Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль цитохрома b5 в микросомальной монооксигеназной системе печени, реконструированной в растворе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль цитохрома b5 в микросомальной монооксигеназной системе печени, реконструированной в растворе"

российская академия медицинских наук институт биомедицинской химии

На правах рукописи

УДК 577.158.022

СТЕПАНОВА Наталия Владимировна

роль цитохрома ь5 в микросомальной монооксигеназной системе печени, реконструированной в растворе.

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва 1996

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В НИИ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

академик РАМН, профессор Арчаков А.И. ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

д.б.н., профессор Карякин A.B.

д.м.и., профессор Гаппаров М.Г.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится ¿jyj" (X^J^^CS^ 1996 года в /000 часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д 001. 10. 01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул, Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН

Автореферат разослан "¿2 ¡.X . 1996 года.

Ученый секретарь Специализированного Ученого Совета, к.б.н. БылИнкина B.C.

/уфр

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

актуальность проблемы. Монооксигеиазная система ЭПР печеночных клеток, включающая NAD(P)H-3aBKCHMMC флавопротеииы и питохромы Р450 и Ь5, ответственна за метаболизм широкого спектра эндогенных и экзогенных субстратов. Принимая участие в активации кинетически инертной молекулы кислорода и внедрении одного из его атомов в молекулу субстрата, эта ферментная система окисляет гидрофобные соединения, превращая их в более полярные и, таким образом, способствует выведению их из организма (Archakov and Bachmanova, 1990).

Для понимания механизмов взаимодействия белков и изучения молекулярной организации микросомальной монооксигеназной системы (ММС), представляющей собой многоферментный мембрано-связанный комплекс, используется метод реконструкции этой системы из отдельных высокоочищенных компонентов, фосфолипидов или детергентов. С помощью этого метода решен ряд вопросов, связанных с выяснением субстратной специфичности различных цитохромов Р450, механизма реакций окисления, идентификации функциональных групп, ответственных за взаимодействие белков (Канаева и др., 1985; Скоцеляс и др., 1987; Miwa and Lu, 1981; Miller-Enoch et al., 1984; Kanaeva et ai., 1992 a, b). Для большинства оксигеназных реакций оказалось достаточным присутствия в реконструированной системе NADPH-зависимого флавопротеина (NADPH-FP), цитохрома Р450 (Р450) и фосфолипидов или детергентов.

В зависимости от типа окисляемого субстрата, формы Р450, соотношений белок : белок или белок : фосфолипид, фосфолипидного состава в реконструированных системах наблюдается разнообразное действие b5 на Р450-катализируемые реакции. Многие авторы наблюдали стимулирующий эффект плтохрома Ь5 (Ь5) на монооксигеназные реакции [Вознесенский и др.,1990б; Canova-Davis et al.,1984; Tamburini and Schenkman, 1987), другие - ингибирующий (Morgan and Coon, 1984; 4!avica and Golly, 1986; Golly et al.,1988 ). В некоторых случаях Ь5 не жазывал эффекта или его присутствие было обязательным как, например, 1ля реакций окисления п-нитроанизола и метоксифлурана (Sugiyama et il.,1982; Konopka and Waskell, 1988; Lipka and Waskell, 1989). Использование мономерной реконструированной системы (MPC) делает "юлее простым исследование влияния Ь5 на монооксигеназные реакции.

ММС, состоящая из мономеров цитохро.ма Р4502В4 (Р4502В4) и NADPH-FP, была реконструирована в присутствии неионного детергента эмульгена 913 при сотношении белок : детергент = 1:100. При этом концентрация Р4502В4 в растворе составляла 0.5 - 5 мкМ. Эта система, содержащая мономеры флаво- и гемопротеинов при их мольном соотношении 1:1, с высокой скоростью катализировала реакции восстановления Р4502В4 и N-деметилирования бензфетамина (ВФ), диметиланилина (ДМА) и аминогшрина (АП). Было показано, что компоненты монооксигеназной системы взаимодействовали по принципу случайных соударений согласно закону действующих масс (Bachmanova et

al.,1986, 1989; Kanaeva et al.,1987, 1992 a, b).

В отличие от реконструированных систем, в микросомах имеет место совсем другое соотношение Р450 и NADPH-FP: па 1 молекулу NADPH-FP приходится 10-20 молекул Р450 (Dean and Gray, 1982; Archakov and Bachmanova, 1990). Поэтому представляло также интерес реконструировать ММС при соотношении NADPH-FP и Р4502В4, близком к микросомалыюму, и исследовать кинетические особенности ее функционирования в растворе.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: реконструировать монооксигеназпую систему микросом печени, содержащую цитохром Р4502В4, NADPH-FP и цитохром Ь5 в виде мономеров, и выяснить роль цитохро.ма Ь5 в реакции окисления бензфетамина.

ЗАДАЧИ:

1. Исследовать влияние цитохрома Ь5 на скорость гидроксилирования бензфетамина и других субстратов в реконструированной монооксигеназной системе, когда все се компоненты присутствуют в виде мономеров.

2. Исследовать стехиометрию NADPH-зависимых реакций окисления в мономерной реконструированной системе (MPC) в отсутствие и присутствии Ь5.

3. Провести сравнительный анализ исследованных параметров в MPC при соотношении гемо- и флавопротеинов 1:0.05 и 1:1 и микросомах печени кроликов, получавших фенобарбитал.

4. Измерить параметры взаимодействия Ь5 с Р4502В4: константу связывания Kj, константы скорости образования (k+i) и распада комплекса Р4502В4-Ь5 (k_i). Определить время жизни (Т) комплекса

Ь5-Р4502В4 и сравнить его со скоростью переноса второго электрона в MPC.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

В результате проведенных исследований была реконструирована монооксигеназная система, все компоненты которой (Р4502В4, NADPH-FP и Ь5) присутствовали в виде мономеров. Выявлено, что для переноса электронов с NADPH-FP на Ь5 наличие гидрофобных мембранных фрагментов этих белков не является обязательным. В случае образования комплексов цитохромов Р4502В4 и Ь5, регистрируемых электрофоретически и спектрофотометрически, наличие гидрофобного фрагмента Ь5 было абсолютно необходимым. Только детергентный ¿итохром Ь5 (д-Ь5) оказывал стимулирующий эффект на скорости жисления различных субстратов в MPC и на степень сопряжения MADPH-зависимых реакций окисления бензфетамина при различном :оотношении Р4502В4 : NADPH-FP. В механизме сопрягающего (сйствия Ь5 следует учитывать как увеличение константы скорости iepenoca второго электрона, так и ингибирование непродуктивного распада героксикомплекса Р4502В4. Определено время жизни комплекса D4502B4 - Ь5, которое равно 10 с.

ШРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы были ¡редставлены на 8ой Международной конференции по биохимии, ¡иофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Португалия, \иссабон, 1993), на 10°м Международном симпозиуме по микросомам и кислению лекарств (Канада, Торонто, 1994), на Зеи Международной онференции по молекулярному узнаванию (Сингапур, 1995) и на 9ой Леждународной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной иологии цитохрома Р450 (Швейцария, Цюрих, 1995). Апробация аботы состоялась на научной конференции лабораторий НИИ иомедицинской химии РАМН.

1УБАИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

ОБ'ЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включает ^ таблиц и § рисунков и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы".

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Высокоочищенный препарат цитохрома Р4502В4 получали по методу Imai and Sato (Imai and Sato, 1974) с некоторыми модификациями аффинной хроматографии (Карузина и др., 1979).

NADPH-цитохром Р450 редуктазу выделяли по методу Yasukuchi and Masters (1976).

Выделение д-Ь5 проводили по модифицированному методу Spatz and Strittmatter (1971). Трипсиновые фрагменты NADPH-FP (т-NADPH-FP) и Ь5 (т-Ь5) выделяли по методу Ornura and Takesue (1970).

Содержание цитохрома Р450 измеряли по дифференциальному спектру поглощения его восстановленного СО-комплекса при длинах волн 450 и 490 нм (Omura and Sato, 1964). При расчетах использовали коэффициент молярной экстинции 91 мМ"1 см"'.

Содержание NADPH-FP определяли по абсолютному спектру поглощения в диапазоне 300-600 нм, используя коэффициент молярной экстинции 21.4 мМ'1 см"* для "К 456 (Dignam and Strobe!, 1977).

Содержание цитохрома Ь5 определяли но дифференциальной схеме. Коэффициент молярной экстинции для А424-4О8 восстановленной формы

Ь5 165 мМ-1 см-1.

Мономеризацию Р4502В4 и NADPH-FP проводили по методу Kanaeva et al. (1992, а).

Мономеризацию цитохрома Ь5 проводили в 500 мМ К-фосфатном буфере, рН=7.2, содержащем 0.25 г/л эмульгена 913, в течении 18-24 часов.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в присутствии додецилсульфата натрия по методу Laemmli (1970).

Для регистрации спектров связывания Р4502В4 и Ь5 использовали дифференциальную схему для четырехкюветной тандемной системы в

диапазоне 350-450 им. Расчет К<] проводили с использованием программы "Spec Ks/Kd" по уравнению Скэтчарда.

Кинетику NADPH- и дитионит-записимого восстановления Р4502В4 и Ь5 регистрировали в анаэробных условиях при 30° С. За процессом восстановления следили по изменению разности оптических плотностей при длинах волн 450 и 490 для Р4502В4, 424 и 408 для Ь5. Обработку кинетических кривых восстановления осуществляли с использованием методов нелинейной регрессии при помощи программы SpectraLab (Davydov et al.,1995).

Определение скорости окисления NADPH проводили при 340 нм, в термостатируемой кювете при 30° С, используя коэффициент молярной экстинции 6.22 мМ-1 см~1.

Все спектральные измерения проводили на спектрофотометре "Hewlett Packard" 8451А (США).

Скорость генерации Н2О2 определяли тиоцианатным методом (Thurman et а]., 1972).

Скорость генерации О2 определяли путем регистрации скорости восстановления сукцинилированного цитохрома с (Жуков и Арчаков,

1985).

Скорость NADPH-зависимого N-деметилирования БФ, ДМА и анилина (АН) определяли по накоплению формальдегида (ФА). Скорость О-деметилирования п-нитроанизола (п-НА) определяли по скорости накопления п-нитрофенола (Kanaeva et al., 1992 a, b)

Определение концентрации оксикомплекса Р4502В4 проводили по методу Werringloer and Kawano (1980).

Константы скорости образования комплекса Р4502В4 - Ь5 были засчитаны из кривых сдвига спинового равновесия Р4502В4 в сторону его ¡ысокоспиновой формы, регистрируемого по увеличению разности эптическнх плотностей при длинах волн 386 и 417 нм, с использованием такета программ SpectraLab (Davydov et al., 1995). Константы скорости эаспада комплекса Р4502В4 - Ь5 были расчитаны из следующей рормулы:

k.i - I<d * k+i

Время жизни комплекса расчитывали как X ~ \ / k_j

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Влияние Ь5 на скорость N-деметилирования

БФ в реконструированных системах.

В условиях получения мономеров Р4502В4 и NADPH-FP цитохром Ь5 присутствует в виде тетрамеров. Только при увеличении ионной силы буфера до 500 мМ с 0.25 г/л эмульгена 913 были получены мономеры Ь5 (Кондрашин и др. ,1989).

Так как мономеризация NADPH-FP и Р4502В4 проводилась в отличных от мономеризации Ь5 условиях, то представлялось интересным выяснить, зависит ли эффект Ь5 от степени его диссоциации. Данные по определению скорости N-деметилирования БФ в присутствии Ь5 представлены на рисунке 1.

Можно видеть, что стимулирующий эффект Ь5 на скорость

Рисунок 1.

Влияние цитохрома Ь5 на скорость N-деметилирования БФ в MPC.

1. Тетрамеры Ь5

2. Мономеры Ь5

3. Т-Ь5.

окисления субстрата в реконструированной системе с соотношением Р4502В4 и МАОРН-РР 1:1 не зависел от того, присутствует ли он в инкубационной среде в виде тетрамера (преинкубация Ь5 и проведение реакции в 100 мМ калий-фосфатном буфере с детергентом) или мономера (преинкубация Ь5 и проведение реакции в 500 мМ буфере с детергентом) : во всех случаях скорость образования продукта реакции в его присутствии увеличивалась на 50-60%.

Таким образом, можно заключить, что ММС, реконструированная в 500 мМ К-фосфатном буфере, когда все ее компоненты присутствуют в виде мономеров, также эффективна как и реконструированная в 100 мМ буфере.

Роль гидрофобного фрагмента Ь5 во взаимодеиствии

с ^РРН-РР И Р4502В4.

Цитохром Ь5, лишенный гидрофобного фрагмента (т-Ь5) в отличии от детергентного не оказывал стимулирующего действия на окисление БФ ( рисунок 1 ). Кроме того, как было показано в совместной работе с Никитюк О.В. и др., при использовании в качестве сшивающего агента водорастворимого карбодиимида (ЭДК) электрофоретически удалось зафиксировать образование комплекса между детергеитным Ь5 и Р4502В4 и детергентными Ь5 и ИАОРН-РР, в то время как такие комплексы не были обнаружены для т-Ь5. Таким образом, гидрофобный фрагмент Ь5 необходим для образования комплекса двух гемопротеинов и ЫАОРН-РР - Ь5, сшивающихся ЭДК.

В отсутствие гидрофобных фрагментов у ИАОРН-РР или Ь5 не наблюдалось образования комплексов, сшивающихся ЭДК. В то же время скорость восстановления Ь5 не зависела от наличия мембранных фрагментов у ИАОРН-РР и Ь5: кинетика реакций оставалась двухфазной, и величины констант скоростей быстрой и медленной фаз реакции восстановления д-Ь5 и т-Ь5 были одинаковыми (таблица 1). Эти данные свидетельствуют о том, что для переноса электронов между д- и т-редуктазами и Ь5 наличие гидрофобных фрагментов у этих белков не является обязательным, в то время как эти фрагменты необходимы для образования комплексов, сшивающихся ЭДК. Гидрофобный фрагмент ИАБРН-РР также абсолютно необходим и для восстановления Р4502В4, то есть его роль в реакциях восстановления цитохромов Ь5 и Р4502В4 совершенно различна.

Таблица 1.

Константы скоростей NAD РН-зависимого восстановления Ь5 И Р4502В4 Т- И a-NADPH-FP.( И )

Пары ki к2

т-Ь5 - д-NADPH-FP 0.423 ± 0.020 0.029 ± 0.005

т-Ь5 - тг-NADPH-FP 0.386 ± 0.030 0.029 ± 0.008

д-Ь5 - т-NADPH-FP 0.367 ± 0.025 0.042 ± 0.010

д-Ь5 - д-NADPH-FP 0.394 ± 0.030 0.054 ± 0.012

Р4502В4- д-NADPH-FP - 0.054 ± 0.002

Р4502В4- т-NADPH-FP - 0

к| и к2 - константы скоростей быстрой и медленной фаз восстановления Ь5, соответственно.

Спектры связывания Р4502В4 и Ь5.

Добавление Ь5 в реконструированную систему, содержащую Р4502В4, приводило к сдвигу спинового равновесия Р4502В4 в сторону высокоспиновой формы, что проявлялось спектральными изменениями в диапазоне 350-450 нм ( А А386.417 ). По данным разных авторов, доля высокоспинового Р450 в присутствии Ь5 увеличивалась с 7% до 2337% (Hlavica, 1984; Tamburini et al.,1985; Tamburini and Schenkman, 1987). Спектры связывания мономеров и агрегатов Р4502В4 и Ь5 представлены на рисунке 2.

Расчитанные Kj для комплексов мономеров и агрегатов Р4502В4 и Ь5 не отличались и были равны 1.1 ± 0.2 мкМ и 1.2 ± 0.2 мкМ, соответственно. Для мономеров Р4502В4 и т-Ь5 комплексообразование спектрофотомстричсски обнаружить не удалось. Аналогично, не удалось зарегистрировать комплексообразование между агрегатами Р4502В4 и т- Ь5.

Спектры связывания мономеров и агрегатов цитохромов Р4502В4 и Ь5 в присутствии 1 мМ БФ носили тот же характер, a Kj комплексов Р4502В4 и Ь5 были равны 0.8 ± 0.2 и 0.7 ± 0.2 мкМ для мономеров и

олигомеров гемопротеинов, соответственно.

Рнсунок 2.

Спектры связывания цитохромов Р4502В4 и h .5 в отсутствии бензфетамина.

0.01

0.005

о

-0.005-

-0.01

350 390 430 -170 нм

Инкубационная смеса содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рИ—7.2, 0.25 г/л эмульгеиа 913 в случае мономеров Р4502В4, 1 мкМ Р4502В4. В инкубационную смесь добавлялись аликвоты Ь5 до получения максимальных спектральных изменений.

Исследование NADPH-зависимого восстановления Р4502В4 в MPC с соотношением NADPH-FP:P4502B4 1:1.

Данные по NADPH-зависимому восстановлению Р4502В4 в MPC представлены в таблице 2 и на рисунке 3. Видно, что в отсутствии БФ и Ь5 реакция восстановления Р4502В4 была монофазной с консшггой скорости реакции к2 = 0.054 ± 0.002 с"' (коэффициент корреляции 0.99). Добавление Ь5 не влияло ни на форму кинетической кривой, ни на величину константы скорости ( к2 = 0.065 + 0.003 с-' ). Добавление БФ сопровождалось появлением быстрой фазы реакции восстановления Р4502В4 и кинетические кривые подчинялись описанию уравнением суммы двух экспонент с kj, равной 1.1 ± 0.2 с*1, и к2, равной 0.024 ± 0.010 с* (коэффициент корреляции 0.99). При этом доля быстрой фазы составляла примерно 25%. Максимальный уровень восстановления за 1 мин составил 56%. Присутствие в инкубационной смеси Ь5 не влияло на кинетику реакции восстановления Р4502В4.

Рисунок 3.

Кинетические кривые восстановления Р4502В4 в MPC при соотношении P4502B4:NADPH-FP 1:1 в отсутствие (А) и присутствии (В) БФ.

[P4502B4(Fe^*)], цМ [P4502B4(Fi2n], цМ

Таблица 2.

Константы скоростей NADPH-зависимого восстановления Р4502В4 в MPC 1:1. ( с-1 )

Система kl к2

-Ь5 -БФ _ 0.054 ± 0.002

+Ь5 -БФ 0.065 ± 0.003

1:1

-Ь 5 +БФ 1.1 ± 0.2 0.024 ± 0.010

+Ь5 +БФ 1.3 ± 0.1 0.030 ± 0.008

к1 и к2 - константы скоростей быстрой и медленной фаз восстановления Р4502В4, соответственно.

Инкубационная смесь содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л эмульгена 913, по 1 мкМ ЫАОРН-РР и Р4502В4, 2 мМ БФ. Анаэробиоз создавали добавлением 50 мМ глюкозы, 90 ед/мл глкжозоксидазы и 2500 ед/мл каталазы. СО пропускали в течении 1 мин. Реакцию инициировали добавлением 1 мМ ЫАОРН-РР. Температура 30° С.

Резкое увеличение скорости реакции переноса первого электрона в присутствии субстратов в реконструированных системах с фосфолигтидом и детергентами отмечали также Eyer and Backes (1992), которые показали, что субстрат увеличивал относительное количество быстро восстанавливающегося комплекса Р450 и NADPH-FP и константу его образования.

Стехиометрия NADPH-зависимых реакций окисления в MPC с соотношением NADPH-FP:P4502B4 1:1.

Р450 катализирует реакции окисления субстратов, в которых один из атомов кислорода внедряется в молекулу субстрата, а другой восстанавливается до Н2О. Но в ряде случаев определенная доля доноров электронов расходуется на восстановление С>2, не сопровождающееся внедрением в субстрат (Massey and Hemmerich, 1975). Подобное явление получило название разобщения. При этом в отличии от других монооксигеназ, Р450 печени не окисляет ни один из известных субстратов с полным сопряжением, часть редокс-эквивалентов NADPH расходуется в побочных оксидазных реакциях (Zhukov and Archakov, 1989). При свободном окислении NADPH Р450, кроме образования супероксид-радикала О2 (Kuthan et al.,1982), способен катализировать прямое двух-и четырех-электронное восстановление О2 с образованием Н2О2 (Thurman et al.,1972; Ullrich and Kuthan, 1980) и H2O, соответственно (Жуков, Арчаков, 1983). При этом относительный вклад каждого пути в суммарную реакцию непостоянен и зависит как от состава среды, условий проведения реакций, так и от формы Р450 и природы самого субстрата.

Таким образом, исследование стехиометрии реакций микросомального окисления дает очень ценный материал для выяснения каталитического процесса, проходящего с участием Р450, распределения редокс-эквивалентов NADPH но монооксигеназному и оксидазным путям.

Данные по исследованию влияния Ь5 на скорость окисления различных субстратов в MPC при эквимолярном соотношении белков представлены в таблице 3. Видно, что в отсутствии Ь5 MPC способна с высокой скоростью окислять субстраты I типа БФ и ДМА и с гораздо меньшей скоростью АП. Субстрат И типа - АН окисляется в MPC с очень низкой скоростью. В то же время было показано, что анилин связывается как с цитохромом Р4502В4 в составе микросом, так и с агрегатами и мономерами Р4502В4 с образованием типичных спектров, характерных для субстратов II типа. Различия наблюдались только в

Таблица 3.

Влияние Ь5 на скорость окисления различных субстратов d MPC 1:1. ( нмоль продукта /(с * нмоль Р4502В4 ))

Субстрат -Ь5 +Ь5

БФ 0.21 ± 0.02 0.33 ± 0.02

ДМ А 0.15 ±0.01 0.29 ±0.01

АП 0.015 ± 0.002 0.04 ± 0.01

АН 0.0005±0.0002 0.0005±0.0002

п-НА 0 0.045 ± 0.005

Инкубационная смесь содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л эмульгена 913, 2 мМ БФ, или 6 мМ ДМА, или 16 мМ АП, или 6 мМ АН, или 2 мМ п-НА, 2 мМ NADPH, по 1 мкМ мономеров Р4502В4, NADPH-FP и Ь5. Температура 30° С.

величинах констант диссоциации, самые высокие значения которых имели место для мономеров Р4502В4 (Kanaeva et al., 1992 а). В отсутствии Ь5 не наблюдалось О -деметилирования п-НА. Добавление Ь5 сопровождалось увеличением скорости окисления БФ, ДМА и АП в 1.52.5 раза и не влияло на скорость окисления АН. Ранее Sugiyama et al. (1980) показали, что в реконструированных системах, содержащих фосфолипид, для окисления п-НА присутствие Ь5 является необходимым условием, что и подтверждается нашими данными в MPC.

Для выяснения механизма стимулирующего действия Ь5 на монооксигеназные реакции исследовали стехиометрию NADPH-зависимых реакций окисления в MPC в отсутствии и присутствии Ь5 для БФ, окисляющегося в MPC с наибольшей скоростью. Данные представлены в таблице 4. Как видно из таблицы, в отсутствии субтрата добавление Ь5 не влияло на скорости окисления NADPH, генерации суперокисного радикала и Н2О2, что говорит об отсутствии влияния Ь5 на оксидазные реакции. В присутствии БФ скорость окисления NADPH возрастала в 3 раза, как в отсутствии, так и в присутствии Ь5. При добавлении БФ также наблюдалось увеличение скорости генерации О2 в 2.3 раза и общей Н2О2 в 2 раза. Максимально увеличивалась скорость генерации прямой перекиси водорода ( в 10 раз ), образующейся при распаде пероксикомплекса, при добавлении БФ. Добавление Ь5 сопровождалось уменьшением константы скорости генерации О2 и прямой Н2О2 примерно

в 1.3 раза и в 1.7 раза при наличии БФ в инкубационной среде. Видно, что в отсутствии субстрата образование Н2О2 происходит в основном в результате дисмутации OJ, тогда как в присутствии БФ около 25% Н2О2 образуется путем прямого двухзлектрониого восстановления О2 на

Р4502В4.

Одним из показателей эффективности работы ММС является степень сопряжения, т.е. отношение скорости образования продукта реакции к скорости окисления NADPH. В MPC в отсутствии Ь5 для БФ этот показатель равен 0.28, добавление Ь5 увеличивало степень сопряжения до 0.42. Таким образом, исходя из полученных результатов, можно заключить, что Ь5 способствует более продуктивной работе MPC за счет снижения расхода редуцирующих эквивалентов NADPH на генерацию таких продуктов как OJ, Н2О2 и возможно Н2О. Сопрягающий эффект Ь5 может быть связан с тем, что второй электрон с Ь5 поступает на комплекс оксиферроцитохрома Р450 с субстратом быстрее, чем с редуктазы (Imai et al., 1981; Taniguchi et al., 1980).

Таблица 4.

Стехиометрия NADPH-зависимых реакций окисления (свободных и в присутствии БФ) в MPC при соотношении Р4502В4 : NADPH-FP : Ь5 1:1:1. (нмоль продукта /(с * нмоль Р4502В4))

-БФ +БФ

Продукт

* -Ь5 +Ь5 -Ь5 +Ь5

NADPH 0.25 ± 0.03 0.28 ± 0.01 0.79 ± 0.05 0.81 ± 0.04

О2 0.29 ± 0.04 0.27 ± 0.03 0.78 ± 0.07 0.61 ± 0.07

Н2О2 общ 017 ± 0.01 0.17 ± 0.01 0.44 ± 0.02 0.35 ± 0.03

Н202 прям 0.01510.005 0.01710.003 0.15 1 0.01 0.09 1 0.01

ФА - - 0.22 1 0.01 0.34 ± 0.01

Н2О2 o6m:NADPH 0.68 0.61 0.56 0.43

®A:NADPH - - 0.28 0.42

Н2О2 прям^ФА - - 0.68 0.26

Инкубационная смссь содержала 500 мМ калий-Фосфатный буфер, рН=7.2, 0.25 г/л змульгена 913, по Î мкМ мономеров NADPH-FP, Р4502В4 и Ь5, 2 мМ БФ, 2 мМ NADPH. Температура 30° С.

Увеличение сопряжения реакций N-деметилирования БФ в присутствии Ь5 можно об'яснить тем, что Ь5, являясь донором второго электрона, снижает концентрацию оксикомплекса Р450, то есть снижает генерацию супероксида О2, направляя больший поток электронов на образование пероксикомплекса. Наблюдающееся при этом замедление скорости генерации прямой Н2О2 говорит в пользу второго эффекта Ь5, а именно стабилизации образующегося в его присутствии пероксикомплекса.

Чтобы проверить правильность этого предположения, измеряли концентрацию оксикомплекса Р4502В4 в инкубационной среде в присутствии и отсутствии Ь5, а также рассчитали стехиометрию образования прямой Н2О2 в расчете на моль продукта в этих же условиях. В присутствии БФ концентрация оксикомплекса была равна 0.12 мкМ, и при добавлении в инкубационную среду Ь5 снижалась в 2 раза ( 0.06 мкМ ). В то же время соотношение Н2О2 прям:®А снижается в 2.6 раза при добавлении Ь5. Это подтверждает предположение, что Ь5 способствует более быстрому переходу оксикомплекса в псроксикомплекс, направляя реакцию по монооксигеназному пути.

Сравнительное исследование стехиометрии NADPH-зависимых реакций окисления в MPC с соотношением P4502B4:NADPH-FP 1:0.05

и микротомах.

Так как монооксигеназная система микросом печени содержит Р4502В4 и NADPH-FP в соотношении примерно 10-20 : 1, было интересным реконструировать ММС с соотношением компонентов, аналогичном микросомальному. Предстояло сравнить эффективность работы MPC 1:0.05 с таковой MPC 1:1, обладающей максимальной активностью. В отсутствие субстрата в обеих системах добавление Ь5 не влияло на скорости окисления NADPH и генерации Н2О2, величины которых были выше в MPC 1:1 в 2.9 и 2.4 раза, соответственно. В присутствии БФ скорость окисления NADPH в MPC 1:1 возрастала в 3 раза, как в отсутствии, так и в присутствии Ь5. Влияние БФ в данных системах на скорость образования Н2О2 было разным : стехиометрическое соотношение Н2О206Щ : NADPH снижалось в MPC 1:0.05 в 2 раза, а в MPC 1:1 на 25-40%. В то же время, в обеих системах при добавлении Ь5 наблюдалось увеличение стехиометрического соотношения ФА: NADPH в 1.5-1.7 раза. Следовательно, добавление Ь5 к реконструированным системам приводило к увеличению уровня их

сопряжения и сдвигу реакции в сторону продуктивного распада пероксикомплекса Р4502В4 ( рисунок 4 ). Несмотря на то, что скорость реакции окисления NADPH, образования Н2О2 и ФА в присутствии Ь5 значительно выше ( в 5-8 раз ) в MPC 1:1, степени сопряжения реакций окисления БФ практически одинаковы и приближаются к значению, полученному в случае микросом. Системы, реконструированные при разном соотношении переносчиков, работают одинаково эффективно и являются хорошей моделью для исследования микросомальной монооксигеназной системы в целом и взаимодействия ее компонентов друг с другом.

Рисунок 4.

Степень сопряжения NADPH-зависимых реакций окисления в различных системах.

Параметры взаимодействия Р4502В4 и Ь5. Цитохромы Р4502В4 и Ь5 взаимодействуют друг с другом по смехе:

к+1

Р4502В4 + Ь5 =±Р4502В4-Ь5 к-1

Kd =k-/ k+,

Константа скорости образования комплекса Р4502В4 - Ь5 (к+]) регистрировалась по скорости сдвига спинового равновесия Р4502В4 в сторону его высокоспиновой формы, то есть по скорости нарастания Аз86-417 при добавлении в инкубационную смесь Ь5 в соотношении 1:1. Данные по исследованию параметров взаимодействия Р4502В4 и Ь5 и влияния на них БФ представлены на рисунке 5 и в таблице 5.

Время жизни комплекса составило 10 ± 1 с и 11 ± 1 с в отсутствие и присутствии БФ, соответственно.

Рисунок 5.

Кинетические кривые сдвига спинового равновесия Р4502В4 в сторону высокоспиновой формы в присутствии Ь5.

14

12 10 8 6 4 2 0

О 5 10 15 20 25 30 35

Ертмя (с)

Таблица 5.

Параметры взаимодействия мономеров Р4502В4 и Ь5 в отсутствие и присутствии БФ.

Параметры -БФ +БФ

к+1 * 105, МИ * с-1 0.89 ± 0.16 1.1 ± 0.2

к-ь с-1 0.10 ± 0.05 0.09 ± 0.04

Т, с 10 ± 1 11 ± 1

Для измерения к-и инкубационная смесь содержала 500 мМ калий-фосфатный буфер, рН=7.2, 0./5 г/л эмулигена 913, 1 мкМ Р4502В4, 1 мМ БФ. Реакцию инициировали добавлением 1 мкМ Ь5.

А 3«Л>17 *

Зная константы скоростей переноса второго электрона на Р4502В4 в отсутствии и присутствии Ь5, можно оценить процент продуктивных комплексов. Константа скорости переноса второго электрона на Р4502В4, равная разнице констант переноса с NADPH двух электронов и одноэлектроиного восстановления 02 на Р450 с образованием супероксид-радикала, в отсутствии Ь5 равна 0.8 с"^ (таблица 6). В то aie время константа скорости переноса второго электрона в присутствии Ь5 равна 1.0 то есть увеличивается в 1.3 раза. Еще более существенно, в 1.6 раза в присутствии цитохрома Ь5 увеличивается константа скорости продуктивного распада пероксикомплекса, определяемая как разница констант скоростей окисления NADPH и суммы констант скоростей распада оксикомплекса (А О2) и непродуктивного распада пероксикомплекса (А Н202ПрЯм)- Принимая во внимание время жизни комплекса Р4502В4 - Ь5 (11 с в присутствии БФ), можно сделать заключение, что все образующиеся комплексы гемопротеинов являются продуктивными и долгоживущими. В каждом из них возможен не только перенос электронов, но и цитохром Ь5 может осуществлять эффекторнуго роль, направляя распад пероксикомплекса по продуктивному пути.

Наличие гидрофобного фрагмента, то есть увеличение об'ема молекулы, не может приводить к увеличению константы скорости образования комплекса, а может лишь замедлять его распад, снижая к„], при этом должно увеличиваться время жизни комплекса.

Таблица 6.

Константы переноса второго электрона и продуктивного распада пероксикомплекса в MPC в присутствии БФ.

Константы — Ь5 +Ь5

к переноса второго электрона 0.8+0.05 1.0±0.03

(2ANADPH-A01), с-1

к распада пероксикомплекса 0.5+0.03 0.8±0.04

(2ANADPH-A0J-2AH202npiîM), с-1

ВЫВОДЫ.

1. Микросомальная мопооксигеназная система печени реконструирована из мономеров Р4502В4, NADPH-FP и Ь5 при соотношении компонентов 1:1:1 и 1:0.05:1.

2. При взаимодействии цитохрома Ь5 с NADPH-FP образование комплексов, сшивающихся ЭДК, не является обязательным для переноса электронов. Восстановление т- и д-Ь5 происходит в условиях, когда электрофоретически не удается обнаружить их комплексов с флавопротеином.

3. В случае исследования комплексов т- и д-Ь5 с Р4502В4 показано, что продуктивным является только комплекс д-Ь5 — Р4502В4. При этом только д-Ь5 обладал сопрягающим действием в MPC, увеличивая степень сопряжения NADPH-зависимых реакций окисления бензфетамина в 1.51.7 раза. В комплексе д-Ь5 — Р4502В4 наблюдался сдвиг спинового равновесия Р4502В4 в сторону его высокоспиповой формы, и он регистрировался электрофоретически после сшивания ЭДК.

4. В отличии от д-Ь5 его трипсиновый фрагмент не оказывал сопрягающего действия на реакции, катализируемые Р4502В4, не вызывал сдвига спинового равновесия Р4502В4 и не образовывал комплексов, сшивающихся ЭДК.

5. На основании расчетов стехиометрии реакций гидроксилирования бензфетамина показано, что в механизме сопрягающего действия Ь5 важную роль играет как увеличение константы скорости переноса второго электрона, так и ингибирование непродуктивного распада пероксикомплекса с образованием Н202- Не наблюдалось влияния Ь5 на скорость переноса первого электрона на Р4502В4.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. A.M.Kritsky, I.P.Kanaeva, D.R.Davy tlov, N.V.Stepanova, G.I.Bachmanova. The use of synthetic peptides for the investigation of cytochrome P450 interaction with partner proteins. Abstracts of the 8th International conf. on Cyt. P450, Lisbon, Portugal, p.181

2. A.M.Kritsky, I.P.Kanaeva, D.R.Davydov, N.V.Stepanova, G.I.Bachmanova. The use of synthetic peptides for the investigation of components interaction in monooxygenase rabbit liver system. Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology - ed. Lechner M.C. Proc. of the 8th International conf. P.L.R., 1994 pp.477-480

3. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, O.V.Nikityuk, N.V.Stepanova, T.V.Knushko, Ya.M.Koen, A.I.Archakov. Electron transfer and proteinprotein interaction in soluble reconstituted liver monooxygenase systems. Abstracts of the 8th International conf. on Cyt. P450, Lisbon, Portugal, p.31

4. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, O.V.Nikityuk, N.V.Stepanova, T.V.Knushko, Ya.M.Koen, A.I.Archakov. Electron transfer and proteinprotein interaction in soluble reconstituted liver monooxygenase systems. Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology - cd. Lechner M.C. Proc of the 8th International conf. P.L.R., 1994 pp.395-401

5. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, O.V.Nikityuk, N.V.Stepanova, A.I.Archakov. Protein-protein interaction in reconstituted rabbit liver monooxygenase systems. Abstracts of the 3rd IUBMB Conf. Molecular recognition - 1995, Singapore, p. 138

6. G.I.Bachmanova, I.P.Kanaeva, N.V.Stepanova, Ya.M.Koen, N.F.Samenkova, A.I.Archakov. Role of cytochrome b5 in microsomal soluble reconstituted monooxygenase system. Abstracts of the 9th Internationa! conf. on Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology -1995, Zurich Switzerland, p.232