Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование свойств рекомбинантных модульных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование свойств рекомбинантных модульных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторов"

\

На правах рукописи

»

I I

ГИЛЯЗОВА Динара Гафуровна

Исследование свойств рекомбинантных модульных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.02 - биофизика 03.00.03 - молекулярная биология

4

1

5

I

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор физико-математических наук

Ведущая организация

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 9 февраля 2006 г в _ на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.% биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан ¿9 Э^К-ОБРЯ ¿005г.

А.А. Розенкранц А.С. Соболев

Ю.Н. Антоненко Р.Г. Ефремов

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

И

ТЕ. Креццелева

¿№3. 22ÖYY3*

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Использование инициирования деструктивных реакций в белках, липидах и нуклеиновых кислотах под действием света при помощи фотосенсибилизаторов (ФС) лежит в основе быстро развивающегося метода лечения злокачественных новообразований - фотодинамической терапии. Перенос энергии от молекулы ФС, перешедшей под действием света в возбужденное триплетное состояние, а также образование реакционно-способных радикалов и/или ион-радикалов ФС и молекул биологического субстрата приводит к генерации активных форм кислорода (АФК, в первую очередь синглетного кислорода *02 и свободных радикалов *ОН, Н02'), способных окислять большинство биологически важных молекул, что вызывает разрушение клеточных структур и гибель клеток. Из-за высокой реакционной способности пробег АФК в клетке ограничен несколькими десятками нанометров и их повреждающий эффект проявляется вблизи места их образования. Все имеющие терапевтическое значение ФС преимущественно локализуются в не самых чувствительных к их действию компартментах клетки - мембранных структурах, цитозоле, но не в ядре, которое наиболее чувствительно к деструктивным окислительным реакциям (Wiseman and Halliwell, 1996, Sobolev et al., 2000). Это приводит к необходимости введения в организм высоких доз ФС для получения терапевтического эффекта. Специфическая внутриклеточная доставка ФС в ядра раковых клеток является актуальной задачей биофизики клетки, поскольку могла бы значительно повысить эффективность фотодинамической терапии и снизить ее негативное воздействие на организм.

Адресную доставку ФС в ядра клеток-мишеней можно осуществить,

используя естественные клеточные механизмы транспорта макромолекул, с

помощью модульных рекомбинантных транспортеров (Rosenkranz et al., 2003).

Молекула MPT с присоединенным к ней ФС в процессе внутриклеточного

транспорта в ядра опухолевых клеток-мишеней выполняет за счет своих

модулей несколько разных функций, последовательно вступая в физико-

химических взаимодействия с компонентами клетки, определяющими

различные этапы транспорта макромолекул. Включение нескольких пептидных

модулей в состав единой полипептидной цепи мо кЛО<у<(*в|йеаяо№1В^ф>ся на

БИБЛИОТЕКА I

С.Н. 09

их способности вступать во взаимодействия с ключевыми участниками транспорта МРТ и повлиять на эффективность транспорта. В связи с этим представляется актуальным исследование влияния особенностей физико-химических взаимодействий МРТ с клеточными компонентами транспорта на эффективность фотоцитотоксического действия ФС, присоединенного к МРТ. В качестве лиганда в исследованных МРТ был использован эпидермальный фактор роста человека (ЭФР), поскольку повышенная экспрессия рецепторов к нему наблюдается при многих опухолях (плоскоклеточный рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, молочной железы и многие другие; Kolibaba and Druker, 1997, Mendelsohn and Baselga, 2000, Ford and Grandis, 2003).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование влияния структуры и состава модульных рекомбинантных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки ФС, содержащих эпидермальный фактор роста в качестве лиганда, на их функциональные свойства и эффективность действия.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие практические задачи:

• Исследовать особенности взаимодействия отдельных модулей рекомбинантных транспортеров (лиганда, эндосомолитика и сигнала ядерной локализации) с соответствующими клеточными компонентами транспорта в зависимости от модульного состава транспортеров.

• Исследовать эффективность фотодинамического действия конъюгатов фотосенсибилизаторов с модульными рекомбинантными транспортерами на клетках in vitro.

• Проанализировать взаимное влияние отдельных модулей на функционирование остальных модулей и транспортеров в целом.

Новизна работы. В работе впервые исследованы свойства и эффективность действия МРТ, содержащих в качестве лиганда эпидермальный фактор роста, показано, что использование подобных конструкций для направленной доставки ФС в ядра клеток эпидермоидной карциномы человека линии А431, сверхэкспрессирующих рецепторы ЭФР, позволяет повысить эффективность фотодинамического действия ФС более чем в 3000 раз. Изучены особенности физико-химических взаимодействий МРТ разного состава с различными

компонентами клетки, участвующими в транспорте макромолекул. Обнаружено, что расположение модулей в молекуле МРТ существенно влияет на функциональную активность отдельных модулей и всего транспортера в целом, что сказывается на эффективности фотодинамического действия ФС, присоединенного к МРТ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты диссертации имеют принципиальное значение для создания высокоэффективных систем доставки ФС в ядра опухолевых клеток-мишеней. Исследование отдельных этапов физико-химических взаимодействий модульных транспортеров для адресной доставки ФС с различными компонентами клеток, обеспечивающими внутриклеточный транспорт макромолекул, позволяет сформулировать спектр требований к составу и расположению модулей, предъявляемых к конструируемым полипептидам. Изученные в работе модульные транспортеры для адресной доставки ФС могут представлять интерес для разработки средств лечения и диагностики опухолей, характеризующихся повышенной экспрессией рецепторов эпидермального фактора роста.

Апробапия работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 14* зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (11-15 февраля 2002 г., Москва); международной конференции «Molecular genetics of eucaryotes» (4-7 февраля 2003 г., Москва); 3м съезде биофизиков России (24-29 июня 2004 г., Воронеж); Iй Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (26-28 октября 2004 г., Москва); 15м IUPAB и 5м EBSA международном биофизическом конгрессе (27 августа -1 сентября 2005 г., Монпелье, Франция); научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ и лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта ИБГ РАН. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Содержание и структура диссертапии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на № страница у, содержит 9 таблиц и рисункЭ. Список литературы включает 196 источников.

Содержание работы

Материалы и методы

Исследованные полипептиды

При создании нового МРТ ДТокс-#МР-(СЯЛ БУЩ-сп-ЗФ? за основу был взят транспортер для адресной доставки ФС в клетки меланомы, исследованный ранее (Rosenkranz et al., 2003), в котором лиганд - меланоцит-стимулируюший гормон - был заменен последовательностью эпидермального фактора роста человека (ЭФР). МРТ содержит последовательности транс локационного домена дифтерийного токсина (ДТокс), обеспечивающего выход конструкции из замкнутых внутриклеточных компартментов; сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40 (СЯЛ SV40), а также носителя ФС -бактериального гемоглобиноподобного белка (НМР). Для исследования взаимного влияния модулей на их функционирование и на транспортер в целом также были созданы конструкции, дефицитные по одному из модулей: НМР-(СЯЛ 5У40)-сп-ЭФР, ДТокс-#МР-(СЯЛ SV40), ДТокс-ЯМР-сп-ЭФР и конструкция с измененным порядком модулей НМР-(СЯЛ 5У40)-ДТокс-сп-ЭФР. Все МРТ содержали N-концевую последовательность из 6 остатков гистидина для аффинного выделения на Ni-NTA-агарозе, а также глицил-сериновый спейсер (сп) для пространственного отделения лиганда от остальной части молекулы.

Конструирование плазмид, кодирующих МРТ, а также трансформация клеток штамма M15(REP4) Е. coli соответствующими плазмидами было осуществлено В.Г. Луниным (лаборатория молекулярной генетики внутриклеточного транспорта ИБГ РАН и ВНИИСБ РАСХН).

МРТ были получены в Е. coli путем индуцибельной экспрессии соответствующих химерных генов, выделены и очищены при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе согласно методике фирмы QIAGEN.

Вестерн-блот

Препараты МРТ после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле переносили на нитроцеллюлозную мембрану путем полусухого переноса. Идентификацию связанных с мембраной антигенов

проводили с помощью аффинно очищенных кроличьих антител к белку НМР-(СЯЛ SV40)-aMCF (получены в лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта П.В. Гулаком) и козьих анти-кроличьих антител, меченных пероксидазой хрена.

Культура клеток

Клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина при 5% С02 и 37°С в С02-инкубаторе.

Функциональная активность модулей

Функциональную активность лигандного модуля проверяли по способности МРТ вытеснять с поверхности клеток А431 ЭФР и МРТ НМР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР, меченные 1251; количество клеточных рецепторов к ЭФР и МРТ определяли методом Скэтчарда с помощью радиоактивно меченных полипептидов.

Способность МРТ нарушать целостность липидной мембраны проверяли по индуцированному транспортерами выходу флуоресцирующего красителя кальцеина из липосом в диапазоне pH 3-7,5 (Rosenkranz et al., 1997).

Наличие в МРТ функционально-активного СЯЛ определяли по взаимодействию МРТ с гетеродимером импортинов методом регистрации поверхностного плазмонного резонанса с помощью системы Biacore X («Biacore», Швеция). Плазмида pGEX-2T НА-РТАС97 с опероном, экспрессирующим химерный белок глутатион-8-трансфераза-РТАС97 (импортин-ß), была любезно предоставлена доктором Й. Йонеда (Университет Осаки, Япония). Клетки Е. coli с плазмидой pQE-IA, содержащая в своем составе ген РТАС58 (импортин-а), были любезно предоставлены в.н.с. B.JI. Друцей (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ). Импортин-а и импортин-ß были получены в Е. coli методом индуцибельной экспрессии соответствующих генов, выделены и очищены методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе и глутатион-сефарозе, соответственно, согласно стандартным методикам. Кривые взаимодействия МРТ, присоединенных к поверхности чипа СМ5, с гетеродимером импортинов обрабатывали с помощью программного пакета BIAevaluation 4.1 («Biacore»), аппроксимация экспериментальных данных теоретическими кривыми, соответствующих различным моделям

взаимодействия, была проведена методом наименьших квадратов с помощью алгоритма Левенберга-Маквардта.

Деградация МРТ в клетках А431

Клетки А431, преинкубированные с [1251]-МРТ или с [,25IJ-MPT и ингибитором протеасом MG132 в течение 2 часов, разрушали ультразвуком в присутствии детергентов и ингибиторов протеаз. Полученные лизаты анализировали с помощью электрофореза, распределение радиоактивности визуализовали при помощи фосфоримиджера Cyclone Storage Phosphor System («Packard Biosciences», США). Проверку на соответствие выборок нормальному распределению проводили с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Для анализа значимости наблюдаемых различий между двумя выборками использовали непараметрический U-тест Манна-Уитни. Все статистические процедуры проводили с использованием программы SPSS for Windows 11.0.1.

Внутриклеточная локализация МРТ

Для определения мест внутриклеточной локализации МРТ был использован метод непрямой иммунофлуоресценции. Клетки А431, преинкубированные с МРТ в течение 4 часов, отмывали, инкубировали в среде без МРТ 3 часа и фиксировали смесью ацетона с метанолом в соотношении 2:3 в течение 15 мин при температуре -20 °С. Идентификацию иммуногенного МРТ в клетках проводили окрашиванием с помощью кроличьих антител к белку НМР-(СЯЛ SV40)-aMCT и козьих анти-кроличьих антител, меченных флуорофором СуЗ. Внутриклеточное распределение МРТ выявляли при помощи микроскопии на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе TCS SP2 («Leica Microsystems», Германия).

Синтез конъюгатов МРТ с ФС

Конъюгаты МРТ с ФС хлорином е6 в молярном соотношении 1:1 получали путем ковалентного присоединения хлорина к аминогруппам МРТ с помощью 1-этил-3-(3-димстиламинопропил)-карбодиимида и N-гидроксицукцинимида и очищали при помощи гель-фильтрации и аффинной хроматографии.

Исследование эффективности фотодинамического действия ФСт vitro

Клетки А431 инкубировали с конъюгатами МРТ-(хлорин е6) и свободным ФС в течение 20 часов, облучали белым светом дозой 270 кДж/м2 и оставляли расти в течение 48 часов. Выживаемость клеток определяли окрашиванием метиленовым синим (Finlay et al, 1984). Для определения 50%-ной эффективной дозы ЕС}0 использовали пробит-метод; линейное уравнение регрессии и величина ЕС,Й были получены с помощью программы SPSS for Windows.

Результаты и их обсуждение

Получение и очистка МРТ

Важным требованием при исследовании физико-химических взаимодействий МРТ с компонентами, определяющими его транспорт в клетке, является высокая чистота используемых препаратов МРТ. Чистота полученных препаратов МРТ ДТокс-ЯМР-(СЯЛ 5Т-/0)-сп-ЭФР, НМР-(СЯЛ ЛТ-/0)-сп-ЭФР, ¡\Токс-НМР-(СЯЛ SV40), ДТокс-#МР-сп-ЭФР составила более 98%, тогда как чистота МРТ с измененным порядком модулей НМР-(СЯJ1 6Т-/0)-ДТокс-сп-ЭФР варьировала от 40% до 80% в зависимости от условий экспрессии в бактериальных клетках (концентрация индуктора, время и температура экспрессии) и метода очистки (адсорбционная хроматография на Голубой сефарозе CL-6B, аффинная хроматография на Ni-NTA-агарозе и Сефарозе CL-4В, модифицированной протопорфирином IX). Наибольший вклад в долю примесей вносил полипептидный фрагмент молекулярной массой 47-50 кД (до 50% от общего содержания белка в пробе). Препараты МРТ с перестановкой модулей с максимально возможной чистотой (80%) без существенного ущерба для выхода целевого белка были получены индукцией экспрессии МРТ 0,2 мМ изопропил-Р-О-тиогалактозидом в течение 2 часов при температуре 13-15 °С. Эта же схема была использована для получения и очистки остальных МРТ. Выход целевого белка в среднем составил 13-16 мг белка на 1 л клеточной суспензии.

Для определения природы примесей в препарате МРТ с перестановкой модулей НМР-(СЯЛ Л'К-/0)-ДТокс-сп-ЭФР был проведен Вестерн-блот с антителами к белку НМР-(СЯЯ SV-40)-aMCT (то есть преимущественно к N-

концевому участку молекулы). Иммунохимическое окрашивание компонентов препарата МРТ НМР-(СЯJ1 5У-/0)-ДТокс-сп-ЭФР показало, что примесная полоса с молекулярной массой 50 кД специфически окрашивается использованными антителами, то есть является продуктом деградации полного транспортера, вызванной, по-видимому, действием протеаз в ходе бактериального синтеза полипептида. На это же указывают и результаты аффинной хроматографии МРТ на Ni-NTA-агарозе и протопорфирин-Сефарозе

В процессе выделения и очистки всех остальных транспортеров подобная деградация отсутствовала. По-видимому, разная степень устойчивости к действию бактериальных протеаз зависит от структуры синтезируемых МРТ.

Взаимодействие МРТ с импортинами

Для проверки функциональной активности сигнала ядерной локализации в составе МРТ были выделены и очищены компоненты белкового комплекса, опосредующего транспорт через ядерную пору: РТАС58 (импортин-а) и РТАС97 (импортин-p). комппекс которых, как было показано Имамото с коллегами (Imamoto et а!., 1995), осуществляет ядерный импорт СЯЛ большого Т-антигена вируса SV-40, входящего в состав исследованных МРТ.

Для каждого МРТ были порчены семейства кривых взаимодействия с различными концентрациями гетеродимера импортинов методом регистрации поверхностного плазмонного резонанса. Типичные кривые взаимодействия полноразмерного транспортера ДТокс-ЯМР-(СЯЛ 5К40)-сп-ЭФР приведены на рис. 1 А. Для сравнения приведены кривые взаимодействия гетеродимера импортинов с МРТ, дефицитным по модулю СЯЛ (рис. 1 Б), а также кривые взаимодействия полноразмерного транспортера с импортином-ос и импортином-Р в отдельности (рис. 1 В).

Математическая обработка экспериментальных кривых с помощью нескольких теоретических моделей показала, что взаимодействие СЯЛ 1

транспортеров с импортинами не может быть адекватно описано простой моделью одностадийного процесса (А+В^АВ). Наилучший результат аппроксимации экспериментальных данных теоретическими кривыми был получен при использовании модели двухстадийного процесса, в которой учитываются конформационные изменения образовавшегося комплекса

взаимодействующих молекул (А+В^ АВ = АВ*), что согласуется с литературными данными для изолированного СЯЛ вируса SV-40 (Catimel et al., 2001). Результат оценки кажущихся равновесных констант сродства МРТ к импортинам с помощью модели двухстадийного взаимодействия приведен в таблице 1.

140 190 240 Время, с

90 190 290 Время, с

Рис 1 Взаимодействие МРТ с импортинами А - Связывание Д'Го кс- ИМ/>-( С Я Л SV40)-сп-ЭФР с возрастающими концентрациями гетеродимера импортинов (350 нМ, 450 нМ, 500 нМ, 600 нМ, 800 нМ, 850 нМ, 900 нМ, 1 мкМ) Экспериментальные данные, использованные в расчетах, обозначены символами, результат аппроксимации - сплошной линией, Б - Взаимодействие зквимолярных концентраций комплекса импортинов (1мкМ) с МРТ ДТокс-///№-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР (1) и ДТокс-ЯЛ/Р-сп-ЭФР (2), В - Взаимодействие МРТ Д'Гокс-/УМЛ(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР с эквимолярными концентрациями (1 мкМ) гетеродимера импортинов (1), импортина-а (2), импортина-ß (3)

Максимальным сродством к импортинам, близким к сродству изолированного СЯЛ, обладают транспортеры, дефицитные по одному из модулей: лигандному или эндосомолитическому, тогда как в случае МРТ ДТокс-ЯА/Р-(СЯЛ SV40)-cn-3<&V, содержащего оба модуля в тех же положениях, сродство к импортинам снижено на 2 порядка. Следовательно, сами по себе ни эндосомолитический, ни лигандный модули существенно не влияют на способность СЯЛ образовывать комплекс с импортинами, сродство снижается только в том случае, когда оба модуля располагаются по разные стороны от модуля НМР. По-видимому, при подобном расположении возникают стерические затруднения для взаимодействия МРТ с комплексом

импортинов. Это предположение подтверждается полученными в последнее время данными о конформации молекулы НМР, С- и N-концевые участки которой сближены (Ilari et al., 2002). Сродство транспортера с перестановкой модулей к импортинам примерно на порядок ниже, чем сродство МРТ, дефицитных по лиганду и эндосомолитику; по-видимому, это вызвано расположением СЯЛ между двумя объемными модулями НМР и ДТокс, которые мешают образованию комплекса с импортинами.

Таблица I Оценка кажущихся равновесных констант сродства МРТ к гетеродимеру импортинов

МРТ К,, М1

НМР-(СЯЛ SV40Yсп-ЭФР 3,2-Ю8

ДТокс-#МР-(СЯЛ SV40) 1,0'109

НМР-(СЯ Л 5К40)-ДТокс-сп-ЭФР 4,6» 107

ДТокс-ЯЛ//>-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР 3,6-106

Исследование сродства МРТ к рецептору ЭФР клеток Л 431

Константу связывания МРТ с рецепторами ЭФР клеток А431 определяли методом конкурентного вытеснения радиоактивно меченных лигандов с известной константой сродства с поверхности клеток возрастающими концентрациями исследуемых МРТ. Типичные кривые конкурентного вытеснения радиоактивно меченного ЭФР его немеченым аналогом, а также транспортером НМР-(СЯЛ 5К^0)-ДТокс-сп-ЭФР приведены на рис. 2 А. Для увеличения сродства ЭФР в составе МРТ был проведен рефолдинг лигандного модуля в присутствии окисленного и восстановленного глутатиона, который позволил повысить сродство МРТ НМР-(СЯЛ 5К40)-ДТокс-сп-ЭФР более чем в 2 раза. В связи с этим при дальнейших исследованиях были использованы МРТ, прошедшие аналогичную процедуру рефолдинга.

Все МРТ, содержащие лигандный модуль, обладали способностью вытеснять радиоактивно меченные лиганды с поверхности клеток А431, (таблица 2). Значения констант диссоциации разных коммерческих рекомбинантных препаратов ЭФР человека, определенные в наших экспериментах тем же способом, лежали в диапазоне 2-19 нМ. Типичные

кривые конкурентного вытеснения радиоактивно меченного МРТ НМР-(СЯЛ SK40)-cn-3<J>P немечеными транспортерами изображены на рис. 2 Б.

Таблица 2. Кажущиеся равновесные константы диссоциации комплексов МРТ с рецепторами ЭФР. _

МРТ Ki, нМ Границы 95% доверительного интервала К<(, нМ

ДТокс-ЯА/Р-сп-ЭФР 76 68-86

НМР-(СЯЛ 5У40)-ДТокс-сп-ЭФР 40 35-45

ДТокс-ЯМР-(СЯЛ SV40)-cn-3<bP 29 26-33

НМР-(СЯ Л 5К40)-сп-ЭФР 21 19-23

Наивысшим сродством к рецептору обладают транспортеры НМР-(СЯЛ БУ40)-сп-ЭФР и ДТокс-ЯЛ//'-(СЯЛ 5К40)-сп-ЭФР. По-видимому, транслокационный домен дифтерийного токсина, значительно снижающий сродство СЯЛ транспортера ДТокс-ЯМ/'-(СЯЛ 5К40)-сп-ЭФР к импортинам, на сродство лигандного модуля к клеточному рецептору влияет не столь существенно. В отсутствие сигнала ядерной локализации между лигандом и остальной частью молекулы в транспортере ДТокс-ЯМР-сп-ЭФР сродство ЭФР снижается почти в 4 раза.

0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1 10 100 1000 Концентрация, нМ Концентрация, нМ

Рис2 Связывание [1251]-ЭФР (А) и \"Ь\)-НМР-(СШ 5У<М)-сп-ЭФР (Б) с клетками A43I в присутствии конкурирующих лигандов А - немеченного ЭФР (I), НМР-(СЯЛ 5К40)-Дтокс-сп-ЭФР (2) до рефолдинга, «В,%» - связанный [1251]-ЭФР, Б - МРТ ДТокс-/ШР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР (1), НМР-(СЯЛ SV40)-Дтокс-сп-ЭФР (2), ДТокс-ЯМР-(СЯЛ SV40) (3), «В,%» - связанный [,2-\]-НМР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР

Основными причинами снижения сродства по сравнению с исходным ЭФР, по-видимому, могут быть: 1) отличие конформании ЭФР транспортеров от нативной, требующей однозначного замыкания 3 дисульфидных связей, что подтверждается положительным влиянием рефолдинга на сродство лигандного модуля; 2) стерические затруднения при образовании лиганд-рецепторного комплекса.

С помощью радиоактивно меченных МРТ было определено количество рецепторов к транспортерам на поверхности клеток А431, которое находилось в диапазоне (2,2-3)* 10й рецепторов на клетку. Количество рецепторов ЭФР, определенное нами тем же способом, составило 2,6*106 рецепторов на клетку, что совпадает с литературными данными (Никольский и др., 1987).

Оценка темпов накопления радиоактивно меченных МРТ клетками А431 показала, что эндоцитоз является одной из существенных стадий их внутриклеточного транспорта и зависит от состава МРТ. Количество накопленного в течение 2 часов инкубации транспортера НМР-(СЯJ1 SV40)-сп-ЭФР (380±10 тысяч молекул на клетку) в 1,5 раза превышало (уровень значимости различий между выборками по тесту Манна-Уитни р<0,01) количество накопленных МРТ ДТокс-ЯМ/>-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР и ДТокс-НМР-сп-ЭФР (250+20 и 230+10 тысяч молекул на клетку соответственно). Поскольку сродство препаратов радиоактивно меченных МРТ, содержащих и не содержащих эндосомолитический модуль ДТокс, к рецептору ЭФР клеток А431 практически не отличалось, причиной обнаруженных различий являлась, по-видимому, разная скорость их эндоцитоза.

Способность МРТ нарушать целостность липидной мембраны

Для проверки способности МРТ нарушать целостность липидной мембраны были изучены рН-зависимости выхода красителя из фосфатидилхолиновых липосом под их действием. На рис. 3 приведены типичные кривые индукции выхода кальцеина транспортерами И MP-(С ЯЛ SV40)-ДТокс-сп-ЭФР, ДТокс-ЯМР-(СЯЛ 5К40)-сп-ЭФР и НМР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР.

Все исследованные МРТ вызывали выход кальцеина из липосом рН-зависимым образом. Для всех полипептидов было характерно увеличение

исследованной активности при закислении среды, которая достигала максимума при pH 3,5. В области pH 5 и ниже характер мембранолитической активности у всех МРТ практически не отличался, так как, по-видимому, в большей степени определялся функционированием модуля НМР, который, как было показано ранее (Rosenkranz et al, 2003), способен нарушать целостность мембраны в кислой области. В диапазоне pH 5,5-7 способность транспортера, не содержащего эндосомолитический модуль, индуцировать выход красителя была заметно ниже, чем у всех МРТ, содержащий модуль ДТокс.

рН

Рис 3 рТТ-зависимостъ нарушения истостносж типосом поч действием МРТ Ш/Р-(ОЯЛ SV40)-ДТокс-сп-ЭФР (1), ДТокс-ЯМ/ЧСЯЛ SV40)-сп-ЭФР (2) и НМР-(СЯП SV40)-сп-ЭФР (3) (конценфация всех МРТ 100 нМ, концентрация липидаЗО мкг/мл)

Таким образом, можно предположить, что включение транслокационного домена дифтерийного токсина в состав МРТ может позволить такому транспортеру покинуть везикулы эндоцитозного пути на стадии ранних эндосом, тем самым снизив вероятность деградации МРТ в поздних эндосомах и лизосомах.

Деградация МРТ в клетках

Большая часть белков (в том числе и ЭФР (Carpenter and Cohan, 1979), а значит и МРТ на его основе), попадающие в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, после интернапизации поступает в лизосомы, где поглощенные молекулы деградируют под действием кислых протеаз. Если транслокационный домен дифтерийного токсина, включенный в состав МРТ, выполняет возложенную на него функцию (обеспечение выхода МРТ из эндосом), то уровень деградации МРТ, его содержащего, должен быть ниже по сравнению с транспортером, дефицитным по этому модулю.

Оценка доли недеградированных МРТ, различающихся наличием эндосомолитического модуля, показала, что включение эндосомолитического модуля в состав МРТ привело к трехкратному увеличению доли недеградированного МРТ в клетках А431 (2,2±0,1 % и 0,7±0,1 % интактного МРТ, содержащего и не содержащего модуль ДТокс, соответственно, уровень значимости различий между выборками р<0,01, рис.4). По-видимому, это можно объяснить тем, что наличие транслокационного домена дифтерийного токсина обеспечивает более ранний выход полноразмерного МРТ из эндосом в цитозоль, чем в случае транспортера, дефицитного по этому модулю.

Рис 4 Доля недеградированных МРТ в клетках НМР-(СЯП SV40)-сп-ЭФР (1,3) и ДТокс-//М/>-(СЯЛ 5К40)-сп-ЭФР (2,4) в клетках А431 в отсутствии (1,2) и присутствии (3,4) ингибитора протеасом MG132

Белок, попавший в клетку путем эндоцитоза и избежавший деградации в лизосомах за счет транслокации в цитозоль, становится доступным для действия протеасом - цитозольных белковых комплексов, обладающих широким спектром протеолитической активности (Pajonk and McBride, 2001). Если транспортер проникает в цитозоль и подвергается протеасомной деградации, то добавление в среду инкубации ингибитора протеасом должно снизить деградацию МРТ.

Доля интактного МРТ ЦТокс-НМРАСЯЛ SV40)-сп-ЭФР при инкубации с клетками в присутствии ингибитора MG132, блокирующего химотрипсиновую активность протеасом (Kisselev and Goldberg, 2001), достоверно возросла почти в 3 раза (до 5,9±0,7%, р<0,01), в случае транспортера НМР-(СЯЛ .ST-ОД-сп-ЭФР использование ингибитора протеасом повысило долю недеградированного

полипептида в 1,7 раза (до 1,2±0,1%, р<0,01, рис.4). Следовательно, можно предположить, что протеасомная деградация вносит больший вклад в деградацию транспортера, содержащего ДТокс, чем в деградацию МРТ, лишенного этого модуля, то есть транспортер без эндосомолитика, по-видимому, покидает эндоцитозный путь на более поздней стадии, чем полноразмерный транспортер, и в большей степени деградирует под действием лизосомных ферментов.

Внутриклеточная локализация МРТ

Визуализация мест внутриклеточной локализации полноразмерного МРТ ДТокс-ЯМЧСЯЛ SV40)-сп-ЭФР с помощью метода непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания показала, что поглощенный клетками транспортер преимущественно накапливается в ядрах и гранулярных образованиях вблизи ядер (рис.5). Следовательно, транспортер, содержащий все функциональные модули, способен осуществлять адресную доставку в ядра клеток А431 из внеклеточного пространства.

Рис.5 Внутриклеточное распределение ДТокс-#т№-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР в клетках А431 после 4-часовой инкубации с 200 нМ МРТ. А - результат регистрации изображения при помощи лазерной конфокальной микроскопии непрямой иммунофлуоресценции клеток, окрашенных антителами к МРТ; Б - выявление ядер с помощью ДНК-специфичного флуоресцентного красителя То-Рго-3.

Эффективность фотодинамического действия ФС

Эффективность фотодинамического действия (ФДД) оценивали по выживаемости клеток линии А431 в результате ФДД свободного и присоединенного к МРТ ФС хлорина е6. Гибель клеток рассчитывали по отношению к контролю, которым служили клетки, облученные светом, без добавления ФС. Облучение клеток практически не влияло на их рост. Величины

15

50% эффективной дозы ЕС50, границы 95% доверительного интервала ЕС50, а также эффективность ФДД Ef, рассчитанная как отношение ЕС ¡о свободного ФС к ECso его конъюгатов с МРТ, приведены в таблице 3,

Таблица 3. Сравнительная характеристика ФДД свободного и связанного с МРТ хлорина е6

ФС ECso, нМ Границы 9S% доверительного интервала ЕС50, нМ Ef

Хлорин в( 1780 1075-3100 1

НМР-( СЯЛ 5У40)-ДТокс-сп-ЭФР-(хл е6) 2,25 1-4,75 790

ДТокс-#М>-сп-ЭФР-(хл е6) 0,63 0,52-0,78 2830

ДТокс-#МР-(СЯЛ 5К40)-сп-ЭФР-(хл е6) 0,53 0,41-0,67 3360

НМР-(СЯЯ 5К40)-сп-ЭФР-(хл еб) 0,47 0,2-1 3790

Присоединение ФС к МРТ ДТокс-#МР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР, содержащему все функциональные модули, позволило повысить эффективность ФД Д хлорина е6 на клетки А431 более чем в 3000 раз. Значительное увеличение эффективности фотоцитотоксического действия ФС, по-видимому, было достигнуто благодаря адресной доставке хлорина е6 в ядра, наиболее чувствительный к действию АФК компартмент клеток.

Однако, эффективность ФДД полноразмерного МРТ ДТокс-#МР-(СЯЛ SV4O)-cn-30P оказалась почти такой же, как и эффективность МРТ, не содержащего эндосомолитический модуль, и незначительно выше эффективности МРТ, дефицитного по модулю С ЯЛ. По-видимому, это можно объяснить, в первую очередь, сниженным сродством СЯЛ в составе полноразмерного МРТ к импортинам, которое на 2 порядка меньше, чем сродство МРТ НМР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР, который, кроме того, характеризуется и более высоким темпом эндоцитоза. Однако тот факт, что значения ЕС$о этих МРТ сравнимы, свидетельствует о том, что эндосомолитическая активность ДТокс в составе МРТ ДТокс-ЯМР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР позволила почти

полностью компенсировать малоэффективное функционирование СЯЛ и лиганда, вызванное его негативным влиянием на эти модули. Более низкая эффективность ФДД транспортера НМР-(СЯЯ 5К^0)-ДТокс-сп-ЭФР с перестановкой модулей, возможно, была обусловлена повышенной деградабельностью полипептида, интенсивный протеолиз которого наблюдался даже на стадии бактериальной экспрессии.

Заключение

Использование МРТ, содержащих ЭФР в качестве лиганда, для специфической доставки фотосенсибилизатора хлорина е6 в ядра клеток А431 позволяет повысить эффективность его фотоцитотоксического действия более чем в 3000 раз. Величина фотоцитотоксического эффекта зависит от состава и расположения в молекуле транспортера модулей, определяющих спектр функциональной активности МРТ на различных этапах специфического транспорта из внеклеточного пространства в ядро клетки.

Необходимым условием эффективной внутриклеточной доставки ФС в ядра клеток-мишеней является эффективное функционирование каждого из модулей молекулы МРТ, которое мы оценивали по способности транспортеров вступать в физико-химические взаимодействия с соответствующими компонентами клетки, опосредующими внутриклеточный транспорт макромолекул. Функциональная активность каждого из исследованных модулей зависит от его местоположения в последовательности молекулы транспортера. Эффективное функционирование каждого модулей позволяет увеличивать эффективность действия МРТ, оцениваемую по величине фотоцитотоксического эффекта.

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что дальнейшее увеличение эффективности ядерной доставки ФС с помощью полноразмерного транспортера ДТокс-ЯМР-(СЯЛ SV40)-сп-ЭФР возможно за счет оптимизации его структуры таким образом, чтобы все функциональные модули обладали максимумом присущей им активности. Такая оптимизация может быть достигнута, например, за счет введения в состав транспортера дополнительных спейсерных последовательностей между модулями, или, наоборот, делепий в модуле НМР, которые позволят разнести в пространстве С- и N-концевые участки белковой молекулы.

Выводы

1. Показано, что эпидермальный фактор роста в составе модульных рекомбинантных транспортеров обеспечивает им проникновение внутрь клеток эпидермоидной карциномы человека линии А431 с повышенной экспрессией рецепторов эпидермального фактора роста.

2. Методом регистрации поверхностного плазменного резонанса показано, что сигнал ядерной локализации большого Т-антигена вируса 8У-40 в составе модульных рекомбинантных транспортеров способен эффективно взаимодействовать с комплексом а- и (3-импортинов, который опосредует цитоплазмено-ядерный транспорт.

3. Продемонстрировано, что модульные рекомбинантные транспортеры, содержащие транслокационный домен дифтерийного токсина, способны нарушать целостность липосом в диапазоне рН 5,5-6,5.

4. Показано, что наличие в модульном рекомбинантном транспортере эндосомолитического модуля снижает его внутриклеточную протеолитическую деградацию.

5. Наличие, место расположения и эффективность функционирования модулей транспортера влияют на фотоцитотоксическое действие фотосенсибилизатора, доставляемого модульным рекомбинантным транспортером.

6. Показано, что присоединение фотосенсибилизатора хлорина е6 к транспортерам для адресной доставки, содержащим сигнал ядерной локализации большого Т-антигена вируса БУ-40 позволяет повысить эффективность его фотоцитотоксического действия на клетки А431 более чем в 3000 ра:

1. Гилязова Д.Г., Кофнер A.A., Шумянцева М.А., Смирнова O.A., Лунин В.Г., Розенкранц A.A., Соболев A.C. Исследование рекомбинантных белков для направленного транспорта фотосенсибилизаторов в ядра опухолевых клеток // XIV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»: Тезисы докладов и стендовых сообщений. - Москва, 2002. - С. 5-6.

2. Gilyazova D.G., Shumiantseva М.А., Rosenkranz A.A., Sobolev A.S. Modular recombinant transporters for intracellular delivery of photosensitizers: functionality

Список печатных работ по теме диссертации

and cytotoxity // International conference «Molecular genetics of eucaryotes»: Abstracts. - Moscow, 2003. - P. 10.

3. Розенкранц A.A., Лунин В.Г., Сергиенко O.B., Гилязова Д.Г., Воронина О.Л., Янс Д.Э., Кофнер A.A., Шумянцева М.А., Миронов А.Ф., Соболев A.C. Направленная внутриклеточная доставка локально действующих лекарств: Специфическая доставка фотосенсибилизаторов в ядра клеток меланомы // Генетика. - 2003. - Т. 39. - № 2. - С. 6-9.

4. Rosenkranz A.A., Lunin V.G., Gulak P.V., Sergienko O.V., Shumiantseva M.A., Voronina O.L., Gilyazova D.G., John A.P., Kofner A.A., Mironov A.F., Jans D.A., Sobolev A.S. Recombinant modular transporters for cell-specific nuclear delivery of locally acting drugs enhance photosensitizer activity // FASEB J. - 2003. - V. 17. - P. 523-541.

5. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Гилязова Д.Г. Подходы к направленной внутриклеточной доставке фотосенсибилизаторов для увеличения их эффективности и придания клеточной специфичности // Биофизика. - 2004. - Т. 49.-№2.-С. 351-379.

6. Гилязова Д.Г., Розенкранц A.A., Лунин В.Г., Соболев A.C. Модульные рекомбинантные транспортеры на основе эпидермального фактора роста для направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторов в клетки-мишени // Ш съезд биофизиков России: Тезисы докладов. - Воронеж, 2004. - С. 508-509.

7. Гилязова Д.Г., Розенкранц A.A., Гулак П.В., Соболев A.C. Усиление фотодинамического повреждения клеток эпидермоидной карциномы человека при помощи направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторов в клеточные ядра И I Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность»: Сборник тезисов. - Москва, 2004. - С. 54-55

8. Артеменко Е.О., Тимофеев К.Н., Гилязова Д.Г., Розенкранц A.A., Соболев A.C. Генерация активных форм кислорода фотосенсибилизаторами, конъюгированными с модульными рекомбинантными носителями для направленной внутриклеточной доставки локально действующих лекарств // 1 Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность»: Сборник тезисов. - Москва, 2004. - С. 10-12.

9. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Sobolev A.S. Recombinant modular transporters on the basis of epidermal growth factor for targeted intracellular delivery of photosensitizers // Proceedings of SPIE. - 2005. - V. 5973. - P. 101-110.

10. Артеменко E.O., Гилязова Д.Г., Розенкранц A.A., Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Тимофеев К.Н., Грин М.А., Миронов А.Ф., Рубин А.Б., Соболев A.C. Влияние присоединения бактериохлорина р к модульным рекомбинантным транспортерам для направленной внутриклеточной доставки на эффективность его фотодинамического действия // Молекулярная медицина. - 2005. - №4. - С. 43-47.

11. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Sobolev A.S. Targeted delivery of photosensitizers into the cancer cell nuclei enhances their cytotoxic efficacy // European biophysics journal with biophysics letters. - 2005. - V. 34. - P. 823.

к исполнению 28/12/2005 Исполнено 29/12/2005

Заказ № 1403 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

1125532

РНБ Русский фонд

2006-4 28875

i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гилязова, Динара Гафуровна

Оглавление.

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Фотодипамическая терапия.

2.1.1. Физико-химические свойства ФС.

2.1.2. Внутриклеточная локализация ФС.

2.1.3. Методы доставки ФС в опухолевые ткани и клетки.

2.2. Направленная внутриклеточная доставка ФС в ядра опухолевых клеток-мишеней

2.2.1. Рецептор-опосредоваппый эндоцитоз.

2.2.2. Цитоплазмепо-ядерпый транспорт.

2.2.3. Транслокациоппын домен дифтерийного токсина: преодоление эпдосомпого барьера.

2.2.4. Использование носителей.

2.2.5. Создание молекулярных конструкций для направленного транспорта ФС.

3. Материалы и методы.

3.1. МРТ.

3.1.1. Структура и состав МРТ.

3.1.2. Плазмиды, кодирующие МРТ.

3.1.3. Экспрессия МРТ в бактериальных клетках.

3.1.4. Выделение и очистка МРТ.

3.1.5. Рефолдинг лигандного модуля МРТ.

3.2. Получение импортинов.

3.2.1 Плазмида, кодирующая p-импортин.

3.2.2. Трансформация клеток.

3.2.3. Клетки, окспрессирующие а-импортии.

3.2.4. Экспрессия импортинов в бактериальных клетках.

3.2.5. Выделение и очистка а-импортипа.

3.2.6. Выделение и очистка Р-импортина.

3.3. Измерение концентрации белка.

3.4. Электрофорез белков.

3.5. Вестерп-блот препаратов МРТ.

3.6. Получение препаратов МРТ и ЭФР, меченных |251.

3.7. Фотосепсибилизатор.

3.7.1. Получение водного раствора тринатриевой соли хлорина ев.

3.8. Синтез и очистка копыогатов МРТ с ФС.

3.8.1 Активация карбоксильных групп хлорина С(,.

3.8.2. Синтез коныогата МРТ-ФС.

3.8.3. Очистка конъюгата.

3.9. Культура клеток.

3.10. Определение количества рецепторов к ЭФР и МРТ на поверхности клеток А431 и констант сродства радиоактивно меченных ЭФР и МРТ к рецепторам.

3.11. Анализ связывания и эпдоцитоза ЭФР рецепторами на поверхности клеток А

3.12. Исследование сродства лигандов к рецептору ЭФР клеток А431.

3.13. Получение моноелойных липосом, нагруженных флуоресцентным красителем.

3.14. Определение мембранолитичсского действия рекомбинантпых белков на липосомы

1 "У ^

3.15. Исследование деградации [ 1]-МРТ клетках А431.

3.16. Анализ связывания МРТ с комплексом импортинов.

3.16.1. Модификация поверхности сенсорных чипов.

3.16.2. Получение комплекса импортинов.

3.16.3. Получение кинетических кривых взаимодействия МРТ с импортинами.

3.16.4. Математическая обработка кинетических кривых.

3.17. Определение внутриклеточной локализации МРТ.

3.17.1. Инкубация клеток с МРТ.

3.17.2. Иммупофлуоресцситное окрашивание клеток.

3.17.3. Окрашивание клеточных ядер.

3.17.4. Получение и обработка изображений.

3.18. Исследование эффективности ФДД ФС.

3.18.1. Инкубация клеток с ФС.

3.18.2. Облучение.

3.18.3. Определение выживаемости клеток.

4. Результаты.

4.1. Получение и очистка МРТ.

4.2. Иммупоблотинг НМР-(СЯЛ 8У40)-ДТокс-сп-ЭФР.

4.3. Получение и очистка импортинов.

4.4. Модификация поверхности чипов СМ5 с помощью МРТ.

4.5. Взаимодействие МРТ с гетеродимером а/р-импортипов.

4.6. Взаимодействие МРТ с а-импортином и p-импортином.

4.7. Характеристика клеточной модели.

4.7. Характеристика клеточной модели.

4.8. Влияние спейссра па сродство МРТ к рецептору ЭФР клеток А431.

4.8. Влияние спейссра на сродство МРТ к рецептору ЭФР клеток А431.

4.9. Влияние рефолдинга лиганда па сродство МРТ к клеточному рецептору.

4.10. Исследование связывания радиоактивно меченных МРТ с клетками А431.

4.11. Влияние МРТ па целостность липидной мембраны.

4.12. Деградация МРТ в клетках.

4.13. Внутриклеточная локализация МРТ.

4.14. Эффективность фотодинамического действия ФС.

5. Обсуждение результатов.

5.1. Сигнал ядерной локализации.

5.2. Лигапд.

5.3. Эндосомолитический модуль.

5.4. Внутриклеточная локализация МРТ.

5.5. Эффективность фотодинамического действия ФС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование свойств рекомбинантных модульных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторов"

Протекание деструктивных реакций в белках, липидах и нуклеиновых кислотах под действием света при участии фотосенсибилизаторов (ФС) и кислорода лежит в основе быстро развивающегося метода лечения злокачественных новообразований - фотодинамической терапии (ФДТ), заключающегося в уничтожении клеток опухоли после облучения её светом, поглощаемым ФС, который накопился в этой опухоли. Перенос энергии от молекулы ФС, перешедшей под действием света в возбужденное триплетпое состояние, приводит к генерации активных форм кислорода (АФК, в первую очередь синглетного кислорода и свободных радикалов 'ОН, Н02*), способных окислять большинство биологически важных молекул, что вызывает разрушение клеточных структур и гибель клеток.

Нормальные клетки также могут накапливать ФС, что является причиной серьезных побочных эффектов, таких, например, как повышенная фоточувствительность кожи и сетчатки глаз. Из-за высокой реакционной способности пробег АФК в клетке ограничен несколькими десятками нанометров (Hutchinson, 1957; Takemura et al., 1989; Moan and Berg, 1991; Elgohary et al., 1998; Li et al., 1999), и их повреждающий эффект проявляется вблизи места их образования. Клеточные компартменты имеют разную чувствительность к окислительным реакциям, поэтому эффективность действия ФС зависит от их внутриклеточного распределения. Все имеющие терапевтическое значение ФС преимущественно локализуются в не самых чувствительных к их действию компартментах клетки -мембранных структурах, цитозоле, но не в ядре, которое наиболее чувствительно к деструктивным окислительным реакциям, осуществляемым АФК (Wiseman and Halliwell, 1996, Sobolev et al., 2000). Это приводит к необходимости введения в организм высоких доз ФС для получения терапевтического эффекта. Специфическая внутриклеточная доставка ФС в ядра раковых клеток является актуальной задачей биофизики клетки, поскольку могла бы значительно повысить эффективность фотодипамической терапии и снизить ее негативное воздействие на организм.

Адресную доставку ФС в ядра раковых клеток-мишеней можно осуществить, используя естественные клеточные механизмы транспорта макромолекул с помощью модульных рекомбипаптных транспортеров (MPT) (Rosenkranz et al., 2003). Молекула MPT e присоединенным к пей ФС в процессе внутриклеточного транспорта в ядра опухолевых клеток-мишспей выполняет за счет своих модулей несколько разных функций, последовательно взаимодействуя с компонентами клетки, определяющими различные этапы транспорта макромолекул. Избирательность накопления ФС в опухолевых клетках определяется связыванием лигапда в составе МРТ с теми иптернализуемыми клеточными мембранными рецепторами, содержание которых значительно повышено в опухолевых клетках. К таким рецепторам относятся, например, рецепторы для инсулина, эпидермального фактора роста (ЭФР), липопротеипов низкой плотности, соматостатипа и др. (см обзор (Sobolev et al., 2000)). Дальнейший транспорт ФС в наиболее уязвимый к их действию компартмент клетки - ядро - определяется наличием в составе транспортера дополнительных модулей. Эти модули обеспечивают транспорт ФС из эпдосом, в которые попадают поглощенные в результате рецептор-опосредоваппого опдоцитоза МРТ, в ядро. Первый из этих модулей - транслокационпый домен дифтерийного токсина - отвечает за выход транспортеров из эпдосом в цитозоль, где второй из дополнительных модулей - сигнал ядерной локализации - обеспечивает ядерную доставку МРТ, где и проявляется в наибольшей степени фотоцитотоксический эффект присоединенного к транспортеру ФС. Высокая эффективность данного подхода была продемонстрирована на культуре клеток меланомы с использованием ряда МРТ для адресной доставки ФС в ядра клеток-мишеней (Sobolev et al., 2000; Rosenkranz et al., 2003; Розепкрапц и др., 2003), содержащие в качестве лигапдпого модуля а-мелапоцит-стимулирующий гормон, рецепторы к которому еверхэкспрессировапы у клеток меланомы.

Как уже упоминалось, специфичность по отношению к опухоли определяется природой входящего в состав транспортера лиганда, что позволяет создавать модульные полипептиды для направленного транспорта в различные типы опухолевых клеток. Повышенная экспрессия рецепторов к ЭФР наблюдается при многих опухолях (плоскоклеточный рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, молочной железы и многие другие (Kolibaba and Druker, 1997; Mendelsohn and

Baselga, 2000; Ford and Grandis, 2003)), что позволяет использовать ЭФР для избирательной доставки ФС в клетки соответствующих опухолей.

При создании нового МРТ за основу был взят транспортер для адресной доставки в клетки меланомы, исследованный ранее (Rosenkranz et al., 2003; Розепкранц и др., 2003), в котором лигапд - меланоцит-стимулирующий гормон -был заменен последовательностью эпидермального фактора роста человека. Новый МРТ содержит также последовательности трапслокационного домена дифтерийного токсина (ДТокс), для обеспечения выхода транспортера из замкнутых внутриклеточных компартментов - эндосом, сигнала ядерной локализации большого Т-антигеиа вируса SV-40 (СЯЛ SV40), а также бактериального гемоглобиноподобного белка (НМР), служащего носителем для ФС. Молекула ЭФР более чем в четыре раза превосходит по размеру использованный в предыдущих работах лигандный модуль - а-меланоцит-стимулирующий гормон. Такое изменение конструкции МРТ может сказаться па его функционировании. Включение нескольких пептидных модулей в состав единой полипептидпой цепи также может существенно отразиться на их способности вступать во взаимодействия с ключевыми участниками транспорта МРТ и, как следствие, на эффективности транспорта. В связи с этим представляется актуальным исследование влияния особенностей взаимодействий МРТ с клеточными компонентами транспорта па эффективность фотоцитотоксического действия ФС, присоединенного к МРТ. Полезным инструментом для исследования взаимного влияния модулей в составе единой белковой молекулы па эффективность доставки ФС является использование транспортеров, дефицитных по одному из функциональных модулей.

Целыо настоящей работы было исследование влияния структуры и состава модульных рекомбинантных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки ФС, содержащих эпидермальпый фактор роста в качестве лигапда, на их функциональные свойства и эффективность действия.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие практические задачи:

• Исследовать особенности взаимодействия отдельных модулей рекомбинантных транспортеров (лиганда, эндосомолитика и сигнала ядерной локализации) с соответствующими клеточными компонентами транспорта в зависимости от модульного состава транспортеров.

• Исследовать эффективность фотодипамического действия коныогатов фотосенсибилизаторов с модульными рекомбипантными транспортерами на клетках in vitro.

• Проанализировать взаимное влияние отдельных модулей на функционирование остальных модулей и транспортеров в целом.

2. Обзор литературы

2.1. Фотодинамичсская терапия

В настоящее время все большее распространение в клинической онкологии находят новые методы диагностики и лечения опухолевых заболеваний, основанные на современных достижениях фотохимии, фотобиологии и квантовой физики. Одним из таких перспективных подходов является фотодинамическая терапия -современный метод лечения рака, заключающегося в уничтожении клеток опухоли после облучения её светом, поглощаемым ФС, который накопился в этой опухоли. При этом происходит образование активных форм кислорода, таких как синглетпый кислород, супероксид-анион радикал, гидрокеильный радикал и др., мишенями для которых в клетке служат различные молекулы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) и образуемые ими надмолекулярные структуры. В результате сложной последовательности фотохимических и фотобиологических процессов происходит необратимое разрушение раковых клеток и/или сосудистой системы опухоли.

Идея использования фотоактивируемых химических соединений для лечения различных заболеваний далеко не нова: еще в Древнем Египте применяли растения, содержащие псоралепы, и солнечный свет для лечения витилиго (заболевание кожи), однако, научное объяснение данному явлению было дано лишь в первой половине XX века. Применение в клинике этот подход получил только в конце семидесятых годов прошлого столетия, когда для лечения рака кожи была успешно использована смесь производных гематопорфирина (ПГП), состоящая из мономеров, димеров и олигомеров порфирипа (Dougherty et al., 1978). Позднее компанией QLTPhotoTherapeutics (Ванкувер, Канада) был запатентован первый препарат для ФДТ - Фотофрин®, представляющий собой очищенную смесь ПГП. Несмотря на то, что во многих странах Фотофрин® и по сей день достаточно успешно используют для лечения некоторых видов рака (легких, кожи, молочной железы и др.), а также некоторых пеонкологических заболеваний, этот препарат имеет два существенных недостатка. Во-первых, ПГП накапливаются в раковых клетках неспецифически и очень медленно выводятся из организма, оставаясь в организме в течение 2-3 месяцев, что приводит к повышенной фоточувствительности кожи и сетчатки глаз (Sharman et al., 1999). Во-вторых, спектральные характеристики Фотофрииа® не удовлетворяют одному из важных требований, предъявляемому к ФС, — они должны иметь интенсивный максимум поглощения в красной и ближней инфракрасной области спектра (660 - 900 им), так как с увеличением длины волны света возрастает его способность проникать в животные ткани. Небольшой пик при 630 им в спектре поглощения Фотофрина® не позволяет использовать его для эффективной ФДТ обширных и глубокорасположепных опухолей (Миронов, 1996; Sharman et al., 1999).

Большое количество новых ФС было создано за последние 20 - 30 лет и продолжает разрабатываться и по сей день. Их можно разделить на 3 больших группы: 1) ФС на основе порфирина (Фотофрин и др.), 2) ФС на основе хлорофилла (хлорины, пурпурины, бактериохлорины) и 3) красители (фталоцианины и др.). Большинство ФС, используемых в настоящее время в клинике, принадлежат к первой группе. Традиционно, производные порфиринов и другие фотосенсибилизаторы, созданные в 1970-х - начале 1980-х годов, относят к ФС первого поколения, ко второму поколению ФС относят порфирины и другие пигменты, появившиеся в конце 1980-х годов, в настоящее время разрабатываются ФС третьего поколения (Huang, 2005). Формулы некоторых фогосепсибилизаторов приведены на рис. 1.

Основные требования, предъявляемые к разрабатываемым ФС, можно сформулировать следующим образом (Sternbeerg et al., 1998; Detty et al., 2004): высокая химическая чистота препарата; высокий выход АФК (в первую очередь сипглетного кислорода); низкая темновая токсичность; высокая устойчивость при хранении и при введении в организм; интенсивная полоса поглощения в области 660 - 900 им; высокая специфичность накопления в раковых клетках; слабое накопление в коже; высокая скорость выведения из организма.

H02C(H2C)2

Na-02C(H2C)2.

CH2)2C02"Na*

CH2)2C02 Na'

Фотофрин®

CH2)2C02 Na'

-(CH2}2C02Na'

R = CH;,CHOH или CH2CH

NH2CH2C0CH2CH2C02H --

5-амимолевулиновая кислота н3сос

С2Н5

COOH

Бактернохлорин р X. -.N. Г V ' х.

Фталоцианип но2с„ ч^-со2н

Протопорфирин IX н3со. лен.

Н3СО'

ОСНз

Порфицсн

Гх

•у4

N. X \

Нафталоцианин

Л/с. 1. Структура некоторых фотосенсибилизаторов.

Другим направлением в ФДТ является предложенный канадским ученым Д. Кеннеди метод, основанный на таком регулировании биосинтеза порфиринов, при котором в опухоли в избытке образуются эндогенные порфирины. Метод Кеннеди предполагает местное нанесение предшественника всех порфиринов, образующихся в организме человека, 5-амииолевулиновой кислоты в виде крема, при этом отпадает необходимость введения в организм внешних ФС (Миронов, 1996).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Гилязова, Динара Гафуровна

7. Выводы

1. Показано, что эпидермальный фактор роста в составе модульных рекомбинантных транспортеров обеспечивает им проникновение внутрь клеток эпидермоидпой карциномы человека линии А431 с повышенной экспрессией рецепторов эпидермального фактора роста.

2. Методом регистрации поверхностного плазмонпого резонанса показано, что сигнал ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40 в составе модульных рекомбинантных транспортеров способен эффективно взаимодействовать с комплексом а- и p-импортинов, который опосредует цитоплазмепо-ядерный транспорт.

3. Продемонстрировано, что модульные рекомбипаптные транспортеры, содержащие транслокационпый домен дифтерийного токсина, способны нарушать целостность липосом в диапазоне рН 5,5 - 6,5.

4. Показано, что наличие в модульном рекомбинантном транспортере эндосомолитического модуля снижает его внутриклеточную протеолитическую деградацию.

5. Наличие, место расположения и эффективность функционирования модулей транспортера влияют на фотоцитотоксическое действие фотосепсибилизатора, доставляемого модульным рекомбинаптным транспортером.

6. Показано, что присоединение фотосенсибилизатора хлорина е6 к транспортерам для адресной доставки, содержащим сигнал ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40 позволяет повысить эффективность его фотоцитотоксического действия на клетки А431 более чем в 3000 раз.

6. Заключение

Использование МРТ, содержащих ЭФР в качестве лиганда, для специфической доставки фотосенсибилизатора хлорина е6 в ядра клеток эпидермоидной карциномы человека линии А431 позволяет повысить эффективность его фотоцитотоксического действия более чем в 3000 раз. Величина фотоцитотоксического эффекта зависит от состава и расположения в молекуле транспортера модулей, определяющих спектр функциональной активности МРТ па различных этапах специфического транспорта из внеклеточного пространства в ядро клетки.

Необходимым условием эффективной внутриклеточной доставки ФС в ядра клеток-мишеней является эффективное функционирование каждого из модулей молекулы МРТ, которое мы оценивали по способности транспортеров вступать во взаимодействия с соответствующими компонентами клетки, опосредующими внутриклеточный транспорт макромолекул. Функциональная активность каждого из исследованных модулей зависит от его местоположения в последовательности молекулы транспортера. Эффективное функционирование каждого из модулей позволяет увеличивать эффективность действия МРТ, оцениваемую по величине фотоцитотоксического эффекта присоединенного к нему ФС.

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что дальнейшее увеличение эффективности ядерной доставки ФС с помощью полноразмерного транспортера ДТокс-ЯМР-(СЯЛ 5У40)-сп-ЭФР возможно за счет оптимизации его структуры таким образом, чтобы все функциональные модули обладали максимумом присущей им активности. Такая оптимизация может быть достигнута, например, за счет введения в состав транспортера дополнительных спейссрпых последовательностей между модулями, или, наоборот, делений в модуле НМР, которые позволят разнести в пространстве С- и N-концевые участки белковой молекулы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гилязова, Динара Гафуровна, Москва

1. Ахлынина Т.В., Гулак П.В., Серебрякова П.В., Розенкранц A.A., and Соболев А.С. Фотодинамическое действие конъюгата конканавалина А с хлорином еб па фибробласты человека. // Бюлл. эксп. биол. мед. 1990. - V. 109.-Р. 150-152.

2. Варфоломеев С.Д. и Зайцев С.В. Кинетические методы в биохимических исследованиях. М.: Издательство Московского университета, 1982.-С. 180270.

3. Геннис Р.Б. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997.-Р. 396-453.

4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У. и Джонс К. Справочник биохимика. -М.:Мир, 1991.-Р. 464-467.

5. Мапиатис Т., Фрич Э. и Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-420 с.

6. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей // Соросовский образовательный журнал - 1996. - Р. 32 - 40.

7. Никольский Н.Н., Соркин А.Д. и Соркин А.Б. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука, 1987. 200 с.

8. Урбах B.IO. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. - С. 234 - 247. ф 11. Abels С., Fickweiler S., Weiderer P., Baumler W., Ilofstadter F., Landthaler

9. M., and Szeimies R.M. Indocyanine green (ICG) and laser irradiation induce photooxidation // Arch. Dermatol. Res. 2000. - V. 292. - P. 404 - 411.

10. Akhlynina T.V., Jans D.A., Rosenkranz A.A., Statsyuk N.V., Balashova I.Y., Toth G., Pavo I., Rubin А.В., and Sobolev A.S. Nuclear targeting of chlorin c6 enhances its photosensitizing activity // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 20328 -20331.

11. Akhlynina T.V., Rosenkranz A.A., Jans D.A., and Sobolev A.S. Insulin-mediated intracellular targeting enhances the photodynamic activity of chlorin e6 // Cancer Res.- 1995.-V. 55.-P. 1014-1019.

12. Akhlynina T.V., Rosenkranz A.A., Jans D.A., Gulak P.V., Serebryakova N.V., and Sobolev A.S. The use of internalizable derivatives of chlorin E6 for increasing its photosensitizing activity // Photochem. Photobiol. 1993. - V. 58. - P. 45 -48.

13. Alder G.M., Bashford C.L., and Pasternak C.A. Action of diphtheria toxindoes not depend on the induction of large, stable pores across biological membranes // J. Membr. Biol. 1990. - V. 113. - P. 67 - 74.

14. Ali S.M. and Olivo M. Bio-distribution and subcellular localization of Hypericin and its role in PDT induced apoptosis in cancer cells // Int. J. Oncol. -2002. V. 21.-P. 531 -540.

15. Allen C.M., Sharman W.M., La Madeleine C., Weber J.M., Langlois R., Ouellet R., and van Lier J.E. Photodynamic therapy: tumor targeting with adenoviral proteins // Photochem. Photobiol. 1999. - V. 70. - P. 512 - 523.

16. Ф 19. AloufJ.E, Freer J.H. (Eds) The comprehensive sourcebook of bactcrialtoxins. London: Academic Press, 1999. - 718 p.

17. Bachor R., Shea C.R., Gillies R., and Hasan T. Photosensitized destruction of human bladder carcinoma cells treated with chlorin e6-conjugated microspheres // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991.-V. 88.-P. 1580- 1584.

18. Berg K. and Moan J. Lysosomes and microtubules as targets for photochemotherapy of cancer // Photochem. Photobiol. 1997. - V. 65. - P. 403 -409.

19. Berg K., Anholt H., Moan J., Ronnestad A., and Rimington C. Photobiological properties of hematoporphyrin diesters: evaluation for possible application in photochemotherapy of cancer // J. Photochem. Photobiol. В 1993. -V. 20.-P. 37-45.

20. BischoffF.R. and Ponstingl H. Catalysis of guanine nucleotide exchange of Ran by RCC1 and stimulation of hydrolysis of Ran-bound GTP by Ran-GAPl // Methods Enzymol- 1995.-V. 257.-P. 135 144.

21. Bisland S.K., Singh D., and Gariepy J. Potentiation of chlorin еб photodynamic activity in vitro with peptide-based intracellular vehicles // Bioconjug. Chem. 1999. - V. 10. - P. 982 - 992.

22. Blewitt M.G., Chung L.A., and London E. Effect of pi I on the conformation of diphtheria toxin and its implications for membrane penetration // Biochemistry -1985.-V. 24.-P. 5458- 5464.

23. Blondelle S.E. and Houghten R.A. Hemolytic and antimicrobial activities of the twenty-four individual omission analogues of melittin // Biochemistry 1991. -V. 30.-P. 4671 -4678.

24. Brodsky F.M., Chen C.Y., Knuehl C., Towler M.C., and Wakeham D.E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. - V. 17. - P. 517 - 568.

25. Carpenter G. and Cohen S. Epidermal growth factor // Annu. Rev. Biochem. -1979.-V. 48.-P. 193-216.

26. Carthy C.M., Granville D.J., Jiang H., Levy J.G., Rudin C.M., Thompson C.B., McManus B.M., and Hunt D.W. Early release of mitochondrial cytochrome с and expression of mitochondrial epitope 7A6 with a porphyrin-derived photosensitizer:

27. Bcl-2 and Bcl-xL overexpression do not prevent early mitochondrial events but still depress caspase activity // Lab Invest 1999. - V. 79. - P. 953 - 965.

28. Catimel В., Teh Т., Fontes M.R., Jennings I.G., Jans D.A., Howlett G.J., Nice E.C., and Kobe B. Biophysical characterization of interactions involving importin-alpha during nuclear import // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 34189 - 34198.

29. Cavanaugh P.G. Synthesis of chlorin e6-transferrin and demonstration of its light-dependent in vitro breast cancer cell killing ability // Breast Cancer Res. Treat. -2002,-V. 72.-P. 117-130.

30. Ceresa B.P. and Schmid S.L. Regulation of signal transduction by endocytosis // Curr. Opin. Cell Biol. 2000. - V. 12. - P. 204 - 210.

31. Chen J.Y., Cheung N.H., Fung M.C., Wen J.M., Leung W.N., and Мак N.K. Subcellular localization of merocyanine 540 (MC540) and induction of apoptosis in murine myeloid leukemia cells // Photochem. Photobiol. 2000. - V. 72. - P. 114120.

32. Chen Q., Huang Z., Chen H., Shapiro H., Beckers J., and Iletzel F.W. Improvement of tumor response by manipulation of tumor oxygenation during photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 2002. - V. 76. - P. 197 - 203.

33. Chen Y.J., Zhang P., Egelman E.H., and Hinshaw J.E. The stalk region of dynamin drives the constriction of dynamin tubes // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. -V. 11.-P. 574- 575.

34. Coutavas E., Ren M., Oppenheim J.D., D'Eustachio P., and Rush M.G. Characterization of proteins that interact with the cell-cycle regulatory protein Ran/TC4 // Nature 1993. - V. 366. - P. 585 - 587.

35. Cronshavv J.M., Krutchinsky A.N., Zhang W., Chait B.T., and Matunis M.J. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex // J. Cell Biol. 2002. -V. 158.-P. 915 -927.

36. Damoiseau X., Schuitmaker H.J., Lagcrberg J.W., and Hoebeke M. Increase of the photosensitizing efficiency of the Bacteriochlorin a by liposome-incorporation // J. Photochem. Photobiol. В 2001. - V. 60. - P. 50 - 60.

37. Delaey H.M., Obermueller R., Zupko I., De Vos D., Falk H., and De Witte P.A. In vitro study of the photocytotoxicity of some hypericin analogs on different

38. Ф cell lines // Photochem. Photobiol. 2001. - V. 74. - P. 164 - 171.

39. Derycke A.S. and De Witte P.A. Transferrin-mediated targeting of hypericin embedded in sterically stabilized PEG-liposomes // Int. J. Oncol. 2002. - V. 20. - P. 181 - 187.

40. Detty M.R., Gibson S.L., and Wagner S.J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy // J. Med. Chem. 2004. - V. 47. -P. 3897-3915.

41. Dietzen D.J., Hastings W.R., and Lublin D.M. Caveolin is palmitoylated on multiple cysteine residues. Palmitoylation is not necessary for localization of caveolin to caveolae // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 6838 - 6842.

42. Dingwall C. and Laskey R.A. Nuclear targeting sequences-a consensus? //

43. Trends Biochem. Sci. 1991. - V. 16.-P. 478-481.

44. Dougherty T.J., Kaufman J.E., Goldfarb A., Weishaupt K.R., Boyle D., and Mittleman A. Photoradiation therapy for the treatment of malignant tumors // Cancer Res. 1978. - V. 38. - P. 2628 - 2635.

45. Fahrenkrog В., Koser J., and Aebi U. The nuclear pore complex:a jack of all trades? // TRENDS in Biochemical Sciences 2004. - V. 29. - P. 175 - 182.

46. Falnes P.O. and Olsnes S. Modulation of the intracellular stability and toxicity of diphtheria toxin through degradation by the N-end rule pathway // EMBO J. -1998. V. 17. -P. 615 - 625.

47. Fanuel-Barret D., Patrice Т., Foultier M.T., Vonarx-Coinsmann V., Robillard N., and Lajat Y. Influence of epidermal growth factor on photodynamic therapy of glioblastoma cells in vitro // Res. Exp. Med. (Berl) 1997. - V. 197. - P. 219 - 233.

48. Finlay G.J., Baguley B.C., and Wilson W.R. A semiautomated microculture method for investigating growth inhibitory effects of cytotoxic compounds on exponentially growing carcinoma cells // Anal. Biochem. 1984. - V. 139. - P. 272• 277.

49. Fisher K.J. and Wilson J.M. The transmembrane domain of diphtheria toxin improves molecular conjugate gene transfer // Biochem. J. 1997. - V. 321 ( Pt 1). -P. 49-58.

50. Ford A.C. and Grandis J.R. Targeting epidermal growth factor receptor in head and neck cancer // Head Neck 2003. - V. 25. - P. 67 - 73.

51. Francis G.E., Delgado C., Fisher D., Malik F., and Agrawal A.K. Polyethylene glycol modification: relevance of improved methodology to tumour targeting // J. Drug Target 1996. - V. 3. - P. 321 - 340.

52. Gascard P., Nunomura W., Lee G., Walensky L.D., Krauss S.W., Takakuwa Y., Chasis J.A., Mohandas N., and Conboy J.G. Deciphering the nuclear import pathway for the cytoskeletal red cell protein 4.1R // Mol. Biol. Cell 1999. - V. 10. -P. 1783 - 1798.

53. J. Clin. Invest 2000.-V. 105.-P. 9- 13.

54. Goff B.A., I-Iermanto U., Rumbaugh J., Blake J., Bamberg M., and Hasan T. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model // Br. J. Cancer 1994. - V. 70. - P. 474 -480.

55. Gorlich D. and Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport // Sciencc 1996. -V. 271.-P. 1513 - 1518.

56. Greber U.F., Willetts M., Webster P., and Helenius A. Stepwise dismantling of adenovirus 2 during entry into cells // Cell 1993. - V. 75. - P. 477 - 486.

57. Greene В., Liu S.H., Wilde A., and Brodsky F.M. Complete reconstitution of clathrin basket formation with recombinant protein fragments: adaptor control of clathrin self-assembly // Traffic. 2000. - V. 1. - P. 69 - 75.

58. Hall M.N., Craik C., and Hiraoka Y. Homeodomain of yeast repressor alpha 2 contains a nuclear localization signal // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1990. - V. 87. -P. 6954-6958.

59. Hamblin M.R., Miller J.L., and Ortel B. Scavenger-receptor targeted photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 2000. - V. 72. - P. 533 - 540.

60. Hammond K., Caputo G.A., and London E. Interaction of the membrane-inserted diphtheria toxin T domain with peptides and its possible implications for chaperone-like T domain behavior // Biochemistry 2002. - V. 41. - P. 3243 - 3253.

61. Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. / Ed.:Gregory J., Molecular Probes, 2002. - P. 338 - 342.

62. Heilker R., Manning-Krieg U., Zuber J.F., and Spiess M. In vitro binding of clathrin adaptors to sorting signals correlates with endocytosis and basolateral sorting // EMBO J. 1996. - V. 15. - P. 2893 - 2899.

63. Henderson B.W. and Dougherty T.J. How does photodynamic therapy work? // Photochem. Photobiol. 1992. - V. 55. - P. 145 - 157.

64. Henderson B.W. and Fingar V.H. Relationship of tumor hypoxia and response to photodynamic treatment in an experimental mouse tumor // Cancer Res. 1987. -V. 47.-P. 3110-3114.

65. Hommelgaard A.M., Roepstorff K., Vilhardt F., Torgersen M.L., Sandvig K., and van Deurs B. Caveolae: stable membrane domains with a potential for internalization // Traffic. 2005. - V. 6. - P. 720 - 724.

66. HopfF.R., Whiten D.G. Chemical transformation involving photocxcited porphyrins and metalloporphyrins. // In: Dolphin D. (Ed.). The porphyrins: structure and synthesis. New York: Academic Press, 1978. -V. 2. - P. 161 - 195. - Part B.

67. IIu L.K., Hasan Т., Gragoudas E.S., and Young L.H. Photoimmunotherapy of human uveal melanoma cells // Exp. Eye Res. 1995. - V. 61. - P. 385 - 391.

68. Huang Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy // Technol. Cancer Res. Treat. 2005. - V. 4. - P. 283 - 293.

69. Hubner S., Xiao C.Y., and Jans D.A. The protein kinase CK2 site (Ser 111/112) enhances recognition of the simian virus 40 large T-antigen nuclear localization sequence by importin // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 17191 -17195.

70. Hudson Т.Н. and Neville D.M., Jr. Quantal entry of diphtheria toxin to the cytosol // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 2675 - 2680.

71. Hutchinson F. The distance that a radical formed by ionizing radiation can diffuse in a yeast cell // Radiat. Res. 1957. - V. 7. - P. 473 - 483.

72. Ilari A., Bonamore A., Farina A., Johnson K.A., and Boffi A. The X-ray structure of ferric Escherichia coli flavohemoglobin reveals an unexpected geometry of the distal heme pocket // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 23725-23732.

73. Imamoto N., Tachibana Т., Matsubae M., and Yoneda Y. A karyophilic protein forms a stable complex with cytoplasmic components prior to nuclear pore

74. Ф binding//J. Biol. Chem. 1995b.-V. 270.-P. 8559- 8565.

75. Jans D.A. Nuclear signaling pathways for polypeptide ligands and their membrane receptors? // FASEB J. 1994. - V. 8. - P. 841 - 847.

76. Jans D.A. and Hubner S. Regulation of protein transport to the nucleus: central role of phosphorylation// Physiol Rev. 1996.-V. 76. - P. 651 -685.

77. Jans D.A., Ackermann M.J., Bischoff J.R., Beach D.H., and Peters R. p34cdc2-mediated phosphorylation at T124 inhibits nuclear import of SV-40 T antigen proteins// J. Cell Biol. 1991. - V. 115. - P. 1203 - 1212.

78. Jiang F., Lilge L., Grenier J., Li Y., Wilson M.D., and Chopp M. Photodynamic therapy of U87 human glioma in nude rat using liposome-delivcred• photofrin // Lasers Surg. Med. 1998. - V. 22. - P. 74 - 80.

79. Jiang G.S., Solow R., and Hu V.W. Characterization of diphtheria toxin-induced lesions in liposomal membranes. An evaluation of the relationship between toxin insertion and "channel" formation // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 13424-13429.

80. Jiang R., Gao В., Prasad K., Greene L.E., and Eisenberg E. Hsc70 chaperoncs clathrin and primes it to interact with vesicle membranes // J. Biol. Chem. 2000. -V. 275.-P. 8439- 8447.

81. Jorissen R.N., Walker F., Pouliot N., Garrett T.P., Ward C.W., and Burgess A.W. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling // Exp. Cell Res. 2003. - V. 284. - P. 31 - 53.

82. Kagan B.L., Finkelstein A., and Colombini M. Diphtheria toxin fragment forms large pores in phospholipid bilayer membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Aф 1981.-V. 78.-P. 4950-4954.

83. Kalderon D., Roberts B.L., Richardson W.D., and Smith A.E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location // Cell 1984. - V. 39. - P. 499 - 509.

84. Kessel D. and Poretz R.D. Sites of photodamage induced by photodynamic therapy with a chlorin e6 triacetoxymethyl ester (CAME) // Photochem. Photobiol. -2000.-V. 71.-P. 94-96.

85. Kessel D., Luo Y., Deng Y., and Chang C.K. The role of subcellular localization in initiation of apoptosis by photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 1997. - V. 65. - P. 422 - 426.

86. Kessel D., Woodburn K., Gomer C.J., Jagerovic N., and Smith K.M. Photosensitization with derivatives of chlorin p6 // J. Photochem. Photobiol. В -1995.-V. 28. P. 13-18.

87. Khan E.H., Ali H., Tian H., Rousseau J., Tessier G., Shafiullah, and van Lier J.E. Synthesis and biological activities of phthalocyanine-estradiol conjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett.-2003.-V. 13.-P. 1287- 1290.

88. Kirchhausen Т., Bonifacino J.S., and Riezman H. Linking cargo to vesicle formation: receptor tail interactions with coat proteins // Curr. Opin. Cell Biol. -1997.-V. 9.-P. 488-495.

89. Kolibaba K.S. and Druker B.J. Protein tyrosine kinases and cancer // Biochim. Biophys. Acta 1997. - V. 1333. - P. F217 - F248.

90. Konan Y.N., Chevallier J., Gurny R., and Allemann E. Encapsulation of p-THPP into nanoparticles: cellular uptake, subcellular localization and effect of serum on photodynamic activity // Photochem. Photobiol. 2003. - V. 77. - P. 638 - 644.

91. Kundu S. and Jernigan R.L. Molecular mechanism of domain swapping in proteins: an analysis of slower motions // Biophysical Journal 2004. - V. 86. - P. 3846 -3854.

92. Kurzchalia T.V. and Parton R.G. Membrane microdomains and caveolae // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. - V. 11. - P. 424 - 431.

93. Kwok T.T. and Sutherland R.M. Differences in EGF related radiosensitisation of human squamous carcinoma cells with high and low numbers of EGF receptors // Br. J. Cancer 1991. - V. 64. - P. 251 - 254.

94. Leach M.W., Higgins R.J., Autry S.A., Boggan J.E., Lee S.J., and Smith K.M. In vitro photodynamic effects of lysyl chlorin p6: cell survival, localization and ultrastructural changes // Photochem. Photobiol. 1993. - V. 58. - P. 653 - 660.

95. Lemmon S.K. Clathrin uncoating: Auxilin comes to life // Curr. Biol. 2001. -V. ll.-P. R49-R52.

96. Li H., Jacque A., Wang F., and Byrnes R.W. Diffusion distances of known iron complexes in model systems // Free Radic. Biol. Med 1999. - V. 26. - P. 61 -72.

97. Liang H., Shin D.S., Lee Y.E., Nguyen D.C., Kasravi S., Do Т., Aurasteh P., and Berns M.W. Subcellular Phototoxicity of Photofrin-II and Lutetium Texaphyrin in Cells In Vitro// Lasers Med Sci-2000.-V. 15.-P. 109- 122.

98. Lin S.Y., Makino K., Xia W., Matin A., Wen Y., Kvvong K.Y., Bourguignon L., and Hung M.C. Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a transcription factor // Nat. Cell Biol. 2001. - V. 3. - P. 802 - 808.

99. Luo Y. and Kessel D. Initiation of apoptosis versus necrosis by photodynamic therapy with chloroaluminum phthalocyanine // Photochem. Photobiol. 1997. - V. 66.-P. 479 -483.

100. Mattaj I.W. and Englmcier L. Nucleocytoplasmic transport: the soluble phase // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V. 67. - P. 265 - 306.

101. Mendelsohn J. and Basclga J. The EGF receptor family as targets for cancer therapy // Oncogene 2000. - V. 19. - P. 6550 - 6565.

102. Michael W.M., Choi M., and Dreyfuss G. A nuclear export signal in hnRNP Al: a signal-mediated, temperature-dependent nuclear protein export pathway // Cell 1995.-V. 83. - P. 415 - 422.

103. Moan J. and Berg K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen // Photochem. Photobiol. 1991. - V. 53.ф P. 549-553.

104. Monier S., Parton R.G., Vogel F., Behlke J., Henske A., and Kurzchalia T.V. VIP21-caveolin, a membrane protein constituent of the caveolar coat, oligomerizes in vivo and in vitro // Mol. Biol. Cell 1995. - V. 6. - P. 911 - 927.

105. Murata M., Peranen J., Schreiner R., Wieland F., Kurzchalia T.V., and Simons K. VIP21/caveolin is a cholesterol-binding protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A1995.-V. 92.-P. 10339 10343.

106. Niedre M.J., Secord A.J., Patterson M.S., and Wilson B.C. In vitro tests of the validity of singlet oxygen luminescence measurements as a dose metric in photodynamic therapy // Cancer Res. 2003. - V. 63. - P. 7986 - 7994.

107. Noodt B.B., Berg K., Stokke Т., Peng Q., and Nesland J.M. Different apoptotic pathways are induced from various intracellular sites by tetraphenylporphyrins and light // Br. J. Cancer 1999. - V. 79. - P. 72 - 81.

108. Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours//J. Photochem. Photobiol. В 1997. -V. 39. -P. 1-18.

109. Oh K.J., Senzel L., Collier R.J., and Finkelstein A. Translocation of the catalytic domain of diphtheria toxin across planar phospholipid bilayers by its own T domain // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1999. - V. 96. - P. 8467 - 8470.

110. Oh P., Mcintosh D.P., and Schnitzer J.E. Dynamin at the neck of caveolae mediates their budding to form transport vesicles by GTP-driven fission from the plasma membrane of endothelium// J. Cell Biol. 1998. - V. 141. - P. 101 - 114.

111. Oku N., Namba Y., and Okada S. Tumor accumulation of novel RES-avoiding liposomes // Biochim. Biophys. Acta 1992. - V. 1126. - P. 255 - 260. ф 123. Opanasopit P., Sakai M., Nishikawa M., Kawakami S., Yamashita F., and

112. Hashida M. Inhibition of liver metastasis by targeting of immunomodulators using mannosylated liposome carriers // J. Control Release 2002. - V. 80. - P. 283 - 294.

113. Owen D.J., Vallis Y., Pearse B.M., McMahon H.T., and Evans P.R. The structure and function of the beta 2-adaptin appendage domain // EMBO J. 2000. -V. 19.-P. 4216-4227.

114. Page L.J. and Robinson M.S. Targeting signals and subunit interactions in coated vesicle adaptor complexes // J. Cell Biol. 1995. - V. 131. - P. 619 - 630.

115. Pajonk F. and McBride W.H. The proteasome in cancer biology and treatment // Radiat. Res. 2001. - V. 156. - P. 447 - 459.

116. Papini E., Rappuoli R., Murgia M., and Montecucco C. Cell penetration ofdiphtheria toxin. Reduction of the interchain disulfide bridge is the rate-limiting step of translocation in the cytosol // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268.-P. 1567- 1574.

117. Parton R.G. and Richards A.A. Lipid rafts and caveolae as portals for endocytosis: new insights and common mechanisms // Traffic. 2003. - V. 4. - P. 724-738.

118. Parton R.G., Way M., Zorzi N., and Stang E. Caveolin-3 associates with developing T-tubules during muscle differentiation // J. Cell Biol. 1997. - V. 136. -P. 137- 154.

119. Paschal B.M. and Gerace L. Identification of NTF2, a cytosolic factor for nuclear import that interacts with nuclear pore complex protein p62 // J. Cell Biol. -1995.-V. 129.-P. 925 -937.

120. Pearse B.M., Smith C.J., and Owen D.J. Clathrin coat construction in endocytosis // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. - V. 10. - P. 220 - 228.

121. Pemberton L.F., Blobel G., and Rosenblum J.S. Transport routes through the nuclear pore complex // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V. 10. - P. 392 - 399.

122. Pharmacia . Polyacrilamide gel electrophoresis laboratory techniques, revised edition. 1990.

123. Polo L., Valduga G., Jori G., and Reddi E. Low-density lipoprotein rcccptors in the uptake of tumour photosensitizers by human and rat transformed fibroblasts // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. - V. 34. - P. 10 - 23.

124. Reddi E. Role of delivery vehicles for photosensitizers in the photodynamic therapy of tumours // J. Photochem. Photobiol. В 1997. - V. 37. - P. 189 - 195.

125. Reddy J.A., Dean D., Kennedy M.D., and Low P.S. Optimization of folate-conjugated liposomal vectors for folate rcceptor-mediated gene therapy // J. Pharm. Sci. 1999. - V. 88.-P. 1112-1118.

126. Ren J., Kachel K., Kim H., Malenbaum S.E., Collier R.J., and London E. Interaction of diphtheria toxin T domain with molten globulc-likc proteins and its implications for translocation // Science 1999. - V. 284. - P. 955 - 957.

127. Rihova B. Receptor-mediated targeted drug or toxin delivery // Adv. Drug Dcliv. Rev. 1998. - V. 29. - P. 273 - 289.

128. Robbins J., Dilworth S.M., Laskey R.A., and Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a classof bipartite nuclear targeting sequence // Cell 1991. - V. 64. - P. 615 - 623.

129. Robinson M.S. The role of clathrin, adaptors and dynamin in endocytosis // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. - V. 6. - P. 538 - 544. Ф 145. Rosenkranz A.A., Antonenko Y.N., Smirnova O.A., Yurov G.K., Naroditsky

130. B.S., and Sobolev A.S. Avian adenovirus induces ion channels in model bilayer lipid membranes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V. 236. - P. 750 - 753.

131. Rothberg K.G., Heuser J.E., Donzell W.C., Ying Y.S., Glenney J.R., and Anderson R.G. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats // Cell• 1992.-V. 68.-P. 673 -682.

132. Salomon D.S., Brandt R., Ciardiello F., and Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies // Crit Rev. Oncol. Hematol. 1995. - V. 19. - P. 183 - 232.

133. Sandvig K. and Olsnes S. Diphtheria toxin-induced channels in Vero cells selective for monovalent cations // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 1235212359.

134. Schatz G. and Dobberstein B. Common principles of protein translocation across membranes // Science 1996. - V. 271. - P. 1519 - 1526.

135. Schmid S.L. Clathrin-coated vesicle formation and protein sorting: an integrated process // Annu. Rev. Biochem. 1997. - V. 66. - P. 51 1 - 548.

136. Schmidt-Erfurth U., Diddens H., Birngruber R., and Ilasan T. Photodynamic targeting of human retinoblastoma cells using covalent low-density lipoprotein conjugates//Br. J. Cancer 1997.-V. 75.-P. 54-61.

137. Schmidt-Erfurth U., Flotte T.J., Gragoudas E.S., Schomacker K., Birngruber R., and Hasan T. Benzoporphyrin-lipoprotein-mediated photodestruction of intraocular tumors // Exp. Eye Res. 1996. - V. 62. - P. 1-10.

138. Schroit A.J., Madsen J., and Nayar R. Liposome-cell interactions: in vitro discrimination of uptake mechanism and in vivo targeting strategies to mononuclear phagocytes // Chem. Phys. Lipids 1986. - V. 40. - P. 373 - 393.

139. Scourides P.A., Bohmer R.M., Kaye A.H., and Morstyn G. Nature of the tumor-localizing components of hematoporphyrin derivative // Cancer Res. 1987. -V. 47.-P. 3439-3445.

140. Senzel L., Huynh P.D., Jakes K.S., Collier R.J., and Finkelstein A. The diphtheria toxin channel-forming T domain translocates its own NH2-terminal region across planar bilayers // J. Gen. Physiol 1998. - V. 112. - P. 317 - 324.

141. Sharman W.M., Allen C.M., and van Lier J.E. Photodynamic therapeutics: basic principles and clinical applications // Drug Discov. Today 1999. - V. 4. - P. 507 -517.

142. Sharman W.M., van Lier J.E., and Allen C.M. Targeted photodynamic therapy via receptor mediated delivery systems // Adv. Drug Deliv. Rev. 2004. - V. 56. - P. 53 -76.

143. Sharpe J.C. and London E. Diphtheria toxin forms pores of different sizes depending on its concentration in membranes: probable relationship to oligomerization // J. Membr. Biol. 1999. - V. 171. - P. 209 - 221.

144. Shiver J.W. and Donovan J.J. Interactions of diphtheria toxin with lipid vesicles: determinants of ion channel fonnation // Biochim. Biophys. Acta 1987. -V. 903.-P. 48- 55.

145. Silverman J.A., Mindell J.A., Finkelstein A., Shen W.H., and Collier R.J. Mutational analysis of the helical hairpin region of diphtheria toxin transmembrane domain // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 22524 - 22532.

146. Smythe E. and Warren G. The mechanism of receptor-mediated endocytosis // Eur. J. Biochem. 1991. - V. 202. - P. 689 - 699.

147. Sobolev A.S., Akhlynina T.V., Yachmenev S.V., Rosenkranz A.A., and Severin E.S. Internalizable insulin-BSA-chlorin E6 conjugate is a more effective photosensitizer than chlorin E6 alone // Biochem. Int. 1992. - V. 26. - P. 445 - 450.

148. Sobolev A.S., Jans D.A., and Rosenkranz A.A. Targeted intracellular delivery of photosensitizers // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2000. - V. 73. - P. 51 - 90.

149. Song B.D. and Schmid S.L. A molecular motor or a regulator? Dynamin's in a class of its own//Biochemistry-2003.-V. 42.-P. 1369- 1376.

150. Stahlhut M. and van Deurs B. Identification of filamin as a novel ligand for caveolin-1: evidence for the organization of caveolin-1 -associated membrane domains by the actin cytoskeleton // Mol. Biol. Cell 2000. - V. 11. - P. 325 - 337.

151. Stender I.M., Bech-Thomsen N., Poulsen Т., and Wulf Ы.С. Photodynamic therapy with topical delta-aminolevulinic acid delays UV photocarcinogenesis in hairless mice // Photochem. Photobiol. 1997. - V. 66. - P. 493 - 496.

152. Sternbeerg E.D., Dolphin D„ and Bruckner C. Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy // Tetrahedron 1998. - V. 54. - P. 4151 -4202.

153. Stoffler D., Fahrenkrog В., and Aebi U. The nuclear pore complex: from molecular architecture to functional dynamics // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. - V. 11.-P.391 -401.

154. Stowell M.H., Marks В., Wigge P., and McMahon H.T. Nucleotide-dependent conformational changes in dynamin: evidence for a mechanochemical molecular spring // Nat. Cell Biol. 1999. - V. 1. - P. 27 - 32.

155. Straight R.C., Spikes J.D. Photosensitized oxidation of biomolecules. // In: Frimer A.A. (Ed.). Singlet 02, Boca Raton: CRCPres., 1985. V. 4. P. 91-143.

156. Strawn L.A., Shen Т., Shulga N., Goldfarb D.S., and Wente S.R. Minimal nuclear pore complexes define FG repeat domains essential for transport // Nat. Cell Biol. 2004. - V. 6. - P. 197 - 206.

157. Szoka F., Jr. and Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1978. - V. 75. - P. 4194 - 4198.

158. Takemura Т., Ohta N., Nakajima S., and Sakata I. Critical importance of the triplet lifetime of photosensitizer in photodynamic therapy of tumor // Photochem. Photobiol. 1989. - V. 50. - P. 339 - 344.

159. Talcott B. and Moore M.S. Getting across the nuclear pore complex // Trends Cell Biol. 1999. - V. 9. - P. 312 - 318.

160. Umata Т. and Mekada E. Diphtheria toxin translocation across endosome membranes. A novel cell permeabilization assay reveals new diphtheria toxinф fragments in endocytic vesicles//J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 8351 -8359.

161. Vorbrodt A.W. and Dobrogowska D.H. Interaction of glycated albumin-gold complexes with mouse brain microvascular endothelium // Folia Histochem.

162. Cytobiol. 1999. - V. 37. - P. 3 - 10.

163. Wakshull E.M. and Wharton W. Stabilized complexes of epidermal growth factor and its receptor on the cell surface stimulate RNA synthesis but not mitogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1985. - V. 82. - P. 8513 - 8517.

164. Wang S., Gao R., Zhou F., and Selke M. Nanomaterials and singlet oxygenphotosensitizers: potential applications in photodynamic therapy // Journal of Materials Chemistry 2004. - V. 14. - P. 487 - 493.

165. Watson J.T., Yang Y., and Wu J. Capture and identification of folding intermediates of cystinyl proteins by cyanylation and mass spectrometry // J. Mol. Graph. Model. 2001.-V. 19.-P. 119-128.

166. Weizman E., Rothmann C., Greenbaum L., Shainberg A., Adamek M., Ehrenberg В., and Malik Z. Mitochondrial localization and photodamage during photodynamic therapy with tetraphenylporphines // J. Photochem. Photobiol. В• 2000.-V. 59.-P. 92- 102.

167. Wiseman H. and Halliwell В. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer // Biochem. J. 1996.- V. 313 (Pt 1).-P. 17-29.

168. Wood S.R., Holroyd J.A., and Brown S.B. The subcellular localization of Zn(II) phthalocyanines and their redistribution on exposure to light // Photochem. Photobiol. 1997. - V. 65. - P. 397 - 402.

169. Xue L.Y., Chiu S.M., and Oleinick N.L. Photodynamic therapy-induced death of MCF-7 human breast cancer cells: a role for caspase-3 in the late steps of apoptosis but not for the critical lethal event // Exp. Cell Res. 2001. - V. 263. - P. 145 - 155.

170. Ybe J.A., Greene В., Liu S.H., Pley U., Parham P., and Brodsky F.M. Clathrin self-assembly is regulated by three light-chain residues controlling the formation of critical salt bridges // EMBO J. 1998. - V. 17. - P. 1297 - 1303.