Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Освобождение ионов Са2+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и миокарда

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Освобождение ионов Са2+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и миокарда"

; ОД

1 з ФВ !

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской революции и ордена Трудового красного знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.353.4

МЕНЬШИКОВА Елизавета Вениаминовна

ОСВОБОЖДЕНИЕ ИОНОВ Са2+ ИЗ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕГИНУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ МШЩ И МИОКАРДА

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

♦

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физико-химии биомембран биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.П.Козлов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор И.И.Иванов доктор биологических наук Ю.В.Архипенко

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН.

Защита диссертации состоится "/ & срЖ^ри&лЛ 1994-^г. в часов на заседании специализированного совета К.053.05.68. в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, М1У, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан _ 19945г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ!»

I. Актуальность проблемы. Важным направлением биофизики и биохимии клетки является исследование механизмов регуляции мышечного сокращения.

Цикл сокращения-расслабления мышц определяется изменениями концентрации ионов кальция в цитоплазме. Ключевая роль в регуляции концентрации внутриклеточного принадлежит саркоплазмати-ческому ретикулуму - специализированной мембранной системе цистерн и трубочек, окружающих сократительный аппарат. Система мембран СР* состоит из двух отделов: терминальных цистерн, контактирующих с сарколеммой, и продольных трубочек, сообщающихся с терминальными цистернами. В состоянии покоя практически весь Сз^+ находится в терминальных цистернах. Деполяризация сарколеммы вызывает освобождение Ca*'4" из цистерн СР в цитоплазму. При расслаблении мышцы движение Са^+ происходит в обратном направлении - из цитоплазмы в полости СР.

Исследования, проведенные на демембранированных волокнах и изолированных везикулах СР скелетных мышц и миокарда, показали, что освобождение Са^+ из СР может быть индуцировано путем повышения концентрации Са^+ до I0"^-I0~5M ( Endo, 1977, Martonosi 1984). Основным компонентом Са^+-зависимой системы освобождения Са^+ являются Са^+-каналы, активируемые Са^+ и адениновыми нук-

О

леотидами (Smith et al., 1986). Локализация Ca -каналов в от-

^ринятые сокращения: СР-саркоплаэматический ретикулум, Са-АТЗ>а-за-Са-зависимая аденозинтрифосфатаза, ТЦ-терминальные цистерны, ПТ-продольные трубочки, И<£3-инозитол-1,4,5-трифосфат, ДПФХ-ди-пальмитоилфосфатидилхолин, ЭГТА-этиленгликольтетраацетат.

делах СР, контактирующих с сарколеммой, высокая проводимость (до 100 пС), а такие большая плотность в мембране, обеспечивающая освобождение Са^+ из изолированных везикул СР с константой скорости 100 с-1, позволяет предполагать участие Са^+-зависимой системы освобождения Са^+ СР в инициации мышечного сокращения. Физиологический механизм активации Са^+-каналов в настоящее время не установлен. Решению этой проблемы могут способствовать исследования по поиску различных способов активации освобождения Са^+ из СР. Известными активаторами системы освобождения Са^+ являются кофеин, галотан ( Endo , 1977, Martonosi» 1984), ионы серебра ( Salma , 1984). В качестве возможного активатора рассматривается также инозит ол-1,4,5-трифосфат (Berridge, Irvin, 1984).

Дальнейшие исследования в этом направлении позволят более полно охарактеризовать освобождение из СР скелетных мышц и миокарда, а также выявить их специфические различия. Это является необходимым не только для понимания физиологического механизма освобождения но и имеет важное практическое значение для

поиска путей фармакологического воздействия на сократительную активность скелетных мышц и миокарда.

2. Цель работы.

1. Сравнительное исследование действия известных активаторов йионы кальция, кофеин, ионы серебра) и блокаторов (ионы магния, рутениевый красный, тетракаин) на систему освобождения Са^+ в изолированных везикулах СР скелетных мышц и миокарда.

2. Поиск новых способов активации освобождения Са^+ из СР.

3. Сравнительное исследование действия инозитол-1,4,5-три-

о.

фосфата на транспорт Ca в СР скелетных мышц, миокарда и гладких мышечных волокнах аорты.

3. Научная новизна работы. С использованием Са^+-электро-

да, а также по флуоресценции ди!п 2 и хлортетрациклина провел

депо сравнительное исследование освобождения Са + из изолированных везикул СР скелетных мышц и миокарда. Показано, что концен-

О о

трация Са необходимая для активации освобождения Са + из СР

-5

скелетных мышц и миокарда одинакова, и лежит в области 10 М. На основании исследования действия активаторов и блокаторов

О

выявлен ряд различий в системе освобождения Са + СР скелетных мышц и миокарда. Впервые показано, что полианион гепарин и разветвленный алифатический углеводород 2,2,4-триметилпентан вызывают освобождение Са^+ из везикул терминальных цистерн СР скелетных мышц. Показано, что ннозитол-1,4,5-трифосфат является

О

индуктором освобождения Са + из СР гладких мышечных волокон

2+

аорты, и не вызывает выхода Са из СР скелетных мышц и миокарда .

4. Практическое значение. Метод непрерывной регистрации концентрации Са в среде по флуоресценции зшл 2 может быть использован для изучения освобождения Са^+ из СР скелетных мышц, миокарда и гладких мышечных волокон аорты, а также для скрининга различных фармакологических соединений, воздействующих на систему освобождения Са^+ СР мышц. Выявленные различия системы освобождения Са^+ СР скелетных мышц, миокарда и гладких мышечных волокон аорты свидетельствуют, что Са*"+-каналы СР скелетных мышц, миокарда и гладких мышечных волокон аорты, по-видимому, различны по физиологическим способам активации. Эти данные могут служить основой для разработки фармакологических средств, селективно влияющих на сократительную активность скелетных мышц, миокарда и гладких мышечных волокон сосудов.

5. Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XI и XII Всесоюзных совещаниях "Транспортные АТФазы" (Ташкент, 1985), (Иркутск, 1987), на У и УП Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Телави, 1985), (Тбилиси, 1989), на У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), III симпозиуме "Метаболизм, структура и функция сердечной клетки" (Баку, 1986), УШ симпозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности" (Пущино, 1987), Международном симпозиуме "Молекулярные и клеточные аспекты регуляции сердечно-сосудистой системы" (Берлин, 1987).

6. Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.

7. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и обсуждения. Список литературы включает 241 наименование. Работа изложена на 193 страницах, содержит 3 таблицы и 51 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мембраны CP выделяли из скелетных мышц кролика (Ритов, 1985) и из миокарда собаки, морской свинки и крысы ( Jones, Cala, 1981). Мембраны CP миокарда очищали на линейном ( Levitsky et alI976) ИЛИ ступенчатом ( Jones, Cala, 1981) градиенте плотности сахарозы.

Фракцию микросом из гладких мышечных волокон аорты собаки выделяли по методу (Watras, Benevolensky,I987).

Транспорт Са^+ везикулами CP измеряли с использованием

2+

Ca -селективного электрода и по флуоресценции хлортетрацик-лина (Gaswell, 1979 ) и quin 2 (Rink, 1983), а также методом нефелометрии (Fairhurst et al.,1966).

Са^+-селективный электрод. Измерения проводили с исполь-2+

зованием Ca -электрода 93-20 ("Orion Research" СМ), подключенного к иономеру И-120 с выходом на самописец Tz 4221 (ЧСФР), в среде, содержащей 100 мМ KCl, NaCI, гхоконат калия или глю-конат натрия, 0,5-4 мМ MsCIg, 2 мМ АТФ, 5 мМ креатинфосфат, 2-3 ед.акт. креатинкиназы, 12-15 мкМ Са'"+, мембраны CP 40-60

мкг белка/мл, 10 мМ НЕР23 (pH 6,8 при ?.8°С). В ряде опытов для 2+

увеличения Ca -емкости везикул CP в среду инкубации добавляли 5-15 мМ оксалат калия, измерения в присутствии оксалата проводили при 37°С.

Хлортетрациклин. Измерения проводили на спектрофлуоримет-ре " Hitachi" М-850 (Япония) в термостатированной кювете с перемешиванием, в среде инкубации такого же состава, как при ре-

2+ 2+ гистрации транспорта Ca с использованием Ca -электрода в

отсутствие оксалата. Концентрация хлортетрациклина составляла

10 мкМ, длина волны возбуждающего света 390 нм, длина волны

испускаемого света 530 нм.

Quin 2. Измерения проводили на спектрофлуориметре "Hitachi"

в термостатированной кювете с перемешиванием в среде инкубации

Ol

для Ca -электрода, не содержащей оксалата. Концентрация quin 2 составляла 15-25 мкМ, длина волны возбуждающего света 334 нм, длина волны испускаемого света 500 нм.

Концентрацию свободных ионов кальция рассчитывали по метода (Rink 1983).

Нефелометрия. Измерения проводили на спектрофлуориметре "Hitachi" в термостатированной кювете с перемешиванием, в среде инкубации, содержащей 5 мМ оксалат калия. Длина волн возбуждающего и испускаемого света 540 нм.

АТФазную активность везикул СР и среднюю величину эффек-

р I

тивности транспорта Ca + (Са/АТФ) измеряли методом рН-метрии (Ритов, 1971) в термостатированной ячейке с перемешиванием в среде, содержащей 100 мМ NaCI, 4 мМ MgC]^, 5 мМ оксалат натрия, 2 мМ АТФ, 25 мкМ СаС12, 50-150 мкг белка СР, 2,5 мМ ими-дазол (pH 7,0 при 37°С). Для измерения АТФазной активности в среду инкубации добавляли аламетицин 5 мкг/мл.

Активность уабаинчувствительной п-нитрофенилфосфатазы определяли по методу (Vetter, Haase, 1982).

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методу (Laemmly 1970).

Кофеин и гепарин освобождали от примеси ионов кальция на смоле Chslex 100, Д2О и АТФ - на смоле дауэкс 50x8.

Концентрацию белка определяли по биуретовой реакции и по al

методу (Lowry et 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Действие кофеина на систему освобождения Са^+ СР скелетных мышц и миокарда.

Кофеин (1,3,7-триметилксантин) нашел широкое применение при исследовании механизма электромеханического сопряжения в

Ol

мышцах, как индуктор освобождения Ca из СР (Endo, 1977,

Martonosi 1984). На рис.1а видно, что кофеин подавляет ак-2+

тивный транспорт Ca везикулами ТД из скелетных мышц более

Ca, нмоль

30 Г- / 50 — 30 / 50[

ТЦ / ПТ СР

\

0 — —у 0 — —J 0 0 L

f>

1,2

I_I

I мин.

РисЛ. Транспорт Ca + фракциями ТЦ и ПГ скелетных мышц (а), легкой фракцией СР миокарда крысы (б), фракцией В и Е СР миокарда собаки (в) в отсутствие (I) и в присутствии 5 мМ кофеина (2). Са-электрод.

чем на 80 %, и практически не действует- на фракцию ПТ, что находится в соответствии с известными данными ( Weber, Herz, 1968, Ритов, 1985, Алиев и соавт., 1985). Действие кофеина полностью подавляется рутениевым красным 3 мкМ, тетракаином 0,2 мМ и диметилсульфоксидом 10 об./?.

Методом нефелометрии и с использованием Са^+-электрода

2+

наш было обнаружено, что кофеин ингиб.трует транспорт Ca везикулами СР из миокарда крысы и собаки. Согласно данным работы (Weber, Herz, 1968) кофеин ингибирует поглощение Са^+ тяжелой фракцией СР скелетных мышц кролика и практически не дей-

ствует на легкую фракцию, что является доказательством специфичности его действия на фракцию, содержащую Са^+-каналы. При исследовании действия кофеина на тяжелую и легкую фракции СР из миокарда крысы наш было обнаружено, что степень ингибиро-

о I

вания транспорта Са легкой фракцией СР кофеином составляет 30 + 2 % (рисЛб), тяжелой фракцией СР 38 + 6 %.

Используя ингибиругощий эффект кофеина на активный транс-

24.

порт Са в качестве теста на содержание ТЦ мы попытались по-

лучить фракции мембран CP миокарда с различной чувствительностью к кофеину.54 Для этой цели была выделена суммарная фракция из микросом сердца собаки, которую можно получить в большем количестве, чем микросомы сердца крысы. Для фракционирования мембран CP из сердца собаки был использован метод избирательного утяжеления активных везикул CP оксалатом кальция с последующим разделением на градиенте плотности сахарозы (Jones, Cala, 1981, Levitsky et al., 1976). Характеристика фракций, полученных в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, приведена в табл.1. Скорость транспорта Са^+ фракцией В в присут-

Таблица I

Характеристика фракций CP миокарда собаки

Фракция SKY Скорость х транспорта Ca мкмоль Ca мин'мг оелка Ингибирующее Са-зависимый действие выход Ca, кофеина, % %

А 0,6 0 _ __

В 0,6-0,8 1Д 79 20

С 0¿8-I,0 1,0 68 27

Д 1,0-1,5 2,1 49 19

Е осадок 4,1 0 0

5е€Выход Са измерен по флуоресценции хлортетрациклина. ствии 5 мМ кофеина снижается на 80 % (рисЛв, табл.1), что соответствует чувствительности стандартных препаратов ТЦ скелетных мышц. Кофеин в концентрации до 15 мМ не действует на активные везикулы осадка (фракция Е). В линейном градиенте сахарозы (20-60%) можно получить фракции А, Е и надосадочную фракцию, соответствующую сумме фракций В4С+Д.

Таким образом метод частичного насыщения везикул СР мио-

*Исследования проведены совместно с Беневоленским Д.С. Левицким Д.О. [ВКНЦ АМН СССР, г.Москва).

карда оксалатом кальция с последующим центрифугированием в градиенте плотности сахарозы позволяет получить фракцию СР, которая характеризуется высокой чувствительностью к кофеину и, по-видимомУ эквивалентна фракции ТЦ скелетных мышц.

р I

Для исследования освобождения Ca из везикул СР были использованы методы флуоресценции quin 2 и хлортетрациклина, а 2+

также Ca -электрод. Одновременное применение этих методов позволяет компенсировать некоторые ограничения, присущие каждому методу. На рис.2 представлены данные по влиянию кофеина на со-

держание Ca'

2+

внутри везикул СР скелетных мышц и миокарда. Ко-

аламе-кофеин тицин

кофеин

го

к

ч <D 100

■о

Ен

2

\ +

CV го 50

О

л

Ч

о 0

СО 234 ч я а О 120

I ^

Й СО о 60

л ч о 0

ПТ

J

« К

с;

О) ю 50 —

Си

X +

см аЗ О 25 "СР

л ч о 1 6_

f 0

кофеин

1'

,62

345 I

8 мин.

8 мин.

8 мин.

о I

Рис.2. Транспорт Са фракцией ТЦ (а), ПТ (б) скелетных мышц и надосадочной фракцией СР миокарда (в) в отсутствие (I) и в присутствии 3 мкМ рутениевого красного (2), 0,2 мМ тетракаина (3), 10 об.% диметилсульфоксида (4). 1(ЁС12 1,5 мМ (1-4), 4 мМ (5), 10 мМ (6). Флуоресценция диап 2.

2+

феин вызывает быстрое освобождение Са из фракции ТЦ скелетных

мышц и надосадочной фракции СР миокарда собаки, и практически

2+

не оказывает влияния на транспорт Са фракцией ПТ. Кофеин-ин-

2+

дуцированный выход Са из ТЦ скелетных мышц полностью подавляется рутениевым красным, тетракаином, диметилсульфоксидом и вы-

О I

сокой концентрацией Мв (рис.2а). Эти соединения оказывают не-

2+

значительное действие на выход Са под действием кофеина из СР

миокарда (рис.2в). Освобождение Са под действием кофеина не зависит от природы одновалентных катионов и анионов. Таким образом, проведенное сравнительное исследование показало, что

2+

существуют различия в системе освобождения Са , проявляющиеся в меньшей чувствительности кофеин-индуцированного освобож-

Ол

дения Са из СР миокарда к рутениевому красному, тетракаину,

диметилсульфоксиду, ионной силе и ионам магния.

о, р.

2. Освобождение Са ^под действием Са из СР скелетных

мышц и миокарда.

2+

Проведено сравнение освобождения Са из везикул СР миокарда и скелетных мышц. На рис. 3 представлено освобождение Са^+ из СР скелетных мышц и миокарда, измеренное по флуоресценции хлортетрациклина. Видно, что после поглощения Са^+ везикулами СР добавление 15 ыкМ СаС^ вызывает быстрое снижение флуоресценции хлортетрациклина, связанное с освобождением Са'

СаС1

2+

СС ®

Ж т 1

о

аГ

я £

ф Я"

о ф

Рч

о >»

СаС1г

Освобождение Са2+,?0

50

5 мин.

скелетные миокард мышцы

15 мкМ ■СаС1

2

Рис.3. Освобождение Са под действием 15 мкМ СаС12 из фракции ТЦ скелетных мышц инадосадочной фракции СР миокарда, измеренное по флуоресценции хлортетрациклина (А). Зависимость степени освобождения Са из СР скелетных мышц и миокарда от концентрации Са (Б).

Степень снижения флуоресценции составляет для фракции ТЦ 4050 %, а для надосадочной фракции СР миокарда -20-25 %. На рис. 3 видно, что сродство к кальцию в Са^+-зависимой системе освобождения Са^+ СР скелетных мышц и миокарда сходно, и лежит с

в области 10 М. Блокаторы кофеин-индуцированного освобождения Са^+ - рутениевый красный, тетракаин, диметилсульфоксид, ионы магния - практически не влияют, на выход под действием Са^+ СР скелетных мышц и миокарда.

Было проведено сопоставление степени освобождения Са^+ под действием Са^+ и величины ингибирующего действия кофеина на активный транспорт Са^+ фракциями СР миокарда, полученными при разделении общей фракции СР на ступенчатом градиенте плотности сахарозы (табл.1). Видно, что освобождение Са^+ наблюдается только на тех фракциях СР миокарда, на которых активный транспорт Са^+ ингибируются кофеином.

Полученные данные показывают, что освобождение Са^+ из СР миокарда происходит из везикул, аналогичных фрагментам ТЦ скелетных мышц. Характеристики Са^+-активируемого освобождения Са^+ СР скелетных мышц и миокарда практически одинаковы.

л

3. Действие ионов серебра на систему освобождения Са СР скелетных мышц и миокарда.

Несмотря на определенное сходство системы освобождения Са^+ СР скелетных мышц и миокарда, проявляющееся в одинаковой чувствительности к Са^+ и кофеину, их структурная организация, по-видимоцу, не идентична. На это указывают, в частности, наши данные по действию ионов серебра на СР скелетных мышц и миокарда. Ионы серебра, являющиеся эффективными блокаторами тиоло-вых групп, способны в низких концентрациях индуцировать осво-

бождение Са2+ из CP скелетных мышц.(Sabia, АЪгатаоп, 1984, Тимонин и соавт., 1986). Предполагается, что действие ионов серебра направлено на систему освобождения Са^+ CP (Salma, 1984, Тимонин и соавт., 1986). Не исключается также участие Са^+-за-висимой АТФазы в этом эффекте (McLennan et al., 19&7).

Полученные нами данные подтверждают предположение, что ионы серебра активируют систему освобождения Са^+ CP скелетных

мышц. Как видно на рис.4, ионы серебра в концентрации 0,1 мкМ

р«

не оказывают влияния на содержание Са в везикулах ПТ, и вызы-

Л,

вают освобождение около 70 % Са , поглощенного везикулами ТЦ.

СО

к

1 100

и

2 \

Л

сб О

л ч

о

AgW

0

Г

'3

-4 2

IU

1 120

о

чэ

и ^

Л

«5

л ч о

8 мин.

0

AgtiOo аламети-цин 50

L

«

к ч (1} VD

U <

А

«В О

ja Ч

8 мин.

j § о

AgN03 *

8 мин.

ТЦ ПТ СР

Рис.4. Транспорт Са^+ фракцией ТЦ (а), ПТ (б) скелетных мышц и надосадочной фракцией СР миокарда (в), измеренный по флуоресценции quin 2. I - контроль, 2-3 мкМ рутениевый красный, 3 - 0,2 мМ тетракаин, 4 - в отсутствие KCl. Концентрация AgN03 - 0,1 мкМ (а), I мкМ (б,в).

Эффект ионов серебра частично подавляется в присутствии рутениевого красного и тетракаина, и полностью исчезает при исключении из среды инкубации KCl. При исследовании действия ионов

р.

серебра на содержание Са в везикулах СР миокарда было обнаружено, что ионы серебра даже в концентрации I мкМ не вызывают р. р. освобождения Са из везикул СР миокарда, содержащих Са -акти-

вируемую систему освобождения Са1

2+

5. Действие полианионов и инозитол-1,4,5-трифосфата На

рI

систему освобождения Са СР скелетных мышц и миокарда.

Ранее было высказано предположение, что активация Са-кана-

лов СР может происходить в результате изменения поверхностного

заряда мембраны (СаБадеИ, ВгапсН;, 1981). В соответствии с этим

предположением было обнаружено, что гидрофобный проникающий анион

р.

тетрафенилбор способен вызывать освобождение Са из СР скелетных

мышц ( sh.osh.an et а1., 1983). Мы предположили, что если изменение

поверхностного заряда мембраны СР является причиной освобождения 2+

Са из СР в мышце, то такое изменение должно происходить при участии заряженной макромолекулы. В качестве модели такой макромолекулы, не проникающей через мембрану, обладающей высокой полярностью и отрицательным зарядом, был выбран природный полианион гепарин.

2+

На рис.5 представлена кинетика поглощения и выхода Са , измеренная по флуоресценции ди±п 2. Введение в среду инкубации 10

о 1

мкг/мл гепарина вызывает быстрое освобождение Са из везикул ТЦ.

Полумаксимальный эффект наблюдается при концентрации гепарина 2,5

мкг/мл. Гепарин практически не влияет на фракцию ПТ, где Са-кана-

р.

лы отсутствуют. Освобождение Са^" под действием гепарина зависит

о, р.

от концентрации Са в среде. Гепарин освобождает Са при кон-

гу г*

центрации оионов кальция в среде 10 -10 М, и практически перестает действовать при концентрации Са2+ 10"%. Скорость освобож-р.

дения Са под действием гепарина уменьшается при замене АТФ в

р.

среде инкубации на ацетилфосфат. Специфическое освобождение Са

под действием гепарина из везикул ТЦ, а также зависимость эффекта

р.

гепарина от концентрации Са и присутствия АТФ показывает, что

1

гепарин является активатором Са -зависимой системы освобождения Са2+. Было обнаружено, что гепарин предотвращает снижение сродст-

1 100

•ф

■о

и £

3

Л

4

о

Гепарин

Кофеин Гепарин

^Кофеин 100

I

| 8 мин. ТЦ

as

И Ч О)

хэ

U 2 \

§ 0

а х

5 50

с« 2

CÎ

1,2 <3

3 ja

L

J

| 8 мин. Щ

8 мин.

Рис.5. Транспорт Са фракцией ТЦ скелетных мышц (А,Б) и надоса-дочной фракцией СР сердца собаки (В). I-контроль, 2-тетракаин 0,2 мМ, 3-диметилсульфоксид 10%. МкС1?-1,5 мМ (А, 2Б, ЗВ, В) или 4 мМ ( 1Б) ),

гепарин 10 мкг/мл, кофеин 5 мМ. Флуоресценция

quln 2.

ва системы освобождения Са2+ к ионам кальция под действием Д2О. Освобождение Са2+ под действием гепарина усиливается в присутствии кофеина (рис.5).

Несомненно, что в регуляции сродства системы освобождения

о. р.

Са к Са основное значение имеет наличие отрицательного заряда на молекуле гепарина, так как выход Са^+ из СР может быть индуцирован другим сульфат-содержащим полианионом - декстран-

сульфатом, при этом незаряженный декстран (Т-500) не вызывает о.

освобождения Са'. Рутениевый красный блокирует гепарин-индуци-

2+

рованное освобождение Са , по-видимому, цутем образования с ним электронейтрального комплекса.

Исследования, проведенные на изолированных везикулах СР из миокарда, показали, что гепарин не только не индуцирует освобож-

р I

дение Са из СР миокарда, а напротив вызывает небольшое, но

■х-

достоверное увеличение АТФ-эависимого поглощения (рис.5 В).

Обнаружено, что действие гепарина на СР миокарда является специфичным, так как он увеличивает поглощение Са^+ только в тех везикулах, которые содержат систему освобождения Са^+. Активация транспорта определяется, по-видимому, полианионными свойствами гепарина, так как другой полианион декстрансульфат также увеличивает накопление Са^+ СР, незыряженный декстран не оказывает эффекта .

Инозитол-1,4,5-трифосфат рассматривается в настоящее время как возможный медиатор электро-механического сопряжения в мышцах. Нами была поставлена задача провести сравнительное исследование действия инозитол-1,4,5-трифосфата на систему освобождения Са^+ в микросомах гладких мышечных волокон аорты собаки и в СР скелетных мышц кролика и миокарда собаки.

Инозитол-1,4,5-трифосфат в концентрации 5 мкМ вызывает быстрое освобождение 20-25 % поглощенного кальция из фракции микросом гладких мышечных волокон аорты собаки (рис. 6). Показано, что инозитол-1,4,5-трифосфат в концентрации до 10 мкМ не

Рис.6. Транспорт Са^+ препаратом микросом гладких мышечных волокон аорты, измеренный по флуоресценции квин 2. Освобождение Са индуцировано инозитол-1,4,5-трифосфатом (И$з) или ;аламетицином (15 мкг/ !мл).

5Т|КМ 5мкМ

03

4 б

С-| 2

Л

3

Л

4

о

аламети-цин

8 мин. микросомы аорты

р.

вызывает освобождения Са г из СР скелетных мышц и миокарда, хотя выброс Са^+ из этих фракций может быть индуцирован кофеином или Са . На основании полученных данных можно заключить, что содержащаяся во фракциях СР скелетных мышц и миокарда система освобождения Са^+, активируемая кофеином и Са^+, не чувствительна к действию инозитол-1,4,5-трифосфата.

б. Влияние алифатических углеводородов на систему осво-о.

бождения Са терминальных цистерн СР. ГалотановыЙ наркоз в ряде случаев осложняется развитием злокачественной гипертермии, которую в настоящее время связывают со

способностью общего анестетика галотана (1,1,1-трифтор-2-хлор-2-

2+

бромэтана) индуцировать освобождение Са из СР путем повышения

2+

сродства системы освобождения Са к ионам кальция (Вее1ег, ваЫе, 1985). Учитывая относительно неполярный характер молекулы галотана можно предполагать, что в структуре системы освобождения Са^+ находится гидрофобный участок, взаимодействие с которым определенных неполярных соединений переводит систем освобождения Са^+ из состояния с низким сродством к ионам кальция в состояние с высоким сродством. Для выявления такого участка и установления его специфичности по отношению к определенным молекулярным структурам в нашей работе была исследована способность ряда негалоидированных

алифатических углеводородов вызывать подобно галотану освобожде-р.

ние Са т из СР скелетных мышц. . '

Алифатические углеводороды практически не растворимы в воде, поэтому для встраивания углеводородов в мембрану ТЦ был использован метод, основанный на применении углеводород-содержащих липо-сом (Ритов, ВДурзахметова, 1979). На рис.7 видно, что добавление в

(Я

ч <и ю

Л

и О

л ч

о

2,2,4-триметил-л,пентан 2

— 4 - 3

аз К

ч 0> ■о

и 2

\

Л

аз

О

л Ч

О

I 8 мин. ТЦ

J

2,2,4-триметил-

пентан аламетицин

^ 8 мин.

ПТ

Рис.7. Освобождение Са^+ из терминальных цистерн и продольных трубочек СР скелетных мышц под действием 2,2,4-триметилпентана (3,5 мкг/мл). I - контроль, 2 -рутениевый красный 3 мкМ, 4 -№012 4 мМ. Флуоресценция 2. 3 - тетракаин 0,2 м!Л.

среду инкубации после поглощения Са^+ мембранами ТЦ спиртового

раствора дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) с 2,2,4-триметил-

пентаном вызывает быстрое освобождение 70-75 % поглощенного Са^+

о.

из фракции ТЦ, содержащей систему освобождения Са , и 5-10 %

о, р ,

Са из фракции ПТ. Освобождение Са из ПТ под действием 2,2,4-триметилпентана обусловлено примесью везикул ТЦ во фракции ПТ. Смесь ДПФХ с гексаном, гептаном или октаном вызывает медленное освобождение 5-10 % Са^+ из фракции ТЦ. Раствор ДПФХ или смесь ДПФХ с деканом не оказывают эффекта. Освобождение Са^+ под действием 2,2,4-триметилпентана подавляется полностью рутениевым красным (3 мкМ), частично тетракаином (0,2 мМ) и при повышении концентрации %С1«> с 1,5 до 4 мМ (рис.7). Уменьшение концентрации

АТФ с 2 мМ до 10 мкМ при неизменной концентрации (0,5 мМ) су-

2+

щественно снижает скорость освобождения Са под действием 2,2,4-триметилпентана .

Представленные данные позволяют предположить, что под дей-

А

Б

ствисм 2,2,4-триметилпентана происходит активация Са ^"-каналов, входящих в Са ^"-зависимую систему освобождения Са^+. На это указывают следующие факты: I) фракция ТЦ, которая обогащена Са^+-каналами, проявляет большую чувствительность к 2,2,4-триметил-пентану, чем фракция ПТ; 2) скорость освобождения Са^+ под действием 2,2,4-триметилпентана снижается при уменьшении концентрации АТФ - активатора Са ^"-каналов ТЦ; 3) блокаторы кофеин-инду-цированного освобождения Са^+ подавляют эффект 2,2,4-триметилпентана .

Л &

О) X X О)

о •о о № О

о

75

50

25

Рис.8. Зависимость степени освобождения Са из ТЦ под действием 2,2,4-триметилпентана от концентрации М^йр в отсутствие 1 о ) и в присутствии ( • ) 5 мМ кофеина. Флуоресценция квин 2.

2 4 ммМ

%С12

Высокая специфичность 2,2,4-триметилпентана как индуктора освобождения Са^+ по сравнению с исследованными н-алканами позволяет предположить, что в структуре системы освобождения Са^+ находится гидрофобная полость, стерически адаптированная к разветвленной углеводородной группировке. Заполнение этой полости

р.

подходящим по структуре радикалом приводит к активации Са -каналов. Физиологическое значение этих гидрофобных взаимодействий станет более понятным, если удастся выявить эндогенный ли-ганд, содержащий соответствующую группировку. Возможно, что таким

лигандом может быть белок, в состав которого входит триметиллизин.

р.

Обнаруженное освобождение Са под действием 2,2,4-триметилпента-

на может иметь важное значение для фармакологии, так как 2,2,4-

о,

триметилпентан не вызывает выхода Са"~ из СР смиокарпя.

Заключение.

Полученные гт.анные показывают, что няблюпяются некоторые различия в системе освобождения СР скелетных мышц и миокарда, которые проявляются в разной чувствительности к активирующему действию ионов серебра, гепарину и 2,2,4-триметилпентану, а также к блокаторам эффекта кофеина. Наиболее ванным отличием СР миокарда является низкая чувствительность к ионам магния. Это различие может иметь важное физиологическое значение, так как концентрация свободных ионов магния в волокнах скелетных мышц и миокарда довольно велика и составляет примерно 2 мМ.

Можно предположить, что в скелетных мышцах в отличие от миокарда должен существовать специальный механизм снятия ингибируто-щего действия ионов магния в момент активации Са-каналов. Только в этом случае скорость освобождения Са^+ будет достаточна для инициации сокращения. Поэтому большой интерес представляют полученные нами данные по совместному действию гепарина и кофеина, • или 2,2,4-триметилпентана и кофеина на освобождение Са^+ из везикул СР скелетных мышц. При совместном действии гепарина и кофеина (рис.5) или 2,2,4-триметилпентана и кофеина (рис.8) ионы магния не оказывают блокирующего действия на освобождение Са^+.

Обнаруженные различия в чувствительности системы освобождения Са^+ СР скелетных мышц и миокарда к полианионам указывают на различную структурную организацию этих систем. Известно, что в скелетных мышцах для освобождения Са^+ из СР достаточно деполяризации сарколеммы (МИесИ et а1., 1984). В миокарде кроме деполяризации необходимым условием является поступление Са^+ внутрь

волокна (Chapman ot al., 1979). Существование в мембрянах CP скелетных мышц и миокарда Са-зависимой системы освобождения Са2+ дает основание предположить два возможных способа ее активации в клетке:

1 - активация в результате повышения концентрации Са^+ вблизи

Са ^"-рецептора;

2 - активация в результате повышения сролства Са2+-рецептора к

Са^+ в такой степени, что концентрации Са^+ в покоящейся мышце (Ю М) достаточно для инициации освобождения Са' .

Логично допустить, что в миокарде реализуется первый способ реактивации (при участии Са , поступающего из внеклеточной среды), а в скелетных мышцах - второй способ.

ЕЫВОДЫ

1. Разработан метод получения фракции мембран саркоплазматическо-

го ретикулума миокарда, обогащенной везикулами, содержащими „ р+

Са -каналы.

2. Налажен метод измерения поглощения и освобождения Са^+ изолированными везикулами саркоплазматического ретикулума скелетных мышц, миокарда и гладких мышечных волокон аорты с использованием Са^+-комплексона квин 2.

3. Проведено сравнительное исследование освобождения Са^+ из изолированных везикул саркоплазматического ретикулума скелетных

р.

мышц,и миокарда. Показано, что Са -каналы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и миокарда активируются под действием ионов кальция, а не инозитол~1,4,5-трифосфата. Характеристики Са ^"-активируемого освобождения Са^+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и миокарда одинаковы.

4. Обнаружен новый способ инициации освобождения Са2+ из сарко-плазматического ретикулума скелетных мышц под действием полианионов. Механизм действия полианионов заключается в увеличе-

о.

нии сродства системы освобождения Са к ионам кальция.

5. Обнаружен новый способ инициации освобождения Са2+ из сарко-плазматического ретикулума скелетных мышц под действием 2,2,4-триметилпентана. Предполагается, что в структуре системы освобождения Са2+ находится гидрофобная полость, адаптированная к триметильной группировке. Заполнение этой полости подходящим по структуре радикалом приводит к активации Са -каналов.

6. На основании изучения действия активаторов и блокаторов выявлены различия в системе освобождения Са2+ саркоплазматичес-кого ретикулума скелетных мышц и миокарда, которые заключаются в разной чувствительности к активирующему действию ионов серебра, полианионов и 2,2,4-триметилпентана, а также к бло-каторам эффекта кофеина.

7. На основании полученных результатов предложен механизм инициации освобождения Са2+ в волокнах скелетных мышц и миокарда .

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ритов В.Б., Меньшикова Е.В., Будина Н.Б., Козлов Ю.П. Выход

о, о »

Са под действием кофеина и Са - два независимых способа освобождения ионов Са из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц. Биол. мембр., 1984, т.1, № II, с.1184-1190.

2. Ритов В.Б., Меньшикова Е.В., Козлов Ю.П. Освобождение ионов

из фракции терминальных цистерн саркоплазматического ретикулума скелетных мышц под действием гепарина. Биол. мембр., 1985, т.2, № 3, с.315-318.

3. Беневоленский Д.С., Меньшикова Е.В., Левицкий Д.О., Ритов В.Б., Козлов Ю.П. Влияние кофеина на Са^+-транспортирующую функцию пузырьков саркоплазматического ретикулума из миокарда крысы. Бюлл.экспер.биол. и мед., 1985, № 9, с.315-317.

,4. Меньшикова Е.В., Ритов В.Б., Козлов Ю.П. Действие кофеина на изолированные пузырьки саркоплазматического ретикулума. В сб. 5 Всесоэз. конф. по биохимии мышц, Тбилиси, 1985,

5. Ritov V.B., Menshikova E.V., Kozlov Yu.P. Heparin induces Ca release from the terminal cysterns of skeletal muscle, sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett., 1985, v.188, Ы1, 77-80.

6. Ритов В.Б., Меньшикова Е.В., Будина Н.Б., Козлов Ю.П. Два способа освобождения Са^+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц. В сб. 5 Всесоюзн. биохим. съезда, Киев, 1986, с. 396.

о,

7. Меньшикова Е.В., Ритов В.Б. Освобождение ионов Са из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц под действием -кофеина. Биохимия, 1986, т. 51, № 4, с.бОЗ-бЦ.

8. Беневоленский Д.С., Меньшикова Е.В., Феттер Р., Левицкий Д.О. Ритов В.Б. Са^+-индуцируеыый выброс Са^+ из саркоплазматического ретикулума сердца. Биол. мембр., 1986, т.З, № 7, с,668-673.

9. Беневоленский Д.С., Меньшикова Е.В., Логинов В.А., Левицкий Д.О., Ритов В.Б. Сравнение механизмов освобождения Са^* из саркоплазматического ретикулума сердца и гладких мышц аорты. В сб. III Симп."Метаболизм, структура и функция сердечной клетки", Баку, 1985, с.100.

10. Ритов В.Б., Меньшикова Е.В. Механизмы освобождения ионов Са^

из саркоплазматического ретикулума. В сб. III Симп."Метаболизм, структура и функция сердечной клетки", Баку, 1986,с.102.

11. Меньшикова Е.В., Беневоленский Д.С., Левицкий Д.О., Ритов В.Б. Сравнительный анализ освобождения ионов Са*"+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и миокарда. В сб. III Симп. "Метаболизм, структура и функция сердечной клетки", Баку, 1986, с.163.

12. Меньшикова Е.В., Ритов В.Б., Козлов ЮЛ. Освобождение ионов Са^+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц под действием гепарина. Связь с освобождением Са^+ под действием Са2+ и кофеина. Биохимия, 1985, т.51, № 10, с.1696-1701.

13. Ритов В.Б., Меньшикова Е.В., Ходоров Б.И. Сравнительный анализ действия гепарина и кнозит-I,4,5-трифосфата на систему освобождения Са2+ в саркоплазматичзском ретикулуме скелетных мышц. Биол. мембр., 1985, т.З, № II, с.1122-1129.

14. Меньшикова Е.В., Беневоленский Д.С., Левицкий Д.0., Ритов В.Б. Козлов Ю.П. Сравнительное исследование освобождения ионов Са2+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и миокарда. В сб.XII Всесоюзн.конф. по транспортным АТФазам, Иркутск,1987, с.47.

15. Цупрун В.Л., Зограф О.Н., Кафтанова А.С., Орлова Е.В., Меньшикова Е.В., Ритов В.Б., Киселев Н.А. Электронная микроскопия кристаллов Са^+-АТФазы в мембранах фракции терминальных цистерн и продольных трубочек саркоплазматического ретикулума. . Докл. АН СССР, 1987, т.296, № 3, с.760-762.

16. Ритов В.Б., Меньшикова Е.В., Козлов Ю.П. Два способа активации системы освобождения Са в саркоплазматическом ретикулуме скелетных мышц. В сб.УШ Симп."Биофизика и биохимия биологической подвижности", Пущино, 1987, . . .

17. Benevolengky D.S., Menshikova B.V., Watras J., Levitsky D.O., Ritov V.B. Characterization of Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum of myocardium and vascular smooth muscle.

Biomed. Biochim. Acta, 1987, v.46, N 8/9, 393-398;

p.

18. Ритов В.Б., Меньшикова E.B. Освобождение ионов Са из терминальных цистерн саркоплазматического ретикулума скелетных мышц под действием 2,2,4-триметилпентана. Биол. мембр., 198Э, т.6, № 6, с.587-596.

19. Ritov V.B. , Uenshikova E.V. 2,2,4-Trimethylpentane induces Ca release from the sarcoplasmic reticulum terminal cisterns..Biochim. Biophys..Acta, 1991, v.1067, 187-190.

20. Ritov V.B. , Murzakhmotova M.K. , TvercLislova I.L., Menshikova

E.V., Butylin A.A., AvaMan T.Yu., Xakovenko L.V.

Alamethicin as a permeabilizing agent for measurements of 2+

Ca -dependent ATPase activity in proteoliposomes, sealed membrane vesicles, an<L whole cells. Biochim. Biophys. Acta, 1993, v.1148, 257-262.

jlUuu^

MIT JIHK3aica3 2Sä, Tiipas 603K3.