Ингибирование экспрессии онкогенов семейства myc и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью двуцепочечных интерферирующих РНК

Кабилова, Татьяна Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ингибирование экспрессии онкогенов семейства myc и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью двуцепочечных интерферирующих РНК
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ингибирование экспрессии онкогенов семейства myc и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью двуцепочечных интерферирующих РНК"

На правах рукописи

КАБИЛОВА ТАТЬЯНА ОЛЕГОВНА

Ингибирование экспрессии онкогенов семейства туе и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью "" двуцепочечных интерферирующих РНК

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2007 г.

003068578

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н. Черноловская Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Дыгало Николай Николаевич д.б.н., профессор Загребельный Станислав Николаевич

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « /У » ¡уЛклА 2007 г. в № часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « И » (ХОЛМСА! 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Д.Х.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Транскрипционные факторы с-Мус и И-Мус участвуют в контроле клеточной пролиферации, дифференцировке и канцерогенезе. Эти факторы рассматриваются как перспективные терапевтические мишени, так как они стоят в начале каскада сигнальных событий, приводящих к злокачественному перерождению клеток. Гиперэкспрессия гена с-тус наблюдается в таких опухолях, как миеломы, лимфомы, карциномы, нейробластомы и др., в то время как Ы-тус играет ключевую роль при развитии ретинобластом и нейробластом - опухолей, наиболее часто встречающихся у детей. Идентификация высокоэффективных и специфичных ингибиторов пролиферации опухолевых клеток является актуальной проблемой, как молекулярной биологии, так и медицины. Одним из возможных путей ингибирования пролиферации опухолевых клеток могло бы стать избирательное подавление экспрессии генов семейства туе с помощью ген-направленных биологически активных препаратов, адресованных к мРНК генов с-тус и И-тус. Короткие интерферирующие РНК фРНК) рассматриваются как перспективные препараты для применения в терапии, благодаря их уникальной способности запускать в клетках процесс РНК-интерференции (РНКи), приводящий к специфической деградации мРНК гомологичных им генов.

Особый интерес в качестве ингибиторов пролиферации раковых клеток представляют длинные дцРНК, способные активировать интерфероновый ответ, вызывающий подавление интерферон-чувствительных генов, в том числе с- и И-тус, а также неспецифическое ингибирование синтеза мРНК и белка, и индуцирующий гибель клеток путем апоптоза.

Таким образом, создание высокоэффективных дцРНК, действующих как по механизму РНК-интерференции и направленных на подавление экспрессии генов с-тус и И-тус, так и дцРНК - индукторов интерферонового ответа является актуальной проблемой молекулярной биологии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось создание специфических ингибиторов экспрессии протоонкогенов с-тус и Ы-тус и индукторов интерферонового ответа на основе двуцепочечных РНК и исследование их действия на пролиферацию раковых клеток человека различного происхождения. В ходе исследования решались следующие задачи:

- Получить с помощью ферментативного синтеза siPHK и протяженные дцРНК, соответствующие различным участкам генов с-тус и N-myc и исследовать их действие на экспрессию генов-мишеней в клетках КВ-3-1, SK-N-MC и IMR-32.

- Исследовать действие полученных siPHK и дцРНК на пролиферацию опухолевых клеток человека различного происхождения.

- Исследовать динамику изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа под действием siPHK и дцРНК.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые предложено использование siPHK, специфично снижающей экспрессию двух генов-мишеней одновременно. Полученная siPHK, гомологичная мРНК генов с-тус и N-myc, способна с высокой эффективностью снижать экспрессию генов-мишеней и оказывать значительное антипролиферативное действие на раковые клетки человека. Изученная анти-с-тус siPHK оказалась наиболее эффективной по сравнению с описанными в литературе в подавлении экспрессии этого гена и клеточной пролиферации. В работе впервые было проведено подробное исследование ингибирования экспрессии гена N-myc с помощью siPHK.

Впервые предложено использование длинной дцРНК (dsMyc) гомологичной мРНК гена с-тус способной к эффективному подавлению экспрессии гена-мишени одновременно по двум механизмам: РНК-интерференции и индукции неспецифического интерферонового ответа. Показано, что dsMyc при проникновении в клетки способна эффективно снижать уровень экспрессии интерферон-чувствительных генов с-тус и р-актина, и скорость клеточной пролиферации, а также повышать уровень экспрессии генов-маркёров интерферонового ответа OAS1 и PKR. Разработанные янти-тус siPHK и длинная дцРНК могут рассматриваться как основа терапевтических препаратов для лечения опухолевых заболеваний.

Публикации и апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA Interference» (Новосибирск, Россия, 2003), «29th FEBS Congress» (Варшава, Польша, 2004), «Chemical & Biological Problems of Proteomics» (Новосибирск, Россия, 2004), «International Conference on Chemical Biology» (Новосибирск, Россия, 2005), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, Россия, 2005), «IX Онкологический конгресс» (Москва, Россия, 2005), «Genome

and Trascriptome Targets in Medicine» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), «Cell Signaling World» (Люксембург, 2006), «Nucleic Acids as Targets and Tools» (Новосибирск, Россия, 2006), «Биотехнолония и медицина» (Москва, Россия, 2006), «31th FEBS Congress» (Стамбул, Турция, 2006). По материалам диссертации опубликовано 7 статей.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 151 странице, содержит 42 рисунка и 8 таблиц. Библиография включает 341 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Специфическое подавление экспрессии генов семейства туе и пролиферации раковых клеток человека с помощью siPHK

Для направленного подавления экспрессии генов семейства туе мы использовали две siPHK (табл. 1), одна из которых siEx3 направлена к участку 3 экзона мРНК гена с-тус, а другая siEx2 направлена к гомологичным районам вторых экзонов мРНК генов с-тус и N-myc. Последовательность siEx2 содержит по одной однонуклеотидной замене относительно последовательности мРНК каждого из генов, при этом в обоих случаях между антисмысловой цепью siEx2 и мРНК-мишенью образуется несовершенная GU пара. Согласно литературным данным наличие замен приводящих к образованию наиболее прочных из несовершенных GU-nap, незначительно влияет на эффективность ингибирующего действия siPHK. В качестве негомологичных по

Таблица 1. siPHK, использованные для подавления экспрессии генов туе

Обозна чение siPHK Последовательность Мишень

siEx3 5' -GAGGUGCCACGUCUCCACAUU- 3' 3' -UUCUCCACGGUGCAGAGGUGU-5' 1452 - 1470 н. с-тус мРНК

siEx2 5' -GAGGACAUCUGGAAGAAAUUU-3' 3' -UUCUCCUGUAGACCUUCUUUA-5' 697 - 715 н. с-тус мРНК с одной заменой в позиции 702; 302 - 320 н. N-myc мРНК с одной заменой в позиции 319

siScr 5' -CAAGUCUCGUAUGUAGUGGUU-3' 3' -UUGUUCAGAGCAUACAUCACC-5' некомплементарный контроль

Жирным шрифтом выделены замены относительно последовательности мРНК каждого из генов.

отношению к генам-мишеням контролей использовали siPHK siScr, не обладающую значительной гомологией с последовательностями генов человека. Все исследуемые siPHK были получены с помощью in vitro транскрипции с Т7-РНК-полимеразой. Реакцию транскрипции проводили на линейных дцДНК-матрицах с последующим гидролизом РНК-дуплексов РНКазой Т1.

В качестве модельных клеточных систем для исследования биологической активности siPHK и длинных дцРНК были использованы клетки эпидермоидной карциномы КВ-3-1 и нейробластомы SK-N-MC, характеризующиеся повышенной экспрессией гена с-тус, а также нейробластомы IMR-32, в которой наблюдается гиперэкспрессия гена N-тус.

Влияние анти-тус siPHK на уровень мРНК генов-мишеней и белка с-Мус. Эффективность действия используемых siPHK на экспрессию генов-мишеней оценивали по снижению уровня целевой мРНК, а также по снижению уровня белка — продукта экспрессии гена. Относительный уровень мРНК генов туе и белка с-Мус определяли с помощью ОТ-ПЦР и Вестерн блот анализа, соответственно, в качестве внутреннего стандарта использовали мРНК р2-микроглобулина (Ргш) или белок Р-актин. Показано (рис. 1), что siPHK siEx3 и siEx2 при трансфекции их в клетки КВ-3-1 с помощью олигофектамина способны с высокой эффективностью подавлять экспрессию гена с-тус. Так, siEx3 при использовании ее в концентрациях 75- 150 нМ снижает уровень с-тус мРНК и Мус белка на 60 — 85%. siPHK siEx2 в аналогичных условиях снижает уровень целевой мРНК на 40 - 75% и уровень белка на 65 - 85%. siPHK siScr не влияет на уровень с-тус мРНК и белка Мус даже при использовании ее в максимальных концентрациях (150 - 300 нМ), что свидетельствует о специфичности действия выбранных siPHK. Результаты исследования концентрационных зависимостей действия siEx3 и siEx2 (рис. 1) указывают на то, что снижение уровня специфических мРНК достигается при использовании относительно высоких концентраций siPHK (75 - 150 нМ), что согласуется с данными других исследований, в которых эффективное подавление экспрессии гена с-тус достигалось, как правило, в присутствии 100 нМ siPHK. Необходимость использования относительно высоких концентраций siPHK, которая была выявлена практически во всех работах по подавлению экспрессии гена с-тус может быть связана с коротким временем полужизни как мРНК этого гена (0.5 -1 час для разных линий клеток), так и самого Мус белка (20 - 50 мин) и как следствие быстрым их обменом, который обеспечивается высоким уровнем транскрипции гена с-тус.

1,2 п

0.4 -

0,0

1 й й ■ 1 Й

1 : 1 1 .Л

м.^с I'

50 75 150 150

г-Мус ,

р~я!тпН 1.4

I 1.2

•2 1,0 ? о.я

0.2

0.(1

150 300

[е1РНК1,НМ

^ 75 150

= 1,0 ¿0,6

0,0

О 25 Я) 75 15(1 [50 [«¡Р»к"|,н,М

50 75 150

Рас, 1. Снижение уровня экспрессии «РНК гена с-тус (Л) к белка Мус {!>) под действием «¡РНК в клетках КВ-3-1. Уровень с-тус мРНК или белка определяли с помощью ОТ-ПЦР или Вестерн блот анализа через 72 ч после обработки клеток 5|РНК з5ЕхЗ (черные столбцы), 51Ех2 (серые столбцы) и в'Эсг (белые столбцы) в концентрациях 25 — 150 нМ, в присутствии олигофектамина. Уровень мРНК и белка гена с-тус нормировали на уровень -микро глобул и па и ¡З-Актина, соответственно. Стандартное отклонение определяли по результатам трех независимых экспериментов.

Исследование действия »¡ЕхЗ на экспрессию гена-мишени в клетках нейробластомы БК-^-МС показало (рис. 2), что в данной клеточной линии эффективность ингибирования под действием кШхЗ

siEx3

j ¡Sc г

1,4

О 25 50 75 150 150

0,4 0,2 0,0

IsiPHKj.iiM

Рис, 2. Снижение уровня экспрессии мРНК гена с-тус (А) и белка Мус (Б) под действием *¡1*11 К в клетках SK-N-MC. Уровень с-тус мРНК или белка определяли с помощью ОТ-ПЦР или Вестерн блот анализа через 72 ч после обработки клеток siPHK siEx3 (черные столбцы) и siScr (белые столбцы) в концентрациях 25 - 150 нМ, в присутствии олигофектамина. Уровень мРНК и белка сена с-тус нормировали на уровень ßi-микроглобулина и ß-Актина, соответственно. Стандартное отклонение определяли по результатам трех независимых экспериментов.

несколько ниже, чем в клетках карциномы КВ-3-1. Так, при трансфекции клеток SK-N-MC siEx3 в концентрации 150 нМ уровень с-тус мРНК и с-Мус белка снижается до 40% и 50%, соответственно. Мы предположили, что одной из причин различия эффективности ингибирующего действия siEx3 в КВ-3-1 и SK-N-MC является разная эффективность трансфекции siPHK в эти клеточные линии. Исследование проникновения флуоресцентно-меченной siEx3 в разные типы клеток показало (рис. 3), что в отсутствии олигофектамина siEx3 накапливается только в клетках SK-N-MC. Окрашивание клеток с помощью Хехст 33258 (Mycoplasma Hoechst Stain Kit) не выявило их инфицирования Микоплазмой, которая может в значительной степени увеличивать проницаемость клеток для ол и гону клеотидов. В присутствии олигофектамина проникновение siEx3 в клетки нейробластомы (SK-N-MC, IMR-32) также было более эффективным, чем в клетки карциномы КВ-3-1. Уровень флуоресценции si£x3-FITC в клетках SK-N-MC был в 1.5 и 2.5 раза выше, чем в IMR-32 и КВ-3-1, соответственно (рис. 3), Таким образом, накопление siPHK не коррелирует со степенью ингибирования экспрессии гена-мишени. Различия в эффективности ингибирующего действия siPHK могут быть связаны с разной эффективностью действия механизма РНК-интерференции в клетках нейробластомы и карциномы.

0,30 -.

Рис. 3. Проникновение ф.чюореецснтно меченной siPHK siEx3 в КВ-3-1, SK-N-МС u 1MR-J2 клетки.

Диаграмма отражает

соотношения интенсивности й зеленого (флюоресцентно-меченная siEx3 в цитоплазме), и синего (ядра окрашенные Хекет 33258): соотношение зеленый : синий в необработанных клетках {черные столбцы); в клетках, инкубированных в присутствии 150 нМ siEx3-FITC в течение 4 ч {серьсе столбцы): в клетках, инкубированных в присутствии 150 нМ siEx3-F!TC и олигофектамина в течение 4 ч (белые столбцы). На рисунке представлены усредненные данные, полученные при обсчете интенсйвностей сигналов всех клеток с 3 полей микроскопа.

0,00

КВ-3-1

SK-N-MC

1MR-32

Последовательность siPHK siEx2 была выбрана для специфического подавления экспрессии как гена с-тус, так и N-myc, чтобы использовать эту siPHK для ингибирования пролиферации разных типов нейроб ластом. Полученные нами данные показали (рис. 1), что siEx2 эффективно ингибирует экспрессию гена с-тус в клетках КВ-3-1. На следующем этапе мы исследовали действие siEx2 как ингибитора экспрессии гена N-myc в клетках нейробластомы IMR-32, в качестве негомологичных по отношению к мишени контролен использовали анти с-тус siPHK siEx3 и siPHK случайной последовательности siScr. Показано (рис. 4), что поддействием 150 нМ siEx2 в клетках IMR-32 наблюдается

siEx3 siE*2 stScr

контроле принимали за 1, стандартное от трех независимых экспериментов.

Рис. 4. Ишибнрование экспрессии гена N-myc в клетках КВ-3-1 под действием siPHK* stEx2. В качестве контролен специфичности использовали siPHK siEx3 и siScr. Уровень мРНК гена N-myc определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени через 72 ч после трансфскции клеток siPHK (siEx2, siEx3 и stScr) в концентрации ¡50 нМ с помощью олигофектамина, К - клетки, обработанные только о.чигофекта-мином. Соотношение N-mycl$iin в клонение определяли по результатам

снижение уровня мРНК гена N-myc на 85% относительно контроля, в то время как контрольные siPHK siEx3 и siScr, используемые в концентрации 150 нМ, не влияют на экспрессию исследуемого гена. Таким образом, siPHK siEx2 приводит к эффективному и специфичному ингибированию экспрессии как гена с-тус, так и гена N-myc.

Ингибирование пролиферации раковых клеток человека с помощью анти-тус siPHK. Данные полученные несколькими группами исследователей указывают на то, что даже кратковременное ингибирование экспрессии гена с-тус может вызвать значительное снижение скорости деления клеток и устойчивую потерю клетками опухолевого фенотипа.

Мы исследовали действие разных препаратов siPHK на пролиферацию клеток карциномы КВ-3-1 и нейробластом SK-N-MC и IMR-32 с помощью МТТ теста. Показано (табл. 2), что исследуемые siPHK (siEx3 и siEx2) способны с различной эффективностью ингибировать пролиферацию разных типов клеток. Так, под действием siEx3 (150 нМ) скорость роста клеток SK-N-MC снижается в 2.5 раза, а деление клеток КВ-3-1 полностью блокируется. Антипролиферативное действие siEx2 было несколько менее эффективным: при использовании его в 150 нМ концентрации наблюдается 2.5 — 3-кратное снижение скорости деления клеток, характеризующихся повышенной экспрессией гена с-тус (КВ-3-1) или гена N-myc (IMR-32). Показано, что антипролиферативная активность исследуемых siPHK напрямую коррелирует со степенью ингибирования экспрессии генов-мишеней.

♦Степень ингибирования пролиферации -отношение числа живых клеток в контроле к числу живых клеток, обработанных исследуемыми препаратами через 120 часов после трансфекции.

Таблица 2. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ-3-1 и нейробластом SK-N-MC, IMR-32 под действием siPHK

Препараты siPHK (150 иМ) Степень ингибирования пролиферации*

КВ-3-1 SK-N-MC IMR-32

siEx3 10 2,5 не влияет

siEx2 3 н.о. 2,5

siScr не влияет не влияет не влияет

Достигнутое ингибирование пролиферации является терапевтически значимым и специфическим относительно последовательности siPHK, так как siPHK не имеющая гомологии с последовательностью генов человека (siScr) не влияет на рост клеток, кроме того, siPHK siEx3, направленная к последовательности гена с-тус не влияет пролиферацию клеток IMR-32, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии гена N-myc.

Таким образом, выбранные нами siPHK siEx3 и siEx2 являются высокоэффективными и специфичными ингибиторами экспрессии генов-мишеней и пролиферации опухолевых клеток человека. siEx3, направленная на ингибирование экспрессии гена с-тус, вызывает несколько более эффективное подавление экспрессии гена-мишени, чем siEx2. С другой стороны, siEx2, соответствующая гомологичным районам вторых экзонов мРНК генов с- и N-myc, способна ингибировать экспрессию обоих генов-мишеней и приводить к снижению скорости пролиферации клеток карциномы и нейробластомы. Выбор последовательности siPHK siEx2 в высоко консервативных участках мРНК генов туе имеет ряд преимуществ. Во-первых, siEx2 может быть использован для одновременного ингибирования экспрессии генов с- и N-тус, что особенно важно для нейробластом где зачастую наблюдается перекрестная регуляция этих генов, например, в клетках 1MR-32 подавление экспрессии гена N-myc приводит к активации экспрессии с-тус. Во-вторых, siEx2 может быть использован для ингибирования генов-мишеней в клетках млекопитающих разных видов. Для исследования терапевтических свойств лекарственных препаратов in vivo необходимо проведение экспериментов на животных. Сравнение последовательностей мРНК генов с-тус мыши, крысы, собаки, кролика и человека показало, что для участка, соответствующего по последовательности siEx2, наблюдается 100%-ная консервативность. Следовательно, siEx2 может быть использована в экспериментах на животных моделях с целью оценки потенциала siPHK как противоопухолевых лекарственных препаратов.

2. Неспецифическое подавление экспрессии гена с-тус и пролиферации раковых клеток человека с помощью siPHK и длинных дцРНК

В клетках млекопитающих длинные дцРНК и некоторые короткие siPHK, содержащие определенные мотивы в их последовательности, могут вызывать неспецифический интерфероновый ответ. В случае специфического ингибирования экспрессии определенных мРНК с помощью дцРНК, индукция интерферонового ответа является нежелательным побочным эффектом, однако сама по себе она имеет большое терапевтическое значение, т.к. может приводить к

ингибированию пролиферации опухолевых клеток, их дифференцировке или апоптозу. Одной из мишеней действия интерферонов являются гены семейства туе (с-тус и N-myc).

Для ингибирования клеточной пролиферации нами была выбрана длинная дцРНК dsMyc, соответствующая 1159 - 1631 н. участку второго и третьего экзонов мРНК гена с-тус (табл. 3). Мы предположили, что препарат dsMyc будет функционировать сразу на двух уровнях регуляции, по механизму РНК-интерференции, и, активируя неспецифический интерфероновый ответ. В качестве контрольных индукторов интерферона использовали дцРНК аналогичной длины dsEGFP, соответствующую району 1 - 448 н. мРНК гена EGFP, последовательность которой не обладает существенной гомологией с геном с-тус человека, а также коммерчески доступный препарат поли-инозиновой-поли-цитидиловой кислоты poly(I:C) (табл. 3). Антисмысловую и смысловую цепи дцРНК dsMyc и dsEGFP синтезировали с помощью транскрипции in vitro на ДНК-матрицах, полученных в параллельных реакциях ОТ-ПЦР.

Таблица 3. siPIIK и длинные дцРНК, использованные для ингибирования _пролиферации раковых клеток_

siPHK и дцРНК Последовательность, мишень

sil 5' -АААиСиСАААСССиСАСАСии-З' 3' -иииииАбАСиииСССАСисиС- 5' (первый интрон гена МЬШ)

dsMyc 1159 - 1631 н. мРНК гена с-тус

dsEGFP 1 - 448 н. мРНК гена £GFP

po!y(I:C) коммерчески доступный гомополимер

При исследовании коротких интерферирующих РНК нами было обнаружено, что siPHK sil гомологичная участку первого интрона гена MDR1, не имеющая значительной гомологии с мРНК человека и выбранная в качестве контроля, вызывает неспецифическое ингибирование экспрессии гена с-тус (рис. 5). Недавно было обнаружено, что siPHK в зависимости от их последовательности и используемой концентрации могут вызывать целый ряд неспецифических эффектов. Эти эффекты могут быть связаны как с влиянием на экспрессию генов в состав которых входят последовательности частично гомологичные последовательности siPHK, так и с индукцией интерферонового ответа путем активации PKR (РНК-зависимой протеинкиназы) или путем связывания с рецепторами, распознающими двуцепочечную РНК (TLR3) или одноцепочечную РНК (TLR7, 8).

Рис. 5. Ilm "и Г> и [i ли а-iiiic экспрессии гена с-тус в клетках Kß-3-l под действием siPHK sil и длинных дцРПК (dsMyc, dsEGFP и polv(I:C)). Уровень мРНК гена с-тус определяли с помощью ОТ-ПЦР через 72 ч после трансфекции клеток исследуемыми препаратами в концентрации 0.01 мкг/мл (серые столбцы), 0.05 мкг/мл (белые столбцы), 0.1 мкг/мл (столбцы с косой штриховкой) и 0.25 мкг/мл (столбцы с горизонтальной штрйховкой), 0 {черные столбцы) - клетки о работа иные только олигофектамином. Соотношение c-myclfi¡m в контроле принимали за 1. стандартное отклонение определяли по результатам трех независимых з ксн ери ментов.

Влияние длинных дцРНК и siPHK sil на экспрессию гепа с-тус. Исследование действия длинных дцРНК (dsMyc, dsEGFP и ро!у(1:С)) и siPHK sil па экспрессию гена с-тус в клетках КВ-3-1 показало (рис. S), что все исследуемые препараты вызывают кон центра пион но-за виси мое снижение уровня мРНК гена с-тус, причем максимальное воздействие оказывает препарат dsMyc, a poly(I:C) наименее эффективен. При трансфекции клеток КВ-3-1 препаратом dsMyc в концентрациях 0.05 и 0,25 мкг/мл (табл. 4) наблюдается снижение уровня с-тус мРНК на 85 и 95% относительно контроля, соответственно; препарат dsEGFP в аналогичных условиях снижает экспрессию гена с-тус на 70 и 80%, соответствсно; в то время как ро!у(1:С) лишь при максимальной концентрации (0.25 мкг/мл) снижает уровень с-тус мРНК на 70% относительно контроля (рис, 5).

Аналогичное исследование было проведено на клетках нейробластомы SK-N-MC (табл. 4). Трансфекция клеток препаратом dsMyc в концентрациях 0.05 - 0.25 мкг/мл приводит к снижению уровня мРНК гена с-тус на 50 - 70% относительно контроля, несколько менее эффективное снижение с-тус мРНК (на 40 - 60%) наблюдается после трансфекции клеток препаратами dsEGFP или poly(I:C). Таким образом, в клетках SK-N-MC, как и в КВ-3-1, препарат dsMyc является наиболее эффективным ингибитором экспрессии гена с-тус, dsEGFP оказывает менее эффективное ингибирующее действие, а препарат ро!у{1;С) наименее эффективен. Выявленные различия в ингибирующей активности препаратов dsMyc и dsEGFP позволяют предположить, что более

Таблица 4. Влияние siPHK sil и длинных дцРНК на экспрессию гена

с-тус в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC

Концентрация дцРНК Препараты дцРНК Процент ингибирования экспрессии гена с-тус

КВ-3-1 SK-N-MC

0.05 мкг/мл 30 нМ sil 35 не определено

dsMyc 85 50

dsEGFP 65 40

poly(I:C) 10 30

0.25 мкг/мл 150 нМ sil 85 не определено

dsMyc 95 70

dsEGFP 80 60

poly(I:C) 70 40

эффективное подавление экспрессии гена с-тус под действием dsMyc, детектируемое в более ранние сроки (данные не приведены) и при более низких концентрациях, связано с действием данного препарата не только как индуктора неспецифического интерферонового ответа, но и по механизму РНК-интерференции.

Данные приведенные на рис. 5 показывают, что siPHK sil, выбранная как контроль, не имеющий значительной гомологии с последовательностью гена с-тус, приводит к эффективному подавлению экспрессии исследуемого гена в клетках КВ-3-1. Так, siPHK sil при использовании ее в концентрации 150 нМ (что соответствует 0.25 мкг/мл) снижает уровень с-тус мРНК на 85% относительно контроля. Эффективность ингибирования sil сравнима с эффективностью действия сиквенс-специфической siPHK siEx3 (рис. 1). Мы предположили, что биологическая активность sil, последовательность которой не имеет значительной гомологии с последовательностями известных мРНК человека, связана с активацией неспецифического интерферонового ответа.

Ингибирование пролиферации раковых клеток человека с помощью неспецифической siPHK sil и длинных дцРНК. Исследование с помощью МТТ-теста антипролиферативного действия siPHK sil и протяженных дцРНК на клетки КВ-3-1, SK-N-MC и IMR-32 показало, что все препараты вызывают значительное снижение скорости пролиферации и даже полную остановку деления клеток КВ-3-1 и SK-N-MC (табл. 5). Наиболее

Таблица 5. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ-3-1 и

Концентрация Препараты Степень ингибирования пролиферации*

ДЦРНК дцРНК КВ-3-1 вк-гч-мс 1МИ-32

<кМус 6.5 >10 не влияет

0.005 мкг/мл (ЬЕОРР >10 >10 не влияет

ро1у(1:С) не влияет не влияет не влияет

вИ не влияет не влияет не влияет

0.05 мкг/мл сЬМус >10 >10 не влияет

<ЬЕОРР >10 >10 не влияет

ро1у(1:С) 3.5 >10 не влияет

ей >10 5 1.5

0.5 мкг/мл сЬМус >10 >10 2.5

сЬЕОРР >10 >10 2

Ро1у(1:С) >10 >10 не влияет

♦Степень ингибирования пролиферации - отношение числа живых клеток в контроле к числу живых клеток, обработанных исследуемыми препаратами через 120 часов после трансфекции

эффективное антипролиферативное действие на клетки оказывает препарат сЬЕОРР, так при использовании его в концентрации 0.005 мкг/мл наблюдается полное ингибирование деления клеток КВ-3-1, аналогичный эффект наблюдается при использовании препаратов сЬМус и ро1у(1:С) в концентрациях 0.05 и 0.5 мкг/мл, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что антипролиферативное действие дцРНК, по-видимому, зависит от их последовательности, так, во всех исследуемых клеточных линиях наименее эффективным ингибитором пролиферации является гомополимер ро1у(1:С), тогда как дцРНК гетерогенной последовательности более эффективны. Клетки 1МК-32 в отличие от КВ-3-1 и БК-Ы-МС проявляют довольно высокую устойчивость к действию исследуемых дцРНК (табл. 5) и только при использовании их в максимальной концентрации (0.5 мкг/мл) наблюдается 1.5 - 2.5-кратное снижение скорости пролиферации. Такая устойчивость 1МЛ-32 связана с наличием мутаций в промоторной области гена Ат-тус, что препятствует

его регуляции под действием альфа-интерферона и транс-ретиноевой кислоты - препаратов, которые применяются в терапии нейробластом. Таким образом, для лечения некоторых типов нейробластом устойчивых к интерферонам (например IMR-32), возможно использование только специфических siPHK (в нашем случае siEx2), направленных на ингибирование экспрессии генов, ответственных за пролиферацию клеток.

3. Анализ специфичности действия используемых siPHK и длинных дцРНК

Известно, что при развитии интерферонового ответа в клетках млекопитающих повышается уровень экспрессии генов семейства 2'-5'-олигоаденилатсинтетаз (OAS) и протеинкиназы R (PKR), экспрессия этих генов часто используется для мониторинга возможных неспецифических эффектов siPHK. Чтобы проверить является ли подавление экспрессии гена с-тус с помощью siPHK siEx3 или siEx2 сиквенс-специфичным, а также исследовать природу ингибирующего действия на экспрессию гена с-тус и клеточную пролиферацию siPHK sil мы оценивали уровень экспрессии генов OAS1 и PKR с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Показано (рис. 6), что трансфекция клеток КВ-3-1 препаратами длинных дцРНК в концентрации 0.05 мкг/мл приводит к значительной, но кратковременной активации экспрессии генов OAS1 (через 24 ч) и PKR (через 48 ч). При трансфекции клеток КВ-3-1 препаратами siPHK (siEx3, siEx2, sil или siScr) в 150 нМ концентрации в некоторых случаях наблюдаются изменения экспрессии генов OAS1 и PKR (рис. 6), однако эффекты, вызываемые siPHK отличаются от действия длинных дцРНК. Так, анти-wyc siPHK (siEx3 и siEx2) приводят к некоторому повышению уровня OAS1 мРНК через 48 — 72 ч после трансфекции, в то время как препараты dsMyc и poly(I:C) активируют экспрессию данного гена после 24 ч инкубации, к 48 ч уровень OAS1 мРНК начинает снижаться и достигает исходного уровня к 72 ч. Такая активация OAS1 после трансфекции siEx3 или siEx2 может являться следствием ингибирования экспрессии гена с-тус, белковый продукт которого является важным регулятором многих процессов в клетке. siPHK sil или siScr в аналогичных условиях не оказывают влияния на экспрессию гена О ASI. Акги-тус siPHK siEx3 и siEx2, а также siPHK случайной последовательности siScr не влияют на экспрессию гена PKR. В случае же siPHK sil, которая рассматривается как потенциальный индуктор интерферонового ответа, наблюдается значительное повышение уровня PKR мРНК через 48 ч после трансфекции. Такой эффект sil на экспрессию гена PKR аналогичен действию длинных дцРНК.

Рис. 6. Влншше siPHK и длинных дцРНК на уровень OASÍ (Л) » PKR (Б) мРНК в клетках КВ-3-1.

Относительный уровень мРНК генов OAS! и PKR в клетка?! определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени через 24 ч (белые столбцы), 48 ч (серые столбцы) и 72 ч (черные столбцы) после добавления препаратов siPHK s¡Ex3, s¡Ex2, siScr, sil (150 llM) или длинных дцРНК dsMyc, poly(I:С) (0,05 м к г/мл). Соотношения OASl/[S,m или PKR/p2m i) контроле принимали за 1, стандартное отклонение определяли по результатам трёх независимых экспериментов.

Мы предположили, что уровень экспрессии интерферон-чувствительных генов может также являться маркером интерферонового ответа клетки на введение дцРНК, однако, в результате мутаций, затрагивающих регул яторные элементы определенных генов может происходить утрата чувствительности таких генов к интерферону, поэтому для достоверного выявления неспецифического ответа необходимо рассматривать динамику изменения экспрессии нескольких генов.

Известно, что экспрессия актинов (которые играют ключевую роль в митотическом делении) в клетке также как и генов семейства туе является интерферон-чувствительной. Полученные нами данные указывают на то (табл. 4, 5), что все исследуемые индукторы интерферонового ответа (sil, dsMyc, dsEGFP и poly(I:C)) приводят к эффективному ингибированию экспрессии гена с-тус и значительному снижению скорости пролиферации клеток. В данном случае с-тус является как макером интерферонового ответа, так и маркером а нти п ро л иф ерати в н о го действия препаратов, поскольку белок с-Мус

А.

играет важную роль в регуляции клеточного роста. Однако, в данной работе ген с-туе выступал еще и в качестве мишени для специфических siPHK (siEx3 и siEx2), поэтому мы исследовали изменение уровня экспрессии р-актина, являющегося интерферон-чувствительным геном, под действием разных препаратов siPHK и длинных дцРНК в клетках КВ-3-1. Показано (рис. 7), что в присутствии олигофектамина уровень мРНК ^-актина значительно снижается под действием потенциальных индукторов интерферонового ответа, а именно siPHK sil и длинных дцРНК dsMyc, dsEGFP, poly(I:C), в то время как siPHK siEx3, siEx2 и siScr не оказывали значительного влияния на экспрессию этого гена.

А.

Б. fsiPHKl. нМ

[дцРНК], мкг/мл

Рис. 7. Ингибирование экспрессии Р-актина под действием siPHK (А) и длинных дцРНК (Б) в клетках КВ-3-1. Уровень мРНК гена fi-актта определяли с помощью ОТ-ПЦР через 72 ч после трансфек-ции клеток увеличивающимися концентрациями siPHK (25 - 150 нМ): siEx3 (-Д-), siEx2 ( Ж ), siScr (-•-) и sil (-■-); или длинных дцРНК (0.01 - 0.25 мкг/мл): dsMyc (-♦-), dsEGFP (-□-) и poly(I:C) (-А-) с помощью олигофектамина. Соотношение P-actinl$2m в контроле принимали за 1. На рисунке представлены усредненные данные, полученные по результатам 3 независимых экспериментов, стандартное отклонение составляет менее 20%.

Таким образом, суммарные данные по динамике уровней экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа (OAS1 и PKR), а также интерферон-чувствительных генов (/?-актина и с-тус) свидетельствуют о том, что siPHK siEx3 и siEx2 специфически ингибируют экспрессию генов-мишеней и пролиферацию опухолевых клеток; тогда как длинные дцРНК и siPHK sil неспецифически изменяют

экспрессию генов, вовлеченных в развитие интерферонового ответа, что приводит к ингибированию роста и гибели клеток путем апоптоза.

Результаты исследований свидетельствуют, что двуцепочечные РНК (siPHK или длинные дцРНК), действующие как по механизму РНК-интерференции, так и активирующие иммунный ответ могут стать основой препратов для терапии онкологических заболеваний. Выбранные нами siPHK, направленные на ингибирование экспрессии генов семейства туе, способны с высокой эффективностью и специфичностью снижать экспрессию генов-мишеней и оказывать значительное антипролиферативное действие на раковые клетки человека. Длинные дцРНК, а также неспецифическая siPHK sil при проникновении в клетки, способны эффективно снижать уровень экспрессии интерферон-чувствительных генов с-тус и ¡i-актина, скорость клеточной пролиферации и повышать уровень экспрессии генов-маркёров интерферонового ответа. Тот факт, что препарат dsMyc оказывает более сильное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени, чем dsEGFP и poly(I:C) позволяет предположить, что оно достигается не только вследствие индукции неспецифического интерферонового ответа, но и РНК-интерференции, специфически направленной на мРНК гена с-тус.

выводы

1. Исследовано подавление экспрессии генов с-тус и N-myc и пролиферации раковых клеток человека КВ-3-1, SK-N-MC и IMR-32 под действием ферментативно синтезированных siPHK, направленных к мРНК гена с-тус (siEx3) и к гомологичным районам мРНК генов с-тус и N-myc (siEx2).

- Показано, что siPHK siEx3 вызывает концентрационно зависимое ингибирование экспрессии гена с-тус в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC и снижает степень пролиферации этих клеток.

- Показано, что siPHK siEx2 вызывает концентрационно зависимое ингибирование экспрессии как гена с-тус в клетках КВ-3-1, так и гена N-myc в клетках IMR-32, что сопровождается ингибированием пролиферации обеих клеточных линий. Такая siPHK, подавляющая экспрессию двух разных онкогенов предложена и исследована впервые.

- Показано, что степень ингибирования пролиферации коррелирует со степенью подавления экспрессии генов с-тус или N-myc, гиперэкспрессия которых наблюдается в исследованных клеточных линиях.

- Показано, что флуоресцентно меченная siPHK siEx3 накапливается более эффективно в клетках нейробластом SK-N-MC и IMR-32, чем в клетках карциномы КВ-3-1, однако накопление siPHK не коррелирует со степенью ингибирования экспрессии гена-мишени и ее антипролиферативным действием.

2. Исследовано действие индукторов интерферона короткой (sil) и протяженных (dsMyc, dsEGFP) дцРНК как неспецифических ингибиторов экспрессии гена с-тус и пролиферации раковых клеток человека. Показано, что исследованные дцРНК эффективно снижают уровень мРНК гена с-тус в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC и ингибируют их пролиферацию, однако не влияют на уровень гена N-myc в клетках интерферон-устойчивой линии IMR-32 и оказывают лишь слабое влияние на их пролиферацию.

3. Исследована динамика изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа и интерферон-чувствительного гена Р-актина под действием двуцепочечных РНК.

- Показано, что siPHK siEx2 и siEx3 не вызывают изменения экспрессии генов PKR и Р-актина, что может свидетельствовать о специфичности их действия.

- Показано, что под действием дцРНК sil и dsMyc на клетки КВ-3-1 и SK-N-MC происходит активация экспрессии гена PKR и подавление экспрессии гена P-actin, в то время как уровень экспрессии О ASI увеличивается только под действием dsMyc, что указывает на отличия в механизме действия коротких и длинных дцРНК как индукторов интерферонового ответа.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах

1. Kabilova Т.О.. Chernolovskaya E.L., Vladimirova A.V., Vlassov V.V. Silencing of c-myc expression in tumor cells by siRNA. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2004. V. 23. № 6-7. P. 867-872.

2. Логашенко Е.Б., Кабшова Т.О. Владимирова А.В., Власов В.В. Черноловская E.JI. Подавление экспрессии генов c-myc и mdrl в линиях опухолевых клеток человека короткими двуцепочечными РНК (siRNA). // Вестник НОЦ. 2004. № 5-6. С. 22-25.

3. Черноловская E.JI., Кабилова Т.О.. Владимирова А.В., Власов В.В. Ингибирование пролиферации раковых клеток человека с помощью siPHK. //Труды IX Онкологического конгресса. Москва. 2005. С. 75-77.

4. Kabilova Т.О.. Chernolovskaya E.L., Vladimirova A.V., Vlassov V.V. Inhibition of human carcinoma and neuroblastoma cell proliferation by anti c-Myc siRNA. // Oligonucleotides. 2006. V. 16. № 1. P. 15-25.

5. Кабшова Т.О.. Владимирова A.B., Репкова M.H., Венъяминова А.Г., Черноловская E.JI., Власов В.В. Подавление экспрессии гена c-myc с помощью ферментативно и химически синтезированных siPHK. // Молекулярная Биология. 2006. Т. 40. № 6. С. 1037-1046.

6. Кабилова Т.О.. Черноловская E.JI. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток человека двуцепочечными РНК, направленными на подавление экспрессии онкогенов семейства туе. // Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. № 2. С. 373-382.

7. Kabilova Т.О.. Vladimirova А. V., Chernolovskaya E.L., Vlassov V. V. Arrest of cancer cells proliferation by dsRNAs. // Annals of NY Acad, of Sci. 2006. V. 1091. P. 425-436.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кабилова, Татьяна Олеговна

Список Сокращений.

Введение.

Глава 1. Онкогены семейства туе как терапевтические мишени обзор литературы).

1.1. Транскрипционные факторы семейства Мус.g

1.1.1. Биологические функции Мус.

1.1.2. Структура белков семейства Мус.

1.1.3. Регуляция транскрипции белками семейства МУС.

1.1.3.1. Мус и Мах: структура и функции.

1.1.3.2. Механизмы Мус-зависимой активации транскрипции.

1.1.3.3. Механизмы Мус-зависимой репрессии транскрипции.

1.1.3.4. Регуляция функции Мус и Мус-индуцируемый онкогенез.

1.1.4. МУС как терапевтическая мишень.

1.1.4.1. Блокирование взаимодействий Мус с Мах.

1.1.4.2. Экспрессия токсинов под контролем Мус-регулируемых промоторов.

1.1.4.3. Ингибирование экспрессии Мус.

1.1.4.3.1. Антигенный подход.

Триплекс-формирующие олигонуклеотиды.

Соединения, стабилизирующие образование

G-тетраплексов.

1.1.4.3.2. Антисмысловой подход.

1.1.4.3.3. Рибозимы.

1.1.4.3.4. РНК-интерференция и микроРНК.

Использование феномена РНК-интерференции в молекулярной биологии.

Специфичность действия интерферирующих РНК.

Ингибирование экспрессии генов семейства туе с помощью интерферирующих РНК.

1.2. Длинные дцРНК как противоопухолевые агенты.

1.2.1. Неспецифический клеточный ответ на двуцепочечную РНК.

1.2.1.1. ДцРНК-зависимая протеинкиназа R.

1.2.1.2. 2 '-5'-Олигоаденилатсинтетаза и РНКаза L.

1.2.1.3. То11-подобные рецепторы.

1.2.1.4. Интерфероны.

1.2.2. Потенциал интерферонового ответа в противоопухолевой терапии.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы и препараты.

2.1.2. Линии клеток.

2.1.3. Олигонуклеотиды.

2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе.

2.2. Методы.

2.2.1. Ферментативный синтез siPHK.

2.2.1.1. Получение дцДНК-матриц в реакции с фрагментом Кленова.

2.2.1.2. In vitro транскрипция.

2.2.1.3. Выделение in vitro транскриптов.

2.2.1.4. Гибридизация РНК-транскриптов и гидролиз РНКазой Т1.

2.2.2. Введение 32Р-метки по З'-концу РНК.

2.2.3. Статистическое расщепление олигорибонуклеотидов ЕхЗ-AS и ЕхЗ-S 2 М имидазолом.

2.2.4. Гибридизация химически синтезированных олигорибонуклеотидов.

2.2.5. Выделение суммарной клеточной РНК.

2.2.6. Ферментативный синтез длинной дцРНК.

2.2.6.1. Обратная транскрипция.

2.2.6.2. Амплификация фрагментов генов с-тус и EGFP.

2.2.6.3. In vitro транскрипция.

2.2.6.4. Гибридизация РНК-транскриптов и очистка целевых дцРНК.

2.2.7. Клеточные культуры и трансфекция.

2.2.8. Измерение уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР.

2.2.8.1. Обратная транскрипция.

2.2.8.2 ПЦР.

2.2.8.3. ПЦР в режиме реального времени.

2.2.10. Вестерн блот анализ.

2.2.11. Определение количества живых клеток (МТТ-тест).

2.2.12. Определение эффективности накопления siPHK в клетках.

2.2.12.1. Введение остатка флуоресцеина в siPHK.

2.2.12.2. Анализ проникновения siPHK в клетки.

2.2.13. Электрофорез.

2.2.13.1. Электрофорез в ПААГ.

2.2.13.2. Электрофорез в агарозном геле.

2.2.14. Статистика.

Глава 3. Ингибирование экспрессии онкогенов семейства туе и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью двуцепочечных интерферирующих РНК (результаты и обсуждение).

3.1. Результаты.

3.1.1. siPHK как ингибиторы экспрессии генов семейства туе.

3.1.1.1. Выбор последовательностей siPHK.

3.1.1.2. Получение siPHK.

3.1.1.3. Подавление экспрессии генов семейства туе с помощью siPHK.

3.1.1.3.1. Подавление экспрессии гена с-тус с помощью siPHK в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC.

Проникновение меченной флуоресцеином siPHK $iEx3 в клеточные линии разного происхождения.

3.1.1.3.2. Подавление экспрессии гена N-myc с помощью siPHK siEx2 в клетках IMR-32.

3.1.1.4. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ-3и нейробластом SK-N-MC и IMR-32 с помощью siPHK.

3.1.2. Длинные дцРНК как неспецифические ингибиторы экспрессии генов семейства туе и пролиферации раковых клеток человека.

3.1.2.1. Получение длинных дцРНК.

3.1.2.2. Подавление экспрессии гена с-тус с помощью длинных дцРНК в клетках карциномы КВ-3-1 и нейробластомы SK-N-MC.

3.1.2.3. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ-3-1 и нейробластом SK-N-MC и IMR-32 с помощью длинных дцРНК.

3.1.3. Динамика изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа под действием siPHK и длинных дцРНК в раковых клетках человека.

3.1.3.1. Изменение уровня экспрессии генов OAS1 и PKR под действием коротких siPHK и длинных дцРНК в клетках карциномы КВ-3и нейробластомы SK-N-MC.

3.1.3.2. Изменение уровня экспрессии /3-актина под действием коротких siPHK и длинных дцРНК в клетках карциномы КВ-3-1 и нейробластомы SK-N-MC.

3.2. Обсуждение результатов.

3.2.1. Специфическое подавление экспрессии генов с-тус и N-myc и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью siPHK.

3.2.2. Неспецифическое подавление экспрессии гена с-тус и пролиферации раковых клеток человека с помощью siPHK и длинных дцРНК.

3.2.3. Синергическое подавление экспрессии гена с-тус препаратом dsMyc по специфическому и неспецифическому механизмам.

3.2.4. Изменение уровня экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа под действием siPHK и протяженных дцРНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ингибирование экспрессии онкогенов семейства myc и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью двуцепочечных интерферирующих РНК"

Транскрипционные факторы семейства Мус (с-Мус и N-Myc) участвуют в контроле пролиферации клеток, их дифференцировке и канцерогенезе. Эти факторы рассматриваются как перспективные терапевтические мишени, так как они стоят в начале каскада сигнальных событий, приводящих к злокачественному перерождению клеток. Гиперэкспрессия гена с-тус наблюдается в таких опухолях, как миеломы, лимфомы, карциномы, нейробластомы и др., в то время как N-myc играет ключевую роль при развитии ретинобластом и нейробластом - опухолей, наиболее часто встречающихся у детей. Традиционные схемы лечения нейробластом, а также некоторых других типов опухолей, включают а-интерферон и ретиноевую кислоту, которые оказывают ингибирующее действие на экспрессию генов семейства туе и индуцируют дифференцировку опухолевых клеток. Однако в случае мутаций, затрагивающих регуляторные районы генов туе, опухоли становятся резистентными к такому лечению [1, 2]. Кроме того, в некотрых типах нейробластом, например в клетках линии IMR-32, подавление экспрессии гена N-myc с помощью антисмысловых олигонуклеотидов приводит к активации онкогена с-тус [3], т.е. наблюдается их перекрестная регуляция. Следовательно, для ингибирования пролиферации клеток таких опухолей необходимо одновременное подавление экспрессии генов с-тус и N-myc. Идентификация высокоэффективных и специфичных ингибиторов экспрессии генов семейства туе является актуальной задачей при разработке противоопухолевых препаратов.

Двуцепочечные РНК рассматриваются как перспективные препараты для применения в терапии, благодаря их уникальной способности запускать в клетках процесс РНК-интерференции, приводящий к специфической деградации мРНК гомологичных им генов. Выбор высокоэффективных siPHK, направленных на подавление экспрессии как гена с-тус, так и N-myc, позволит использовать их для ингибирования пролиферации разных типов нейробластом, а также преодолеть перекрестную активацию этих онкогенов.

Помимо создания siPHK, действующих по механизму РНК-интерференции и вызывающих направленное расщепление специфических мРНК, особый интерес представляет использование длинных дцРНК, способных активировать интерфероновый ответ, вызывающий неспецифическое ингибирование синтеза мРНК и белка, и индуцирующий гибель клеток путем апоптоза [4]. Известно, что интерфероны способны специфически регулировать экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл, в том числе генов семейства туе (с-тус и N-myc) [5]. Одним из подходов к снижению экспрессии гена с-тус может стать применение длинных двуцепочечных РНК, гомологичных по последовательности участкам мРНК этого гена. Можно ожидать, что такие дцРНК будут ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, действуя сразу на двух уровнях регуляции по механизму РНК-интерференции и активируя неспецифический интерфероновый ответ.

Целью данной работы являлось создание специфических ингибиторов экспрессии протоонкогенов с-пгус и N-myc и индукторов интерферонового ответа на основе двуцепочечных РНК и исследование их действия на пролиферацию раковых клеток человека различного происхождения. Были поставлены следующие задачи:

1. Получить с помощью ферментативного синтеза siPHK и протяженные дцРНК, соответствующие различным участкам генов с-тус и N-myc и исследовать их действие на экспрессию генов-мишеней в клетках КВ-3-1, SK-N-MC и IMR-32.

2. Исследовать действие полученных siPHK и дцРНК на пролиферацию опухолевых клеток человека различного происхождения.

3. Исследовать динамику изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа под действием siPHK и дцРНК.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кабилова, Татьяна Олеговна

выводы

2. Исследовано действие индукторов интерферона короткой (sil) и протяженных (dsMyc, dsGFP) дцРНК как неспецифических ингибиторов экспрессии гена с-тус и пролиферации раковых клеток человека. Показано, что исследованные дцРНК эффективно снижают уровень мРНК гена с-тус в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC и ингибируют их пролиферацию, однако не влияют на уровень гена N-myc в клетках интерферон-устойчивой линии IMR-32 и оказывают лишь слабое влияние на их пролиферацию.

3. Исследована динамика изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа и интерферон-чувствительного гена р-актина под действием двуцепочечных РНК.

- Показано, что siPHK siEx2 и siEx3 не вызывают изменения экспрессии генов PKR и р-актина, что может свидетельствовать о специфичности их действия.

- Показано, что под действием дцРНК sil и dsMyc на клетки КВ-3-1 и SK-N-MC происходит активация экспрессии гена PKR и подавление экспрессии гена P-actin, в то время как уровень экспрессии OAS1 увеличивается только под действием dsMyc, что указывает на отличия в механизме действия коротких и длинных дцРНК как индукторов интерферонового ответа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследований свидетельствуют, что двуточечные РНК (siPHK или длинные дцРНК), действующие как по механизму РНК-интерференции, так и активирующие иммунный ответ могут стать основой препратов для терапии онкологических заболеваний. Ряд препаратов на основе siPHK уже проходят клинические испытания, которые позволят выявить как их терапевтический потенциал, так и возможные побочные эффекты. Выбранные нами siPHK, направленные на ингибирование экспрессии генов семейства туе, способны с высокой эффективностью и специфичностью снижать экспрессию генов-мишеней и оказывать значительное антипролиферативное действие на раковые клетки человека.

Длинные дцРНК, а также неспецифическая siPHK sil при проникновении в клетки, способны эффективно снижать уровень экспрессии интерферон-чувствительных генов с-тус и р-актина, скорость клеточной пролиферации и повышать уровень экспрессии генов-маркёров интерферонового ответа. Тот факт, что dsMyc оказывает более сильное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени, чем dsEGFP и poly(l:C) позволяет предположить, что оно достигается не только вследствие высокоэффективной индукции неспецифического интерферонового ответа, но и РНК-интерференции, специфически направленной на мРНК гена с-тус. При условии эффективной и локальной доставки интерфероногенная активность препаратов длинных двуцепочечных РНК также может использоваться при создании терапевтических препаратов для лечения опухолевых заболеваний. Многие опухоли приобретают устойчивость к развитию интерферонового ответа вследствие возникновения мутаций в промоторах интерферон-регулируемых генов, участвующих в регуляции деления клеток и при развитии апоптоза, как например, в клетках нейробластомы IMR-32. В последнем случае в качестве эффективных ингибиторов пролиферации клеток могут использоваться только специфические siPHK, направленные на подавление экспрессии генов, ответственных за неконтролируемое деление клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кабилова, Татьяна Олеговна, Новосибирск

1. Uppman S.M., Glisson B.S., Kavanagh J.J., Lotan R., Hong W.K., Paredes-Espinoza M., Hittelman W.N., Holdener E.E., Krakoff I.H. Retinoic acid and interferon combination studies in human cancer// Eur. J. Cancer 1993. V. 29A Suppl 5 P. S9-13

2. Reynolds C.P., Wang Y., Melton L.J., Einhorn P.A., Slamon D.J., Maurer B.J. Retinoic-acid-resistant neuroblastoma cell lines show altered MYC regulation and high sensitivity to fenretinide// Med. Pediatr. Oncol. 2000. V. 35 P. 597-602

3. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R., Silverman R.H., Schreiber R.D. How cells respond to interferons II Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67 P. 227-264

4. Kimchi A. Cytokine triggered molecular pathways that control cell cycle arrest II J. Cell Biochem. 1992. V. 50 P. 1-9

5. Sawyers C. Targeted cancer therapy // Nature 2004. V. 432 P. 294-297

6. Emens L.A. Trastuzumab: targeted therapy for the management of HER-2/neu-overexpressing metastatic breast cancer //Am. J. Ther. 2005. V. 12 P. 243-253

7. Krause D.S., Van Etten R.A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy // N. Engl. J. Med. 2005. V. 353 P. 172-187

8. DePinho R.A., Schreiber-Agus N. Alt F.W. myc family oncogenes in the development of normal and neoplastic ceils//Adv. Cancer Res. 1991. V. 57 P. 1-46

9. Dang C.V. c-Myc target genes involved in cell growth, apoptosis, and metabolism // Mol. Cell Biol. 1999. V. 19 P. 1-11

10. Resar L.M., Dolde C., Barrett J.F., Dang C.V. B-myc inhibits neoplastic transformation and transcriptional activation by c-myc// Mol. Cell Biol. 1993. V. 13 P. 1130-1136

11. Asai A., Miyagi Y., Sugiyama A., Nagashima Y., Kanemitsu H., Obinata M., Mishima K, Kuchino Y. The s-Myc protein having the ability to induce apoptosis is selectively expressed in rat embryo chondrocytes // Oncogene 1994. V. 9 P. 2345-2352

12. Sugiyama A., Noguchi K., Kitanaka C., Katou N. Tashiro F., Ono Т., Yoshida M.C., Kuchino Y. Molecular cloning and chromosomal mapping of mouse intronless myc gene acting as a potent apoptosis inducer // Gene 1999. V. 226 P. 273-283

13. Heikkila R., Schwab G., Wickstrom E., Loke S.L., Pluznik D.H., Watt R., Neckers L.M. A c-myc antisense oligodeoxynucieotide inhibits entry into S phase but not progress from GO to G1 // Nature 1987. V. 328 P. 445-449

14. Eilers M., Picard D., Yamamoto K.R., Bishop J.M. Chimaeras of myc oncoprotein and steroid receptors cause hormone-dependent transformation of cells // Nature 1989. V. 340 P. 66-68

15. Roussel M.F. Key effectors of signal transduction and G1 progression II Adv. Cancer Res. 1998. V. 74 P. 1-24

16. Adachi S., Obaya A.J., Han Z., Ramos-Desimone N. Wyche J.H., Sedivy J.M. c-Myc is necessary for DNA damage-induced apoptosis in the G(2) phase of the cell cycle // Mol. Cell Biol. 2001. V. 21 P. 4929-4937

17. Dani C., Blanchard J.M., Piechaczyk M., El S.S., Marty L., Jeanteur P. Extreme instability of myc mRNA in normal and transformed human cells // Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 1984. V. 81 P. 7046-7050

18. Hann S.R., Eisenman R.N. Proteins encoded by the human c-myc oncogene: differential expression in neoplastic cells // Mol. Cell Biol. 1984. V. 4 P. 2486-2497

19. Ramsay G., Evan G.I., Bishop J.M. The protein encoded by the human proto-oncogene c-myc // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1984. V. 81 P. 7742-7746

20. Oster S.K., Ho C.S., Soucie E.L., Penn L.Z. The myc oncogene: MarvelouslY Complex II Adv. Cancer Res. 2002. V. 84 P. 81-154

21. Cole M.D. The myc oncogene: its role in transformation and differentiation // Annu. Rev. Genet. 1986. V. 20 P. 361-384

22. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. MYC oncogenes and human neoplastic disease // Oncogene 1999. V. 18 P. 3004-3016

23. Boxer L.M., Dang C.V. Translocations involving c-myc and c-myc function // Oncogene 2001. V. 20 P. 5595-5610

24. Prochownik E.V. c-Myc as a therapeutic target in cancer // Expert. Rev. Anticancer Ther. 2004. V. 4 P. 289-302

25. Schwab M. MYCN in neuronal tumours // Cancer Lett. 2004. V. 204 P. 179-187

26. Thomas W.D., Raif A., Hansford L., Marshall G. N-myc transcription molecule and oncoprotein II Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. V. 36 P. 771-775

27. Lee W.H., Murphree A.L., Benedict W.F. Expression and amplification of the N-myc gene in primary retinoblastoma // Nature 1984. V. 309 P. 458-460

28. Garson J.A., Mclntyre P.G., Kemshead J.T. N-myc amplification in malignant astrocytoma // Lancet 1985. V. 2 P. 718-719

29. Collins V.P. Amplified genes in human gliomas // Semin. Cancer Biol. 1993. V. 4 P. 2732

30. Hui А.В., Lo K.W., Yin X.L., Poon W.S., Ng H.K. Detection of multiple gene amplifications in glioblastoma multiforme using array-based comparative genomic hybridization // Lab Invest 2001. V. 81 P. 717-723

31. Wu R., Lin L., Beer D.G., Ellenson L.H., Lamb B.J., Rouillard J.M., Kuick R., Hanash S., Schwartz D.R., Fearon E.R., Cho K.R. Amplification and overexpression of the L-MYC proto-oncogene in ovarian carcinomas//Am. J. Pathol. 2003. V. 162 P. 1603-1610

32. Bernasconi N.L., Wormhoudt T.A., Laird-Offringa I.A. Post-transcriptional deregulation of myc genes in lung cancer cell lines // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000. V. 23 P. 560565

33. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D.( Penn L.Z. Cancer therapeutics: targeting the dark side of Мус // Eur. J. Cancer 2005. V. 41 P. 2485-2501

34. Hoffman В., Amanullah A., Shafarenko M., Liebermann D.A. The proto-oncogene c-myc in hematopoietic development and leukemogenesis // Oncogene 2002. V. 21 P. 34143421

35. Mai S., Mushinski J.F. c-Myc-induced genomic instability // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 2003. V. 22 P. 179-199

36. Nilsson J.A., Cleveland J.L. Мус pathways provoking cell suicide and cancer // Oncogene 2003. V. 22 P. 9007-9021

37. Ruddell A., Mezquita P., Brandvold K.A., Farr A., Iritani B.M. В lymphocyte-specific c-Myc expression stimulates early and functional expansion of the vasculature and lymphatics during lymphomagenesis // Am. J. Pathol. 2003. V. 163 P. 2233-2245

38. Flores I., Murphy D.J., Swigart L.B., Knies U., Evan G.I. Defining the temporal requirements for Мус in the progression and maintenance of skin neoplasia // Oncogene 2004. V. 23 P. 5923-5930

39. Schmidt E.V. The role of c-myc in regulation of translation initiation // Oncogene 2004. V. 23 P. 3217-3221

40. Blakely C.M., Sintasath L. D'Cruz C.M., Hahn K.T., Dugan K.D., Belka G.K., Chodosh L.A. Developmental stage determines the effects of MYC in the mammary epithelium // Development 2005. V. 132 P. 1147-1160

41. Luscher B. Function and regulation of the transcription factors of the Myc/Max/Mad network // Gene 2001. V. 277 P. 1-14

42. Kato G.J., Barrett J., Villa-Garcia M., Dang C.V. An amino-terminal c-myc domain required for neoplastic transformation activates transcription // Mol. Ceil Biol. 1990. V. 10 P. 5914-5920

43. Baxevanis A.D., Vinson C.R. Interactions of coiled coils in transcription factors: where is the specificity?// Curr.Opin. Genet. Dev. 1993. V. 3 P. 278-285

44. Blackwell Т.К., Kretzner L., Blackwood EM, Eisenman R.N., Weintraub H. Sequence-specific DNA binding by the c-Myc protein // Science 1990. V. 250 P. 1149-1151

45. Herbst A., Hemann M.T., Tworkowski K.A., Salghetti S.E., Lowe S.W., Tansey W.P. A conserved element in Мус that negatively regulates its proapoptotic activity II EMBO Rep. 2005. V. 6 P. 177-183

46. McEwan I.J., hlman-Wright K., Ford J., Wright A.P. Functional interaction of the c-Myc transactivation domain with the TATA binding protein: evidence for an induced fit model of transactivation domain folding II Biochemistry 1996. V. 35 P. 9584-9593

47. Fladvad M., Zhou K., Moshref A., Pursglove S., Safsten P., Sunnerhagen M. N and C-terminal sub-regions in the c-Myc transactivation region and their joint role in creating versatility in folding and binding // J. Mol. Biol. 2005. V. 346 P. 175-189

48. Mukherjee В., Morgenbesser S.D., DePinho R.A. Мус family oncoproteins function through a common pathway to transform normal cells in culture: cross-interference by Max and trans-acting dominant mutants II Genes Dev. 1992. V. 6 P. 1480-1492

49. Amati В., Brooks M.W., Levy N. Littlewood T.D., Evan G.I., Land H. Oncogenic activity of the c-Myc protein requires dimerization with Max II Cell 1993. V. 72 P. 233-245

50. Nair S.K., Burley S.K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors II Cell 2003. V. 112 P. 193-205

51. Galaktionov K„ Chen X., Beach O. Cdc25 cell-cycle phosphatase as a target of c-myc // Nature 1996. V. 382 P. 511-517

52. Wu S., Pena A., Korcz A., Soprano D.R., Soprano K.J. Overexpression of Mxi1 inhibits the induction of the human ornithine decarboxylase gene by the Myc/Max protein complex//Oncogene 1996. V. 12 P. 621-629

53. Facchini L.M., Penn L.Z. The molecular role of Мус in growth and transformation: recent discoveries lead to new insights // FASEB J. 1998. V. 12 P. 633-651

54. Amati В., Dalton S., Brooks M.W., Littlewood T.D., Evan G.I., Land H. Transcriptional activation by the human c-Myc oncoprotein in yeast requires interaction with Max // Nature 1992. V. 359 P. 423-426

55. Gu W., Cechova K., Tassi V., la-Favera R. Opposite regulation of gene transcription and cell proliferation by c-Myc and Max // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A1993. V. 90 P. 29352939

56. Ayer D.E., Kretzner L., Eisenman R.N. Mad: a heterodimeric partner for Max that antagonizes Мус transcriptional activity// Cell 1993. V. 72 P. 211-222

57. Zervos A.S., Gyuris J., Brent R. Mxi1, a protein that specifically interacts with Max to bind Myc-Max recognition sites // Cell 1993. V. 72 P. 223-232

58. Hurlin P.J., Queva С., Eisenman R.N. Mnt, a novel Max-interacting protein is coexpressed with Мус in proliferating cells and mediates repression at Мус binding sites // Genes Dev. 1997. V. 11 P. 44-58

59. Adhikary S., Eilers M. Transcriptional regulation and transformation by Мус proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6 P. 635-645

60. Blackwell Т.К., Huang J., Ma A., Kretzner L., Alt F.W., Eisenman R.N., Weintraub H. Binding of myc proteins to canonical and noncanonical DNA sequences // Mol. Cell Biol. 1993. V. 13 P. 5216-5224

61. Ayer D.E., Eisenman R.N. A switch from Myc.Max to Mad:Max heterocomplexes accompanies monocyte/macrophage differentiation // Genes Dev. 1993. V. 7 P. 21102119

62. Patel J.H., Loboda A.P., Showe M.K., Showe L.C., McMahon S.B. Analysis of genomic targets reveals complex functions of MYC // Nat. Rev. Cancer 2004. V. 4 P. 562-568

63. Izumi H„ Molander C., Penn L.Z., Ishisaki A., Kohno K., Funa K. Mechanism for the transcriptional repression by c-Mycon PDGF beta-receptor//J. Cell Sci. 2001. V. 114 P. 1533-1544

64. Staller P., Peukert K., Kiermaier A., Seoane J., Lukas J., Karsunky H., Moroy Т., Bartek J., Massague J., Hanel F„ Eilers M. Repression of p15INK4b expression by Мус through association with Miz-1 // Nat. Cell Biol. 2001. V. 3 P. 392-399

65. Seoane J., Le H.V., Massague J. Мус suppression of the p21(Cip1) Cdk inhibitor influences the outcome of the p53 response to DNA damage // Nature 2002. V. 419 P. 729-734

66. Datta A., Nag A., Pan W., Hay N., Gartel A.L., Colamonici O., Mori Y., Raychaudhuri P. Myc-ARF (alternate reading frame) interaction inhibits the functions of Мус // J. Biol. Chem. 2004. V. 279 P. 36698-36707

67. Qi Y., Gregory M.A., Li Z., Brousal J.P., West K., Hann S.R. p19ARF directly and differentially controls the functions of c-Myc independently of p53 // Nature 2004. V. 431 P. 712-717

68. Fernandez P.C., Frank S.R., Wang L., Schroeder M., Liu S., Greene J., Cocito A., Amati B. Genomic targets of the human c-Myc protein // Genes Dev. 2003. V. 17 P. 1115-1129

69. McMahon S.B., Van Buskirk H.A., Dugan K.A., Copeland T.D., Cole M.D. The novel ATM-related protein TRRAP is an essential cofactor for the c-Myc and E2F oncoproteins // Cell 1998. V. 94 P. 363-374

70. Amati В., Frank S.R., Donjerkovic D., Taubert S. Function of the c-Myc oncoprotein in chromatin remodeling and transcription // Biochim. Biophys. Acta 2001. V. 1471 P. M135-M145

71. Park J., Kunjibettu S., McMahon S.B., Cole M.D. The ATM-related domain of TRRAP is required for histone acetyltransferase recruitment and Мус-dependent oncogenesis // Genes Dev. 2001. V. 15 P. 1619-1624

72. Vervoorts J., Luscher-Firzfaff J.M., Rottmann S., Lilischkis R„ Walsemann G., Dohmann K., Austen M., Luscher B. Stimulation of c-MYC transcriptional activity and acetylation by recruitment of the cofactor СВР // EMBO Rep. 2003. V. 4 P. 484-490

73. Wood M.A., McMahon S.B., Cole M.D. An ATPase/helicase complex is an essential cofactor for oncogenic transformation by c-Myc // Mol. Cell 2000. V. 5 P. 321-330

74. Eberhardy S.R., Famham P.J. c-Myc mediates activation of the cad promoter via a post-RNA polymerase II recruitment mechanism // J. Biol. Chem. 2001. V. 276 P. 4856248571

75. Eberhardy S.R., Farnham P.J. Мус recruits P-TEFb to mediate the final step in the transcriptional activation of the cad promoter // J. Biol. Chem. 2002. V. 277 P. 4015640162

76. Felton-Edkins Z.A., Kenneth N.S., Brown T.R., Daly N.L., Gomez-Roman N., Grandori C., Eisenman R.N., White R.J. Direct regulation of RNA polymerase III transcription by RB, p53 and c-Myc// Cell Cycle2003. V. 2 P. 181-184

77. Gomez-Roman N., Grandori C., Eisenman R.N., White R.J. Direct activation of RNA polymerase III transcription by c-Myc // Nature 2003. V. 421 P. 290-294

78. Grummt I. Life on a planet of its own: regulation of RNA polymerase I transcription in the nucleolus//Genes Dev. 2003. V. 17 P. 1691-1702

79. Moss T. At the crossroads of growth control; making ribosomal RNA // Curr. Opin. Genet. Dev. 2004. V. 14 P. 210-217

80. Grewal S.S., Li L., Orian A., Eisenman R.N., Edgar B.A. Мус-dependent regulation of ribosomal RNA synthesis during Drosophila development // Nat. Cell Biol. 2005. V. 7 P. 295-302

81. Wanzel M., Kleine-Kohlbrecher D., Herold S., Hock A., Berns K., Park J., Hemmings В., Eilers M. Akt and 14-3-3eta regulate Miz1 to control cell-cycle arrest after DNA damage // Nat. Cell Biol. 2005. V. 7 P. 30-41

82. Gartel A.L., Ye X., Goufman E„ Shianov P., Hay N., Najmabadi F„ Tyner A.L. Мус represses the p21(WAFl/CIP1) promoter and interacts with Sp1/Sp3 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2001. V. 98 P. 4510-4515

83. Roy A.L., Carruthers C„ Gutjahr Т., Roeder R.G. Direct role for Мус in transcription initiation mediated by interactions with TFII-I // Nature 1993. V. 365 P. 359-361

84. Shrivastava A., Saleque S., Kalpana G.V., Artandi S., Goff S.P., Calame K. Inhibition of transcriptional regulator Vin-Vang-1 by association with c-Myc // Science 1993. V. 262 P. 1889-1892

85. Barsyte-Lovejoy D., Mao D.Y., Penn L.Z. c-Myc represses the proximal promoters of GADD45a and GADD153 by a post-RNA polymerase II recruitment mechanism // Oncogene 2004. V. 23 P. 3481-3486

86. O'Donnell K.A., Wentzel E.A., Zeller K.I., Dang C.V., Mendell J.T. c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression // Nature 2005. V. 435 P. 839-843

87. Knoepfler P.S., Cheng P.F., Eisenman R.N. N-myc is essential during neurogenesis for the rapid expansion of progenitor cell populations and the inhibition of neuronal differentiation // Genes Dev. 2002. V. 16 P. 2699-2712

88. Kowalczyk A., Filipkowski R.K., Rylski M., Wilczynski G.M., Konopacki F.A., Jaworski J., Ciemerych M.A., Sicinski P., Kaczmarek L. The critical role of cyclin D2 in adult neurogenesis //J. Cell Biol. 2004. V. 167 P. 209-213

89. Kenney A.M., Cole M.D., Rowitch D.H. Nmyc upregulation by sonic hedgehog signaling promotes proliferation in developing cerebellar granule neuron precursors // Development 2003. V. 130 P. 15-28

90. Kozar K, Ciemerych M.A., Rebel V.I., Shigematsu H., Zagozdzon A., Sicinska E., Geng Y., Yu Q., Bhattacharya S., Branson R.T., Akashi K., Sicinski P. Mouse development and cell proliferation in the absence of D-cyclins // Cell 2004. V. 118 P. 477-491

91. Bouchard C., Dittrich O., Kiermaier A., Dohmann K., Menkel A., Eilers M., Luscher B. Regulation of cyclin D2 gene expression by the Myc/Max/Mad network: Myc-dependent

92. TRRAP recruitment and histone acetylation at the cyclin D2 promoter // Genes Dev. 2001. V. 15 P. 2042-2047

93. Herald S., Wanzel M., Beuger V., Frohme C., Beul D., Hillukkala Т., Syvaoja J., Saluz H.P., Haenel F., Eilers M. Negative regulation of the mammalian UV response by Мус through association with Miz-1 // Mol. Cell 2002. V. 10 P. 509-521

94. Shim H., Dolde C., Lewis B.C., Wu C.S., Dang G., Jungmann R.A., la-Favera R., Dang C.V. c-Myc transactivation of LDH-A: implications for tumor metabolism and growth // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A1997. V. 94 P. 6658-6663

95. Semenza G.L., Artemov D., Bedi A., Bhujwalla Z., Chiles K., Feldser D., Laughner E., Ravi R., Simons J., Taghavi P., Zhong H. The metabolism of tumours': 70 years later// Novartis. Found. Symp. 2001. V. 240 P. 251-260

96. Wu K.J., Polack A., la-Favera R. Coordinated regulation of iron-controlling genes, H-ferritin and IRP2, by c-MYC // Science 1999. V. 283 P. 676-679

97. Gregory M.A., Qi Y., Hann S.R. Phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 controls c-myc proteolysis and subnuclear localization // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 P. 5160651612

98. Welcker M., Orian A., Grim J.E., Eisenman R.N., Clurman B.E. A nucleolar isoform of the Fbw7 ubiquitin ligase regulates c-Myc and cell size // Curr. Biol. 2004. V. 14 P. 18521857

99. Yada M., Hatakeyama S., Kamura Т., Nishiyama M., Tsunematsu R., Imaki H., Ishida N., Okumura F., Nakayama K., Nakayama K.I. Phosphorylation-dependent degradation of c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7 // EMBO J. 2004. V. 23 P. 2116-2125

100. Bahram F., von der L.N., Cetinkaya C., Larsson L.G. c-Myc hot spot mutations in lymphomas result in inefficient ubiquitination and decreased proteasome-mediated turnover // Blood 2000. V. 95 P. 2104-2110

101. Bouchard C., Marquardt J., Bras A., Medema R.H., Eilers M. Myc-induced proliferation and transformation require Akt-mediated phosphorylation of FoxO proteins // EMBO J. 2004. V. 23 P. 2830-2840

102. Watnick R.S., Cheng Y.N., Rangarajan A., Ince T.A., Weinberg R.A. Ras modulates Мус activity to repress thrombospondin-1 expression and increase tumor angiogenesis // Cancer Cell 2003. V. 3 P. 219-231

103. Evan G.I., Wyllie A.H., Gilbert C.S., Littlewood Т.О., Land H., Brooks M„ Waters C.M., Penn L.Z., Hancock D.C. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein // Cell 1992. V. 69 P. 119-128

104. Zindy F., Eischen C.M., Randle D.H., Kamijo Т., Cleveland J.L., Sherr C.J., Roussel M.F. Мус signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization // Genes Dev. 1998. V. 12 P. 2424-2433

105. Eischen C.M., Weber J.D., Roussel M.F., Sherr C.J., Cleveland J.L. Disruption of the ARF-Mdm2-p53 tumor suppressor pathway in Myc-induced lymphomagenesis // Genes Dev. 1999. V. 13 P. 2658-2669

106. Aslanian A., laquinta P.J., Verona R., Lees J.A. Repression of the Arf tumor suppressor by E2F3 is required for normal cell cycle kinetics // Genes Dev. 2004. V. 18 P. 14131422

107. Juin P., Hueber A.O., Littlewood Т., Evan G. c-Myc-induced sensitization to apoptosis is mediated through cytochrome с release // Genes Dev. 1999. V. 13 P. 1367-1381

108. Mitchell K.O., Ricci M.S., Miyashita Т., Dicker D.T., Jin Z., Reed J.C., El-Deiry W.S. Bax is a transcriptional target and mediator of c-myc-induced apoptosis // Cancer Res. 2000. V. 60 P. 6318-6325

109. Egle A., Harris A.W., Bouillet P., Cory S. Bim is a suppressor of Myc-induced mouse В cell leukemia // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2004. V. 101 P. 6164-6169

110. Eischen C.M., Woo D., Roussel M.F., Cleveland J.L. Apoptosis triggered by Myc-induced suppression of Bcl-X(L) or Bcl-2 is bypassed during lymphomagenesis // Mol. Cell Biol. 2001. V. 21 P. 5063-5070

111. Pelengaris S., Khan M., Evan G.I. Suppression of Myc-induced apoptosis in beta cells exposes multiple oncogenic properties of Мус and triggers carcinogenic progression // Cell 2002. V. 109 P. 321-334

112. Karlsson A., Deb-Basu D., Cherry A., Turner S., Ford J., Felsher D.W. Defective double-strand DNA break repair and chromosomal translocations by MYC overexpression // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2003. V. 100 P. 9974-9979

113. Felsher D.W., Bishop J.M. Reversible tumorigenesis by MYC in hematopoietic lineages // Mol. Cell 1999. V. 4 P. 199-207

114. Arnold I., Watt F.M. c-Myc activation in transgenic mouse epidermis results in mobilization of stem cells and differentiation of their progeny // Curr. Biol. 2001. V. 11 P. 558-568

115. Jonkers J., Berns A. Oncogene addiction: sometimes a temporary slavery // Cancer Cell 2004. V. 6 P. 535-538

116. Felsher D.W., Bishop J.M. Transient excess of MYC activity can elicit genomic instability and tumorigenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1999. V. 96 P. 3940-3944

117. Jain M., Arvanitis C„ Chu K., Dewey W., Leonhardt E., Trinh M., Sundberg C.D., Bishop J.M., Felsher D.W. Sustained loss of a neoplastic phenotype by brief inactivation of MYC // Science 2002. V. 297 P. 102-104

118. Iversen P.L., Arora V., Acker A.J., Mason D.H., Devi G.R. Efficacy of antisense morpholino oligomer targeted to c-myc in prostate cancer xenograft murine model and a Phase I safety study in humans // Clin. Cancer Res. 2003. V. 9 P. 2510-2519

119. Fest Т., Mougey V., Dalstein V., Hagerty M., Milette D., Silva S„ Mai S. c-MYC overexpression in Ba/F3 cells simultaneously elicits genomic instability and apoptosis II Oncogene 2002. V. 21 P. 2981-2990

120. Wechsler D.S., Shelly C.A., Petroff C.A., Dang C.V. MXI1, a putative tumor suppressor gene, suppresses growth of human glioblastoma cells // Cancer Res. 1997. V. 57 P. 4905-4912

121. Chen J., Willingham Т., Margraf L.R., Schreiber-Agus N., DePinho R.A., Nisen P.D. Effects of the MYC oncogene antagonist, MAD, on proliferation, cell cycling and the malignant phenotype of human brain tumour cells // Nat. Med. 1995. V. 1 P. 638-643

122. Soucek L., Helmer-Citterich M., Sacco A., Jucker R., Cesareni G., Nasi S. Design and properties of а Мус derivative that efficiently homodimerizes // Oncogene 1998. V. 17 P. 2463-2472

123. Soucek L., Jucker R., Panacchia L., Ricordy R., Tato F., Nasi S. Omomyc, a potential Мус dominant negative, enhances Myc-induced apoptosis // Cancer Res. 2002. V. 62 P. 3507-3510

124. Soucek L., Nasi S„ Evan G.I. Omomyc expression in skin prevents Myc-induced papillomatosis //Cell Death. Differ. 2004. V. 11 P. 1038-1045

125. Kohlhuber F., Hermeking H., Graessmann A., Eick D. Induction of apoptosis by the c-Myc helix-loop-helix/leucine zipper domain in mouse 3T3-L1 fibroblasts II J. Biol. Chem. 1995. V. 270 P. 28797-28805

126. Draeger L.J., Mullen G.P. Interaction of the bHLH-zip domain of c-Myc with H1-type peptides. Characterization of helicity in the H1 peptides by NMRII J. Biol. Chem. 1994. V. 269 P. 1785-1793

127. Yin X., Giap C., Lazo J.S., Prochownik E.V. Low molecular weight inhibitors of Myc-Max interaction and function // Oncogene 2003. V. 22 P. 6151-6159

128. Mo H., Henriksson M. identification of small molecules that induce apoptosis in a Myc-dependent manner and inhibit Мус-driven transformation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2006. V. 103 P. 6344-6349

129. Lu X., Pearson A., Lunec J. The MYCN oncoprotein as a drug development target // Cancer Lett. 2003. V. 197 P. 125-130

130. Giovannangeli C., Helene C. Triplex-forming molecules for modulation of DNA information processing // Curr. Opin. Mol. Ther. 2000. V. 2 P. 288-296

131. Casey B.P., Glazer P.M. Gene targeting via triple-helix formation // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001. V. 67 P. 163-192

132. McGuffie E.M., Pacheco 0., Carbone G.M., Catapano C.V. Antigene and antiproliferative effects of a c-myc-targeting phosphorothioate triple helix-forming oligonucleotide in human leukemia cells // Cancer Res. 2000. V. 60 P. 3790-3799

133. Siddiqui-Jain A., Grand C.L., Bearss D.J., Hurley L.H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2002. V. 99 P. 11593-11598

134. Lemarteleur Т., Gomez D., Paterski R., Mandine E., Mailliet P., Riou J.F. Stabilization of the c-myc gene promoter quadruplex by specific ligands' inhibitors of telomerase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 323 P. 802-808

135. Simonsson Т., Henriksson M. c-myc Suppression in Burkitt's lymphoma cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 290 P. 11-15

136. Eder P.S., DeVine R.J., Dagle J.M., Walder J.A. Substrate specificity and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma И Antisense Res. Dev. 1991. V. 1 P. 141-151

137. Lima W.F., Mohan V., Crooke S.T. The influence of antisense oligonucleotide-induced RNA structure on Escherichia coli RNase H1 activity И J. Biol. Chem. 1997. V. 272 P. 18191-18199

138. Stahel R.A., Zahgemeister-Wittke U. Antisense oligonucleotides for cancer therapy-an overview // Lung Cancer 2003. V. 41 Suppl 1 P. S81-S88

139. Prochownik E.V., Kukowska J., Rodgers C. c-myc antisense transcripts accelerate differentiation and inhibit G1 progression in murine erythroleukemia cells // Mol. Cell Biol. 1988. V. 8 P. 3683-3695

140. Holt J.T., Redner R.L., Nienhuis A.W. An oligomer complementary to c-myc mRNA inhibits proliferation of HL-60 promyelocyte cells and induces differentiation // Mol. Cell Biol. 1988. V. 8 P. 963-973

141. Negroni A., Scarpa S., Romeo A., Ferrari S., Modesti A., Raschella G. Decrease of proliferation rate and induction of differentiation by a MYCN antisense DNA oligomer in a human neuroblastoma cell line // Cell Growth Differ. 1991. V. 2 P. 511-518

142. Smith J.B., Wickstrom E. Inhibition of tumorigenesis in a murine B-cell lymphoma transplant model by c-Myc complementary oligonucleotides //Adv. Exp. Med. Biol. 1998. V. 451 P. 17-22

143. Smith J.B., Wickstrom E. Antisense c-myc and immunostimulatory oligonucleotide inhibition of tumorigenesis in a murine B-cell lymphoma transplant model // J. Natl. Cancer Inst. 1998. V. 90 P. 1146-1154

144. Huang Y.( Snyder R., Kligshteyn M., Wickstrom E. Prevention of tumor formation in a mouse model of Burkitt's lymphoma by 6 weeks of treatment with anti-c-myc DNA phosphorothioate//Mol. Med. 1995. V. 1 P. 647-658

145. Sklar M.D., Prochownik E.V. Modulation of cis-platinum resistance in Friend erythroleukemia cells by c-myc // Cancer Res. 1991. V. 51 P. 2118-2123

146. Mizutani Y., Fukumoto M., Bonavida В., Yoshida O. Enhancement of sensitivity of urinary bladder tumor cells to cisplatin by c-myc antisense oligonucleotide // Cancer 1994. V. 74 P. 2546-2554

147. Van Waardenburg R.C., Prins J., Meijer C., Uges D.R., De Vries E.G., Mulder N.H. Effects of c-myc oncogene modulation on drug resistance in human small cell lung carcinoma cell lines//Anticancer Res. 1996. V. 16 P. 1963-1970

148. Citro G., D'Agnano I., Leonetti C., Perini R., Bucci В., Zon G., Calabretta В., Zupi G. c-myc antisense oligodeoxynucleotides enhance the efficacy of cisplatin in melanoma chemotherapy in vitro and in nude mice // Cancer Res. 1998. V. 58 P. 283-289

149. Knapp D.C., Mata J.E., Reddy M.T., Devi G.R., Iversen P.L. Resistance to chemotherapeutic drugs overcome by c-Myc inhibition in a Lewis lung carcinoma murine model // Anticancer Drugs 2003. V. 14 P. 39-47

150. Devi G.R., Oldenkamp J.R., London C.A., Iversen P.L. Inhibition of human chorionic gonadotropin beta-subunit modulates the mitogenic effect of c-myc in human prostate cancer cells // Prostate 2002. V. 53 P. 200-210

151. Ricker J.L., Mata J.E., Iversen P.L., Gattone V.H. c-myc antisense oligonucleotide treatment ameliorates murine ARPKD// Kidney Int. 2002. V. 61 Suppl 1 P. 125-131

152. Devi G.R., Beer T.M., Corless C.L., Arora V., Weller D.L., Iversen P.L. In vivo bioavailability and pharmacokinetics of a c-MYC antisense phosphorodiamidate morpholino oligomer, AVI-4126, in solid tumors // Clin. Cancer Res. 2005. V. 11 P. 39303938

153. Henry S.P., Novotny W„ Leeds J„ Auletta C., Kornbrust D.J. Inhibition of coagulation by a phosphorothioate oligonucleotide // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7 P. 503-510

154. Levin A.A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides // Biochim. Biophys. Acta 1999. V. 1489 P. 69-84

155. Pooga M., Land Т., Bartfai Т., Langel U. PNA oligomers as tools for specific modulation of gene expression // Biomol. Eng 2001. V. 17 P. 183-192

156. Pession A., Tonelli R. The MYCN oncogene as a specific and selective drug target for peripheral and central nervous system tumors // Curr. Cancer Drug Targets. 2005. V. 5 P. 273-283

157. Whitesell L., Rosolen A., Neckers L.M. In vivo modulation of N-myc expression by continuous perfusion with an antisense oligonucleotide // Antisense Res. Dev. 1991. V. 1 P. 343-350

158. Cheng J., Luo J., Zhang X., Hu J., Hui H., Wang C., Stern A. Inhibition of cell proliferation in HCC-9204 hepatoma cells by a c-myc specific ribozyme // Cancer Gene Ther. 2000. V. 7 P. 407-412

159. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature 1998. V. 391 P. 806-811

160. Mello C.C., Conte D., Jr. Revealing the world of RNA interference // Nature 2004. V. 431 P. 338-342

161. Zamore P.D., Tuschl Т., Sharp P.A., Bartel D.P. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals // Cell 2000. V. 101 P. 25-33

162. Meister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA // Nature 2004. V. 431 P. 343-349

163. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi // Cell 2002. V. 110 P. 563-574

164. Hammond S.M. Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference pathway // FEBS Lett. 2005. V. 579 P. 5822-5829

165. Lehner В., Williams G., Campbell R.D., Sanderson C.M. Antisense transcripts in the human genome //Trends Genet. 2002. V. 18 P. 63-65

166. Carrington J.C., Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development // Science 2003. V. 301 P. 336-338

167. Urn L.P., Glasner M.E., Yekta S., Burge C.B., Bartel D.P. Vertebrate microRNA genes // Science 2003. V. 299 P. 1540

168. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function // Cell 2004. V. 116 P. 281-297

169. Ambros V. The functions of animal microRNAs // Nature 2004. V. 431 P. 350-355

170. Lee Y., Ahn C„ Han J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Radmark O., Kim S., Kim V.N. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing // Nature 2003. V. 425 P. 415-419

171. Mourelatos Z., Dostie J., Paushkin S., Sharma A., Charroux В., Abel L., Rappsilber J., Mann M., Dreyfuss G. miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs // Genes Dev. 2002. V. 16 P. 720-728

172. Doench J.G., Petersen C.P., Sharp P.A. siRNAs can function as miRNAs // Genes Dev.2003. V. 17 P. 438-442

173. Tebes S.J., Kruk P.A. The genesis of RNA interference, its potential clinical applications, and implications in gynecologic cancer // Gynecol. Oncol. 2005. V. 99 P. 736-741

174. Fuchs U., mm-Welk C., Borkhardt A. Silencing of disease-related genes by small interfering RNAs // Curr. Mol. Med. 2004. V. 4 P. 507-517

175. Pai S.I., Lin Y.Y., Macaes В., Meneshian A., Hung C.F., Wu Т.О. Prospects of RNA interference therapy for cancer // Gene Ther. 2006. V. 13 P. 464-477

176. Morris K.V., Rossi J.J. Lentiviral-mediated delivery of siRNAs for antiviral therapy // Gene Ther. 2006. V. 13 P. 553-558

177. Oates A.C., Bruce A.E., Ho R.K. Too much interference: injection of double-stranded RNA has nonspecific effects in the zebrafish embryo // Dev. Biol. 2000. V. 224 P. 20-28

178. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W„ Yalcin A., Weber K., Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells // Nature 2001. V. 411 P. 494-498

179. Hohjoh H. Enhancement of RNAi activity by improved siRNA duplexes II FEBS Lett.2004. V. 557 P. 193-198

180. Sioud M. Therapeutic siRNAs // Trends Pharmacol. Sci. 2004. V. 25 P. 22-28

181. Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., Haraguchi Т., Ohki-Hamazaki H., Juni A., Ueda R., Saigo K. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference II Nucleic Acids Res. 2004. V. 32 P. 936-948

182. Dykxhoorn D.M., Lieberman J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic II Annu. Rev. Med. 2005. V. 56 P. 401-423

183. Bertrand J.R., Pottier M., Vekris A., Opolon P., Maksimenko A., Malvy C. Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 296 P. 1000-1004

184. Hutvagner G., Zamore P.D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex II Science 2002. V. 297 P. 2056-2060

185. Amarzguioui M., Holen Т., Babaie E., Prydz H. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA//Nucleic Acids Res. 2003. V. 31 P. 589-595

186. Braasch D.A., Jensen S., Liu Y., Kaur K., Arar K., White M.A., Corey D.R. RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA // Biochemistry 2003. V. 42 P. 7967-7975

187. Dorsett Y., Tuschl T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics II Nat. Rev. Drug Discov. 2004. V. 3 P. 318-329

188. Bridge A.J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A.L., Iggo R. Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells // Nat. Genet. 2003. V. 34 P. 263-264

189. Sledz С.A., Holko M., de Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R. Activation of the interferon system by short-interfering RNAs // Nat. Cell Biol. 2003. V. 5 P. 834-839

190. Persengiev S.P., Zhu X., Green M.R. Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs) // RNA. 2004. V. 10 P. 12-18

191. Heidel J.D., Hu S., Liu X.F., Triche T.J., Davis M.E. Lack of interferon response in animals to naked siRNAs // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22 P. 1579-1582

192. Kariko K., Bhuyan P., Capodici J., Weissman D. Small interfering RNAs mediate sequence-independent gene suppression and induce immune activation by signaling through toll-like receptor 3 // J. Immunol. 2004. V. 172 P. 6545-6549

193. Sioud M. Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double-stranded and single-stranded siRNAs is sequence-dependent and requires endosomal localization // J. Mol. Biol. 2005. V. 348 P. 1079-1090

194. Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., McClintock K., MacLachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23 P. 457-462

195. Fedorov Y., King A., Anderson E., Karpilow J., Ilsley D., Marshall W., Khvorova A. Different delivery methods-different expression profiles // Nat. Methods 2005. V. 2 P. 241

196. Hosono Т., Mizuguchi H., Katayama K., Xu Z.L., Sakurai F., Ishii-Watabe A., Kawabata K., Yamaguchi Т., Nakagawa S., Mayumi Т., Hayakawa T. Adenovirus vector-mediated doxycycline-inducible RNA interference // Hum. Gene Ther. 2004. V. 15 P. 813-819

197. Wang Y.H., Liu S., Zhang G„ Zhou C.Q., Zhu H.X., Zhou X.B., Quan L.P., Bai J.F., Xu N.Z. Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast tumor cells growth in vitro and in vivo II Breast Cancer Res. 2005. V. 7 P. R220-R228

198. Stevenson M. Therapeutic potential of RNA interference II N. Engl. J. Med. 2004. V. 351 P. 1772-1777

199. Demeterco C., Itkin-Ansari P., Tyrberg В., Ford L.P., Jarvis R.A., Levine F. c-Myc controls proliferation versus differentiation in human pancreatic endocrine cells // J. Clin. Endocrinol. Metab 2002. V. 87 P. 3475-3485

200. Gao X., Wang H., Sairenji T. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation by short interfering RNAs targeting p38 mitogen-activated protein kinase or c-myc in EBV-positive epithelial cells // J. Virol. 2004. V. 78 P. 11798-11806

201. Shen L., Zhang C., Ambrus J.L., Wang J.H. Silencing of human c-myc oncogene expression by poly-DNP-RNA // Oligonucleotides. 2005. V. 15 P. 23-35

202. Chen X., Shen L., Wang J.H. Poly-2'-DNP-RNAs with enhanced efficacy for inhibiting cancer cell growth // Oligonucleotides. 2004. V. 14 P. 90-99

203. Aronin N. Target selectivity in mRNA silencing // Gene Ther. 2006. V. 13 P. 509-516

204. Li X., Stuckert P., Bosch I., Marks J.D., Marasco W.A. Single-chain antibody-mediated gene delivery into ErbB2-positive human breast cancer cells // Cancer Gene Ther. 2001. V. 8 P. 555-565

205. Shang Y., Baumrucker C.R., Green M.H. c-Myc is a major mediator of the synergistic growth inhibitory effects of retinoic acid and interferon in breast cancer cells // J. Biol. Chem. 1998. V. 273 P. 30608-30613

206. Lampson G.P., Tytell A.A., Field A.K., Nemes M.M., Hilleman M.R. Inducers of interferon and host resistance. I. Double-stranded RNA from extracts of Penicillium funiculosum // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1967. V. 58 P. 782-789

207. Samuel C.E. Antiviral actions of interferons // Clin. Microbiol. Rev. 2001. V. 14 P. 778809, table

208. Castelli J.C., Hassel B.A., Wood K.A., Li X.L., Amemiya K., Dalakas M.C., Torrence P.F., Youle R.J. A study of the interferon antiviral mechanism: apoptosis activation by the 2-5A system //J. Exp. Med. 1997. V. 186 P. 967-972

209. Clemens M.J. PKR-a protein kinase regulated by double-stranded RNA // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. V. 29 P. 945-949

210. Underbill D.M., Ozinsky A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection // Curr. Opin. Immunol. 2002. V. 14 P. 103-110

211. Meurs E., Chong K., Galabru J., Thomas N.S., Kerr I.M., Williams B.R., Hovanessian A.G. Molecular cloning and characterization of the human double-stranded RNA-activated protein kinase induced by interferon // Cell 1990. V. 62 P. 379-390

212. Samuel C.E. The elF-2 alpha protein kinases, regulators of translation in eukaryotes from yeasts to humans // J. Biol. Chem. 1993. V. 268 P. 7603-7606

213. Manche L., Green S.R., Schmedt C., Mathews M.B. Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI // Mol. Cell Biol. 1992. V. 12 P. 5238-5248

214. Spanggord R.J., Vuyisich M., Seal P.A. Identification of binding sites for both dsRBMs of PKR on kinase-activating and kinase-inhibiting RNA ligands // Biochemistry 2002. V. 41 P. 4511-4520

215. Kumar A., Haque J., Lacoste J., Hiscott J., Williams B.R. Double-stranded RNA-dependent protein kinase activates transcription factor NF-kappa В by phosphorylating I kappa В// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994. V. 91 P. 6288-6292

216. Xu Z., Williams B.R. The B56alpha regulatory subunit of protein phosphatase 2A is a target for regulation by double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20 P. 5285-5299

217. Langland J.O., Kao P.N., Jacobs B.L. Nuclear factor-90 of activated T-cells: A double-stranded RNA-binding protein and substrate for the double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR // Biochemistry 1999. V. 38 P. 6361-6368

218. Clemens M.J. Does protein phosphorylation play a role in translational control by eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetases? // Trends Biochem. Sci. 1990. V. 15 P. 172175

219. Zandi E., Karin M. Bridging the gap: composition, regulation, and physiological function of the IkappaB kinase complex// Mol. Cell Biol. 1999. V. 19 P. 4547-4551

220. Delhase M., Hayakawa M„ Chen Y., Karin M. Positive and negative regulation of IkappaB kinase activity through IKKbeta subunit phosphorylation // Science 1999. V. 284 P. 309-313

221. Zandi E., Karin M. Bridging the gap: composition, regulation, and physiological function of the IkappaB kinase complex// Mol. Cell Biol. 1999. V. 19 P. 4547-4551

222. Zamanian-Daryoush M., Mogensen Т.Н., DiDonato J.A., Williams B.R. NF-kappaB activation by double-stranded-RNA-activated protein kinase (PKR) is mediated through NF-kappaB-inducing kinase and IkappaB kinase // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20 P. 12781290

223. Cuddihy A.R., Li S., Tam N.W., Wong A.H., Taya Y„ Abraham N., Bell J.C., Koromilas A.E. Double-stranded-RNA-activated protein kinase PKR enhances transcriptional activation by tumor suppressor p53 // Mol. Cell Biol. 1999. V. 19 P. 2475-2484

224. Donze O., Dostie J., Sonenberg N. Regulatable expression of the interferon-induced double-stranded RNA dependent protein kinase PKR induces apoptosis and fas receptor expression // Virology 1999. V. 256 P. 322-329

225. Goh K.C., deVeer M.J., Williams B.R. The protein kinase PKR is required for p38 МАРК activation and the innate immune response to bacterial endotoxin // EMBO J. 2000. V. 19 P. 4292-4297

226. Li G., Xiang Y., Sabapathy K., Silverman R.H. An apoptotic signaling pathway in the interferon antiviral response mediated by RNase L and c-Jun NH2-terminal kinase // J. Biol. Chem. 2004. V. 279 P. 1123-1131

227. Balachandran S., Kim C.N., Yeh W.C., Мак T.W., Bhalla K., Barber G.N. Activation of the dsRNA-dependent protein kinase, PKR, induces apoptosis through FADD-mediated death signaling // EMBO J. 1998. V. 17 P. 6888-6902

228. Gil J., Garcia M.A., Esteban M. Caspase 9 activation by the dsRNA-dependent protein kinase, PKR: molecular mechanism and relevance // FEBS Lett. 2002. V. 529 P. 249255

229. Kumar M., Carmichael G.G. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62 P. 1415-1434

230. Dong В., Silverman R.H. 2-5A-dependent RNase molecules dimerize during activation by 2-5A // J. Biol. Chem. 1995. V. 270 P. 4133-4137

231. Li X.L., Blackford J.A., Hassel B.A. RNase L mediates the antiviral effect of interferon through a selective reduction in viral RNA during encephalomyocarditis virus infection // J. Virol. 1998. V. 72 P. 2752-2759

232. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signalling // Nat. Rev. Immunol. 2004. V. 4 P. 499511

233. Alexopoulou L., Holt A.C., Medzhitov R., Flavell R.A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3 // Nature 2001. V. 413 P. 732738

234. Crozat K, Beutler B. TLR7: A new sensor of viral infection // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2004. V. 101 P. 6835-6836

235. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai Т., Kaisho Т., Sato S„ Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA // Nature 2000. V. 408 P. 740-745

236. Rehli M. Of mice and men: species variations of Toll-like receptor expression // Trends Immunol. 2002. V. 23 P. 375-378

237. Matsumoto M., Kikkawa S., Kohase M., Miyake K., Seya T. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 293 P. 13641369

238. Kariko K., Ni H., Capodici J„ Lamphier M., Weissman D. mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3 // J. Biol. Chem. 2004. V. 279 P. 12542-12550

239. Vogel S.N., Fitzgerald K.A., Fenton M.J. TLRs: differential adapter utilization by toll-like receptors mediates TLR-specific patterns of gene expression // Mol. Interv. 2003. V. 3 P. 466-477

240. Sen G.C., Sarkar S.N. Transcriptional signaling by double-stranded RNA: role of TLR3 // Cytokine Growth Factor Rev. 2005. V. 16 P. 1-14

241. Thale C., Kiderien A.F. Sources of interferon-gamma (IFN-gamma) in early immune response to Listeria monocytogenes // Immunobiology 2005. V. 210 P. 673-683

242. Samuel M.A., Diamond M.S. Alpha/beta interferon protects against lethal West Nile virus infection by restricting cellular tropism and enhancing neuronal survival // J. Virol. 2005. V. 79 P. 13350-13361

243. Schroder K., Hertzog P.J., Ravasi Т., Hume D.A. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions // J. Leukoc. Biol. 2004. V. 75 P. 163-189

244. Munoz-Jordan J.L., Sanchez-Burgos G.G., Laurent-Rolle M., Garcia-Sastre A. Inhibition of interferon signaling by dengue virus // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2003. V. 100 P. 14333-14338

245. Basler C.F., Garcia-Sastre A. Viruses and the type I interferon antiviral system: induction and evasion // Int. Rev. Immunol. 2002. V. 21 P. 305-337

246. Boudny V., Kovarik J. JAK/STAT signaling pathways and cancer. Janus kinases/signal transducers and activators of transcription // Neoplasma 2002. V. 49 P. 349-355

247. Bach E.A., Aguet M., Schreiber R.D. The IFN gamma receptor: a paradigm for cytokine receptor signaling // Annu. Rev. Immunol. 1997. V. 15 P. 563-591

248. Einat M., Resnitzky D., Kimchi A. Close link between reduction of c-myc expression by interferon and, G0/G1 arrest// Nature 1985. V. 313 P. 597-600

249. Yarden A., Kimchi A. Tumor necrosis factor reduces c-myc expression and cooperates with interferon-gamma in HeLa cells // Science 1986. V. 234 P. 1419-1421

250. Sangfelt O., Erickson S., Grander D. Mechanisms of interferon-induced cell cycle arrest // Front Biosci. 2000. V. 5 P. D479-D487

251. Wada R.K., Pai D.S., Huang J., Yamashiro J.M., Sidell N. Interferon-gamma and retinoic acid down-regulate N-myc in neuroblastoma through complementary mechanisms of action // Cancer Lett. 1997. V. 121 P. 181-188

252. Новиков В.И. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях // М. 1997.

253. Damha M.J., Ogilvie К.К. Oligoribonucleotide synthesis. The silyl-phosphoramidite method // Methods Mol. Biol. 1993. V. 20 P. 81-114

254. Donis-Keller H., Maxam A.M., Gilbert W. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA // Nucleic Acids Res. 1977. V. 4 P. 2527-2538

255. Milligan J.F., Groebe D.R., Witherell G.W., Uhlenbeck O.C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15 P. 8783-8798

256. England Т.Е., Bruce A.G., Uhlenbeck O.C. Specific labeling of 3' termini of RNA with T4 RNA ligase // Methods Enzymol. 1980. V. 65 P. 65-74

257. Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. Inexpensive SDS/phenol method for RNA extraction from tissues II Biotechniques 1993. V. 15 P. 24-26

258. Siebert P.D. Quantitative RT-PCR. Methods and Applications. Book 3. // USA: Clontech Laboratories Inc. 1993.

259. Cobb B.D., Clarkson J.M. A simple procedure for optimising the polymerase chain reaction (PCR) using modified Taguchi methods // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22 P. 3801-3805

260. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. V. 227 P. 680-685

261. Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D., Mitchell J.B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing // Cancer Res. 1987. V. 47 P. 936-942

262. Proudnikov D., Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling II Nucleic Acids Res. 1996. V. 24 P. 4535-4542

263. Rosenbaum H., Webb E., Adams J.M., Cory S., Harris A.W. N-myc transgene promotes В lymphoid proliferation, elicits lymphomas and reveals cross-regulation with c-myc // EMBO J. 1989. V. 8 P. 749-755

264. Dildrop R., Ma A., Zimmerman K., Hsu E., Tesfaye A., DePinho R., Alt F.W. IgH enhancer-mediated deregulation of N-myc gene expression in transgenic mice: generation of lymphoid neoplasias that lack c-myc expression // EMBO J. 1989. V. 8 P. 1121-1128

265. Du Q., Thonberg H., Wang J., Wahlestedt C., Liang Z. A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33 P. 1671-1677

266. Cao M., Ren H., Pan X., Pan W., Qi Z.T. Inhibition of EGFP expression by siRNA in EGFP-stably expressing Huh-7 cells//J. Virol. Methods2004. V. 119 P. 189-194

267. Amarzguioui M., Rossi J.J., Kim D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi IIFEBS Lett. 2005. V. 579 P. 5974-5981

268. Poliseno L., Mercatanti A., Citti L., Rainaldi G. RNA-based drugs: from RNA interference to short interfering RNAs // Curr. Pharm. Biotechnol. 2004. V. 5 P. 361-368

269. Donze O., Picard D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30 P. e46

270. Sohail M., Doran G., Riedemann J., Macaulay V., Southern E.M. A simple and cost-effective method for producing small interfering RNAs with high efficacy // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31 P. e38

271. Fagot D., Buquet-Fagot C., Lallemand F., Mester J. Antiproliferative effects of sodium butyrate in adriamycin-sensitive and -resistant human cancer cell lines // Anticancer Drugs 1994. V. 5 P. 548-556

272. Feo S., Di L.C., Jones Т., Read M., Fried M. The DNA region around the c-myc gene and its amplification in human tumour cell lines // Oncogene 1994. V. 9 P. 955-961

273. Hemmi H., Yamada K., Yoon U.H., Kato M., Taniguchi F., Tsuchida Y., Shimatake H. Coexpression of the myc gene family members in human neuroblastoma cell lines // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. V. 36 P. 1135-1141

274. Kim D.H., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E., Rossi J.J. Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22 P. 321-325

275. Matsumoto M., Funami K., Oshiumi H., Seya T. Toll-like receptor 3: a link between tolllike receptor, interferon and viruses // Microbiol. Immunol. 2004. V. 48 P. 147-154

276. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature 2001. V. 409 P. 363-366

277. Rosenblatt M.N., Burns J.R., Duncan V.E., Hughes J.A. Infection of the macrophage cell line NR8383 with Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) leads to an increase in oligodeoxynucleotide accumulation // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000. V. 10 P. 1-9

278. Galderisi U., Di B.G., Cipollaro M., Peluso G., Cascino A., Cotrufo R., Melone M.A. Differentiation and apoptosis of neuroblastoma ceils: role of N-myc gene product // J. Cell Biochem. 1999. V. 73 P. 97-105

279. Amy CM, Bartholomew J.C. Regulation of N-myc transcript stability in human neuroblastoma and retinoblastoma cells // Cancer Res. 1987. V. 47 P. 6310-6314

280. Shimazaki Т., Honda M., Kaneko S., Kobayashi K. Inhibition of internal ribosomal entry site-directed translation of HCV by recombinant IFN-alpha correlates with a reduced La protein II Hepatology 2002. V. 35 P. 199-208

281. Kaempfer R. RNA sensors: novel regulators of gene expression // EMBO Rep. 2003. V. 4 P. 1043-1047

Информация о работе

Кабилова, Татьяна Олеговна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Ингибирование экспрессии онкогенов семейства myc и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью двуцепочечных интерферирующих РНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы