Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование специфичности и эффективности противоопухолевых препаратов, доставляемых модульными нанотранспортерами

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование специфичности и эффективности противоопухолевых препаратов, доставляемых модульными нанотранспортерами"

на правах рукописи

СЛАСТНИКОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Исследование специфичности и эффективности противоопухолевых препаратов, доставляемых модульными нанотранспортерами

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з і ЯНВ 20)3

Москва - 2013

005048944

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук и на биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Соболев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

Гурский Георгий Валерианович, член-корреспондент РАН, доктор физико-математических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, лаборатория ДНК-белковых взаимодействий, заведующий лабораторией

Максимов Георгий Владимирович, доктор биологических наук, профессор кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.ВЛомоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Защита диссертации состоится 21 февраля 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 на базе Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан января 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Страховская М.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак — одна из основных причин преждевременной смертности в развитых странах. Несмотря на огромное количество затрачиваемых на борьбу с этим заболеванием сил и средств, проблема остается пока далекой от решения. Поэтому поиск новых подходов лечения рака не перестает быть актуальным.

Из ряда существующих подходов к лечению рака можно выделить использование физических факторов с локальным повреждающим действием, эффективность которых в отличие от биохимического подхода, опирающегося на особенности метаболизма или регуляции чрезвычайно гетерогенных раковых клеток, определяется лишь местом проявления этого действия.

Так, в последнее время всё больший интерес приобретают такие цитотоксические физические факторы, которые действуют на малые расстояния, тем самым не повреждая «немишенные» клетки, при этом их действие обычно ограничено достаточно коротким, лучше всего — наперед заданным периодом времени. Примером могут служить: 1) фотосенсибилизаторы (ФС), генерирующие активные формы кислорода с пробегом не более 40 нм (Sobolev, 2008) лишь пока они возбуждаются светом нужной длины волны; 2) короткоживущие радионуклиды, испускающие электроны Оже (с пробегом 2-500 нм) (Kassis, 2008) или a-частицы (с пробегом в десятки мкм) (Vaidyanathan and Zalutsky, 2011); 3) изотопы, используемые для нейтрон-захватной терапии, в ходе которой - пока идет облучение нейтронами - происходит ядерная реакция с образованием а-частиц (Byvaltsev et al., 2012). Эффективность действия физических факторов, обладающих такими свойствами, принципиально зависит от места их локализации в клетке. Для всех этих агентов показано, что наиболее чувствительным к их поражающему действию компартментом является клеточное ядро (Sobolev, 2009). Таким образом, для обеспечения максимально эффективного функционирования, подобные физические агенты должны быть селективно узнаны клеткой-мишенью, поглощены внутрь клетки и доставлены в ядро.

Однако сами по себе ни известные свободные ФС, ни эмиттеры электронов Оже обычно не обладают ни необходимой клеточной специфичностью, ни способностью накапливаться в ядре в заметном количестве (Соболев и др., 2004, Wiseman and Halliwell, 1996).

Таким образом, высокоспецифическая внутриклеточная доставка таких локально действующих противоопухолевых физических факторов, как эмиттеры электронов Оже и ФС, в ядра раковых клеток представляет собой актуальную задачу биофизики клетки, решение которой представляется важным для повышения эффективности противоопухолевой терапии. Будучи направленной на увеличение эффективности и снижение побочных эффектов проводимой терапии, адресная доставка лекарств является чрезвычайно актуальной задачей современной молекулярной биомедицины и фармакологии.

Одним из многообещающих подходов для направленной доставки локально действующих физических факторов в ядра клеток-мишеней является использование естественной клеточной машинерии внутриклеточного транспорта и сортировки макромолекул. Этот принцип заложен в основу разработанных в нашей лаборатории модульных нанотранспортеров (МНТ). Функциональные модули, входящие в состав МНТ, обеспечивают последовательное взаимодействие транспортера со специфическими клеточными системами, обеспечивающими тот или иной этап внутриклеточного транспорта присоединенного к транспортеру цитотоксического агента от поверхности в ядро клетки-мишени (Sobolev, 2009).

Ранее, на примере ФС и а-эмитгеров было показано значительное (до нескольких тысяч раз) увеличение их эффективности в экспериментах на культурах клеток в результате их присоединения к МНТ (Gilyazova et al., 2006, Rosenkranz et al., 2008). Однако, важные вопросы эффективности in vivo ФС, доставляемых МНТ, оставались нерешенными.

Эмиттеры электронов Оже обладают значительно меньшим радиусом действия по сравнению с эмиттерами a-частиц и, как и последние, не требуют дополнительного облучения видимым светом для активации, - а, значит, в отличие от ФС, не имеют ограничений по глубине залегания опухолей и метастазов. Поэтому представляются актуальными характеристика кинетики внутриклеточного транспорта и исследование возможности увеличения эффективности эмиттеров электронов Оже, присоединенных к МНТ.

Для случаев с незначительными различиями в экспрессии поверхностных рецепторов у раковых и нормальных клеток, а также в целях повышения избирательности действия в принципе, в МНТ, благодаря его модульной структуре, был заложен модуль, направленный на придание МНТ дополнительного - внутриклеточного - уровня специфичности. Исследование принципиальной перспективности подобного подхода увеличения специфичности систем адресной доставки противораковых веществ с

коротким радиусом летального физического воздействия представляет собой важную задачу.

Вышеизложенное приводит к заключению, что исследование транспорта и цитотоксического действия препаратов, вызывающих локальные летальные физические воздействия в наиболее чувствительных к ним компартментах клеток-мишеней, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование специфичности и эффективности на уровне клетки и целого организма модульных нанотранспортеров, специфически доставляющих противоопухолевые физические факторы (ФС и эмиттеры электронов Оже) в раковые клетки-мишени и их ядра.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие практические задачи:

1. На ряде животных моделей in vivo исследовать специфичность накопления и особенности внутриклеточной локализации МНТ в раковых клетках и охарактеризовать эффективность фотодинамического действия ФС, доставляемых МНТ, имеющими своими мишенями различные раковые клетки.

2. Исследовать взаимодействие МНТ с рецепторами-мишенями на поверхности клеток-мишеней, кинетические характеристики внутриклеточного транспорта и эффективность цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ.

3. Исследовать кинетику связывания и внутриклеточного накопления, а также эффективность цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ с дополнительным внутриклеточным уровнем специфичности.

Научная новизна и практическая значимость

Настоящая работа посвящена исследованию специфичности и эффективности на уровне клетки и целого организма МНТ, доставляющих локально действующие противоопухолевые физические факторы в ядра клеток-мишеней.

Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, впервые показали, что адресная направленная доставка таких противоопухолевых локально действующих физических факторов, как эмиттеры электронов Оже, в ядра злокачественных клеток-мишеней с помощью МНТ значительно увеличивает их эффективность. При этом выявлено, что усиление эффективности действия эмиттера электронов Оже, доставляемого при помощи МНТ, почти на 2 порядка более выражено в случае доставки

5

радионуклида иода-125, испускающего преимущественно электроны Оже с меньшими длинами пробега (и энергией), чем большинство электронов Оже, испускаемых галлием-67. Более того, впервые показано, что цитотоксическому действию доставляемого локально действующего физического фактора можно придать дополнительную специфичность к ядрам раковых клеток, не зависимую от разницы в экспрессии мишенного рецептора между раковыми и нераковыми клетками, используя МНТ с двойным уровнем специфичности. Наконец, обнаружено высокоизбирательное накопление МНТ в опухоли по сравнению с окружающей здоровой тканью и его значительная концентрация в ядрах опухолевых клеток in vivo. При этом впервые показано, что опосредованная МНТ адресная доставка приводит к значительному, ранее не достигавшемуся (вплоть до излечения большинства животных) усилению терапевтического эффекта доставляемого МНТ локально действующего физического агента in vivo.

Таким образом, полученные в ходе работы результаты показывают перспективность разработанного подхода для терапии онкологических заболеваний, а также пути дальнейшего улучшения имеющихся систем адресной доставки.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: 1) «Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии», 10-14 июня 2009 г., Новосибирск, Россия; 2) «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», 29 июня - 4 июля 2009 г., Москва, Россия; 3) AACR 101st Annual Meeting April 17-20, 2010, USA; 4) Первая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине»», 17-19 ноября 2010 г., Москва, Россия; 5) International Symposium «Control of Gene Expression», 21-25 июня 2010 г., Москва, Россия; 6) Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011», 11-15 апреля 2011 года, Москва, Россия; 7) SNM Annual Meeting June 9-13, 2012; Miami, Florida, USA. 8) IV Съезд биофизиков России, 20-26 августа 2012 г., Нижний Новгород, Россия. Работа была представлена на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2012 г.), а также на семинаре кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Публикации. По материалам работы опубликовано 12 печатных работ. Из них 4 статьи в международных и российских рецензируемых журналах и 8 тезисов докладов и материалов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах, включает

12 таблиц и 33 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и

6

методов, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 160 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованные в работе МНТ представляют собой рекомбинантные белки, включающие в себя последовательности эпидермального фактора роста человека (ЭФР) или а-меланоцитстимулирующего гормона (аМСГ), которые связываются с интернализуемыми клеточными рецепторами, сверхэкспрессия которых характерна для ряда раковых опухолей; транслокационного домена дифтерийного токсина (ДТокс), обеспечивающего выход транспортеров из замкнутых внутриклеточных компартментов; одного из сигналов ядерной локализации — большого Т-антигена вируса SV-40 (СЯЛ) или неизменённого С-концевого фрагмента апоптина (апоСЯЛ); а также бактериального гемоглобиноподобного белка (НМР), служащего носителем для действующего агента. Были исследованы следующие МНТ: ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР, ДТокс-ЯМР-СЯЛ-аМСГ и ДТокс-ЯЛ/Р-апоСЯЛ-ЭФР.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы следующие методы: конфокальная лазерная сканирующая микроскопия иммунофлуоресцентно окрашенных срезов тканей, анализ изображений методом линейного разделения спектров, фотодинамическая терапия экспериментальных опухолей лабораторных животных in vivo, исследование межмолекулярных взаимодействий методом регистрации поверхностного плазменного резонанса, анализ взаимодействия МНТ с клетками при помощи радиолигандного анализа с расчетом констант скоростей взаимодействия с клеточными рецепторами при помощи нелинейного оценивания параметров, методы культивирования клеток, рутинные биофизические, биохимические и радиохимические методы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Специфичность и эффективность противоопухолевых препаратов, доставляемых МНТ in vivo

В предыдущих работах с ФС и а-эмиттерами в качестве доставляемых локально действующих лекарств, было показано значительное (до нескольких тысяч раз) увеличение их эффективности в экспериментах на культурах клеток в результате их присоединения к транспортерам (Gilyazova et al., 2006; Rosenkranz et al., 2008). Однако нерешенными оставались важные вопросы эффективности in vivo ФС, доставляемых МНТ.

Исследование специфичности накопления МНТ in vivo

Ранее специфичность фотоцитотоксического действия ФС, доставляемых МНТ, на раковые клетки, экспрессирующие соответствующие рецепторы, а также накопление МНТ в ядрах раковых клеток были показаны in vitro (Gilyazova et al., 2006). Однако, на уровне организма препятствий на пути доставляемого агента значительно больше (Sui et al., 2011). Поскольку доставляемый ФС проявляет свое фотоцитотоксическое действие лишь в пределах облучаемого участка, наиболее значимым для ФДТ является специфичность накопления ФС в опухоли по сравнению с ее непосредственным окружением.

Показано избирательное накопление радиоактивно меченного МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-аМСГ в опухоли по сравнению с окружающими здоровыми тканями уже спустя три часа после его внутривенного введения мышам C57Black/6J с привитой меланомой В16-F1 (Рис. 1).

ЮЛ 213.5 850

Количество введенного МНТ. мкг/мышь

Рис. 1. Распределение радиоактивно меченного МНТ ДТокс-ЯМ/'-СЯЛ-аМСГ в меланоме B16-F1 и окружающих тканях спустя 3 часа после внутривенного введения.

Для того чтобы выявлять опухолевые клетки на фоне окружающих неопухолевых, применили клетки меланомы Клаудмана S91, клон М-3 (получены из лаборатории акад. С.А. Лукьянова, ИБХ РАН), трансфицированные зеленым флуоресцентным белом (GFP). Затем эти клетки использовали для создания экспериментальных опухолей у мышей DBA/2. Получали срезы опухоли и окружающих тканей, после чего методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследовали внутриклеточную локализацию МНТ, а также специфичность его накопления в опухолевых клетках in vivo.

Спустя 3 часа после внутривенного введения МНТ ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-аМСГ отмечено хорошо видимое специфическое накопление МНТ (флуоресценция в канале Alexa 555) в клетках меланомы Клаудмана S91 (флуоресценция в канале GFP) относительно клеток окружающей нормальной ткани (наличие флуоресценции в канале DAPI, выявляющего ядра клеток, и отсутствие флуоресценции в канале GFP) (см. Рис. 2)

Рис. 2. Распределение МНТ ДТокс-ЯМР-СЯЛ-аМСГ в меланоме мыши и прилегающей ткани через 3 часа после третьего внутривенного введения: А - оптический срез препарата ткани, результат регистрации непрямой иммунофлуоресценции клеток, окрашенных антителами к МНТ; Б - оптический срез препарата ткани, результат регистрации флуоресценции зеленого флуоресцентного белка, экспрессирующегося в опухолевой ткани; В - выявление ядер с помощью ДНК-специфичного флуоресцентного красителя DAPI; Г - результат наложения всех трех каналов флуоресценции.

Для того, чтобы охарактеризовать внутриклеточное распределение МНТ in vivo были получены изображения срезов тканей с большим увеличением.

Проведенная нами количественная оценка специфичности накопления МНТ ДТокс-ЯМР-СЯЛ-аМСГ в опухолевых клетках, а также способности МНТ накапливаться в ядрах этих клеток in vivo, показала, что МНТ оказывается практически в 100% клеток меланомы, а из них 84% аккумулируют МНТ в своих ядрах.

Подобные результаты были получены и для МНТ ДТокс-ЯМР-СЯЛ-ЭФР на модели эпидермоидной карциномы человека, привитой бестимусным мышам. На рисунке 3 представлены изображения срезов эпидермоидной карциномы человека, полученных спустя 3 часа после внутривенного введения (хлорин е6)-ДТокс-ЯМР-СЯЛ-ЭФР или контрольного физиологического раствора. Изображения срезов опухолей эпидермоидной карциномы человека обладали высоким уровнем автофлуоресценции в канале регистрации флуоресценции А1еха555. Для выявления целевого сигнала был проведен анализ спектров флуоресценции срезов ткани в диапазоне 564-704 нм с использованием МЕТА-системы микроскопа. Далее при помощи программного пакета Zeiss LSM 5 Software Version 3.2 была проведена процедура линейного разделения полученных спектров по предварительно снятым по отдельности спектрам автофлуоресценции опухоли и Alexa 555.

Рис. 3. Внутриклеточное распределение МНТ в 2-3-мкм срезах опухолей (объектив 63х), i полученных от мышей линии Balb/c ByJIco-пи/пи с привитой эпидермоидной карциномой j человека А431 через 3 часа после внутривенного введения (хлорин ей)-ДТокс-ЯМР-СЯЛ-ЭФР (слева) или физиологического раствора (справа). Приведены наложения каналов флуоресцентных j изображений ядер (синий) и непрямой иммунофлуоресценции МНТ (красный).

Эффективность ФДТмышиных меланом in vivo с применением бактериохлорина р, доставляемого МНТДТокс-НМР-СЯЛ-аМСГ

Для оценки эффективности локально действующих противоопухолевых физических факторов, доставляемых МНТ, in vivo мы выбрали ФС, используемые в ФДТ. Образующиеся при переносе энергии от молекулы ФС, перешедшей под действием света в возбужденное триплетное состояние, АФК обладают радиусом действия менее 20 нм от места их образования (Соболев и др., 2004), при этом наиболее чувствительным к их поражающему действию является клеточное ядро (Liang et al., 2000). Более того, активируясь только под действием света, ФС являются физическим фактором, действующим лишь в течение определенного времени в строго заданном месте.

Пигментированные меланомы считаются трудно поддающимися ФДТ из-за того, что обуславливающий их пигментацию меланин сильно поглощает свет, затрудняя его проникновение в более глубокие слои ткани (Lim et al., 2004). Однако, опираясь на значительный эффект МНТ, полученный в опытах с ФС бактериохлорином р на клетках меланомы в культуре, а также спектральные особенности этого ФС (максимум поглощения при 761 нм, т.е. в области более глубокого проникновения света в ткани, чем у большинства ФС), мы поставили эксперименты по ФДТ на мышиной меланоме in vivo. В результате мы наблюдали значительный эффект ФДТ при использовании ФС, конъюгированного с МНТ ДТокс-ЯМР-СЯЛ-аМСГ. Так, на мышиной меланоме B16-F1, при полном отсутствии какого-либо эффекта свободного ФС и в идентичных условиях проведения ФДТ, мы наблюдали как значительное ингибирование (до 89%) роста опухоли, так и достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных, леченных ФС, конъюгированным с МНТ ДТокс-ЯМР-СЯЛ-аМСГ, относительно группы, леченной свободным ФС и нелеченого контроля (Рис. 4 А, А'). Ещё более выраженное ингибирование роста опухолей и увеличение средней продолжительности жизни мышей,

леченных ФС, конъюгированным с МНТ ДТокс-ЯА/Р-СЯЛ-аМСГ, были получены с использованием менее пигментированной меланомы Клаудмана Б91 (Рис. 4 Б, Б').

J 200

s .

5 800 2

1600

>.

= 400 ®200

i i: 6 10 16 20 26 Время с момента инокуляции, дни

|фДТ

Время с момента инокуляции, дни

МНТ-бакте р иохяорин

1

MKT-баю* рм ох

Время с момента инокуляции, дни

Время с момента инокуляции, дни

Рис. 4. Сравнительная эффективность ФДТ с использованием конъюгата МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-аМСГ с ФС бактериохлорином р и свободного ФС. (А)-(А') ФДТ мышей линии C57Black/6J с привитой сингенной меланомой B16-F1; (Б)-(Б') ФДТ мышей линии DBA/2 с привитой сингенной меланомой Клаудмана S91, клон М-3; (А), (Б) кинетики роста опухолей, среднее ± ст. ош.; (А'), (Б') динамики продолжительности жизни (кривые выживаемости Каплана-Мейера). Стрелками обозначены дни проведения сеансов ФДТ.

Эффективность ФС хлорина е6, доставляемого МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР, на модели эпидермоидной карциномы человека in vivo

На два порядка большее количество специфических мест связывания на клетках эпидермоидной карциномы может облегчить селективное связывание МНТ с опухолевыми клетками, необходимое для всех последующих этапов адресного транспорта конъюгированного с МНТ ФС. Так, эффект применения МНТ ДТокс-Т/А/Р-СЯЛ-ЭФР на клетках А431 in vitro для доставки ФС был ещё на порядок более выраженным, чем в случае использования конъюгатов ФС с МНТ ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-аМСГ на клетках меланомы (Gilyazova et al., 2006). Более того, проникновение света в ткани карциномы несколько облегчено по сравнению с меланомами за счёт отсутствия пигментации. В соответствие с этим эффективность проводимой ФДТ эпидермоидной карциномы А431, привитой бестимусным мышам линии Balb/c ByJIco-ям/иы, с использованием с использованием ФС хлорина е6, конъюгированного с МНТ ДТокс-ЯМ/'-СЯЛ-ЭФР, оказалась наиболее выраженной, приведя к 75% выживших животных на конец трехмесячного периода наблюдения.

А А'

О _ 10 1й 30 40 60

Время с момента инокуляции, дни Время с момента инокуляции, дни

Рис. 5. Сравнительная эффективность ФДТ мышей линии Balb/c ByJIco-пи/пи с привитой эпидермоидной карциномой человека А431 с использованием конъюгата МНТ ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР с ФС хлорином е6 и свободного ФС. (А) Кинетики роста опухолей, среднее ± ст. ош.; (А') динамики продолжительности жизни (кривые выживаемости Каплана-Мейера). Стрелками обозначены дни проведения сеансов ФДТ.

Таким образом, высокоизбирательное накопление МНТ в опухоли по сравнению с окружающей здоровой тканью и его значительная концентрация в ядрах опухолевых клеток, продемонстрированные in vivo, привели к значительному (вплоть до 75% выживаемости на конец срока наблюдения) усилению терапевтического эффекта при адресной доставке локально действующего физического агента in vivo.

Адресная доставка эмиттеров электронов Оже, с помощью модульного нанотранспортера в ядра раковых клеток in vitro

ФС, активируясь только под действием света, являются физическим фактором, действующим лишь в течение определенного времени в строго заданном месте. Подобная локализованность действия, снижает побочные эффекты, и является хорошим решением для лечения опухолей, которые можно тем или иным образом направленно облучить видимым светом. Но это преимущество оборачивается недостатком в случае локализации опухоли в недоступных для облучения светом местах организма, а также при необходимости удаления множественных метастазов и микрометастазов, диссеминированных по организму и имеющих заранее неизвестную локализацию. Поэтому возникает необходимость использования иных противораковых агентов.

В последнее время всё больший интерес проявляется к таким перспективным противораковым физическим факторам, как эмиттеры электронов Оже.

Электроны Оже обладают высокой линейной передачей энергии - 4-26 кэВ/мкм, наряду с чрезвычайно малой длиной пробега в тканях, сравнимой с размерами клеточных компартментов. В отличие от ФС, электроны Оже не требуют облучения видимым светом для своей активации, а потому не накладывают ограничений ни на глубину залегания опухолей, ни на степень диссеминированности раковых клеток по организму. Таким образом, благодаря своим физическим свойствам, эмиттеры электронов Оже

12

представляются очень перспективными для уничтожения отдельных раковых клеток или их небольших скоплений, что может быть использовано, однако, только при условии их доставки в ядра клеток-мишеней (Cornelissen and Vallis, 2010).

Однако сами по себе радионуклиды, испускающие электроны Оже, не обладают ни клеточной специфичностью, ни способностью накапливаться в наиболее уязвимом клеточном компартменте. Специфичность и эффективность адресной доставки ФС при помощи МНТ, позволяет предполагать перспективность используемого подхода и для обеспечения высокоспецифической внутриклеточной доставки эмиттеров электронов Оже в ядра раковых клеток.

Для присоединения к МНТ были выбраны: 1) 1251 - наиболее изученный и доступный эмиттер электронов Оже, а также 2) 67Ga, излучающий электроны Оже с большей энергией, а следовательно - большим пробегом в тканях, и обладающий совершенно иными химическим свойствами, а значит, требующий абсолютно иного подхода к способу присоединения.

Мечение иодом проводилось при помощи Ы-сукцинимидил-4-гуанидинометил-3-[1251]иодбензоата ([1251]СГМИБ), дающего меченый продукт, более устойчивый к деиодированию in vivo и значительно лучше удерживающийся в клетке, чем белок, иодированный традиционными методами (Vaidyanathan and Zalutsky, 2007). Для присоединения галлия был выбран хелатирующий агент на основе 1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (НОТА), образующий чрезвычайно стабильный комплекс с галлием (log Кус1 =31 ) (Velikyan et al., 2008).

Исследование связывания с поверхностью и внутриклеточного накопления f 7Ga¡НОТА-(ДТокс-ИМР-СЯЛ-ЭФР) и 1иЧ]СГМИБ-(ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР) в раковых клетках

Полученные МНТ, меченные эмиттерами электронов Оже, связывались поверхностью клеток эпидермоидной карциномы человека А431 и глиобластомы человека D247 MG, сверхэкспрессирующими рецепторы ЭФР, и эффективно интернализовались (см. Рис. 6).

А431 0247MG

В|»тя инкубации с ["^-СГМИБ-МНТ.иин Вреия «шувации с [,мП-СГМИБ-МНТ. «ин Вре«я инкубации с "Ga-HOTArMHT, мин

Рис. 6. Кинетики связывания с поверхностью и внутриклеточного накопления и [1251]СГМИБ-(ДТокс-ЯЛ//,-СЯЛ-ЭФР) в клетках эпидермоидной карциномы человека А431 (А) и глиомы человека D247 MG (Б) и |*7Са]НОТА-(ДТокс-ЯМР-СЯЛ-ЭФР) в клетках эпидермоидной карциномы человека А431 (В).

Полученные кривые кинетики связывания на поверхности и поглощения радиоактивной метки клетками А431 и D247 MG (см. Рис.6) хорошо аппроксимировались (R2=0,90-0,99) при помощи экспоненциальной функции: У^Ушах-а-е*),

где: у -радиоактивность, накопленная внутри клеток; t -время инкубации клеток после добавления радиоактивной метки в среду; утах - «максимальная» радиоактивность, накопленная внутри/на поверхности клеток - асимптота, к которой стремится внутриклеточное накопление/связывание с поверхностью метки при временах инкубации, стремящихся к бесконечности; к -скорость внутриклеточного накопления/связывания с поверхностью клетки.

Параметры утах и к для были рассчитаны с помощью программы GraphPad Prism Version 5.01 (GraphPad, San Diego, CA). Значения рассчитанных на основе экспериментальных кривых параметров приведены в Таблицах 1 и 2. Таблица 1. Параметры кинетики внутриклеточного накопления и связывания на поверхности

А431

параметр внутриклеточное накопление связывание на поверхности

Ушах, импульс/мин на клетку 1,024±0,035* 0,345±0,013

к, мин" 0,0048±0,0004 0,0089±0,0010

D247MG

параметр внутриклеточное накопление связывание на поверхности

Утах, импульс/мин НЭ клетку 1,499±0,042 0,656±0,039

к, мин"1 0,0052±0,0004 0,0046±0,0007

* Даны средние значения ± стандартная ошибка (п = 3)

Таблица 2. Параметры кинетики внутриклеточного накопления и связывания на поверхности

----_ .... а Л -3 1 v".. 11 тгч'г а { ггг—— 1Л4П па тт

А431

параметр внутриклеточное накопление связывание на поверхности

Ушах, импульс/мин НЭ клетку 4,716±0,128* 0,512±0,028

к, мин"' 0,0023±0,0001 0,0118±0,0025

* Даны средние значения ± стандартная ошибка (п = 3)

Исследование кинетики удержания в раковых клетках эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР

Эксперименты были проведены на клетках эпидермоидной карциномы человека А431 и клетках глиобластомы человека 0247 МО. Кинетики удержания [1251]СГМИБ-(ДТокс-//А/Я-СЯЛ-ЭФР) в клетках были исследованы трипсина на протяжении 24 часов в свежей среде после суточной инкубации, последующей отмывки клеток и снятия с поверхности клеток радиоактивности 0,05% (для ХУ1М МО) или 0,25% (для А431) раствором.

Кинетики удержания радиоактивной метки клетками А431 и 0247 МО (см. Рис. 7) хорошо аппроксимировались (Я2=0,97) при помощи экспоненциальной функции:

У ~~ Упах'С ,

где у - удержанная радиоактивность внутри клеток на данный момент времени; I — время инкубации клеток после отмывки от радиоактивной метки; утах — удержанная радиоактивность внутри клеток на момент начала инкубации после отмывки; к — параметр, характеризующий скорость выхода кривой внутриклеточного удержания к нулевому значению.

А431 024717Ю

Время пост-инкубации, мин Время пост-инкубации, мин

Рис. 7. Кинетики удержания радиоактивности в клетках эпидермоидной карциномы человека А431 и глиомы человека 0247 \Ю после инкубации с [125Г]СГМИБ-(ДТокс-ЯЛ//)-СЯЛ-ЭФР)

Параметры ушах и к для были рассчитаны с помощью программы GraphPad Prism Version 5.01 (GraphPad, San Diego, CA). Значения рассчитанных на основе экспериментальных кривых параметров приведены в Таблице 3.

Таблица 3. Параметры кинетики внутриклеточного удержания радиоактивности в клетках А431

параметр А431 D247 MG

значение±ст. ош. значение±ст. ош.

Ушах, импульс/мин на клетку 0,045±0,001 0,210±0,003

к, мин* 0,0007±0,0001 0,0007±0,00001

Исследование кинетики накопления эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР в ядрах раковых клетках

Кинетика ядерного накопления [1251]СГМИБ-(ДТокс-ЯМ>-СЯЛ-ЭФР) и [67Оа]НОТА-(ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР) была исследована на протяжении 24 часов инкубации клеток с меченым МНТ (см. Рис. 8). Метка накапливалась в ядрах клеток быстро, уже спустя 1 час инкубации от 55,5 ±3,0% ([67Оа]НОТА-(ДТокс-ЯЛ//>-СЯЛ-ЭФР)) до 61,9 ±1,5% ([1251]СГМИБ-(ДТокс-ЯМР-СЯЛ-ЭФР)) суммарной внутриклеточной радиоактивности было зарегистрировано в ядрах. Далее содержание метки в ядрах падало, оставаясь, однако, на уровне от 7,3 ± 1,0% ([67Оа]НОТА-(ДТокс-ЯЛ/Я-СЯЛ-ЭФР)) до 8,1 ± 1,9% ([1251]СГМИБ-(ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР)) от накопленной внутриклеточной активности спустя 24 часа инкубации.

Время, часы Время, часы

Рис. 8. Кинетика ядерного накопления [125Г|СГМИБ-(ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР) и [67Оа]НОТА-(ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР) в клетках эпидермоидной карциномы человека А431.

Исследование эффективности цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР, на раковые клетки в культуре

По результатам проведенного исследования цитотоксического действия МНТ с присоединенным эмиттером электронов Оже на двух различных линиях раковых клеток в культуре (см. Рис. 9 А, Б), показано, что эффективность цитотоксического действия

16

[1251]СГМИБ-(ДТокс-ЯМР-СЯЛ-ЭФР) усиливается до 3950 раз по сравнению с неспецифическим и не накапливающимся в клетках и, соответственно, ядрах, контролем, в качестве которого был использован 1251-БСА. В случае доставки 67Са эффективность цитотоксического действия [67Оа]НОТА-(ДТокс-ЯЛ//5-СЯЛ-ЭФР) увеличивается в несколько десятков раз по сравнению с двумя различными неспецифическими контролями (см. Рис. 9 В).

"'1-БСА

Б

100'

?261]СГМИБ-МНТ

100 200 300 400 s00

Концентрация в среде, цКи/мл

А431

"5/-БСА

['"1]СГМИБ-МНТ

о 100 200 300

Концентрация в среде, цКи/мл

90 100 150

Концентрация в среде, jiKh/мл

Рис. 9. Эффективность цитотоксического действия эмиттера электронов Оже иода-125 (А и Б) и галлия-67 (В), доставляемого МНТ ДГокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР (черный) и контрольным БСА или ЭДТА (серый) на клетки эпидермоидной карциномы человека А431 (А и В) и клетки глиобластомы человека D247 MG (Б). На графике приведены репрезентативные кривые из трех (для А431) и двух (для D247 MG) отдельных экспериментов: среднее ± ст. ош. данного эксперимента. Каждый отдельный эксперимент выполнен в трех повторах.

Поскольку эмиттеры электронов Оже практически неэффективны вне клетки (а многие считаются малоэффективными и вне клеточного ядра) (Comelissen and Vallis, 2010), эффективность их действия часто оценивают величиной N37 - количеством распадов, пришедшихся на клетку/ядро, необходимых для снижения выживаемости клеток до 37%.

Для проведения подобной оценки на основе полученных кривых кинетики накопления и вымывания радиоактивности из клеток было рассчитано общее число распадов, пришедшихся на одну клетку, в соответствии с уравнением:

J I ччу мпп

распадов в клетке = —( jAl(t)dt+ j A2(t)dt)

где А ¡(1) и А2(1) - накопление и вымывание, соответственно, [ 1]СГМИБ-(ДТокс-ЯМ>-СЯЛ-ЭФР) или [67Оа]НОТЛ-(ДТокс-ЯМЯ-СЯЛ-ЭФР), импульс/мин, а -эффективность счёта

Общее количество распадов, пришедшихся на одно ядро, рассчитывалось следующим образом:

1) Площадь под кривой, отражающая количество распадов, накопленных в ядре за период инкубации с известной концентрацией [125[]СГМИБ-(ДТокс-ЯМ/3-СЯЛ-ЭФР) или [67Са]НОТЛ-(ДТокс-ЯЛ/Я-СЯЛ-ЭФР), была рассчитана, исходя из кинетики ядерного накопления радиоактивности.

2) Было принято предположение о том, что процент внутриклеточных распадов, пришедшихся на ядро, постоянен во всем диапазоне концентраций, использованных для исследования цитотоксичности.

Тогда:

1440мин | +оо |

распадов в ядре = х„2.ч- | — А.(1)Ж + х24ч ■ | — А2 (I)<Л ^ а о

* = Распадов 8 ядРе > доля распадов, пришедшихся на ядро за 24 часа инкубации " распадов в клетке

хы = Распадов в я^Ре ^ доля распадов, пришедшихся на ядро на момент окончания 24-распадов в клетке

часовой инкубации.

Эффективности цитотоксического действия [,251]СГМИБ-(ДТокс-#МР-СЯЛ-ЭФР) и [б7Оа]НОТА-(ДТокс-ЯЛ№-СЯЛ-ЭФР), выраженные в распадах на клетку/ядро, представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Значения N37 для цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже иода-125 и галлия-67, доставляемых МЫТ ДТокс-ЯЛ/Р-СЯЛ-ЭФР.

N37

|та1]СГМИБ-(ДТокс-ЯМ/>-СЯЛ-ЭФР)

клетки А431 среднее значение ± ст. ош.

клетки Б247 МО среднее значение ± ст. ош.

[ Оа]НОТА-(ДТокс-НМР-С ЯЛ-ЭФР)

клетки А431 среднее значение ± ст. ош.

распадов на клетку

3001±624

3819±878

28600±9300

распадов на ядро

317±66

нет данных

9700±3100

Таким образом, для летального поражения 63% клеток достаточно, чтобы внутри них произошло около 3 тысяч распадов иода-125 или 30 тысяч распадов галлия-67; если эти изотопы попадают в ядро, то достаточно на порядок (для иода-125) или в 3 раза (для галлия-67) меньшей радиоактивности для достижения такого же эффекта. В то же время, если эти изотопы находятся вне клеток, пусть даже в непосредственной близости, эта же степень поражения достигается при активностях на 2-3 порядка больших для иода-125 или в десятки раз больших для галлия-67.

МНТ с дополнительным уровнем специфичности

Описанные ранее МНТ придают доставляемому терапевтическому агенту специфичность только на уровне лиганда. Однако, и рецепторы а-МСГ, и рецепторы ЭФР экспрессируются не только на соответствующих раковых, но и (в значительно меньшем

количестве) на ряде нормальных клеток. Следовательно - особенно при системном введении, транспортер будет оказываться и в каком-то количестве ядер нормальных клеток. Поэтому для придания МНТ дополнительного — внутриклеточного — уровня специфичности по отношению к раковым клеткам (особенно значимого в случае незначительных различий в экспрессии поверхностных рецепторов у раковых и нормальных клеток) входящий в состав МНТ сигнал ядерной локализации был заменен в лаборатории Дэвида Янса (Университет Монаша, Австралия) на С-концевой (74-121) домен апоптина. Апоптин - белок вируса анемии цыплят, обладающий способностью селективно накапливаться в ядрах раковых, но не нормальных клеток (Рооп й а1., 2005), а также неспецифически связываться с ДНК (ЬеНуеМ й а1., 2003), что является крайне желательным для доставки таких локально действующих физических факторов, как эмиттеры электронов Оже (Ка5Б1з, 2008). В лаборатории Дэвида Янса было показано увеличенное накопление МНТ с С-концевым доменом апоптина в ядрах раковых клеток 8аоэ-2 по сравнению с изогенными им «нормальными» клетками.

Кинетические характеристики связывания МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР и ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР с ДНК

Мы попытались вьиснить, сохраняет ли использованный нами фрагмент апоптина в составе МНТ свою способность связываться с ДНК. Данная характеристика, как уже упоминалось, является весьма важной для доставляемых ФС и, особенно, для эмиттеров электронов Оже.

Исследование связывания МНТ с ДНК проводили методом регистрации поверхностного плазмонного резонанса (ППР) с использованием высокочувствительной полуавтоматической микрожидкостной системы для изучения и анализа взаимодействия молекул ЕНасоге X («ЕНасоге», Швеция).

Для аппроксимации экспериментальных данных по изменению сигнала ППР в результате взаимодействия МНТ с ДНК теоретическими кривыми нами была выбрана модель взаимодействия молекулы с двумя местами связывания, которая позволяет учитывать неспецифическое взаимодействие молекул исследуемого МНТ с немодифицированной матрицей:

А+В, 2 > АВ, аВ1/с11 = - (кагА В] - кагА-ВО

йВ2/& = - (кй-А-Вг - каг АВ2) аАВ1/А = (ка1-А-В1-кйгА-В1) ёАВг/Л = (каг А В2 - ко АВ2) Яи=АВ1 +А-В2 + Ш

А - молекулы МНТ

В1 — сайты связывания МНТ непосредственно на материале матрицы (без ДНК) В2 —ДНК, иммобилизованная на поверхности матрицы

АВ, — образовавшийся комплекс МНТ-матрица АВ2 - комплекс МНТ-ДНК

ка1 и — константы скоростей образования и диссоциации комплекса АВ,,

и к,

<12

- константы скоростей образования и

диссоциации комплекса АВ2

^Мах1> Р*Мах2- макСИМЭЛЬНО ВОЗМОЖНОе связывание МНТ с матрицей и с ДНК, соответственно,

И - вклад изменения коэффициента преломления при смене раствора, в котором вводят образец, в резонансный ответ К11 - суммарный резонансный ответ

В1[0] - Ямах1

в2[0] = Лмахг

АВ][0] = О АВ2[0] = О

Кинетические кривые взаимодействия ДТокс-ЯМР-апоСЯЛ-ЭФР с ДНК и результат аппроксимации кривых двух стадийной моделью приведены на Рис. 10.

ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР

3,2 мкм мнт 2,4 мкМ МНТ 1,9 МкМ МНТ 1,1 МКМ МНТ 0,9 МкМ МНТ ,7 мкМ МНТ

100 200 300 400 ООО 600 700 800

Время, с

Рис. 10. Взаимодействие иммобилизованной на матрице ДНК с возрастающими концентрациями МНТ ДТокс-ЯА^-апоСЯЛ-ЭФР. Экспериментальные данные, использованные в расчетах, обозначены цветными символами, результат аппроксимации - сплошной черной линией.

Оценка констант скоростей прямых и обратных реакций взаимодействия МНТ с матрицей (каЬ к^), и с иммобилизованной на матрице ДНК (ка2 и к^), приведена в Таблице 5.

Таблица 5. Оценка кинетических характеристик взаимодействия МНТ с ДНК, иммобилизованной на поверхности матрицы, по модели взаимодействия молекулы с двумя местами связывания с помощью программы В1Аеуа1иа1юп 4.1 («В1Асоге»), Приведены

МНТ каь М'Ч"1 с1 ка2, М-'-С1 к<12, С 1

ДТокс-Ш/Р-апоСЯЛ-ЭФР 1,75-104 3,48-10"5 148 1,07-10"3

Рассчитанные на основе выбранной модели константы диссоциации МНТ с ДНК, равные (4,4±1,4) Ю-6 М (п=3) для ДТокс-ЯМР-апоСЯЛ-ЭФР в сравнении с известной из литературы Кдисс=(4,0±0,5) 10"7 М (ЬеПуеЫ е1 а1., 2004), характеризующей сродство чуть

20

более длинного С-концевого участка апоптина (66-121) к ДНК, позволяют предположить сохранение модулем апоСЯЛ в составе МНТ его ДНК-связывающих свойств.

Исследование эффективности цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР

Для проведения экспериментов по исследованию специфичности цитотоксического действия на раковые клетки противоопухолевых локально действующих физических факторов, доставляемых ДТокс-ЯМР-апоСЯЛ-ЭФР, были выбраны клетки остеосаркомы человека Saos-2, а в качестве контроля - изогенная им пару не образующих опухолей клеток SR5, полученных путём трансфекции Saos-2 геном ретинобластомного белка (Wagstaff and Jans, 2009).

На основе предварительно полученных кривых кинетики накопления радиоактивности в исследуемых клетках, для каждой из клеточных линий было рассчитано общее число распадов, пришедшихся на одну клетку, в соответствии с уравнением:

| 1440мин

распадов на клетку = — I А (t)dt а

" 0 мин

A(t) - функция кинетики накопления [1251]СГМИБ-(ДТокс-ЯА//'-апоСЯЛ-ЭФР) в соответствующей клеточной линии, а - эффективность счёта

Значения N37 для [1251]СГМИБ-(ДТокс-ЯЛ/Р-апоСЯЛ-ЭФР) для раковых клеток Saos-2 составили 221 распад на клетку, в то время как для изогенных им нераковых клеток N37 оказалось равным 701 распадам на клетку (см. Рис. 11), таким образом эффективность МНТ с С-концевым доменом апоптина для раковых клеток оказалась более чем в три раза выше, чем для изогенных им нераковых.

Рис. 11. Эффективность цитотоксического действия эмиттера электронов Оже иода-125, доставляемого МНТ ДТокс-ЯЛ/Р-апоСЯЛ-ЭФР, на клетки остеосаркомы человека йаоз-2 (кружки) и изогенные им клетки 8Я5 (квадраты). На графике приведены кривые отдельных экспериментов ± стандартная ошибка данного эксперимента. Каждый эксперимент выполнен в трех повторах.

Полученные результаты свидетельствуют, что включение С-концевого домена апоптина в состав МЫТ делает доставку локально действующих физических факторов специфичной на внутриклеточном уровне: МНТ приобретают дополнительную избирательность в отношении раковых клеток.

Таким образом, совокупность полученных данных указывает на перспективность разрабатываемого подхода и целесообразность дальнейшего улучшения продемонстрированных в работе опухолевой специфичности и высокой эффективности модульных нанотранспортеров для доставки локально действующих физических агентов.

ВЫВОДЫ:

1) Обнаружено in vivo избирательное накопление МНТ с различными лигандными модулями в раковых клетках опухоли и продемонстрирована локализация МНТ в их ядрах.

2) Адресная доставка фотосенсибилизаторов с помощью МНТ в ядра раковых клеток in vivo приводит к значительному усилению терапевтического эффекта, вплоть до излечения большинства животных-опухоленосителей.

3) Впервые показано, что присоединение эмиттера электронов Оже к МНТ увеличивает его цитотоксичность на раковых клетках почти в 4000 раз.

4) Показано возможное направление дальнейшего улучшения специфичности и эффективности МНТ путем включения в его состав С-концевого домена апоптина, способного накапливаться преимущественно в раковых клетках:

а) методом поверхностного плазмонного резонанса показано, что С-концевой (74-121) домен апоптина в составе МНТ сохраняет способность к связыванию с ДНК

б) впервые показано, что фотосенсибилизаторы и эмиттеры электронов Оже, доставляемые МНТ с С-концевым доменом апоптина, поражают в большей мере раковые клетки Saos-2, чем сингенные «нормальные» клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Slastnikova Т.А., Rosenkranz А.А., Gulak P.V., Schiffelers R.M., Lupanova T.N., Khramtsov Y.V., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. Modular nanotransporters: a multi-purpose in vivo working platform for targeted drug delivery//Int. J. Nanomed. - 2012. - V.7. - P.467-482.

2. Durymanov M.O., Beletkaia E.A., Ulasov A.V., Khramtsov Y.V., Trusov G.A., Rodichenko N.S., Slastnikova T.A., Vinogradova T.V., Uspenskaya N.Y., Kopantsev E.P., Rosenkranz A.A., Sverdlov E.D., Sobolev A.S. Subcellular trafficking and transfection efficacy of polyethylenimine-polyethylene glycol polyplex nanoparticles with a ligand to melanocortin receptor-1//J. Control. Release - 2012. - V.163(2). - P.211-219.

3. Сластникова T.A.. Розенкранц A.A., Лупанова Т.Н., Гулак П.В., Гнучев Н.В., Соболев А.С. Исследование эффективности модульного транспортера для адресной доставки фотосенсибилизаторов в ядра клеток меланомы in у;Ч>о//Докл. Акад. Наук РФ -2012. — Т.446(3). - С.342-344.

4. Slastnikova Т.А.. Koumarianou Е.К., Rosenkranz А.А., Vaidyanathan G., Lupanova T.N., Sobolev A.S., Zalutsky M.R. Modular Nanotransporters: A Versatile Approach for Enhancing Nuclear Delivery and Cytotoxicity of Auger Electron Emitting 125I//EJNMMI Research. - 2012. -V.2:59.

Тезисы конференций:

1. Сластникова T.A.. Розенкранц А.А., Гулак П.В., Скиффелерс P.M., Соболев А.С. Модульный нанотранспортер для адресной доставки в ядра клеток-мишеней увеличивает эффективность действия фотосенсибилизаторов in vivo. Сборник трудов научной конференции «Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии», 1014 июня 2009, Новосибирск, стр.124.

2. Сластникова Т.А., Шевкун Н.А., Розенкранц А.А., Гулак П.В., Скиффелерс P.M., Соболев А.С. Оценка эффективности модульных нанотранспортеров для адресной доставки лекарств в ядра клеток-мишеней in vivo. Стендовый доклад. 1-ая Международная научная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», 29 июня - 4 июля 2009, стр. 142.

3. Sobolev A.S., Slastnikova Т.А.. Rosenkranz А.А., Schiffelers R.M., Zalutsky M.R. Modular nanotransporters - a chimeric multi-functional platform for drug delivery in vivo. AACR 101st Annual Meeting 2010 April 17-20,2010.

4. Slastnikova T.A.. Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lupanova T.N., Schiffelers R.M., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. Efficient therapy of experimental tumors with the use of modular

23

nanotransporters delivering photosensitizers into the nuclei of target cells. In: Proc. Internat. Symp. "Control of gene expression and cancer" June 21-25,2010, Moscow, Russia.

5. Сластникова Т.Д.. Лупанова Т.Н., Розенкранц А.А., Соболев А.С. Модульные нанотранспортеры - новая многоцелевая платформа для доставки лекарств in vivo. В «Первая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине»». Материалы I Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине, 17-19 ноября 2010 г., Москва.

6. Лупанова Т.Н.. Сластникова Т.А. Исследование сохранности свойств модульного нанотранспортера для адресной внутриклеточной доставки лекарств. XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва. 11-15 апреля 2011 года. Секция "Биология", стр. 25.

7. Koumarianou Е., Slastnikova Т.А.. Pmszynski M., Zhao X., Rosenkranz A.A., Vaidyanathan G., Sobolev A.S., Zalutsky M.R. Modular nanotransporters: A flexible platform forward for targeted Auger electron therapy. SNM Annual Meeting, held at the Miami Beach Convention Center, Miami, Florida, June 9-13,2012. J Nucl Med. 2012; 53 (Supplement 1):1697

8. Сластникова T.A.. Розенкранц A.A., Кумариану E., Залутски M.P., Соболев А.С. Использование модульных нанотранспортеров для эффективной направленной доставки эмиттеров электронов Оже в ядра клеток-мишеней. Съезд биофизиков России. Симпозиум III «Физика - медицине и экологии». Материалы докладов. — Нижний Новгород, 2012, стр. 210.

Подписано в печать 16.01.2013 г. Формат 60x90/16. Заказ 1629. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,1. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сластникова, Татьяна Александровна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ

М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА БИОФИЗИКИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

СЛАСТНИКОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Исследование специфичности и эффективности противоопухолевых препаратов, доставляемых модульными нанотранспортерами

Специальность 03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Соболев Александр Сергеевич

Москва-2013

Оглавление

Оглавление..............................................................................................................................................2

1. Введение..............................................................................................................................................5

2. Литературный обзор.....................................................................................................................11

2.1. Противораковые агенты с малым радиусом действия..................................................................11

2.1.1. ФС и фотодинамическая терапия....................................................................................................................11

2.1.2. Распределение фотосенсибилизаторов в клетке и организме......................................................................21

2.1.3. Эмиттеры электронов Оже..............................................................................................................................22

2.1.4. Методы присоединения эмиттеров электронов Оже к макромолекулам....................................................24

2.2. Подходы к направленной внутриклеточной доставке...................................................................26

2.2.1. Методы специфичной для раковых клеток доставки в ядро........................................................................29

2.3. Модульные конструкции для направленного транспорта терапевтических агентов с малым радиусом физического воздействия...........................................................................................................34

2.4. Модульные конструкции для направленного транспорта ФС и других АМРД.......................36

2.4.1. Транспорт ФС...................................................................................................................................................36

2.4.2. Направленная доставка а-эмитгеров..............................................................................................................41

3. Материалы и методы....................................................................................................................42

3.1. МНТ..........................................................................................................................................................42

3.1.1. Структура и состав МНТ.................................................................................................................................42

3.1.2. Экспрессия МНТ в бактериальных клетках...................................................................................................43

3.1.3. Выделение и очистка МНТ..............................................................................................................................43

3.1.4. Рефолдинг лигандного модуля МНТ..............................................................................................................45

3.1.5. Трансформация клеток.....................................................................................................................................45

3.1.6. Измерение концентрации бежа......................................................................................................................46

3.1.7. Электрофорез белков........................................................................................................................................47

3.1.8 Определение биологической активности а-меланоцит-стимулирующего гормона и МНТ ДТокс-НМР-

СЯЛ-аМСГ..................................................................................................................................................................48

3.1.9. Лиофилизация МНТ.........................................................................................................................................48

3.2 Получение радиоактивно меченых препаратов МНТ и ЭФР........................................................48

3.2.1. Получение препаратов МНТ и ЭФР, меченных 1251 при помощи 1,3,4,6-тетрахлоро-3(х-6а-дифенилгликоурила....................................................................................................................................................48

3.2.2. Получение препаратов МНТ и ЭФР, меченных |251 при помощи N [1251]-СГМИБ.....................................49

3.2.3. Получение препаратов МНТ и ЭФР, меченных 670а при помощи хелатирующего агента на основе 1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусной кислоты.......................................................................................................52

3.3. Получение препаратов МНТ, конъюгированных с ФС.................................................................54

3.3.1. Получение водного раствора тринатриевой соли хлорина е6.......................................................................55

3.3.2. Синтез и очистка конъюгатов МНТ с ФС......................................................................................................55

3.3.3. Активация карбоксильных групп ФС.............................................................................................................55

3.3.4. Синтез конъюгата МНТ - ФС.........................................................................................................................56

3.3.5. Очистка конъюгата...........................................................................................................................................57

3.4. Культуры клеток...................................................................................................................................58

3.5. Определение количества рецепторов к ЭФР и МНТ на поверхности клеток и констант сродства радиоактивно меченных ЭФР и МНТ к рецепторам............................................................58

3.6. Анализ кинетики связывания МНТ с ДНК......................................................................................60

3.6.1. Модификация поверхности сенсорных чипов...............................................................................................61

3.6.2. Получение кинетических кривых взаимодействия МНТ с ДНК..................................................................61

3.6.3. Математическая обработка кинетических кривых........................................................................................62

3.7. Исследование кинетических характеристик транспорта [1251|-СГМИБ-МНТ и [67Са]-НОТА-МНТ в различных раковых и нераковых клетках................................................................................63

3.7.1. Исследование кинетики поверхностного связывания, накопления и удержания [1251]-СГМИБ-МНТ и [67Оа]-НОТА-МНТ в различных раковых и нераковых клетках............................................................................63

3.7.2. Исследование кинетики транспорта [1251]-СГМИБ-МНТ и [67Ga]-HOTA-MHT в ядра клеток эпидермоидной карциномы человека А431.............................................................................................................64

3.8. Исследование цитототоксического действия [1251]-СГМИБ-МНТ, [67Ga]-HOTA-MHT и [I2SI]-СГМИБ-апоМНТ на раковые и нераковые клетки в культуре..........................................................65

3.9. Исследование эффективности фотодинамического действия ФС..................................................................66

3.10. Исследование внутриклеточного распределения нанотранспортера в тканях мыши..........67

3.10.1. Прививка опухоли..........................................................................................................................................67

3.10.2. Введение нанотранспортера..........................................................................................................................68

3.10.3. Изготовление и окрашивание срезов тканей................................................................................................69

3.10.4. Получение и обработка изображений...........................................................................................................70

3.11. Исследование распределения радиоактивно меченного нанотранспортера в тканях мыши ..........................................................................................................................................................................72

3.11.1. Прививка опухоли..........................................................................................................................................72

3.11.2. Используемые растворы МНТ.......................................................................................................................72

3.11.3. Введение радиоактивно меченного МНТ и исследование распределения радиоактивной метки в тканях мышей..........................................................................................................................................................................72

3.12. Исследование эффективности ФДТ in vivo......................................................................................73

3.12.1. ФДТ меланомы B16-F1 у мышей С57/В1аск................................................................................................73

3.12.2. Фотодинамическая терапия меланомы Клаудмана S91 (клон М-3) у мышей DBA/2..............................75

3.12.3. Фотодинамическая терапия эпидермоидной карциномы человека А431 у мышей Balb/c ByJIco-nu/nu 76

3.12.4. Оценка результатов ФДТ...............................................................................................................................77

4. Результаты.....................................................................................................................................78

4.1. Специфичность и эффективность противоопухолевых препаратов, доставляемых МНТ in vivo....................................................................................................................................................................78

4.1.1. Оценка влияния долговременного хранения МНТ в лиофилизованном виде в различных условиях связывания на специфичность его связывания с раковыми клетками..................................................................78

4.1.2. Исследование специфичности накопления радиоактивно меченного МНТ in vivo...................................80

4.1.3. Исследование специфичности накопления МНТ in vivo методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии...............................................................................................................................................................81

4.1.4. Исследование эффективности фотодинамического действия ФС, доставляемых МНТ in vivo...............86

4.2. Адресная доставка эмиттеров электронов Оже с помощью модульного нанотранспортера в ядра раковых клеток in vitro.......................................................................................................................89

4.2.1. Мечение МНТ...................................................................................................................................................89

4.2.2. Характеристика используемых клеточных линий.........................................................................................90

4.2.3. Оценка специфичности связывания с раковыми клетками МНТ, модифицированных эмиттерами электронов Оже..........................................................................................................................................................91

4.2.4. Исследование связывания с клеточной поверхностью и внутриклеточного накопления [Ш1]-СГМИБ-(ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР) и [67Оа]-НОТА-(ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР) в раковых клетках......................................92

4.2.5. Исследование кинетики удержания в раковых клетках эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР...............................................................................................................................................94

4.2.6. Исследование кинетики накопления эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР, в ядрах раковых клеток....................................................................................................................................96

4.2.7. Исследование эффективности цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР, на раковые клетки в культуре................................................................................97

4.3. МНТ с дополнительным уровнем специфичности........................................................................102

4.3.1. Кинетические характеристики связывания МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР с ДНК..............................102

4.3.2. Характеристика используемой клеточной пары изогенных раковых и нераковых клеточных линий... 106

4.3.3. Исследование эффективности фотодинамического действия ФС, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР.............................................................................................................................................................107

4.3.4. Исследование кинетики связывания с поверхностью и внутриклеточного накопления эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР.......................................................................110

4.3.5. Исследование эффективности цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР.............................................................................................................................111

5. Обсуждение результатов............................................................................................................114

5.1. Специфичность и эффективность противоопухолевых препаратов, доставляемых МНТ ш vivo..................................................................................................................................................................114

5.2. Эффективность цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых в

ядра раковых клеток модульным нанотранспортером in vitro..........................................................120

5.3. МНТ с дополнительным уровнем специфичности........................................................................126

6. Заключение.....................................................................................................................................129

7. Выводы............................................................................................................................................130

8. Список сокращений и условных обозначений..........................................................................131

9. Список литературы.....................................................................................................................133

10. Благодарности............................................................................................................................145

1. Введение

Рак - одна из основных причин преждевременной смертности в развитых странах. Несмотря на огромное количество затрачиваемых на борьбу с этим заболеванием сил и средств, проблема остается пока далекой от решения. Поэтому поиск новых подходов лечения рака не перестает быть актуальным.

Из ряда существующих подходов к лечению рака можно выделить использование физических факторов с локальным повреждающим действием, эффективность которых в отличие от биохимического подхода, опирающегося на особенности метаболизма или регуляции чрезвычайно гетерогенных раковых клеток, определяется лишь местом проявления этого действия.

Так, в последнее время все больший интерес приобретают такие цитотоксические физические факторы, которые действуют на малые расстояния, тем самым не повреждая «немишенные» клетки, при этом их действие обычно ограничено достаточно коротким, лучше всего - наперед заданным периодом времени. Примером могут служить: 1) фотосенсибилизаторы (ФС), генерирующие активные формы кислорода с пробегом не более 40 нм (Sobolev 2008) лишь пока они возбуждаются светом нужной длины волны; 2) короткоживущие радионуклиды, испускающие электроны Оже (с пробегом 2-500 нм) (Kassis 2008) или а-частицы (с пробегом в десятки мкм) (Vaidyanathan and Zalutsky 2011); 3) изотопы, используемые для нейтрон-захватной терапии, в ходе которой - пока идет облучение нейтронами - происходит ядерная реакция с образованием а-частиц (Byvaltsev et al. 2012). Эффективность действия физических факторов, обладающих такими свойствами, принципиально зависит от места их локализации в клетке. Для всех этих агентов показано, что наиболее чувствительным к их поражающему действию компартментом является клеточное ядро (Sobolev 2009). Таким образом, для обеспечения максимально эффективного функционирования, подобные физические агенты должны быть селективно узнаны клеткой-мишенью, поглощены внутрь клетки и доставлены в ядро.

Однако сами по себе ни имеющие практическую значимость известные свободные ФС, ни эмиттеры электронов Оже обычно не обладают ни необходимой клеточной специфичностью, ни способностью накапливаться в ядре в заметном количестве (Wiseman and Halliwell 1996; Соболев и др. 2004).

Таким образом, высокоспецифическая внутриклеточная доставка таких локально действующих противоопухолевых физических факторов, как эмиттеры электронов Оже и ФС, в ядра раковых клеток представляет собой актуальную задачу биофизики клетки, решение которой представляется важным для повышения эффективности противоопухолевой терапии. Будучи направленной на увеличение эффективности и снижение побочных эффектов проводимой терапии, адресная доставка лекарств является чрезвычайно актуальной задачей современной молекулярной биомедицины и фармакологии.

Одним из многообещающих подходов для направленной доставки локально действующих физических факторов в ядра клеток-мишеней является использование естественной клеточной машинерии внутриклеточного транспорта и сортировки макромолекул. Этот принцип заложен в основу разработанных в нашей лаборатории модульных нанотранспортеров (МНТ). Функциональные модули, входящие в состав МНТ, обеспечивают последовательное взаимодействие транспортера со специфическими клеточными системами, обеспечивающими тот или иной этап транспорта цитотоксического агента, присоединенного к транспортеру, от поверхности в ядро клетки-мишени (Sobolev 2009).

Ранее, на примере ФС и а-эмиттеров было показано значительное (до нескольких тысяч раз) увеличение их эффективности в экспериментах на культурах клеток в результате присоединения к МНТ (Gilyazova et al. 2006; Rosenkranz et al. 2008). Однако, важные вопросы эффективности in vivo ФС, доставляемых МНТ, оставались нерешенными.

Эмиттеры электронов Оже обладают значительно меньшим радиусом действия по сравнению с эмиттерами a-частиц и, как и последние, не требуют дополнительного облучения видимым светом для активации, - а, значит, в

отличие от ФС, не имеют ограничений по глубине залегания опухолей и метастазов. Поэтому представляются актуальными характеристика кинетики внутриклеточного транспорта и исследование возможности увеличения эффективности эмиттеров электронов Оже, присоединенных к МНТ.

Для случаев с незначительными различиями в экспрессии поверхностных рецепторов у раковых и нормальных клеток, а также в целях повышения избирательности действия в принципе, в МНТ, благодаря его модульной структуре, был заложен модуль, направленный на придание МНТ дополнительного - внутриклеточного - уровня специфичности. Исследование принципиальной перспективности подобного подхода увеличения специфичности систем адресной доставки противораковых веществ, генерирующих продукты с коротким радиусом летального физического воздействия представляет собой важную задачу.

Вышеизложенное приводит к заключению, что исследование транспорта и цитотоксического действия препаратов, вызывающих локальные летальные физические воздействия в наиболее чувствительных к ним компартментах клеток-мишеней, представляет значительный интерес.

Целью настоящей работы было исследование специфичности и эффективности на уровне клетки и целого организма модульных нанотра