Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химическая характеристика и функциональные свойства дефенсинов и протегринов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химическая характеристика и функциональные свойства дефенсинов и протегринов"

Р г Б ОД РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

- 2 ЯНН 1995

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

на правах рукописи

ШАМОВА Ольга Валерьевна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ДЕФЕНСИНОВ И ПРОТЕГРИНОВ

03.00.04 - биохимия

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патологической физиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (директор - академик РАМН Б.И.Ткаченко).

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор Е.А.Корнева, старший научный сотрудник, к.б.н. В.Н.Кокряков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.НЛызлова, доктор медицинских наук В.Н.Александров

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова РАН, г.Санкт-Петербург.

Защита состоится я и ь а рй 19951 г. в "И " часов на

заседании специализированного . совета К 001.23.01 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад.Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан " " г*** 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О.Г.Куликова

Актуальность проблемы. В последние годы все большее внимание уделяется изучению неспецифических факторов защиты организма от различных повреждающих воздействий. Одним из ключевых компонентов системы неспецифической резистентности являются нейтрофильные гранулоциты - высокодифференцированные клетки, специализированные на осуществления защитных реакций путем фагоцитоза или выделения антимикробных веществ е среду (Пига-ревский,1973; Klebanoff, Clark,197S). Сочетание готоеого эф-фекторного потенциала со способностью к быстрой его реализации

- свойство, которое делает нейтрофил одним из участников ранней ответной реакции на любые изменения в тканях организма (Маянский А., Маянский Д. ,1989). В лизосомальных гранулах нейтрофилов содержится набор биологически' активных молекул -миелопероксидаза, лизоцим, нейтрально-Щелочные протеиназы, кислые гидролазы, неферментные катионные белки. Одним из компонентов гранулярного аппарата нейтрофилов являются дефенсины

- группа гомологичных катионных полипептидов, открытых в 1963 году (Zeya, Spitznagel,1963) и детально изученных позднее другими американскими учеными (Ganz et al.,1985; Lehrer et al. ,1993), а в настоящее время привлекающих внимание многих исследователей благодаря обнаружению у этих пептидов спектра функциональных- свойств. Дефенсины обладают высокой антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибков и некоторых оболочечных вирусов, а также имеют ряд свойств, проявляющихся при взаимодействии их с различными типами клеток организма - способны вызывать хемотаксис макрофагов (Territo et al. ,1989), дегрануляцию тучных клеток (Yamashita, Saito,1989), увеличивать проницаемость сосудов СRanadive,Cochrane, 1963) и стимулировать их рост (Кудряшов и др, 1989), воздействовать наСа++ каналы L-типа на мембранах энтероцитов (MacLeod et al. ,1991), а также ингибировать индуцированный АКТГ стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников крыс in vitro (Zhu et al. ,1988). Основной функцией дефенсинов большинство ученых считает их универсальную антимикробную активность, за которую их назвали "антибиотиками животного происхождения" (Кокряков,1988, Lehrer et al. ,1991). Дефенсиноподобные белки обнаружены в гемолимфе насекомых (Lambert et al, 1989).Это свидетельствует о том, что такие соединения могут являться одними из древнейших факторов защиты

организма от инфекционных агентов. Поэтому поиск и сравнитель- ' но-биохимический анализ дефенсинов и подобных им пептидов в фагоцитах животных разных видов, классов и даже типов может дать информацию, существенную для понимания путей эволюции факторов неспецифической резистентности.

Особого внимания заслуживает и установленная пока только in vitro способность дефенсинов ингибировать стимулированную АКТГ продукцию кортикостероидов клетками надпочечников крыс . (Zhu et al. ,1987,1988). Авторы назвали это сбойстбо пептидов кортикостатической активностью и предположили, что дефенсины могут, быть включены в число соединений, участвующих во взаимодействиях между гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и иммунной системами (Bateman et al, 1989J. Однако на уровне целостного организма способность эндогенных или экзогенных дефенсинов влиять на стероидогенез не показана, . нет данных и об их эффектах в условиях активации глюкокортикоидной реакции при стрессе, хотя эти данные могли бы оказаться немаловажными для объяснения известного феномена нейтрофилеза, наблюдаемого при стрессорных воздействиях,- биолцгический смысл которого до сих пор полностью не ясен.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании физико-химических и функциональных свойств катионных полипептидов из лейкоцитов свиньи ( протегринов ) и дефенсинов из нейтрофильных гранулоцитов кролика, крысы и человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: •

1. Получить высокоочищенные индивидуальные фракции полипептидов из лейкоцитов свиньи (протегринов; и дефенсинов человека, кролика и крысы.

2. Исследовать физико-химические свойства протегринов (.хрома-тографические и электрофоретические свойства, молекулярную массу и структурные особенности ).

3. Провести сравнительный анализ антимикробной активности протегринов и дефенсинов человека и кролика.

4. Изучить влияние суммарных препаратов и индивидуальных фракций дефенсинов и протегринов на стимулированное введением АКТГ повышение уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных.

5. Исследовать влияние экзогенных дефенсинов на характер глюкокортикоидной реакции при стрессе.

6. Изучить эффекты введения дефенсинов на показатели г/морального иммунного ответа при стресс-индуцированной иммуносуп-рессии.

Научная новизна. Открыт новый класс ранее неизвестных полипептидов из лейкоцитов свиньи - протегринов (РЭ-1, РЗ-2 и

• ге-З), осуществлен анализ ряда их физико-химических свойств (изучены хроматографические Ти электрофоретические характеристики, ' определен молекулярный вес, аминокислотный состав). Установлено, что эти полепептиды имеют не только ряд структурных особенностей, сближающих их с дефенсинами, но и по-видимому, являются их функциональными аналогами' - показана их еысо-

• кая антимикробная активность, а также наличие кортикостати-ческих свойств у протегрина Рб-З/

Впервые в условиях целостного организма установлено, что экзогенные дефенсины и протегрины способны снижать повышенный после инъекции АКТГ уровень кортикостерона в крови экспериментальных животных.

Впервые показано, что предварительное введение дефенсинов животным предотвращает ингйбирующий эффект стрессорных воздействий на некоторые показатели гуморального иммунного ответа.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты сравнительного анализа структурных и функциональных свойств протегринов и дефенсинов могут внести свой вклад в развитие ■ представлений о путях эволюции молекулярных механизмов неспецифической резистентности.

Сочетание высокой микробоцидной активности и относительно простой структуры, позволяющей производить химический синтез протегринов, открывает перспективы создания новых антимикробных лекарственных препаратов на основе этих соединений.

Установленная способность экзогенных дефенсинов влиять на уровень кортикостерона в крови экспериментальных животных в условиях активации глюкокортикоидной функции надпочечников свидетельствует в пользу гипотетического представления о де-фенсинах как об участниках взаимодействия между нейроэндок-ринной и иммунной системами, а также дает основание рассматривать дефенсины и протегрины как потенциальные стресс-лимитирую-щие агенты.

Данные об отмене дефенсинами стресс-индуцированной имму-носупрессии могли бы оказаться полезными при'разработке препаратов для клинического использования в случаях, нарушения деятельности иммунной системы, вызванных тяжелыми стрессорными воздействиями.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Использованные препаративные методы выделения дефенси-нов и протегринов из лейкоцитарной массы позволяют получить высокоочишенные индивидуальное фракции этих полипептидов.

2. Из лейкоцитов свиньи получены три гомологичных полипептида с молекулярной массой около 2 тыс. Д, получивших название протегрины, представляющих собой новую группу полипептидов, сочетающих в своей структуре черты дёфенсинов (значительное содержание основных аминокислот, в том числе аргинина, и, следовательно, высокий положительный заряд, а также наличие идентичных участков в молекулах дефенсинов и протегринов; и антимикробного полипептида из гемоцитов подковообразного краба - тахиплезина.

3. Протегрины проявляют микробоцидную активность против грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибков, сравнимую с активностью дефенсинов кролика.

4. Экзогенные дефенсины и протегрины снижают' повышенный после введения АКТГ или стрессорного воздействия уровень кор-тикостерона в крови у крыс и мышей.

5. Введение дефенсинов предотвращает стресс-индуцирован-ную иммуносупрессию у экспериментальных животных.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании научной-конференции-' Отдела общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского ордена Трудового Красного Знамени института экспериментальной медицины РАМН (г. Санкт-Петербург) 3 ноября 1994г.

Основные положения диссертации были представлены на Санкт-Петербургской конференции молодых ученых и специалистов "Механизмы физиологических функций",1992 г. , 2 International Gongress ISNIM, Paestum (Italy), 1993 г., конференции " Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний", Санкт-Петербург, 1993, конференция молодых ученых России, посвященной 50-летию АМН, Москва, 1994.

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на IUо страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы ' (шесть глав;, материалов и методов, S глав собственных исследований, общего заключения, выводов. В диссертации 9 таблиц и 24 рисунка. Прилагаемый список литературы содержит 2Ь5 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

)

Препараты дефенсинов человека, крысы и кролика получаля из лейкоцитарной фракции крови (дефенсины человека.) или из нейтрофилов перитонеального экссудата (дефенсины крысы и кролика; с использованием схемы очистки, предложенной (.Selsted et al,1984,-1985), а также с помощью набора процедур, включающего экстракцию лейкоцитарной массы 0,3% раствором цетилтриметилам-монийбромида, последующую ионообменную хроматографию на колонке с карбоксиметил-целлюлозой (СМ-32, "Whatman", Англия;, забуференной 0,02 M Иа-фосфатным буфером, содержащим 0,1 M NaCl, проводя элюцию белков тем же буфером с линейным градиентом NaCl от 0,1 до 1.2 M. Индивидуальные фракции дефенсинов получали с помощью обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на микроколоночном жидкостном хроматографе "Милихром" на колонке (2 х 62 мм; с "Нуклеосилом С-18" (Macherey-Nagel, ФРГ; с использованием градиента концентрации ацетонитрила от 10 до 40% в 0,1% трифторуксусной кислоте! ТФУ).

Протегрины получали из лейкоцитарной фракции крови свиньи, проводя экстракцию лейкоцитарной массы в 10% уксусной кислоте, затем с помощью диализа (диализные трубки "Sigma", 250-9U) отделяли низкомолекулярную фракцию, которую далее наносили на колонку с акрилексом Р-10 ("Reanal"), забуференную 5% уксусной кислотой. Фракции, содержащие протегрины (по данным электрофоретического анализа в кислой среде;, объединяли, лиофилизировали и разделяли с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке с "Нуклеосилом С-18" с использованием градиента ацетонитрила от 15 до 35% в 0,1% ТФУ.

Для оценки чистоты полученных фракций использовали электрофорез в кислой буферной системе (Panyim, Chalkley, 1969) и электрофорез в присутствии додецил-сульфата натрия (Thomas, Homberg, 1977).

Молекулярную массу протегринов определяли методом Электроспрей масс-спектрометрии (Dodonöv et al, 1992) в ходе совместной работа' с сотрудниками Института Аналитического приборостроения РАЕ Первичная структура очищенных препаратов про-' тегринов была определена методом автоматической деградации пептидов по Эдману на установке Рогton Model 2090 в лаборатории проф. Лерера (США, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес).

Антимикробную активности протегринов исследовали с помощью метода радиальной диффузии в агарозном геле (.Lehrer et al,1991). •

Исследование-кортикостатических и иммуномодулирующих эффектов дефенсинов и протегринов проводилось на 620 крысах-самцах породы "Вистар" весом 180-200 г и 1050 мышах линии СБА весом 18-20 г из питомника "Рапполово". Животных содержали в условиях вивария на стандартной диете.

Уровень кортикостерона в сыворотке крови определяли пря-. мым радиоиммунологическим методом (Гончаров и др., 1977) Иммунизацию производили эритроцитами барана в дозе 1 млрд клеток (крысам) и 0,5 млрд клеток (мышам)" в/бр. Животных забивали быстрой декапитацией при помощи гильотины. Забор крови для оценки величины гуморального иммунного ответа ' проводили на шестой день после иммунизации. Уровень антител в-сыворотке крови определяли методом прямой гемагглютинации в микротитраторе "Такачи", количество антителообразующих клеток в селезенке -методом локального гемолиза в геле агарозы (Erne,Nordin,1963).

Данные экспериментов обрабатывали с помощью методов вариационной статистики. Достоверность различий между группами (Р) оценивали по t-критерию Стьюдента (ПлохинскийдэзО) или по U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Гублер, Генкин,1973). Во всех расчетах за достоверный принимали 95% уровень значимости (р<0,05). -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и очистка дефенсинов человека,, крысы и кролика

В результате очистки были получены индивидуальные фракции дефенсинов человека, кролика и крысы. Идентификацию всех поли-

пептидов осуществляли как электрофоретически, так и масс-спектрометрически. Гомогенность полученных препаратов оценивали с помощью электрофореза в ПААГ в кислой буферной системе. Для всех очищенных препаратов дефенсинов при электрофорезе в кислой среде выявлялась- только одна белковая фракция . Общий выход дефенсинов (сумма всех фракций) на 1 млрд клеток составил 4-6 мг для дефенсинов кролика, 1-1,5 мг для крысы я 2-3 мг для человека.

Выделение и очистка протегринов

'в поисках гомологов дефенсинов у животных разных видов мы обратились к изучению ранее не исследованного в этом направлении обьекта - лейкоцитов свиньи. Электрофоретический анализ препарата, полученного в результате экстракции лейкоцитарной массы в 10% уксусной кислоте, выявил присутствие трех низкомолекулярных компонентов с электрофоретической подвижностью, близкой к подвижности наиболее катионных дефенсинов кролика (впоследствии по предложению проф. Лерера они были названы протегринами (Рб-1, Р6-2, Р6-3) (от латинского рго-Ьего - защищать, покрывать;). Эти три пептида были очищены с помощью гель-фильтрации на колонке с акрилексом Р-10, забуференной 5% уксусной кислотой, и последующей высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с•"Нуклеосилом С-18" с использованием градиента концентрации ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте от 15 до 35%. Идентификацию отдельных фракций протегринов осуществляли масс-спектрометрически и электрофоретически (Рис.1).

В результате очистки были получены в гомогенном состоянии индивидуальные фракции протегринов Рб-1, РО-2, РБ-З, выход которых из 1 млрд лейкоцитов составил 0,1-0,2 мг (сумма трех пептидов).

Таким образом, нами были получены очищенные индивидуальные фракции дефенсинов кролика, крысы, человека и ранее не описанных пептидов из лейкоцитов свиньи - протегринов. Отсутствие белковых примесей подтверждалось данными элёктрофорети-ческого анализа и ВЭЖХ каждой фракции .

2? & &

1 'т л<

л» ШЬ

X»

£ & — - ^ £

1 2. 345 678

Рис.1. Электрофорез в ПААГ в кислой буферной системе С по .мет. РапуШ,Са1к1еу, 1963): 1 -кислотный.экстракт из лейкоцитов свиньи; 2 - низкомолекулярная фракция, полученная после отделения высокомолекулярных компонентов с помощью диализа; 3 -суммарный препарат протегринов, полученный после фракционирования на колонке с акрилексом Р-10; 4, 5, 6 - индивидуальные фракции протегринов после разделения с помощью ОФ ВЭЖХ С 4 -Ра-1, 5 - Р6-2, б - Рв-З ); 7 - тахиплезин 1; 3 - тотальный де-фенсин кролика.

Некоторые биохимические характеристики протегринов

Результаты электрофоретического анализа протегринов в кислой среде свидетельствали о том, что эти полипептиды обладают высоким положительным зарядом, сходным с зарядом наиболее катионных фракций дефенсинов кролика . Нумерация протегринов соответствует их электрофоретической подвижности: Рв-1 имеет наибольшую подвижность по направлению, к катоду, за ним следует РБ-2 и далее РБ-З. Молекулярную массу протегринов приблизительно оценивали с помощью электрофореза в присутствии ДС-Иа , установили, что она ниже, чем у дефенсинов и близка к таковой тахиплезина (2тыс. Д). Точные молекулярные массы были определены с помощью Электроспрей масс-спектрометрии, выполненной в ходе совместной работы с сотрудником Института Аналитического

приборостроения РАН А. А. Шевченко, и составили: 2156,'.' + 0,3 (PG-I), 1957,4 +0,3 (PQ2) И 2057,8 +0,3 (PG-3).

Анализ аминокислотного состава каждого из трех протегри-нов показал, что все пептиды богаты цистеином (21-25 мол%),. аргинином (27-33 мол%) и глицином (11,2-21,6 мол%), содержат тирозин и также гидрофобные остатки - валин, фенилаланин, лейцин и изолейцин.

Первичная структура протегринов была установлена ( Рис. 2) методом автоматической деградации пептидов по Эдману на установке Porton Model 2090 в лаборатории проф. Лерера (США). PG-1 и PG-3 содержали по 18 аминокислотных остатков и были идентичны за'исключением четвертого остатка, который в молекуле PG-1 предстален аргинином, a PG-3 - глицином. PG-2 почти идентичен PG-1 , но содержит изолейцин в 14 положении вместо валина и короче на два аминокислотных остатка.

Сравнивая первичную структуру молекул протегринов с молекулами других известных ныне групп пептидов, необходимо отметить сходство их с тахиплезинами - полипептидами, обнаруженными в малых цитоплазматических гранулах гемоцитов подковообразного краба и обладающими способностью ингибировать рост различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также инактивировать вирус везикулярного стоматита, вирус гриппа А и ВИЧ in vitro (Morimoto et al,1991).Молекулярная масса тахипле-зинов, как и протегринов, около 2 тыс Д, они тоже содержат 17-18 аминокислотных остатков, ■ включая 4 цистеина, связанных двумя внутримолекулярными дисульфидными мостиками (Muta et al, 1990). Однако расположение остатков цистеина в молекулах та-хиплезинов и протегринов различно, это свидетельствует о том, что, несмотря на определенное сходство, эти пептиды относятся к разным семействам.

£] A ÎGI'E

HNP-1

PG-1

PG-2

PG-3

NP-3a

TP-1

k n m A|

G G RlL G G RjL|

g g

dtk

С y С r| I p;a!|c cycrrrfc cycrrrfc cycrrrfc cfâic r r r f с

lvi civig 0C|v| п5 с !ю g

P N S E

r ygtciyqgrlwafcc

f sgycrvngaryvrccsrr

К V С Р И V С У е й 1 С У й й С R-NH2 Рис. 2. Первичная структура протегринов в сравнении со структурами дефенсина человека НМР-1, дефенсина кролика мр-За и тахиплезина 1..

- 12 -

При сопоставлении первичных структур протегринов и классических дефенсинов оказалось, что, несмотря на отличия Сдефенсины имеют в 1,5-2 раза большую молекулярную массу и содержат б остатков цистеина на молекулу; молекулы сравниваемых полипептидов имеют идентичные участки - так в составе молекулы одного из дефенсинов кролика NP-За присутствует участок из 10 аминокислот (GICACRRRFC), почти идентичный области (GLCYCRRRFC) в PG-3, если не считать консервативной замены лейцина на изолейцина и аланина на тирозин.

Необходимо отметить, что NP-За (кортикостатин 1) имеет наиболее выраженную среди остальных дефенсинов "кортикостати-ческуто активность" - способность ингибировать продукцию глюко-кортикоидов клетками надпочечников крыс, -стимулированную введением АКТГ in vitro (Zhu et al, 1988). Это свойство связано со способностью дефенсина NP-За конкурентно взаимодействовать с рецептором АКТГ, делая его недоступным для гормона. Как полагают канадские исследователи (Zhu, Solomon, 1992) за связывание с рецептором ответственен участок молекулы дефенсина, включающий R R R, т. е. именно тот участок, который присутствует и в протегринах.

Таким образом, исходя из анализа строения молекул протегринов, NP-За и тахиплезина можно предположить наличие у протегринов как высокой антимикробной активности, так и "корти-костатического" действия, которое было показано для дефенсинов в экспериментах in vitro.

Антимикробная активность протегринов

Антимикробную активность протегринов и дефенсинов против грамположительных (Listeria monocytogenes), грамотрицательных (Escherichia coli) бактерий и грибков (Candida albicans) методом радиальной диффузии в агарозном геле изучали в сравнении с микробоцидными свойствами одного из наиболее активных дефенсинов - пептидом кролика NP-1 и значительно менее активным дефенсином человека HNP-1 . Оказалось, что PG-1 u PG-3 поражают грамотрицательную бактерию Е. coli ML-35p менее эффективно, чем NP-1, но более эффективно, чем HNP-1. PG-1 u PG-3 были также активны против грамположительной бактерии Listeria monocytogenes (штамм EGD), хотя и менее, чем NP-1, но в кон-

. - 13 - ••

центрациях до 20 нг/мл значительно. превышая эффективность HNP-1. Оба протегрина продемонстрировали высокую противогриб-

■ ковую активность, превосходящую (в низких концентрациях.) активность дефенсинов кролика и человека. Протегрин PG-3, хотя и оказывал действие на исследуемые микроорганизмы, но был менее эффективен, чем остальные протегрины.

Таким образом, в результате проведенных исследований было _ показано, что протегрины обладают антимикробной активностью

■ широкого спектра действия. >

Влияние дефенсинов и протегринов на стимулированную АКТГ продукцию кортикостерона

Важная роль взаимодействия нейроэндокринной и .иммунной

• систем в формировании защитной реакции организма при стрессе является в настоящее время общепризнанной. Тем не менее, конкретные механизмы этого процесса остаются предметом новейших исследований.

Для выяснения вопроса о возможности влияния экзогенных дефенсинов на продукцию глюкокортикоидов в организме была про-

• ведена серия экспериментов по изучению действия полипептидов на глюкокортикоидные реакции у крыс, вызванные введением АКТГ. В этой серии использовались суммарные препараты дефенсинов кролика и крысы, полученные после•фракционирования на КМ-ц. АКТГ ("Sigma") вводили внутрибрюшинно в дозе 3 Ед/крысу. Препараты дефенсинов кролика и дефенсинов крысы инъецировали

■внутрибрюшинно за 30 минут до введения АКТГ или одновременно с гормоном и через 30 минут после иньекции АКТГ производили забор крови (Табл.1).

Контролями служили животные (1-я группа) и крысы, которым за полчаса до инъекции гормона вводили физиологический раствор (2-я группа). Установлено, что дефенсин кролика в дозе 1 мкг/г и 10 мкг/г существенно снижа^ АКТГ-индуцированную реакцию организма (7-я и 8-я группы), не оказывая, однако ингибирующего действия' в концентрации 50 нг/г (5-я группа). Дефенсин крысы даже в низкой дозе оказывал выраженное кортикостатическое действие.-

Таблица 1.

Влияние дефенсинов кролика и крысы на'вызываемое АКТГ повышение уровня кортикостерона в крови у крыс

N 1 | Группа животных 1 -f Конц-ия КС, нг/мл 1 1 1 1

1. |Интактные 1 1 50 + 4 12 1

2. |Введен физиол. раствор- 1 80 + б 6 1

3. |Введен АКТГ (3 ед/крысу) 1 400 + 11 7 1

4. I Введен 1 мкг дефенсина кроли-

|ка(ДК)/г веса животного 1 160 + 5 6 1

5. |Введено 50 нг ДК/г веса за

|30 мин до инъекции АКТГ 1 450 + 51 6 1

6. | Введено ЮОнг ДК/г за 1

130 мин до инъекции АКТГ 1 320 40 6 1

7. |Введен 1 мкг ДК/г за 1

130 мин до инъекции АКТГ. 1 120 + 4 * 6 1

8. |Введено 10 мкг ДК/г за 1

|30 мин до АКТГ 1 125 + 13 * 6 1

9. |Введено 50 нг дефенсина крысы/г 1 128 £ 4 6 1

10. |Введено 50 нг дефенсина крысы/г 1

|за 30 мин до АКТГ 1 197 + 12 * •7 I

11. |Введен 1 мкг дефенсина кро-|лика/г одновременно с инъек- 1 1

цией АКТГ I 1 420 1 + 50 1 6 1 1

* - Р < 0,05 по сравнению с группой 3.

Обработано по t-критерию Стьюдента

Можно предположить, что либо имеет значение видовой источник полипептидов, либо различия в их эффективности объясняются разным составом препаратов: суммарный препарат из 6 фракций дефенсина кролика имеет относительно низкое содержание фракций NP-За и Зв, которые в опытах in vitro демонстрировали наиболее высокую кортикостатическую активность (Solomon et al,l993), в то время, как суммарный дефенсин крысы имеет более высокое содержание- кортикостатически активного дефенсина Rat NP-1.

Использование индивидуальных фракций дефенсинов позволило

- - 15 -

более однозначно трактовать результаты при сопоставлении эффектов различных полипептидов. В трех сериях экспериментов, поставленных на мышах в той же модели (инъекция исследуемого препарата, через 30 минут - инъекция АКТГ, еще через 30 минут - декапитация и забор крови) испытывали действие шести фракций дефенсинов кролика, трех дефенсинов человека и трех протегри-нов. АКТГ вводили внутрибрюшинно в дозе 0,4 ед/мышь ита доза вызывала увеличение концентрации КС в крови до уровня, наблюдаемого в условиях ротационного стресса у мышей.). Препараты полипептидов, растворенные в физиологическом растворе, вводили внутрибрюшинно в дозах 50 нг/г веса животного и 0,5 мкг/г. Из шести фракций дефенсинов кролика фракции NP-За и NP-Зв вызывали достоверное снижение уровня КС в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой (Табл. 2). Эти результаты согласуются с данными канадских исследователей, которые установили, что NP-За наиболее активен по способности ингибировать индуцированный АКТГ стероидогенез в культуре клеток надпочечников, за ним следовал NP-Зв, остальные дефенсины кролика NP-1, NP-2, NP-4 и NP-5 демонстрировали значительно меньшую активность.

Введение дефенсинов человека HNP-1, HNP-2 и HNP-3 не приводило к достоверным изменениям концентрации КС в крови у мышей. К сожалению мы не располагали необходимым количеством HNP-4, который в экспериментах in vitro (Singh et al, 1988) обладал кортикостатической активностью (тогда как дефенсины HNP-1, HNP-2 и 3 оказались неактивными), так как его содержание в гранулах нейтрофилов крайне низкое - примерно на 2 порядка ниже, чем HNP-1, 2 и 3.

В тех же условиях исследовали эффекты протегринов. Хотя способность протегринов оказывать аналогичное действие в культуре клеток не изучалась, можно было предположить, что вследствие значительного сходства структуры молекул протегринов и наиболее активного "кортикостатического" дефенсина NP-За эти полипептиды также обнаружат более или менее выраженную кортикостатическую активность.

Действительно, введение протегрина PG 3, который по структуре наиболее близок к NP-За, достоверно снижало уровеннь КС, повышенный после иньекции АКТГ, тогда как другие протегри-ны в исследуемых концентрациях (50 нг/г и 0,5 мкг/г веса) оказались не эффективны (Табл. 3).

Таблица 2

Влияние индивидуальных фракций дефенашов кролика на вызванное АКТГ повышение уровня кортикостерона в сыворотке у мышей

N 1 Группа животных | Доза вво- Конц-ия 1 КС в | 1

п/п 1 1 димого препарата сыворотке, | нг/мл | п I

1. 1 Интактные | - 23,7 + 11,4 | 12 |

2. Животные, которым вве-|

ден физиол. раствор | - 52,7 + 2,2 | 5 I

3. Животные, которым вве-|

ден лактоферрин (ЛФ) | 0,5 мкг/г 31 + 4,5 | 4 I

4. -"- введен ИР-2 | 0,5 мкг/г 42,5 + О О 1 О | «V | 5 I

5. Животные, которым вве-|

ден АКТГ (0,4 ед/мышь)| - 73,2 + 9,6 | 5 I

6. Животные, которым Еве-| ден физ. р-р за 30 мин|

до АКТГ | - 'У с: -Э | и, <-> + 11,5 | 5 I

7. Животные, которым вве-|

ден ИР-1 за 30 мин | 50 НГ/Г 73,4 + 13,5 | 5 I

до АКТГ | 0. 5 мкг/г 64.8 + 10.8 | 5 I

8. 50 нг/г 73,6 + 14,6 | 5 I

1 0,5 мкг/г 70 + 6,2 | 5 I

9. —"— ЫР-За —"— | 50 нг/г 60,6 + 9,1 1 5 I

1 0,5 мкг/г 45,8 + 8,1* | 5 I

10. —"— НР-Зв —| ■50 нг/г 44,6 + 5,7* | 5 I

1 0,5 мкг/г 45,8. + 6,4* | 5 I

11. —••— ЫР-4 —| 50 нг/г 80,3 + 6,7 | 5 I

1 0,5 мкн/г 65,3 + 13,8 | 5" !

12. —ЫР-5 —"— | 50 нг/г 64,4 + 1,9 1 5 I

1 0,5 мкг/г 75,4 + 5,4 | 5 I

13. —"— ЛФ --"— | 50 нг/г 65,5 + 9,3 I 5 I

14. -"-протамин-сульфат-"-| 1 0,5 мкг/г , 1 74,3 + -1 о 1 1<_. | 1 4 I 1

* - Р < 0,05 в сравнении с 6-й группой Обработано с помощью ^критерия Стьдента

Таблица 3.

Влияние индивидуальных фракций протегринов на вызванное АКТГ повышение уровня кортикостерона в сыворотке крови у мышей

Доза Конц-ция КС в N п/п Группы животных вводимого крови, нг/мл п

препарата

1. Интактные - 31 + 13 10

2. Животные, которым введен

физиологический раствор - 52 + 34 5

3. Животные, которым введен

физ. р-р за 30 мин до - 171 + 16 6

введения АКТГ (0,4ед/мышь)

4. Животные, которым введен 50 нг/г 183 + 47 5

РВ1 за 30 мин до АКТГ веса животн.

5. -----"----- 500 нг/г 161 + 26 5

6. Животные, которым введен

Р62 за 30 мин до АКТГ 50 нг/г 173 + 12 5

гу И 500 нг/г 157 + 29 5 '

8. Животные, которым введен

'РйЗ за 30 мин до АКТГ 50 нг/г 132 + 19 5

9. -----"----- 500 нг/г 122 + 15* 5

10. Животные, которым введен

протамин-сульфат за 30

мин до АКТГ ■500 нг/г 138 + 31 5

11. Животные, которым введен

БСА за 30 мин до АКТГ 500 нг/г 161 + 20 5

* - Р < 0,05 в сравнении с гр. 3,обработано по Ь-крит. Стьюдента

Влияние дефенсинов на уровень кортикостерона в крови при стрессе

Исходя из полученных данных, правомерно было предположить, что введение дефенсинов окажет влияние на уровень глюко-кортикоидных гормонов, повышенный под воздействием стрессорных

агентов.

Исследования проводили на модели ротационного стресса у мышей. Длительность стресса составляла 10 минут при 78 об/мин. Дефенсин кролика (суммарный препарат, состоящий из 6 фракций дефенсинов) в дозах 20 нг/г и 2 мкг/г веса животного вводили внутрибрюшинно за 10 минут до стресса. Кровь для определения кортикостерона забирали декапитацией животных через 30, 60 и 120 минут после стрессорного воздействия. Показано, что инъекция дефенсинов вызывает существенное снижение стресс-индуциро-ванного 'повышения глюкокортикоидных гормонов в сравнении с контрольной группой животных (животные, которым за 10 минут до стресса вводили физиологический раствор) (Табл.4). Ингибир'ующее

Таблица 4.

Влияние дефенсинов на изменение концентрации кортикостерона в крови у мышей, подвергнутых ротационному стрессу

Концентрация кортикостерона, нг/мл

Группы животных -:-

через ЗОмин через бОмин через 120мин после стресса

I. Животные, которым за 290 + 27 316 + 41 295 + 46

10 мин до стресса п = 6 п = 6 п =5

введен физ. раствор

II. Животные, которым за

10 мин до стресса вве- 164 + 18* 213 + 32* 173 + 37

ден дефенсин кролика ■п = 6 п = 5 п = 5

в дозе 20 нг/г

III. Животные, которым за

10 мин до стресса 52 + 26* 114 + 12* 168 + 8*

введен дефенсин кро- п = 6 п = 6 п = 6

лика в дозе 2 мкг/г

* - Р < 0,05 в сравнении с I группой

Обработано по ^критерию Стьюдента Ингибирующее действие полипептидов было особенно четко выражено через 30 минут после окончания стрессорного воздействия, причем доза 20 мкг/г вызывала более значительный эф-

фект. Введение дефенсинов на более ранних сроках (.за 1 час,, 10 мин.), а также через 30 минут после стресса оказалось не эффективным.

Таким образом, полученные данные 'позволяют говорить о наличие кортикостатических свойств у испытанных препаратов дефенсинов в отношении глюкокортикоидных реакций, вызываемых стрессорными факторами или АКТГ, в организме экспериментальных животных.

3. ■ Влияние дефенсинов на некоторые показатели иммунного ответа при стресс-опосредованной иммуносупрессии.

Глюкокортикоидные гормоны при стрессе оказывают существенное влияние на формирование защитных реакций организма, в том числе иммунного ответа. Известно, что гиперпродукция глю-кокортикоидов надпочечниками является одной из причин стресс-обусловленных дисфункций иммунной системы. В свете рассмотренных ранее фактов можно было предположить, что иммуносупрессив-ное действие некоторых видов стресса может быть отменено предварительным введением дефенсинов.

В экспериментах на мышах использовали модель комбинированного стресса (иммобилизация - 1 час при +4 градусах С и затем еще сутки при комнатной температуре), который практически полностью блокирует иммунный ответ (Табл.5).

Суммарный дефенсин кролика в дозе 2 и 20 мкг/г веса животного вводили внутрибрющинно за 10 минут до начала стресса. Эритроциты барана вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 млрд клеток сразу после окончания стрессорного воздействия (т.е. через 1 сутки после введения дефенсина). На шестые сутки после иммунизации животных декапитировали и определяли количество анти-телообразующих клеток в селезенке (АОК) и титры антител в сыворотке крови. Контролями служили животные, которым в той же модели вместо дефенсина вводили физиологический раствор и иммунизированные мыши, не. испытавшие стрессорных воздействий (группы 1-я и 2-я). Показано,"что предварительное введение полипептидов восстанавливает гуморальный иммунный ответ экспериментальных животных (5-я, 6-я группы). Необходимо отметить, что дефенсины в этих условиях действуют не только как корти-костатины, но и способны, по видимому, модулировать иммунный

ответ (3-я, 4-я группы) по другим неизвестным механизмам ' действия.

Таблица 5.

Влияние дефенсинов на уровень титров антител е сыворотке крови и число антителообразукмцих клеток (АОК/Ю''' кл) в селезенке при стресс-индуцированной иммуносупрессии

у мышей

Нестресс- Стрессй- Введение дефенсина кролика

сирован- рованные -

ные имму- иммуни- 20мкг/г 2мкг/г 20мкг/г 2мкг/г низирова-' зиров. Нестрессированные Стрессированные нные мыши мыши иммунизированные мыши

I II III IV V VI

Титры AT 2,4 0,15. 2,4 *0 2,7 *о 3,2 *

п 7 7 7 г< , 4 5

АОК 49 1,7 85,7 *о 67 *о 53 * 67 *

п 7 7 7 7 4 5

о - Р < 0,05 по сравнению с группой I * - Р < 0,05 по сравнению с группой II Обваботано методом Вилконсона-Манна-Уитни Сходные результаты были получены в экспериментах на крысах, подвергавшихся холодовому воздействию (20 мин при -20 градусах С). Дефенсин крыс•(суммарный препарат) вводили внут- . рибрюшинно за 10 минут до начала стресса или .через 10 минут после окончания стрессирующего воздействия в дозе 160 нг/г. Иммунизацию проводили эритроцитами барана в дозе 1 млрд клеток ■ внутрибрюшинно через 10 минут после стресса или через 10 минут после введения дефенсина. Через 1 час после окончания стрессорных воздействий производили забор крови для определения концентрации КС. Контролями служили группы животных, которым вместо дефенсинов вводили физиологический раствор, прота-мин-сульфат, и нестрессированные крысы. Было установлено, что введение дефенсинов достоверно снижает уровень КО в сыворотке через 1 час после стресса, в то время как введение другого

■- 21 -

белкового препарата заметного эффекта не давало.

Оказывая действие на гормональные сдвиги у экспериментальных животных, дефенсины, как было показано, восстанавливали и иммунный ответ, сниженный в результате интенсивных стрессорных воздействий. У стрессированных крыс величины -1ог, титров АТ в сыворотке крови падали в 2 раза, а количество АОК - примерно на 90%, в то время как у животных, которым вводили дефенсин, как до, так и сразу после стресса, эти показатели соответствовали значениям, Характерным для контрольных крыс.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что введение экзогенных дефенсинов экспериментальным животным снижает у них стресс- и АКТГ-индуцированную глюкокортикоидную реакцию. Эти факты согласуются с гипотетическими представлениями о кортикостатической функции дефенсинов (ВаЬетап еЬ а1, 1989). В настоящее время не известен механизм действия экзогенных дефенсинов на ГГАКС а также роль эндогенных полипептидов в рассматриваемых процессах - это задачи последующих исследований. Можно, однако, предположить, что адаптивная значимость известного при стрессе феномена мобилизации нейтрофилов из костного мозга - нейтрофилеза не ограничивается превентивным усилением антимикробного барьера организма. В процессе выхода нейтрофилов в кровь и их последующей миграции в ткани имеет место постоянная секреция физиологически активных веществ гранулярного аппарата нейтрофилов, в том числе и дефенсинов (РапуиЬЮЬ'еЬ а1, 1991). При этом последние уже в роли гуморальных факторов могли бы проявлять свои кортикостатические и иммунопротективные свойства, обеспечивая взаимодействие иммунной и нейроэндокринной систем, направленное на формирование защитных реакций при стрессе.

ВЫВОДЫ

1. Комплекс использованных . в работе препаративных методов, включающих гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, позволяет получить суммарные и индивидуальные фракции дефенсинов человека, крысы и кролика.

2.' Получены очищенные фракции трех полипептидов из лейкоцитов свиньи - протегринов, представляющих собой новую, не из-

вестную ранее группу пептидов, имеющих высокое содержание аргинина и цистеина и сочетающих в своей структуре черты корти-костатических дефенсинов и антимикробного пептида иг гемоцитов подковообразного краба - тахиплезйна.

3. Протегрины проявляют микробоцидную активность против Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Candida albicans In vitro, сравнимую с активностью наиболее бактерицидных фракций дефенсинов кролика.

4. Введение суммарных фракций дефенсинов кролика и крысы, а также индивидуальных фракций дефенсинов кролика NP-3a, NP-3b и протегрина PQ-3 вызывает снижение на 20-60% АКТГ-индуцированного подъёма уровня кортикостерона в сыворотке крови экспериментальных животных.

5. Иньекция дефенсинов приводит к снижению в 1,5-2 раза уровня кортикостерона в крови, повышенного под действием стресса.

6. Введение дефенсинов предотвращает• индуцированное стрессом снижение показателей гуморального иммунного ответа i числа ан-тителообразующих клеток в селезенке, и титров антител в крови крыс и мышей).

7. Таким образом, в результате проведенных исследованиий показаны кортикостатические и иммуномодулирующие эффекты экзогенных дефенсинов и протегринов, что позволяет предположить наличие стресс-лимитирующих свойств у этих полипептидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кокряков В. Н. , Пигаревский В. Е. , Алешина Г. М. , Шамова О. В. Синергическое антимикробное действие катионных белков при фагоцитозе. // Респ. сборник научн. трудов: "Моделирование ' и клиническая характеристика фагоцитарных реакций." под ред. А. Н. Маянского. - Горький. - 1989. -с: 98-103.

2. Пигаревский В. Е. , Кокряков. В. Е , Мазинг Ю. А. , Селиверстова В. Г. , Данилова М. А. , Шамова 0. В. 'Биологическая роль катионных белков нейтрофильных гранулоцитов при воспалении. // В сб.: Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. Тез. докл. IV Всес. съезда патофизиологов. - Кишинев. - М.-1989.-Т. 2. - С.451.

3. Кокряков В. Е , Мазинг Ю. А., Данилова М. А., Алешина Г. М. , Новикова Н. С. ,Шамова 0. В. ,Кузьмин В. О. Катионные белки нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении. //В кн.: Проблемы медицины и биологии сегодня и завтра. Тез. конф. ,посвященной 100-летию НИИЭМ, Л. 1990.- с.59-61.

- 234. Лесникова М. П. , Шхинек Э. К. , Невейкина О. К , Шамова О. В. Низкомолекулярный катионный белок нейтрофилов ( НКЕ) как ингибитор стресс- и АКТГ-индуцированного повышения глюкокортикоид-ных гормонов. //В сб.: Взаимодействие нервной и иммунной систем. -Тез. докл. Всес. симп. , Оренбург, 1990, с. 52

5. Шамова О. В. , Лесникова М. П. , Кокряков В. Н. Влияние дефе-нсинов на стресс-индуцированную иммуносупрессию.//В кн.: Механизмы физиологических функций. Тез. докл. конф. молодых ученых и специалистов, Санкт-Петербург7 1992. - С. 70.

6. Lesnikova М. P. .Kokryakov V.N. .Shamova О. V. Stress-protective activity of defensin. //Abstracts: 1st Baltic Sea Conf. on Psyhosonvatics and Psyhotherapy, Germany (Kiel),1992, p. 132.

7. Шамова О. В. , Лесникова М. П. , Кокряков В. Е , Шхинек Э. К. , Корнева Е. А. Действие дефенсинов на уровень кортикостерона в крови и иммунный ответ при стрессе.// Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1993.- Т. 115, N6.- С. 646-649.

8. Kokryakov V.N. .Harwig S. S. L. .Panyutich E. A..Shevchenko A. A. , Alechina G. M. , Shamova 0. V. , Korneva H. A. , Lehrer R. I. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins and tachyplesins. //FEBS Lett.-1993. - Vol.327, N2.- P. 231-236.

9. Shamova О. V. , Lesnikova M. P. , Kokryakov V. N. , Aleshina G. M. The effect of defensins application on the stress-induced immunosuppression..//Abstracts: 2nd Intern. Congress ISNIM. -1993, Italy (Paestum), p. 153.

10. Mirgorodskaya 0. A. , Shevchenko A. A. , Kamal M. Abdalla, Chernuschevich I. V. , Egorov Т., Musoliamov A. X. , Kokryakov V.N., Shamova 0. V; Primary structure of three cationic peptides from porcine neutrophils. Sequence determination by combined usage of elektrospray ionization mass spektrometry and Edman degradation// FEBS Lett.-1993.-Vol. 330, N3, p. 339-342.

11. Шамова 0. В. , Орлов Д. С. , Лесникова M.IL, Алешина Г. М. Влияние дефенсина на некоторые иммунологические показатели при иммуносупрессии, индуцированной Холодовым стрессом//В сб.: Ак-

' туальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний. Тез. конф., посвящ. 100-летию со дня. рожд: акад. И.-Р. Петрова, Санкт-Петербург, 1993, с. 176.

12. Orlov D. S. , Shamova 0. V. , Lesnikova М. P. , Shan in

S.N., Kokryakov V.N., Rybakina E. Q. Stress1protective effects of IL-Ib and defensins// Abstract: 2nd Int. Cytokine Conf. ,Canada, Cytokines. 1994, Vol. 6, N5, p. 561.

13. Korneva E. A. , Kokryakov. V. N. , Rybakina E.G., Fomicheva E. E. .Shamova О. V. .Shanin S.N. Stress-induced disfunction of the immune system and their rehabilitation/ZAbstr.: 1st Int. Congr. ofImmunorehabilitation,1994,Nl Supplement,p. 181

14. Шамова О. В. , Лесникова M. П. , Кокряков В. Н. Роль дефен-синов в формировании иммунного ответа при стрессе/ /Тез. конф. мол. ученых России, поев. 50-летию АМН, Москва, 1994, с.156.