Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль цитохрома 65 в микросомальной монооксигеназной системе печени, реконструированной в растворе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль цитохрома 65 в микросомальной монооксигеназной системе печени, реконструированной в растворе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК . ИНСТИТУТ БИОМЕДИиИНСКОЙ ХИМИИ

рг Б ОД - 8 АПР

На правах рукописи

УДК 577.158.022

СТЕПАНОВА Наталия Владимировна

РОЛЬ ЦИТОХРОМА Ь5 В МИКРОСОМАЛЬНОЙ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЕ ПЕЧЕНИ, РЕКОНСТРУИРОВАННОЙ В РАСТВОРЕ.

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1996

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В НИИ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

академик РАМН, профессор Арчаков А.И. ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

д.б.н., профессор Карякин A.B.

д.м.и., профессор Гаппаров М.Г.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится "_" _ 1996 года

в _ часов на заседании Специализированного Ученого Совета

Д 001. 10. 01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул, Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН

Автореферат разослан "_"_1996 года.

Ученый секретарь Специализированного Ученого Совета, к.б.н.

Былинкина B.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Монооксигеназная система TIP печеночных клеток, включающая NAD(P)H-33BHCHMbie лавопротеины и цитохромы Р450 и Ь5, ответственна за метаболизм ирокого спектра эндогенных и экзогенных субстратов. Принимая гастие в активации кинетически инертной молекулы кислорода и ¡сдрении одного из его атомов в молекулу субстрата, эта ферментная *стема окисляет гидрофобные соединения, прекращай их в более элярные и, таким образом, способствует выведению их из организма Archakov and Bachmanova, 1990).

Для понимания механизмов взаимодействия белков и изучения олекулярной организации мнкросомальной монооксигеназной системы VIMC), представляющей собой многоферментный мембрано-связанный змплекс, используется метод реконструкции этой системы из отдельных згеокоочищенкмх компонентов, фосфсшшидов или детергентов. С омощью этого метода решен ряд вопросов, связанных с выяснением ,'бстратной специфичности различных цитохромов Р450, механизма гакций окисления, идентификации функциональных групп, ответственных * взаимодействие белков (Канаева и др., 1985; Скоцеляс и др., 1987; liwa and Lu, 1981; Miller-Enoch et ai., 1984; Kanaeva et al., 1992 a, b). pw большинства оксигеназных реакций оказалось достаточным рисутствия в реконструированной системе NADPH-зависимого лавопротеина (NADPH-FP), цитохрома Р450 (Р450) и фосфолипидов ли детергентов.

В зависимости от типа окисляемого субстрата, формы Р450, эотношений белок : белок или белок : фосфолипид, фосфолипидного эстава в реконструированных системах наблюдается разнообразное ействие Ь5 на Р4 50- катализируемые реакции. Многие авторы наблюдали гимулирующий эффект цитохрома Ь5 (Ь5) на монооксигеназные реакции Вознесенский и др.,19906; Canova-Davis et al.,1984; Tamburini and chenkman, 1987), другие - ингибирующий (Morgan and Coon, 1984; Ilavica and Golly, 1986; Golly et al.,1988 ). В некоторых случаях Ь5 не каэывал эффекта или его присутствие было обязательным как, например, ля реакций окисления п-нитроанизола и метоксифлурана (Sugiyama et L,1982; Konopka and WaskeJ), 1988; Lipka and Waskell, 1989). 1спользование мономерной реконструированной системы (MPC) делает олее простым исследование влияния Ь5 на монооксигеназные реакции.

ММС, состоящая из мономеров цитохрома Р4502В4 (Р4502В4) i NADPH-FP, была реконструирована в присутствии неионного детергент; эмульгена 913 при сотношении белок : детергент = 1:100. При это» концентрация Р4502В4 в растворе составляла 0.5 - 5 мкМ. Эта система содержащая мономеры флаво- и гемопротеинов при их мольно.\ соотношении 1:1, с высокой скоростью катализировала реакцш восстановления Р4502В4 и N-деметилирования бензфетамина (БФ) диметиланилина (ДМА) и аминопирина (АГ1). Было показано, чт< компоненты монооксигеназной системы взаимодействовали по принцип] случайных соударений согласно закону действующих масс (Bachmanova е;

ai.,1986, 1989; Kanaeva et al.,1987, 1992 a, Ь).

В отличие от реконструированных систем, в микросомах имеет местс совсем другое соотношение Р450 и NADPH-FP: на 1 молекул) NADPH-FP приходится 10-20 молекул Р450 (Dean and Gray, 1982: Archakov and Bachmanova, 1990). Поэтому представляло также интерес реконструировать ММС при соотношении NADPH-FP и Р4502В4. близком к микросомалыгому, и исследовать кинетические особенности ее функционирования в растворе.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: реконструировать монооксигеназную систему микросом печени, содержащую цитохром Р4502В4, NADPH-FP и цитохром Ь5 в виде мономеров, и выяснить роль цитохрома Ь5 в реакции окисления бензфетамина.

ЗАДАЧИ:

1. Исследовать влияние цитохрома Ь5 на скорость гидроксилирования бензфетамина и других субстратов в реконструированной моиооксигеназггой системе, когда все ее компоненты присутствуют в виде мономеров.

2. Исследовать стехиометрию NADPH-зависимых реакций окисления в мономерной реконструированной системе (MPC) в отсутствие и присутствии Ь5.

3. Провести сравнительный анализ исследованных параметров в MPC при соотношении гемо- и флавопротеинов 1:0.05 и 1:1 и микросомах печени кроликов, получавших фенобарбитал.

4. Измерить параметры взаимодействия Ь5 с Р4502В4: константу связывания Kj, константы скорости образования (k+l) и распада комплекса Р4502В4-Ь5 (к.]). Определить время жизни (Т) комплекса

5-Р4502В4 и сравнить его со скоростью переноса второго электрона в <1РС.

[ЛУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ АБОТЫ:

В результате проведенных исследований была реконструирована онооксигеназная система, все компоненты которой (Р4502В4, NADPH-Р и Ь5) присутствовали в виде мономеров. Выявлено, что для переноса лектронов с NADPH-FP на Ь5 наличие гидрофобных мембранных рагментов этих белков не является обязательным. В случае образования омплексов цитохромов Р4502В4 и Ь5, регистрируемых лектрофоретически и спектрофотометрически, наличие гидрофобного рагмента Ь5 было абсолютно необходимым. Только детергентный итохром Ь5 (д-Ь5) оказывал стимулирующий эффект на скорости кисления различных субстратов в MPC и на степень сопряжения JADPH-зависимых реакций окисления бсизфетамипа при различном эотношении Р4502В4 : NADPH-FP. В механизме сопрягающего ействия Ь5 следует учитывать как увеличение константы скорости ереиоса второго электрона, так и ингибирование непродуктивного распада ероксикомплекса Р4502В4. Определено время жизни комплекса ■4502В4 - Ь5, которое равно 10 с.

ЛРОВАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы были редставлсны на 8ой Международной конференции по биохимии, иофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Португалия, Лиссабон, 1993), на 10ом Международном симпозиуме по микросомам и кислению лекарств (Канада, Торонто, 1994), на Зеи Международной онференции по молекулярному узнаванию (Сингапур, 1995) и на 9ой Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной иологии цитохрома Р450 (Швейцария, Цюрих, 1995). Апробация аботы состоялась на научной конференции лабораторий НИИ иомедицинской химии РАМН.

1УБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

ОБ'ЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 9 рисунков и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", Результаты исследований", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы".

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Высокоочищенный препарат цитохрома Р4502В4 получали по методу imai and Sato (Imai and Sato, 1974) с некоторыми модификациями аффинной хроматографии (Карузина и др., 1979).

NADPH-цитохром Р450 редуктазу выделяли по методу Yasukuchi and Masters (1976).

Выделение д- Ъ5 проводили по модифицированному методу Spatz and

Strittmatter (1971). Трипсиновые фрагменты NADPH-FP (т-NADPH-FP) и Ь5 (т-Ь5) выделяли по методу Omura and Takesue (1970).

Содержание цитохрома Р450 измеряли по дифференциальному спектру поглощения его восстановленного СО-комплекса при длинах волн 450 и 490 нм (Omura and Sato, 1964). При расчетах использовали коэффициент молярной экстинции 91 мМ~' см'^.

Содержание NADPH-FP определяли по абсолютному спектру поглощения в диапазоне 300-600 нм, используя коэффициент молярной экстинции 21.4 мМ~1 cm'Í для Я 456 (Digtiam and Strobe!, 1977).

Содержание цитохрома Ь5 определяли по дифференциальной схеме. Коэффициент молярной экстинции для А424-4О8 восстановленной формы Ь5 165 мМ-1 см-í.

Мономеризацию Р4502В4 и NADPH-FP проводили по методу Kanaeva et al. (1992, а).

Мономеризацию цитохрома Ь5 проводили в 500 мМ К-фосфатном буфере, рН=7.2, содержащем 0.25 г/л эмульгена 913, в течении 18-24 часов.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в присутствии додецилсульфата натрия по методу Laemmü (1970).

Для регистрации спектров связывания Р4502В4 и Ь5 использовали дифференциальную схему для четырехкюветной тандемной системы в

иапазоне 350-450 им. Расчет К^ проводили с использованием рограммы "Spec Ks/Kd" по уравнению Скэтчарда.

Кинетику NADPH- и дитионит-записнмого восстановления )4502В4 и Ь5 регистрировали в анаэробных условиях при 30° С. За роцессом восстановления следили по изменению разности оптических лотностей при длинах волн 450 и 490 для Р4502В4, 424 и 408 для Ь5. )бработку кинетических кривых восстановления осуществляли с спользованием методов нелинейной регрессии при помощи программы ipectraLab (Davydov et al.,1995).

Определение скорости окисления NADPH проводили при 340 им, в ериостатируемой кювете при 30° С, используя коэффициент молярной кстинции 6.22 mIVH см-1.

Все спектральные измерения проводили на спектрофотометре Hewlett Packard" 8451А (США).

Скорость генерации Н2О2 определяли тионианатным методом Thurman et al., 1972).

Скорость генерации О2 определяли путем регистрации скорости осстановления сукцинияироватюго цитохрома с (Жуков и Арчаков,

985).

Скорость NADPH-зависимого N-деметилирования БФ, ДМА и нилина (АН) определяли по накоплению формальдегида (ФА). Скорость )-деметилироваиия п-нитроанизола (п-НА) определяли по скорости акопления п-нитрофенола (Kanaeva et al., 1992 a, b)

Определение концентрации оксикомплекса Р4502В4 проводили по [етоду Werringloer and Kawano (1980).

Константы скорости образования комплекса Р4502В4 - Ь5 k+j были асчитаны из кривых сдвига спинового равновесия Р4502В4 в сторону его ысокоспиновой формы, регистрируемого по увеличению разности птических плотностей при длинах волн 386 и 417 нм, с использованием акета программ SpectraLab (Davydov et al., 1995). Константы скорости аспада комплекса Р4502В4 - Ь5 были расчитаны из следующей юрмулы:

k.i = Kd * k+1

5ремя жизни комплекса расчитывали как X = 1 / k_i

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Влияние Ь5 на скорость N-деметилирования

БФ в реконструированных системах.

В условиях получения мономеров P45Û2B4 и NADPH-FP цитохром Ь5 присутствует в виде тетрамеров. Только при увеличении ионной силы буфера до 500 мМ с 0.25 г/л эмульгена 913 были получены мономеры Ь5 (Кондрашин и др.,1989).

Так как мономеризация NADPH-FP н Р4502В4 проводилась в отличных от мономеризации Ь5 условиях, то представлялось интересным выяснить, зависит ли эффект Ь5 от степени его диссоциации. Данные по определению скорости N-деметилирования БФ в присутствии Ь5 представлены на рисунке 1.

Можно видеть, что стимулирующий эффект Ь5 на скорость

Рисунок 1.

Влияние цитохрома Ь5 на скорость N-деметилирования БФ в MPC.

1. Тетрамеры Ь5

2. Мономеры Ь5

3. Т-Ь5.

окисления субстрата в реконструированной системе с соотношением Р4502В4 и ГЧАОРН-КР 1:1 не зависел от того, присутствует ли он в инкубационной среде в виде тетрамера (пр>еинкубация Ь5 и проведение реакции в 100 мМ калий-фосфатном буфере с детергентом) или мономера (преинкубация Ь 5 и проведение реакции в 500 мМ буфере с детергентом) : во всех случаях скорость образования продукта реакции в его присутствии увеличивалась на 50-60%.

Таким образом, можно заключить, что ММС, реконструированная в 500 мМ К-фосфатном буфере, когда все ее компоненты присутствуют в виде мономеров, также эффективна как и реконструированная в 100 мМ буфере.

Роль гидрофобного фрагмента Ь5 во взаимодействии

с ЫАРРН-РР и Р4502В4.

Цитохром Ь5, лишенный гидрофобного фрагмента (т-Ь5) в отличии от детергеитного не оказывал стимулирующего действия на окисление БФ ( рисунок 1 ). Кроме того, как было показано в совместной работе с Никитюк О.В. и др., при использовании в качестве сшивающего агента водорастворимого карбодиимида (ЭДК) электрофоретически удалось зафиксировать образование комплекса между детергентным Ь5 и Р4502В4 и детергентными Ь5 и МАОРН-РР, в то время как такие комплексы не были обнаружены для т-Ь5. Таким образом, гидрофобный фрагмент Ь5 необходим для образования комплекса двух гемопротеинов и ^ВРН-РР - Ь5, сшивающихся ЭДК.

В отсутствие гидрофобных фрагментов у МАОРН-РР или Ь5 не наблюдалось образования комплексов, сшивающихся ЭДК. В то же время скорость восстановления Ь5 не зависела от наличия мембранных фрагментов у ЫАОРН-ЕР и Ь5: кинетика реакций оставалась двухфазной, и величины констант скоростей быстрой и медленной фаз реакции восстановления д-Ь5 и т-Ь5 были одинаковыми (таблица 1). Эти данные свидетельствуют о том, что для переноса электронов между д- и т-редуктазами и Ь5 наличие гидрофобных фрагментов у этих белков не является обязательным, в то время как эти фрагменты необходимы для образования комплексов, сшивающихся ЭДК. Гидрофобный фрагмент ЫАОРН-РР также абсолютно необходим и для восстановления Р4502В4, то есть его роль в реакциях восстановления цитохромов Ь5 и Р4502В4 совершенно различна.

Таблица 1.

Константы скоростей NAD РН-зависимого восстановления Ь5 И Р4502В4 Т- И A-NADPH-FP.( С* )

Пары ki k2

т-Ь5 - д-NADPH-FP 0.423 : t 0.020 0.029 ± 0.005

t-b5 - д-NADPH-FP 0.386 ± 0.030 0.029 ± 0.008

д-Ь5 - т-NADPH-FP 0.367 ± : 0.025 0.042 ± 0.010

д-Ь5 - д-NADPH-FP 0.394 ± 0.030 0.054 ± 0.012

Р4502В4- д-NADPH-FP - 0.054 ± 0.002

Р4502В4- т-NADPH-FP - 0

к] и - константы скоростей быстрой и медленной фаз восстановления Ь5, соответственно.

Спектры связывания Р4502В4 и Ь5.

Добавление Ь5 в реконструированную систему, содержащую Р4502В4, приводило к сдвигу спинового равновесия Р4502В4 в сторону высокоспиновой формы, что проявлялось спектральными изменениями в диапазоне 350-450 нм ( Д Аззб-417 ). По данным разных авторов, доля высокоспинового Р450 в присутствии Ь5 увеличивалась с 7% до 2337% (Hiavica, 1984; Tamburini et al.,1985; Tamburini and Schenkman, 1987). Спектры связывания мономеров и агрегатов Р4502В4 и Ь5 представлены на рисунке 2.

Расчитанные Kj для комплексов мономеров и агрегатов Р4502В4 и Ь5 не отличались и были равны 1.1 + 0.2 мкМ и 1.2 ± 0.2 мкМ, соответственно. Для мономеров Р4502В4 и т-Ь5 комплексообразование спектрофотометрически обнаружить не удалось. Аналогично, не удалось зарегистрировать комплексообразование между агрегатами Р4502В4 и т- Ь5.

Спектры связывания мономеров и агрегатов цитохромов Р4502В4 и Ь5 в присутствии 1 мМ БФ носили тот же характер, a Kj комплексов Р4502В4 и Ь5 были равны 0.8 ± 0.2 и 0.7 ± 0.2 мкМ для мономеров и олигомеров гемопротеинов, соответственно.

Рисунок 2.

Спектры связывания цитохромов Р4502В4 и Ь5 в отсутствии бензфетамина.

А

нм

Инкубационная смесь содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л эмульгена 913 в случае мономеров Р4502В4, 1 мкМ Р4502В4. В инкубационную смесь добавлялись аликвога Ь5 до получения максимальных спектральных изменений.

Исследование NADPH-зависимого восстановления Р4502В4 в MPC с соотношением NADPH-FP.-P4502B4 1:1.

Данные по NADPH-зависимому восстановлению Р4502В4 в MPC представлены в таблице 2 и на рисунке 3. Видно, что в отсутствии БФ и Ь5 реакция восстановления Р4502В4 была монофазной с константой скорости реакции к£ = 0.054 ± 0.002 с"' (коэффициент корреляции 0.99). Добавление Ь5 не влияло ни на форму кинетической кривой, ни на величину константы скорости ( к2 — 0.065 ± 0.003 с-' ). Добавление БФ сопровождалось появлением быстрой фазы реакции восстановления Р4502В4 и кинетические кривые подчинялись описанию уравнением суммы двух экспонент с kj, равной 1.1 ± 0.2 с'*, и к2, равной 0.024 + 0.010 с' (коэффициент корреляции 0.99). При этом доля быстрой фазы составляла примерно 25%. Максимальный уровень восстановления за 1 мин составил 56%. Присутствие в инкубационной смеси Ь5 не влияло на кинетику реакции восстановления Р4502В4.

Рисунок 3.

Кинетические кривые восстановления Р4502В4 в MPC при соотношении P4502B4:NADPH-FP 1:1 в отсутствие (А) и присутствии (В) БФ.

[P4502B4(Ft14)], И M ¡P4502&HF<r4], к M

Таблица 2.

Константы скоростей NADPH-зависимого восстановления Р4502В4 в MPC 1:1. ( c-t )

Система ki

-Ь5 -БФ т 0.054 ± 0.002

+Ь5 -БФ „ 0.065 ± 0.003

1:1

-Ь5 +БФ 1.1 ± 0.2 0.024 ± 0.010

+Ь5 +БФ 1.3 ± 0.1 0.030 ± 0.008

к1 и У.2 - константы скоростей быстрой и медленной фаз восстановления Р4502В4, соответственно.

Инкубационная смесь содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л эмульгена 913, по 1 мкМ NADPH-FP и Р4502В4, 2 мМ БФ. Анаэробиоз создавали добавлением 50 мМ глюкозы, 90 ед/мл глюкозоксидазы и 2500 ед/мл каталазы. СО пропускали в течении 1 мин. Реакцию инициировали добавлением 1 мМ NADPH.FR Температура 30° С.

Резкое увеличение скорости реакции переноса первого электрона в присутствии субстратов в реконструированных системах с фосфолипидом и детергентами отмечали также Eyer and Backes (1992), которые показали, что субстрат увеличивал относительное количество быстро восстанавливающегося комплекса Р450 и NADPH-FP и константу его образования.

Стехиометрия NADPH-зависимых реакций окисления в MPC с соотношением NADPH-FP:P4502B4 1:1 Р450 катализирует реакции окисления субстратов, в которых один из атомов кислорода внедряется в молекулу субстрата, а другой восстанавливается до Н20. Но в ряде случаев определенная доля доноров электронов расходуется на восстановление С>2, не сопровождающееся внедрением в субстрат (Massey and Hemmerich, 1975). Подобное явление получило название разобщения. При этом в отличии от других монооксигеназ, Р450 печени не окисляет ни один из известных субстратов с полным сопряжением, часть редокс-эквивалентов NADPH расходуется в побочных оксидазных реакциях (Zhukov and Archakov, 1989). При свободном окислении NADPH Р450, кроме образования супероксид-радикала С>2 (Kutban et al.,1982), способен катализировать прямое двух-и четырех-электронное восстановление Ох с образованием Н2О2 (Thurman et al.,1972; Ullrich and Kutban, 1980) и H2O, соответственно (Жуков, Арчаков, 1983). При этом относительный вклад каждого пути в суммарную реакцию непостоянен и зависит как от состава среды, условий проведения реакций, так и от формы Р450 и природы самого субстрата.

Таким образом, исследование стехиометрии реакций микросомального окисления дает очень ценный материал для выяснения каталитического процесса, проходящего с участием Р450, распределения редокс-эквивалентов NADPH по монооксигеназному и оксидазным путям.

Данные по исследованию влияния Ь5 на скорость окисления различных субстратов в MPC при эквимолярном соотношении белков представлены в таблице 3. Видно, что в отсутствии Ь5 MPC способна с высокой скоростью окислять субстраты I типа БФ и ДМА и с гораздо меньшей скоростью АП. Субстрат II типа - АН окисляется в MPC с очень низкой скоростью. В то же время было показано, что анилин связывается как с цитохромом Р4502В4 в составе микросом, так и с агрегатами и мономерами Р4502В4 с образованием типичных спектров, характерных для субстратов II типа. Различия наблюдались только в

Таблица 3.

Влияние Ь5 на скорость окисления различных субстратов в MPC 1:1. ( нмоль продукта /(с * нмоль Р4502В4 ))

Субстрат -Ь5 +Ь5

БФ 0.21 ± 0.02 0.33 ± 0.02

ДМА 0.15 ± 0.01 0.29 ± 0.01

АП 0.015 ± 0.002 0.04 ± 0.01

АН 0.0005±0.0002 0.0005±0.0002

п-НА 0 0.045 ± 0.005

Инкубационная смесь содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л эмульгена 913, 2 мМ БФ, или 6 мМ ДМА, или 16 мМ АП, или 6 мМ АН, или 2 мМ П.НА, 2 мМ NÀDPH, по 1 мкМ мономеров Р4502В4, NADPH-FP и Ь5. Температура 30° С.

величинах констант диссоциации, самые высокие значения которых имели место для мономеров Р4502В4 (Kanaeva et al., 1992 а). В отсутствии Ь5 не наблюдалось О-деметилирования п-НА. Добавление Ь5 сопровождалось увеличением скорости окисления БФ, ДМА и АП в 1.52.5 раза и не влияло на скорость окисления АН. Ранее Sugiyama et al. (1980) показали, что в реконструированных системах, содержащих фосфолипид, для окисления п-НА присутствие Ь5 является необходимым условием, что и подтверждается нашими данными в MPC.

Для выяснения механизма стимулирующего действия Ь5 на монооксигеназные реакции исследовали стехиометрию NADPH-зависимых реакций окисления в MPC в отсутствии и присутствии Ь5 для БФ, окисляющегося в MPC с наибольшей скоростью. Данные представлены в таблице 4. Как видно из таблицы, в отсутствии субтрата добавление Ь5 не влияло на скорости окисления NADPH, генерации суперокисного радикала и Н2О2, что говорит об отсутствии влияния Ь5 на оксидаэные реакции. В присутствии БФ скорость окисления NADPH возрастала в 3 раза, как в отсутствии, так и в присутствии Ь5- При добавлении БФ также наблюдалось увеличение скорости генерации С>2 в 2.3 раза и общей Н2О2 в 2 раза. Максимально увеличивалась скорость генерации прямой перекиси водорода ( в 10 раз ), образующейся ири распаде псроксикомплекса, при добавлении БФ. Добавление Ь5 сопровождалось уменьшением константы скорости генерации О2 и прямой Н2О2 примерно

в 1.3 раза и в 1.7 раза при наличии БФ в инкубационной среде. Видно, что в отсутствии субстрата образование Н2О2 происходит в основном в результате дисмутации О2, тогда как в присутствии БФ около 25% Н2О2 образуется путем прямого двухэлектронного восстановления О2 на

Р4502В4.

Одним из показателей эффективности работы ммс является степень сопряжения, т.е. отношение скорости образования продукта реакции к скорости окисления NADPH. В MPC в отсутствии Ь5 для БФ этот показатель равен 0.28, добавление Ь5 увеличивало -степень сопряжения до 0.42. Таким образом, исходя из полученных результатов, можно заключить, что Ь5 способствует более продуктивной работе MPC за счет снижения расхода редуцирующих эквивалентов NADPH на генерацию таких продуктов как О2, Н2О2 и возможно Н2О. Сопрягающий эффект Ь5 может быть связан с тем, что второй электрон с Ь5 поступает на комплекс оксиферроцитохрома Р450 с субстратом быстрее, чем с редуктазы (Imai et al., 1981; Taniguchi et al., 1980).

Таблица 4.

Стехиометрия NADPH-заБисимых реакций окисления (свободных и в присутствии БФ) в MPC при соотношении Р4502В4 : NADPH-FP : Ь5 1:1:1. (нмоль продукта /(с * нмоль Р4502В4))

................................-БФ...........................+БФ.....

Продукт

и * -Ь5 +Ь5 -Ь5 +Ь5

ЫАБРН 0.25 ± 0.03 0.28 ± 0.01 0.79 ± 0.05 0.81 ± 0.04

О2 0.29 ± 0.04 0.27 ± 0.03 0.78 ± 0.07 0.61 ± 0.07

Н2О2 общ 017 ± 0 01 0Л1 ± 0.01 0.44 ± 0.02 0.35 ± 0.03

Н2О2 прям 0.01510.005 0.01710.003 0.15 + 0.01 0.09 + 0.01

ФА - - 0.22 ± 0.01 0.34 ± 0.01

Н2О2 общ-^АОРН 0.68 0.61 0.56 0.43

ФАгЫАБРН - - 0.28 0.42

Н202 прям:ФА - - 0.68 0.26

Инкубационная смесь содержала 500 мМ калиг«-фосфагный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л эмульгена 913, по 1 мкМ мономеров ГЧАБРН-ГР, Р4502В4 и Ь5, 2 мМ БФ, 2 мМ КАОРН. Температура 30° С.

Увеличение сопряжения реакций N-дсмстилировамия БФ в присутствии Ь5 можно об'яснить тем, что Ь5, являясь донором второго электрона, снижает концентрацию оксикомплекса Р450, то есть снижает генерацию супероксида О2, направляя больший поток электронов на образование пероксикомплекса. Наблюдающееся при этом замедление скорости генерации прямой H ¿О 2 говорит в пользу второго эффекта Ь5, а именно стабилизации образующегося в его присутствии пероксикомплекса.

Чтобы проверить правильность этого предположения, измеряли концентрацию оксикомплекса Р4502В4 в инкубационной среде в присутствии и отсутствии Ь5, а также рассчитали стехиометрию образования прямой Н2О2 в расчете на моль продукта в этих же условиях. В присутствии БФ концентрация оксикомплекса была равна 0.12 мкМ, и при добавлении в инкубационную среду Ь5 снижалась в 2 раза ( 0.06 мкМ ). В то же время соотношение Н2О2 прям:®А снижается в 2.6 раза при добавлении Ь5. Это подтверждает предположение, что Ь5 способствует более быстрому переходу оксикомплекса в пероксикомплекс, направляя реакцию по монооксигеназному пути.

Сравнительное исследование стехиометрии NADPH-завксимых реакций окисления в MPC с соотношением P4502B4:NADPH-FP 1:0.05

и микросомах.

Так как монооксигеназная система макросом печени содержит Р4502В4 и NADPH-FP в соотношении примерно 10-20 : 1, было интересным реконструировать ММС с соотношением компонентов, аналогичном мнкросомальному. Предстояло сравнить эффективность работы MPC 1:0.05 с таковой MPC 1:1, обладающей максимальной активностью. В отсутствие субстрата в обеих системах добавление Ь5 не влияло на скорости окисления NADPH и генерации Н2О2, величины которых были выше в MPC 1:1 в 2.9 и 2.4 раза, соответственно. В присутствии БФ скорость окисления NADPH в MPC 1:1 возрастала в 3 раза, как в отсутствии, так и в присутствии Ь5. Влияние БФ в данных системах на скорость образования Н2О2 было разным : стехиометрическое соотношение Н2О206Щ : NADPH снижалось в MPC 1:0.05 в 2 раза, а в MPC 1:1 на 25-40%. В то же время, в обеих системах при добавлении Ь5 наблюдалось увеличение стехиометрического соотношения ФА: NADPH в 1.5-1.7 раза. Следовательно, добавление Ь5 к реконструированным системам приводило к увеличению уровня их

:опряжения и сдвигу реакции в сторону продуктивного распада героксикомплекса Р4502В4 ( рисунок 4 ). Несмотря на то, что скорость эеакции окисления NADPH, образования Н2О2 и ФА в присутствии Ь5 значительно выше ( в 5-8 раз ) в MPC 1:1, степени сопряжения реакций жисления БФ практически одинаковы и приближаются к значению, толученному в случае микросом. Системы, реконструированные при зазном соотношении переносчиков, работают одинаково эффективно и таляготся хорошей моделью для исследования микросомальной ионооксигеназной системы в целом и взаимодействия ее компонентов друг : другом.

Рисунок 4.

Степень сопряжения NADPH-зависимых реакций окисления в различных системах.

Параметры взаимодействия Р4502В4 и Ь5. Цитохромы Р4502В4 и Ь5 взаимодействуют друг с другом по смехе:

к+1

Р4502В4 + Ь5 — Р4502В4-Ь5 к-1

Kd = / k+f

Константа скорости образования комплекса Р4502В4 - Ь5 (к.О регистрировалась по скорости сдвига спинового равновесия Р4502В4 в сторону его высокоспиновой формы, то есть по скорости нарастания Аз8£-417 при добавлении в инкубационную смесь Ь5 в соотношении Ы. Данные по исследованию параметров взаимодействия Р4502В4 и Ь5 и влияния на них БФ представлены на рисунке 5 и в таблице 5.

Время жизни комплекса составило 10 ± 1 с и И ± 1 с в отсутствие и присутствии БФ, соответственно.

Рисунок 5.

Кинетические кривые сдвига спинового равновесия Р4502В4 в сторону высокоспиновой формы в присутствии Ь5.

Таблица 5.

Параметры взаимодействия мономеров Р4502В4 и Ь5 в отсутствие и присутствии БФ.

Параметры -БФ +БФ

к+1 * 105, м-1 * с-1 0.89 ± 0.16 1.1 ± 0.2

к,1, с-1 0.10 ± 0.05 0.09 ± 0.04

I, с 10 ± 1 11 ± 1

Для измерения к+1 инкубационная смесь содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л вмульгеиа 913, 1 мкМ Р4502В4, 1 мМ БФ. Реакцию инициировали добавлением 1 мкМ Ь5.

Зная константы скоростей переноса второго электрона па Р4502В4 в отсутствии и присутствии Ь5, можно оценить процент продуктивных комплексов. Константа скорости переноса второго электрона на Р4502В4, равная разнице констант переноса с ЫАВРН двух электронов и одноэлектронного восстановления О2 на Р450 с образованием супероксид-радикэла, в отсутствии Ь5 равна 0.8 с^ (таблица 6). В то же время константа скорости переноса второго электрона в присутствии Ь5 равна 1.0 с'1, то есть увеличивается в 1.3 раза. Еще более существенно, в 1.6 раза в присутствии цитохрома Ь5 увеличивается константа скорости продуктивного распада пероксикомплекса, определяемая как разница констант скоростей окисления МАОРН и суммы констант скоростей распада оксикомплекса (А О2) и непродуктивного распада пероксикомплекса (А Н202Прям)- Принимая во внимание время жизни комплекса Р4502В4 - Ь5 (11 с в присутствии БФ), можно сделать заключение, что все образующиеся комплексы гемопротеигюв являются продуктивными и долгоживущимк. В каждом из них возможен не только перенос электронов, но и цитохром Ь5 может осуществлять эффекторную роль, направляя распад пероксикомплекса по продуктивному пути.

Наличие гидрофобного фрагмента, то есть увеличение об'ема молекулы, не может приводить к увеличению константы скорости образования комплекса, а может лишь замедлять его распад, снижая к.}, при этом должно увеличиваться время жизни комплекса.

Таблица 6.

Константы переноса второго электрона и продуктивного распада пероксикомплекса в MPC п присутствии БФ.

Константы

— Ь5

+Ь5

0.8+0.05 1.0+Ю.03

0.5+0.03 0.8+0.04

ВЫВОДЫ.

1. Микросомалъная монооксигеиазкая система печени реконструирована из мономеров Р4502В4, NADPH-FP и Ь5 При соотношении компонентов 1:1:1 и 1:0.05:1.

2. При взаимодействии цитохрома Ь5 с NADPH-FP образование комплексов, сшивающихся ЭДК, не является обязательным для переноса электронов. Восстановление т- и д-Ь5 происходит в условиях, когда электрофоретически не удается обнаружить их комплексов с флавопротеином.

3. В случае исследования комплексов т- и д-Ь5 с Р4502В4 показано, что продуктивным является только комплекс д-Ь5 — Р4502В4. При этом только д-Ь5 обладал сопрягающим действием в MPC, увеличивая степень сопряжения NADPH-зависимых реакций окисления бензфетамина в 1.51.7 раза. В комплексе д-Ь5 — Р4502В4 наблюдался сдвиг спинового равновесия Р4502В4 в сторону его высокоспиновой формы, и он регистрировался электрофоретически после сшивания ЭДК.

4. В отличии от д-Ь5 его трипсииовый фрагмент не оказывал сопрягающего действия на реакции, катализируемые Р4502В4, не вызывал сдвига спинового равновесия Р4502В4 и не образовывал комплексов, сшивающихся ЭДК.

5. На основании расчетов стехиометрии реакций гидроксилирования бензфетамина показано, что в механизме сопрягающего действия Ь5 важную роль играет как увеличение константы скорости переноса второго электрона, так и ингибирование непродуктивного распада нероксикомплекса с образованием Н2О2- Не наблюдалось влияния Ь5 на скорость переноса первого электрона на Р4502В4.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. A.M.Kritsky, I.P.Kanaeva, D.R.Davydov, N.V.Stepanova, G.I.Bachmanova. The use of synthetic peptides for the investigation of cytochrome P450 interaction with partner proteins. Abstracts of the 8th International conf. on Cyt. P450, Lisbon, Portugal, p.181

2. A.M.Kritsky, I.P.Kanaeva, D.R.Davydov, N.V.Stepanova, G.I.Bachmanova. The use of synthetic peptides for the investigation of components interaction in monooxygenase rabbit liver system. Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology - ed. Lechner M.C. Proc. of the 8th International conf. P.L.R., 1994 pp.477-480

3. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, O.V.Nikityuk, N.V.Stepanova, T.V.Knushko, Ya.M.Koen, A.I.Archakov. Electron transfer and proteinprotein interaction in soluble reconstituted liver monooxygenase systems. Abstracts of the 8th International conf. on Cyt. P450, Lisbon, Portugal, p.31

4. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, O.V.Nikityuk, N.V.Stepanova, T.V.Knushko, Ya.M.Koen, A.I.Archakov. Electron transfer and proteinprotein interaction in soluble reconstituted liver monooxygenase systems. Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology - ed. Lechner M.C. Proc of the 8th International conf. P.L.R., 1994 pp.395-401

5. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, O.V.Nikityuk, N.V.Stepanova, A.I.Archakov. Protein-protein interaction in reconstituted rabbit liver monooxygenase systems. Abstracts of the 3rd IUBMB Conf. Molecular recognition - 1995, Singapore, p. 138

6. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, N.V.Stepanova, Ya.M.Koen, N.F.Samenkova, A.I.Archakov. Role of cytochrome b5 in microsomal soluble reconstituted monooxygenase system. Abstracts of the 9th international conf. on Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology -1995, Zurich Switzerland, p.232