Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химическая характеристика и функциональные свойства дефенсинов и протегринов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химическая характеристика и функциональные свойства дефенсинов и протегринов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

ШАМОВА Ольга Валерьевна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ДЕФЕНСИНОВ И ПРОТЕГРННОВ

03.00.04 - биохимия

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена в Отделе общей- патологии и патологаческо] физиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (директор - академш РАМН Б.И.Ткаченко).

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор Е.А.Корнева, старший научный сотрудник, к.б.н. В.Н.Кокряков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.Н Лызлова, доктор медицинских наук В.НАлександров

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова РАН, г.Санкт-Петербург.

Защита состоится " 16 " ёсир^- 1995) г. в " IЪ " часов п; заседании специализированного . совета К 001.23.01 при Научно исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул. акад.Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИР экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан " ^ " О^гихБр.й. 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

ОЛГ-Куликова

Актуальность проблемы. В последние годы Бее большее внимание уделяется изучению неспецифических факторов защиты организма от различных повреждающих воздействий. Одним из ключевых ' компонентов системы неспецифической резистентности являются нейтрофильные гранулоциты - высокодифференцированные клетки, специализированные на осуществлении защитных реакций путем фагоцитоза или выделения антимикробных Ееществ в среду (Пига-ревский,1973; Klebanoff, Clark,1978). Сочетание готового эф-фекторного потенциала со способностью к быстрой его реализации

- свойство, которое делает нейтрофил одним из участников ранней ответной реакции на любые изменения в тканях организма (Маянский А., Маянский Д. ,1939). В лизосомальных гранулах нейтрофилов содержится набор биологически активных молекул -миелопероксидаза, лиз.оцим, нейтрально-Щелочные протеиназы, кислые гидролазы, неферментные катионные белки. Одним из компонентов гранулярного аппарата нейтрофилов являются дефенсины

- группа гомологичных катионных полипептидов, открытых в 1963 году (Zeya, Spitznagel,1963) и детально изученных позднее другими американскими учеными (Ganz et al. ,1985; Lehrer et al.,1993), а в настоящее время привлекающих внимание многих исследователей благодаря обнаружению у этих пептидов спектра функциональных свойств. Дефенсины обладают высокой антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибков и некоторых оболочечных вирусов, а тага© имеют ряд свойств, проявляющихся при взаимодействии их с различными типами клеток организма - способны вызывать хемотаксис макрофагов (Territo et al. ,1989), дегрануляцига тучных клеток (Yamashita, Saito, 1989), увеличивать проницаемость сосудов (Ranadive,Cochrane, 1963) и стимулировать их рост (Кудряшов и др, 1939), воздействовать на-Са++ каналы L-типа на мембранах энтероцитов (MacLeod et al. ,1991), а также ингибировать индуцированный АКТГ стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников крыс in vitro (Zhu et al. ,1938). Основной функцией дефенсинов большинство ученых считает их универсальную антимикробную активность, за которую их назвали "антибиотиками -тавотного происхождения" (Кокряков,1938, Lehrer et al. ,1991). Дефенсиноподобные белки обнаружены в гемолимфе насекомых (Lambert et al, 1989). Это свидетельствует о том, что такие соединения могут являться одними из древнейших факторов защиты

организма от инфекционных агентов. Поэтому поиск и сравнительно- биохимический анализ дефенсинов и подобных им пептидов в фагоцитах животных разных видов, классов и даже типов может дать информацию, существенную для понимания путей эволюции факторов неспецифической резистентности.

Особого внимания заслуживает и установленная пока только in vitro способность дефенсинов ингибировать стимулированную АКТГ продукцию кортикостероидов клетками надпочечников крыс (Zhu et al. ,1987,1988). Авторы назвали это свойство пептидов кортикостатической активностью и предположили, что дефенсины могут, быть включены в число соединений, участвующих ео взашио--действиях между гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и иммунной системами (Bateman et al, 1989). Однако на уровне целостного организма способность эндогенных или экзогенных дефенсинов влиять на стероидогенез не показана, . нет данных и об их эффектах в условиях активации глюкокортикоидной реакции при стрессе, хотя эти данные могли бы оказаться немаловажными для объяснения известного феномена нейтрофилеза, наблюдаемого при стрессорных воздействиях,- биолдгический смысл которого до сих пор полностью не ясен.

Цель и задачи исследования. ■ Цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании'физико-химических и функциональных свойств катионных полипептидов из лейкоцитов свиньи ( протегринов ) и дефенсинов из нейтрофильных гранулоцигов кролика, крысы и человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: ■

1. Получить высокоочищенные индивидуальные фракции полипептидов из лейкоцитов свиньи (протегриноБ; и дефенсинов человека, кролика и крысы.

2. Исследовать физико-химические свойства протегринов (хрома-тографические и злектрофоретические свойства, молекулярную массу и структурные особенности ).

3. Провести сравнительный анализ антимикробной активности протегринов и дефенсинов человека и кролика.

4. Изучить влияние суммарных препаратов и индивидуальных фракций дефенсинов и протегринов на стимулированное введением АКТГ повышение уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных.

1 5 '5. Исследовать влияние экзогенных дефенсинов на характер

глюкокортикоидной реакции при стрессе. 6. Изучить эффекты введения дефенсинов на показатели гуморального иммунного ответа при стресс-индуцированной шлмуносуп-рессии.

Научная новизна. Открыт новый класс ранее неизвестных полипептидов из лейкоцитов свиньи - прогегринов С РЭ-1, РЗ-2 и

• РБ-З), осуществлен анализ ряда их физико-химических свойств (. изучены хроматографические " и электрофоретические характеристики, ■ определен молекулярный вес, аминокислотный состаЕ). Установлено, что эти полепептиды имеют не только ряд структурных особенностей, сближающих их с дефенсинами, но и по-видимому, являются их функциональными аналогами' - показана их еысо-

• кая антимикробная активность, а также наличие кортикостати-ческих свойств у протегрина Рб-З/

Впервые в условиях целостного организма установлено, что экзогенные дефенсины и протегрины способны снижать повышенный после инъекции АКТГ уровень кортикостерона в крови экспериментальных животных.

Впервые показано, что предварительное введение дефенсинов животным предотвращает ингйбирующий эффект стрессорных воздействий на некоторые показатели гуморального иммунного ответа.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты сравнительного анализа структурных и функциональных свойств протегринов и дефенсинов могут внести свой вклад в развитие ■ представлений о путях эволюции молекулярных механизмов неспецифической резистентности.

Сочетание высокой микробоцидной активности и относительно простой структуры, позволяющей производить химический синтез протегринов, открывает перспективы создания новых антимикробных лекарственных препаратов на основе этих соединений.

Установленная способность экзогенных дефенсиноЕ влиять на уровень кортикостерона в крови экспериментальных животных в условиях активации глюкокортикоидной функции надпочечников свидетельствует в пользу гипотетического представления о де-фенсинах как об участниках взаимодействия между нейроэндок-ринной и иммунной системами, а также дает основание рассматривать дефенсины и протегрины как потенциальные стресс-лимитирую-щие агенты.

Данные об отмене дефенсинами стресс-индуцированной имму-иосупрессии могли бы оказаться полевными при' разработке препаратов для клинического использования в случаях нарушения деятельности иммунной системы, вызванных тяжелыми стрессорными воздействиями.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Использованные препаративные методы выделения дефенси-нов и протегринов из лейкоцитарной массы позволяют получить высокоочищенные индивидуальное фракции этих полипептидов.

2. Из лейкоцитов свиньи получены три гомологичных полипептида с молекулярной массой около 2 тыс. Л, получивших название' протегрины, представляющих собой новую группу полипептидов, сочетающих в своей структуре черты дёфенсинов С значительное содержание основных аминокислот, в том числе аргинина, и, следовательно, высокий положительный заряд, а также наличие идентичных участков в молекулах дефенсинов и протегринов; и антимикробного полипептида из гемоцитов подковообразного краба - тахиплезина.

3. Протегрины проявляют микробоцидную активность против грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибков, сравнимую с активностью дефенсинов кролика.

4. Экзогенные дефенсины и протегрины снижают' повышенный после введения АКТГ или стрессорного воздействия уровень кор-тикостерона в крови у крыс и мышей.

5. Введение дефенсинов предотвращает стресс-индуцированную иммуносупрессию у экспериментальных животных.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании научной конференции-' Отдела общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского ордена Трудового Красного Знамени института экспериментальной медицины РАМН С г. Санкт-Петербург; 3 ноября 1994г.

Основные положения диссертации были представлены на Санкт-Петербургской конференции молодых ученых и специалистов "Механизмы физиологических функций",1992 г. , 2 International Gongress ISNIM, Paestum (Italy), 1993 г., конференции "Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний", Санкт-Петербург, 1993, конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию АМН, Москва, 1994.

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

- ?'-

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы ' С шесть глав), материалов и методов, s глав собственных исследований, общего заключения, еыводоб. В диссертации 9 таблиц и 24 рисунка. Прилагаемый список литературы содержит 220 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

;

Препараты дефенсинов человека, крысы и кролика получали из лейкоцитарной фракции крови (дефенсикы человека.) или из нейтрофилов перитонеалького экссудата (дефенсины крысы.и кролика) с использованием схемы очистки, предложенной (Selsted et al,1984, 1985), а также с помощью набора процедур, включающего экстракцию лейкоцитарной массы 0,3% раствором цетилтриметилам-монийбромида, последующую ионообменную хроматографию на колонке с карбоксиметил-целлюлозой (СМ- 32, "Whatman", Англия), забуференной 0,02 М Na-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl, проводя элюцию белков тем же буфером с линейным градиентом NaCl от 0,1 до 1,2 М, Индивидуальные фракции дефенсинов получали с помощью обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии СОФ ВЭЖК) на микроколоночном жидкостном хроматографе "Милихром" на колонке (2 х 62 мм) с "Нуклеосилом 0-18" (Macherey-Nagel, ФРГ) с использованием градиента концентрации ацетонитрила от 10 до 40% в 0,1% трифторуксусной кислоте; ТФУ).

Протегрины получали из лейкоцитарной фракции крови свиньи, проводя экстракцию лейкоцитарной массы в 10% уксусной кислоте, затем с помощью диализа (диализные трубки "Sigma", 250-9U) отделяли низкомолекулярную фракцию, которую далее наносили на колонку с акрилексом Р-10 ("Reaiial"), забуференную 5% уксусной кислотой. Фракции, содержащие протегрины (по данным электрофоретического анализа б кислой среде), объединяли, лиофилизироЕали и разделяли с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке с "Нуклеосилом 0-18" с использованием градиента ацетонитрила от 15 до 35% в 0,1% ТФУ.

Для оценки чистоты полученных фракций использовали электрофорез в кислой буферной системе (Panyim, C'halkley, 1969) и электрофорез в присутствии додецил-сульфата натрия (Thomas, Romberg, 197?).

Молекулярную массу протегринов определяли методом Электроспрей масс-спектрометрии (Dodonöv et al, 1992) в ходе совместной работа' с сотрудниками Института Аналитического приборостроения РАЕ Первичная структура очищенных препаратов про-' тегринов была определена методом автоматической деградации пептидов по Эдману на установке Porton Model 2090 в лаборатории проф. Лерера (США, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес).

Антимикробную активность протегринов исследовали с помощью метода радиальной диффузии в агарозном геле (Lehrer et al,1991). •

Исследование'кортикостатических и иммуномодулирующих эффектов дефенсинов и протегринов проводилось на 620 крысах-самцах породы "Вистар" весом 180-200 г/и 1050 мышах линии СБА весом 18-20 г из питомника "Рапполово". Животных содержали в условиях вивария на стандартной диете.

Уровень кортикостерона в сыворотке крови определяли пря-. мым радиоиммунологическим методом (Гончаров и др., 197?) Имму- ■ низацию производили эритроцитами барана в дозе 1 млрд клеток (крысам) и 0,5 млрд клеток (мышам)" в/бр. Животных забивали быстрой декапитацией при помощи гильотины. Забор крови для оценки величины гуморального иммунного ответа ' проводили на шестой день после иммунизации. Уровень антител в.сыворотке крови определяли методом прямой гемагглюгинации в микротитраторе "Такачи", количество антителообразующих клеток в селезенке -методом локального гемолиза в геле агарозы Uärne,Nordin,1963).

Данные экспериментов обрабатывали с помощью методов вариационной статистики. Достоверность различий между группами (Р) оценивали по t-критерию Стьюдента (Плохинский,1980) или по U-критерию Вилко кс о на-Манна-Уитни (Гублер, Генкин,1973). Во всех расчетах за достоверный принимали 95% уровень значимости (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и очистка дефенсинов человека, крысы и кролика

В результате очистки были получены индивидуальные фракции дефенсинов человека, кролика и крысы. Идентификацию всех поли-

пептидов осуществляли как электрофоретически, так и масс-спектрометрически. Гомогенность- полученных препаратов оценивали с помощью электрофореза в ПААГ в кислой буферной системе. Для всех очищенных препаратов дефенсиков при электрофорезе в кислой среде выявлялась- только одна белковая фракция . Общий выход дефенсинов (сумма всех фракций) на 1 млрд клеток составил 4-6 мг для дефенсинов кролика, 1-1,5 мг для крысы и 2-3 мг для человека.

•V.

Выделение и очистка протегринов

В поисках гомологов дефенсинов у животных разных видов мы обратились к изучению ранее не исследованного в этом направлении объекта - лейкоцитов свиньи. Электрофоретический анализ препарата, полученного в результате экстракции лейкоцитарной массы в 10% уксусной кислоте, выявил присутствие трех низкомолекулярных компонентов с электрофоретической подвижностью, близкой к подвижности наиболее катионных дефенсинов кролика (впоследствии по предложению проф. Лерера они были названы протегринами (Рй-1, РО-2, Рй-3)(от латинского рго-Ьедо - защищать, покрывать;). Эти три пептида былй очищены с помощью гель-фильтрации на колонке с акрилексом Р-10, забуференной 5% уксусной кислотой, и последующей высокоэффективной жидкостной ■хроматографии на колонке с-"Нуклеосилом С-13" с использованием градиента концентрации ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте от 15 до 352,. Идентификацию отдельных фракций протегринов осуществляли масс-спектрометрически и электрофоретически (Рис.1).

В результате очистки были получены в гомогенном состоянии индивидуальные фракции протегринов РО-1, Р(3-2, Рб-3, выход которых из 1 млрд лейкоцитов составил 0,1-0,2 мг (сумма трех пептидов).

Таким образом, нами были получены очищенные индивидуальные фракции дефенсинов кролика, крысы, человека и ранее не описанных пептидов из лейкоцитов свиньи - протегринов. Отсутствие белковых примесей подтверждалось данными элёктрофорети-ческого анализа и ВЭЖХ каждой фракции .

! ш

¥ «а

С»

#" А <М» «К тт.

1 2. 345 678

Рис.1. Электрофорез в ПААГ в кислой буферной системе С по ,,мет. Рапу1т,Са1к1еу, 1963): 1 -кислотный.экстракт из лейкоцитов свиньи; 2 - низкомолекулярная фракция, полученная после отделения высокомолекулярных компонентов с помощью диализа; 3 -суммарный препарат протегринов, полученный после фракционирования на колонке с акрилексом Р-10; 4, 5, 6 - индивидуальные фракции протегринов после разделения с помощью ОФ ВЭЖХ (. 4 -. Рб-1, 5 - Рб-2, 6 - Р6-3 ); 7 - тахиплезин 1; 8 - тотальный де-фенсин кролика.

Некоторые биохимические характеристики протегринов

Результаты электрофоретического анализа протегринов в .кислой среде свидетельствали о том, что эти полипепгиды обладают высоким положительным зарядом, сходным с зарядом наиболее катионных фракций дефенсинов кролика . Нумерация протегринов соответствует их электрофоретической подвижности: Р6-1 имеет наибольшую подвижность по направлению, к катоду, за ним следует Рб-2 и далее Р6-3. Молекулярную массу протегринов приблизительно оценивали с помощью электрофореза в присутствия ДС-На , установили, что она ниже, чем у дефенсинов и близка к таковой тахиплезина (2тыс. Д). Точные молекулярные массы были определены с помощью Электроспрей масс-спектрометрии, выполненной в ходе совместной работы с сотрудником Института Аналитического

приборостроения РАН А. А. Шевченко, и составили: 2156,7 + 0,3 (PG-1), 1957,4 + 0,3 (PG2) и 2057,8 + 0,3 (PG-3).

Анализ аминокислотного состава каадого из трех протегри-нов показал, что все пептиды богаты цисте ином (21-25 mojl'îj , аргинином (27-33 мол%) и глицином (11,2-21,6 молХ), содержат тирозин и также гидрофобные остатки - валин, фенилаланин, лейцин и изолейцин.

Первичная структура протегринов была установлена (Рис.2) методом автоматической деградации пептидов по Здману на установке Porton Model 2090 в лаборатории проф. Лерера (США). PG-1 и PG-3 содержали по 18 аминокислотных остатков и были идентичны за'исключением четвертого остатка, который в молекуле PG-1 предстален аргинином, a PG-3 - глицином. PG-2 почти идентичен PG-1 , но содержит изолейцин в 14 положении вместо валина и короче на два аминокислотных остатка.

Сравнивая первичную структуру молекул протегринов с молекулами других известных ныне групп пептидов, необходимо отметить сходство их с тахиплезинами - полипептидами, обнаруженными в малых циголлазматических гранулах гемоцигов подковообразного краба и обладающими способностью ингибировать рост различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также инактивировать вирус везикулярного стоматита, вирус гриппа А и ВИЧ in vitro (Morimoto et al,1991). Молекулярная масса тахипле-зинов, как и протегринов, около 2 тыс Д, они тоже содержат 17-18 аминокислотных остатков, • включая 4 цистеина, связанных двумя внутримолекулярными дисульфидными мостиками (Muta et al, 1990). Однако расположение остатков цистеина в молекулах та-хиплезинов и протегринов различно, это свидетельствует о том, что, несмотря на определенное сходство, эти пептиды относятся к разным семействам. . k n mÏAi

HNP-1 г

PG-1 R

PG-2 R

PG-3 R

G G NP~3a d t к

g g r|l|

g g r!lI

Li

С У С R I PAC

CYCRRRFC CYCRRRFC CYCRRRFC

Ij|_C["Â]C R R R F С

j A ¡gj £

vi С ¡VIG

0c!v! ijclvje

p n s e

R YGTCIYQGRLVAFCC

F SGYCRVNGARYVRCCSRR

тр-1 к v с р и v с у 8 е i с у и й с н-инг

Рис. -2. Первичная структура протегринов в сравнении со структурами дефенсина человека Н№-1, дефенсина кролика ИР-За и тахиплезина 1..

- 12 -

При сопоставлении первичных структур протегринов и классических дефенсинов оказалось, что, несмотря на отличия Сдефенсины имеют в 1,5-2 раза большую молекулярную массу и содержат 6 остатков цистеина на молекулу) молекулы сравниваемых -полипептидов имеют идентичные участки- так в составе молекулы одного из дефенсинов кролика NP-За присутствует участок из 10 аминокислот (GICACRRRFC), почти идентичный области С GLCYCRRRFC) в PG-3, если не считать консервативной замены лейцина на изолейцина и аланина на тирозин.

Необходимо отметить, что NP-За (кортикостатин 1) имеет наиболее выраженную среди остальных дефенсинов "кортикостати-ческую активность" - способность ингибировать продукцию глюко-кортикоидов клетками надпочечников крыс, -стимулированную введением АКТГ in vitro (Zhu et al, 1988). Это свойство связано со способностью дефенсина NP-За конкурентно взаимодействовать с рецептором АКТГ, делая его недоступным для гормона. Как полагают канадские исследователи СZhu, Solomon, 1992) за связывание с рецептором ответственен участок молекулы дефенсина, включающий R R R, т.е.- именно тот участок, который присутствует и в протегринах.

Таким образом, исходя из анализа строения молекул протегринов, NP-За и тахиплезина можно предположить наличие у протегринов как высокой антимикробной активности, так и "корти-костатического" действия, которое было показано для дефенсинов в экспериментах in vitro.

Антимикробная активность протегринов

Антимикробную активность протегринов и дефенсинов против грамположительных (Listeria monocytogenes), грамотрицательных (Escherichia coli) бактерий и грибков (Candida albicans) ме- , тодом радиальной диффузии б агарозном геле изучали в сравнении с микробоцидными свойствами одного из наиболее активных дефенсинов - пептидом кролика NP-1 и значительно менее активным дефенсином человека HNP-1 . Оказалось, что PQ-1 u PG-3 поражают грамотрицагельную бактерию Е. coli ML-35p менее эффективно, чем NP-1, но более эффективно, чем HNP-1. PG-1 u PG-3 были также активны против грамположительной бактерии Listeria monocytogenes (штамм EGD), хотя и менее, чем NP-1, но в кон-

. - 13 - ■•

центрациях до 20 мнг/мл значительно превышая эффективность HNP-1. Оба протегрина продемонстрировали Еысокую противогриб-• ковую активность,- превосходящую (в низких концентрациях.) активность дефенсинов кролика и человека. Протегрин PG-3, хотя и оказывал действие на исследуемые микроорганизмы, но был менее эффективен, чем остальные прогегрины.

Таким образом, в результате проведенных исследований было _ показано, что протегрины обладают антимикробной активностью

■ широкого спектра действия.

Влияние дефенсинов и протегринов на стимулированную АКТГ продукцию кортикостерона

Важная роль взаимодействия нейроэндокринной и .иммунной

■ систем в формировании защитной реакции организма при стрессе является в настоящее время общепризнанной. Тем не менее, конкретные механизмы этого процесса остаются предметом новейших исследований.

Для выяснения вопроса о возможности влияния экзогенных дефенсинов на продукцию глюкокортикоидов в организме была проведена серия экспериментов по изучению действия полипептидов на глюкокортикоидные реакции у крыс, вызванные введением АКТГ. В этой серии использовались суммарные препараты дефенсинов кролика и крысы, полученные после■фракционирования на КМ-ц. АКТГ ("Sigma") вводили внутрибрюшинно в дозе 3 Ед/крысу. Препараты дефенсинов кролика и дефенсинов крысы инъецировали внутрибрюшинно за 30 минут до введения АКТГ или одновременно с гормоном и через 30 минут после инъекции АКТГ производили забор крови (Табл.1).

интдктнис

Контролями служили животные (1-я группа) и крысы, которым за полчаса до инъекции гормона вводили физиологический раствор (2-я группа). Установлено, что дефенсин кролика в дозе 1 мкг/г и 10 мкг/г существенно енижа^ АКТГ-индуцированную реакцию организма (7-я и 8-я группы), не оказывая, однако ингибирующего действия' в концентрации 50 нг/г (5-я группа). Дефенсин крысы даже в низкой дозе оказывал выраженное кортикостатическое действие.'

Таблица 1.

Влияние дефенсинов кролика и крысы на вызываемое АКТГ повышение уровня кортикостерона в крови у крыс

N 1 I Группа животных 1 j Конц-ия 1 КС.нг/мл 1 п |

1. |Интактные 1 | 50 ± ^ 12 |

2. I Введен физиол. раствор-? | 80 ± 6 6 I

3. |Введен АКТГ (3 ед/крысу) I 400 + 11 г» 1 • |

4. [Введен 1 мкг дефенсина кроли-

|ка(ДК)/г веса животного | 160 ± 5 б |

5. I Введено 50 нг ДК/г веса за

|30 мин до инъекции АКТГ I 450 + 51 6 I

6. | Введено ЮОнг ДК/г за 1

[30 мин до инъекции АКТГ | 320 ± 40 6 I

7. I Введен 1 мкг ДК/г за 1

|30 мин до инъекции АКТГ. | 120 ± 4 * 6 I

8. |Введено 10 мкг ДК/г за 1

I30 мин до АКТГ 1 1.25 ± is * 6 I

9. |Введено 50 нг дефенсина крысы/г | 128 ± 4 6 I

10. I Введено 50 нг дефенсина крысы/г 1

|за 30 мин до АКТГ I 197 + 12 * •у i

11. |Введен 1 мкг дефенсина кро-|лика/г одновременно с инъек- 1

|цией АКТГ 1 | 420 1 + 50 6 1 1

* - Р < 0,05 по сравнению с группой 3.

Обработано по t-критерию Огьюдента Можно предположить, что либо имеет значение видовой источник полипептидов, либо различия в их эффективности объясняются разным составом препаратов: суммарный препарат из 6 фракций дефенсина кролика имеет относительно низкое содержание фракций NP-За и Зв, которые в опытах in vitro демонстрировали наиболее высокую кортикостатическую активность (. Solomon et al,1993), в то время, как суммарный дефенсин крысы имеет более высокое содержание■ кортикостатически активного дефенсина Rat NP-1.

Использование индивидуальных фракций дефенсинов позволило

\ - 15 -

более однозначно трактовать результаты при сопоставлении эффектов различных полипептидов. В трех сериях экспериментов, поставленных на мышах в той две модели (инъекция исследуемого препарата, через 30 минут - инъекция АКТГ, еще через 30 минут - декапитация и забор крови) испытывали действие шести фракций дефенсинов кролика, трех дефенсинов человека и трех протегри-нов. АКТГ вводили внутрибрюшинно в дозе 0,4 ед/мышь lэта доза вызывала увеличение концентрации КС в крови до уровня, наблюдаемого в условиях ротационного стресса у мышей). Препараты полипептидов, растворенные в физиологическом растворе, вводили внутрибрюшинно в дозах 50 нг/г веса животного и 0,5 мкг/г. Из шести фракций дефенсинов кролика фракции NP-За и НР-Зв вызывали достоверное снижение уровня КС в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой (Табл.2).' Эти результаты согласуются с данными канадских исследователей, которые установили, что NP-За наиболее активен по способности ингибировать индуцированный АКТГ стероидогенез в культуре клегок надпочечников, за ним следовал NP-Зв, остальные дефенсины кролика NP-1, NP-2, NP-4 и NP-5 демонстрировали значительно меньшую активность.

Введение дефенсинов человека HNP-1, HNP-2 и HNP-3 не приводило к достоверным изменениям концентрации КС в крови у мышей. К сожалению мы не располагали необходимым количеством HNP-4, который в экспериментах in vitro (Singh et al, 1988) обладал кортикосгатической активностью (тогда как дефенсины HNP-l, HNP-2 и 3 оказались неактивными), так как его содержание в гранулах нейтрофилов крайне низкое - примерно' на 2 порядка ниже, чем HNP-1, 2 и 3.

В тех же условиях исследовали эффекты протегринов. Хотя способность протегринов оказывать аналогичное .действие в культуре клеток не изучалась, можно было предположить, что вследствие значительного сходства структуры молекул протегринов и наиболее активного "кортикостатического" дефенсина NP-За эти полипептиды также обнаружат более или менее выраженную кортикостатическую активность.

Действительно, введение протегрина PG 3, который по структуре наиболее близок к NP-За, достоверно снихало уровеннь КС, повышенный после иньекции АКТГ, тогда как другие протегри-ны в исследуемых концентрациях (50 нг/г и 0,5 мкг/г веса) оказались не эффективны (Табл. 3).

Таблица 2

Влияние индивидуальных фракций дефенсинов кролика на вызванное АКТГ повышение уровня кортикостерона в сыворотке у мышей

N .......... ' 1 Группа животных | 1 Доза вво- | Конц-ия КС в | 1

п/п 1 1 1 димого | препарата | сыворотке, | нг/мл I п 1

1. 1 Интактные | 1 23,7 + 11,4 | 12 |

г. Животные, которым вве-|

ден физиол. раствор | | 52,7 + 2,2 | 5 I

3. Животные, которым вве-| 1

ден лактоферрин (ЛФ) | 0,5 мкг/г | 31 £ 4,5 | 4 (

4. введен ЫР-2 | 0,5 мкг/г 1 42,5 + 3,2 | 5 I

5. Животные, которым вве-| 1

ден АКТГ (0,4 ед/мышь)| - | 73,2 + 9,6 | 5 I

6. Животные, которым вве-| ден физ. р-р за 30 мин! 1

до АКТГ | 1 Г? с: о 11,5 | 5 I

7. Животные, которым вве-| 1

ден ЫР-1 за 30 мин ! 50 нг/г | 73,4 + 13,5 ! 5 I

до АКТГ | 0. 5 мкг/г I 64.8 £ 10.3 | 5 I

3. —№-2 —| 50 нг/г | 73,6 + 14,6 | 5 I

1 0,5 мкг/г | 70 + 6,2 | 5 I

9. —"— МР-За | 50 нг/г | 60,6 + 9,1 I 5 !

1 0,5 мкг/г | 45,8 + 8,1* I 5 I

10. №-Зв —"— | •50 нг/г | 44,6 + 5,7* | 5 I

Г 0,5 мкг/г | 45,8. + ■6,4* | 5 !

11. ИР-4 —"— | 50 нг/г | 80,3 + 6,7 | 5 I

1 0,5 мкн/г 1 65,3 + 13,3 | 5 1

12. --"— ЫР-5 —| 50 нг/г | 64,4 + 1,9 | 5 I

0,5 мкг/г | 75,4 + 5,4 | 5 I

13. —ЛФ | 50 нг/г | 65,5 9,3 | 5 I

14. -"-протамин-сульфат-"-| | 0,5 мкг/г | ..........j 74,3 + 13 | .1 4 I 1

* - Р < 0,05 в сравнении с 6-й группой Обработано с помощью Ь-критерия Стьдента

Таблица 3.

Влияние индивидуальных фракций протегринов на вызванное АКТГ повышение уровня кортикостерона в сыворотке крови у мышей

Доза Конц-ция КО в N п/п Группы животных вводимого крови, нг/мл п

препарата

1, Интактные - 31 13 10

2. Животные, которым введен

физиологический раствор - '52 + 34 5

3.животные, которым введен

физ. р-р за 30 мин до - 171 + 16 6

введения АКТГ (0,4ед/мьшш)

4. Животные, которым введен 50 нг/г 183 + 47 5

Ра за 30 мин до АКТГ веса животн.

5. -----"----- 500 нг/г 161 £ 26 5

6. Животные, которым введен

Рб2 за 30 мин до АКТГ 50 нг/г 173 + 12 5

7. -----"----- 500 нг/г 157 + 29 5

8. Животные, которым введен

Раз за 30 мин до АКТГ 50 нг/г 132 + 19 5

9. -----"----- 500 нг/г 122 15* 5

10. Животные, которым введен

протамин-сульфат за 30

мин до АКТГ •500 нг/г 138 + 31 5

11. Животные, которым введен

БСА за 30 мин до АКТГ 500 нг/г .161 + 20 5

* - Р < 0,05 в сравнении с гр. 3,обработано по 1-крит. Стьюдента

Влияние дефенсинов на уровень кортикостерона в крови при стрессе

Исходя из полученных данных, правомерно было предположить, что введение дефенсинов окажет влияние на уровень глюко-кортикоидных гормонов, повышенный под воздействием стрессорных

агентов.

Исследования проводили на модели ротационного стресса у мышей. Длительность стресса составляла 10 минут при 78 об/мин. Дефенсин кролика (суммарный препарат, состоящий из 6 фракций дефенсинов) в дозах 20 нг/г и 2 мкг/г веса животного вводили внутрибрюшинно за 10 минут до стресса. Кровь для определения кортикостерона забирали декапитацией животных через 30, 60 и 120 минут после стрессорного воздействия. Показано, что инъекция дефенсинов вызывает существенное снижение стресс-индуциро-ванного повышения глшокортикоидных гормонов в сравнении с контрольной группой животных (животные, которым за 10 минут до стресса вводили физиологический раствор) (Табл.4).

Таблица 4.

Влияние дефенсинов на изменение концентрации кортикостерона в крови у мышей, подвергнутых ротационному стрессу

Концентрация кортикостерона, нг/мл

, Группы животных --:-

через ЗОмин через бОмин через 120мин после стресса

L Животные, которым за 290 + 27 316 + 41 295 + 46

10 мин до стресса п » = 6 п - 6 П =5

введен физ. раствор

II. Животные, которым за

10 мин до стресса вве- 164 + 18* Ol -3 + 32* 178 + 37

ден дефенсин кролика п = = 6 п = 5 п = 5

в дозе 20 нг/г

III. Животные, которым за

10 мин до стресса 52 + 26* 114. + 12* 168 ± s*

введен дефенсин кро- п = 6 п = 6 п = 6

лика в дозе 2 мкг/г

* - Р < 0,05 в сравнении с I группой

Обработано по Ь-критерию Стьюдента Ингибирующее действие полипепгидов было особенно четко выражено через 30 минут после окончания стрессорного воздействия, причем доза 20 мкг/г вызывала более значительный эф-

фект. Введение дефенсинов на более ранних сроках (за 1 час,, 10 мин.), а также через 30 минут после стресса оказалось не эффективным.

Таким образом, полученные данные 'позволяют говорить о наличие кортикоетагических свойств у испытанных препаратов дефенсинов в отношении глюкокортикоидных реакций, вызываемых стрессорными факторами или АКТГ, в организме.экспериментальных животных.

3. • Влияние дефенсинов на некоторые показатели иммунного ответа при стресс-опосредованной иммуносупрессии.

Глюкокортикоидные гормоны при стрессе оказывают существенное влияние на формирование защитных реакций организма, в том числе иммунного ответа. Известно, что гиперпродукция глю-кокортикоидов надпочечниками является одной из причин стресс-обусловленных дисфункций иммунной системы. В свете рассмотренных ранее фактов можно было предположить, что иммуносупрессив-ное действие некоторых видов стресса может быть отменено предварительным введением дефенсинов.

В экспериментах на мышах использовали модель комбинированного стресса (иммобилизация - 1 час при +4 градусах С и затем еще сутки при комнатной температуре), который практически полностью блокирует иммунный ответ (Табл.5).

Суммарный дефенсин кролика в дозе 2 и 20 мкг/г веса животного вводили внутрибрюшинно за 10 минут до начала стресса. Эритроциты барана вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 млрд клеток сразу после окончания стрессорного воздействия (т.е. через 1 сутки после введения дефенсина). На шестые сутки после иммунизации животных декапитировали и определяли количество анти-телообразующих клеток в селезенке (АОК) и титры антител в сыворотке крови. Контролями служили животные, которым в той же модели вместо дефенсина вводили физиологический раствор и иммунизированные мыши, не. испытавшие стрессорных воздействий (группы 1-я и 2-я). Показано/что предварительное введение полипептидов восстанавливает гуморальный иммунный ответ экспериментальных животных (5-я, 6-я группы). Необходимо отметить, что дефенсины в этих условиях действуют не только как корти-. костатины, но и способны, по видимому, модулировать иммунный

ответ (3-я, 4-я группы) по другим неизвестным механизмам действия.

Таблица 5.

Влияние дефенсинов на уровень титров антител в сыворотке крови и число антителообразующих клеток (А0К/106 кл) в селезенке при стресс-индуцированной шмуносупреесии

у мышей

Нестресс- Стрессй- Введение дефенсина кролика

сирован- рованные ---

ные имму- иммуни- 20мкг/г 2мкг/г 20мкг/г 2МКГ/Г

низирова-' зиров. Нестрессированные Отрессированные

нные мыши мыши иммунизированные мыши

I II III IV V VI

Титры АТ 2,4 0,15. 2,4 *о 2,7 *0 3,2 * 2,2 *

п 7 7 7 4 5

АОК 49 1,7 85,7 ао 67 *о 53 л 67 *

п 7 7 7 7 4 5

о - Р < 0,05 по сравнению с группой 1 * - Р < 0,05 по сравнению с группой II Обработано методом Вилконеона-Манна-Уитни Сходные результаты были получены в экспериментах на крысах, подвергавшихся холодовому воздействию (.20 мин при -20 градусах С). Дефенсин крыс-(суммарный препарат) вводили внут- . рибрюшинно за 10 минут до начала стресса или .через 10 минут после окончания стрессирующего воздействия в дозе 160 нг/г. Иммунизацию проводили эритроцитами барана в дозе 1 млрд клеток внутрибрюшинно через 10 минут после стресса или через 10 минут после введения. дефенсина. Через 1 час после окончания стрессорных воздействий производили забор крови для определения концентрации КС. Контролями служили группы' животных, которым вместо дефенсинов вводили физиологический раствор, прота-мин-сульфат, и нестрессированные крысы. Было установлено, что введение дефенсинов достоверно снижает уровень КС в сыворотке через 1 час после стресса, в то время как введение другого

-- 21 -

белкового препарата заметного эффекта не давало.

Оказывая действие на гормональные сдвиги у экспериментальных животных, дефенсины, как было показано, восстанавливали и иммунный ответ, сниженный в результате интенсивных стрессорных воздействий. У стресеированных крыс величины -1од? титров АТ в сыворотке крови падали в 2 раза, а количество АОК - примерно на 90%, в то время как у животных, которым вводили дефенсин, как до, так и сразу после стресса, эти показатели соответствовали значениям. Характерным для контрольных крыс.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что введение экзогенных дефенсинов экспериментальным животным снижает у них стресс- и АКТГ-индуцированную глюкокортикоидную реакцию. Эти факты согласуются с гипотетическими представлениями о кортикостатической функции дефенсинов (Ва1етап еЬ а1, 1989). В настоящее время не известен механизм действия экзогенных дефенсинов на ГГАКС а также роль эндогенных полипептидов в рассматриваемых процессах - это задачи последующих исследований. Можно, однако, предположить, что адаптивная значимость известного при стрессе феномена мобилизации нейтрофилов из костного мозга - нейтрофилеза не ограничивается превентивным усилением антимикробного барьера организма. В процессе выхода нейтрофилов в кровь и их последующей миграции в ткани имеет место постоянная секреция физиологически активных веществ гранулярного аппарата нейтрофилов, в том числе и дефенсинов (РапуиисЬ'еЬ а1, 1991). При этом последние уже в роли гуморальных факторов могли бы проявлять свои кортикостатические и иммунопротективные свойства, обеспечивая взаимодействие иммунной и нейроэндокринной систем, направленное на формирование защитных реакций при стрессе.

ВЫВОДЫ

1. Комплекс использованных в работе препаративных методов, включающих гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, позволяет получить суммарные и индивидуальные фракции дефенсинов человека, крысы и кролика.

2. Получены очищенные фракции трех полипептидов из лейкоцитов свиньи - протегринов, представляющих собой новую, не из-

вестную ранее группу пептидов, имеющих высокое содержание аргинина и цистеина и сочетающих в своей структуре черты корти-костатических дефенсинов и антимикробного пептида из гемоцитов подковообразного краба - тахиплезйна.

3. Протегрины проявляют микробоцидную активность против Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Candida albicans in vitro, сравнимую с активностью наиболее бактерицидных фракций дефенсинов кролика.

4. Введение суммарных фракций дефенсинов кролика и крысы, а также индивидуальных фракций дефенсинов кролика NP-3a, NP-3b и прогегрина PG-3 вызывает снижение на 20-60% АКТГ-индуцирован-ного подъёма уровня кортикостерона в сыворотке крови экспериментальных животных. '

5. Иньекция дефенсинов приводит к снижению в 1,5-2 раза уровня кортикостерона в крови, повышенного под действием стресса.

6. Введение дефенсинов предотвращает■ - индуцированное стрессом снижение показателей гуморального иммунного ответа (.числа ан-тителообразующих клеток в селезенке- и титров антител б крови крыс и мышей).

7. Таким образом, в результате проведенных исследованиий показаны кортикостатические и иммуномодулируюше эффекты экзогенных дефенсинов и протегринов, что позволяет предположить наличие стресс-лимитирующих свойств у этих полипептидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кокряков В. Е , Пигаревский В. Е. , Алешина Г. М. , Шамова 0. В. Синергическое антимикробное действие катионных белков при фагоцитозе. // Респ. сборник научн. трудов: "Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций." под ред. А. Е Маянского. - Горький. - 1989.-е: 98-103.

2. Пигаревский В. Е., Кокряков. В. Е, Мазинг Е А., Селиверстова В. Г., Данилова М. А., Шамова О. В. 'Биологическая роль катионных белков нейтрофильных гранулоцитов при воспалении. // В сб.: Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. Тез. докл. IV Всес. съезда патофизиологов. - Кишинев. - М. -1989. -Т. 2. - 0.451.

3. Кокряков В. Е , Мазинг Ю. А., Данилова II А., Алешина Г. М. , Новикова Е С. , Шамова 0. В. ,Кузьмин Е О. Катионные белки нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении. //В кн.: Проблемы медицины и биологии сегодня и завтра. Тез. конф. .посвященной 100-летию НИЙЭМ, JL 1990. - с. 59-61.

- 23 -

4. Лесникова М. П. , Шхинек Э. К. , Невейкина О. К. , ШаыоЕа О. В. Низкомолекулярный катионный белок нейтрофилов (НКЕ) как ингибитор стресс- и АКТГ-индуцированного повышения глюкокортикоид-ных гормонов. //В сб.: Взаимодействие нервной и иммунной систем. -Тез. докл. Всес. симп. , Оренбург, 1990, с. 52.

5. Шамова 0. В. .Лесникова М. П. , Кокряков В. Н. Влияние дефе-нсинов на стресс-индуцированную иммуносупрессию. //В кн.: Механизмы физиологических функций. Тез. докл. конф. молодых ученых и специалистов, Санкт-Петербург? 1992. - С. 70.

6. Lesnikova М. P. .Kokryakov V.N. .Shamova О. V. Stress-protective activity of defensin.//Abstracts: 1st Baltic Sea Conf. on Psyhosomatics and Psyhotherapy, Germany (Kiel),1992, p. 132.

7. Шамова О. В. , Лесникова M. IL , Кокряков В. Н. , Шхинек Э. К. , Корнева Е. А. Действие дефенсинов на " уровень кортикостерона в крови и иммунный ответ при стрессе.// Вюлл. экспер. биол. и мед. - 1993.- Т. 115, N6.- С. 646-649.

8. Kokryakov V. N. .Harwig S. S. L. .Panyutich E. A. .Shevchenko ' A. A. , Alechina G. M. , Shamova 0. V. , Korneva H. A. , Lehrer R. I.

Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins and tachyplesins. //FEBS Lett.-1993. - Vol.327, N2.- P. 231-236.

9. Shamova 0. V. , Lesnikova M. P. , Kokryakov V.N. , Aleshina G. M. The effect' of defensins application on the stress-induced immunosuppression..//Abstracts: 2nd Intern. Congress ISN1M.-1993, Italy (Paestum), p. 153.

10. Mirgorodskaya 0. A. , Shevchenko A. A. , Kamal M. Abdalla, Chernuschevich I.V., Egorov Т., Musoliamov A. X. , Kokryakov V.N., Shamova 0. V. Primary structure of three cationic peptides from porcine neutrophils. Sequence determination by combined usage of elektrospray ionization mass spektrometry and Edman degradation// FEBS Lett. -1993. -Vol. 330, N 3, p. 339-342.

11. Шамова О. В. , Орлов Д. С. , Лесникова М. П., Алешина Г. М. Влияние дефенсина на некоторые иммунологические показатели при иммуносупрессии, индуцированной Холодовым стрессом//В сб.: Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний. Тез.

конф., посвящ. 100-летию со дня . ровд. акад. И. -Р. Петрова, Санкт-Петербург, 1993, с. 176.

12. Orlov D. S. , Shamova 0. V. , Lesnikova М. P. , Shanin

т-

S. N. , Kokryakov V.N., Rybakina £. G. Stress-protective effects of IL-Ib and defensins// Abstract: 2nd Int. Cytokine Conf. .Canada, Cytokines, 1994, Vol. 6, N5, p.561.

13. Korneva E. A. , Kokryakov V.N. , Rybakina E.G., Fomicheva E.E. .Sharoova 0. V. .Shanin S.N. Stress-induced disfunction of the immune system and their rehabilitation/ZAbstr.: 1st Int. Congr. ofImmunorehabilitation,1994,Nl Supplement,p. 1S1

14. Шамова О. В. , Лесникова М. П. , Кокряков В. Е Роль дефен-синов в формировании иммунного ответа при стрессе/ /Тез. конф. мол. ученых России, поев. 50-летию АМН, Москва, 1994, с.156.