Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфический анионный транспортер церебральных эндотелиоцитов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Специфический анионный транспортер церебральных эндотелиоцитов"

На правах рукописи

КАРДАШОВА Карина Шамилевна

Специфический анионный транспортер церебральных эндотелиоцитов (получение моноклональных антител, исследование органной и клеточной локализации и нейрокогнитивных функций)

03.01.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАР 2015

Москва-2015

005559699

005559699

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Турина Ольга Ивановна Официальные онпоненты:

Морозов Сергей Георгиевич - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией общей и перинатальной нейроим-мунопатологии, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно исследовательский институт общей патологии и патофизиологии».

Егоров Алексей Михайлович - Академик РАН, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией инженерной энзимологии химического факультета Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Ведущее учреждение:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» МЗ РФ

Защита состоится «23 марта» 2015 г. в 16 ч. на заседании Диссертационного совета Д.001.002.01 при ФГБНУ «НИИ питания» (109240, г.Москва, Устьинский проезд, д.2/14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «НИИ питания» и на сайте www.ion.ru.

Автореферат разослан «_»2015 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук,

Шилина Н.М.

Актуальность исследования.

Создание лекарственных препаратов направленного типа действия уже более 100 лет является актуальной задачей медицины [ Weiss N, Miller F. et al., 2009]. Особое значение создание адресных препаратов имеет в терапии глиаль-ных опухолей. Избирательная проницаемость гематоэнцефалического барьера и высокая активность эффлюксных систем даже в слабо дифференцированном церебральном эндотелии существенно ограничивают возможности фармакотерапии [Torchilin VP., 2004; Pardridge WM„ 2012].

Один из перспективных подходов к созданию адресных лекарственных препаратов центрального действия заключается в применении высокоспецифических антител к белкам-мишеням в нервные ткани в качестве вектора, определяющего избирательность доставки лекарства [Belitsky P. et al., 1978; Goldenberg D. M. et al., 1981; Chekhonin VP. et al., 2001-2014; Wen Z. et al., 2011].

Среди белков, специфичных для церебрального эндотелия особого внимания заслуживает цереброспецифический анионный транспортер (BSAT1 или ОАТР14) [Li, J. Y. et al., 2001; Sugiyama D. et al, 2001]. BSAT1 является представителем широко распространенного семейства транспортеров органических анионов ОАТР, локализуется на люминальной и аблюминальной мембране эн-дотелиацитов, осуществляя АТФ-зависимый транспорт тироксина в головной мозг [Noe В. et al, 1991; Kullak-Ublick GA. et al, 2001]. Высокая специфичность BSAT1 по отношению к микрососудам нервной ткани делает его очень интересной мишенью для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в церебральные капилляры [Sugiyama D. et al., 2003].

Цель работы; получить моноклональные антитела к рекомбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоцитов, изучить его клеточную и органную локализацию, нейрокогнитивные свойства, а также оценить перспективы применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем в экспериментальную глиому Сб.

Задачи исследования:

1. Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к ре-комбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоцитов (BSAT1).

2. Изучить иммунохимические свойства моноклональных анти-BSATl-антител.

3. Изучить клеточную и органную локализацию BSAT1.

4. Изучить когнитивные функции у потомства самок крыс, которым в перинатальном периоде парентерально вводили анти-В SAT 1-антитела.

5. Оценить перспективы применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем в экспериментальную глиому Сб.

Научная новизна исследования.

Впервые исследована органная, клеточная и субклеточная локализацию цереброспецифического анионного транспортера BSAT1 крысы с помощью антител к его внеклеточному фрагменту. Продемонстрировано влияние антител к внеклеточному фрагменту BSAT1 на когнитивные функции экспериментальных животных. Показано, что полученные моноклональные анти-В SAT 1 антитела при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 накапливаются в опухолевой ткани. Впервые изучены перспективы применения анти-BSATl антител в качестве высокоселективного вектора для направленной доставки наноразмерных систем в злокачественные новообразования центральной нервной системы.

Практическая значимость.

С применением моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному фрагменту BSAT изучена клеточная, тканевая и органная локализация. Полученные в работе данные могут использоваться для планирования дизайна доклинических исследований по направленному транспорту диагностических и лекарственных препаратов в мозг.

Апробация диссертационной работы.

Основные положения диссертационной работы были представлены на межлабораторных конференциях ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского», Москва, 2011-2013; Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2012; XXVIII(93) сессии общего собрания РАМН (2013). Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры и Отдела медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета ГБОУ ВПО Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета имени Н.И. Пирогова Минздрава России и сотрудников Отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ Социальной и Судебной Психиатрии имени В.П. Сербского Минздрава России 28 июня 2012 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3-статьи в российских научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, одна статья в иностранном журнале, 2 - тезисы в материалах российских и международных конференций. Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, семи глав, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 181 машинописных страницах, содержит 6 таблиц и иллюстрирована 55 рисунками. Список литературы включает 6 отечественных и 336 иностранных источника. Материалы и методы.

Получение моноклональных aumu-BSATl антител.

Рекомбинантный BSAT1 для иммунизации был получен в совместной работе с Баклаушевым В.П. [Баклаушев В.П. и др, 2011]. Самок мышей линии Balb/C подкожно иммунизировали рекомбинантным очищенным препаратом BSAT1 крысы (20 мкг) с полным адъювантом Фрейнда («BD Advanced Biotech», США). Иммунизация состояла из двух циклов: в первом - четыре подкожных иммуни-

зации, во втором - две подкожных иммунизации и заключительное бустерное введение препарата.

Получение гибридом проводили по методике Köhler G. и Milstein С. в нашей модификации [Чехонин В.П. и др., 2001]. Скрининг гибридных клеток продуцирующих анти-В SAT 1 -антитела проводили параллельно несколькими методами трехкратно: твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА), иммуноцитохимическим анализом (ИЦХ), иммуногистохимическим анализом (ИГХ) и иммуноблотингом. Для положительного контроля использовали коммерческие анти-BS ATI -антитела («Antibodies-online Inc.», США). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические иммуноглобулины мыши в эквивалентной концентрации. Первичные антитела проявляли козьими антителами к F(ab)2 фрагментам иммуноглобулинов мыши, конъюгированны-ми с пероксидазой хрена и предабсорбированными сывороткой крысы (А3682, «Sigma», США). Иммунофлуоресцентный анализ проводили с козьими антимышиными антителами конъюгированными с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США) в разведении 1:1000, ядра клеток докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Моноклональные антитела выделяли из асцита методом аффинной хроматографии на протеин А агарозе («Invitrogen», США). Для получения первично меченных флуорохромом моноклональных анти-В SAT 1-антител и неспецифических IgG использовали набор Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit («Invitrogen», США).

Аффинность полученных моноклональных антител к BSAT1 определяли методом ИФА, путем расчета константы гетерофазного равновесия образования комплексов антиген-антитело [BeattyJ.D. etal., 1987].

Исследование когнитивных функций у крыс. Эксперименты проводили на белых беспородных самках крыс и их потомстве. Потомство самцов полученное от самок, которым вводили на 10-й день гестации в бедренную вену: -анти-BSATl антитела 100мг/кг(1) -неспецифические IgG 5 мг/кг (2) -физраствор (3)

Тестирование поведения потомства начинали по достижении возраста 30

дней. Условия содержания крыс и все экспериментальные процедуры соответствовали международным правилам обращения с животными (Директива 86/309 Европейского сообщества от 24 декабря 1986 г.). Антнангиогенная терапия глиомы 101/8.

Интракраниальную опухоль моделировали на самках породы Вистар (п = 37), которым имплантировали кусочки опухоли глиобластомы 101/8 (моделирование выполнялось в НИИ морфологии человека РАМН доктором A.C. Халан-ским). Для терапевтического применения на группе животных с имплантированной глиомой (п = 32) использовали следующие препараты: цисплатин (CDDP, п = 5), невекторные наногели (NG, п = 8), векторные наногели с неспецифическими IgG мыши в качестве вектора (NG-IgG, п = 4), векторные наногели с анти-BSATl антителами в качестве вектора (NG-BSAT1, п = 6) и группа животных с плацебо (5 % глюкоза, п = 9). Все препараты вводили в бедренную вену под кетаминовым наркозом, 1 раз в 5 дней, начиная с 5 суток после имплантации, в дозировке при пересчете на концентрацию цисплатина 5 мг/кг веса. Результаты экспериментальной терапии оценивали по динамике развития опухоли (на основании проводимого МРТ исследования и морфометрии) и увеличению продолжительности жизни. Анализ выживания проводили по методу Каплана-Мейер, обрабатывали результаты в программе «Statistics 7.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Иммуноблотинг. Для подтверждения иммунохимической специфичности полученных антител по отношению к антигену BSAT1 был проведен имму-ноблотт анализ, позволяющий идентифицировать молекулярную массу белка, который взаимодействует с полученными анти-В8АТ1-антителами. Константа аффинности моноклональных антител к рекомбинантному препарату BSAT1 составила Ка = 4,44 ±0,39 * 108 М-1. В качестве отрицательного контроля использовались неспецифические IgG антитела. Эксперимент был проведен в трех повторах.

Иммунофлюоресцеитный анализ. На этапе иммунохимической характеристики анти-BSATl-антител, проводили иммунофлюоресцеитный анализ на замо-

решенных срезах головного мозга и на фиксированных препаратах НЕК.293. В качестве положительного контроля использовали коммерческие анти-BSATl-антитела (10 мкг/мл, (Antibodies-online Inc., США). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные IgG из асцита в эквивалентной концентрации. Проявляли козьими антимышиными антителами конъ-югированными с Alexa Fluor® 488 («Invitrogen», США), ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США).

А Б в

х- ' t •

■ • ' 1ЙГ ч •1 V I s ш ц i -

ч

в 1 ' J

' . 1 100 Jim 1

Рисунок .1 Результаты иммунофлюоресцентного анализа В8АТ1.

А. Б. Замороженные срезы мозга крысы. Визуализируются мембранные структуры клеток в паренхиме мозга (А) и в перивазальных пространствах (Б). Увеличение х200 (А) и х100. В. Культура клеток НЕК293. Ядра клеток докрашены РАР1 (1пуйп^еп, США). Отрезок - 20 мкм.

На этапе тестирования, нами было продемонстировано, что данные антитела при иммунофлюоресцентном анализе специфически выявляют мембранные структуры в паренхиме мозга и перивазальном пространстве. Иммуноморфологический анализ органной локализации В8АТ.

В результате проведенного исследования, было продемонстрировано, что ни в печени, ни в почках флюоресценция, показывающая экспрессию В8АТ1, не отличалась от контрольных срезов, окрашенных только вторичными антителами с А1ехаР1иог® 488 (рис. 2 А, Б).

Отсутствие экспрессии ВБАТ] по данным иммуногистохимического анализа также наблюдалось на срезах селезенки, легкого и сердца. В тоже время, на срезах яичников экспрессия В8АТ1. выявляемая моноклональными анти-В5АТ1-антителами, была обнаружена в примордиальных фолликулах (рис. 3

В).

Рисунок 2. Результаты им-муногистохимнческого анализа В8АТ1 на вибротомных срезах органов крысы.

А. Почка,

Б.Печень, В.Яичник.

1 .Суммарное изображение. 2.Окрашивание ядер клеток (ОАР1, ¡пуигс^еп. США). З.Моноклональные антитела к ВБАТЧ и вторичные антимышиные антитела с А1ехаР1иог 488.

В продолжение исследования, проводили двойное иммунофлюоресцент-ное окрашивание с помощью моноклональных антител к BSAT1 и поликло-нальных антител к GFAP срезов мозга крысы. При этом было продемонстрировано, что специфическая флюоресценция BSAT1 в нормальной нервной ткани локализуется преимущественно в GFAP-положительных астроцитах (рис.3).

При иммуногистохимическом исследовании срезов мозга, содержащих глиальные опухоли 101/8 мы также обнаружили экспрессию BSAT1 как в пери-туморальной области в реактивных астроцитах, образующих глиальный вал вокруг опухоли, так и в самих глиомных клетках (рис. З.Д - Е).

Рисунок 3. Результаты двойного имму-нофлюоресцентного анализа В8АТ1 и СРАР на срезах головного мозга.

A. Суммарное изображение.

Б. Ядра клеток, окрашенные ОАР1

B. ИммунофлюоресценцияВ8АТ1. Г. ИммунофлюоресценцияОРАР.

Д., Е. Иммунофлюоресцентный анализ ВБАТ! в глиальной опухоли 101/8. Зеленая флюоресценция - моноклональ-ные анти-В8АТ1-антитела, красная флюоресценция - поликлональ-ные антитела к вРАР.

Иммуноцитохнмичеекий анализ BSAT1 в культуре церебральных эндоте-лиоцитов крысы (RBEC).

На следующем этапе исследования при проведении иммуноцитохимиче-ского анализа анти-BS ATI-антител на культуре церебральных эндотелиоцитов крысы четко выявлялось двойное окрашивание одних и тех же клеток, но с различной локализацией - внутриклеточное окрашивание Z01 и клеточная мембрана, выявляемая BSAT1 (рисунок 4).

■ Рисунок 4. Результаты двойного иммуно-флюоресцентного анализ BSAT1 и ZOl на в культуре клеток RBEC.

A. Суммарное изображение.

Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI

B. Иммунофлюоресценция BSAT1. Г. Иммунофлюоресценция ZOl.

Зеленая флюоресценция - моноклональные

анти-BSAT 1 -антитела.

Красная флюоресценция - антитела к ZOl.

к* ,, г- v. А Б

В Г

V* 4v д -'V * \ -г Е

В отрицательных контролях специфической флюоресценции не было. Полученные результаты иммуноморфологического анализа, включающего в себя исследование органной, тканевой и клеточной локализации В8АТ с применением полученных моноклональных анти-В8АТ1 -антител, послужили предпосылкой для проведения следующего этапа исследования - анализу распределения меченных анти-ВБАТЬАТ в организме взрослых и новорожденных крыс при внутривенном введении.

Изучение влияния анти-В8АТ1-антител на когнитивные функции беременных крыс и их потомства.

Хорошо известно, что для проникновения через гематоэнцефалический барьер в нейроны и клетки глии гидрофильных тиреоидных гормонов необходимы специфические транспортеры тиреоидных гормонов. В эндотелиоцитах мозга и сосудистого сплетения грызунов показан высокий уровень экспрессии В8АТ1. У нокаутных по гену В8АТ1 мышей, проводились исследование концентрации ТГ в сыворотке крови, но эффекты снижения биосинтеза В8АТ1 на когнитивные функции крыс изучены не были.

Беременным самкам крыс (по 3 в каждой группе, возраст 3 мес., вес 240280 г) на 16-й день гестации под общей анестезией кетамином (внутрибрюшин-но, 100 мг/кг) в бедренную вену вводили раствор анти-В8АТ1-АТ, неспецифических мыши из расчета 5 мг/кг или эквивалентное количество физраствора.

При проведении экспериментального исследования животные были разделены на три группы:

1. Потомство, полученное от самок крыс, которым на 16 день гестации вводили анти-В8АТ1-АТ;

2. Потомство, полученное от самок крыс, которым на 16 день гестации вводили неспецифические ^О мыши (группа сравнения)

3. Потомство, которым на 16 день гестации внутривенно вводили физиологический раствор.

К процедуре тестирования поведения потомства приступали по достижении возраста 30 дней. Дальнейшие экспериментальные исследования проводи-

ли на самцах. В опытной группе было 15 животных, группе сравнения - 21, в контрольной - 17. Исследование проводилось слепым методом.

Индекс спонтанного чередования в У-лабиринте, являющийся показателем рабочей памяти, у крыс опытной группы был достоверно ниже, чем у крыс группы сравнения и контрольной (20,4 ± 2, 29,2 ± 0,6 и 28,4 ± 0,9 соответственно; р<0,001), в то же время значения индекса между двумя последними не отличались (р>0.05), (рисунок 5).

анти-ВвАТ-АТ

<8<3 ф/р

Рисунок 5. Индекс спонтанного чередования в тесте У'-лабнринт (в условных единицах). *р<0.001 по сравнению с опытной группой.

□

Рисунок 6. Тест распознованин новою объекта (в условных единицах).

*р<0.001 по сравнению с опытной группой.

В тесте распознавания нового объекта значение индекса дискриминации, характеризующего соотношение времени исследования нового и знакомого предметов, у животных опытной группы составило -26,1 ± 7,0, что было существенно ниже, чем в группах сравнения и контрольной (41,8 ± 5,6 и 40,3 ± 8,4 соответственно; р < 0.001) (рисунок 6.). Статистически значимых отличий между двумя контрольными группами выявлено не было (р > 0.05).

При оценке долговременной рабочей памяти в модели пассивного избегания через 48 ч после обучения у крыс контрольной группы (с анти-ВБАИ-АТ) сохран-ность навыка, оцениваемая по разнице времени перехода в темный отсек (с), была намного ниже (56,0 ± 27,0), чем в группах с введением физраствора и неспецифиче-ских (225,0 ± 24,0 и 253,0 ± 10,0 соответственно; р < 0.001), (рисунок 7).

350 300

анти-ВвАТ-АТ ф/р

Рисунок 7. Разница но времени (с) перехода в темный отсек в тесте пассивного избегания. *р<0.001 по сравнению с опытной группой.

При тестировании кратковременной пространственной памяти в лабиринте Морриса крысы всех групп обучались одинаково. Но через 48 ч при оценке долговременной памяти крысы контрольной группы (с анти-В8АТ1-АТ) достоверно дольше находили платформу (53,2 ± 2,8), чем животные, матерям которым вводили физраствор и (35,6 ± 4,4 и 33,1 ± 5,0 соответственно; р < 0.01). При этом разницы между группой контроля группой сравнения выявлено не было (р > 0.05), (рисунок 8).

70

? 60 а.

1 50

2 эи

| 40 | * *

4

| 30 1 2 20 ■ 1 ГГ" 1

2 ж а. ] () ■ г

А ■ 1

антн-ВБАТ-АТ ДО ф/р

Рисунок 8. Время (с) нахождения животными платформы в тесте Морриса через 48 ч (при однократной пробе) после обучения. *р<0.01 по сравнению с опытной группой.

У потомства крыс, после внутривенного введения самкам моноклональ-ных анти-В5АТ1-антител, наблюдаются нарушения рабочей памяти в У-лабиринте, долговременной визуальной памяти в модели распознавания нового объекта, рабочей долговременной в тесте пассивного избегания и долговременной пространственной памяти в тесте Морриса. Результаты проведенных в нашем исследовании поведенческих тестов свидетельствуют о нарушениях функциональной активности различных структур мозга, вовлеченных в процессы памяти и обучения: периринальной и префронтапьной коры, а также гиппо-кампа. В связи с этим, можно предположить, что наблюдаемые эффекты анти-В8АТ-антител обусловлены нарушением транспорта Т4 через временную блокаду их мишени - В8АТ1, что приводит к развитию локального гипотиреои-дизма в мозге на критических стадиях его раннего развития, последствия чего проявляются уже в зрелом возрасте.

Исследование распределения меченных I125 и AlexaFluor®660 анти-BSATl-антител in vivo и оценка перспектив применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем в экспериментальную глиому 101/8.

Одной из задач проводимого исследования явилось обоснование применения полученных моноклональных анти-BSATl-AT для разработки систем направленного транспорта к клеткам церебрального эндотелия, в связи с этим был проведен анализ распределения этих антител в организме взрослых крыс и новорожденных крысят после внутривенного введения.

Исследование накопления анти-BSA TI антител меченных AlexaFluor® 660 в головном мозге плода, введенных в кровоток беременной самки на 16 день гестации.

Исследование проводили на двух группах крысят:

1. Потомство, полученное от самок, которым на 16 сутки гестации вводили анти-BSATl-антитела (опытная группа);

2. Группа контроля — потомство от самок, которым на 16 сутки гестации внутривенно вводили неспецифические IgG мыши.

В результате проведенного исследования было показано, что максимальная концентрация неспецифических IgG в контрольной группе наблюдалось через 24 часа после введения, однако, в дальнейшем происходила элиминация неспецифических антител из мозга, и к концу наблюдения (72 часов) флуоресценция отсутствовала. В тоже время, у плодов крысы, которым вводили анти-BSATl-AT, при анализе срезов мозга, в больших полушариях и мозжечке плода крысы обнаруживалась специфическая флюоресценция, обусловленная накоплением антител к BSAT1, вплоть до 72 часов после введения. Это подтверждает специфическое накопление моноклональных анти-BSATl антител в ткани мозга плода, обусловленное селективным взаимодействием с антигеном, а не пассивную диффузию из плазмы в межклеточное пространство головного мозга и наглядно демонстрирует проникновение введеных антител через фето-плацентарный и гематоэнцефалический барьеры крысы (рисунок 9).

Рисунок 9. Распредение анти-BSATl-антител, меченных AlexaFluor 660

А - через 24 ч после введения, Б - через 72 ч после введения.

А, Б - результирующее изображение; А1, Б1 — DAPI; А2, Б2 - Ahth-BSATI антитела.

Исследование распределения меченных I12' анти-В8АТ1-антител при внутривенном введении крысам с индуцированной глиомой Сб.

После получения результатов анализа проникновения анти-BSATl -антител через фетоплацентарный и гематоэнцефалический барьеры и специфическому накоплению этих антител в ткани мозга плодов, мы приступили к анализу распределения этих антител в органах и тканях у взрослых крыс с индуцированной глиомой Сб. Для этого мы использовали анти-BSATl-АТ, предварительно меченные I1"5 Для проведения эксперимента были взяты две группы крыс с 18-дневной экспериментальной глиомой С6:

1. Крысы, которым вводили меченные I12' анти-BSATl-антитела;

2. Группа контроля - крысы, которым внутривенно вводили меченные I125 неспецифические IgG мыши.

Анализ распределения меченых анти-BSATl-антител по органам подтвердил, что эти антитела не накапливаются в печени, почках, легком, сердце и селезенке, а также в интактном левом полушарии головного мозга. Накопление

радиоактивных анти-В8АТ1-антител в этих органах не отличалось от накопления неспецифических иммуноглобулинов мыши

Накопление специфических анти-В8АТ1-антител в области глиомы, превышающее более чем в 20 раз накопление неспецифических ^О мыши дает основания предположить, что моноклональные антитела к В8АТ1 могут быть использованы в качестве вектора при создании систем направленного транспорта в область глиом.

Направленный транспорт контейнерных систем на основе моноклональ-ных антн-В8АТ1-антнтел в экспериментальную глиому 101/8.

В настоящее время одним из классических подходов к пролонгированию циркуляции лекарственных препаратов в крови, уменьшению системной токсичности и улучшению биодоступности, является заключение их в наноконтей-неры. При проведении конъюгации наноконтейнерных препаратов с монокло-нальными антителами к антигенам клеток опухолевой ткани и пери-туморальной зоны, такие наноконтейнеры приобретаю векторные свойства.

Как было показано при предыдущих исследованиях, моноклональные ан-ти-В8АТ1-АТ при системном введении обладают способностью специфически накапливаться в очаге глиомы и, тем самым, повышать селективность нанокон-тейнерного препарата к клеткам опухоли.

Перед экспериментами по терапии образцы мозга крыс с экспериментальной глиомой 101/8 исследовали с помощью иммуногистохимического и гистологического методов на предмет экспрессии В8АТ1(рисунок 10).

Результаты проведенных морфологического и иммуногистохимического анализов служили основанием для проведения эксперимента по изучению векторных наноконтейнерных препаратов цисплатина с анти-В8АТ1-антителами в качестве вектора для терапии низкодифференцированных глиом.

Рисунок 10. Результаты иммуногнстохимнческого анализа экспериментальной глиобластомы 101/8.

A. Суммарное изображение

B. Окрашивание ядер клеток ОАР1.

C. Иммунофлюоресценция В8АТ1 в опухоли.

О. Иммунофлюоресценция СРАР в перитуморальной зоне астроглиального вала.

При проведении эксперимента крыс с моделированной глиомой 101/8 разделили на шесть групп:

1. СБОР - группа животных, получавших свободный цисплатин;

2. N0 - группа животных, получавших невекторные наногели;

3. NG-MAbBSATl — группа крыс, которым вводили наногели с анти-В8АТ1-антителами;

4. N0-^0 - группа животных, получавших наногели с неспецифическими иммуноглобулинами;

5. Плацебо — контрольная группа, получавшая 5% глюкозу, которая является растворителем для свободного и наноконтейнерного цисплатина.

Животные с имплантированной глиобластомой 101/8 и получавшие в качестве терапии 5% глюкозы (плацебо), погибали максимально в течение 21 суток. При этом отмечалось постепенное снижение веса тела к 15 суткам после имплантации. Постмортально у животных выявляли отек мозга с кровоизлиянием в ткань опухоли; при прорастании в желудочковую систему отмечалось присоединение окклюзионной гидроцефалии.

В группе животных, получавших терапию цисплатином (СБОР) отмечалось увеличение выживаемости, по сравнению с группой плацебо. Однако клинически с 5 по 15 сутки состояние крыс было объективно тяжелее - двигатель-

ная активность снижалась, выявлялись признаки поражения ЦНС и периферической нервной системы. Потеря веса у животных этой группы к 15 суткам была большей, чем в группе животных с плацебо. Однако в дальнейшем значимой потери веса у этих животных не происходило. После 15 суток отмечалась относительная стабилизация состояния и продолжительность жизни увеличивалась до 45 суток. Таким образом, медиана выживаемости у животных этой группы (28 суток) была достоверно выше по сравнению с животными из группы плацебо (15 суток).

У группы животных, получавших наноконтейнерный цисплатин (N0), отмечалась относительная сохранность двигательной активности до 25-27 суток (до гибели животных). Также была менее выраженная потеря веса у животных этой группы. Таким образом, объективное состояние крыс было объективно лучше, чем у животных групп плацебо и с цисплатином. Медиана выживаемости у этих животных была выше, чем в группе плацебо.

Аналогичная ситуация наблюдалась в группе животных, получавших терапию наноконтейнерным цисплатином с неспецифическим вектором (N0-1цО): объективно отмечалось более легкое состояние, двигательная активность сохранялась практически до 25 суток жизни, когда развивались симптомы внутричерепной дислокации. Потери веса в группе этих животных не наблюдалось. Медиана выживаемости, однако, была несколько ниже (20 суток), чем у животных, получавших невекторный наноконтейнерный цисплатин. У животных, получавших препарат векторного наноконтейнерного цисплатина (N0-МАЬ В8АТ1) не выявлялись признаки объективного ухудшения состояния и развития неврологической симптоматики вплоть до момента гибели. Медиана выживаемости крыс этой группы (39 суток) была достоверно выше, чем у животных других экспериментальных групп. Потери веса в этой группе животных не наблюдалось.

Динамическое МРТ головного мозга крыс проводили на 5, 10, 15, 20 сутки после имплантации и при этом на аксиальных и коронарных сканах определяли объем опухоли.

При последующем морфометрическом анализе было показано, что объем глиомы у крыс, получавших в качестве терапии наноконтейнерный невекторный цисплатин (NG), наноконтейнерный цисплатин с неспецифическим вектором (NG-IgG) и 5% глюкозу, достоверных отличий не имел до 15 суток включительно после имплантации, затем у животных групп с плацебо и NG-IgG отмечалось резкое увеличение объема опухоли и животные погибали. Объем опухоли у животных, получавших препарат векторного наноконтейнерного цисплатина (NG-MAb BSAT1) практически до 30 суток исследования был достоверно ниже, чем у животных групп плацебо, NG и NG-IgG. В тоже время, у группы животных, получавших цисплатин (CDDP), объем опухоли достоверно не отличался от объема глиомы у крыс группы (NG-MAb BSAT1) до 30 суток наблюдения, однако после 30 суток выявлено быстрое увеличение роста опухоли.

Таким образом, в результате проведенного эксперимента на основании анализа выживаемости показано, что терапия глиобластомы 101/8 адресными препаратами наноконтейнерного цисплатина достоверно более эффективна, чем терапия невекторными наногелями и свободным цисплатином. Кроме того, с применением объективных методов исследования - МРТ и морфометрии -продемонстрировано, что на начальных этапах развития опухолевого процесса при терапии препаратами векторных наногелей с цисплатином объем опухоли достоверно меньше, чем у крыс группы плацебо, а также получавших терапию невекторного наноконтейнерного цисплатина и препаратом наноконтейнерного цисплатина с неспецифическим вектором. Результаты проведенного эксперимента могут служить предпосылками для развития нового направления в области создания транспортных систем векторного типа действия — лекарственных препаратов на основе моноклональных антител к цереброспецифическомй анионному транспортеру BSAT1. Выводы.

1. Иммунизация мышей линии Balb/c рекомбинантным препаратом эктракле-точного фрагмента ассоциированного с нервной тканью анионного транспорте-

ра В5АТ1 и последующее слияние В-лимфоцитов этих мышей с клетками мие-ломы линии 8р2/0-А§14 позволили получить гибридому, продуцирующую мо-ноклональные анти-ВБАТЬАТ, характеризующиеся константой аффинности равной 4,4 х 108 М-1.

2. Полученные моноклональные анти-ВБАТ-АТ способны специфично распознавать экстраклеточный фрагмент (451-557 а.о.) ассоциированный с нервной тканью анионного транспортера В8АТ1 в иммунохимическом анализе (имму-ноблот, иммуноферментный и иммуноцитологический анализ) нативных препаратов дефинитивной и патологически измененной нервной ткани.

3. Иммуноцитологический и иммуногистохимический анализ В5АТ1 на основе полученных моноклонапьных анти-В8АТ1-АТ позволяет специфично локализовать антиген в ОРАР-положительных астроцитах нормальной нервной ткани и примордиальных фолликулах яичников. Моноклональные анти-ВБАИ-АТ визуализируют глиомные клетки. При конфокальной микроскопии В8АТ1 локализуется в структурных компонентах цитоскелета актинпозитивных глиом-ных клеток.

4. Выявлены ингибирующие эффекты анти-В5АТ1-АТ на когнитивные функции потомства самок крыс, которым в пренатапьном периоде парентерально вводили анти-В5АТ1-АТ. Среди них: нарушение рабочей памяти в У-лабиринте, снижение долговременной памяти в модели распознавания нового объекта, тесте пассивного избегания, а также долговременной пространственной памяти в тесте Морриса.

5. Полученные моноклональные анти-ВБАТЬАТ, введенные внутривеннно крысам с глиомой С6 способны достоверно накапливаться в ткани глиомы (0,26 % ± 0,02%).

6. Применение с терапевтической целью векторной нанонтейнерной системы на основе моноклональные анти-В8АТ1-АТ и полиэлектролитных гелей нагруженных цисплатином позволяет достоверно уменьшить скорость роста экспе-

риментальной глиомы 101/8 крысы и достоверно увеличить медиану выживаемости лабораторных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России:

1. Баклаушев В.П., Кардашова К.Ш., Турина О.И., Леопольд A.B., Семенова A.B., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Клонирование, экспрессия цереброспецифи-ческого анионного транспортера bsatl и получение моноклональных антител к его внеклеточному фрагменту. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011 - Т. 152(12), С. 679-683 (0,3 печ. л.)

2. Баклаушев В.П., Кардашова К.Ш., Турина О.И., Юсубалиева Г.М., Зорки-на Я.А., Чехонин В.П. Органная, клеточная и субклеточная локализация цере-броспецифического анионного транспортера bsatl. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013 - Т. 155(4) - С. 487-494 (0,6 печ. л.)

3. Зубков Е.А., Баклаушев В.П., Кардашова К.Ш., Турина О.И., Морозова А.Ю., Сторожева З.И., Кекелидзе З.И., Чехонин В.П. Эффекты пренатального воздействия антител к мозгоспецифическому транспортеру анионов на когнитивные функции крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2013 - Т. 155(4).- С. 435-438 (0,3 печ. л.)

Работы, опубликованные в других рецензируемых журналах

4. Baklaushev VP., Nukolova NN., Khalansky AS., Gurina OL, Yusubalieva GM., Grinenko NPh., Gubskiyl IL., Melnikovl PP., Kardashova KSh., Kabanov AV., Chekhonin VP. Treatment of glioma by cisplatin-loaded nanogels conjugated with monoclonal anti-bodies against Cx43 and BSATl. // Drug Deliv, Early Online: 1-10 - 2014 - Informa Healthcare USA.

Тезисы конференций

1. Я.А. Зоркина, Г.М. Юсубалиева, Т.А. Савельева, С.А. Горяйнов, К.Ш. Кардашова, М.Н. Холодцова. Моноклональные антитела к опухоль-ассоциированным антигенам в интраоперационной диагностике глиобла-

стом. VII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых. Москва, Россия. Тезисы докладов, 2012, с.198.

2. К.Ш. Кардашова. Получение гибридомы, продуцирующей моноклональ-ные антитела, распознающие нативный внеклеточный фрагмент ВБАТЬ VII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых. Москва, Россия. Тезисы докладов, 2012, с.213.

Заказ № 44-Р/02/2015 Подписано в печать 10.02.15 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел. (495)649-83-30 ! ( ОТ )) www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru