Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние окиси углерода на энергетический статус Desulfovibrio desulfuricans B-1388

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние окиси углерода на энергетический статус Desulfovibrio desulfuricans B-1388"

«с ^

\ На правах рукописи

МИТЯШИНА Светлана Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ОКИСИ УГЛЕРОДА НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ СТАТУС БЕ8иЬРОУ1ВШО ВЕЗиЬГСЛНСА^ В-1388

03.00.07 — микробиология 03.00.04 — биохимия

А вт ореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

//

.»V

КАЗАНЬ— 1998

Работа выполнена в Казанском институте биологии КНЦ РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник М.Н. Давыдова

Официальные оппоненты: доктор биологических наух,

профессор, Наумова Р.П. (КГУ, г.Казань), доктор биологических наук, профессор, Звягильская P.A. (Институт биохимии РАН, г.Москва)

Ведущая организация: Институт экологии природных систем АНТ,

г. Казань

Защит а диссертации состоится 1998 г. в / ^ часов на

заседании диссертационного Совета К 053.29.19. при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420048, ( .Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского I осударственного университета

Автореферат разослан

У/

» {¿¿/¿¿Я 1998

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандмда! биологических на\к ./ А.II. Аскарова

Г/ л А < ' ••

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Загрязнение воздушного бассейна отходами химических, нефтехимических и металлургических предприятий ставит серьезные экологические проблемы. По существующим оценкам суммарный выброс окиси углерода в атмосферу составляет 1,4 • 109 тонн/год (Williams, et al, 1987). . СО является сильным дыхательным ядом, блокирующим терминальный участок дыхательной цепи у организмов различных уровней организации. Вместе с тем, известны микроорганизмы, окисляющие СО при использовании кислорода в качестве акцептора электронов (Cypionka, Meyer. 1983, Diekert, 1986, Волова, 1988).

Среди анаэробов способность расти в атмосфере СО обнаружена у представителей метаногенньгх, ацетогенных, фототрофных и сульфатредуцируюгцих бактерий (Daniels, et al., 1977, Diekert, et al., 1978. Davidova et al., 1994). Последние благодаря высокой метаболической изменчивости и строгой регуляции обменных процессов привлекают все большее внимание ученых. Биохимической основой устойчивости этой группы бактерий к окиси углерода является наличие у них активной СО-дегндрогеназы, а также гидрогеназ, различающихся по своей чувствительности к СО (Berlier et al., 1987, Diekert, 1994).

Сульфатредуцирующие бактерии обладают сложной энергозапасающей системой: у них обнаружены цитохромы с-типа, а также явление электрон-транспортного фосфорилирования, сопряженное с окислением органических субстратов и молекулярного водорода, получены доказательства существования обратимой АТФ-азы, а также данные о том, что цитсплазматическая мембрана функционирует по хемиосмотическому принципу (Peck, Lissolo, 1988). Однако в литературе отсутствуют данные о влиянии окиси углерода на энергетический обмен этих бактерий.

Принцип биохимического единства позволяет на примере микроорганизмов изучать основные особенности ответной реакции живой клетки на воздействие ингибиторов, которые в низких концентрациях являются наиболее эффективными регуляторами метаболизма (Звягильская. 1978, 1981). Сульфатредуцирующие бактерии могут явиться удобной моделью для выяснения механизмов устойчивости к окиси углерода, а изучение особенностей энергетического обмена в атмосфере СО позволит выявить тонкие механизмы регуляции внутриклеточных процессов, направленных на сохранение жизнеспособности.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение влияния окиси углерода на энергетический стагус бактерий штамма О.скзиИипсаш В-1388. В соответствии с основной целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить основные параметры роста бактерий О.скзи^ипсаш В-1388 на лактатно-сульфатной среде в атмосфере 100%Аг или смеси: 5%СО+95%Аг.

2. Исследовать влияние окиси углерода на энергетические параметры и нуклеотидчый фонд клеток.

3. Исследовать влияние окиси углерода на цитохромный состав клеток.

4. Изучить устойчивость О.скзи^ипсапб В-1388 к окиси углерода в зависимости от исходного энергетического статуса клеток.

Научная новизна

Установлено, что введение окиси углерода в концентрации 5% в аргоновую газовую фазу культуры О.скзиНипсапз В-1388, растущей на лактатно-сульфатной среде, вызывает у бактерий состояние

неспецифического стресса и приводит к увеличению энергетических затрат на поддержание жизнедеятельности.

Изучен нуклеотидный состав сульфатредуцирутощих бакгерий штамма ОеэиИстЬгю с1«и1Гипсапь В-1388. Показано, что внутриклеточное содержание пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, а также восстановленных никотинамидадениндинуклеотидов зависит от фазы роста бактерий и условий культивирования.

Впервые установлено, что основной ответной реакцией

сульфатредуцирующих бактерий на культивирование в присутствии окиси углерода является образование в клетках избытка восстановленных пиридиннуклеотидов (НАД(Ф)Н) и увеличение продукции цитохромов с-типа.

Показано, что устойчивость О.йезиИипсапБ В-1388 к окиси углерода в значительной степени определяется энергетическим зарядом аденилатной системы, выполняющим регуляторную функцию в метаболизме бактерий. Наблюдаемые изменения являются частью адаптационных процессов, происходящих в клетках в атмосфере дыхательного яда и направленных на сохранение жизнеспособности. Научно-практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления о механизмах устойчивости сульфатредуцирующих бакгерий к действию стрессоров и могут быть использованы при разработке оптимальных условий их культивирования с целью окисления/восстановления окиси углерода в практике.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на 17 конференции молодых ученых биофака МГУ (Москва, 1986). Республиканской конференции молодых ученых-химиков (Таллин, 1987), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989), на 6 научной конференции молодых ученых КИБ (Казань, 1990), на конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1990), итоговых научных конференциях КИБ РАН (Казань, 1993,1995,1996), Международной конференции Европейских стран "ЕВЕС96" (Бельгия, 1996), на 2 съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на 11 Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 1998г). Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 статей и 10 тезисов. Структура диссертации

Диссертация, изложенная на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 10 таблицами. Список литературы содержит 213 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследований служила сульфатредуцирующая бактерия - штамм ОеБиНоуШпо ёезиИтшсапБ В-1388, полученный из коллекции культур Института микробиологии РАН. Для культивирования бактерий использовали среду Постгейта В (Роз1да1е, 1966), без дрожжевого экстракта. При изучении влияния энергетического заряда клеток на их устойчивость к СО бактерии культивировали на среде Постгейта В в трех вариантах: 1 - среде, содержащей 30 мМ лактата, 2 - среде Постгейта В, содержащей 15 мМ лактата, 3 - полной среде с 30 мМ лактата и дрожжевым экстрактом. Дрожжевой экстракт использовали в виде 10%-ного раствора, стерилизовали при 0,5 атм. и вносили в среду до конечной концентрации 1 г/л. Бактерии выращивали в анаэробных условиях при 30 С.

Содержание белка в клетках определяли по модифицированному методу Лоури (Горина, Яковлева, 1980). Анализ газовой фазы проводили на хроматографе "Газохром 3101". Для определения кислоторастворимых нуклеотидов клетки предварительно фиксировали 4Ы НСЮд, для восстановленных пиридиннуклеотидов применяли ЗN КОН. Анализ нуклеотидного фонда клего'к осуществляли методом ВЭЖХ. разделение нуклеотидов проводили на колонке "Силасорб БРН С^" (Корнилова и др.,

5

1988). Энергетический заряд рассчитывали по общепринятой формуле (Раоотнова, Позмогова, 1979). Количество H2S определяли колориметрическим методом, модифицированным для микроколичеств (Truper, 1964). Цитохромный состав клеток в опытах с суспензиями и клеточными экстрактами анализировали методом дифференциальной спектрофотометрии. Содержание цитохрома с определяли по методу Лисенковой и Моховой (Лисенкова Мохова, 1964). Ацетат в культуральной жидкости анализировали методом газо-жидкостной хроматографии на приборе "Chrom 5", лактат определяли по стандартному методу с использованием "Test-Combination Lactate fully enzymatic", |4С-лактат определяли в ЖС-1 на счетчике радиоактивности "Delta-ЗОО ". Эффективность счета составляла 80%. Экономический и энергетический коэффициенты рассчитывали по стандартному методу (Перт Д., 1978).

Полученные экспериментальные данные обрабатывались на IBM PC методом сплайнов в сочетании с методом наименьших квадратов с использованием пакета программ Microsoft Grapher Golden Software, 1988, a также Origin 4,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Энергетические и ростовые параметры клеток штамма D.desulfuricans В-1388, культивируемых на лактатно-сульфатной среде в атмосфере 100% Аг или смеси: 5% СО + 95% Аг

Среди анаэробов способность расти в присутствии окиси углерода обнаружена у представителей метаногенных, ацетогенных, фототрофных и сульфатредуцирующих бактерий (Daniels et al., 1977, Diekert, Thauer, 197S, Davidova et al., 1994).

В ряде работ было показано, что бактерии D.desulfuricans В-1388 используют окись углерода в процессах метаболизма. Рост в атмосфере 3-20% СО наблюдался только в присутствии органического вещества. Основная часть окиси углерода использовалась как субстрат катаболизма и только незначительное ее количество включалось в биомассу бактерий (Мухитова с соавт., 1983, Карпилова, 1983, Золотухина с соавт., 1987).

В настоящей работе влияние окиси углерода на рост и биоэнергетику D.desulfuricans В-1388 изучали, используя среду Постгейта В, содержащую лактат кальция в качестве донора электронов. Проведенные исследования показали, что присутствие окиси углерода в газовой фазе (5%) при культивировании D.desulfuricans В-1388 не приводит к гибели клеток. Вместе с тем, под влиянием окиси углерода наблюдается замедление роста, которое проявляется в увеличении длительности лаг-фазы в 1,5 раза, снижении скорости роста (Тарасова. 1990). некотором уменьшении количества

6

синтезируемого белка по сравнению с соответствующими показателями контрольного варианта (рис.1, 2).

Рис. 1 Общий клеточный белок (I), сероводород (2), С02 (3) при

культивировании О^езиМипсапБ В-1388 на среде Постгейта В в атмосфере 100%Аг

Рис.2 Общий клеточный белок (1). сероводород (2), С02 (3), СО (4) при культивировании О.ёеБиШтсаш В-1388 на среде Постгейта В в атмосфере 5%СО+95%Аг

Время культивирования, ч

Потребление лактата происходит, в основном, в лаг-фазе и начальной экспоненциальной фазе роста. Такой же характер поглощения лактата описан

7

Pankhania с соавт. (Pankhania et al., 1986) для D.vulgaris (Hildenborough). Пру введении в газовую фазу 5% СО интенсивность потребления лактат. снижается, а его полное поглощение из среды отмечается лишь к 60 час) культивирования. Однако при этом не происходит пропорционального рост} снижения скорости потребления исходного субстрата, в результате чеп падает величина экономического коэффициента (табл.1).

Таблица 1. Показатели роста клеток штамма D.desulfuricans В-1388 в различных условиях культивирования

Условия культивирования Y, г/л Y лакт, г.с.в./М Лактат/ ацетат Yat®

Среда Постгейта В, газовая фаза: 100% Аг 0,67 4,39 1,40 10,5

Среда Постгейта В, газовая фаза:5%СО+95%Аг 0,45 3,88 0,95 9,8

Снижение величины экономического коэффициента связано, как правило с увеличением затрат исходного источника энергии на синтез единиць биомассы. Ранее показано, что чем сильнее воздействие неблагоприятноп для роста фактора, тем ниже величина экономического коэффициент; (Работнова, Позмогова, 1979; Тарасова, 1990). Снижение экономической коэффициента указывает, очевидно, на то, что конструктивный метаболиз» ингибируется окисью углерода сильнее, чем энергетический. Прк рост< бактерий в атмосфере окиси углерода снижается отношение лактат/ацетат, чт< свидетельствует о преобладании энергетических процессов.

Основная причина снижения урожая клеток при культивировании 1 присутствии окиси углерода - это, вероятно, недостаток энергии образующийся из-за возрастания трат на поддержание. В зависимости о условий культивирования энергия поддержания может составлять 10-20^ всей энергии, расходуемой в АТФ-зависимых реакциях (Готтшалк, 1982) Снижение величины энергетического коэффициента при росте 0.с1е5и1Лтсап в атмосфере 5%СО свидетельствует, согласно Перту, (Перт, 1978) о( увеличении расхода АТФ на процессы поддержания жизнедеятельности.

Полученные нами данные позволяют заключить, что окись углерода : небольших концентрациях (5%) является ингибитором, только замедляюпци рост, но не останавливающим его и не убивающим клетку. Его воздействи! приводит культуру в состояние "неспецифического стресса" (Работнова 1980). Культивирование В.ёезиИипсапз В-1388 на органической среде 1 атмосфере СО сопровождается окислением окиси углерода и снижением ег! концентрации уже в лаг-фазе, хотя максимальная скорость окисления СС регистрируется в фазу экспоненциального роста. Убыль окиси углерода и

8

газовой фазы коррелирует с выделением СО2. являющейся продуктом окисления СО (Беляева с соавт., 1992). При росте сульфатредуцирующих бактерий на лактат-содержащей среде в атмосфере аргона происходит небольшое ее подкисление за счет продуктов метаболизма (с рН 7,2 до рН 6,7). В условиях культивирования бактерий на той же среде при наличии 5% окиси углерода наблюдается более сильное смещение рН в кислую область (до рН 5,3). Фактически, это нижнее предельное значение рН, ограничивающее рост представителей рода Desulfovibrio (Розанова, Назина, 1989). Для поддержания градиента рН на уровне выше критического при росте в атмосфере, содержащей 5% СО, клетке D.desulfuricans В-1388 необходимы дополнительные затраты энергии.

Обмен нуклеотидов тесно связан с превращениями энергии, функционированием разнообразных ферментных систем, биосинтезом белков и нуклеиновых кислот. Многосторонность обменных взаимодействий нуклеотидов создает возможность их использования для косвенной оценки состояния клеточного обмена (Ханина с соавт., 1964).

Нуклеотидный состав клеток D.desulfuricans В-1388 меняется в процессе роста, в обоих вариантах опыта. На рисунках 3, 4 представлена динамика компонентов нуклеотидного фонда, играющих основную роль в метаболизме сульфатредуцирующих бактерий. Известно, что аденилаты представляют собой универсальную энергетическую валюту клетки (Ленинджер, 1976), НАДН служит донором водорода при восстановлении сульфатов (Kremer, 1988). Согласно полученным результатам, введение в среду культивирования D.desulfuricans В-1388 5% СО приводит к снижению содержания АТФ в клетках в первые 5 часов роста (лаг-фаза). Известно, что в течение лаг-периода идут процессы, требующие больших энергетических затрат в форме АТФ: восстанавливается состав ферментов и РНК в клетке (Перт, 1978). Ранее показано, что экзогенная окись углерода стимулирует в клетках синтез СО-дегидрогеназы de novo (Тарасова, 1990). В целом, уровень АТФ в клетках в атмосфере СО значительно ниже, чем у бактерий, находящихся в атмосфере аргона.

Под влиянием окиси углерода существенно меняется содержание восстановленного НАД в клетке. В экспоненциальной фазе роста его внутриклеточный уровень в 1,5 раза выше, чем у бактерий, растущих в атмосфере аргона. Известно, что окись углерода участвует в процессах активации гидрогеназ (Золотухина с соавт., 1987, Berlier et al., 1987), а окисление НАДН у сульфатредуцирующих бактерий Desulfovibrio сопряжено с восстановлением сульфатов (Kremer et al., 1988; Chen et al., 1994). Эти данные указывают в пользу возможности опосредованного влияния процесса

окисления СО на увеличение образования НгБ клетками 0.(1е5и1Гипсапз В-1388 в атмосфере 5% СО.

Рис.3 Содержание АТФ (I), АМФ(2), НАДН (3) в клетках О.скзиНипсапз, растущих на среде Постгейта В в атмосфере 100%Аг.

Рис.4 Содержание АТФ (1), АМФ (2). НАДН (3) в клетках В^еБ^Шпсапэ, растущих на среде Постгейта В в атмосфере 5%СО+95%Аг.

Время культивирования, ч

Способность клетки к размножению характеризует ее энергетический заряд. Известно, что при увеличении энергетического заряда ускоряются биосинтетические реакции (Шлегель, 1987). Увеличение энергетического заряда клеток отмечено при уменьшении скорости их роста: при максимальной скорости размножения в экспоненциальной фазе энергетический заряд колеблется от 0,42 до 0,5 в условиях роста

10

сульфатредуцирующих бактерий в атмосфере аргона, или от 0,18 до 0,22 в атмосфере 5%СО+95%Аг, при замедлении роста энергетический заряд клеток и в том, и в другом случае возрастает. Аналогичные данные получены для культур Enterobacter aerogenes и дрожжей (Работнова, Позмогова, 1979). Величина энергетического заряда клеток, растущих в неблагоприятных условиях, в атмосфере, содержащей окись углерода, ниже, чем при росте бактерий в атмосфере аргона. Падение энергетического заряда осуществляется в основном за счет возрастания пула АМФ, который предшествует другим аденилатам на пути их синтеза. Снижение энергетического заряда служит сигналом к замедлению реакций биосинтеза (Nierlich, 1978), что и наблюдается в опытном варианте эксперимента.

Окись углерода при введении в газовую фазу в концентрации 5% ингибирует транспорт лактата в клетки D.desulfuricans В-1388. В случае использования в экспериментах суспензии бактерий, предварительно выращенных на среде с лактатом в атмосфере 5%СО+95%Аг, транспорт лактата менее подвержен ингибированию. Некоторые исследователи связывают обнаруженное сопряжение окисления лактата и потребления АТФ с активным транспортом лактата в клетки микроорганизмов, предполагающем участие протондвижущей силы D.vulgaris (Marburg) (Pankhania et al.. 1988. Axe, Bailey, 1995). В генерации электрохимического потенциала у бактерий Desulfovibrio принимает участие периплазматическая гидрогеназа (Fitz. Cypionka,1991). Окись углерода, являясь селективным ингибитором гидрогеназ, с одной стороны препятствует выделению протонов из клеток сульфатредуцирующих бактерий (Fitz, Cypionka, 1989). С другой стороны, за счет способности окиси углерода активировать периплазматическую [N'iFe]-гидрогеназу возможно восстановление электрохимического потенциала и связанных с ним транспортных механизмов бактерий рода Desulfovibrio.

2. Влияние окиси углерода на энергодающне процессы в клетках D.desulfuricans В-1388

Характерным свойством всех сульфатредуцирующих бактерий является их способность осуществлять анаэробное дыхание с использованием сульфатов в качестве акцепторов электронов. Рост ряда сульфатредукторов, в том числе представителей рода Desulfovibrio, возможен также в результате брожения тех или иных органических веществ, например, лактата. В этом случае важное значение имеет реакция субстратного фосфорилирования при участии ацетаткиназы. Таким образом, при наличии в среде органического вещее та и какого-либо утилизируемого экзогенного акцептора электронов происходит синтез АТФ как в резулыаге субстратного фосфорилирования. так и мембранного фосфорилирования. связанного с дейепшем электронтранспортной цепи.

Окись углерода в концентрации 5% в газовой фазе ингибирует процесс синтеза ЛТФ в клетках О^евиШтсаш на уровне субстратного фосфорилирования при окисления лактата (рис. 5, табл. 2).

Рис.5 Изменения

нуклеотидного состава клеток 0.<1е5и1Й1Псаш В-1388, инкубируемых в различных условиях: А-среда с лактатом без сульфатов +100%Аг, Б-среда с лактатом, без сульфатов, + 5% СО

Таблица 2. Влияние окиси углерода на эффективность субстратного фосфорилирования в клетках D.desulfuricans В-1388

Параметры, варианты опыта АТФ, нМ/мг б А СО, мкМ

Среда с лактатом без сульфатов -г 100% Аг 4,09 ± 0,2 -

Среда с лактатом, без сульфатов + 5% СО+95% Аг 0,6 ± 0,01 0,09 ± 0,05

При инкубировании клеток D.desulfuricans В-1388 в условиях, исключающих субстратное фосфсрилирование (среда Постгейта В без лактата) окись углерода может служить донором электронов. В этом случае клетками синтезируется АТФ, в инкубационной среде фиксируется H2S (рис.6, табл. 3). Это согласуется с данными литературы о том, что реакция окисления СО может быть связана с формированием электро-химического протонного потенциала и синтезом АТФ (Diekert et al., 1986; Diekert, 1990; Тарасова. 1990). 12

Рис.6 Изменения нуклеотидного состава клеток Э (1е5и1йдпсапз В-388, инкубируемых в различных условиях: А-среда без лактата + 100% Аг, Б-среда без лактата + 5% СО

Таблица 3. Влияние окиси углерода на эффективность окислительного фосфорилировапия в клетках D.desulfuricans В-1388

Параметры, варианты опыта АТФ, нМ/мг б Д СО, мкМ Д H2S, мкг

Среда без лактата + 100% Аг 1,2 ± 0,5 - 2,01 ± 0,2

Среда без лактата + 5% СО 3,9 ± 0,9 0,135 ± 0,02 3,5 ± 0,3

Условия культивирования существенно влияют на эффективность окислительного фосфорилирования у различных групп микроорганизмов, воздействуя на качественный и количественный состав переносчиков электронов (Rüden et al., 1990; Kletzin, 1989). Увеличение концентрации цитохромов с-типа показано для Desulfovibrio при росте на среде с формиатом, ацетатом и сульфатом (Odom, Peck, 1981), а также при культивировании их в присутствии кислорода (Abdollahi, Wimpenny, 1990). В клетках карбоксидобактерий под воздействием окиси углерода возрастала общая продукция цитохромов (Волова с соавт., 1988).

Дифференциальные спектры экстрактов клеток, выращенных на лактате в атмосфере 100% Аг или в присутствии СО, не имеют принципиальных качественных отличий и характеризуются наличием ярко выраженных полос поглощения с максимумами при 419, 523, 552 нм, что соответствует у, ß, и а -полосам поглощения цитохрома с (Odom, Peck, 1984), а увеличение оптической плотности в области 570-630 нм., может быть вызвано наличием

бисульфитредуктазы - десульфовиридина (Реек, LeGall, 1982, Золотов, Давыдова, 1993) (рис.7). Однако, доля цитохрома с-типа в общем клеточном белке меняется в зависимости от условий культивирования. Окись углерода вызывает увеличение количества цитохрома с (таблица 4).

Рис.7 Дифференциальный спектр поглощения экстрактов клеток О.ёеэи^ипсапз В-1388, выращенных на среде с лактатом в атмосфере: 1100% Аг, 2 - 5% СО + 95% Аг.

Таблица 4. Содержание цитохрома с в экстрактах клеток П. ¿еьиЦипсапл В-13НК в различных условиях культивирования

Условия культивирования Количество цитохрома с, нМ/мг б

Среда с лактатом + ¡00% Аг 0,245 ± 0,004

Среда с лактатом -1- 5% СО 0,356 ± 0,001

Цитохромы с-типа служат промежуточным звеном между дегидрогеназами и редуктазами. Увеличение их содержания в клетках 0.с1е5и1йшсапБ В-1388, культивируемых в атмосфере окиси углерода, может рассматриваться как проявление одного из адаптивных механизмов клетки, направленного на поддержание активности редокс-цепи в неблагоприятных условиях роста.

3. Устойчивость О. (1е8и1Гипсапз В-1388 к окиси углерода в зависимости от исходного энергетического статуса клетки

Чувствительность сульфатредуцирующих бактерий к СО зависит от исходного энергетического статуса клеток, который определяется условиями культивирования и, в первую очередь, составом питательной среды (Безбородое, 1974). Наиболее часто критерием при оценке энергетического гомеостаза микроорганизмов продолжает оставаться уровень пула АТФ. У клеток бактерий, выращенных на среде Постгейта В (30 мМ лактата) до экспоненциальной фазы, энергетический заряд клеток составляет 0,42 и отражает снижение количества внутриклеточной АТФ в результате высокой скорости роста ОЛезШАшсапв В-1388 (табл. 5).

Таблица 5. Влияние условий культивирования на ростовые и энергетические параметры Г).¿¡ехиЦигкапя В-1388

Условия культивирования Биомасса, г. сух. в. /л Н25, мкг/мл АТФ, нМ/мг б АТФ/АДФ, ед. Э.З., ед.

Лактат (30 мМ) + др. экстр. 0,101 53,3 ± 1,2 14,27 + 1,4 4,08 0,7

Лактат (30 мМ) без др. экстракта 0,012 37,98 ± 2,5 1,29 ± 0,7 1,34 0,42

Лактат (15 мМ) без др . экстракта 0,007 15,34 ± 0,7 4,33 ± 0,35 - 1

Лимитация среды по лактату (15 мМ) приводит к увеличению энергетического заряда до 1,0. Максимальное значение величины энергетического заряда характеризует высокую потенциальную способность бактерий к размножению, которая, однако, в данных условиях не реализована: обращает на себя внимание очень низкий выход биомассы, что позволяет предположить преимущественное протекание реакций энергетического обмена. Клетки О.ёезиШнтсапз В-1388, выращенные на полной среде Постгейта В (30 мМ лактата + дрожжевой экстракт) имеют высокий энергетический заряд (0,7), свидетельствующий о метаболической стабильности (Работнова, Позмогова, 1979).

Условия предшествующего культивирования бактерий О.скзиИгтсапз В-1388 в значительной мере определяют характер изменения их энергетических параметров в атмосфере 5% СО (табл 6,7). Клетки, отобранные с полной

15

среды Постгейта В и помещенные в атмосферу окиси углерода менее зсего подвержены ингибирующему действию СО: в атмосфере 5%СО их энергетический заряд сохраняется.

Таблица 6. Влияние окиси углерода на энергетические параметры D.desulfuncanxB-1388, выращенных на полной среде Постгейта В

Параметры. варианты опыта АТФ'Л ДФ. ед НАДФН/Н АДФ, ед. НАДНУ НАД, ед. эз, ед. ДСО, мкМ AH2S мкг Д АТФ, нМ

Среда с лактатом * 100"о Лг 5.3 2,3 1,2 0,7 0 9,8 ±0,5 0

Среда с лак-тагом СО -05° о Лг 3.9 2,5 0.15 0,8 0,35 ±0,02 11,7 ±0,3 7,49

Таблица 7. Влияние окиси углерода на энергетические параметры D.tlesulfuricans В-13Я8, выращенных на лимитированной по лактату (15 мМ) среди Постгсйта В

Параметры , варианты опыта АТФ/ АДФ. ед. НАДФН/ НАДО, ед. ПАДИ' НАД, ед. Э. 3., ед. ДСО, мкМ дн-s, мкг Д АТФ, нМ

Среда с .такта i ом (15мМ) -100% Ar 5,1? 10,4 0,4 0,74 - 35 ±2,3 0,37 ±0,05

Среда с так-! а го м (15мМ) * 5°оСО - 4,95 0,78 1 0,79 111 ±5,6 2,62 + 0.2

При эксгремальных воздействиях некоторые сложные природные с\бс граты - компоненты среды- могут играть стабилизирующую роль, обеспечивая жизнеспособность клеток (Работнова, 1979). Так, добавление дрожжевого автолизата в среду культивирования Streptococcus creraoris задерживало тепловую инактивацию клеток (Работнова, Позмогова, 1978). Исходя из полученных в работе результатов, можно заключить, что по-видимому. дрожжевой экстракт играет роль протектора и для .клеток, находящихся в атмосфере окиси углерода.

Следует отметить, что согласно полученным данным эффективность окисления СО сульфатредуцирующими бактериями выше при инкубировании клеток в средах с низким содержанием органического вещества. Эти данные

согласуются с результатами по изучению потребления СО культурой О.ёезиМипсаш шт.2198, растущей в условиях лимитации по источнику энергии (Луа2а15еуа е1 а1., 1988).

Для клеток О^езиНтшсапБ В-1388, инкубируемых в атмосфере 5%СО, характерно значительное увеличение отношения НАДФН/НАДФ", «то является показателем их высокой восстановительной способности. Одной из основных реакичй, благодаря которой НАДФН/НАДФ* устанавливается и поддерживается на более высоком уровне, чем отношение НАДН/НАД (Мецлер, 1986) является реакция трансгидрирования ( НАДН + НАДФ' -» НАД" (- НАДФН ). С необходимостью сброса избытка восстановленного НАДФ возможно связан синтез алифатических углеводородов клетками О.ёезиИилсапз, культивируемыми в атмосфере СО/Н2 (Акименко, 1989. Беляева с соавт., 1992).

Таким образом, из представленных результатов следует, что клетки

0.с1е5и1Ашсап5 В-1388 при росте на органической среде в атмосфере, содержащей 5% окиси углерода, тратят повышенное количество энергетического материала для поддержания жизни в экстремальных условиях. Энергетические процессы искажаются. Сложный поток энергодающих реакций становится менее сбалансированным и эффективным. В то же время, характер изменений энергетических параметров клетки в атмосфере окиси углерода в значительной степени определяется ее энергетическим зарядом. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли аденилатов в метаболизме сульфатредуцирукшьгх бактерий, культивируемых в условиях стресса.

ВЫВОДЫ

1.Показано, что введение окиси углерода в концентрации 5% в пиовую фазу при культивировании О^еБ^йшсапз В-1388 на лактат-сульфатной среде вызывает в клетках состояние неспецифического стресса. Под действием СО меняется характер утилизации субстрата: увеличивается доля органического субстрата (лактата), используемого в качестве источника энергии, возрастают энергетические траты клетки на поддержание жизнедеятельности.

2. Вьивлено, что введение в среду культивирования О.скзиМттсапэ В-1388 5"о СО приводит к торможению поступления лактата в клетку. При длительном культивировании бактерий в присутствии ингибитора происходи г практически полное восстановление транспорта субстрата.

3. Впервые установлено, что устойчивость клеток Од1е5иИипсап? В-1388 к

окиси углерода зависит от их энергетического статуса. Клетки.

отобранные с полной лактат-сульфатной среды, в атмосфере 5% СО

поддерживают энергетический заряд клетки в пределах, обеспечивающих метаболическую стабильность.

4. Показано, что эффективность окисления окиси углерода выше в условиях лимитации по источнику энергии.

5. В атмосфере окиси углерода в клетке D.desulfuricans В-1388 значительно возрастает содержание цитохромов с-типа, а также восстановленных пиридиннуклеотидов (НАД(Ф)Н). Эти изменения являются следствием адаптационных процессов, происходящих в клетке и направленных на выживание.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Митяшина С.Ю., Кияшко C.B., Мухитова Ф.К. Восстановление двуокиси углерода экстрактами клеток D.desulfuricans, шт.2198. /В сб. «Проблемы современной биологии», Труды 17-ой конференции мол. ученых биол. ф-та МГУ, 4.1, С.202-203, 1986, N 6642-В Деп.

2. Kiyashko S.V., Mityashina S.Yu., Mukhitova F.K.., Belyaeva M.I. Enzymatic

synthesis of organic compounds on CO and H;. 18-th FEBS Meeting, Lublyana. 1987, p. 102.

3. Кияшко C.B., Гусева O.A., Митяшина С.Ю., Гробовенко С.Я. Влияние давления на процесс ферментативного синтеза органических соединений из СО и Н;. Тез. докл. конф. мол. ученых, Уфа, 1487, С. 125.

4. Кияшко C.B.. Митяшина С.Ю., Мухитова Ф.К. К вопросу о механизме ферментативного восстановления окиси углерода. Тез. докл. 7-ой Респ. конф.мол.ученых-химиков, Таллин, 1987, 4.1, С.98.

5. Мухитова Ф.К., Кияшко C.B., Митяшина С.Ю. Каталитический синтез углеводородов и кислородсодержащих соединений из СО и Н2 на ферментных системах. Тез. докл. Всесоюзн. конф. «Химический синтез на основе Ci - молекул», 1987, Москва, С. 54.

6. Мухитова Ф.К., Кияшко C.B., Рябцева O.A., Митяшина С.Ю. Ферменты

сульфатредуцирующих бактерий в реакциях органического синтеза на основе окиси углерода и водорода. В сб. «Вопросы физиологии и биохимии сульфатредуцирующих бактерий» п/ред. Лещикской И.Б., Беляевой М.И., Казань, 1987, С. 77-84.

7. Kiyashko S.V., Mityashina S.Y., Mukhitova F.K. Catalytic reduction of carbon oxides by extracts of D.desulfuricans. 14-th International Congr. of biochem., Prague, 1988, abstr., V.III. P.35, WE Oil.

8. Рябцева O.A., Митяшина С.Ю., Кияшко C.B. Изучение гидрогеназной активности экстрактов клеток D.desulfuricans шт.2198. Материалы 6 научи, конф. мол. ученых КИБ, Казань. 1990, N 1014-В 90 Деп., С. 123-125.