Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация аминокислот активного центра транспортеров органических катионов (ОСТs), участвующих в связывании кортикостерона

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Шацкая, Наталья Владимировна, Вюрцбург

62 12/40

БАВАРСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ЮЛИУСА МАКС а/1 ЛИАНА

И И

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ТРАНСПОРТЕРОВ ОРГАНИЧЕСКИХ КАТИОНОВ (ОСТэ), УЧАСТВУЮЩИХ В СВЯЗЫВАНИИ КОРТИКОСТЕРОНА

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.01.04 - биохимия

Шацкая Наталья Владиславовона , /

Руководитель: Проф. Кёпсель (Prof. Koepsell)

М.

В юр бург 2006

Оглавление

Список сокращений 4

Цель работы 6

1. Обзор литературы 7

1.1 Транспортеры семейства SLC22 8

1.2 Функциональные характеристики транспортеров ОСТ 12

1.3 Субстратные свойства транспортеров ОСТ 15

1.4 Клеточная локализация субтипов ОСТ 19

1.5 Полиморфизм и мутации транспортеров ОСТ 23

1.6 Клиническая значимость транспортеров ОСТ 26

2. Материалы и методы 30

2.1 Материалы 30

2.1.1 Реактивы 30

2.1.2 Радиоактивные соединения 31

2.1.3 Ферменты и наборы 31

2.1.4 Оборудование 31

2.2 Молекулярно биологические методы 32

2.2.1 Приготовление плазмид дикого типа, точечных мутантов и химерных

конструктов 32

2.2.2 Линеаризация плазмидной ДНК 35

2.2.3 Спектрофотометрический анализ ДНК 35

2.2.4 Электрофорез ДНК 35

2.2.5 Транскрипция мРНК с матрицы ДНК 36

2.2.6 Электрофорез РНК 36

2.3 Система экспрессии в ооцитах лягушки Xenopus Laevis 37

2.3.1 Лапоротомия Xenopus Laevis 37

2.3.2 Приготовление ооцитов для инъекций 33

2.3.3 Стадии развития ооцитов 38

2.3.4 Микроинъекции РНК в ооциты 39

2.3.5 Измерение транспорта 40

2.3.6 Расчеты и статистика 40

3. Результаты

3.1 Функциональная характеристика химер, созданных на базе транспортера

ЮСТ1 с заменой фрагментов на соответствующие из ЮСТ2 42

3.2 Анализ активности химер 45

3.3 Измерение значений Км для ТЕА 48

3.4 Взаимодействие кортикостерона с конструктами с точечными мутациями на базе транспортера ЮСТ1 56

3.5 Взаимодействие катионных субстратов с мутантами ЮСТ1, имеющими высокое сродство к кортикостерону 65

3.6 Ингибирование кортикостероном мутантов на базе ЮСТ2, содержащих единичные замены аминокублот из ЮСТ1 71

4. Обсуждение 74

5. Литература 86

Список сокращений.

АТФ Аденозинтрифосфорная кислота

BSA Бычий сывороточный альбумин

BES N, N-бис [2-гидроксиэтил]-2-аминоэтансульфоновая кислота

Срт (counts per minute) количество импульсов в минуту

Кю Кюри

С-Тегт (C-terminus) С-конец

DEPC Диэтилпирокарбонат

DMSO Диметилсульфоксид

E-Loop (extracellular loop) внеклеточная петля

ЮСТ (Flounder organic cation transporter) транспортер органических

катионов камбалы

hOCT (Human organic cation transporter) транспортер органических

катионов человека

IC50 (half maximal inhibitory concentration), концентрация ингибитора, при которой активность белка составляет 50 % от исходной l-Loop (Internal loop) внутриклеточная петля

MFS (Major facilitator superfamily) Основное надсемейство транспортеров

МРР 1-Метил-4-фенилпиридин йодид

мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

mOCT (Mouse organic cation transporter) транспортер органических

катионов мыши

NMN N-1-метилникотинамид

N-Term (N-terminus) N-конец

OAT (Organic anion transporter) транспортер органических анионов

OCT (Organic cation transporter) транспортер органических катионов

OCTN (Organic cation-carnitine transporter) транспортер органических

катионов и карнитина

РАН Парааминогиппуровая кислота

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ЮСТ (Rat organic cation transporter) транспортер органических катионов

крысы

SDS Додецил сульфат натрия

SLC (Solute carrier superfamily) надсемейство транспортеров

растворенных веществ

TEA Тетраэтиламмоний

TMD (Transmembrane domain) трансмембранный домен

ЭДТА Этилендиаминтетраацетат

Аминокислоты.

Аланан Ala A

Аргинин Arg R

Аспарагин Asn N

Аспартат Asp D

Цистеин Cys С

Глутамат Glu E

Глутамин Gin Q

Глицин Gly G

Гистидин His H

Изолейцин lie 1

Лейцин Leu L

Лизин Lys К

Метионин Met M

Фенилаланин Phe F

Пролин Pro P

Серин Ser S

Треонин Thr T

Триптофан Trp w

Тирозин Tyr Y

Валин Val V

Цель работы.

Субтипы транспортера ОСТ имеют перекрывающиеся субстратные свойства, но различное распространение по тканям, регуляцию и селективность для субстратов и ингибиторов [Koepsell et al., 2003]. Например, стероидные гормоны ингибируют транспорт органических катионов у всех трех субтипов ОСТ, но с разным сродством, характерным для каждого субтипа [Koepsell et al., 2003]. Стероиды трже участвуют в долгосрочном регулировании транспортера ОСТ2, но не имеют такого влияния на ОСТ1 [Urakami et al., 2000; Shu et al., 2001]. Известно, что при ингибировании ОСТ кортикостероном значения IC5o составили: для человеческого ОСТ1 -10 мкМ, для человеческого ОСТ2 -30 мкМ, для человеческого ОСТЗ -0.2 мкМ, для крысиного ОСТ1 -150 мкМ, для крысиного ОСТ2-4 мкМ и для крысиного ОСТЗ -5 мкМ [Grundemann et al., 1998; Wu et al., 1998; Zhang et al., 1998; Arndt et al., 2001; Hayer- Zillgen et al., 2002].

Целью настоящей работы было определить аминокислоты транспортера гОСТ2, которые определяют высокое сродство белка к кортикостерону в сравнении с

субтипом транспортера ОСТ1.

Для этих целей на основе транспортера ЮСТ1 была сконструирована серия химерных белков, в которой белок был разделен на 16 частей (включающих в себя: предполагаемые трансмембранные домены, внутри- и внеклеточные петли) и каждая из этих частей была заменена на соответствующию область из ЮСТ2 транспортера. Для характеризации этих химерных конструктов измерялся транспорт 10 мкМ [14С]ТЕА и относительные константы Михаэлиса-Ментен Km транспорта TEA и ингибирования TEA транспорта прокаинамидом и кортикостероном.

1. Обзор литературы.

Транспортеры это инструмент поддержания жизни и помощи в адаптации живых систем к изменяющимся условиям внешней среды. Они снабжают клетки питательными веществами и ионами и, таким образом, оказывают влияние на их метаболизм. Конечные продукты метаболизма также удаляются из клеток при помощи транспортеров. В печени и почках транспортеры играют важную роль в детоксикации и выведении ксенобиотиков из организма и, таким образом, являются главными определяющими факторами в ответе на лекарства и степени чувствительности к ним. Например, при цистинурии, которая может приводить к смерти, транспортеры играют важную роль. Поскольку их роль так критична, то они часто выступают в качестве мишени при терапевтических вмешательствах. В некоторых случаях они ответственны за проблемы, возникающие при химиотерапии в лечении рака и устойчивости микроорганизмов к антибиотикам [Ambudkar et al. 2003, Paulsen 2003]. Почечная выделительная система - это основной путь выведения многих лекарств, использующихся в клинической практике и единственный способ для выведения многих конечных продуктов переработки препарата [Leabman et al., 2002; Pritchard et al., 1993; Koepsell et al 2003; Wright et al., 2004]. Большая доля этих агентов попадает в химический класс, так называемых, органических катионов, это разнообразное множество первичных, вторичных, третичных и четвертичных аминов, которые несут положительный заряд на аминогруппе при физиологических значениях рН. Было показано, что внеклеточные органические катионы (в том числе Nl-метилникотинамид, холин, эпинефрин и допамин) активно секретируются проксимальными канальцами и главная функция этого процесса - это очищение организма от ксенобиотиков [Dantzler and Wright, 1997; Pritchard and Miller, 1993; Wright and Dantzler, 2004], включающих в себя широкий спектр алкалойдов и других положительно заряженных, гетероциклических соединений поступивших с пищей; катионов, которые содержатся в лекарствах и продуктах их переработки или других положительно заряженных токсинов, поступивших из внешней среды (например, никотин).

Транспорт органических катионов изучается более сорока лет, с применением различных подходов, среди которых - измерение транспорта у интактных животных, в изолированных органах, срезах тканей, перфузорованных почечных канальцах и изолированных везикулах плазматической мембраны [Eisenhofer 2001; Elferink et al. 1995; Graefe et al.1988; Roch-Ramel et al. 1992;Turnheim and Lauterbach 1977; Ullrich 1994]. Благодаря быстрому развитию различных техник молекулярной биологии, в частности клонирования, за последние двадцать лет было охарактеризовано большое количество транспортеров органических катионов.

1.1 Транспортеры семейства SLC22.

Транспортные белки - это интегральные мембранные белки, которые подразделяются на несколько надсемейств. Одно надсемейство это транспортеры SLC (Solute Carrier - надсемейство транспортеров растворенных веществ), которое включает 360 различных транспортеров, разделенных на 47 семейств [Koepsell and Endou 2004]. Транспортеры надсемейства SLC могут действовать как унипортеры, симпортеры и антипортеры, ионные каналы и аквапорины.

Другое надсемейство это - MFS транспортеры, представляет самую большую группу (Saier 2000). Несмотря на растущий интерес к этим белкам и большое количество лабораторий занимающихся ими, структурная информация на уровне атомов появилась сравнительно недавно. Изначально предполагалось, что надсемейство MFS участвует в транспорте Сахаров [Henderson and Maiden 1990].

Pao et al. обобщили свойства транспортеров надсемейства MFS (the major facilitator superfamily). Они разделили членов семейства MFS на 18 подсемейств, среди которых транспортеры Сахаров (среди которых OCTs); лекарства:Н+ антипортеры; органофосфаты:Р1 антипортеры; олигосахариды:Н+ симпортеры; метоболиты:Н+ симпортеры и так далее [Pao et al 1998].

В 1994, наша лаборатория клонировала первый полиспецифический транспортер ЮСТ1 (транспортер органических катионов) из печени крысы [Grdndemann et al. 1994]. Позднее был клонирован первый транспортер органических анионов ОАТ1 (SLC22A6) из крысы и камбалы [Sekine et al. 1997; Sweet et al. 1997; Wolff et al. 1997] и после клонирования остальных членов подсемейства обнаружилось, что ЮСТ1 был первым прототипом большого надсемейства MFS [Pao et al. 1998; Koepsell et al. 2004]. Семейство SLC22

включает три подсемейства: транспортеры органических катионов (ОСТ), транспортеры карнитина (OCTN) и транспортеры органических анионов (ОАТ).

Подсемейство ОСТ на настоящий момент представлено 12 различными гомологичными транспортерами, которые, базируясь на филогении, могут быть разделены на несколько эволюционно различных ветвей (Рис. 1), включая OCTs (вкл. hOCTI-3), OCTNs (вкл. hOCTN1-2) и OATs (вкл. ИОАТ1-4).

Транспортеры органических катионов представлены тремя субтипами: ОСТ1, ОСТ2, ОСТЗ [Gorbouiev et al. 1997; Gründemarin et al. 1994, 1997, 1998a; Kekuda et al. 1998; Mooslehner and Allen 1999; Okuda et al. 1996; Schweifer and Barlow 1996; Terashita et al. 1998; Zhang et al. 1997] и OCTN1, OCTN2 [Sekine et al. 1998; Tamai et al. 1997, 1998, 2000; Wu et al. 1998a, 2000а]. Большая группа транспортеров из семейства SLC22 вовлечена в транспорт органических анионов: шесть транспортеров органических анионов были обнаружены у человека ОАТ1-ОАТ5 и URAT1 [Cha et al. 2000, 2001; Enomoto et al. 2002; Youngblood et al. 2004; Hosoyamada et al. 1999; Reid et al. 1998]. Fliptl, hUST3, OCTL1 и OCTL2 - продукты генов с неизвестной функцией [Eraly and Nigam 2002; Nishiwaki et al. 1998; Sun et al. 2001]. За исключением вариантов сплайсинга [Bahn et al. 2000; Urakami et al. 2002; Zhang et al. 1997b], все члены семейства SLC22 имеют длину около 550-560 аминокислот и по анализу гидрофобности они имеют 12 предполагаемых трансмембранных доменов (TMDs) и две больших гидрофильных петли. N- и С-концы белка находятся в цитоплазме [Meyer-Wentrup et al., 1998], и между доменами первым и вторым есть большая (внеклеточная) петля и вторая большая петля находится внутри клетки между доменами 6 и 7 (смотреть Рис. 2).

ГСАТ5

Рисунок 1. Филогенетическое дерево транспортеров человека, принадлежащих семейству SLC22. Расстояние между ветками обратно пропорционально степени идентичности последовательности. Рисунок взят из [Wright S. and Dantzler W., 2004].

Рисунок 2. Предполагаемая топология транспортеров семейства БЬС22 на примере транспортера органических катионов ЮСТ1 .Аминогруппы, которые различаются у транспортеров гОСТ1 и гОСТ2 окрашены в желтый

Три субтипа полиспецифических транспортеров катионов ОСИ, ОСТ2 и OCT3-были выделены из крысы [GrQndemann et al. 1994; Kekuda et al. 1998; Okuda et al. 1996], мыши [Mooslehner and Allen 1999; Schweifer and Barlow 1996; and Gen-Bank accession no. AF078750] и человека [Gorboulev et al. 1997; Grundemann et al. 1998a; Zhang et al. 1997а]. Также, был клонирован OCT1 кролика [Terashita et al.1998], и OCT2 кролика и свиньи [Grundemann et al. 1997; Zhang et al. 2002]. У человека гены кодирующие ОСТ1, ОСТ2 и ОСТЗ локализованы в кластере на хромосоме 6 (q26-27) [Grundemann and Schomig 2000; Grundemann et al. 1998a; Koehler et al. 1997; Eraly et al. 2002]. Каждый из трех генов содержит 11 экзонов и 10 интронов [Grundemann and Schomig 2000; Hayer et al. 1999; Verhaagh et al. 1999]. На белковом уровне субтипы транспортеров у человека, мыши и крысы имеют межвидовое сходство: 78-95% (ОСТ1), 81-91% (ОСТ2) и 87-93% (ОСТЗ). У данных видов сходство между аминокислотами разных субтипов: 67-70% между ОСТ1 и ОСТ2, 47-57% между ОСТ1 и ОСТЗ, и 49-51% между ОСТ2 и ОСТЗ. Сплайсинговые варианты были обнаружены для ОСТ1 у крысы и человека [Hayer et al. 1999; Zhang et al. 1997b] и для OCT2 [Urakami et al. 2002]. Например, был обнаружен вариант белка ОСТ1, ЮСТ1А у крысы [Zhang et al. 1997b], с отсутствующими первыми двумя трансмембранными доменами и большой внеклеточной петлей, связывающей их. При его экспрессии в ооцитах лягушки, ЮСТ1А ингибировал TEA транспорт со значением константы Михаэлиса-Ментен Km = 42 рМ, которое примерно совпадает со значением Km для ЮСТ1=95 рМ [GrQndemann et al. 1994]. Для сплайсингового варианта транспортера ОСТ1 человека активности показано не было [Hayer et al. 1999], в то время как для hOCT2A - сплайсинговый вариант человеческого ОСТ2, у которого отсутствовал С-конец и последние три трансмембранных домена, транспортировал TEA с -5% активностью, в сравнении с нормальным, но обнаружил более высокое сродство к некоторым катионам [Urakami et al. 2002].

1.2 Функциональные характеристики транспортеров ОСТ.

Транспорт катионов белками OCTs изучался на разных системах, среди которых: ооциты шпорцевой лягушки Xenopus laevis, клеточные линии в числе которых: НЕК 293, HeLa, MDCK, СНО-К1, RPE, Sf9 клетки насекомых и другие [Koepseil et al. 2003]. Транспорт определялся как поглощение радиоактивно меченых или

флуоресцентных соединений [Ciarimboli et al. 2004; Mehrens et al. 2000; Pietig et al. 2001], как электрический ток проходящий через мембрану ооцита по методике двухэлектродной фиксации потенциала (2-electrode voltage clamp) или методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp), при котором ограниченный пипеткой фрагмент мембраны используется для определения трансмембранного потенциала [Budiman et al. 2000, Volk et al. 2003]. Относительные значения константы Михаэлиса-Ментен (Km) для субстратов и относительные значения константы ингибирования (Ki) для ингибиторов очень сильно зависят от использованного метода и системы экспрессии. Данные по абсолютным скоростям транспорта очень сильно варьируют между лабораториями. Поскольку сродство для субстратов и ингибиторов зависит от мембранного потенциала и регулируется состоянием транспортера [Mehrens et al. 2000], что в разных экспериментальных условиях является причиной вариабельности измеряемых параметров. В этом отношении, методы двухэлектродной и локальной фиксации потенциала имеют большие преимущества: поскольку мембранный потенциал в этих экспериментах не просто известен, а фиксируется (обычно на -50 mV), таким образом, при измерении кинетических параметров вариация уменьшается, что делает эксперименты более воспроизводимыми.

Некоторые свойства общие для всех транспортеров OCTs и не зависят от субтипа и вида:

1. ОСТ - являются переносчиками различных органических катионов с различными структурами и ингибируются другими - нетранспортируемыми соединениями.

2. ОСТ - переносят органические катионы электрогенным способом, то есть при переносе молекулы субстрата происходит перенос заряда. Электрогенность транспорта была показана для транспортеров ЮСТ1, ЮСТ2 и ЮСТЗ [Arndt et al. 2001 ; Busch et al. 1996a; Gründemann et al. 1994; Kekuda et al. 1998; Nagel et al. 1997; Okuda et al. 1999], и для человеческих белков hOCT1 и hOCT2 [Busch et al. 1998; Dresseret al. 2000; Gorboulev et al. 1997].

3. ОСТ - функционируют независимо от концентрации ионов Na+ и СГ [Busch et

al. 1996а; Gorboulev et al. 1997; Kekuda et al. 1998].

4. ОСТ - способны переносить катионы через плазматическую мембрану в обе стороны. Вдобавок к транспорту катионов внутрь клетки, для ЮСТ1, ЮСТ2, hOCT2

и ЮСТЗ был продемонстрирован транспорт катионов из клетки [Busch et al. 1996а, 1998; Kekuda et al. 1998; Nagel et al. 1997].

Большинство субстратов, переносимых ОСТ транспортерами - органические катионы, но слабые основания и незаряженные соединения также могут являться для них субстратами. Транспортируемые субстраты, как впрочем, и ингибиторы ОСТ транспортеров, могут быть эндогенными соединениями, лекарствами или ксенобиотиками. Эндогенные субстраты, транспортируемые ОСТ, включают моноамины нейротрансмиттеры, такие как: ацетилхолин, допамин, серотонин, гистамин и другие соединения, такие как: креатинин, холин, гуанидин и тиамин. Многие лекарства и ксенобиотики взаимодействуют с ОСТ так же, как и транспортируемые субстраты или как ингибиторы. Когда взаимодействие соединения с ОСТ проверяется непосредственно через эффект поглощения выбранного соединения, например, типичных субстратов - тетраэтиламмония (TEA) или 1 -метил-4-фенилперидиниумиодида (МРР) [Koepsell et al., 2004], важно отметить что, наличие ингибирования в данном случае не отвечает на вопрос транспортируется ли данное соединение или нет. Конкурентное связывание второго лиганда может быть достаточным для объяснения причин наблюдаемого ингибирования. Однако, вне зависимости от того транспортируется второй лиганд или нет, это не оказывает влияния на предсказания транспорта первого лиганда.

Например, человеческий ОСТ транспортирует такие лекарства как: циметидин -антагонист гистаминового рецептора [Barendt and Wright 2002; Zhang et al. 1998], антиди