Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОПТИМИЗАЦИЯ РОСТА ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В ПРОТОЧНЫХ УСЛОВИЯХ В СВЯЗИ С МЕТАБОЛИЗМОМ ВОДОРОДА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ОПТИМИЗАЦИЯ РОСТА ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В ПРОТОЧНЫХ УСЛОВИЯХ В СВЯЗИ С МЕТАБОЛИЗМОМ ВОДОРОДА"

S - '■ '--'.J 1." .' .. -- ■ j ■.■.._ Г; . ' ">. 'J ■ Í

МОЯЮВСЩ. ГОСУДЙСШННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИЫШ М.В.ЖЖШОСОБЛ-j _ ■ Шыоттестй факультет--*-'' г'^Т-" "

"л-.:.к'.--' ■ ■ " г■/;':V '.".^^На"щрввах.ружописж . .■

■ л ^Цнгагзюв_Анат<«^Аттсоав»ет "Г"-"

м.Штатов..

' - ".'Г "■'- i

^..V' '■ ^ . УДК 57S.809.5I

.- .■ - ' f - W -■■'■л■

к. * '/У--

v" * "'сКТПОВЗИШ ГОСТА ®ОТОТРО«Ш Б4КГЕЯЙ В ПРОПУШЫХ^, ' ■ к- - устают В СВЯЗИ C HBTAKUDBMO« ВСЦЮОДА: - —

' • 'vT ■.■■"'< ..j"'" r v.- - '''.■.-i'-

^^у к^Г' 03.00.07 ^шофобяоюгхя) -г*" , : - v

- •-' ' .—s»".. - . ' ' Л -..'": * * ••' •' ' „ V " ' ' • • - j^'r;.:. •

'•'Ч. : ' • - - à в-т. о р .в. «врат" / - : - ,* * ».

-■Л:", -..-:- ' ^ ■: ... .......... ".i....... . - _. ■ ......■■ -

дкссертедга на ооиокавжв учВюЙ смпетж* ; *

кандидата биологических наук'

^ ■>■■ ■ .-.s :

. • -Л* Москва « 1964:

.... .л

',. Работа выполнена в лаборатории, метаболизма фототрофных иик-": роорганиэмов Института почвоведения и фотосинтеза АН СССР. •

НаучщД руководитель:1 каедвдат биологкческюснауи . . ' -

■ ' . ■". -"-'- :• ; - ' •~ И.Н.Гоготоо .,--•'•' -. • .. •';; V-:- Официальные оппоненты:" докторубиологических наук/;' - ^ . ',:.^В»М,Горленко

''1• "0.В »Родионов

- Ведунов ^тфевденио:'Институт биохимии и физиологии масро- '

- - ■•:Г|. Автореферат разослан */У -йе^и^Х ' 1964

Зашта'дисссртагпзг состоится'." /Р " 1964 г» -

в " часов на' заседании Специализированного'Совета." . . / . К 053 05 II в Московском .государственном университете им/ .; • . , Ы.В. Ломоносова .по,-защите ,'диссертшрй и- (трисуадению ученой степе-" ни каедадата биологических наук.

• , Отэьгаы на автореферат в двух экземпляра*'проси*! нштравяять";-: по, адресу; л 117234, Иосква," Ленинские горы,; МГУ, БиояогичесхнЙ фелульт9г,-СпециаляэировшоиД 'Сове» № 2/ ученоыу' с«1фетаро.^.-^ '\- :-^ С диссертацией иожно ознакомиться в; библиотеке Биологи*»- '. " V ■скоро факультета* псковского государственного университета* • •

, У«е>1ьй секротарь. Сс2^та № 2 . .. . ' -\ " "

каадидат-биодог^РС^.-^ртл^-Л;'- Л.И.Лебедева ■■г^'..*■".;

работали алгоритмы и составлены программы управления работой установки в режимах,периодического и непрерывного культивирования пурпурных, бактериа. На оснорв определения зависидасти скорости ! роста Rh.capsulata- от разных факторов среды и экономических коэффициентов использования некоторых субстратов устаяовленыус-ловия, обеспечивапцие высоки! выход биомассы, а также синтез V гидрогеназы инитрогеназы. Показано, »то биосинтез гцдрогеказы и китрогенаэы у Eiwcepc-Jiato происходит некоординироваиио. Установлено, что синтез гидрогеназы у нь.capsulata. в присутствии органических соединения снижается и регулируется, в основном, по т;шу рецрессии-д ©репрессии. Синтез и активность гидроге-нагы к нитрогенаэы вь.capsulata зависит также от концентрации кислорода в среде. Синтез татрогеназы возможен не только при росте Rh.capBUlata в условиях азотфиксащш» но h при лимитировании его , атакже в" присутствии ко^" ♦ .. '■;--.■

Практическая ценность работе. Наготовленная установка для управляемого непрерывного выращивания пурпурных бактерий может явиться основой для разработки управляемюс культиваторов разных фото тройных микроорганизмов при - юс практической применении;; Подобранные условия выращивания пурпурных бактерий используются в Институте почвоведения и фотосинтеза АН СССР для получения большого количества биомассы этих микроорганизмов с высоким содержанием гидрогенаэы, штрогеназы п НДД(Ф)-редуктаэ. Исследо- ; вание этюс ферментов ведется в ряде учреждений с цель» их практического использования» в частности, для разработки биохимического топливного элемента и" получения' молекулярного водорода в целях возобновления энергетических ресурсов. '■■*'-■■

Апробация работы. Основные ма^ериалы диссертации доккады- -вадись на всесоюзных Ваковских коллоквиумах по биологической фиксации азота (Чернигов,1900; Тбилиси,1983), конференции молодых ученых "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ"(Рига, I9ÖI), Всесоюзном совещании "Анаэробные микроор-; ганизмы" (Пущино, I9S2), Международном симпозиуме "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов* (Пущино, 1983).

Публикации! По материалам диссертации опубликовано 12 работ

Структура и объём работы.1 Диссертация состоит из введения, трех глав литературного обзора» главы объектов и методов исследо авкия,результатов и'ях обсуждения',вывода и списка цитируемой ли~ тературы. Работа содержит 151 страницу мршинописного текста,в: том числе 18 рисунков и Зйтаблици.Список литературы включает

•• .Ï : . v : •> ^ • • ; ¡ ; Г Г: • •".; ... ;.. . : /

' : .. . 187 йаименовадий работ. ;••'! У. * •• ' '' Л'- У^'УН-?'*-- -Í^-Ví ■■

- ■ , : Объекта и метода исследований. Огллк™» исследования про-- • -' ; водили. .С щгрпурной иесерноЯ бактерией RhôdcpeeudûBonea- capsulata ,

• А-штамм BIO, из коллекции чистых культур кафедры микробиологии ' ' / ■ ' - Иосковского го^дарттзе^ото у^ В ^равнитёлгьноы ¿uta-." > ...

; не некоторые опыты проводили с пурпурной серобактерией Thiócapsá Y : ■

* ' Московского -государственного университета й: цианобактёрией spiru- •'• 1 piatanata i. , полученной ' из института ВНИИ ' "Биотехника* .

В прокшленно выпускаемьос ферментерах для выращивания хемо-^ " '.'■■ "-'тройных микроорганизмов' невозшжно'гфоводйть^исс^едования то * "

\ ч>": «Ktltnnm. VU4lâUM»HtAA№i ' /inahA Vs h ПААВ Жа HU ьч ■ мХш »M J "

преицуществог перед имеющимися"; в нстей стране фермен-' • \.J_:-;¡ i.;* тергш для-культивироваюм^фототрЬфнис мотфоорганизыов заключает^;/ í .... ; ся в'том,.что• выращивание. фототрофных бактерий ' в' нем проводится ; -• .V - в тонком оеввцаемом слое,.причем условия.уверенности, гаэомас- . .' ■ сообмена й герметичности гозволяют''культявировать чистые культур ' •: ра не лимитлруяих рост;светоы, а;таете'гаэо6бразни№.с0едине-}. i• ';^ - : нкяыи, TaKvwM'KâK.HgV Kg ' • •:

-. -.;• " "''4 ; ; Ферментер освещается. двумя кварцево-галогенными лампами . ' ' '." ' охлаядаемыми отражателя»! ¿ набором; . i '

"■ ^l/^пилв Пт-.|* TTAUTVflTU^ Hïmcitlfin' ииТСи^ГЮиЛгЧ^к ГГ П П П Г*ТП f>rv» i ьд íT^nvAH— v ' '

' - фототвофных бактерий и сш*теэ1МИ ферментов было изготовлено ;. ; •-. .

.*.;•' две'установки для непрерывного'культивирования фототрофшх.мик-" . ■ -■K/í-v роорганиз1юв?.'В одной из них,''для управления процессом культиви-., ■. . рованид используются устройства! локальной .^то»жтикиЛпредстав-. ляющие'собой позиционные регуляторы, жестко регулирующие пара-'".' ;," ' . метры вокруг заданного значения. Установка'соброна на'основе у. ; : ; • шш^ата ^ AIt-ÍO-1 ^^э^томеяного; в^СКБ ЕП ; tó ,ОССР ;и поэ^ляет^/v; . . ; вести в контролируе-лдс условиях периодическое и непрерывное ,

', V •".-.'' культивирование. ; Непрерывное культивирование можно проводить как •. ' режиме хеиэстата, так.и■'турбидостатаЧ;- Л'ifй-JÍ-Yv

Рис. I. Схема фешентера вш кхрыиивагаи фототрофных. микро-" .

. ■ .г.;;>.. - организмов ■ ■ л-,. :

.1' - вертикальный прозрачный ишщдр; 2 - основание V, с теплообменником; 3 - крышка; 4 - магнитная цуфга;: , 5;- ведущий эал; б - канал дя подача газовой смеси; i : :7 - обратный клапан: 8 - отбойник пень; 9 - перемешг-

-í- вазцее устройство; 10 - герметические-дрокладки;. , : ^ ; И - отбойники струй. . vV^1-;:

' ,; Шла: изготовлена также установка для непрерывного рультввл-розяния фстотрофпше микроюргакпз^ав; в которой большинство функ-.

управления передано шжро-ЭШ I5BCM-S. Микуо-ЭБМ.Управляет " .c6opori данных, выполняет вычисления в реальном времени пря обработке дашшх и на этапе, принятия релснил. Установка (рис. 2) со- . еахмт.яз техаологлсческой: частивклшающей'ферментер "с источни-. каш света; дозаторы,;;баки со средой, субстратом, кислотой, щелочью, "урсжат*, регулятор скорости , вращешл сереыештавщего . устройства с двигателем, регулятор.температуру, .биофильтры, ро-, - j-таметры и друтие ьспомогат<чльяне устройства, а; такие устройства автоматического коюфоиь* я. управления цроцессоы культивирования. ■',■

' ' ■ Дия'работн о этой'установкой били вйработанн две основные программы, которые перекрнзалт достаточна большой вдапаэон стан-,-дартшп алгоритмов управления. Первая программа испольэ/етоя в {

Бак о .; 4 | • Бак,со Бак с '

ЩёЛ&ЧЬП : - V- кислотой- 1 средой субстрата»

_И_ с

Дозатор

Дозатор; V ■

Дозатор,:

Доватор•

Т

Газовн! смесятель-

; '. Дстчакя рН, г А) р0о,^®(еН,да[1

Елок-ИСПОЛНИ-,

тельных.реле . -

Бак с урожаем

Самопишущий: потенциометр ксп-4 .

Рис.-2.'Установка для непрерывного культивирования '•:• ','•'• >. : • . ^ фотот^^ых^гак^органиэиов» управляемая .;.'». * .

■ рехиые1 периодического. культивирования. Перед. началом работы ус- • г.- тановки в'машину вводятся.следующие данные: среднее значение- ■ < • " рН0, допустимое отклонение С , от среднего рН0 и данные,, необхо- . , -диные для калибровки:датчика оптической плотности. Датчик можно . ' •.

калибровать, как до начала эксперимента, так и: в' ходе его. В то- . ч^чашв .часа ЭВМ делает 15 измерений оптической плотности и столь-^ ' , .' яо .же раз корректирует.' рН внузри "ферментера," вкл^&я'дозаторы,'.>, ? ■ ¡■■V подающие кислоту «ли щелочь в ферментер если. значение рН вшло -',- -. . за допустимые границы. На основании экспериментальных данных вън- ' числяется удельная скорость изменения оптической плотности,'ко- < торая обычно равна'скорости роста культуры. В конце часа произ- ; . 1 /водится запись основных.параметров н'а «агнит^ю лен"у и микро- ; ЭВМ возвращается в цикл измерения. . >.. .. ^-':■-'''■-■

- . При непрерывном культивировании используется вторая программа, при работе с которой в машину дополнительно вводятся -времена работы насосов, дозирующих титр анты, субстрат и минеральной фон,.а.также поддергивается оптическая плотность. Цикл измерения и регулирования температуры, еН, рЗ, оптической плотности - I минута. Каддьй час микро-ЭШ эьдиснзает на магнитную ленту основные параметры культивирования. Данная программа тз--воляет в момент времени, опредеденньЯ экспериментатором, изменить режим и условия культивирования, В момент времени, указанная экспериментатором в самом начале опыта, машина изменяет эе-данньз значения рН0, оптической плотности и времена работы насосов-дозаторов. .Благодаря этой операции установка может без участия экспериментатора осуществить перзход с турбндостатного на : хемостатньД режим культивирования, изменить рН срегы, концентра цип'интересующего субстрата или произвести любую комбинацию из этих изменения. Описаннае выше две программы объединяются в од. НУ» когда необходим автоматический переход из периодической культуры в непрерывную.

... Для культивирования Юю<1ора ей йопопа а сарэа1а1а использовали среду Ормеруда (Огтегоа еЪ а1., 1961). В периодическом режй-мэ в среда добавляли органлческое соединение (лактат, малат, га:-руват, ацетат или сукцинат) в такой, концентрации (0^2%), чтобы ехч> исчерпание вызывало переход культуры в стационарную фазу. При внращквании КЬ. сараи1а1а". в непрерывных условиях использовали турбидостатный режим при изучении зависимости скорости рос-■ та от рр2» рН, температуры,- интенсивности света, содержания и хемостатнШ режим с лимитированием разными субстратами - в остальных.случаях.' Лимитирование достигали уменьшением содержания соответствующего субстрата в подаваемой среде. Обычно нь.сарви-выразцивали при'рН7,0 , 30°С, интенсивности све<та 200* 10" : зрг*см .сек**. ■'.■■->' .'■,;'■ -

ТЫ о с аре а гс и е ор е гя icl.na выращивали в режиме хемостата с лимитированием тиосульфатом на видоизмененной срзде Пфеннига (Во го ров, 1974) при 28°С И рН 7,0. Зр1гиИла р1а1;епв1в культиви ровалИ в .режиме турбидоотата на среде Кратца ( Кга*;а, Цувгв, 1955) при интенсивности света 30*10 эрг*см"*»сеи""*, 35°С и рН 7,0. - ^■:.;;' -.:.

Гюдрогелазную активность клеток по ввдеяенип Н^ из восстановленного метклвиологена определяли методом газовой хроматогра фии (Гоготов и др., 1974), а по поглощению водорода - спектрофо тометрическьм методом по реакции восстановления бенэилвиодогена

■ - викх зависит от парциального давления^ растворенного; кислорода V (р02) • С наиболее высокой скоростью культуры растут при рО^ очо-' : до 0,001 атм.;Увеличение р0£ до 0,063 атм приводит к четырех-■ крашоцр снижению скорости роста. Отсюда можно заключить, ■ что :

. НП.сараи1ага . как и КЪ.ас1аорЬ11а ( 31е>£вгк, ПигиШв, 1979) . ' ■ О. относится к мякроаэрофилам. ■'."'; ч-..'-'1-■ -■'■1

^ Для управления непрерывным культивированием шкрооргакиз- ~

. нов'в оптимальном режиме необходимо знание,экономических коэффи— - циентовто использование разных субстратов. Поэтхиу нами были . измерены при росте кь.сарвга^а >: -в фотогетеротрофных условиях ■ экономические коэффициенты'использования; клетками '¿адата',' лаята- > та, Н2, НН4+Бги Р043~ (табл. 2). ^■7'7;'7■ ^ " ." . ■7■ ".•'•• '. ,• . -. Таблица 2,

; . Экономические коэффициенты поиепользоваштонекоторшс ' субстратов при фототрофном росте 11Ь.сервиса -

Субстрат

Режим куаьтивированик .

•■}■'-■■-у- '-""Г1- .■■■'■■*; j биомассы* субстра-

-п'7 ; -• 7.7.; 7—j,-.V.

та

- Малат. : периодический . . ' ; ' Н0±20

.. Лактат -■■ хемостат с лимитированием по лак- '•• . • '

' V ■ ■ • - тату - ;■,;■>:■;>.'.■■■■ - ■ б0-71л •• •

■ Н2 • турбидостат . 77 ■ :■ 7+0,7 7

• шг4 + .хемостат с лимитированием по' Ш4+ . 90^60** ' ; ! д 7- - Hg' - хемостат с лимитированием по к, 7:.- 90V30 v.,-: 1

; 7 - хемостат с лимитированием ш Р043~ 1300+100. • :

- . ^Зависит от условия выращивания. v777a-.-:7:77.";V

. : • Исследование влияния условий культивирования на экономичен ' . ские коэффи^енты использования ладтата и аммония показало, что • , ':: •. при росте Hb.capsulata на свету в режиме хемостата с лимитиро-••' ванием лактатом с увеличением скорости протока экономический коэффициент его использования снижается. Это указывает : ^ на менее зффектявте использование лактата с повдаением скорости 7;, ■ роста. Как и у Rh.'.capsulata KBI(Cpbel, 1978 ) , при росте Kh.'. ' . ;

v>. capsulata BIO в условиях азотфиксацииГ лак?ата несколько ниже, -L'чем при использовании ®н4+ . Дополнительный расход электронов

, на азотфиксацшо» по-видишцу,. (фиводит к. менее эффективному ис-■:'. ' ' V-,':1'' пользовании лактата. При ощюделенпи максимальней производитель— -*' нос-си в случае ьырйчиввния ЕЬ.сзреиХага 'кошентрации лактата и > а»аюния в ферментере подд«ришахи постоянной. Из полученных дан- , л

; ных (табл. 3) ввдно, что при стационарной хондентрации клеток *; висе 300 мг/л скорость -роста культуры начинает, снижаться. В втихх... ■ - условиях щюцесс ведется технически в режиме турбидостата» а фак- > У У Этически' он эдег врежимв хедагтата с лимитированием светом. По. -этоцу и вроизводительность установки: возрастает не прямо проюрци- ; онально увеличенив стационарно» концентраоии клеток.-Достигнув ; -^цэ^свдума^пря стационарной концентрации,клеток 1350'иг/л она на- 1 ."-•> пинает снижаться. О-ч ."'-^Ч Ул" '•'.'.••• * \ '•'.'•'■'"•"'.'У

г./*;''•• •• • V ' ; ''* •'/'•V '-V-. Таблица ЗЛ'/'--•'"

У -ч1.:.Пртиэводи^ьность установки при выращивании ЯЬ.са1>виХа*в ^ >; .'• ... : ■ в режиме турбидостата и разных стационарных концентра- » : . ■'■■■■ * циях; 'клеток1 в.ферьгентереУ ? ] ЧР1;' ^ ^Ьй^ЧУ ''..-'

: '-''¡-й; Поддерживаемая ¡Концентрация 1 Скорость {Производительность уста: • оптическая г, ¡клеток в Фе&- »роста, товки, г. сухой биомассы

¿У'"...... | I ■ —1 | ■-— | " 1— | | 1 . ■■ ... I I I .....

." 155:;,:/^:;0»212';- Ч ";0,033 V.. •;.. : 1 ,

■' V 1.0-У'':^';..'310 •*..'•'Л- 0,210- 'V -Дч; ' > , / ...

. ^^'.^О'-—:- 650 "/Й '.У 0,180 ~ ;:' >; • 0,117 "с... ' 1 '■

.••V, :/у-¡1350 "^СОДМ.'••/.•'• " ' ' 0,162 'У' '

У Г 5,0 V V г ^ : ^ 1720 - х' 0,092 0,1581 •

.чУ^•^;б;оУ;У;д.г';':2ооо.у .^ : 0,076уго,152/'>';:.. . ; •■Примечание. Выращивание 'проводили при интенсивности4 света':' ■ ' 200«10?.- врг.см"^.сек~^, л -.. _ • -у. .-у Д ;•.

■V ; ( Таким «браэом. п^ установки 0,162 г сухой . .. ..

• . биомассы ♦л~*«час является максимальной для слоя толп^тоР .

■''"У У 20 »ем при вырагтгаании кь;сервиса." на сраде с лактатом и кн^*. '

. при рй 7,0 и температуре 30°С. Дальнейший рост производительное- 1; "

_ ...• ти устаногки • ограничен интенсивностью света./Дяя к.гцЪг>ыгпри ¿V;, д '; готтенсивности света 400'10** эрг-смТ^-сек^/ишсс^

дигельность достиг ала' 0,25г; сухой,' биомассы* л" ^ гчасТ ; { гиггег, ?

, У ; Влитше условий•Е1фащв'шшя>на мот^близм водо)рода :

4 к. и азотфиксирутесую". способность .-пурпурных бактерий^.: ■

:-

' . : При в1ф8д^вании>Ш1'.сорви1в^а'св периодическом режиме;н

' срёдах - с р^щлм"' органическиш {субстрата^;: ^ актив-; .;;' .'

' .:--Vкость;^еток>.^ествё1шо У ависитмзт "фазн « роста' куль тур

■■ ■ ■ ;

■■ ■ . ■.. ■ V. ■ -. ■ ' ■■

. V :■ ......

•'■ '•'-••-•.■: ■■■ L;-> ■■"''-',■.'' \ ' ' Таблица 4

Гидрогеназная активность Eh.capsulata' в зависимости - от фазы роста культур и характера соединений углерода "-

. ■-'■ ¡Середина экспоненциальной ! Начало стационарной

Источник | фазы' ■ ■ ' 1 ' Фазы • •' _

углерода 1ВьщвЛ€ЯЯв Hg ¡поглощение f^ выделение Hg {поглощение

t 1 • ■ ' ! ■ ' » ■ - • ■ t 2

Ацетат 0,6 ■ 15 1,3 ." 50

Лактат 0,3 5 0,7 10

Пируэат 1,6 СО ив опр. 100

Малат 1,5 70 6,0 450

Сукцииат 0,6 30 3,3 38

Сна минк-хальна в середине экспонендаальной ,фазы и значительно возрастает в начале стационарной фазы роста культур, когда органический-субстрат полностью потребляется. Гидрогеназная активность Wi.capsuiata зависит и оУ природы органических субстратов, имеющихся в среде. Наименьшей гидрогенязной активностью обладали клетки из экспоненциальной фазы роста культур на среде с лактатом. Независимо от используемого субстрата и фазы роста культур, активность гидрогеназы, измеряемая по поглощению HgV была всегда вше, чем по выделении водорода. Таким образом, про- . веденные исследования подтверждают, что Rh.capsulata 'синтезирует гидрогенгзу, основная функция которой, по-видимоцу, состоит в поглощении, а не ввделенки водорода. Гидрогеназная активность клеток Rh. ccpeulata , выросших в фотогетеротрофных условиях,1 независимо от фазы роста, и используемого органического соединения, всегда ниже, чем у;клеток, выросших в фотоавтотрофных уело—-,виях в присутствии Н^ и 1055 COg. При выращивании культур в фотоавто трофных условиях в реяопгз турбидостата с увеличением концентрации Hg 9 газовой фазе до IOit гидрогеназная активность воэрас- ■ тает до 6С0 нмоль»мин~*.мг~* белка. Дальнейшее увеличение содержания Н2 не влияет на гидрогеназную активность клеток.

Длл проверки действия органических соединений и Hg на син-.тез гцдрогеназы клетки Kh.capaulata , выросшие на средах с лак-, татом и малатом, чнкубировали на свету в среде без/органического соединения. После 1-2 часов инкубации гидрогеназная активность клеток, выросших на среде с лахтатсм или манатом;; начинала уве- ' личизаться; В присутствии Hg гидрогеназная активность начинает возрастать уже;через Э0-60 мин ».достигаем больших значений.чем .

■Rh.aeidophila (siefert, Pfennig,-1979). Культуры, выросшие в'режиме хеыостата (D ■ С,03 час'*) с лимитированием аммонием, при предельно низксу парциальном давлении кислорода (0,001 атм) обладают более высокой нитрогеназноЗ активностью, измеренной по ре-': ' акции вое становления-ацетилена на свету в анаэробных условиях ■■.' (табл. 5)7 При увеличении pOg до 0,021 атм нитрогенааная актив- ; ность снижалась в —50 раз. Клетки, ььфосшие в этиг условиях, проявляли способность восстанавливать ацетилен и в темноте в присутствии кислорода (тебл.Б). Скорость образования этилена в тем--ноте также зависит от концентрации кислорода'в',, реакционном сосудике» Но даже при содёрташт 02 в газовой фазе 5-JC&," обеспечивав : пМ1*сацую высокую"активность этого фермента, она достигает нэ более 5-б^ от таковой, наблюдаемой у этих же клеток в анаэробных условиях на свету. Это, вероятно, обусловлено недостатком'энергии, необходимой для обеспечения процесса аэотфяксации в темноте;;

■.'■■■■ V;V~-4.- '- -V-vV■ У.' ' .Таблица 5

Нитрогенаэная активность клеток Rh.capauiota , вкроссих • в темноте в рьжиме хемсстата и лимитировании, по ■■'., '"-при равных' значениях pOg '

р02, атм* j Образование C^

{ анаэробно, свет ] аэробно," темнота'**

o,ooi+o,ooo6 w:—:-■'-^ч--. 190 - 6,9

0,006^3,001 . 22';; 'е.;

С,021+0,001 V.;'. :: ;'!;следы':,..

^Значения р02» при которых выращиьалч клетки •;■:;'.-:

**Иэморения проводили при добавлении в газовую фазу 655 0£.

.л ■ Таким образом, синтез гидрогеназы и нитрогенаиы у ЕЪ.сар- ! чувствителен к 0^ и происходит лишь при;низ;.0м его содержании. Проладение активности этих ферментов также зависит от рОд. . Особенно чувствительна к ькслороду нитрогенаэа. '

Как и у других, аэотфжеаторо в (Кондратьева, Гоготов, 1931) ;' синтез нитрогеназы у Ш1.сарэи1а^е пидавляется аммонием. Однако, , при наличии И14+в средА в лимитирущих рост концентрациях (<■60.; мкМ), синтез нитрогеназы дсропрессируется. Чем глубже степэнь лимитирования роста культуры ии^" ; тем активнее происхо- ■ 4 дит с:штеа нитрогеназы. Но наиболее высокая ни^рогенаэная актив-

7-7-7 . :>-"':77-;-;г"> 7 7-Л77 . .

.. - •, ность наолццалась у клег ов,г выросопи в условиях лимитирования мо-; Ч-'лекулярным.дзотом^табд^б).' Интересно отметить',7что:синтез нит-7 -. рогенаэы у яь.сарвиаага не репрессируется нитратом, а в услови-

; -вашот по аммония, при изменении темпера1уры или рН культивирова-"' гяЧния витрогенаэная активность,- измереш!ая.методами шгетилйнредук- ;-"^ • : . ци11 и повыделению Н<> в процессе роста изменяются в основном ; ' • .-

- 'гтпт1лпнилыатг*.«г1 :' г1 гтпйг^п №т "пп1|1|т|г ' ытммнвшк 'й

7 'сорцконально. С уменьшением рИ ниже.6,7,или увеличением выпе 7,4; 7-7'7 скорость гббразовЕНия'С^д; падает'более, *;чен в 20 раз, тогда'как 7 ; 7 о выделение Н./ уменьшается' лишь*: в два-три раза. Возможно это. свя-_ 7~. 7:7;7;зано" с : тем, что,нигрогеназа№. сареи1а1аг 1л ; у1уо7. ,'> как! и очищен- /.. ' '77'4 ^ НЙ! фермент ■ у1па!аш?117 ( Нагвыап /; Вщт1з, у:19&о) ,\ избиратель- V ' 7; 7

.•.' ;;*7"- "77*:•.•ИЬ. сарои1^а »;выросшими'В разных условиях V: 7- 7.-

7.'. Хеиостат с лимитированием; к: ; -

р-'0,097 час'1/м^>';',б^07::.7Г;7":'-3507^ Г: .7"- :7..'

Г;:47 По некоторым данным;регуляция. синтеза' нигрогеназ'ыи гидро-.. , ' -

.геназы у; отдельных; азотфиксирущюс шкрооргаш!5шв Jo'cyщecтвля- r7í:y:' 7' ,; этся воордшшрованно'. ( ег^Ь" Кепи!*;; М980{7 ВегНег,*; I, ,7'

' ,.1980) ;.Одаахо полученные наш данные;свидетельствуют:о. том,-.'что ..7..; *, синтез этих'ферментов"у нь.сараи1а1ахлроисходитнеэавмсимо.' Это-?» ;-

■__1____- '' :-п ' ' '' ^^ :_;_- ...__и.; и^ш^тчдич . т» ' ' ■-

ococcun (Partrldce et al., 1980). Таким образом, регуляция син-■ теза гидрэгенаэы у,Rb.capsulata происходит опосредованно через водород, образуемы;! при действии нитрогеназы.

Нитрогеназа катализирует выделение Н2 у пурпурных бактерий. Образование водорода куль1^а1мк Ito.ca^sulata^^

.венноэависит от условий их выращвания (табл. 7). Наиболее ак-. л 1 тивнА ввдезюние Hg, 'катализируемое нитрогеназой Rh.capeuiata

происходит культурой, растущей в отсутствие молекулярного азота. Близкое значение (260 мл'час г сухой биомассы) скорости образования Hg этой же бактерией получено другими авторами (Jouan-; neau et al., 1982). В условиях лимитирования роста R.rutrun : аммонием максимальнаяскорость образования Нр Досткгала160 . мл»час~*т~* сухой биомассы (Zurrez, Bachofen, 19Q2).

■ ■„' v■.>.-■'.■' \ ■''' г И" Таблица.7' Скорости образования молекулярного водорода культурами ;.'■'■' -Rh.capsulata , растущими в разных условиях

' • ~ {образование Нр,

Условия выращивания '■'■:■•■■■■■" ,мз»час-1^г~1

• • ,-.... .■■.'..■ {сухой биомассы

Хемостат с лимитированием лактатом (~'1С0 мзМ) 2 '

■ ■ на свету в присутствии н2, D ■ 0,165 час" ж Хемостат с лимитированием Ь'г(0,4^ лактата) '

на свету, D > 0,071 час"1 * ■■: 75

Турбвдостат с использованном н2(0лактата) ■ : на свету, D» 0,192 час-1 ' • •.:''' 90

Хемостпт с лимитированием • ен4+(0,4& лактата) '>■

.на свету, » 0,030 час"1 300 .

. .Таким образом, для получения Hg с помощью пурпурных бактерия, согласно нашим данным, целесообразно использовать культуры ' Kh.copaulata t растущие в непрерывных анаэробны* фотогетеротрсф-чых условиях с.лимитированием аммонием. В этих условиях можот > - , ■ быть.также получена и биомасса, богатая белком.' « ! • • . '

. г '.г.:;'.'-:; I.; Собраны две установки для непрерывного культивирования- " .■■■'. > фототрофных мивгоорганкзшв, одна из ' которых имзет.. систему уп-:равления па основе микро-ЭВМ I5BCM-S. Составлены программы, уп-равлтощие работой этой установки в периодическом и непрерывном

•V ■ ч ■режимах. • У" ■ ■■"1 ■'\ ■■"'■■ ' ■: Г.; ■ ^ /■ - ■■ ■ t

■ '•'■vA' '{w 2. условиях негрертвяогс 1^дьтивирс>8вчия определены сяо- . "■■ • рость роста неэффективность использования некоторые субстратов . (малата, лактата.аымония, Bg и Н^фосфатов) цурпурноя несер* ной бактерией-ithodopacudoraonas capoùlata в зависимости от раз- • •• : ' ных факторов среды. • Отделены также оптимальные условья для

• синтеза гиетюгатэы и гопрогеназы &тоЯ бактерие"!.' ' . - -у. .

" ■ ' 3; Синтзз гидрэгеназа Rh.copeuiete'регулируется, в основ- '..'.'• .ном» цутем репрессии-дерепресски. Деретфессия синтеза этого фер-

• ^мента'лрэиетодит в' отсутствие 'органических'вместе или при киз-.: • --■:> кой их концентрации/. .: / • ' . . •••'.'••••-.'.¡. = •'•.'• :

, ■ V-- 4. Наличие молехул-трного водорода.i;e обязательно для синте- ? ; sa гидрогеназы, однако в его присутствии е§ уровень в клетках • ;• возрастает. Наиболее высокой гедрогеназной активностью обладают клетки, выросшие при освещении в ¿иксотрофкых анаэробных уело- ¡'-^ виях в цр'исутствии" ттих концентраций лактата и Hg. • v-?;-~. 5.'Наибольшей нитрогеназной активность» обладают клетки дь. .' capsuiato, выросшие в анаэробны* фототрефных условиях в режиме, хемэстата с лимитированием молекулярным азотом. . : : " '•••.• • * б. . При ростч: Riuoapsuiata в режиме хемостата на' среде, с ■'■:■■

- лактагом и ликитирозанкем по аммони» нитрогеназа активно катали-: . зкрует'обраэование клетками молекулярного водорода. ; Скорость Vv : 'его выделения достигает 300 мл,час~1.г*1 сухой биомассы. ; .

.,.-'■ . 7, На основании проведенных исследований даются-; реяоменда-'... ' , . дай по вкрал^ванио Kh.oapsulataобеспечивалчие высокий выход • . 7 ' биомассы,' богатой белком, обладащей.вьгсокой-^идрогеназноЯ и V :

■ нитрогеназноЛ. активкостлми, а также получения с помощью этой"- . '..■."■ бактерии молекулярного водорода.: ' Vv '.•

- По ^териалам диссерта1^и!опубл$1кованы'слздуюа(ио работы:-!

I. Цуганков А.А., Гоготов И.Н. Непрерывноэ культивирование фото- ' ■ ^ трофных бактерий-:.- Пр^кл.'; биохим. микроб иол.,, 1979, т.. 15, - .

^ ; 2. Казанцев А.П., йыганков А.А. Усте^вка для непрерывного куль' тивирования фототрофных микрооргштазиов с системой автомата- . • »

культивирования микроорганизмов. ОНШ ШЗЙ!. Пущино,- 1980». ' • - е.: 16-21. •.••••..-. • ■ л- .-••.-•. .•••• ■

•3. Цыганков А.А. :Вльянив условна 1^льтивирования на рос* и ак- : ., ."*■- " тивность ферментов, участвутацих в мотаоолизме водорода у Rho- ; ■ dopseudomoiias capeiiieta.. B cd. : Цикооосганиэмы - продуценты;-:'

- ¿.Цыганков А.А.уПавлова Е,А.,Гоготов И.Н. Активность некого-' рых ферментов, участвующих в метаболизме Н¡, у itbodopseudo-":.;;■ ■ шопп» capsulata в зависимости от условия "роста культур. - -: . - Микробиология, I9Ö2, т. 51, » 2, et 183-193; --ч-

Б. Цыганков A.A., Гоготов И.Н. Влияние температуры и pH-среда > на нитрогеназну» и гидрогеназну» активности у Rhodopeeudomo-■ ■ 7-у "г-nas capsulata при азотфиксацин. - Микробиология, 1902, т.51,.

6. Цыганкев^^А^^Якунин А.Ф., Гоготов И.П. Гидрогеназная актив-'

>бные^микроорганизмы, Тезисы;".

....... . .. Цыганков A.A. Образование Bg'; фото-'"■■"■

_ .....хпфоорганизыами ибиокаталитическикисистем&ми. -

.В со.: Тезисы докл.-Всес, конф. "Фотокаталитичгское преобра- • -V аовалие солнечной энергии", 1903. Новосибирск, с. 15-17; ;-,'\s' -9. Гоготов И.Н., Якун1л А.Ф., Ць^штов А.А. Регуляц.« синтеза ■>", ■ • гкдрогеназы, ндтрогенаэы и фероедоксинов -ihodopseudononaa ...*, — . . capsulata , - Тезисы докладов симпозиума ФЭ«Ю "Регуляция мик-• ровного метаболизма факторами ■ внешней cpo>o*V 1983.- Пуцино, • • ".--.Л •;•' : бНГИ НЦБИ. с. 94. Л , ч,", • • .v-.-; . -ч .-,>.—.- •

•10. Цыганков А.А^, Гоготов И.H,'Взаимосвязь между гидрогенаэой и "т: ^ — нитрогеназой: решенные и нерешенные вопросы .-В. кн.: Биологическая фиксация'молекулярного,азота. Материалы У1 Всес. Ба- • :■ ■■■■■ - ховспого коллоквиума, 1983. Киее; Наукова думка, с.217-219, ■ . II. Цыганков A.A.. Якунин А.®., Гоготов И.Н. Вдаинив тО«'на рост,- --z s' -...< '„--,; ■ гидрогеназну» и нитрогеназную активности'клеток Efio&paaudo-^ . aaoMs capsulata и -/zotobooter -vir.alat»dil . - Микробиология, - ■ •

-Г 1983, t.-52,.»4, с. 543-547. -;,;• • . .. •;.. . • • ,. .. — • 12. Цет-анхов"A.A., Гоготов И.Н.', Кондратьева E.H. Рост к синтез

. • •. гидрогенаоь', Rhodopseudowones capeulata '• при непрерывном - "г. •-•--- V, -культивировании. -.Микробиология,: 1964,'т. 53, JP 3;- - v

Д-64512 14;05.84' г.'' 5ак.538ЭРТйР.125 8кэ. Уч.гэд.л.-Т.О 1 " ' . Отпечатано на ротаарквте в 0Н1И НЦБИ ; '-•'. '; • . ••