Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интерферирующая и антипролиферативная активности препаратов дцРНК в культурах опухолевых клеток человека различного происхождения

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Интерферирующая и антипролиферативная активности препаратов дцРНК в культурах опухолевых клеток человека различного происхождения"

На правах рукописи

АКИМОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ

ИНТЕРФЕРИРУЮЩАЯ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ дцРНК В КУЛЬТУРАХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0050151¿о

1 2012

Новосибирск - 2012

005015135

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной мед!

СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н. Черноловская Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор, чл.-корр. РАН Дыгало Николай Николаевич д.б.н. Рыкова Елена Юрьевна

Ведущая организация:

Защита состоится « » х-^-^м^-Уч 2012 г. в 7/.11 СО часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО, РАН

Автореферат разослан « а » 2012 г.

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Ученый секретарь диссертациоі к.х.н., доцент

Коваль В.В.

с

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных проблем современной медицины. Существующие на данный момент схемы лечения злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе с высокодозной агрессивной химиотерапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность современных противоопухолевых препаратов в отношении жизненно-важных органов и систем организма. Поиск генов-мишеней, селективное ингибирование экспрессии которых блокирует или значительно замедляет пролиферацию опухолевых клеток, является задачей, решение которой важно для разработки новых препаратов для терапии онкологических заболеваний. Продукты генов Her2, CCNBJ и РКС играют ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации. Аномально высокий уровень экспрессии этих генов обнаружен в клетках опухолей человека различных типов, и показано что он может быть причиной развития ряда онкологических заболеваний. Определение влияния селективного "выключения" генов-кандидатов на клеточную пролиферацию является важным для определения их терапевтического потенциала как мишеней для ген-направленной терапии. Продукты генов, участвующих в развитии раковых заболеваний, относятся к разным классам белков, поэтому прямым подходом к получению ингибиторов экспрессии генов является использование малых интерферирующих РНК (siPHK), способных избирательно связываться с мРНК гена-мишени и инактивировать ее. Таким образом, создание на основе siPHK специфических ингибиторов экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла: Her2, CCNBI и РКС, и исследование влияния этих ингибиторов на пролиферацию опухолевых клеток человека различного происхождения является актуальной задачей, решение которой важно для разработки новых методов терапии онкологических заболеваний.

Целью настоящей работы являлось создание специфических ингибиторов экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла: Her2 (c-erb-B2, neu), CCNB1 (циклин В1) и РКС (протеинкиназа С), на основе дцРНК и исследование влияния этих ингибиторов на пролиферацию опухолевых клеток человека различного происхождения. В ходе исследования решались следующие задачи:

1) Исследовать эффективность и длительность ингибирующего действия малых интерферирующих РНК (siPHK), направленных на мРНК генов Her2, CCNB1 и РКС в опухолевых клетках человека различного происхождения.

2) Исследовать влияние длинных дцРНК, гомологичных мРНК генов с-Мус и GFP на пролиферацию опухолевых клеток человека.

3) Исследовать изменение скорости пролиферации опухолевых клеток различного происхождения, подвергнутых действию siPHK, направленных на мРНК генов Her2, CCNB1 и РКС, после восстановления экспрессии генов-мишеней.

4) Исследовать влияние полученных siPHK на изменение генной экспрессии в опухолевых клетках человека и их жизнеспособность.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые исследована кинетика изменения относительного уровня экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС под действием siPHK на протяжении первых 12 суток после трансфекции клеток КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7, с целью определения длительности ингибирующего экспрессию генов-мишеней действия. Показано, что максимальное ингибирование экспрессии генов-мишеней достигается через 72 ч после трансфекции siPHK. Впервые исследована скорость пролиферации данных опухолевых клеток после восстановления уровней экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС. Показано, что наиболее значительный и длительный антипролиферативный эффект оказывает ингибирование экспрессии генов CCNB1 и РКС в клетках культуры SK-N-MC. Впервые показано, что в клетках рака молочной железы MCF-7 антипролиферативное действие ингибирования экспрессии генов CCNB1 и РКС существенно выше антипролиферативного действия, обусловленного ингибированием экспрессии гена Нег2. Таким образом, гены CCNB1 и РКС могут являться перспективными терапевтическими мишенями для препаратов, предназначенных для лечения нейробластом и рака молочной железы. Примененная нами схема технологической платформы исследования может быть использована для расширенных исследований различной целевой направленности при определении генов-мишеней.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. Результаты работы представлены на конференциях: "Apoptosis World 2008: From mechanisms to applications" (Люксембург, 2008); "IV съезд Российского Общества Биохимиков и Молекулярных Биологов" (Новосибирск, 2008); "Фундаментальные науки -медицине" (Новосибирск, 2008, 2010); "Cell Signal-Omics 2011: Integrated cellular pathology. Systems biology of human disease" (Люксембург, 2011).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 27 рисунков и 16 таблиц. Библиография содержит 410 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выбор генов-мишеней, клеточных линий, siPHK и длинных дцРНК.

Гены Her2 (c-erb-B2), CCNB1, РКС и с-Мус (MRTL), кодирующие белковые факторы, относящиеся к разным группам регуляторов клеточного цикла, могут рассматриваться как потенциальные мишени для направленного действия siPHK. Ранее было показано экспериментально и подтверждено клинически, что нарушения экспрессии этих генов могут приводить к возникновению злокачественных опухолей у человека. Основываясь на литературных данных, мы выбрали эти гены в качестве мишеней для siPHK. В качестве моделей для исследования биологической активности siPHK и длинных дцРНК были использованы клетки эпидермоидной карциномы КВ-3-1, нейробластомы SK-N-MC и клетки острого лейкоза HL-60, характеризующиеся повышенной экспрессией генов Нег2 и CCNB1, а также клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 в которых вместе с этими генами также наблюдается гиперэкспрессия РКС (Рис. 1).

А- <N I ü I Б'

_ Я ГО (

£ ü С ¿l Ы

ф

КВ-3-1

SK-N-MC

со ^

I I

m ^

^ со

шт с-тус

HL-60

MCF-7

fi-актин

Рис. 1. А. Уровни мРНК генов Her2, CCNB1 и РКС в клетках линий КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60. Б. Уровни мРНК гена с-Мус в клетках линий КВ-3-1 и SK-N-MC. Продукты реакции ОТ-ПЦР разделяли методом электрофореза в 1.5% агарозном геле и детектировали с помощью окрашивания бромистым этидием.

Для направленного подавления экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС мы использовали siPHK, выбранные с помощью программы BioPredSi и синтезированные твердофазным фосфитамидным методом (Табл. 1). Нуклеазо-чувствительные сайты siPHK были защищены путем введения 2'-О-метил-аналогов рибонуклеотидов. В качестве негомологичного по отношению к мишени контроля использовали siScr, не обладающую значимой гомологией с последовательностями мРНК генов мыши, крысы и человека.

Обозначение Последовательность* Мишень

siHer 5'-GCAGUUACCAGUGCCAAUAUU-3 4 3'-CCCGÜCAAUGGUCACGGÜÜAU-5 ~ 1299- 1319н. мРНК Her2

siCyc 5 --CACCAGGAACUCGAAAAUUUU-3 4 3 4-CAGUGGUCCUUGAGCUUUUAA-5" 190 - 210 н. мРНК CCNB1

siPKC 5"-GCGGCCAGAGAAGGAAAAAUU-3" 3 ~-GOCGCCGGÜCUCUUCCUUUUU-5 ~ 1080-1100 н. мРНК РКС

siScr 5"-CAAGUCUCGÜAUGUAGUGGUU-3 4 3'-UUGUUCAGAGCÄUACAUCACC-5' -

* С - 2"-0-метил-цитозин, U - 2'-0-метил-уридин

Для сравнения с действием siPHK была выбрана длинная дцРНК dsMyc, гомологичная участку мРНК с-Мус, вызывающая как РНК-интерференцию так и интерфероновый ответ; dsEGFP, гомологичная участку мРНК EGFP -способная вызывать только неспецифический интерфероновый ответ; и коммерчески доступный препарат поли-инозиновой-поли-цитидиловой кислоты (poly(I:C)), являющийся индуктором эндогенного интерферона (Табл. 2). Цепи дцРНК получали транскрипцией in vitro на ДНК-матрицах.

Таблица 2. Длинные дцРНК, использованные в работе

дцРНК Мишень

dsMyc 1159 - 1631 н. мРНК гена с-Мус

dsEGFP 1 - 448 н. мРНК гена ЕОРР

poly(I:C) коммерчески доступный препарат

Подавление экспрессии Her2, CCNB1, РКС и с-Мус в клеточных линиях КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 под действием siPHK и дцРНК.

Эффективность интерферирующего действия используемых siPHK оценивали по снижению уровня целевой мРНК. Относительный уровень мРНК генов определяли с помощью ОТ-ПЦР, в качестве внутреннего стандарта использовали мРНК ß-актина. Показано, что через 48 ч после трансфекции siCyc, siHer и siPKC вызывают существенное ингибирование экспрессии генов-мишеней в клетках КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 (Рис. 2).

Через 48 ч после трансфекции siHer уровень мРНК гена Нег2 составлял 28

- 40% в клетках линии КВ-3-1, 33 - 53% в SK-N-MC, 44 - 58% в MCF-7 и 48

- 63% в клетках линии HL-60 относительно уровня этой мРНК в клетках контрольной популяции, которая была обработана только трансфецирующим агентом, причем этот эффект мало зависит от концентрации siHer в диапазоне 50 - 200 нМ (Рис. 2). Трансфекция клеток siCyc в концентрации 50

- 200 нМ снижает уровень мРНК гена CCNB1 концентрационно-зависимым образом, что особенно сильно проявляется в клетках линий MCF-7 и SK-N-МС. Наименьшие по сравнению с контролем уровни экспрессии мРНК гена CCNB1 составили 23% и 29% для клеток КВ-3-1 и HL-60 при концентрации siCyc 100 нМ и 23% и 47% для клеток MCF-7 и SK-N-MC при концентрации siCyc 200 нМ (Рис. 2). Аналогичные данные были получены для siPHK, направленной к мРНК гена РКС: трансфекция siPKC в концентрации 200 нМ вызывает снижение уровня мРНК этого гена в клетках линии MCF-7 до 42%-го уровня по сравнению с контрольной популяцией (Рис. 2). Наблюдаемое подавление экспрессии генов-мишеней под действием siPHK является ген-специфичным, поскольку после добавления, например, комплекса siPHK с трансфекционным реагентом

А. кв-з-1 б. SK-N-мс

Рис. 2. Подавление экспрессии генов Пег2, CCNB1 и РКС в клетках КВ-3-1 (А), SK-N-МС (Б), MCF-7 (В) и HL-60 (Г) через 48 ч после трансфекции siPHK в концентрации от 50 до 200 нМ. Представлено среднее значение ± стандартное отклонение, рассчитанное по результатам трех независимых экспериментов. Относительную экспрессию генов-мишеней определяли как отношение уровня их мРНК к уровню мРНК ß-актина, использованного в качестве внутреннего стандарта.

(олигофектамин для клеток SK-N-МС и липофектамин - для остальных) происходило снижение экспрессии только целевого гена-мишени, а экспрессия других генов и гена домашнего хозяйства ß-актина оставалась на прежнем уровне. Как и ожидалось, siPHK со случайной последовательностью siScr практически не влияет на экспрессию генов-мишеней. Сопоставляя полученные нами результаты с описанными в литературе, можно сделать вывод о том, что последовательности siPHK были выбраны нами удачно, так

как обеспечивают более эффективное подавление экспрессии соответствующих генов, чем описано в литературе.

Для проверки возможности применения длинных дцРНК как в качестве специфических инструментов РНК-интерференции, так и в качестве индукторов неспецифического клеточного ответа мы сравнили действие в^РНК с действием протяженных дцРНК на опухолевые клетки человека. При трансфекции клеток КВ-3-1 и БК-Ы-МС длинной дцРНК скМус, гомологичной участку мРНК гена с-Мус, в концентрации 0.05 - 0.25 мкг/мл, через 48 ч после трансфекции наблюдалось снижение относительного уровня экспрессии этого гена до 5 - 20% в клетках КВ-3-1 и до 30 - 50% в клетках 5К-Ы-МС. с^ЕСРР (в концентрации 0.05 - 0.25 мкг/мл) вызывала снижение экспрессии с-Мус до 35 - 90% в КВ-3-1 и до 40 - 60% - в БК-Ы-МС. Гомополимер ро1у(1:С) был не эффективен в концентрации 0.05 мкг/мл, но при концентрации 0.25 мкг/мл его трансфекция через 48 ч вызывала снижение уровня экспрессии с-Мус в клетках КВ-3-1 и 8К-М-МС до 40%-го уровня в сравнении с контролем (Табл. 3).

Таблица 3. Подавление экспрессии гена с-Мус в клетках КВ-3-1 и БК-М-МС через 48 ч после трансфекции дцРНК

дцРНК Уровень экспрессии c-Mvc, %

KB-3-1 SK-N-MC

0.05 мкг/мл dsMyc 20 50

dsEGFP 90 60

poly(I:C) 100 100

0.25 мкг/мл dsMyc 5 30

dsEGFP 35 40

poly(I:C) 40 40

Пролиферация клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 после подавления экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС. Зависимость скорости пролиферации клеток в линиях КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 от уровня экспрессии генов Herl, CCNBJ и РКС определяли с помощью колориметрического МТТ-теста, принимая за 100% скорость клеточной пролиферации в контрольных лунках. Полученные данные показывают (ТабЛ. 4), что siHer в концентрациях 50 и 200 нМ приводит к снижению скорости пролиферации клеток КВ-3-1 до 84 и 75%, SK-N-MC - до 93 и 79%, MCF-7 - до 82 и 65% от скорости роста клеток в контроле, соответственно. Несмотря на значительное подавление экспрессии гена Нег2 под действием siHer во всех клеточных линиях, скорость пролиферации заметно снижалась лишь в клетках MCF-7 (до 65%), в то время как в остальных клеточных линиях антипролиферативный эффект был выражен слабо.

Подавление экспрессии гена ССЫВ1 с помощью вЮус снижает скорость деления клеток КВ-3-1 до 75 и 61% от контроля, 8К-Ы-МС - до 82 и 4%, МСР-7 - до 77 и 53% при концентрации 50 и 200 нМ, соответственно. Несмотря на значительное снижение экспрессии гена ССИВ1 под действием вГСус в клетках НЬ-60 (Рис. 2), это снижение не сопровождается достоверным снижением скорости их роста (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние вШег, вЮус, 31РКС, скЕСРР и ро1у(1:С) на пролиферацию клеток КВ-3-1, БК-Ы-МС, МСР-7 и НЬ-60

.мРНК / дцРНК, концентрация Скорость пролиферации, %*

КВ-3-1 БК-1Ч-МС МСР-7 НЬ-60

Контроль** 100 ±5 100±1 100 ±3 100 ±3

$18сг, 50 нМ / 0.668 мкг/мл 89 ±2 105 ±5 94 ±4 99 ±2

518сг, 200 нМ / 2.671 мкг/мл 90 ±2 68 ±2 92 ±3 101 ±1

вШег, 50 нМ, 0.665 мкг/мл 84 ±8 93 ±4 82 ±5 97 ±2

«¡Нег, 200 нМ / 2.661 мкг/мл 75 ±9 79 ±1 65 ±1 100 ±4

51Сус, 50 нМ / 0.666 мкг/мл 75 ±2 82 ±4 77 ±3 99 ±2

51Сус, 200 нМ / 2.663 мкг/мл 61 ±4 4 ±2 53 ±4 98 ±4

51РКС, 50 нМ / 0.668 мкг/мл - - 57 ±3 -

«¡РКС, 200 нМ /2.672 мкг/мл - - И ±2 -

51ЕхЗ, 50 нМ / 0.668 мкг/мл 90 ±3*** 95 ±2*** 68 ±2 80 ±5

«¡ЕхЗ, 200 нМ / 2.672 мкг/мл 2±\*** 46 ±3*** 20 ±5 37 ±3

сЬМус, 0.017 нМ / 0.005 мкг/мл 14 ±5 3 ±2 - -

(ЬМус, 0.164 нМ / 0.05 мкг/мл 0±1 7±3 - -

(ЬЕСРР, 0.017 нМ / 0.005 мкг/мл 0 ±2 9 ±7 0±3 102 ±4

dsEGFP, 0.174 нМ / 0.05 мкг/мл 0±1 9 ±5 0±2 106 ±7

ро!у(1:С), 0.005 мкг/мл 104 ±7 112 ±3 53 ±4 101 ±3

ро!у(1:С), 0.05 мкг/мл 44 ±6 0±3 0±5 106 ±10

♦Представлены средние значения по результатам трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

** Клетки, обработанные только трансфецирующим агентом. "♦•Данные Кабиловой Т.О.

Сравнение действия з1РНК с действием длинных дцРНК показало, что трансфекция 0.005 - 0.05 мкг/мл с1зМус приводит к практически полному блокированию деления клеток КВ-3-1 (при 0.05 мкг/мл), и более чем в 10 раз замедляет пролиферацию клеток ЗК-Ы-МС. Трансфекция с^ЕОРР 10-кратно замедляет деление БК-Ы-МС, полностью блокирует пролиферацию КВ-3-1 и МСР-7, и не влияет на пролиферацию клеток НЬ-60. Гомополимер ро1у(1:С),

при трансфекции в концентрации 0.005 мкг/мл, не влияет на деление клеток КВ-3-1, SK-N-MC и HL-60, и вдвое замедляет деление MCF-7. При повышении его концентрации до 0.05 мкг/мл происходит полная остановка деления SK-N-MC и MCF-7, а также 2-кратное замедление деления КВ-3-1, в то время как скорость деления HL-60 остается без изменения (Табл. 4). Полученные данные свидетельствуют о том, что длинная дцРНК dsMyc оказывает более эффективное антипролиферативное действие, чем siPHK, направленная на тот же ген (siEx3, данные Т.О.Кабиловой) (Табл. 4). Это вероятно связано со вкладом интерферон-индуцирующего эффекта дцРНК. Уменьшение относительного уровня мРНК гена с-Мус в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC под действием препаратов dsMyc, dsEGFP и poly(I:C) коррелирует со значительным снижением скорости клеточной пролиферации. Более эффективное снижение скорости пролиферации КВ-3-1 под действием препарата dsMyc, чем под действием poly(I:C), вероятно, в данном случае связано с вкладом специфического подавления экспрессии гена с-Мус по механизму РНК-интерференции. Высокая антипролиферативная активность dsEGFP, сравнимая с активностью dsMyc, вероятно связана с более эффективной индукцией интерферонового ответа, а, возможно, и с наличием определенных последовательностей, которые затем после процессинга dsEGFP, в составе siPHK способны подавлять экспрессию других генов, ответственных за клеточную пролиферацию.

Ингибирование экспрессии гена РКС под действием 50 и 200 нМ siPKC снижает скорость деления клеток MCF-7 до уровня в 57 и 11%, соответственно (Табл. 4). Несмотря на то, что ген Нег2 является традиционной мишенью для генотерапевтического воздействия на клетки рака молочной железы, наши данные показывают, что в клетках MCF-7 ген РКС является более предпочтительной мишенью. Двухкратное снижение уровня экспрессии этого гена почти на порядок подавляет скорость пролиферации клеток линии MCF-7 (Рис. 2, Табл. 4). Ни одна из описанных выше siPHK не влияет на скорость пролиферации клеток HL-60 (Табл. 4). Можно предположить, что в клетках HL-60 активированы альтернативные пути передачи сигнала, способные компенсировать выключение единичных регуляторных генов и поддерживать клеточное деление, не исключено, что присутствующая в этих клетках химерная тирозинкиназа (c-ABL) компенсирует функции тех регуляторных факторов, экспрессия которых была снижена с помощью siPHK. Исходя из полученных экспериментальных данных, можно заключить, что гены Herl и CCNBI, по-видимому, не могут рассматриваться как перспективные мишени для антипролиферативных препаратов в клеточных линиях КВ-3-1 и HL-60, поскольку эффективное подавление экспрессии этих генов не вызывает значимого снижения скорости клеточного деления. Возможно, в клетках карциномы такой мишенью может

быть ген с-Мус, поскольку ранее в нашей лаборатории к. б. н. Кабиловой Т. О. было показано, что подавление экспрессии этого гена в клетках КВ-3-1 (200 нМ siEx3) практически полностью блокирует их пролиферацию (до 2% от контроля), а в клетках SK-N-MC - замедляет ее вдвое (Табл. 4).

Мы испытали полученную ранее анти-с-Мус s¡Ex3 на других клеточных линиях. Трансфекция клеток MCF-7 50 - 200 нМ siEx3 приводит к снижению скорости пролиферации до 20 - 70% от контроля, а скорость деления клеток HL-60 снижается до 40 - 80%, что может указывать на то, что ген с-Мус может являться перспективной мишенью для подавления пролиферации клеток HL-60 с помощью siPHK. Таким образом, наиболее эффективное ингибирование пролиферации клеток КВ-3-1 (до 2%) происходит при ингибировании экспрессии гена с-Мус. Для клеток SK-N-MC наиболее эффективной молекулярной мишенью, ингибирование которой оказывает антипролиферативное действие (до 4%) является ген CCNB1, для клеток MCF-7 - ген РКС (до 11%), а для клеток HL-60 - ген с-Мус (подавление до 40%). Полученные нами данные показали, что использование siPHK позволяет подобрать индивидуальную молекулярную мишень для антипролиферативных агентов в разных типах опухолевых клеток человека.

Кинетика изменения уровня экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС в клетках линий КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7 после трансфекцнн siPHK.

Важной информацией при исследовании антипролиферативного действия siPHK является длительность их специфического ингибирующего экспрессию генов-мишеней действия. Мы исследовали кинетику изменения относительного уровня экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС под действием siPHK (200 нМ) на протяжении первых 12 суток после трансфекции клеток КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7. Все исследуемые siPHK эффективно и специфично подавляют экспрессию своих генов-мишеней в использованных клеточных линиях, причем максимальное подавление (до 1 - 3% от контроля) наблюдается через 72 ч после трансфекции (Рис. 3). Через 72 ч после трансфекции уровень мРНК гена Не г2 составил 15% в клетках КВ-3-1, 4% в клетках SK-N-MC и 7% - в клетках линии MCF-7 относительно контроля. Уровень мРНК гена CCNBÍ через 72 ч после трансфекции siCyc понижался до 22% по сравнению с контролем в клетках КВ-3-1, до 16% - в SK-N-MC и до 18% - в клетках MCF-7. Трансфекция siPKC снижает уровень мРНК гена РКС в клетках MCF-7 до 14%. Полученные данные свидетельствуют о том, что siHer, как ингибитор экспрессии гена Нег2, наиболее эффективен в клетках линий SK-N-MC и MCF-7, a siCyc наиболее эффективно снижает уровень мРНК гена CCNBI в клетках SK-N-MC и MCF-7 (Рис. 3). Начиная с 4-го дня после трансфекции, уровень мРНК всех генов постепенно увеличивался и возвращался к исходному значению к 7 - 12 суткам после трансфекции. Постепенное восстановление исходного уровня мРНК в

А.

клетках может быть связано с клеточным делением, которое приводит к снижению концентрации біРНК в цитоплазме, и, как следствие, к ослаблению эффекта РНК-интерференции. Другой причиной снижения биологической эффективности также может быть расщепление біРНК под действием рибонуклеаз в цитоплазме и снижение их активной концентрации.

Б.

КВ-З-1

SK-N-MC

2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 Дни

MCF-7

Конфоль/Н«г2, CCNB1 —Л— »IScr/Her2

0123456789 1011 12 Дни

siScr/CCNB1 siCyc/CCNB1

23456789 10 11 12 Дни

Рис. 3. Относительный уровень мРНК генов Иег2, CCNB1 и РКС в клетках КВ-З-1 (А), SK-N-MC (Б) и MCF-7 (В) через 1 - 12 суток после трансфекции соответствующими siPHK (200 нМ). Уровень мРНК ß-актина использовали в качестве внутреннего стандарта. Контроль/ген - относительный уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках. siPHK/ген -относительный уровень мРНК

соответствующего гена в клетках после тоансФекнии указанной siPHK.

Проапоптотическая активность вШег, в1Сус, с^Мус, (^ЕСЕР и ро!у(1:С). Для выяснения механизма антипролиферативного действия исследованных з1РНК мы проанализировали их влияние на индукцию апоптоза, используя для этого метод селективного окрашивания живых, мертвых и находящихся в стадии апоптоза клеток. Все образцы, включая контрольные клетки, подвергнутые действию только трансфектанта, через 72 ч содержали определенный процент мертвых клеток (от 11 до 58%), в то время как популяция клеток перед трансфекцией содержала менее 10% мертвых клеток (Табл. 5). Это связано с определенной токсичностью самого трансфецирующего агента. После трансфекции в^Бсг, 5)Нег и эЮус доля мертвых клеток была различна для разных клеточных линий: минимальное их содержание обнаружено в популяции клеток НЬ-60 (10.4 - 15.2%), несколько больше в клетках КВ-З-1 (17.1 - 20.2%) и БК-М-МС (23.7 - 28%), а

наименее жизнеспособными оказались клетки линии МСР-7 (36.3 - 50.5% погибших клеток). Клетки, находящиеся в стадии апоптоза, обнаружены только в популяциях клеток линий КВ-3-1 (1.6 - 3.9%) и НЬ-60 (1.7-2.6%).

Таблица 5. Количество мертвых клеток (М) и клеток в стадии апоптоза (А) через 72 ч после трансфекции дцРНК*

——клетки дцРНК -- КВ-3-1 SK-N-MC MCF-7 HL-60

Контроль** А 2.5 - - 1.7

М 17.1 29.5 41.3 11.4

siScr, 200 нМ А 3.3 - - 2.1

М 17.1 23.7 46 15.2

siHer, 200 нМ А 3.9 - - 1.7

М 20.2 28 50.5 12.7

siCyc, 200 иМ А 1.6 - - 2.6

М 17.3 26 36.2 10.4

dsMyc, 0.05 мкг/мл А 0.32 - - -

М 35.5 - - -

dsEGFP, 0.05 мкг/мл А 0.28 - - -

М 58.5 - - -

ро!у(1:С), 0.05 мкг/мл А 0.3 - - -

М 24.7 - - -

•Данные представлены как средние значения по результатам трех независимых экспериментов. Стандартное отклонение составляет < 10%. ** Клетки, обработанные только трансфектантом.

В популяции КВ-3-1 после трансфекции 0.05 мкг/мл dsMyc, dsEGFP и poly(I:C) доля мертвых клеток составляет, соответственно, 35, 58 и 24%. Из этих данных видно, что доля мертвых клеток в популяции КВ-3-1 через 72 ч после трансфекции значительно превышает таковую после обработки siPHK, что вероятно связано с индукцией интерферонового ответа и вызванной им клеточной гибелью (Табл. 5).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в популяциях, обработанных как контрольной siPHK, так и siPHK, направленными на мРНК генов CCNB1, Нег2 и РКС, не происходит увеличения количества мертвых и находящихся в стадии апоптоза клеток по сравнению с препаратами клеток, обработанных только трансфектантом. Можно предположить, что в используемых клеточных линиях не клеточная гибель, а подавление клеточного деления лежит в основе антипролиферативной активности исследованных siPHK.

Пролиферация клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7 после восстановления исходного уровня экспрессии генов с-Мус, Her2, CCNB1 и РКС. Зависимость скорости пролиферации клеток КВ-3-1, SK-N-MC и

МСР-7 от уровня экспрессии генов Нег2, ССЫВ1 и РКС оценивали с помощью МТТ-теста в период с 7 по 12 день после трансфекции соответствующей 51РНК (200 нМ), принимая скорость пролиферации клеток в контрольных образцах за 100% (Табл. 6).

Таблица 6. Скорость деления клеток КВ-3-1, 8К-Ы-МС, МСР-7 после восстановления исходного уровня экспрессии генов-мишеней

в!РНК, 200 нМ Скорость пролиферации*, %

КВ-3-1 вк-х-мс МСР-7

Контроль** 100±7 100±6 100±3

яйсг 113±10 : 90±7 93±6

«¡Нег 123±8 36±9 78±2

$1Сус 112±9 ■ • 14±4 73±2

в1РКС 117±14 9±3 79±2

•Представлены средние значения по результатам трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. "Клетки, обработанные только трансфектантом.

Показано, что скорость пролиферации клеток линии КВ-3-1 после восстановления исходных уровней экспрессии генов-мишеней (Нег2, ССИВ1) практически не отличается от скорости пролиферации контрольных клеток. После трансфекции эИег скорость деления клеток БК-Ы-МС и МСР-7 в интервале 7-12 суток составляла 36 и 78% от уровня в контроле, соответственно. Скорость пролиферации клеток 8К-Ы-МС и МСР-7, обработанных БЮус, оставалась на уровне 14 и 73%, а клеток, подвергнутых действию б1РКС - 9 и 79% от уровня в контроле, соответственно (Табл. 6). Как видно из Табл. 6, использованные клеточные линии можно условно разделить на три группы: клетки, скорость пролиферации которых полностью восстанавливается (КВ-3-1); скорость пролиферации которых остается значительно сниженной (¿К-Ы-МС); и клетки, скорость пролиферации которых остается незначительно сниженной после восстановления исходного уровня мРНК генов-мишеней. Вероятно, временное подавление экспрессии генов Нег2, ССЫВ1, РКС не приводит к необратимым изменениям в регуляторных системах клеток КВ-3-1, поэтому при восстановлении уровней мРНК этих генов восстанавливается скорость их пролиферации. В культуре клеток БК-М-МС временное выключение экспрессии генов Не г 2, ССМВ1 и РКС приводит к значительному замедлению деления клеток, даже после восстановления исходного уровня мРНК генов-мишеней (Табл. 6). Выраженный антипролиферативный эффект (5-10 раз) кратковременного выключения экспрессии этих генов сохраняется до 12 суток инкубации, причем антипролиферативный эффект ингибирования экспрессии генов ССШ/ и РКС существенно выше эффекта, обусловленного

БМег. Длительное антипролиферативное действие б1РКС на клетки БК-Ы-МС является довольно неожиданным, поскольку в этих клетках не наблюдается гиперэкспрессия гена РКС{Рис. 1А). Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее эффективная мишень в клетках нейробластомы БК-Ы-МС - ген ССЫВ1, а в клетках рака молочной железы МСР-7 - ген РКС, эти гены можно рассматривать как перспективные терапевтические мишени для препаратов, предназначенных для лечения нейробластом и рака молочной железы.

Аналогичное исследование мы выполнили на клетках КВ-3-1 и БК-К-МС после трансфекции длинными дцРНК сЬМус, ёБЕСРР (0.005 мкг/мл) и 0.05 мкг/мл ро1у(1:С) (Табл. 7), Показано, что в интервале 7-12 суток после трансфекции 0.005 мкг/мл <ЬМус скорость пролиферации клеток КВ-3-1 уменьшена до 55% от контрольной, а БК-ЬГ-МС - до 20%. Через 7-12 дней после трансфекции 0.005 мкг/мл <1бЕСРР, а также после 0.05 мкг/мл ро1у(1:С) скорость деления КВ-3-1 восстанавливается до скорости в контроле.

Таблица 7. Скорость деления клеток КВ-3-1 и БК-ЬГ-МС в интервале 7-12 дней после трансфекции 0.005 мкг/мл скМус, с^ЕвЕР и 0.05 мкг/мл ро1у(1:С)

дцРНК Скорость пролиферации*, %

КВ-3-1 SK-N-MC

Контроль** 100±3 100±7

dsMyc, 0.005 мкг/мл 55±4 21±3

dsEGFP, 0.005 мкг/мл 94±4 46±4

poly(I:C), 0.05 мкг/мл 95±2 13±2

"Представлены средние значения по результатам трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. "Клетки, обработанные только трансфектантом.

Скорость деления SK-N-MC остается сниженной, соответственно, до 46 и 13% от контроля. dsEGFP, при сравнимом антипролиферативном эффекте на обеих клеточных линиях через 1 - 5 дней после трансфекции, оказывает более длительное антипролиферанивное действие на клетки SK-N-MC. Длительность антипролиферативного действия poly(I:C) на клетки SK-N-MC сопоставима с длительностью действия siPHK, однако проявляется только при высокой концентрации.

Влияние ингибирования экспрессии генов CCNB1 и РКС на морфологические характеристики клеток линии SK-N-MC. Поскольку наиболее сильный антипролиферативный эффект наблюдается при ингибировании экспрессии CCNB1 и РКС в культуре клеток SK-N-MC (Табл. 4, 6), то мы провели микроскопическое изучение морфологии этих клеток после воздействия 200 нМ siCyc и siPKC. Установлено, что культура SK-N-MC, обработанная олигофектамином (контроль), через 24 ч инкубации представлена разными типами клеток: "островные", распластанные

нейроноподобные, веретеновидные клетки. При одинаковой посевной дозе за 3 дня инкубации контрольные клетки культуры и клетки трансфицированные siScr, практически полностью заполняли площадь стекла, тогда как трансфекция siCyc и siPKC резко замедляла размножение клеток, их число на стекле в это же время было несравнимо меньше (Рис. 4). Также наблюдалось резкое уменьшение числа митозов в клетках (Табл. 8). Даже через 12 дней после трансфекции siCyc количество клеток на стеклах было существенно меньше, чем в контроле через 3 дня после трансфекции. Количество клеток на стекле через 12 дней после трансфекции siPKC превышало их количество после трансфекции siCyc. Таким образом, результаты микроскопического изучения клеток SK-N-MC после трансфекции этими siPHK согласуются с данными по их влиянию на скорость пролиферации этих клеток.

Изучение морфологии клеток SK-N-MC через 3-12 дней после трансфекции показало, что временное ингибирование экспрессии генов CCNB1 и РКС не приводит к их гибели или терминальной дифференцировке, на что указывает сохранение разных типов клеток в популяции, а приводит к задержке клеточного деления.

Постепенное увеличение к 10 - 12 суток инкубации суммарного количества клеток в препаратах, трансфицированных специфическими siPHK, и клеток в стадии митоза (Табл. 8), в частности, указывает на то, что длительность антипролиферативного действия этих siPHK в клетках SK-N-MC, по-видимому, ограничена 12 - 15 сутками.

Рис. 4. Клетки нейробластомы SK-N-MC на стекле (тотальные препараты). Контрольные клетки (обработка только

трансфектантом): А - 1 сутки инкубации, Б - 3 суток инкубации. Трансфекция 200 нМ siScr: В -1 сутки инкубации, Г - 3 сутки инкубации. Трансфекция siCyc: Д - 3 суток инкубации, Е -12 суток инкубации. Трансфекция siPKC: Ж - 3 суток инкубации, 3 -12 суток инкубации. Окраска гематоксилином. Длина

масштабной линии 200 мкм.

í-j . ..•■»" • >••»■. I *1 . —I 1 и? V . ' - Л' ч ,; , \ * т ^ _

' - Л ¿-I * * v; . s / ъ * 1 ¿ г к ь i ^

- < Г,. : . :J ц - .,->- v v г З.у.;. * /* ГГ"«v"-

.... .:.»■ t. .'. » 1 * ..... .'. .»-г.. Л t"" /> * ! ■ < ; t л „ V* '¿> 4 i -I»* -г,.*,-. <...,■»-

Таблица 8. Количество клеток SK-N-MC в фазе митоза через 1 - 12 суток после трансфекции siCyc и siPKC (200 нМ)

Дни Количество митозов на 1000 клеток

Контроль* siScr siCyc siPKC Контроль без трансфектанта

1 14 ±5 16 ± 8 - - -

2 40 ± 16 25 ±7 - - 22 ±15

3 21 ±10 33 ±12 15 ± 11 16 ±7

5 - - 30 ±12 20 ± 11 -

7 - - 28 ±6 35 ±5 -

12 - - 30±6 49 ± 14 -

* Клетки, обработанные только трансфектантом. (-) - не определяли.

Полногеномный анализ экспрессии генов на микрочнпах в клетках 8К-1Ч-МС после подавления экспрессии генов ССТУ-Й/ и РКС. Для более детального изучения антипролиферативного действия исследуемых 51РНК вЮус и б1РКС был выполнен полногеномный анализ экспрессии генов в клетках БК-Ы-МС с использованием микрочипов. При сравнении профиля генной экспрессии в клетках БК-Ы-МС через 3 и 7 дней после трансфекции 200 нМ БЮус и $1РКС, с целью выявить общие гены, экспрессия которых одновременно повышается либо понижается после обработки этими з1РНК, было выявлено 3 гена экспрессия которых понижается на 3 день и 2 гена - на 7-й день, а также 30 общих транскриптов, уровень которых оказался повышен через 7 дней после трансфекции как в^ус, так и 51РКС (Рис. 5).

Повышение Понижение Повышение Понижение

Рис. 5. Сравнение профилей генной экспрессии в клетках SK-N-MC через 3 дня (А) и 7 дней (Б) после трансфекции 200 нМ síCyc и siPKC, нормированных на контрольные клетки.

Анализ распределения этих транскриптов по функциональным категориям генов показал, что они участвуют в таких важных клеточных процессах, как метаболизм, апоптоз и транспорт ионов (Табл. 9).

Изучение регуляторных схем, в которых участвуют выявленные гены, показало, что изменение экспрессии EN02 - известного маркера нейрональной дифференцировки участвующего в метаболизме глюкозы, а также экспрессии AK3L1 - регулятора метаболизма пуриновых нуклеотидов, могут быть факторами, замедляющими клеточное деление после восстановления экспрессии генов-мишеней siPHK. Анализ показал, что наибольшее изменение уровня экспрессии через 7 дней после трансфекции siPKC и siCyc наблюдается для генов, кодирующих: альдолазу С - участника метаболизма Сахаров в клетках мозга; DDIT4, TXNIP и BNIP3 - регуляторов апоптоза и клеточного цикла.

Таким образом, проведенный транскрипционный анализ генов в клетках SK-N-MC, после трансфекции 200 нМ siCyc и siPKC, выявил изменения в уровнях экспрессии генов, которые также косвенно могут быть причастны к антипролиферативному действию исследуемых siPHK.

Таблица 9. Распределение по функциональным категориям генов, экспрессия которых увеличена по сравнению с контролем (Р < 0.01) в клетках БК-Ы-МС, через 7 дней после трансфекции, как 200 нМ БІСус так и біРКС

Ген Функция Категория

люос Фруктозо-дифосфат альдолаза; гликолиз, глюконеогенез, пентозо-фосфатный путь, метаболизм фруктозы и маннозы

ЛСЖ Ацетил-СоА синтаза; гликолиз, глюконеогенез, метаболизм пировиноградной и пропановой кислот

РР№В4 б-Фосфо-фрукто-2-киназа, фруктозо-2,6-бифосфатаза; метаболизм глюкозы, фруктозы и маннозы

ЕИ02 Енолаза; гликолиз, глюконеогенез, метаболизм глюкозы Метаболизм

НК1 Гексокиназа; синтез углеводов

тюі Регуляция концентрации холестерина в клетке

НКЮСЗІ З-гидрокси-З-метилглутарил-СоА синтаза; синтез холестерина

ТМ75Р2 Синтез стероидов, холестерина

Е4И52 Синтез ненасыщенных жирных кислот

леи АТР-цитрат лиаза, синтез липидов, цикл лимонной кислоты

АКЗЫ Аденилат киназа; метаболизм пуринов и пуриновых нуклеотидов

СУР4И22 Монооксигеназа, цитохром Р450

БІС 16АЗ Трансмембранный транспортер монокарбоксильных жирных кислот Метаболизм, транспорт

81С2АЗ Трансмембранный транспортер глюкозы

БІС2уі1 Транспорт глюкозы

ССОС155 Связывание ионов Са2' Транспорт

ЫТАР Позитивная регуляция путей 1-кВ киназы и ОТ-кВ

ВМІРЗЬ Защитный антивирусный ответ, апопгоз

ВШРЗ Индукция апоптоза Апоптоз

ТШР Индукция апоптоза; клеточный цикл

иит Связывание белков семейства 14-3-3

ТРТ1 Ингибирование апоптоза, гомеостаз Са2+

выводы

1. Разработаны siPHK (siHer, siCyc, siPKC), направленные к мРНК генов Her2, CCNB1 и РКС. Показано, что данные siPHK специфично ингибируют экспрессию генов-мишеней в клетках КВ-3-1, SK-N-МС, MCF-7 и HL-60: наибольшее снижение уровня мРНК-мишеней (до 10 - 20% от контроля) достигается через 3 суток после трансфекции, а исходный уровень экспрессии восстанавливается через 7 суток.

2. Показано, что ингибирование экспрессии генов Herl, CCNB1 и РКС с разной эффективностью замедляет деление клеток КВ-3-1, SK-N-МС, MCF-7, однако не влияет на пролиферацию клеток HL-60. Обнаружено, что наиболее выраженный антипролиферативный эффект наблюдается в клетках нейробластомы SK-N-MC под действием siCyc, а рост клеток MCF-7 наиболее эффективно тормозится под действием siPKC. Сравнение антипролиферативного действия siPHK, направленных к мРНК генов Her2, CCNB1 и РКС, на опухолевые клетки различного происхождения выполнено впервые.

3. Получены дцРНК, гомологичные мРНК генов с-Мус (dsMyc) и GFP (dsEGFP) длиной 473 и 448 п.н., соответственно. Показано, что препарат dsMyc, действующий как по механизму РНК-интерференции, так и через индукцию интерферонового ответа, снижает уровень экспрессии интерферон-чувствительного гена с-Мус более эффективно, чем препарат dsEGFP, действующий только по пути индукции интерферонового ответа. При этом оба препарата дцРНК со сравнимой эффективностью замедляют деление клеток КВ-3-1 и SK-N-MC.

4. Впервые изучено изменение скорости пролиферации исследованных клеточных линий после восстановления экспрессии генов Нег2, CCNB1 и РКС. Показано, что скорость деления клеток КВ-3-1 восстанавливается после достижения исходного уровня экспрессии генов-мишеней, в то время как скорость деления SK-N-MC остается в 3 - 10 раз сниженной до 12 суток после воздействия siHer, siCyc и siPKC, а также длинных дцРНК.

5. Показано, что введение в клетки siPHK, направленных к мРНК генов Her2, CCNB1 и РКС не вызывает гибели клеток, а подавляет их деление, что подтверждается данными морфологического анализа. Напротив, доля мертвых клеток в популяции, трансфецированной длинной дцРНК значительно увеличивается, что связано с индукцией интерферонового ответа и вызванной им гибелью клеток.

6. С помощью полногеномного анализа транскриптома клеток SK-N-МС, трансфецированных siCyc и siPKC, обнаружено, что после восстановления экспрессии генов-мишеней, экспрессия определенных генов (EN02, AK3LI, ALDOC, TXNIP, BNIP, DDIT4 и др.) остается измененной, что может обуславливать длительное антипролиферативное действие исследуемых siPHK в этой клеточной линии.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Akimov I.A.. Kabilova Т.О., Vtassov V.V., Chernolovskaya E.L. Inhibition of human cancer-cell proliferation by long double-stranded RNAs. // Oligonucleotides. -2009. -V. 19. -P. 31-40.

2. Акимов И.А.. Черноловская E.JI. Подавление экспрессии генов CCNB1, Нег2 и РКС с помощью малых интерферирующих РНК с разной эффективностью замедляет деление раковых клеток человека различного происхождения. // Молекулярная Биология. -2010. -Т. 44. -С. 98-106.

3. Акимов И.А.. Черноловская E.JI., Спицына Ю.Е., Рябчикова Е.И., Зенкова М.А. Подавление экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС с помощью siPHK снижает скорость пролиферации клеток нейробластомы человека на длительное время.//Acta Naturae. -2011.-Т. 3. -С. 31-41.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акимов, Иван Алексеевич, Новосибирск

61 12-3/1191

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины

На правах рукописи

АКИМОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ

ИНТЕРФЕРИРУЮЩАЯ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ дцРНК В КУЛЬТУРАХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук Черноловская Е. Л.

НОВОСИБИРСК - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.....................................................................................5

Введение...................................................................................................7

Глава 1. Коррекция нарушений клеточного цикла с помощью siPHK (обзор литературы).............................................................................................10

1.1. Введение: Регуляция клеточного цикла и ее нарушения как мишени для действия интерферирующих РНК................................................................ 10

1.2. Регуляция клеточного цикла....................................................................12

1.2.1. Циклины и циклин-зависимые киназы......................................................12

1.2.2. Регуляция активности циклинов и циклин-зависимых киназ...........................15

1.2.3. "Точки проверки" клеточного цикла..........................................................17

1.3. Нарушения клеточного цикла и их причины..............................................21

1.3.1. Her2 (c-erb-B2/Neu).............................................................................26

1.3.2. Циклин В1......................................................................................... 30

1.3.3. Протеинкиназа С (РКС).......................................................................31

1.4. Клеточная дифференцировка.................................................................35

1.4.1. Процессы клеточной дифференцировки....................................................35

1.4.2. Индукторы клеточной дифференцировки.................................................37

1.5. Ингибирование экспрессии генов с помощью siPHK....................................43

1.5.1. РНК — интерференция.........................................................................43

1.5.2. Активация системы врожденного иммунитета под действием дцРНК............46

1.5.3. Клинические испытания препаратов на основе siPHK.................................51

1.5.4. Индукция клеточной дифференцировки с помощью siPHK............................56

1.6. Заключение.........................................................................................59

Глава 2. Экспериментальная часть..............................................................60

2.1. Материалы и оборудование...................................................................60

2.1.1. Реактивы и препараты........................................................................60

2.1.2. Растворы и буферы, использованные в работе..........................................61

2.1.3. Оборудование....................................................................................62

2.1.4. Клеточные линии...............................................................................62

2.1.5. Олигонуклеотиды, siPHK и длинные дцРНК................................................62

2.2. Методы.............................................................................................65

2.2.1. Ферментативный синтез длинных дцРНК................................................65

2.2.2. Приготовление дуплексов РНК...............................................................66

2.2.3. Очистка ферментативно синтезированных длинных дцРНК........................66

2.2.4. Трансфекция клеток siPHK и длинными дцРНК..........................................67

2.2.5. Определение количества живых клеток (МТТ-тест)..................................68

2.2.6. Микроскопический анализ.....................................................................68

2.2.7. Определение доли мертвых и вошедших в стадию апоптоза клеток в популяции...................................... ...........................................................69

2.2.8. Выделение суммарной клеточной РНК.....................................................70

2.2.9. Обратная транскрипция (получение кДНК)..............................................70

2.2.10. ПЦР..............................................................................................71

2.2.11. Гель-электрофорез...........................................................................71

2.2.11.1. Электрофорез вПААГв денатурирующих условиях...............................71

2.2.11.2. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях.........................................72

2.2.11.3. Электрофорез в агарозном геле.........................................................72

2.2.12. Полногеномный анализ экспрессии генов на микрочипах.............................72

2.2.13. Статистика.....................................................................................73

Глава 3. Интерферирующая и антипролиферативная активности препаратов дцРНК в культурах опухолевых клеток человека различного происхождения (результаты и обсуждение)...............................................................................................74

3.1. Выбор генов-мишеней и клеточных линий...............................................74

3.2. Выбор препаратов siPHK и длинных дцРНК и стратегия исследования.........77

3.3. Подавление экспрессии генов Her2 (c-erb-B2), CCNB1, РКС и с-Мус в клеточных линиях КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 под действием siPHK и дцРНК.............78

3.4. Пролиферация клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 после подавления экспрессии генов Her2, CCNB1, РКС и с-Мус....................................84

3.5. Исследование кинетики изменения уровня экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС в клетках линий КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7 после трансфекции siPHK................ 90

3.6. Проапоптотическая активность siHer, siCyc, dsMyc, dsEGFP и poly(I:C).......93

3.7. Пролиферация клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7 после восстановления исходного уровня экспрессии генов с-Мус, Her2, CCNB1 и РКС............................95

3.8. Влияние ингибирования экспрессии генов CCNB1 и РКС на морфологические характеристики клеток линии SK-N-MC......................................................103

3.9. Полногеномный анализ экспрессии генов на микрочипах в клетках БК-И-МС после подавления экспрессии генов ССМВ1 и РКС.......................................... 109

3.10. Заключение......................................................................................123

Выводы.................................................................................................125

Список литературы..................................................................................127

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе были использованы следующие сокращения:

а. о. аминокислотный остаток

бромистый этидий 3,8-диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид

бромфеноловый синий -тетр абромф ено л суль ф о фтал еин

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ДК дендритная клетка

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

дцРНК двуцепочечная рибонуклеиновая кислота

ед. акт. единицы активности

кДа килодальтон

кДНК комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота

кл./лун. клеток на лунку

кРНК комплиментарная рибонуклеиновая кислота

мРНК матричная (информационная) рибонуклеиновая кислота

МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид

н. нуклеотид

ОТ-ПЦР обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

п. н. пара нуклеотидов

ПААГ полиакриламидный гель

РНК рибонуклеиновая кислота

Твин-20 полиоксиацетилен-20-сорбитанмонолауриновая кислота

Трис трис-(оксиметил)-аминометан

(32т (Зг-микроглобулин

BSA бычий сывороточный альбумин

CDK циклин-зависимая киназа

CKI ингибитор циклин-зависимой киназы

DMEM ростовая среда Игла в модификации Дульбекко

DMSO диметилсульфоксид

dNTP дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

DTT 1,4-дитиотреитол

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

EGF эпидермальный фактор роста

EGFR рецептор эпидермального фактора роста

FBS эмбриональная телячья сыворотка

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота

INF интерферон

miPHK микро-РНК

MMLV вирус лейкоза мышей

Na2EDTA двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

NaAc ацетат натрия

NGF фактор роста нервов

NTP рибонуклеозидтрифосфаты

OAS дцРНК-зависимая-2" -5" -олигоаденилатсинтетаза

Opti-MEM оптимизированная минимальная ростовая среда

об./мин оборотов в минуту

PBS фосфатный солевой буфер

PKR дцРНК-зависимая протеинкиназа R

poly(I:C) поли-инозиновая-поли-цитидиловая кислота

PSA персульфат аммония

RISC РНК-зависимый ингибирующий комплекс

RPMI-1640 ростовая среда "Roswell Park Memorial Institute"

SDS додецилсульфат натрия

siPHK малая интерферирующая РНК

Stains-All 4,5,4" ,5"-дибензо-3,3" -диэтил-9-метилтиакарбоцианинбромид

TEMED N,N,N' ,N' -тетраметилэтилендиамин

TGF трансформирующий ростовой фактор

TLR То11-подобные рецепторы

TNF фактор некроза опухоли

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время одной из первоочередных задач онкологии является повышение эффективности лечения опухолей, как путем разработки новых методов лечения, так и путем совершенствования традиционных терапевтических подходов. Хирургическое вмешательство, радиационное облучение и химиотерапия остаются классическими и наиболее распространенными методами лечения онкологических заболеваний. К сожалению, даже комплекс современных противоопухолевых мероприятий, часто не приводит к полной элиминации опухолевых клеток. Поэтому, несмотря на заметные достижения в области терапии онкологических заболеваний, увеличение эффективности лечения злокачественных опухолей и снижение токсичности химиотерапии путем создания лекарственных средств ген-направленного действия являются исключительно актуальными.

Важную роль в процессе злокачественной трансформации клеток играют гены, гиперэкспрессия которых приводит к неконтролируемой пролиферации (белки-регуляторы клеточного цикла) [ 1 ], блокированию апоптоза [ 2 ], нарушению процессов дифференцировки [3], повышению уровня генетической нестабильности [4], а также к усилению инвазивных свойств опухолевой клетки [5-9]. Наиболее часто, в опухолевых клетках наблюдается экспрессия мутантных форм или гиперэкспрессия нормальных клеточных генов, кодирующих рецепторы, транскрипционные факторы, тирозин-киназы и другие регуляторные белки.

Пути передачи сигналов в клетке включают множество дублирующих друг друга элементов, поэтому при подавлении экспрессии одного клеточного фактора, участвующего в передаче сигнала, возможна компенсация его функции путем активации альтернативного сигнального пути [9]. В связи с этим, поиск клеточных мишеней для направленного действия терапевтических агентов различной природы является актуальной задачей.

РНК-интерференция представляет собой процесс деградации мРНК-мишени, который индуцируется под действием двуцепочечных интерферирующих РНК длиной не менее 21-23 звеньев, гомологичных участку данной мРНК[10]. Этот процесс является эффективным способом регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках, появившимся в процессе эволюции. Введение в клетку з1РНК определенной последовательности позволяет эффективно снизить уровень экспрессии генов, ассоциированных с заболеванием, до уровня, соответствующего уровню этой мРНК в нормальных клетках. На сегодняшний день интерферирующие РНК рассматриваются

не только как перспективные лекарственные препараты, но и как эффективный инструмент для поиска молекулярных мишеней для действия лекарственных препаратов. Исследования показывают, что в каждом конкретном случае онкологического заболевания экспрессия большого числа генов, активирована или репрессирована по сравнению с нормальными родительскими клетками, и, исходя из этого, установление хронологии событий злокачественной трансформации является проблематичным [9]. Тем не менее, подавление экспрессии генов, которые кодируют белки, функционально расположенные на пересечении регуляторных каскадов или в начале этих каскадов, может привести к восстановлению контроля над делением клеток [11]. Взаимодействия различных генов, участвующих в процессах канцерогенеза интенсивно исследуются, но роль каждого гена в сложной системе с более чем одним генетическим нарушением требует углубленного изучения [12]. Нарушение регуляции генов, кодирующих компоненты передачи сигналов клеточного цикла рассматривается как ключевой фактор в развитии различных типов опухолей у человека[9, И, 12], тем не менее, терапевтическая значимость ингибирования таких генов в опухолях различного происхождения может существенно отличаться, поэтому для выбора наиболее эффективных мишеней требуется сравнение антипролиферативного действия игибиторов потенциальных мишеней на опухолевых клетках различного происхождения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание специфических ингибиторов экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла: Нег2 (с-егЬ-В2, пей), ССНВ1 (циклин В1) и РКС (протеинкиназа С), на основе дцРНК и исследование влияния этих ингибиторов на пролиферацию опухолевых клеток человека различного происхождения. В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Исследовать эффективность и длительность ингибирующего действия малых интерферирующих РНК фРНК), направленных на мРНК генов Нег2, ССШ1 и РКС в опухолевых клетках человека различного происхождения.

2. Исследовать влияние длинных дцРНК, гомологичных мРНК генов с-Мус и ОРР на пролиферацию опухолевых клеток человека.

3. Исследовать изменение скорости пролиферации опухолевых клеток различного происхождения, подвергнутых действию з1РНК, направленных на мРНК генов Нег2, ССЫВ1 и РКС, после восстановления экспрессии генов-мишеней.

4. Исследовать влияние полученных з1РНК на изменение генной экспрессии в опухолевых клетках человека и их жизнеспособность.

ГЛАВА 1. КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА С ПОМОЩЬЮ

81РНК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Введение: Регуляция клеточного цикла и ее нарушения как мишени для действия интерферирующих РНК.

Деление клетки является сложным процессом, протекание которого контролируется многочисленными регуляторными системами, включающими дублирующие элементы. Нарушение нормальной регуляции клеточного цикла является причиной появления большинства опухолей. Постепенное накопление комплекса генетических и эпигенетических аномалий [ 11,13,14] приводит к формированию злокачественного фенотипа, характеризующегося выраженным тканевым атипизмом, агрессивным ростом и склонностью к метастазированию с образованием новых очагов опухолевого роста [15]. В болыпенстве случаев установить первопричину этих изменений не представляется возможным.

Деление эукариотической клетки состоит из последовательных процессов репликации ДНК и сегрегации удвоенных хромосом по двум дочерним клеткам. Во время каждого деления в клетке происходит серия упорядоченных событий, из которых состоит клеточный цикл (Рис. 1).

6.

Рис. 1. Фазы клеточного цикла. Схема составлена по данным [ 12].

Изначально, в клеточном цикле выделяли только два этапа: митоз (М), то есть процесс деления ядра, и интерфазу (период между двумя митозами). В стадии митоза принято выделять: профазу, метафазу, анафазу, телофазу и цитокинез. Интерфаза состоит из фаз вь Э и йг [ 16]. В периоде О! происходит подготовка клетки к синтезу ДНК (проверка ДНК на отсутствие повреждений, синтез мРНК и необходимых для репликации белков, синтез дезоксирибонуклеозидтрифосфатов), в период Э-фазы происходит удвоение генома (репликация ДНК), в вг-фазе клетка подготавливается к митозу (увеличение числа органелл, синтез АТФ). В профазе формируются центриоли, ядерная оболочка начинает исчезать, формируется веретено деления, хроматин компактизуется, формируя сестринские хроматиды с центромерами. В метафазе сестринские хроматиды компактизуются, прикрепляются к нитям веретена деления через центромеры и выстраиваются посередине клетки. В анафазе центромеры исчезают, сестринские хроматиды расходятся и становятся хромосомами, которые расходятся к противоположным концам клетки, возобновляется синтез РНК и белков. В телофазе происходит декомпактизация хроматина, формирование ядерной оболочки и ядрышка. При цитокинезе клеточная мембрана движется внутрь, происходит деление цитоплазмы, формируются две дочерние клетки, каждая из которых обладает собственным ядром и идентичными наборами хромосом. Таким образом, в М-фазе происходит распределение наборов полностью сформировавшихся хромосом между дочерними клетками (Рис. 1).

В зависимости от внешних сигналов, получаемых клетками, и от стадии развития, клетки находящиеся в Огфазе могут временно или навсегда покидать клеточный цикл, входя в особую стадию покоя (задержки), названную О0-фазой (Рис. 1); клетки находящиеся в этой стадии составляют большую часть неделящихся клеток в многоклеточном организме. В процессе развития организма, типичный соматический цикл деления клетки может меняться для обеспечения выполнения ею специфических функций. Среди разновидностей клеточного цикла выделяют: эмбриональный клеточный цикл, который лишен фаз О] и вг; мейотический цикл, обеспечивающий формирование гаплоидных гамет; и эндорепликативный цикл, в котором за Б-фазой не следует митоз.

Установлено, что индивидуальные события, управляющие делением ранних эмбриональных эукариотических клеток, происходят независимо друг от друга [1719]. В клетках некоторых ранних эмбрионов клеточный цикл осциллирует между двумя стадиями: митозом и интерфазой [20]. И наоборот, соматические клетки

проходят через такие события, как синтез ДНК, разрушение ядерной мембраны и цитокинез, строго определенным образом: инициализация поздних событий зависит от завершенности более ранних [21 ]. Важнейшую роль в этом играют "точки проверки", нарушение контроля во время этих стадий может приводить к накоплению генетических аббераций и способствовать злокачественной трансформации.

Внешние сигналы и внутренняя генетическая программа клетки предопределяют, будет ли она вступать в следующий цикл деления.