Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпоксилгидролаза печени и слизистой тонкой кишки крыс при воздействии различных алиментарных и токсических факторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эпоксилгидролаза печени и слизистой тонкой кишки крыс при воздействии различных алиментарных и токсических факторов"

Академия медицинских наук СССР ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи УДК 577.15 : [616.341+616.36] : 612.392 : 615.9

КУЗЬМИНА Елена Эдуардовна

эпоксидгидролаза печени и слизистой тонкой кишки крыс при воздействии различных алиментарных и токсических факторов

(03.00.04 — Биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в лаборатории энзимологии питания Института питания АМН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ — доктор медицинских наук профессор В. А. ТУТЕЛЬЯН.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор медицинских наук профессор Л. Ф. ПАНЧЕНКО. Доктор биологических наук Н. Н. СОКОЛОВ.

Ведущее учреждение — 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт ям. Н. И. Пирогова.

Защита диссертации состоится «'ОО » . ЛлМа^ 1991 г_

ИЦ™

в _7 7 часов :на заседании специализированного

совета, ш,ифр Д 001.02.01, при Институте питания АМН СССР (109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания АМН СССР.

Автореферат разослан «. 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

В. М. ЖМИНЧЕНКО

I. В 3 Е Д Е Н И Е

1.1. Актуальность темы. Изучение ферментных механизмов защита! клетки от токсического действия ксенобиотиков представляется весьма актуальной и ванной для биохимии проблемой. Многочисленными работа?® последних лет, выполненными как у нас в стране, так и за рубежом, расшифрованы основные пути детоксикации чужеродных соединений; достагну-тк значительные успехи в исследование структуры, свойств, молекулярной организации ферментных систем, ответственных за биотрансформадию ксенобиотиков /Парк Д.В., 1973; Арчаков В.Й., 1975; Покровке:?. А.А., 1977; Панченко Л.Ф.И др.195Г;1яхович В.В., Цкрлов И.В., 1981; ЛгсКа'хоу, Вас1шаво?а, 1990; Ра1коаеп, Че^акш^аэ, 1990/. Однако, остается много неясного в механизмах регуляции ферментативной активности,роди отдельных ферментов в пропессах биотранейормации к детоксикации ряда ксенобиотиков, загрязняющих скружажщуя среду и представляли реальную опасность для здоровья человека. .....

Б последние гсды все большее внимание специалистов в области ох-, ранн окружающей среды и токсикологии привлекают.химические соединения, имеющие в своей структуре эпоксидную группу. Это внимание к апоксидаи обусловлено их высокой биологической активностью: .являясь высокореактивными электрофильныш соединениями, эпоксида способны вступать в нуклеофяльнае взаимодействия с такими макромолекулами клетки, как ДНК и ГЕК, что и обуславливает их токсическое, .мутагенное и канцерогенное действие Доблякоз В.А., Коляда А.Ю., 1986; Иэглвайеа, Влпд, 1982; 1АЕС, 11о1Ю£г&рНе , 1985; Р1чишкг а!., 1987; На1йлкаг et а1., 1989/. Соединения этого класса шрока распространены в природе и могут. поступать в организм человека в виде лекарственных веществ а загрязнителей пищевых продуктов, как биологическом, так.и антропогенного происхождения /Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; Xi.R0 Мопоа- •• гврЬа,1985;.Незааий в! а1., 1988/. Эпоксидные соединения могут образовываться эндогенно в процессе метаболического превращения различных субстратов монооксигеназной. системой клеток печени, легких, почек, желудочно-кишечного тракта и. др. органов /НаХалках- «г а1., 1989; АгсЬа-коу, БасЬсшоуа , 1990/. Учитывая високув биологическую активность эпоксидов, внимание.специалистов в области ксенобиохимии сконцентрировано на ферментах, участвующих в процессах их обезвреживания, в

частности на. эяокездгздрелазах /ЭГ/. .. ................. ~.........

. 1.2. Цель .работы..Целью настоящей работы.является изучение влияния различных алиментарных.и-токсических факторов на активность мин-т росомной. ЭГ и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени ж . слизистой оболочки тонкой юшки крыо. Дм ее реализации сформулирова-

w сяедупчиэ задачи: . * .

- Дать сравнительную характеристику микросомной ЗГ печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс;

- Изучить влияние алиментарных факторов /уровня пищевого белка рациояа, качественна различий жирового компонента рациона и различного обеспечения - рациона селеном/на активность и свойства ЭГ печени и слизистой оболочки тонной кшки крыс; . . *

- Изучить влияние некоторых нонташнантов пищевых продуктов биологической природы /апоксвдсодеркащх микотоксинов: 1-2 токсина, де-зоксиниваленола /ДОН/ и аЪлатокскна Bj/ на. активность и свойства ЭГ печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс. . .

■1.3. Научная новизна и теоретическое значение твботы. Впервые -дана сравнительная характеристика свойств ЭГ макросом печени и ели- . зистой тонкой кишки крнс. При этом установлено, .что оба-фермента имеют одинаковый оптимум ptt, близкие значения кажущейся K,If но отличаются по Удельная'активность ЭГ слизистой кишечника составляет 4,810% от активности з печени. Микросомная ЭГ печени и слизистой кишечника различается по степени индудабельности i» vivo но в равной степени подвержены модулирующему действию активаторов in vitro.

При.выделении ЭГ.из макросом печени был разработан метод, с помощью которого удалось получить высоксочищетши /в 63 раза/ препарат ЭГ печени и. часиганоочащенннй /в 11,6 раза/ препарат фермента из мик-росом слизистой.оболочки тонкой кишка крыс. Установлено, что характер литания оказывает выраженное регулирующее действие на активность микросомной ЭГ и . других, ферментов метаболизма ксенобиотиков печени,... крыс, и, в значительно меньшей степени,на активность Фермента слизистой оболочки тонкой юшки,

1.4. Еаучно-практическая значимость таботы. В опытах на эошотнвх доказана. высокая чувствительность микросомной БГ к воздействию раз- . личных токсических факторов. В частности доказано, что длительное поступление низких доз эпокоядсодержащих микотоксинов - Т-2 токсина.и . ДОН, а также афяатоксина Bp глетаболизируыцсгося в печени с образованием эпоксида, вызывает значительное .увеличение активности, ЭГ как е печени, так.и. в слизистой оболочке тонкой кшки.крыс- Предложено использовать определение активности ЭГ.цри токсиксегого-гигиенической оценке. шодевых добавок я контаминантов пищевых.продуктов. .......

1.5. Внедрение -результатов в птэактику.Иа основании проведенных . токсиколохо-биохимаческих исследований, .вкдачаащих. изучение^.активности ЭГ и других ферментов метаболизма ксенобиотиков, дано заключение. о безвредности пищевой добавки - интенсивного подсластителя аспарта-

ма /регистрационные удостоверения Минздрава СССР - ГЕ-8-242 lb 01630 от 30 мая. 1989' г. иТТ-8-242 £ 0I90I от 6 толя 1990 г./.

Апробация /работа. Результаты исследований докладывались на У Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модафшация макро.моле1:ул" /Ялта, ноябрь 1989/; на 7-м Медвупародногл симпозиуме "Микроэлементы у человека и животных" /Дубровник, май 1990/; научной конференции с иецпународпым участием "Питание: здоровье и болезнь" /Москва, ноябрь 1990/.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано. 15' научннх работ, перечень которых приводится в конце автореферата, .

Стотктута и объем диссертант. Диссертационная работа изложена на,- страницах машинописного текста, включающих 3 схеш, S3 табличен,'41 .рисунок . и состохимгз введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы / источника, в том числе отечественных/.

МШИМ И МЕЩЩ ИССВДОВАНИЯ

Исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар. Всего в работе было использовано более 700 животных.

В качестве исследуемого материала использовали микросомнуга фракцию печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс, полученную методом дифференциального центрифугирования / stohs et al., 1976; Xtó«, 1987/. В гликросоглах печена определяли активность ЭГ /НФ 3.3.2.3/ методом высокоэффективной жидкостной хроттографии, используя в.качестве. субстрата стиреноксид /Кравченко Л.В., Соболев B.C., 1989/; содержание цитохрома Р-450 /НФ 1.14.14.1/ по методу Омура и Сато / Omura, Sato, 1984/; активность 7-этоксикутриндеэтшгазы по.методу Лэйка /bake, 1987/ и. активность карбоксилэстеразы /Ш 3.1.1.1/ по методу Мендоса с соавт. / Mendoza et al., 1971/. В шкросомах слизистой . оболочки кишки определяли активность ЭГ к карбоксилзстеразы. Содержание белка в микросомных фракциях определят по методу Лоури и соавт.

/Lowry et al., 1951/. .....

Величины кааущихся К^ ж У}лах определяли в координатах Лайгуиве-ра-Бэрка и Зди-Хофоти в пределах изменения концентрации субстрата от 0,03 до 0,6 мМ.

В опытах in vivo изучала действие бензила /вводили.в/бр; 5 да.; 210 да/кг/; трансэпоксисткльбана /в/típ; 3 дн.; 400 мг/кг/; 2-ацето-амидофяуорена /в/бр; однократно; 35 мг/кг/;-бутилокситолуола/в/бр; 4 дн.; I г/кг/ и зиксорина /в/ж; однократно; 120 мг/кг/. В опытах

ч

1л vitro бензил, траисэпокспсгилъбен л бутилокситолуол добавляли в инкубационную среду в конечной концентрации 1,6 ití /в 4 шел ДЛСО/ за 5 ыин до внесения субстрата /2 мЭД/. Эпоксициклогексен /1,6 ыМ в ©ICO/ и 1,2-эшкси-3,3,3-трпхл.орпропан /0,4 мМ з ацетонитриле/ одновременно с субстратом; 2-бром-4-нитроацетофеноя /0,3 мМ.в ацетонитриле/ за 10 мин до Бпесешя субстрата /Oesch et ca., 1971; Du Boia et al., 197Б; Bants .Sobnell, 1981/. Гал кнгибирозания и величины iL ЭГ эпокоищгклогсксенои определяли в двойных обратных координатах при концентрации субстрата 0,02-0,25 ъЫ и концентрациях ингибитора 0,15 и 0,25 i¿L

Выделение и очистку ЭГ из макросом'печени и .слизистой оболочки тонкой кишки крыс осуществляли по следущэй схеме:

ьс-жр0с0?лная мвд . .

Солюбшшзацш /1% -раствор холата натшя, , .0,1% раствор Тритона Х-ЮО/

12 № белка/мл,. 3 часч

шергвнт-сол!051ш?знробаим; жутбраншй материал

I. Высаливание сульфатом аммония /0 - 25/»/ центрифугирование 23 ООО х g, 30 шн

ФР/КЙНЯ /сультат аммония/'- s 25

II. Высаливание сульфатом аимош /25 - 38$/ центрифугирование 23 ООО х g , 30 мик

ФРАКЦИЯ /сульйат аммония/ - s gg

III. Высаливание сульфатом аммония /3& - 60#/ центрифугирование 23 ООО х g , 30 мен

ФРАКЦИЯ /после внеаляватя сульфатом аммония/ - s go Диализ

ХРОМАТОГРАФИЯ НА ЖАБ - Sephacel : 65 фракций

/Snulficn Е - 913; 0 - 0,5%'; У О0щ.~50°

Чистоту и молекулярную массу белковых фракций проверяли гель-электрофорезом по методу Лэммли Дэсвзаи:, 1970/'; гели окрашивали по методу Ньюхо.ура /fTeuhoff et al. , IDS5/; в качестве стандарта использовали набор белков /"Signa.", США/.

При изучении влияния алиментарных факторов на активность ЭГ, яи-вотнне содержались та изокалорийных полусинтеткческих рационах, разработанных Институтом питания АШ СССР.

При изучении влияния уровня пищевого белка животные в течение 2 мес. получали рационы с содержавием бачка 5%, 18% и 33$ белка казеина. Изокалорийность обеспечивалась sa счет изменения количества ■ углеводов /маисового крахмала/. При изучении влияния качественно раз-

личных щроз рациона крысы были разделены на 5 групп и в течение 4 нед. получали полноценные рационы, жировой компонент которых был представлен кукурузным маслом, лярдом и.ихтиеновьм шелом, полученным из мышечной ткани сельди "Иваси" /1,П и 1У го.,соответственно/. В рационы крыс Ш и У.гр. ,ядровой компонент которых был представлен лярдом, и-рыбьим лиром, добавляли ¿.-токоферол в концентрации, эквивалентной его содержанию в кукурузном масло. При.изучении влияния обогащения рациона селеном, крысы в.течение 6 нед. получали роцаонк с различным содержанием селена - 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мг селена на I кг рациона., В качестве источника селена.добавляли дрожжовуд луку с вы-? .. соким содержанием селена, селеномвтионин /"мка Фшиявдял/ и селенит натрия. При.изучении хронического действия шкотокешов животные в течение 6 мес. получали Т-2 токсин /0,063 мг/кг массы.тела - 0,021 Ы) 50/, ДОН Д,В мг/кг - 0,024 , М>50/, афлатоксяя Бг /0,008 мг/кг -О,001.1л до/. Токсины-вводили в/ж в 0,1-0,5,1 растворе этанола 5 раз в нед. При изучении возмогших механизмов. возрастания активности. ЭГ при действии трихотецяновых мшсотоксинов, подостркй Т-2 токсикоз у животных вызывали введением Т-2 токсина в/я в течение 9 дней в дозе. 0,64 мг/кг массы тела. При изучении влияния актиномшдана II на сте--пень возрастания активности ЭГ, вызванное Т-2 токсином, апвотнш вво- . дали.фенобарбитал /в/бр; 75 мг/кг; 5 дней/.и актиношцин о /0,1 ьт/кг; в/бр; за 30 мин до введения фенобарбитала/. Во второй серии.эксперимента животным вводили Т-2 токсин /в/а;. I мг/кг - 3 дня и 0,7 мг/кг - 4 дня/ и актиношцин о за 30 мин до введения Т-2 токсина,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделение, очистка и-характеристика эпоксидгидролазы из макросом печени и слизистой оболочки тонкой шпки крыс.

1.1. Сравнительная характеристика шкросомной гпокекд- , гидролазы печени и слизистой оболочки тонкой кишки.

В разных-сериях экспериментов активность ЭГ в микросомах печени варьировала от 6,25 до 9,67, в слизистой оболочке тонкой кишки - 0,38 до 0,81 нмоль/мин на I кг белка. Дяя ЭГ макросом слизистой оболочки тонкой кишки значение кажущейся К^ было довольно близко к ^ фермен^ та макросом печени, а величина V тх значительно ниже /рис. I/. ферментная реакция носила линейный характер в точение 30 мин инкубации, при использовании как макросом печени, так и микросом слизистой тонкой кишки. Линейность ее сохранялась при увеличении содержания белка в пробе от 0,025 до 0,4 мг в случае, микросом печени и от 0,05 до 0,8 мг в случае макросом слизисгоЗ тонкой кишки. Оптимум рЕ для макросом-

в слизистой оболочки тонкой кишка С Б ) «рис, от яояцентрацяи субстрата.

I - В кооротнятах ЛаАщивера-Еэрва;

II -' В координатах Эди-Лофсти.,

V - шаш/ию/иг йелга; [£] - концентрация cjáclpaia, 11M; - шоль/мин/мг Оелка/мМ субстрата.

ной ЭГ слизистой тонкой килей составляет 8,7, что соответствует опти-щку рН. установленному док ЭГ печени крыс и'других видов животных /James et al., 1976; Lu et *1., 1977/. При изучении влияния различных концентраций неионных детергентов - лубража, твина-80 к BETJ--35 на активность ЭГ макросом печеш ж тонкой кишки, не было выявлено, существенных различий.

В опытах in vivo изучали влияние некоторых модуляторов на актив-кость ЭГ микросои печени и слизистой оболочки тонкой кишки. Как вадко из рис. .2 бензил вызывал значительное возрастание активности ЗГ в "печени /до 6.08$/; При введении транссгяльбеноксида и бутилокситолуола, активность ЭГ возрастала в печенн ъ 6,6 и 6,3 раза соответственно. У крыс,- получавших однократно 2-ацетоашнсф>1уорен, активность фермента возрастала почти в 4 раза. Введение зиксорина сопровождалось возрастание:;.: активности фермента в печени на 205%.

Изменения активности шкросомной ЭГ в слизистой оболочке тонкой кишки при введении модуляторов били выраае-кы в меньшей степени. Так, введение зиксорина и бутилокоитолуола не влияло на активность ЭГ, а траясстильбеноксид и 2-ацетоашдофпуорея вызывали возрастание активности в 1,6 раза. Значительное, до 220;?, увеличение активности фермента в слизистой оболочке тонкой юшки наблюдали только при введении бензила /рис. 2/.

В опытах in vi-tro бензил тесте вызывая значительную активацию ЭГ как в микросомах печени,так и в шкросомах слизистой оболочки кишки /в 5,5 и в 3,4 раза соответственно/, з то время как трансстильбен-

оксид и бутклокситолуол вызывали незначительное возрастание активности фермента /соответственно на. 20% и 50%{ только в микросотх слизистой оболочки тонкой кишки /рис. 3/. Изучение вчия:шя ингибиторов на активность ЭГ шкросок показало, чго 1,2-элокеи-3,3,3-трихлорпро-

то

1 гг к

| а га ■

3 jj

6

»по щ |j

1 É •i

н

« эщ. - | i

Я:

$ | ■)

«ТО % 1 l¡

% 35 íj

НО ' ц.

is? -Л ■¡

1

i г Т 4 T

Гм. 2 Ешц| s& (In

WW4»» u uriuocn ашеиштои додаем «,„„ (I > ,

•Шли nun, IIDI Í В )

S - чачеегиалюя«; t . Зиссрм. ¿XTiuccn {tpmm ¡сситш и 11 nut.

3 » —-*1 • ta vltr» UKnoptt MOJJMTOpC» и tUTlHOCTl

юсяе«жлгртягв имрссвд сакаи < i ) ж слэктов 4МШГОЯ тоио! iinu ( Б ) vpwo.

X - Кэ*т?г.т1; 3 - Т)«лсстишМ|01с*21 2 - Eiaui 4 * £^tiuo*CHa£rai.

ImMom ¿*!»»Tt 1КШШ U 1 иг ttxit*

• - аосммгюст» «aiil MUSJ tpjmaM

паж и 2-бром-4-нитроадетофеноп подавляли в равной степени активность ЭГ б печени и в слизистой тонкой кишки. Эпоксициклогексен оказывал более сильное ингибирукцее действие на активность фермента в шкросо-мах печени. При этом установлено, что эпоксицикдогексон'ингибирует активность ЭГ слизистой тонкой кишки,- так ве как и активность фермента печени по неконкурентному типу. Константы ингибирования /Е^/ ЭГ мик-росом печени и слизистой кишки были близки и составляли соответственно 0,10 и 0,14 Ш /рис. 4/, . .........

.Таким образом, на основании сравнительного изучения свойств .ЭГ. мшсросом-печени и слизистой оболочки тонкой кшжн крыс было установлено, что оба.фермента имеют одинаковой, оптимум. рЯ, близкие .значения' Kjj, . но отличаются по 7ш. Отмечается пололштельная корреляция между, изменениями активности ЭГ в микросомах.печени и слизистой тонкой кишки при воздействии различных модуляторов как la vivo так И-in vitro что позволяет.предположить.существование общих механизмов регуляции активности обоих ферментов.

1.2. Выделение, очистка и характеристика эпоксид-гидролазы из мщюеомаяьной фравдии печени и слизистой оболочки тонкоЗ кишки крыс.

]£>Ш1 шхамде мпсзтарсв и итдоост»

»шиеютярсяим кяхроеои печем С А ) * шютоЯ «водой* теио! яшм ( 5 > хрис.

X - Змароп; 3 - иг-Эаздсв-З.З.З-трюяорпрев

2 - Эоокввимотадвев; 4 - г-ВроьЧ-мтроытофввд».

1шиосп {вривит р&сшш ял I мг йвда.

щ - ^йозаача«^ жрсте»ервосс% отжяИ дежз? грушаиа

Выделение и очистку ЭГ из микросом-ной фракции печени и слизистой кшшки. осуществляли по указанной выше схеме. Как видно из данных, представленных в табл. I, степень.максимальной очистки ЭГ, локализованной во Фракциях поете хроматографии на ДЕ&Е - БерЬпся! составила 63,3 раза для микрооом печени и II,& раза - слизистой тонкой кишки. ;

Абсолютный абсорбционный спектр . : очищенного фермента печени.имеет основной пик около 280 км. Плечо, в районе 2.90 нм указывает на высокое содержание тркпр- ^ тофана. Отсутствие шли. абсорбции в области 320-560 км свидетельствует об . отсутствии геыа.шш флавша. .

Таким образом, в результате проведенных экспериментов удаюсь выделить высокооцененны! препарат /более, чем э 63,3 раза/ фермента из микро-сок печени с удельной активностью 481,4 нммъ/мин/мг белка и часткчно-очищенный./в 11,6 раза/ препарат фермента из микросом слизистой тонкой кишки с удельной активностью 4,4 емсшУмгш/глг балка.

2. Изучение влияния различных алиментарных, факторов на активность эткевдгадролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени и- слизистой оболочки тонкой кишки крыс

2.1. Изучение глшхния уровня пищевого белка на активность и некоторые свойства эпег.еид-Ьуфолазн" печени и слизистой ойол.очт тонкой кишки крыс^--------

Как при снижении, так и при увеличении квоты белка в рационе наблюдается возрастание активности ЭГ /тайл. 2/. Так, у крыс, получавших малобелкозый рацион, активность КГ возрастала более чем з 2 раза, а высокобелковый - на 86$. Б дакросомах слизистой оболочки тонкой кишки и дефицит, и избыток белка в рационе 1фыс вызывали незначительное

Таблица I.

Степень очистки эпокседгидролазк из микросом печени и слизисточ оболочки тонкой кишки крыс.

ФРАКЦИЙ { Содержание ( белка, мг { Активность эпонсицгздролаэьг ( ~ » выход, ? % ; Очистка, 1 кол-во раз

| нмоль/шн |Ш0ль/мин/мг бел

¡печень , кишка 1 } печень ¡кишка ¡печено кишка 1 ; ¡печень 5 кишка ■i...... } пзчгнь | кишка

Микросоьш 3560 1508 - 19700 572 5,6 0,38 100 100 1,0 1,0

Фракции сульфата 8ш0ния 2300 2100 14500 483 6,3 0,£3 66,5 93,0 1,1 0Гб

тз-зерьаое1 Фракций 26,2 12610 254 481 4,4 64,0 45.0 63,3 11,6

Таблица 2.

Влияние уровня белка в рационе на активность эпоксидгидролазы, карбсксмлэстеразы и содержание цитохрома Р-450 з микросошх печени и слизистой тонкой кишки крыс:.

$ Содержание белка в рационе, %

Ферменты ' *-1-г

| . 5 } 16 |

Печень

8поксид:чш>олаза, шсль/мин/г ткани ■ ?.01,2±29,5б 89,6±11,1а'в 155,6±12,1б

Карбоксилйстераза, , нмоль/мин/г ткани 8,5?±0,62б>в 10,83-0,47а,в. 15,35±0,45а'?5

Цитохоом Р-450, толь/с ткани Ю,7+1,7В 14,4-0,5® Хе.Б'^.З®'6

Слизистая тонкой килки

Зпокоадгвдролаза, нмоль/мин/г ткани 1,83±0,31 2,44-0,19 2,16*0,25

Представлены средние данные (М - ш ) для б животных;

.- пначония, обозначенные различными буклями, статистически достоверны СР< 0,051 одинаковыми'- статистически недостоверны.

снижение активности ЭГ. При' этой, содержание цптохрома Р-450 и активность- карбоксилэстеразы в мккросомах печени находились в прямой зависимости от уровня бояка в рационе животных: при дефиците балка содер^сание цитохрома P-4S0 л активность яарбоксилэстерази были на 2&% и 21% соответственно ниго, а нри избытке - на 25# п 41$ соответственно выке, чем в контроле.

. Ни удалось выявить существенных различий в величинах казущэЗся К^, ЭГ из-шкроссм печени крыс, получавших рацжшн''.с различным содержанием белка. .С целью характеристики иикросомноЯ ЭГ печени крыс, получавших рационы с 5% и 18% белка, изучено in vivo и in vitro влияние некоторых модуляторов активности фермента /рис. 5/'. Как видно из представленных данных, введение бензила сопровождалось индукцией ЭГ в равной степени выракенной у крыс, получавших рационы с 5% и 18$ белка, iu vitro бзнзал вызывал многократную активацию ЭГ гак в ша-росомах, выделенных из печени крнс, - со-деряавшссся на малобелковси рационо,. так и в мккросошх печени животных, получавших полноценный по белку рацаон /183!/,

Изученные ингибиторы также в равной степени .........

подавляли активность ЭГ в микросомах печени крыс.обоих эксперименталъ-ных груш. Полученные результата свидетельствуют, что шкросомальная ЭГ-печени крыс, получавших шлобелковыЭ рацион, не обличается существенно по своим свойствам от фермента печени животных, получавших рацион с 18$ белка и з равной степени сохраняет способность к индукции и активации.

Изменение /уменьшение/ мякровазкости мембран гндоплазматического ретикулума /Яяпков Б.Г., I98'i; IJorbonne et al. , 1984; Khan, Ивгя, 1988/. возможно является одно:! из причин возрастания активности ЭГ при изменении уровня белка в рациона. Лшучешше в настоящей работе результаты, указывающие на отсутствие существенных изменений свойств /а том числе К^/ ЭГ при низком уровне балка в рационе, позволяет предположить, что возрастание ферментной активности в этих условиях может быть также следствием пвдувдпг фермента.

he. 5» ь- »*»• ' А ) » lo <itr% < Б ) тогершг

iiosjeíTír" U k»rjuoc» jaoKC2T?r:o.,a.4k шитое* D!4U j~rt {из/ладс* jpous» сел» i poor«««. X - Saerp-га ti - CCa-.itfJ4 t(W I

I • Ьны; 2 • ¿.-кпивлскц

ljrSMOCTt pti-QTVJ nte <«л*з.

« «oeomucr щти^деп етга-г4 «из? гя®®"*

Ешмм ta «1« С А ) i íe и«, ( Б ) кюмяи кедумторм и *и«аот1 lücíciirwpcwsait ам^ссаи . вечем cpuc, ложзчхкях lantcíltsao ршдош* xipu с ршсаы.

1 • Kyxjpjíaw nacioj

2 -

Э - sap.

2.2. Изучение атияния качественно различных жгров

рациона на активность и некоторые свойства эпок-сидгйдролазы печени и слизистом ободочки тонкой КЕШКИ крыс. ""

Содержание тавотных на рационах с рыбьим жиром приводило к возрастанию активности ЭГ в микросомах печени в 1,6 раза ш сравнения с животными,, «получавшими кукурузное масло и в 1,9 раза - лярд. При • егом содержание цитохрома Р-450 и 2 активность карбоксилэстеразы в шк- « росомах печени шшотных всех групп практически не изменялось. Добавление о< -токоферола в рационы с лярдом и рыбьим жиром практически не влияло па активность ЭГ и . р,0. g. содержание цитохрома Р-450 з ыик-росомах печени крыс. Использование в рационах животных различных зшров не оказывало существенного влияния на активность изученных ферментов в слизистой тонкой кишки. Величины кажущихся для ЭГ в этих экспериментальных группах имели близкие значения. Дня изучения инду-цибельности, как одной из основных'свойств этой группы ферментов, в опытах, in vivo изучено влияние бензила на активность ЭГ. Как видно из рис, 6 бензил оказывал избирательное индуцируыцее действие на мик-' росомную ЭГ в печени. В микросомах печени крыс, получавших кукурузное масло, активность ЭГ возрастала при введении бензила на 270%, на рационах с лярдом - на 340$, а с рыбьим жиром - на 430?. Не выявлено изменений активности шкросомной. ЭГ ж карбоксилэстеразы в слизистой тонкой юшки крыс, получавших бензил на фоне рационов с кукурузным маслом и лярдом. В то ае время использование в рационах рыбьего тара приводило к увеличению активности ЭГ в слизистой тонкой кишки при введении бензила на г<0%.

Из данных представленных на рис. 6 видно, что in vitro бензил ' активировал ЭГ макросом печени на 400% независимо от характера дара в рационе. В отличие от бензила, метирапон в равной степени /на 240$/ вызывал ув&таченке активности ЭГ в ыикросошх, выделенных из печет крыс, полу чашах кукурузное масло и рыбий жир. В микросомах печени

(СОБграа;

1- £jtuu;

II - iíetrpuca: Ш - Цыдогекеюясвд.

Ьтяшсп <ерк*т» рзочтааа ta I иг fesu. ' ' l?3«3^!) достокРяое:ь отзчаа itessj хрупааиа

Таблица 3.

Влияние качественно различных жиров рациона на удельную активность эпоксвдгидролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени, крыс

Ферменты ! Г р у п п ы животных

!кукурузное ' масло | лярд ; лярд + вит. Е 1 рыбий жир ! рйоии жир + ! бит. Е

Зпоксвдгвдролаза, нмоль/мин/мп белка 9,09±0,69а 7,70±0,49а 8,16-0,75й 14,47±0,60в 13,78^0,57®

Пар бо к силэстераза, к'кмоль/.вдн/мг белка 0,1С-0,007а 0,16±0,01а 0,10±0,01а'в 0,20±0,007а'в 0,22-0,01®

Цитохэом Р-450, нмоль/мг белка 0,95^0,04а 0,91^0,0ба 1,00±0,02а>в 0,95^0,05а,в I,17-0,073 _ 1,14±0,ИВ

7-этоксикумарттеэти-' . „ лаэа.июль/минллг белка 0,86-0,05л' в 0,65±0,03а 0,84^0,04а,в 0,86±0,09*>В •

Прзлетавлекы средние данные (М + я ) для 6 животных;

а,Б - значения, ооозначешше различными буквами, статистически достоверны (р< 0,05>; оданэяовыми статистически не достоверны

животных, получавших лярд, мвткраион активировал ЭГ на 389$.

Степень ингибирозания ЭТ щшгогексеноксидом била равной /около &Ъ%/ в маяросомах"печени крыс, -получавших лярд и .кукурузное масло и составила 50% в микросомах животных, получавших ркбий аир. .-- • - ■

Таким образом, источник акра в рационе не только значительно влияет на удельную активность миирссомной ЭГ, но и монет изменять способность ее к индукции как в печени, так и в слизистой оболочке тонкой кишки. Возрастание активности микроссмной ЭГ печени,-вызванное.изменением лирноккслотного состава мембранных липидов, по-видимому, связано с изменением таких функций мембран, как мпкровязкость и проницаемость. Можно предположить, что максимальный уровень активности ЭГ при использовании рыбьего лира связан не только с уменьшением шкровязкос-ти, но и с изменением проницаемости клеточной мембраны / Сговв-t et al. , 1989; Borgeeon et eü. , 1989; Y/etbriabe et al. , 1939/. Б пользу этого предположения свидетельствует факт обнаружения прямой зависимости степени индукции ЭГ бензилом, в опыте in vivo .-от количества ПН ЕЕ 6>3 в липидах макросом и отсутствия различий в степени активации ЭГ при действии бензила in vitro . По-видимому, увеличение проницаемости клеточной мембраны приводит к изменению внутриклеточной концентрации индуктора и облегчает доступ субстрата к активному центру фермента. Обсуждал возможные причины увеличения активности ЭГ при увеличении доли ШШК в липидах макросом, следует отметить, что определенную роль в этом могут играть эпоксида,. содержащиеся в маслах,/kounie et al. , 1988; ЫбтваХ, Майeel , 1990/.

2.3. Изучение влияния обогащения рациона, селеном на активность эпоксидгидролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени крыс

0богал!ение рациона селеном до2,5мг/кг не вызывало существенных изменений активности ЭГ и других изученных ферментов в микросомах печени крыс; только активность 7-этоксикумариндеэтилазы возрастала на 51$ от контрольного уровня. Лишь при увеличении концентрации селена в рационе до 5мг/кг наблюдалось резкое /до 239?»/ возрастание активности ЭГ в микросомах печени. Скорость деэтилирования 7-этоксикумари-на при этом оставалась повышенной /на 42%/ /рис. 7/.

При сравнении различных химических форм селена - селенометиошна а селенита натрия в концентрации 5 мг/кг, наблюдалась та se тенденция изменения ферментной активности. В большей степени эти изменения в активности ферментов были выражены при использовании в рационах животных натрия седешта.' Степень изменений в активности ферментов коррелировала с гастологи'-юеш.и изменениями, обнаруженным в печени крыс,

получавших натрия селенит с рационом.

Механизмы.обнаруженных изменений активности.изученных ферментов, в частности ЭГ, не ясны. Можно предположить, что эти изменения связаны с действием высоких доз селена на биологические мембраны - как антиоксидашчшй фактор, по мнению одних исследователей,. или как прооксидант, то мнению.других /Coaba, 1985/. Однако, заслуживает внимание предположение /Leiter, Wendel, 1983/ об участии селена в ферментном. катализе жиж его регуляции » жсваобвот»™» вечей» арж.

5 1 ffSlfl'l.O» В - I Г - 5,0 SjvKT мотом!

Д - Сыкшоыетюаяя 1 Е . Сыеяи натри (5,0 и: Se/sr

I - аюксяягьяролвза; 2 - йятохр« i-«50j

3 - 7-Этеясипумаргадб8Тмада,

* - НЕЧАСТ ДПО»»рНОСГ» ОММ*! ЬвХф Т^ртГЕШ»

3. Изучение влияния эпоксидсодерзсащвс микотоксинов на активность эпоксвдгидролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени и слизистой сбо-лочки тонкой кишки крыс. -

3.1. Изучение влияния хронического воздействия микотоксинов на активность эпоксидгидрола-зе и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени л слизистой оболочки тонкой кишки крыс. •

Как еидно из табл, 4, длительное поступление низких доз Т-2 токсина, ДОН и афлатоксика Вт сопровождалось достоверным возрастанием активности ющросомной ЭГ на 39°i, 31% к соответственно. Активность карбоксилэстеразы и 7-этоксикумарквдеэт:1лазы при хроническом воздействии микотоксинов существенно не отличались от контрольного уровня. Некоторое достоверное увеличение содержания цитохрома Р-450 /на 24%/ наблюдали при введения Т-2 токсина, который подвергается гид-роксилированию в цитохром P-450-содержащеЗ монооксигеназног системе печени.

До настоящего времени остается невыясненным, монет ли микроссм-ная ЭГ участвовать в обезвреживании Т-2 токсина и ДОН - эпокслдсодер-жщих трихотецоновых микотоксинов. Однако обнаружено, что ококездео-дерледие соединения способны специфически активировать ЭГ печени / Iieijer , Ее Pierro , 1987; Sinrheimer et , 1927; M-ißilnlou,

¿oo ,

а Ъ

200

к 123 123 хгз 123 123 123

Рис. Вияота эЗогвиная рецяояа селене* ва актигаосп эпоясадлирвлаав 1 вмотори {«рвет"® кетайагазма

Таблица 4.

Влияние хронического воздействия микотоксиков на удельную активность зпоксидгицролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени и слизистой тонкой кишки крыс.

-!--:-!--!-:-!--

Ферменты | Контроль | Т-2 токсин ! ДОН | Афлатоксин В£

Пзчень

нмоль^ин^гЛ§елка 6,05*0,71 8,43*0,90* 7,96*0,24* 8,54*0,69*

мшоль/мш%гРбелка 0,220*0,022 0,205*0,014 0,218*0,013 0,226*0,009

.ЙОТ белка' 0,86*0,05 1,07*0,06* 0,84*0,05 0,95*0,04

7-этокск1т"адиадеэтила- , , ,

за,нмоль/мйн/мг белка 0,77*0,07 0,81*0,07 0,82*0,08 0,87*0,08

Слизистая оболочка тонкои кишки

нмольЖн%гЛбелке. 0,64*0,10 1,40*0,25* 0,97*0,10* 1,14*0,14*

Карбокештэстераза, . . , '

мкмоль/мин/мг белка 0,45*0,02_0,60*0,Об*_0,66*0,08х 0,41*0,31

Представлены средние данные СМ * ю ) для б животных ; к - обозначает достоверность отличий между группами (Р < 0,05)

t?

Нсгтасск , 1988; Ееепеиа е* а1. , 1988/. Возможно, ЧТО аналогичный механизм делит в основе выявленного на фоне введения трихоте-ценовых микотокишов возрастание активности этого фермента. В целом обнаруженное у ответных опытных групп умеренное возрасташе активности шкросомных ферментов печени и слизистой оболочаси тонкой

Ряс. В. Ьлшише Г-2 тексинз яа азтгисгт» нияросом печени крыс.

К - Контроль; I - Т-2 тоиева,

V - нусль/мав/мг С'Лиа; ISJ- суйстрь-а, "J.

киши мояет рассматриваться как адаптивные в ответ на деятельное введение микотоксшоь. Обнаруженные изменения активности ферментов в слизистой оболочке тонкой . кишки показетают, что поступавшие с пищей незначительные количества микотохсиноз. могут влиять на метаболизм, распределение в организме и конечный биологический эффект боль-того числа чухеродшх соединенийг посещающих в организм алиментарным путем и подвергащихся биотрансформации уже в процессе всасывания.

3.2. О возможных механизмах возрастания активности эпоксидгидролазы при действии трихотеценоэых микотоксинов.

Как было показано, хроническое действие трихотеценовых микотокси-нов сопровождается достоверным возрастанием активности ЗГ в шкросомах печени крыс. В связи с этим была предпринята попытка объяснить возможный механизм действия Т-2 токсина ка активность этого фермента.

В.первой части эксперимента, у лсивотных получавших Т-2 токсин в дозе 0,64 от/кг в течение 9 дней активность шкросошюй SI' возрастала в печени до 181%, при этом нз обнаружено различий в величинах кажущихся Х,лг хотя У^^ .дая ЭГ тчени крыс, получавяшх Т-2 токсин била несколько выше /рис. 8/.

Результаты, полученные в опытах in vitro показала,, что Т-2 токсин не влияет на уровень активности ЭГ, в шкрссомах печени: 3,53 -0,10 тлоль/жа/ит белка, против 3,54 - 0,10 нмоль/мпн/мг балка а контроле.

Не обнаружено существенного влияния Т-2 токсина на процессы ПОЛ в мембранах макросом печени крыс. В то ке время, в опытах iu vitro в условиях кндукцот 1?ав?н -зависимого ПОЛ активность ЭГ подазллласг,.

/а

Наряду с этим,. возрастание активности микросомной ЭГ, вызванное многократным введение Т-2 токсина.в значительной степени (более, чем я 3 раза) уменьшалось при введении акти.номицина D.

Полученные результаты позволяют предположить, что возрастание активности ЭГ при введении Т-2 токсина,, по-видимому, является результатом индукции синтеза ферментного белка,

ВЫВОДЫ

1. Дана сравнительная характеристика свойств ЭГ макросом печени и слизистой тонкой юшки крыс. Установлено, что оба, фермента имеют одинаковый оптимум рЕ, близкие значения каяущейся Ку, но отличаются по Удах« Удельная активность SET слизистой кишечника составляет. 4,8$-10$ от активности в печени, Микросомяая ЭГ печени и кишечника различаются по степени индуцибельноста in vivo но в равной степени подвержены модулирующему действии активаторов in vitro.

2. Выделен высокоочшцвшшй /в 63 раза/. препарат ЭГ из микросом печени крыс с удельной активность» 481,4 нмолъ/мш/мг белка и частично очищенный /в 11,6 раза/ препарат фермента.из микросом слизистой оболочки тонкой кишки крыс с удельной активность!; 4,4. нмоль/шш/мг белка. Даны электрофоретическая и спектральная характеристики полученных препаратов ЭГ.

3. Характер питания оказывает выраженное регулирующее действие на активность микросомной ЭГ и других ферментов метаболизма ксенобиотиков печени крыс и в значительно меньшей степени на активность фермента слизистой оболочки гонкой киши.

4. В отличие от цитохрома Р-450, 7-этоксикумариндеэтилазн и кар-боксилзстеразы, активность которых находится в прямей зависимости от уровне белка в рационе, активность ЭГ при низком /5$/ уровне белка более чем в два раза превышает активность фермента при нормальном уровне /18#/ белка в рационе, Микросоыная ЭГ печени крыс, получавших малобелковый рацион, не отличается по своим свойствам от ЭГ печени крыс, получавших полноценный рацион. .......

5. Увеличение доли ШЖ оэ 3 в рационе сопровождается возрастанием их концентрации в мембранах микросом и значительным увеличением . удельной активности и иццуцибельности микросомной ЭГ.

6. Обогащение рациона селеном в количестве до 2,5 мг/кг не ока-. зывает существенного влияния на активность ЭГ и других изученных- ферментов микросом печет. В концентрации близкой к токсичной - 5 мг/кг,

как органичекая, так и неорганическая форш селена вызывают резкое возрастание активности макроаошоЛ ЭГ.

7. Длительное поступление низких доз эпсхсидсодержащих микотокси-нов - Т-2 токсина и ДОН, а.также афлатоксина Bj, метабаяизирущегося в печени с образованием эпоксида,. вызывает 'значительное ув&тачение активности ЭГ как в.печени,, так и в слизистой-оболочке тонкой кишки крыс. Установлено, что возрастание активности фермента, по крайней мере частично, является результатом индукции его синтеза.

ВНдаШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

На основании проведенных токсиколого-биохимических исследований, включающих изучение активности ЭГ и других ферментов метаболизма ксенобиотиков, дано.заключение о безвредности пигаевой добавки - интенсивного подсластителя аспартама /регистрационные удостоверения Минздрава ССОР -.Пт8-242 й 01630 от SO шя 1989 г. и 12-8-242 П 0I90I от S шшгя 1990 г./.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБШШВАБНЫХ ПО ТЕЛЕ ЛИССЕРТАЩЗ!

1. Сравнительная характеристика мнкросонэлыгой эпоксидгпдролазы печени и слизистой оболочки тонкой кишси крыс. .//Вопросы медицинской химии,.1988, £6, 122-128./Соавт. Л.В.Кравченко, В.С.Соболев/.

2. Новые.данные о метаболизме и физиологическом механизме действия аспартшла.//Вощ>осы питания, IS89, й I, 20-24./Соавт. В.А.^утель-ян, М.М.Гаппаров, О.А.Вировец, Л.В.Кравченко, А.В.Ваоильез, А.И.Соколов, Л.С.Коновалсва, Л.С.Ваетйевская, Г.К.Шянгик, И.Б.Тарасова, Т.А.Воробейчик/.

. 3. Цитохром Р-450 и ферменты функционально связанные с ним в печени крнс при Т-2 микотоксикозе на фоно разного обеспечения селеном. //Тез. докл. 7 Всзсоюзн. конференции."Цитохром.Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта,-1989 , 367-368./Соэет. В.А.Тутельян, Л.В.Кравченко/.

4. Активность ферментов метаболизма чужеродных веществ в печени и слизистой.тонкого кишечника в условиях дефицита и избытка пищевого белка. В л®.: Теоретические п. клинические аспекты науки о штанип. Т. 9. М.,. 1989, 27-39./Соавт. Л.И.Авреньева, Л.В.Кравченко/.

5. Hie effect of авртЧгшю on the activity of r?t liver rcMiobio-tio metabolizing enzymes. // Drug ITetnboligffl ьп4 Disposition, 1990, v. 18, 223-225 /With V.A.Tutelyan, L.V.Kravcheulco/.

6. Защитное действие селена при остром Т-2.гяшотоксикозе.//Вопросы медацинской. химии, 1990, S 5, 36-38./Соавт. Л.З.Кравченко, Л.И.Авреньева, В.А.Тутельян/.

?, Обмен кальцин, виташна d и ферменты.метаболизма ксенобиотиков при.хроническом воздействии микотоксинов.//Вопросы питания, 1990, й 5, 25-30,/Соавг. И.Н.Сергеев, Н.Ы,Лилия, Л.И.Авреньева, Л.В.Кравченко, В.Б.Спиричев, В.А.Тутельян/.

8. Роль питания в регуляции активности ферментных систем, обеспечивающих защиту организма от чужеродных веществ.//Тез.. докл. Науч-^ .. ной.конференции с нелдународным.участием "Питание: здоровье и болезнь". - Москва,-1990, 103,/Соэвт..Л.В.Кравченко, Л.И.Авреньева/. . .... J. .

9. Пищевой белок как модулятор активности ферментов, метаболизи-рующих ксенобиотики. Эпоксидгидролаза.//Вопрссы питания, 1990, $ 6, 61-64./Соавт^ В.А.Тутельян, Л.В.КравчеЕКО/',-

10. My со toxins end nutritions effect of dietsiy selenium on the toxicity of 1-2 toxin. // 2-nd A eia-Pacific С cm;-. Animal , PI ant "and. liicrck lojcins, Banayss Hindu Univ.,Varanasi, India, Peb.19-22, 1990, p.94. /With X.I.Avrenyove, L.V.Kravchenio/.

11. Purification and characterization of microsomal epoxide hydrolases from liver end intestinal rncosa of ret end Candida neltosa yeaet // Proc. Ylllth Inter».Symp. on Microsomes end Drug Oxidations, Karo-linska Inst.,Stockholm, Sweden, Juno 25-29, 1990, p.217. /\7ith S.U. Avetisova, I.A.Popovs/.

12. On the mechanism of protective effect of selenium againat. ecute T-2 raycotoxicosis. // Abstr. 7-th Intern. Syrap. on Trace elements in men snd ».niaala. Univ.Zagreb, mbrovnil:, Croatir., Yugoslavia, Hay 20-25, Г990, p.76. /V.'ith I.V.Kravchenkc,L.I.Avxenyeva,V.A.Tutelyan/.

13. Effect of selenium-supplemented dietв on the activities of drug-metabolizing enzymes in rat liver. // Abstr. 7-th Intern.Symp.on Trace elemsbtc in man and animals. Uni v. Zagreb .Dubro vail:, Croatia, Yugoslavia, May 20-25. 1550, p.103./With L.V.Krevchenko.V.A.Tutelyan/.

14. She activity of xenobiotic-metabolising enzymes in the liver and email intestine of rats fed low and high levels of proiein.//Hutr, Rea., 1990, v. 10, III9-II29. /With V.A.Eutelyen.L.V.Kravchenko, L.I. Avrenyeva/.

15« Dietary eeleniua protects againat acute toxicity of T-2 toxin in rets. // Pood Additives and Contaminants, 1990, v. 7, Ho S, 321827. A'ith V.A.Tutflynn, Xi.v.Kravchenko, L.I.Avreniev^, J.T.Kumpulai-aea/.