nephrol. 15, 569-592.

312. Orr I., and Shoshan-Barmatz, V. (1996) Modulation of the skeletal muscle ryanodine receptor by endogenous phosphorylation of 160/150-kDa proteins of the sarcoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1283, 80-88.

313. Peitsch, M. C., Borner, C., and Tschopp L. (1993) Sequence similarity of phospholipase Ai activating protein and the G protein subunits: a new concept of effector protein activation in signal transduction? Trends Biochem. Sci. 18, 292-293.

314. Penner, R., Neher, E., Takeshima, H., Nishimura, S., and Numa, S. (1989) Functional expression of the calcium release channel from skeletal muscle ryanodine receptor cDNA. FEBS Lett. 259, 217-221.

315. Pessah, I., Francini, A., Scales, D., Waterhouse, A., and Casida, J. (1986) Calcium-ryanodine receptor complex. Solubilization and partial characterization from skeletal muscle junctional sarcoplasmic reticulum vesicles. J. Biol. Chem. 261, 8643-8648.

316. Pessah, I., Waterhouse, A., and Casida, J. (1985) The calcium-ryanodine receptor complex of skeletal and cardiac muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 128, 449-456.

317. Pick U. (1982) The interaction of vanadate ions with the Ca-ATPase from sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 257, 6111-6119.

318. Pick, U., and Racker, E. (1979) Inhibition of the (Ca2+)ATPase from sarcoplasmicIreticulum by dicyclohexylcarbodnmide: evidence for location of the Ca binding site in a hydrophobic region. Biochemistry 18, 108-113.

319. Picot, D., Loll, P. J., and Garavito, R. M. (1994) The X-ray crystal structure of the membrane protein prostaglandin H2 synthase-1. Nature 367, 243-249.

320. Pikula, S., Mulner, N., Dux, L., and Martonosi, A. (1988) Stabilization and crystallisation of Ca2+-ATPase in detrgent-solubilized sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 263, 5277-5286.

321. Pisano, J. J., Wilson, J. D., Cohen, L., Abraham, D., and Undenfried, S. (1961) Isolation of y-aminobutyrylhistidine (homocarnosine) from brain. J. Biol. Chem. 236, 499-502.

322. Post, R. L., Hegyvary, C., and Kume, S. (1972) Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. J Biol Chem. 247, 6530-6540.

323. Postnikova, G. B., Tselikova, S. V., Kolaeva, S. G., and Solomonov, N. G. (1999) Myoglobin content in skeletal muscles of hibernating ground squirrels rises in autumn and winter. Comp. Biochem. Physiol. 124A, 35-37.

324. Pozzan, T., Rizutto, R., Volpe, P., and Meldolesi, J. (1994) Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. Physiol. Rev. 74, 595-636.

325. Prendergast, F. G., Lu, J., Wei, G. I., and Bloomfield, V. A. (1982) Lipid orderdisorder transitions in complexes of melittin and ditetra- and dipentadecanoyl glycerophosphocholines. Biochemistry 21, 6963-6972.

326. Rabon, E., Im, W.-B., and Sachs, G. (1988) Preparation of gastric H,K-ATPase. Methods Enzymol. 157, 649-654.

327. Rakovic, S., Galione, A., Ashamu, G. A., Potter, B.V., and Terrar, D.A. (1996) A specific cyclic ADP-ribose antagonist inhibits cardiac excitation-contraction coupling. Curr. Biol. 6, 989-996.

328. Rathbun, W. B., and Betlach, V. V. (1969) Estimation of enzymatically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate. Analyt. Biochem. 28, 436-442.

329. Ribeiro, J. M., Aragao, E. S., and Vianna, A. L. (1980) Steady state kinetics of the (Ca +Mg )-dependent P-nitrophenylphosphatase activity of sarcoplasmic reticulum vessicles. An. Acad. Bras. Cienc. 52, 403-409.

330. Rinuy, J., Brevet, P. F., and Girault, H. H. (1999) Second harmonic generation of glucose oxidase at the air/water interface. Biophys. J. 77, 3350-3355.

331. Rogdestvenskaya, Z. E., Khromov, A. S., and Srebnitskaya, L. K. (1994) The hibernation-induced changes in structure and function of m.psoas from ground squirrels. Abstr. Book of Intern. Symp. "Biological Motility", Pushino, Russia, 189.

332. Rosemblatt, M. S., and Scales, D. J. (1989) Morphological, immunological and biochemical characterization of purified transverse tubule membranes isolated from rabbit skeletal muscle. Mol. Cell Biochem. 87, 57-69.

333. Rossi, B., Leone, F., Gache, C., and Lazdunski, M. (1979) Pseudosubstrates of thea .sarcoplasmic Ca -ATPase as tools to study the coupling between substrate hydrolysis and Ca transport. J. Biol. Chem. 254, 2302-2307.

334. Rousseau, E., Smith, J.S., Henderson, J.S., and Meissner, G. (1986) Single channel and 45Ca2+ flux measurements of the cardiac sarcoplasmic reticulum calcium channel. Biophys. J. 50, 1009-1014.

335. Sabbadini, R. A., Betto, R., Teresi, A., Fachechi-Cassano, G., and Salviati, G. (1992) The effects of sphingosine on sarcoplasmic reticulum membrane calcium release. J. Biol. Chem. 267, 15475-15484.

336. Saiki, Y., and Ikemoto, N. (1999) Coordination between Ca release and subsequent re-uptake in the sarcoplasmic reticulum. Biochemistry, 38, 3112-3119.

337. Saito, A., Seiler, S., Chu, A., and Fleischer, S. (1984) Preparation and morphology of sarcoplasmic reticulum terminal cysternae from rabbit skeletal muscle. J. Biol. Chem., 259, 13363-13369.

338. Sakamoto, J., and Tonomura, Y. (1980) Order of release of ADP and Pi fromIphosphoenzyme with bound ADP of Ca -dependent ATPase from sarcoplasmic reticulum and of Na+, K+-dependent ATPase studied by ADP-inhibition patterns. J. Biochem.%1, 1721-1727.

339. Salama, G., and Abramson, J. J. (1984) Silver ions trigger Ca2+ release by acting at the apparent physiological release site in sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 259, 13363-13369.

340. Sandow, A., and Brust, V. (1966) Caffeine potentiation of twitch tension in frog sartorius muscle. Biochem. Z. 345, 232-247.

341. Scales, D., and Inesi, G. (1976) Assembly of ATPase protein in sarcoplasmic reticulum membranes. Biophys. J. 16, 735-751.

342. Seok, J.-H., Xu, L., Kramarcy, N.R., Sealock, R., and Meissner, G. (1992) The 30 S lobster skeletal muscle Ca release channel (ryanodine receptor) has functional properties distinct from the mammalian channel proteins. J. Biol. Chem. 267, 15893-15901.

343. Serysheva, I.I., Schatz, M., van Heel, M., Chiu, W., and Hamilton, S.L. (1999) Structure of the skeletal muscle calcium release channel activated with Ca and AMP-PCP. Biophys. J. 77, 1936-1944.

344. Sessa, G., Freer, J. H., Colacicco, G., and Weissmann, G. (1969) Interaction of lytic polypeptide, melittin, with lipid membrane systems. J. Biol. Chem. 244, 3575-3582.

345. Severin, S. E., Scolysheva, L. K., Shur, S. A., and Vulfson, P. L. (1990) The pH-dependent conformational transition in glycogen phosphorilase b. The effect of carnosine and anserine on its activity. Biochem. Int. 20, 227-238.

346. Severin, S.E. (1964) Problems concerned with the biological activity of naturally occurring imidazole compounds. Proc. 6th Int. Cong. Biochem., 45-61.

347. Shaltiel, S., and Tauber-Finkelstein, M. (1971) Introduction of intramolecular crosslink at the active site of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Biochim. Biophys. Res. Commun. 44, 482-490.

348. Shannon, T. R., Ginsburg, K. S., and Bers, D. M. (2000) Potentiation of fractional sarcoplasmic reticulum calcium release by total and free intra-sarcoplasmic reticulum calcium concentration. Biophys. J., 78, 334-343.

349. Shoshan-Barmatz, V., and Ashley, R. H. (1998) The structure, function, and cellular regulation of ryanodine-sensitive Ca release channels. Int. Rev. Cytol. 183, 185270.

350. Shou, W., Aghdasi, B., Armstrong, D. L., Guo, Q., Bao, S., Charng, M. J., Mathews, L. M., Schneider, M. D., Hamilton, S.L., and Matzuk, M. M. (1998) Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature 391, 489-492.

351. Simmerman, H.K., and Jones, L.R. (1998) Phospholamban: protein structure, mechanism of action, and role in cardiac contraction. Physiol. Rev. 78, 921-947.

352. Sitsapesan, R., and Williams, A.J. (1997) Regulation of current flow trough ryanodine receptor by luminal Ca . J. Membr. Biol. 159, 179-185.

353. Skulachev, V. P. (1978) Membrane-linked energy buffering as the biological function ofNa/K gradient. FEBSLett., 87, 171-176.

354. Smith, J.S., Coronado, R., and Meissner, G. (1986) Single-channel calcium and barium currents of large and small conductance from sarcoplasmic reticulum. Biophys. J. 50, 921-928.

355. Smith, J.S., Imagawa, T., Ma, J., Fill, M., Campbell, K.P., and Coronado, R. (1988) Purified ryanodine receptor from rabbit skeletal muscle is the calcium-release channel of sarcoplasmic reticulum. J. Gen. Physiol. 92, 1-26.

356. Smith, J.S., Rousseau, E., and Meissner, G. (1989) Calmodulin modulation of single sarcoplasmic reticulum Ca2+-release channel form cardiac and skeletal muscle. Circ. Res. 64, 352-359.

357. Smith, W. S., Broadbridge, R., East, J. M., and Lee, A. G. (2002) Sarcolipin uncouples hydrolysis of ATP from accumulation of Ca by the Ca -ATPase of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 361, 277-286.

358. Sobue, K., Konishi, H., and Nakajima, T. (1975) Preparation and identification of N-acetyl carnosine from brain and muscles. J. Neurochem. 24, 1261-1262.

359. Sorrentino, V., and Reggiani, C. (1999) Expression of the ryanodine receptor type 3 in skeletal muscle. A new partner in excitation-contraction coupling? Trends Cardiovasc. Med., 9, 54-61.

360. Spector, T. (1978) Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation: a simple and linear spectrofotometric assay for 0.5 to 5.0 y of protein. Analyt. Biochem. 86, 142-146.

361. Squier, T. C., Bigelow, D. J., de Ancos, J. G., and Inesi, G. (1987) Localization of site-specific probes on the Ca-ATPase of sarcoplasmic reticulum using fluorescence energy transfer. J. Biol. Chem. 262, 4748-4754.

362. Starling, A. P., East, J. M., and Lee, A. G. (1995) Effects of gel phase phospholipid on the Ca-ATPase. Biochemistry 34, 3084-3091.

363. Steffen, J. M., Koebel, D. A., Musaccia, X. J., and Milson, W. K. (1991) Morphometric and metabolic indices of disuse in muscles of hibernating ground squirrels. Comp. Biochem. Physiol. 99B, 815-819.

364. Stephenson, D. G., Lamb, G. D., and Stephenson, G. M. M. (1998) Events of the excitation-contraction-relaxation (E-C-R) cycle in fast- and slow-twitch mammalian muscle fibres relevant to muscle fatigue. Acta Physiol. Scand. 162, 229-245.

365. Stokes, D. L., and Lacaperre, J. J. (1994) Conformation of Ca-ATPase in two crystal forms. Effects of Ca2+, thapsigargin, adenosine-5'(beta, gamma-methylene)triphosphate, and chromium(III)-ATP on crystallization. J. Biol Chem. 269, 1160611613.

366. Storey, K. B. (1987a) Regulation of liver metabolism by enzyme phosphorylation during mammalian hibernation. J. Biol Chem. 262, 1670-1673.

367. Storey, K. B. (1987b) Investigations of the mechanisms of glycolytical control during hibernation. Can. J. Zool. 65, 3079-3083.

368. Storey, K. B. (1997) Metabolic regulation in mammalian hibernation: enzyme and protein adaptation. Comp. Biochem. Physiol. 118A, 1115-1124.

369. Strand, M., Louis, C., and Mickelson, J. (1993) Phosphorylation of the porcine skeletal and cardiac muscle sarcoplasmic reticulum ryanodine receptor. Biochim. Biophys. Acta 1175, 319-326.

370. Suarez-Isla, B. A., Irribarra, V., Oberhauser, A., Larralde, L., Bull, R., Hidalgo, C., and Jaimovich, E. (1988) Inositol (l,4,5)-trisphosphate activates a calcium channel in isolated sarcoplasmic reticulum membranes. Biophys. J. 54, 737-741.

371. Suk, J. Y., Kim, Y. S., and Park, W. J. (1999) HRC (Histidine-rich Ca2+ binding protein) resides in the lumen of sarcoplasmic reticulum as a multimer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 263, 667-671.

372. Sutko, J., and Airey, J.A. (1996) Ryanodine receptor Ca release channels: does diversity in form equal diversity in function? Physiol Rev. 76, 1027-1071.

373. Sweadner, K. J. (1985) Isozymes of Na+/K+-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 988, 185-220.

374. Szegedi, C., Sarcozi, S., Jona, I., and Varsanyi, M. (1999) Calsequestrin: more thanLonly' a luminal Ca buffer inside the sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 337, 1922.

375. Szegedi, C., Sarkozi, S., Herzog, A., Jona, I., and Varsanyi, M. (1999) Calsequestrin: more than 'only' a lumenal Ca buffer inside the sarcoplasmic raticulum. Biochem. J. 337, 19-22.

376. Szymanska, G., Kim, H. W., and Kranias, E. G. (1991) Reconstitution of the skeletal sarcoplasmic reticulum Ca -pump: influence of negatively charged phospholipids. Biochim. Biophys. Acta 1091, 127-134.

377. Tada, M., Yamamoto, T., and Tonomura, Y. (1978) Molecular mechanism of active calcium transport by sarcoplasmic reticulum. Physiol Rev., 59, 1-79.

378. Tailor, K., Dux, L., and Martonosi, A. (1984) Structure of the vanadate-induced crystals of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. J. Mol. Biol. 174, 193-204.

379. Tailor, K., Dux, L., and Martonosi, A. (1986) Three-dimensional reconstruction of negatively stained crystals of the Ca2+-ATPase from muscle sarcoplasmic reticulum. J. Mol. Biol. 187,417-27.

380. Takasago, T., Imagawa, T., and Shigekawa, M. (1989) Phosphorylation of the cardiac ryanodine receptor by cAMP-dependent protein kinase. J. Biochem. (Tokyo) 106, 872-877.

381. Takasago, T., Imagawa, T., Furukawa, K., Ogurusu, T., and Shigekawa, M. (1991) Regulation of the cardiac ryanodine receptor by protein kinase-dependent phosphorylation. J. Biochem. (Tokyo) 109, 163-170.

382. Takeshima, H., Komazaki, S., Nishi, M., lino, M., and Kangawa, K. (2000) Junctophilins: a novel family of junctional membrane complex proteins. Mol. Cell 6, 11-22.

383. Takisawa, H., and Makinose, M. (1981) Occluded bound calcium on the phosphorylated sarcoplasmic transport ATPase. Nature 290, 271-273.

384. Talbot, J. C., Dufourcq, J., de Bony, J., Faucon, J. F., and Lussan, C. (1979) Conformational change and self-association of monomeric melittin. FEBS Lett. 102, 191-193.

385. Tanford, C. (1984) The sarcoplasmic reticulum calcium pump. Localization of free energy transfer to discrete steps of the reaction cycle. FEBS Lett. 166, 1-7.

386. Tatsumi, S., Suzuno, M., Taguchi, T., and Kasai, M. (1988) Effects of silver ion on the calcium-induced calcium release channel in isolated sarcoplasmic reticulum. J. Biochem. (Tokyo) 104, 279-284.

387. Taylor, K. A., Mullner, N., Pikula, S., Dux, L., Peracchia, C., Varga, S., andj i

388. Martonosi, A. (1988) Electron microscope observations on Ca -ATPase microcrystals in detergent-solubilized sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 263, 5287-5294.

389. Terwilliger, T. C., and Eisenberg, D. (1982) The structure of melittin: structure determination and partial refinement. J. Biol. Chem. 257, 6010-6016.

390. Terwilliger, T. C., Weissman, L., and Eisenberg, D. (1982) The structure of melittin in the form I crystals and its implication for melittin's lytic and surface activities. Biophys. J. 37, 353-361.

391. Tolkachevskaya, N. (1929) Zur Kenntnis der Extractivstoffe der Musceln. Uber die Extractivstoffe des Hühnerfleisches. H.-S. Zeitschr. Physiol. Chem. 185, 28-32.

392. Tosteson, M. T., and Tosteson, D. C. (1981) The sting. Melittin forms channels in lipid bilayers. Biophys. J. 36, 109-117.

393. Towbin, H., Staehelim, T., and Gordon, J. (1992) Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology 24, 145-149.

394. Toyoshima, C., Nakasako, M., Nomura, H., and Ogawa, H. (2000) Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature 405, 647-655.

395. Toyoshima, C., Sasabe, H., and Stokes, D. L. (1993) Three-dimensional cryo-electron microscopy of the calcium ion pump in the sarcoplasmic reticulum membrane. Nature 362, 467-471.

396. Trimm, J. L., Salama, G., and Abramson, J. J. (1986) Sulfhydryl oxidation induces rapid calcium release from sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 261, 1609216097.

397. Tripathy, A., Xu, L., Mann, G., and Meissner, G. (1995) Calmodulin activation and inhibition of skeletal muscle Ca release channel (ryanodine receptor). Biophys. J. 69, 106-119.

398. Valdivia, C., Valdivia, H. H., Mpotter, B. V., and Coronado, R. (1990) Ca2+ release by inositol-trisphosphate in isolated triads of rabbit skeletal muscle. Biophys. J. 57, 1233-1243.

399. Vale, M. G., and Carvalho, A. P. (1980) Effect of temperature on the reversal of the calcium ion pump in sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 186, 461-467.

400. Vanderkooi, J. M., Ierokomas, A., Nakamura, H., and Martonosi, A. (1977) Fluorescence energy transfer between Ca transport ATPase molecules in artificial membranes. Biochemistry 16, 1262-1267.

401. Vogel, H. (1981) Incorporation of melittin into phosphatidylcholine bilayers: study of binding and conformational changes. FEBS Lett. 134, 37-43.

402. Voss, J., Birmachu, W., Hussey, D. M., and Thomas, D. D. (1991) Effects of melittin on molecular dynamics and Ca -ATPase activity in sarcoplasmic reticulum membranes: time-resolved optical anisotropy. Biochemistry 30, 74987506.

403. Voss, J. C., Mahaney, J. E., and Thomas. D. D. (1995) Mechanism of Ca-ATPase inhibition by melittin in skeletal sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 34, 930-939.

404. Voss, J., Jones, L. R., and Thomas, D. D. (1994) The physical mechanism of calcium pump regulation in the heart. Biophys. J. 67, 190-196.

405. Wagenknecht, T., Grassicci, R., Frank, J., Saito, A., Inui, M., and Fleischer, S. (1989) Three-dimensional architecture of the calcium channel/foot structure of sarcoplasmic reticulum. Nature 338, 167-170.

406. Wakabayashi, S., Imagawa, T., and Shigekawa, M. (1990) Does fluorescence of 4-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazole incorporated into sarcoplasmic reticulum ATPase monitor putative E2-E1 conformational transition? J. Biochem., 107, 563-571.

407. Wallmark, B„ Stewart, H. B., Rabon, E., Saccomani, G., and Sachs, G. (1980) The catalytic cycle of gastric (H+, K+)-ATPase. J. Biol. Chem. 255, 5313-5319.

408. Wang, J., and Best, P. M. (1992) Inactivation of the sarcoplasmic reticulum calcium channel by protein kinase. Nature, 359, 739-741.

409. Wang, L. C. H., and Lee, T. F. (1989) Temperature Regulation. In: Psychoendocrinology. 2. Behavior and Regulation of Species Adaptations (Levine, S., and Brush, R., eds.), N. Y., Academic Press, 437-539.

410. Watts, A., Volotovski, D., and Marsh, D. (1979) Rhodopsin-lipid association in bovine rod outer segment membranes. Identification of immobilized lipid by spinlabels. Biochemistry 18, 5006-5013.

411. White, T. E., and Dewey, T. G. (1987) A fluorescence investigation of the nucleotide binding sites of the Ca-ATPase. Membr. Biochem. 7, 67-72.

412. Wickler, S.J., Hoyt, D.F., and van Breukelen, F. (1991) Disuse atrophy in the hibernating golden-mantled ground squirrel, Spermophilus lateralis. Am. J Physiol. 261, 1214-1217.

413. Witcher, D., Kovacs, R., Schulman, H., Cefali, D., and Jones, L. (1991) Unique phosphorylation site on the cardiac ryanodine receptor regulates calcium channel activity. J. Biol. Chem. 266, 11144-11152.

414. Witcher, D., Strifler, B., and Jones, L. (1992) Cardiac specific phosphorylation site for multifunctional Ca /calmodulin-dependent protein kinase is conserved in the brain ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 267,4963-4967.

415. Xia, R., Stangler, T., and Abramson, J.J. (2000) Skeletal muscle ryanodine receptor is a redox sensor with a well defined redox potential that is sensitive to channel modulators. J. Biol. Chem. 275, 36556-36561.

416. Xu, L., Eu, J.P., Meissner, G., Stamler, J.S. (1998) Activation of the cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) by poIy-S-nitrosylation. Science 279, 234-237.

417. Yacoe, M. E. (1983) Adjustments of metabolic pathways in the pectoralis muscles of the bat Eptesicus fuscus related to carbohydrate sparing during hibernation. Physiol. Zool. 56, 648-658.

418. Yamaguchi, N., and Kasai, M. (1998) Identification of 30 kDa calsequestrin-binding protein, which regulates calcium release from sarcoplasmic reticulum of rabbit skeletal muscle. Biochem. J. 335, 541-547.

419. Yamaguchi, N., Kawasaki, T., and Kasai, M. (1995) DIDS binding 30-kDa protein regulates the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 648-653.i

420. Yamomoto, T., and Tonomura, Y. (1967) Reaction mechanism of Ca -dependent ATPase of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle. I. Kinetic studies. Biochem. J. 62, 558-575.

421. Yang, Z., and Steele, D. K. (2000) Effects of cytosolic ATP on spontaneous and triggered Ca2+-induced Ca2+ release in permeabilised rat ventricular myocytes. J. Physiol. 523,29-44.

422. Yano, K., and Zarain-Herzberg, A. (1994) Sarcoplasmic reticulum calsequestrins: structural and functional properties. Mol. Cell. Biochem. 135, 61-70.

423. Yoshida, A., Takahashi, M., Imagawa, T., Shigekawa, M., Takisawa, H., and Nakamura, T. (1992) Phosphorylation of ryanodine receptors in rat myocites during beta-adrenergic stimulation. J. Biochem. (Tokyo) 111, 186-190.

424. Yunes, R. A. (1982) A circular dichroism study of Apis mellifera melittin. Arch. Biochem. Biophys. 216, 559-565.

425. Zaloga, G. P., Roberts, P. R., and Nelson, T. E. (1996) Carnosine: a novel peptide regulator of intracellular calcium and contractility in cardiac muscle. New Horizons 4, 26-35.

426. Zimanyi, I., and Pessah, I. (1991) Comparison of H.ryanodine receptors and Ca release from rat cardiac and rabbit skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. J. Pharmacol. Exp. Ther. 256, 938-946.

427. Zimanyi, I., Buck, E., Abramson, J., Mack, M., and Pessah, I. (1992) Ryanodine produces persistant inactivation of the Ca2+ release channel from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Mol. Pharmacol. 42, 1049-1057.

428. Zocchi, E., Usai, C., Guida, L., Franco, L., Bruzzone, S., Passalacqua, M., and De Flora, A. (1999) Ligand-induced internalization of CD38 results in intracellular Ca mobilization: role of NAD transport across cell membranes. FASEB J. 13, 273-283.

429. Zorzato, F., Margreth, A., and Volpe, P. (1986) Direct photoaffinity labeling of junctional sarcoplasmic reticulum with 14C.doxorubicin. J. Biol. Chem. 261, 13252-13257.

430. Выполнение этой работы стало возможным благодаря помощи многих людей. Я искренне благодарен всем, кто поддерживал меня в течение многих лет работы на кафедре биохимии биологического факультета МГУ им. М.В .Ломоносова.

431. Я благодарю всех членов моей семьи, которые терпеливо переносили все трудности и помогали мне на всех этапах создания этой работы.