Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сульфатредуцирующие бактерии - продуценты углеводородов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Багаева, Татьяна Вадимовна
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1 Синтез углеводородов бактериями
Глава 2 Физиология и биохимия сульфатредуицрующх бактерий
ЗАКМНЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3 Объекты и метода исследовании
3.1 Объекты исследований
3.2 Питательные среды
3.3 Культивирование бактерий
3.4 Газовые смеси
3.5 Определение количества клеток сульфатредуцирующих бактерий
3.6 Определение содержания белка в культуральной жидкости
3.7 Определение удельной скорости роста бактерий См-)
3.8 Определение длительности лаг-фазы
3.9 Получение экстрактов клеток бактерий
3.10 Определение рН и Eh в культуральной жидкости
3.11 Анализ газообразных соединений
3.12 Определение углеводородов газохромато-графическим и масс-спектрометрическим методами
3.13 Определение кислородсодержащих продуктов (кислот и спиртов) методом газо-жидкостной хроматографии
3.14 Тонкослойная хроматография
3.15 Определение включения 14С и 3Н в биомассу бактерий и продукты жизнедеятельности клеток
3.16 Аналитические методы
3.17 Определение лактата и пирувата
3.18 Определение активности формиатде-гидрогеназы
3.19 Устройство для создания различных значений окислитель но-восстановительного потенциала среды при культивировании сульфатредуцирующих бактерий
3.20 Характеристика биореактора используемого для моделирования экспериментов
3.21 Математическая обработка результатов исследований
Глава 4 Способность сульфатредуцируютх бантерий продуцировать внеклеточные углеводороды
4.1 Способность Desulfovibrio desulfuricans 1 к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях гетеротрофного роста
4.2 Сравнительная характеристика спектров внутри и внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans
4.3 Способность других представителей сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях гетеротрофного роста
4.4 Способность сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях литогетеротрофного роста
4.5 Способность сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях автотрофного роста
Глава 5 Влияние различных факторов на рост и образование внеклеточных углеводородов сульфатредуицрушщш бактериями
5.1 Влияние различных сточников углерода и энергии на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
5.2 Влияние неорганических акцепторов электронов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricaus ВКМ
5.3 Влияние физико-химических факторов на рост и образование углеводородов сульфатреду-цирующими бактериями
5.3.1 Влияние рН среды на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans
5.3.2 Влияние окислительно - восстановительного потенциала среды на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans
5.3.3 Влияние соотношения Нг : СОг в газовой фазе на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
5.4 Влияние других факторов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
5.4.1 Влияние органического азота на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
5.4.2 Влияние фосфатов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями
5.4.3 Синтез углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при выращивании бактерий в лабораторном биореакторе
5.4.4 Моделирование образования углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ при росте культуры в биореакторе
Глава 6 Механизм синтеза внеклеточных углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
6.1 Участие лактата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
6.2 Участие ацетата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
6.3 Участие СО2 в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
6.4 Участие формиата в синтезе углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
6.5 Распределение меченого углерода в продуктах метаболизма Desulfovibrio desulfuricans
ВКМ 1799 при синтезе углеводородов
6.6 Участие молекулярного водорода и водорода воды в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ
Глава 7 Применение газохроматографического метода для определения интенсивности образования углеводородов сульфатредуицрующцми бактериями в различных природных объектах
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДИ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Сульфатредуцирующие бактерии - продуценты углеводородов"
Актуальность проблемы. Синтез углеводородов различными организмами занимает внимание ученых многих стран мира в связи с проблемой сокращения энергетических ресурсов в природе.
В настоящее время способность к синтезу углеводородов доказана для целого ряда живых организмов. Значительное число работ, опубликованных за последнее время, посвящено углеводородам и, в частности, алканам, обнаруженным в пыльце и спорах различных растений, а также входящим в состав восков поверхности листьев (Чернова, Сафарова, 1989; Yochkova, Mlade-nova, Stoianova,1992; Gulz, Muler, Herrman, 1993; Yamaqucehi, Mega, Sanada, 1993); у насекомых (Brill, Bertsch, 1990; Guo, Blomquist, 1991; Brown, Sparadbery, Lacey, 1991). Активно, в этом плане, изучаются микроводоросли (Gudin, Thepenier,1986; •Baillier et.al., 1988; Fatma, 1989; Wirth et. al.,1992).
Возможность синтеза углеводородов бактериями занимает особое положение в связи с выяснением роли этих организмов в синтезе углеводородов нефти. Исследования в этой области были начаты еще в 30-ые годы. В этот период появляются сообщения об обнаружении "углеводородоподобных веществи в клетках бактерий и водорослей (Селибер, 1937; Jankowski, ZoBell, 1944; ZoBel1,1945; 0akwood,1945).
Основные исследования состава углеводородов различных организмов и, в частности, бактерий, были выполнены в результате разработки метода газожидкостной хроматографии (Oppenhe-imer,1965; Joneau, Baraud, Cassagne, 1969; Han, Chan, Calvin, 1969; Weete, Weler, Laseter, 1970; Albro, Dittmer, 1970; Tornabene, Morrison, Kloos, 1970; Ерошин, Дедюхина, 1972; Же-лифонова и др.,1975).
В более поздние годы разрабатывались отдельные этапы синтеза углеводородов (Tornabene, Ого, 1967; Albro, Meehan, Dittmer, 1970; Bird, Lynch, 1974; Tornabene, 1976, 1981). Однако в целом вопрос механизма синтеза углеводородов микроорганизмами остается до сих пор не исследованным.
В последние годы в научных программах многих стран большое внимание уделяется изучению метаболизма анаэробных бактерий. Исследование анаэробов привело к открытию огромной роли процессов, осуществляемых этими микроорганизмами в анаэробных зонах биосферы (Заварзин, 1972; Кузнецов, 1974; Розанова, Кузнецов, 1974; Германов, Борзенков, Юсупова, 1981; Hansen, 1988; Иванов с соавт., 1991). К числу таких процессов относится и синтез углеводородов. Наиболее вероятными про-, дуцентами углеводородов в природе, наряду с метаногенами, являются сульфатредуцирующие бактерии, так как именно этим бактериям принадлежит главная роль в терминальных • путях анаэробной деструкции органического вещества и в преобразовании морских осадков (Иванов с соавт., 1980; Беляев, Лейн, Иванов,1979,1981; Hamilton, 1983; Postgate,1984; Иванов и др., 1990; Langendijk, Van Den Kieboom, Van Der Hoeven, 1995). В этой связи несомненно актуальным является исследование процесса синтеза углеводородов сульфатредуцирующими бактериями.
Анализ проблемы показал, что большое число работ посвящено вопросам бактериального синтеза газообразных углеводородов, особенно - метана ( Чан Динь Тоай, Хлудова, Панцхава, 1983; Fukuda, 1984 a,b; 1990; Беляев, 1988; Варфоломеев,
Калюжный, Медман, 1988; Панцкава, 1989; Thauer, 1990; Wolfe, 1990 ; Jetten, Stams, Zehnder, 1992), а также изопреноидным углеводородам (Zhou, White, 1991) . Способность к "синтезу внеклеточных жидких и твердых углеводородов одной из наиболее активных групп анаэробных микроорганизмов, какими являются сульфатредуцирующие бактерии, остается неизученной. Это и определило актуальность настоящей работы, посвященной изучению метаболизма сульфатредуцирующих бактерий в связи с возможным их участием в синтезе углеводородов в природе.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является доказательство способности сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов и разработка научных основ, обеспечивающих осуществление этого процесса.
В соответствии с основной целью работы были определены следующие задачи:
- изучить способность сульфатредуцирующих бактерий продуцировать внеклеточные углеводороды в условиях гетеротрофного, литогетеротрофного и автотрофного роста;
- установить наиболее активных продуцентов углеводородов среди физиологически и биохимически различных видов сульфатредуцирующих бактерий;
- определить состав внеклеточных и внутриклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans для их сравнительной характеристики;
- установить закономерности влияния химического состава питательной среды и физико-химических условий культивирования на процесс образования внеклеточных углеводородов сульфатредуцирующими бактериями;
- изучить механизм синтеза внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans;
- исследовать процесс образования углеводородов в природных объектах, содержащих сульфатредуцирующие бактерии.
Научная новизна. Показана способность сульфатредуцирующих бактерий, принадлежащих к разным метаболическим типам, к синтезу внеклеточных углеводородов, включающему широкий спектр алканов от Сц до С24. Установлено, что синтез углеводородов происходит в условиях гетеротрофного, литогетеро-трофного и автотрофного роста бактерий. Однако наибольшее их количество образуется в условиях роста клеток на среде с лактатом в атмосфере Н2+СО2 с минимальным количеством сульфатов в питательной среде. Определено, что наиболее активным • продуцентом углеводородов среди изученных видов бактерий, является Desulfovibrio desulfuricans. Методами газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа установлено, что углеводороды, синтезируемые Desulfovibrio desulfuricans, представлены, в основном, алканами нормального строения. В отличие от внутриклеточных углеводородов, содержащих 70-80% отн. высокомолекулярных углеводородов (С25-С35)j максимальное количество внеклеточных углеводородов приходится на низкомолекулярную часть (С11-С24 80% отн.).
Установлены закономерности влияния активирующих и ингибирующих факторов питательной среды и условий культивирования клеток на синтез углеводородов сульфатредуцирующими бактериями: наличие доноров и акцепторов электронов в питательной среде, соотношение C:N, присутствие фосфатов, влияние таких факторов, как Eh и рН, соотношения Нг:С02 в газовой фазе. Определена активность формиатдегидрогеназы у Desulfovibrio desulfuricans, изучен механизм синтеза внеклеточных углеводородов. С помощью меченых соединений (Н14С00Н, 14СН3СНОНСООН, СН3СН0Н14С00Н, СНз14С00Н, 14СН3С00Н, NaH14C03, а также 3TzO и 3Тг) показано, что синтез углеводородов суль-фатредуцирующими бактериями осуществляется путем образования жирных кислот (формиата, ацетата) с последующим их восстановлением и конденсацией в углеводороды. В реакциях восстановления участвуют протоны водорода воды и молекулярный водород газовой фазы. Синтез углеводородов возможен только при низком (-290мВ)-(-ЗбОмВ) окислительно-восстановительном потенциале среды.
Исследован процесс образования углеводородов в природных объектах (илы, грунт, пластовая вода, керны), содержащих сульфатредуцирующие бактерии. Установлены закономерности активации процессов синтеза углеводородов в образцах, - содержащих большее количество сульфатредуцирующих бактерий и обогащенных органическим веществом, при наличии в газовой фазе Н2+С02.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволяют по-новому оценить многие важные научные и практические проблемы. Это прежде всего возможность современного образования углеводородов в природе и восполнения запасов углеводородного сырья. Расширение и дополнение сведений о физиологии сульфатредуцирующих бактерий, о цикле углерода в природе. Необходимость разработки рациональных методов борьбы с коррозией металлов без резкого нарушения экосистем, отрицательно влияющих на жизнедеятельность сульфатредуцирующих бактерий.
Способность сульфатредуцирующих бактерий продуцировать внеклеточные углеводороды делает реальным осуществление микробиологического синтеза углеводородов в условиях производства. Метод получения углеводородов с помощью сульфатредуцирующих бактерий зарегистрирован в заявке N 4920514/14 с приоритетом от 01.02.91. На способ получения углеводородов с помощью сульфатредуцирующих бактерий получен патент RU 2027760 С1 от 23.07.93.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Багаева, Татьяна Вадимовна
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Обобщая выше приведенные исследования по изучению сульфатредуцирующих бактерий можно видеть, что физиология и биохимия этих бактерий достаточно хорошо изучена. Показано, • что наиболее широкое распространение среди сульфатредуцирующих бактерий в природе, постоянно присутствующих в местах образования углеводородов, получил вид Deslfovibrio desulfuri-caus. Это неспоровые, мезофильные, грамм-отрицательные бактерии в виде вибрионов, растущих на средах с добавлением органических соединений (Widdel, 1980; Postdate, 1984; Devereux et. al., 1990). По характеру энергетических и конструктивных процессов Desulfovibrio desulfuricaus принадлежит к первому типу (группа А) согласно классификации Розановой, Назиной (1989). Многие органические соединения служат этим бактериям источниками углерода и энергии. Окисляемыми субстратами для D.desulfuricans при сульфатредукции могут служить: лактат, пируват, цитрат, этанол и изобутанол, этиленгликоль и тетраэтиленгли-коль, а также холин (Розанова, Назина, 1989; Gibson, 1990;
Widdel, Hansen, 1992). Некоторые штаммы D.desulfuricans окисляют сукцинат (Stams, Hansen, Skyrlng, 1985).
Разложение лактата до ацетата бактериями D.desulfuricans происходит в периплазме клеток и соответствует схеме, представленной ранее в работе на культуре Desulfovibrio vulgaris. В данном варианте превращение лактата в пируват на первом этапе также катализируется лактатдегидрогеназой. В разложении пирувата участвует пируватферредоксиноксидоредуктаза, катализирующая образование ацетил-СоА и восстановление ферредо-ксина. Ацетил-СоА далее преобразуется в ацетилфосфат при участии фосфотрансферазы. Из ацетилфосфата при участии ацетоки-назы получается ацетат. Превращение ацетилфосфата в ацетат сопровождается субстратным фосфорилированием. Кроме того, АТФ образуется в цепи переноса электронов в процессе окислительного фосфорилирования (Herrers et.al., 1991).
Использует D.desulfuricans и циклический механизм переноса водорода, ответственный за возникновение градиента протонов, предложенный в работах Одома и Пек (Odom, Peck-, 1981; 1984) при изучении выделения и поглощения молекулярного водорода. По этому механизму молекулярный водород, образовавшийся при участии цитоплазматической гидрогеназы (локализованной в цитоплазме), переносится в периплазму и поступает на пери-плазматическую гидрогеназу, связанную цитохромом С. Затем протоны и электроны транслоцируются через мембрану в клетку, где используются на восстановление сульфатов. Как было отмечено ранее, у D.desulfuricans обнаружены обе необходимые для этого процесса гидрогеназы (Martin, Glick, Martin, 1980).
Возможна для D.desulfuricans и другая гипотеза относительно выделения и потребления водорода, предложенная
Лаптоном с соавторами (Lupton et.al.,1984). Она получила название "трансформационная модель следового водорода". По этой модели цитоплазматическая гидрогеназа участвует в регуляции уровня восстановленности ферредоксина для векторного переноса и генерации протондвижущей силы. Переплазматическая гидрогеназа, по мнению этих авторов, выполняет каталитические функции восстановления сульфатов молекулярным водородом.
Схема процесса диссимиляторной сульфатредукции у бактерий рода Desulfovibrio и гипотеза "циклического переноса водорода" представлена в работе Готтшалка (Gottschalk, 1986) : гснз-снон-соон
цитоплазма
М плазма
" 2Х2 2СН3-С0-С00Н 2С02> —2СоА
Р гидро-
2СН3-С00(Р) 2АДФ^ 2АТФ>, 2СН3С00Н
Рост за счет окисления молекулярного водорода у бактерий D.desulfuricans осуществляется в хемолитогетеротрофных условиях при добавлении в питательную среду дрожжевого экстракта и использовании ацетата и СОг в конструктивном обмене.
Установлено, что клетки D.desulfuricans обладают высокой гидрогеназной активностью (Glick, Martin, Martin, 1980; Золотухина, 1985; Fauque et.al., 1988; Hatchikian et. al., 1992). Рост культуры на среде с Нг+СОг+ацетат сопровождается образованием 1М АТФ при восстановлении 1М сульфатов, а восстановление 1М тиосульфата или сульфита - ЗМ АТФ (Badziong, Thauer, 1978; Brandis, Thauer, 1981, 1989).
В процессе сульфатредукции D.desulfuricans способен окислять СО (Карпилова, 1987). В клетках этих бактерий обнаружена активная С0-дегидрогеназа, участвующая в данных реакциях метаболизма (Yagi, Tamiya, 1962; Тарасова и др., 1985).
Показано, что при росте D.desulfuricans за счет разложения органических веществ или за счет молекулярного водорода, эти бактерии могут использовать различные акцепторы электронов. Заменить сульфаты у отдельных штаммов D.desulfuricans могут нитраты и нитриты (Liu, Der Vartanian, Peck, 1980; Seitz, Cypionka, 1986; Keith, Herbert, 1989; Bursakov et.al., 1995). Небольшие количества селената и селенита восстанавливаются D.desulfuricans до селенида, по-видимому, в результате тех же реакций, которые протекают при восстановлении сульфата (Tomei et.al., 1995).
В отсутствие акцепторов электронов, как отмечалось выше, D.desulfuricans способен осуществлять сбраживание холи-на (Hayward, Stadtman, 1960; Barker, Papicka, Campbell, 1962; Widdel, Pfennig, 1984). Другие органические субстраты сбражи-
ваются D.desulfuricans в составе смешенных микробных популяций.
Характерной особенностью Desulfovibrio desulfuricans является способность развиваться в ассоциациях с другими микроорганизмами. Это обеспечивает клетки необходимым количеством питательного и энергетического материала при использовании продуктов метаболизма партнера (Bryant et.al., 1977; Cord-Ruwisch, Alliver, Garcia, 1986).
Биологическое влияние Desulfovibrio desulfuricans и других видов сульфатредуцирующих бактерий на цикл углерода в экосистемах очень велико. Показано, что около 50% органического вещества природных объектов (ил) метаболизируются сульфат-редуцирующими бактериями (Jorgensen, 1977, 1982; Parkes, Buckingham, 1986). В основном, эти процессы связаны с окислением органических соединений, однако, не исключается и возможность восстановительных процессов. Одним из них является синтез углеводородов, возможность участия сульфатредуцирующих бактерий в их образовании требует дальнейшего изучения. В этом направлении имеются лишь единичные работы (Jankowski, ZoBell, 1944; ZoBell, 1945; Oppenheimer, 1965; Davis,1968; Jones, 1969; Han, Calvin, 1969).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 3 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Объект исследований
В работе использовали следующие культуры сульфатредуцирующих бактерий, полученные из Российской коллекции микроорганизмов (г. Пущино):
Бактерии окисляющие лактат до ацетата + С02 (группа А):
1. Desulfovibrio desulfuricans BKM 1388
2. Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799
3. Desulfovibrio vulgaris BKM 1760
4. Desulfovibrio gigas BKM 1382
5. Desulfotomaculum nigrificans BKM 1492
6. Desulfotomaculum orientis BKM 1628
7. Desulfomicrobium baculatus BKM 1378
8. Desulfobacterium macestil BKM 1598
9. Thermodesulfobacterium mobile BKM 1128
Бактерии окисляющие лактат до С02 (группа Б):
1. Desulfobacter postgatei ВКМ 1643
2. Desulfotomaculum kuznetsovii BKM 1805
Бактерии, выделенные из природных объектов: ил, грунт, керн, пластовая вода (штаммы БИ, БГ, БК, БП - кафедра микробиологии КГУ).
3.2 Питательные среды
Для культивирования сульфатредуцирующих бактерий использовали среду Постгейта В (Postdate, 1966) следующего состава (г/л):
Аскорбиновую кислоту и тиогликолат натрия в среду не вносили. В качестве восстановителя использовали сульфид или дитионит натрия. Сульфид натрия готовили в виде 1%-ного раствора NagS в 1%-ном растворе ЫаНСОз, стерилизовали при 0,5 атм. и добавляли по каплям перед посевом до слабого посерения среды. При использовании в качестве восстановителя дитионита натрия, небольшое количество сухого вещества растворяли в дистиллированной воде, освобожденной от кислорода, в ампулах с инертным газом и стерилизовали при 0,5 атм. Дитионит вносили в среду шприцем, перед посевом культуры.
Отдельно готовили 1%-ный раствор FeS04.7H20 в 1%-ном растворе НС1, стерилизовали при 1 атм. Дрожжевой экстракт использовали в виде 10%-ного раствора, стерилизовали при 0,5 атм.
MgS04.7H20 лактат Na или Са дрожжевой экстракт FeS04.7H20 вода водопроводная
• 1.0 - 1,0 - 2,0
• 1,0 - 0,5
После стерилизации и внесения дрожжевого экстракта, сульфата железа, рН среды доводили 20%-ным раствором NaOH до 7,0-7,4.
Кроме того, в опытах использовали среду названную "модифицированной средой Постгейта Ди следующего состава (г/л):
КН2РО4 - 0,5
NH4CI - 1,0
СаС12.2Н20 - 0,1
MgCl2.7H20 - 1,6
лактат - 3,5 ►
дрожжевой экстракт - 1,0
FeS04.7H20 - 0,5 вода дистиллированная
рН среды - 7,2-7,4
В данной среде пируват был заменен на лактат, как более энергоемкое вещество, а количество сульфата железа увеличено до 0,5 г/л для изучения роста и образования углеводородов различными культурами сульфатредуцирующих бактерий.
Все используемые вещества готовили так же, как и для среды Постгейта В.
Росту сульфатредуцирующих бактерий, особенно выделяемых из природных объектов, способствовало добавление в пита-тельну среду раствора микроэлементов следующего состава (мг/л): этилендиаминтетраацетат - 500, FeS04. 7Н20 - 200, ZnS04-7H20 - 10, МпС12-4Н20 - 3, Н3РО3 - 30, СоС12-2Н20 - 20, CuCl2-2H20 - 1, NlCl2'6H20-2, NaMo04'2H20-3 (Розанова,1978).
3.3 Культивирование бактерий
Бактерии выращивались на вышеуказанных средах. Анаэробные условия культивирования достигались кипячением и быстрым охлаждением питательной среды, а также добавлением восстановителей (дитионит, Na2S).
Колбы и пробирки с посевами закрывали стерильными резиновыми пробками не оставляя воздуха. Кроме того, бактерии выращивали в герметично закрытых пенициллиновых флаконах или в склянках (объем 75 мл и 500 мл), в атмосфере аргона или Н2+СО2. Соотношение питательной среды и газовой фазы - 1:2.
Каждый флакон заполняли газовой смесью после предварительной откачки воздуха с помощью вакуумного насоса типа MPW--5 и многократного промывания флаконов соответствующей газовой смесью с использованием бактериального фильтра.
В ходе исследований чистоту культур сульфатредуцирующих бактерий контролировали с помощью микроскопирования и посевами на среды для аэробных и анаэробных гетеротрофных бактерий.
На обнаружение аэробов высев проводили на скошенную глюкозо-пептонную среду следующего состава (г/л):
пептон глюкоза
MgS04.7H20 соль Мора Na2S04 агар
вода дистиллированная рН среды
2,0 0,5 1,0 15,0
Для проверки на отсутствие загрязняющих культуру сульфатредуцирующих бактерий анаэробов, анализ проводили на глюкозо-пептонной среде в запаянных трубочках (Романенко, Кузнецов, 1974). Появление разрывов агара или светлых колоний при культивировании в трубочках, а также на поверхности скошенного агара, свидетельствовало о загрязнении культур, а их отсутствие на чистоту сульфатредуцирующих бактерий.
3.4 Газовые смеси
Газовые смеси, в атмосфере которых культивировали бактерии, готовили и хранили в газометрах. Для приготовления газовых смесей использовали двуокись углерода и аргон из баллонов с соблюдением ГОСТа чистоты газов. Молекулярный водород получали с помощью генератора водорода типа СГС-2.
3.5 Определение количества клеток сульфатредуцирую-
Количество клеток сульфатредуцирующих бактерий определяли методом предельных разведений, фиксируя почернение в жидких средах, происходящее благодаря образованию сульфида железа (Grossman, Postdate, 1953).
В пробирки, содержащие по 18 мл жидкой среды Постгейта В,
щих бактерий
3.6 Определение содержания белка в кулыпуральной жидкости
Содержание белка определяли по модифицированному методу Лоури (Горина, Яковлева, 1980). К пробе объемом 1мл добавляли 0,1 мл 0,15% раствора дезоксихолата натрия, оставляли на 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 0,1 мл 72%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживали до растворения черного осадка и центрифугировали при 7.000 g 15 минут. Осадок растворяли в 1 мл дистиллированной воды, затем к нему добавляли 1 мл реактива "А", приготовленного из 1 части раствора 0,2% тартрата калия и 0,1% CUSO4.5H2O в 10% растворе карбоната натрия, 1 части 0,8 N NaOH и 2 частей дистиллированной воды с добавлением додецилсульфата Na (2,5%). Через 10 минут инкубации в смесь вносили 0,5 мл реактива Фалина. Оптическую плотность белка определяли на спектрофотометре иСФ-26" при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя жидкости 1см. Количество белка в пробе устанавливали по калибровочной кривой.
Для построения калибровочной кривой в логарифмических координатах использовали трехкратное определение содержания белка в растворах бычьего сывороточного альбумина различной
концентрации.
3.7 Определение удельной скорост рост бактерий (i±)
Удельную скорость роста бактерий рассчитывали по формуле (Работнова, 1989):
2,3 (IgN - IgNo )
М- = - (ч-1), где
N - биомасса или число клеток t - время, час
No - биомасса или число клеток в начальный момент времени
3.8 Определение длтельносш лаг-фазы
Длительность лаг-фазы (Т) вычисляли по • (Шлегель, 1987):
InN - InNo Т = tr--
tr - реальное время N - биомасса
No - биомаса в начальный момент времени ц. - удельная скорость роста бактерий
3.9 Получение экстрактов клепок бактерий
Для получения экстрактов клеток с целью изучения внутриклеточных углеводородов и определения активности формиатде-гидрогеназы клетки сульфатредуцирующих бактерий собирали центрифугированием при 7.000 g в течение 20 минут при темпе-
формуле
Полученные клетки ресуспендировали в том же фосфатном буфере из расчета 2,0 -2,5 мг сырой биомассы на 10 мл буфера и разрушали с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-2Т при частоте 22 КГц в течение 6 минут (три раза по 2 минуты), затем центрифугировали при 18.000 g - 1 час.
В опытах использовали супернатантную фракцию.
3.10 Определение рН и Eh в кулыауральаой яидкосш
Данные показатели (рН и Eh) определяли с использованием милливольтметра - рН-метра 673М по стандартным методам (Работнова, 1957).
3.11 Анализ газообразных соединений
Газообразные соединения анализировали на хроматографах "Chrom-4" и "Газохром-3101й по методикам, принятым для анализа соответствующих газов (Вяхирев, Шушунов, 1987).
Молекулярный водород определяли на колонке, заполненной активированным углем АГ-3. Длина колонки - 2,5 м внутренний диаметр - 3,5 мм.Температура колонки и детектора - комнатная. Скорость газов-носителей (аргон и воздух) - 15 мл/мин и ЗОмл/мин, соответственно.
Количество сероводорода определяли методом обратного йодометрического титрования (Лурье, Рыбников,1966). Сероводо-
род предварительно осаждали в виде CdS, для чего в пробу добавляли уксуснокислый кадмий. Затем осадок сульфида растворяли в НС1, а выделившийся сероводород окисляли 0,01N раствором йода. Избыток йода оттитровывали 0,01 N раствором тиосульфата натрия. Йод, израсходованный на окисление сероводорода, определяли по разности между добавленным количеством йода и избытком его. Содержание сероводорода в пробе рассчитывали по формуле и выражали в мг/л :
(VJ2 " Vt). 17,04. 1000. N32
X = - f Где
X - количество сероводорода в мг/л Vj2 - объем прибавленного йода, мл V - объем пробы, мл
Vt - объем тиосульфата, пошедшего на титрование, мл N^2 - нормальность раствора йода 17.04 - эквивалент сероводорода
При использовании сред, содержащих незначительные количества сульфатов (модифицированная среда Постгейта Д), сероводород определяли калориметрически, по изменению интенсивности окраски, образуемой при реакции железосодержащих квасцов с производным сульфида и И^-диметил-пара-фенилдиамина в кислой среде (Widdel, 1980).
Увеличение концентрации сероводорода в питательной среде служило критерием роста бактерий.
3.12 Определение углеводородов гааохромалюграфическим и мисс-спектрометрическим методами
Углеводороды из культуральной жидкости экстрагировали хлороформом в течение 24 часов после отделения клеток от ростовой среды центрифугированием при 7.000 g и проверки супер-натанта на отсутствие белка.
Идентификацию углеводородов осуществляли сравнением со спектрами стандартных углеводородов, используя Recording Integrator 2220 (LKB Bronna) и программу обработки данных на ЭВМ PC AT 286.
Концентрацию углеводородов определяли введением в анализируемую пробу внутреннего стандарта в виде н-алкана С±2.
Количественное содержание углеводородов по углероду (Су) определяли как - сумму концентраций, умноженных на число атомов углерода в молекуле продукта: п
Су - £ (Сх » Nx) су 1
Продуктивность сульфатредуцирующих бактерий рассчитывали по количеству углеводородов, синтезируемых 1 мг белка.
При изучении углеводородов масс-спектрометрическим методом в работе использовали хромато-масс-спектрометр "Hitachi М-80М" (Япония) с обработкой данных на ЭВМ PC AT 286.
3.13 Определение кислородсодержащих продуктов (кислот и спиртов) методом гаао-шдкостной хроматографии
Идентификацию осуществляли сравнивая полученные хрома-тограммы со спектрами стандартных растворов изучаемых соединений, используя интегратор Recording Integrator 2220 (LKB Bronna) и программу обработки данных на ЭВМ PC AT 286.
Концентрацию кислородсодержащих соединений определяли введением в анализируемую пробу внутреннего стандарта в виде пропанола.
Выход кислородосодержащих соединений по углероду (С0) определяли как - сумму концентраций, умноженных на число атомов углерода в молекуле продукта: п
0Со = £ (Сх • Nx) с0 1
Общий выход внеклеточных продуктов синтеза сульфатредуцирующих бактерий определялся как сумма углеводородов (Су) и кислородсодержащих продуктов (С0).
3.14 Тонкослойная хромапюгрвфия
Спирты определяли методом хроматографии на силуфоловых пластинках их динитробензоатов. Для этого к 20мл культуральной жидкости добавляли 0,1мл пиридина и 1мл бензола. К полученному раствору при охлаждении добавляли 1г К2СО3, а затем - 2мл бензола, содержащего 0,5г 3,5-динитробензоилхлорида. После встряхивания в течение 3 минут к раствору добавляли 30 мл эфира и встряхивали еще 10 минут. Затем эфирный экстракт очищали водой для удаления пиридина и наносили на пластинки. Разделение веществ проводили в растворителе: изоамиловый спирт-аммиак-вода (30:15:5) (Шталь, 1965).
3.15 Определение включения 14С и 3Н в биомассу бактерий и продукт жизнедеятельности клеток
С целью определения метки в биомассе, бактерии осаждали центрифугированием при 7.000 £ в течение 10 минут, отмывали фосфатным буфером (рН 7,0), полученный осадок ресуспендирова-ли в том же буфере (0,2 мл), наносили на фильтры и фиксировали 6N НС1. После высушивания фильтры заливали сцинтилляционн-ой жидкостью ЖС-1. Радиоактивность просчитывали на "Delta--300". Эффективность счета составляла 70-80%.
Содержание метки в СОг определяли в герметично закрытых пенициллиновых флаконах в атмосфере аргона, фиксируя газообразную пробу медленно пропуская ее через слой 20%-ного раствора NaOH. Взаимодействие С02 и NaOH проходило в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавляя 100 мкл 6N НС1. Флаконы открывали и 50 мкл пробы наносили на фильтры. Высушенные фильтры помещали во флаконы с сцинтилляционной жидкостью "Aquasol-2M. Радиактивность просчитывали на "Intertechnigue SL-30".
Определение метки в углеводородах осуществляли добавлением хлороформа к культуральной жидкости, после удаления клеток сульфатредуцирующих бактерий. Экстракцию углеводородов проводили в течение 60-90 мин. Затем хлороформ извлекали и
многократно промывали дистиллированной водой до полного исчезновения радиоактивной метки в промывных водах. Затем пробы наносили на фильтры и высушивали. Определение радиоактивности осуществляли во флаконах с сцинтилляционной жидкостью ЖС-7, на приборе "Delta - 300м. Эффективность счета составляла 80-90%.
Для определения метки в кислородсодержащих продуктах во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-7 вносили пробы культуральной жидкости (100 мл), после осаждения клеток центрифугированием и удаления из нее углеводородов с помощью хлороформной вытяжки. Радиоактивность просчитывали на "Delta-300", эффективность счета - 80-90%.
Содержание 14С в индивидуальных меченых соединениях определяли эллюцией данных веществ из соответствующих пятен после разделения кислородсодержащих соединений с помощью тон-. кослойной хроматографии. Анализ на содержание радиоактивности проводили указанным выше методом.
3.16 Аналитические методы
Перед анализами на содержание сульфатов, нитратов или аммония образующийся в пробах сероводород удаляли преципитацией с ацетатом цинка (67 мкМ/л конеч.конц.) с последующим центрифугированием.
Сульфат определяли методом, предложенным Ципионка, Пфеннигом (Cypionka, Pfennig, 1986).
Нитрат - методом Катальдо с сотр. (Cataldo et.al.,1975).
Карбонаты - в реакциях с формиатом (Вяхирев, Шушунов, 1987).
3.17 Определение лактата и пирувата
Определение лактата и пирувата проводили с помощью ферментативного воздействия на эти субстраты - лактатдегидроге-назы (Асатиани, 1969).
Реакционная смесь опытной кюветы для определения лактата включала; гидразинглицериновый буфер рН 9,5 - 1,8 мл; 5-102М раствор НАД - 0,2мл; исследуемый материал (культуральная жидкость без клеток бактерий) - 0,16 мл и Н20 - 0,4 мл.
Реакционная смесь опытной кюветы для определения пирувата включала: трисэтаноламиновый буфер рН 7,6 - 1,0 мл; 5-103М раствор НАДНг - 0,04 мл; исследуемый материал (культуральная жидкость без клеток бактерий) - 2,0 мл.
В контрольных кюветах и в том и другом вариантах исследуемый материал был заменен на дистиллированную воду.
Изменения происходящие в реакционной смеси регистрировали на спектрофотометре иСФ-26" при длине волны 340 нм.
Количество лактата или пирувата (в мкМ) расчитывали по формуле:
X = - где
D0 - оптическая плотность (за вычетом контроля)
R - разведение пробы, мл
Е - коэффициент экстинкции НАД или НАДНг, мкМ-1см-1
d - толщина кюветы, см
3.18 Определение ашавност формиатдэгидрогеназы
За единицу активности фермента принимали восстановление. 1 мкМ метилвиологена в 1мин. 1 мг белка, по формуле:
АФ = - (мкМ.мин1.мг-1 белка)
h - высота пика, см
V - объем реакционной смеси, мл
Е - коэффициент экстинкции метилвиологена
0,1 - коэффициент для перевода в единицы оптической
плотности
t - время, мин
с - содержание белка в препарате, мг
3.19 Устройство для создавая различных значений окислительно-восстановительного потенциала среды при культивировании сульфатредуцирующих бактерий
Использованное устройство создано на основе работ Работ-новой (1957), Вайнштейна и Гоготовой (1987). Основной принцип действия заключается в снижении потенциала среды активным водородом, который образуется в результате электролиза на катоде и диффузно поступает в сосуды, насыщая их водородом. Электрически образуемый кислород в сосуды со средой не поступает, так как анод сообщается с остальной системой только через КС1 - агаровый сифончик. Величина Eh зависит от силы тока, которую можно регулировать. Градиент Eh после выключения электрического тока сохраняется в сосудах в течение двух суток. Установленные значения Eh определяли в контрольных опытах со стерильной средой, соответствующей опытным флаконам и обработанной той же силой тока.
Изменения Eh питательной среды осуществляли также, используя химические соединения с окислительными и восстановительными свойствами (дитионит, марганцово-кислый калий),предварительно подбирая необходимые значения Eh в контрольных вариантах.
3.20 Характеристика биореактора, используемого для моделирования экспериментов
Биореактор (2,5 л) был сконструирован из нержавеющей стали. Его конструкция позволяла регистрировать значения рН и Eh питательной среды, создавать условия протока газовой смеси и питательной среды, производить отбор проб в течение эксперимента.
3.21 Математическая обработка результатов исследований
Полученные экспериментальные данные обрабатывали согласно общепринятым методам (Плохинский, 1978). Результаты считали статистически достоверными при среднеквадратичном отклонении 6 < 10%. В качестве критерия достоверности разности полученных результатов использовали критерий Стьюдента.
ГЛАВА 4 СПОСОБНОСТЬ СУЛЬФАГРЕДУ1ШРУШЩ БАКТЕРИЙ ПРОДУЦИРОВАТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ УГЛЕВОДОРОДЫ
4.1 Способность Desulfovibrio desulfuricans
к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях гетеротрофного роста
В опытах использовали два штамма сульфатредуцирующих бактерий: Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 и Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799. Изучение синтеза углеводородов в условиях гетеротрофного роста бактерий проводили на среде Постгейта В, содержащей в качестве источников энергии и углерода лактат кальция и дрожжевой экстракт. Рост бактерий осуществляли в герметично закрытых флаконах, при отношении питательной среды и газовой фазы 1:2. В качестве газовой фазы использовали аргон или смесь молекулярнного водорода - 95% и СОг - 5% (19:1).
Рост бактерий оценивали по увеличению количества белка и сероводорода. Контролем служили пробы, взятые в начальной точке культивирования бактерий, результаты анализа которых отражены при построении графиков в нулевой точке (рис. 2, 3).
Исследования показали, что при росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 и Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на органическом субстрате (лактат кальция + 0,1% дрожжевого экстракта) в атмосфере аргона или Нг + СОг в культуральной жидкости происходит накопление различных продуктов метаболизма. Результаты динамики роста и накопления внеклеточных продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 представлены на рисунке 2.
Как видно из полученных данных прирост биомассы D.desulfuricans ВКМ 1388 на лактате в атмосфере аргона на 72 час достигает 160,0 ± 2,5 мг/л (lg + 2.20), сероводорода -330,0±2,5 мг/л (рис. 2а). Параллельно увеличению биомассы штамма в культуральной жидкости происходит накопление кислородсодержащих продуктов. Количество углеводородов незначительно и остается без изменений в процессе роста бактерий.
При выращивании бактерий на органическом субстрате в атмосфере водорода и углекислого газа (рис. 26) кривая роста штамма была идентична росту бактерий в атмосфере аргона. Количество сероводорода, несмотря на стационарную фазу роста популяции (44-48 час), продолжает увеличиваться и достигает на 72 час 397,0±2,4 мг/л по сравнению с 330,0±2,5 мг/л при росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 в атмосфере аргона. В культуральной жидкости по мере роста бактерий увеличивается количество кислородсодержащих продуктов, что отмечалось при росте штамма в атмосфере аргона. Однако основное изменение в накоплении внеклеточных продуктов метаболизма D.desulfuricans ВКМ 1388 было связано с углеводородами. Количество последних возрастало в 2,0-2,2 раза в период активного размножения штамма и не менялось с прекращением его роста.
Близкие результаты получены при росте на лактате в атмосфере аргона или Н2+СО2 D.desulfuricans ВКМ 1799 (рис. 3). Культура D. desulfuricans ВКМ 1799 была более активна, чем D. desulfuricans ВКМ 1388. На лактате в атмосфере аргона у этой культуры период лаг-фазы был в 1,5 раза короче, чем у D.desulfuricans ВКМ 1388 (рис. За). Прирост биомассы по белку для D.desulfuricans ВКМ 1799 на 66 час достигает
|—1—J—I—I—|—I—I—I—I | i I—I—I—J—I—I—I—I—| v
00* 00? 00Z 001 0 3
6| 'и/ъяиар an
, NNN NNMr-T-i-^-r-T-i-t-T-r-
|—I—I—I—I—|—I—I—I—I—[—1—1—I—I—|—I—I—I—Г
0| ц/яяиар an
у. H м м M
ir/аи s*H
I—I—I—I—1—(—1—i—i—i—j—i—n—i—J—i—J—\—i—|
00* OOC OOZ 001 0
6|' ц/вяиэр ли
ir>'«l-»or>j*-ocngor-»<Okr>^ro<NT-a NNNNNN^i-'-'- -г-
о ю Q ю О
о Is- «5 с*
ir/jjf '<Ai
00C 002 001- a f
z.4> - n
Б) 'u/muag an
• • ■ • * • • ; I *
N N N rg (N <N -г- — -r-^-,- —
Q О О О О
Ч- Ю <N ^
245,0±2,0 мг/л (lg + 2,39), сероводорода - 400,0±3,0 мг/л. Общее количество кислородсодержащих продуктов и углеводородов было несколько больше (на 80,1±0,8 мг/л), что объясняется, по-видимому, более активным приростом биомассы.
При выращивании D. desulfuricans ВКМ 1799 на лактате в атмосфере Н2+СО2 (рис.36) активность этой культуры была выше, что проявилось в сокращении периода лаг-фазы в 2 раза и в увеличении количества биомассы по сравнению с ростом культуры в атмосфере аргона. Максимальное количество белка на 66 час составляет 250,5±2,0 мг/л (lg+2,40), количество сероводорода - 452,0±3,2 мг/л. Увеличение биомассы Desulfovibrio vulgaris при росте культуры в присутствии молекулярного водорода отмечается в работе Панкхания с соавторами (Pankhania et.al., 1986).
Общее количество внеклеточных продуктов, синтезируемых. клетками D.desulfuricans ВКМ 1799, в литре питательной среды было на 91,8±3,0 мг/л больше, чем у D.desulfuricans ВКМ 1388. Поскольку прирост биомассы в зависимости от штамма культуры и состава газовой фазы был различным, для сравнения отдельных вариантов опытов определяли продуктивность клеток, которую рассчитывали, как указано в разделе " Объекты и методы исследований", отношением количества синтезированных бактериями внеклеточных продуктов метаболизма (кислородсодержащие продукты и углеводороды) на 1 мг белка (табл. 1,2).
Результаты анализа показывают, что в присутствии двуокиси углерода и молекулярного водорода в культуральной жидкости увеличивается количество продуктов метаболизма, как у D. desulfuricans ВКМ 1388, так и D. desulfuricans ВКМ 1799. Общее количество экзометаболитов при росте культуры в газовой
Таблица 1
Количество продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 на среде Постгейта В в зависимости от биомассы и состава газовой фазы
) Газовая | Продукты метаболизма * |
I I-1-1-1-1-1
| аргон | 600,D ± 3,2 | 2,5 ± 0,3 | 3,77 ± 0,04 | 0,02 | 1,56 ± 0,16 1
| 1 (99,6) | (0,4) | | | |
I | (99,2) | (0,8) | ! I I
* За вычетом компонентов, содержащихся в среде до начала опыта
Таблица 2
Количество продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на среде Постгейта В в зависимости от биомассы и состава газовой фазы
Газовая
Продукты метаболизма
Кислород-фаза | содержащие соединения, мг/л, (X)
Углеводороды мг/л, (Л)
Продуктивность, экзометаболиты, мг/мг белка
Продуктивность, углеводороды мкг/мг белка
Углеводороды, % от биомассы (по белку)
680,0 ± 2,5 (99,5)
774,2 ± 3,2 (99,2)
3,4 ± 0,2 (0,5)
6,4 ± 0,2 (0,8)
2,79 ± 0,01
3,12 + 0,02
1,39 ± 0,07
2,56 ± 0,05
* За вычетом компонентов, содержащихся в среде до начала опыта
фазе, состоящей из Н2+СО2» по отношению к росту в атмосфере аргона составляет для D.desulfuricans ВКМ 1388 - 116% и для D.desulfuricans ВКМ 1799 - 114%. Данные показатели свидетельствуют о равнозначном отношении штаммов бактерий к изменению условий газовой фазы питательной среды.
Внеклеточные продукты метаболизма во всех вариантах опыта (в атмосфере аргона и Н2+СО2), в основном, представлены кислородсодержащими соединениями углерода, что соответствует результатам работ проводимых ранее (Badziong et.al., 1979; Traore et.al.,1981).
В атмосфере Н2+СО2» кроме кислородсодержащих продуктов, содержатся углеводороды, включающие широкий спектр соединений от Сц до С24 как нормального, так и изостроения (рис. 4). Преобладающими продуктами являются алифатические углеводороды нормального строения, отношение н-алканов к изоалканам 2,0-. -3,0 в зависимости от фазы роста бактерий.
Существенно отметить, что увеличение внеклеточных углеводородов при росте D.desulfuricans ВКМ 1388, так и D.desulfuricans ВКМ 1799 в атмосфере Н2+СО2 происходит параллельно с нарастанием биомассы, т.е. в период максимальной физиологической активности бактерий и не является следствием разрушения клеток. Об активности бактерий в период синтеза углеводородов можно судить по удельной скорости роста (0,07 ч"1 и 0,13 ч"1 соответственно) и по концентрации сероводорода, образованного клетками на период стационарной фазы роста культур (72% для D. desulfuricans ВКМ 1388 и 82% - для D. desulfuricans ВКМ 1799 от теоретически возможного).
Известно, что бактерии рода Desulfovibrio не растут на среде с лактатом в отсутствие сульфатов из-аа увеличения пар-
a) Desulfovibrio desulfuricans ДОf 1388 6) Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799
Рис. 4 Спектры ввекяеоочаых углеводороде» Desulfovibrio desulfuricans (BKM 1388 и BKM 1799) при родое ва среде Пооягейоа В в аяаюсфере B2+CQ2
циального давления водорода, образующегося при окислении лактата (Bryant et.al., 1977). Представляло интерес выяснить, как отразится на росте и образовании углеводородов сульфатредуцирующих бактерий снижение концентрации SO42" в питательной среде, при наличии СО2 в газовой фазе.
В опытах использовали D.desulfuricans ВКМ 1388 и D.desulfuricans ВКМ 1799. Бактерии выращивали на среде Постгейта В в принятых нами условиях, в атмосфере Нг+СОг с понижением количества сульфата в питательной среде от 3,5 г/л до 2,0 г/л и 0,5 г/л (рис. 5).
Как видно из диаграмм, наблюдается четкая корреляция синтеза углеводородов в зависимости от количества сульфатов в питательной среде. По-видимому, снижение концентрации SO42" в питательной среде способствует частичному перераспределению потока Н+ от S042" к СОг, что вызывает увеличение ко-• личества углеводородов в культуральной жидкости.
В связи с вышеизложенным, в дальнейших исследованиях использовали среду названную нами "модифицированной -средой Постгейта Д", концентрация сульфатов которой составляла 0,5 мг/л. Общий состав модифицированной среды Постгейта Д приведен в разделе " Объекты и методы исследований".
Результаты динамики роста и образования продуктов метаболизма штаммами D.desulfuricans ВКМ 1388 и D.desulfuricans ВКМ 1799 на модифицированной среде Постгейта Д в атмосфере аргона и смеси газов Н2+СО2, представлены на рис. б и 7.
Как показали исследования, значительное снижение концентрации сульфатов ( 7 раз) в принятых нами условиях уменьшает интенсивность роста бактерий и концентрацию синтезируемого клетками сероводорода. Прирост биомассы при культивиро-
П l/l l/l l/l
3,5 г/л SO42"
a) Desulfovibrio desulfuricans BKM 1388
/1 /1 /1 /1 /1 /1
3,5 г/л SO42"
6) Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799
Рис. 5 Изменения в процессе роста и образования углеводородов сульфалфедуицрувщши бактериями в зависимости от концентрации сульфата в питательной среде (газовая фаза И2+СО2); / - углеводорода, - биомасса t - - сероводород
if/iOT 4S*H
I I I I I I
6| 'U/vmu9j> an
u/jn 'ал { i t i i—|—i—i—i—?—]—i—i—i—i—|—i—i—i—i—|
Q О О О О
6( u/vauBp jh
f NN itt oj r<i ei v- iJ «-!«-* «J
001 SL OS SZ 0 g
Б| 'и/стшэр ля
n n n n n <n •«- — ^ -- -r-
и/ап ал i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—I—i—i—i—i—i—i—»—п—|
p О О О О
Ч П <N
В| V/WUHSQ он
вании сульфатредуцирующих бактерий на лактате в атмосфере аргона на период стационарной фазы роста составил 135,0±2,2 мг/л (lg+ 2,13) для D.desulfuricans ВКМ 1388 и 165,2±1,9 мг/л (lg + 2,22) для D desulfuricans ВКМ 1799. Содержание сероводорода 50-60 мг/л (рис. 6а и 7а).
При выращивании бактерий на лактате в атмосфере Н2+СО2 (рис. 66 и 76) с небольшим содержанием сульфатов в среде наблюдаются незначительные изменения в приросте биомассы и образовании H2S по сравнению с ростом бактерий в атмосфере аргона. Количество белка возрастает, как и в случае использования среды Постгейта В и составляет для D.desulfuricans ВКМ 1388 -140,0±2,4 мг/л (lg + 2,15), для D.desulfuricans ВКМ 1799 -170,5±1,9 мг/л (lg * 2,23). Удельная скорость роста бактерий не изменялась (0,07 ч-1 для D.desulfuricans ВКМ 1388 и 0,13ч"1 для D.desulfuricans ВКМ 1799).
По мере нарастания биомассы при росте культур на лактате, как в атмосфере аргона, так и смеси газов (Нг+СОг), происходит увеличение количества внеклеточных кислородсодержащих продуктов и углеводородов, что отмечалось в опытах на среде Постгейта В.
Общее количество зкзометаболитов на модифицированной среде Постгейта Д в атмосфере Н2+СО2 по отношению к продуктам, синтезированным в атмосфере аргона 117% - для штамма ВКМ 1388 и 115% - для штамма ВКМ 1799 D.desulfuricans.
Основные изменения в синтезе внеклеточных соединений при уменьшении сульфатов в питательной среде связаны с увеличением количества углеводородов. Так содержание углеводородов на модифицированной среде Постгейта Д в атмосфере аргона повышается до 6,0-8,0 мг/л по сравнению с количеством углеводоро-
дов, присутствующих в питательной среде до начала опыта за счет внесения дрожжевого экстракта и посевного материала, а в атмосфере Н2+СО2 - до 15,0-19,0 мг/л.
Сравнительные результаты по синтезу внеклеточных продуктов метаболизма сульфатредуцирующими бактериями в зависимости от биомассы и состава газовой фазы на модифицированной среде Постгейта Д приведены в таблицах 3 и 4.
Из данных таблиц видно, что в указанных выше условиях культивирования, основными внеклеточными продуктами метаболизма сульфатредуцирующих бактерий, также как и на среде Постгейта В, являются кислородсодержащие соединения. Количество углеводородов в атмосфере Н2+СО2 увеличивается более, чем в два раза по сравнению с аргоном.
Сравнение спектров углеводородов на модифицированной среде Постгейта Д со спектрами, полученными на среде Постгей-. та В, показало, что несмотря на изменения в количестве отдельных фракций, общим для внеклеточных углеводородов D.desulfuricans является область обнаружения Сц-С24» с преобладанием нормальных алканов (рис. 8).
Масс-спектрометрические исследования внеклеточных углеводородов, продуцируемых D.desulfuricans ВКМ 1388 и ВКМ 1799, подтвердило полученные результаты и позволило более точно установить их присутствие в культуральной жидкости, а также идентифицировать качественный состав.
Таким образом, сульфатредуцирующие бактерии D.desulfuricans ВКМ 1388 и D.desulfuricans ВКМ 1799 при росте на среде с лактатом и небольшим количеством сульфатов способны синтезировать внеклеточные углеводороды особенно в присутствии в Н2+СО2 в газовой фазе.
Таблица 3
Количество продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 на модифицированной среде Постгейта Д в зависимости от биомассы и состава газовой фазы
Газовая
Продукты метаболизма
Кислородсодержащие соединения, мг/л, (%)
Углеводороды мг/л, (%)
Продуктивность, экзометаболиты мг/мг белка
Продуктивность, углеводороды мкг/мг белка
Углеводороды, % от биомассы (по белку)
587,2 + 3,0 (99,0)
677,0 ± 2,8 (97,8)
6,0 + 0,3 (1.0)
15,2 ± 0,4 (2;2)
4,39 + 0,05
4,94 + 0,06
4,44 + 0,15
10,86 ± 0,10
* Эа вычетом компонентов, содержащихся в среде до начала опыта
Таблица 4
Количество продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на модифицированной среде Постгейта Д в зависимости от биомассы и состава газовой фазы
Газовая
I Продукты метаболизма * | 1 1 1
| содержащие { мг/л, (%) | экзометаболиты | углеводороды | % от биомассы |
] соединения, | | мг/мг белка | мкг/мг белка | (по белку) 1
* За вычетом компонентов, содержащихся в среде до начала опыта
4.2 Сравнительная характеристика спектров внутри и внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans
Как отмечалось в обзоре литературы, многие бактерии, в том числе и бактерии рода Desulfovibrio, способны к синтезу внутриклеточных углеводородов (Davis, 1968; Bird, Lynch,1974; Tornabene, 1976, 1983; Дедюхина, Желифонова, Ерошин, 1980).
Представляло интерес провести сравнительное изучение спектров внутри и внеклеточных углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans. Исследования проводили в атмосфере аргона и Нг+СОг.
Результаты сравнительного изучения параметров внутри и внеклеточных углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 и Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, показали, что углеводороды, выделенные из клеток этих бактерий, выросших в атмосфере аргона или Н2+СО2, представлены ал-канами СЦ-С35 (табл. 5, 6).
Основная доля внутриклеточных н-алканов приходится на высокомолекулярную часть С25-С35 ( 70-80% отн.), что соответствует результатам, полученным в работе Девиса (Davis, 1968). Количество изомеров и изопреноидов невелико. Коэффициент нечетности близок к 1,0, что согласуется с данными
Таблица 5
Характеристика спекторов внутри и внеклеточных углеводородов, выделенных из клеток Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 и куль тураль ной жидкости, на период начала стационарной фазы роста (44 часа)
Газовая| фаза
Локализация
Количество углеводородов, X отн. -,-
I Cu-Cia I С19-С24
L Ссог+нг/Саг
L С норм
Е С изо
Е Снеч/Счет
внутриклет. углеводор.
аргон | 7,9±1,2
Н2+СО2 I 5,4±0,8 -1-
16,3+2,3 17,0±2,0
75,8±4,2 77,6±3,5
внекдеточ.
углеводор.
аргон j 49,7+3,8
Н2+СО2 | 53,2+2,8
39,8+4,8 43,2+4,2
10,5+4,5 3,6±2,0
Таблица б
Характеристика спекторов внутри и внеклеточных углеводородов, выделенных из клеток Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и куль тураль ной жидкости, на период начала стационарной фазы роста (34 часа)
1 | Локализация 1 1 | Гаговая| Количество углеводородов, % отн. 1
литературы.
В атмосфере Н2+СО2 количество внутриклеточных углеводородов увеличилось в 1,5-2,0 раза по сравнению с количеством их в клетках Desulfovibrio desulfuricans, растущих в атмосфере аргона без существенных изменений в соотношении между группами углеводородов с различной длиной углеродной цепи.
Применение указанных выше изменений в методике хромато-графирования углеводородов позволило расширить спектр внеклеточных углеводородов с Сц-С24 до С11-С35, тем не менее основная доля данных углеводородов приходится на ранее исследованную более низкомолекулярную часть Сц-С2480£ отн. Изо-преноиды и изомеры присутствуют в незначительных количествах, как и в случае с внутриклеточными углеводородами.
В атмосфере Н2+СО2 происходит более интенсивный синтез внеклеточных углеводородов по сравнению с изменениями в образовании внутриклеточных углеводородов. Увеличение количества внеклеточных углеводородов в 2-3 раза при росте бактерий в атмосфере Н2+СО2 по сравнению с ростом Desulfovibrio desulfuricans в атмосфере аргона, происходит за счет синтеза внеклеточных углеводородов с длиной углеводородной цепи Сц-Ci в и С19-С24» что отражено в данных та)блиц. Такая закономерность характерна как для Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388, так и для Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799.
Сравнительная характеристика внутри и внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans показала, что обнаруживаемые нами в различных экспериментах внеклеточные углеводороды не являются результатом лизиса клеток, так как углеводороды С25 - С35, характерные для клеток Desulfovibrio desulfuricans, присутствуют в них в следовых количествах.
4.3 Способность других представителей сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях гетеротрофного роста
В работе использовали сульфатредуцирующие бактерии, принадлежащие к разным родам и видам (Розанова, Назина,1989; Gibson, 1991; Widell, Pfennig, 1984). Исследуемые бактерии различались по морфологии и физиологии. Среди них были вибрионы (p. Desulfovibrio), палочки спорообразующие (p. Desulfotomaculum) и бесспоровые (p. Desulfomicrobium, p. Desulfobacterium, p. Thermodesulfobacterium). Микроорганизмы, имеющие различный состав клеточной стенки (грам-отрицательные -p. Desulfovibrio и грам-положительные - p. Desulfotomaculum) - б видов, мезофильные бактерии, 3 вида (Dtm. kuznetsovii, Thermodesulfobacterium mobile u Dtm. nigrificans) - термофилы. Однако общим свойством в физиологии этих бактерий является способность к сульфатредукции при окислении лактата до ацетата и СОг, либо (2 вида: Desulfotomaculum kuznetsovii, Desul-fobacter postgatei) - до СОг •
Способность к окислению лактата позволила всем исследо-
ванным нами видам сульфатредуцирующих бактерий активно размножаться в принятых нами условиях опыта. Отмечались лишь незначительные различия в продолжительности лаг-фаз, фаз логарифмического роста и, соответственно, во времени выхода культур на стационарную фазу роста. Тем не менее, все исследуемые
бактерии на 48 час находились в стационарной фазе развития популяции. Данные этого периода отражены в таблице 7.
Наибольшее количество биомассы продуцировала культура Desulfobacter postgate! ВКМ 1643. Способность культуры этого рода к интенсивному накоплению биомассы отмечалась Видделом и Шаудером с сотрудниками (Widdel, 1987; Schauder et.al.,1987) при росте бактерий на среде с ацетатом. Desulfobacter post-gat ei ВКМ 1643 имела самую высокую удельную скорость роста -0,15 ч"1. Высокую удельную скорость роста имели также культуры Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и Desulfomicrobium baculatus ВКМ 1378. Несколько меньшую биомассу, по сравнению с указанными выше сульфатредуцирующими бактериями, продуцировали культуры рода Desulfotomaculum, что также соответствует данным ряда работ (Liu, Peck, 1981; Peck, LeGall, 1987).
Все исследуемые нами сульфатредуцирующие бактерии в том или ином количестве синтезировали внеклеточные углеводороды. Большее количество углеводородов продуцировали Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, Desulfomicrobium baculatus ВКМ 1378, Desulfotomaculum nigrificans BKM 1492. Эти бактерии, имеющие значительные различия в морфологии, по типу метаболизма близки и относятся к группе А, т.е. способны окислять лактат до ацетата и СОг (Розанова, Назина,1989).
Количество синтезированных углеводородов у большинства исследуемых сульфатредуцирующих бактерий при расчете на мг белка составляет 0,07-0,11 мкг. Исключением является Desulfobacter postgatei продуцирующий всего 0,03 мкг углеводородов на мг белка и осуществляющий окисление ацетата в ЦТК до СОг (Thauer, Moller-Zinkhan, Spomann, 1989).
При анализе зависимости количества биомассы сульфатреду-
Таблица 7
Показатели роста культур и синтеза внеклеточных углеводородов продуцируемых на период стационарной фазы
i— 1 -т— i I I i 1
1 1 | Белок ! Количество | Продуктив- | Углеводо- |
| Вид Микроорганизмов } ti | мг/л ! углеводо- | ность MKT 1 роды % от |
I desulfuricans ВКМ 1799 ! 0,13 | 170,5+1,9 | 18,9Ю,8 | 0,11 I 11,09+0,34 |
1 2 | Desulfovibrio | 1 1 1 1
| gig-as ВКМ 1382 | 0,08 | 150,0±2,0 | 11,2Ю,7 | 0,07 J 7,47+0,36 !
1 з I Desulfovibrio 1 1 1 1 !
I vulgaris ВКМ 1870 | 0,06 | 145,011,8 ( 9,910,9 | 0,07 { 6,8310,53 J
1 4 I Desulfotomaculum | 1 1 1 1
i nigrificans BKM 1492 I 0,08 | 138,211,6 f 14,910,6 | 0,11 1 10,78+0,31 !
1 5 I Desulfotomaculum | 1 1
| kuznetsovii BKM 1805 | 0,06 1 138,011,8 | 9,5+0,6 | 0,07 | 6,88+0,34 |
1 6 | Desulfobacterium | 1 1 1 !
I maoestii BKM 1598 I 0,07 ! 140,011,9 | 9,8Ю,8 | 0,07 ! 7,ООЮ,47 J
1 7 I Desulfomicrobium | 1 1 1
I baculatus BKM 1378 | 0,08 | 150,012,0 | 16,2+0,9 | 0,11 ! 10,80Ю,45 |
1 8 I Thermodesulfobacte- | 1 I 1 »
i rium mobile BKM 1128 ! 0,06 | 150,212,0 | 9,610,7 | 0,06 } 6,39+0,38 1
1 9 | Desulfobacter j 1 1 1 1
I postgatei BKM 1643 | 0,15 | 176,012,5 | 4,810,5 | 0,03 | 2,73+0,18 1
1 i « « 1 |
цирующих бактерий и синтезируемых ими внеклеточных углеводородов показано, что прямой корреляции между этими показателями не наблюдается. Так при активном росте Desulfobacter postdatei синтезирует следовые количества углеводородов, а Desulfovibrio desulfuricans при таком же количестве биомассы синтезирует наибольшее их количество по сравнению с другими изучаемыми нами видами. Однако снижение прироста биомассы вызывает уменьшение конценрации углеводородов в культуральной жидкости.
Таким образом, полученные нами результаты показывают, что количество синтезируемых сульфатредуцирующими бактериями углеводородов определяется количеством продуцируемого ими белка и типом метаболизма.
Синтезируемые сульфатредуцирующими бактериями углеводороды представляют собой смесь алифатических углеводородов как нормального, так и изостроения. Данные масс-спектрометрического анализа внеклеточных углеводородов, синтезируемых различными культурами представлены на рисунках 9-17.
Несмотря на разнообразие видового состава сульфатредуцирующих бактерий, спектры углеводородов имеют большое сходство. Незначительные отличия в них у отдельных видов могут быть результатом неполного соответствия параметров окружающей среды (Tornabene, 1982). Все обнаруженные нами углеводороды располагаются в области Сц-С24- В спектрах отмечается значительное преобладание нормальных алканов 85-91%, количество изоформ - 8-15% (табл.8). Среди углеводородов не обнаружены концентрационные максимумы, но отмечается большее количество углеводородов с длиной цепи Cn-Cie, в основном, за счет углеводородов Cie-CiQ. В суммарном количестве углеводородов
100 200 I.I.i.I.I.i.I.I.I.I.I.I.I.I.I.I.i.I.».I.I.I.I.
i.i.i.i.i.t.i.i.i.i.i.
129 171 207 256280
iIit■ 1 "
i.i.iVfl^il.
85,1 2.4, 32,5
Hiffll.Tn M.,
186 227 1 290 ■' ".1.1 I U > ■.I i
355 ' ••
160 210 LltlljJi—J
147j6S 207233 I 290 324 360
4ll lit I<• I I"'II I it hi I И
SAMPLE NO. SCAN NO. T1ME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME< MI N.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. IIME<MIN. )
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN. )
SAMPLE NO. SCAN NO. T1 ME < hIN. )
51 290 16.0
51 330 id. г
51 440 24. 3
51 510 28. 1
Масс-спентр внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Но + СО<г
100 200 i I.I.I.I.I i i 11 111, 111 11 I 11 111
300 400 500
All. "ЗЛЕЕ T
|М,У&» и. ™ ?!
j 147178 220 £80 ШЫIhLJl
11.133167 I
131 207 S,81 8
I'Jli III I 48S T
I'M I i mv> 11 |Ti и i-M-iVfi-ri 11 m[p i n и i i3r|
SAMPLE NO. SCAM NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIMECMIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIMECMIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. T1ME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
: 58 I 50 i 2.7
I 58 < 100 J 3.5
1 58 : 150 t 8.2
SAMPLE NO. SCAN NO'. IME<MIN.)
58 200 11.0
» 58 J 250 I 13.8
J 58 I 300 : 16.5
» 58 : 350 » 19.3
J 58 s 400 s 22.1
Масс-спектр внеклеточных углеводородов Desulfovibrio gigas BKM 1759 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Hz + COz
юо еоо эоо 4оо
tr/i'.241."
llil'l'i '.<7
i w l 123 178 221
1 * 11 11 4. ■ i ■ ■L
Hi li i A n
Г||н,!,38 ■ If4 356
330357 —I-i-
SAMPLE N0 Щ ♦ • 52
SCAN NO. : 50
TIME<МIN. > 2.7
SAMPLE NO « i 52
SCAN NO. ; 100
TIME<MIN. ) i 5.5
SAMPLE NO • i 52
SCAN NO. t 150
TIMECMIN. ) i 8.2
SAMPLE NO • • « 52
SCAN NO. : 200
TIMECMIN. > : 11.0
SAMPLE NO • i 52
SCAN NO. ■ • 250
TIME<MIN. ) ! 13.8
SAMPLE NO a • 52
SCAN NO. : 300
TIME<MIN. ) « • 16.5
SAMPLE NO • « Щ 52
SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE ДО. SCAN NO. TIME<MIN.)
г 350 : 19.3
: 52 » 400 > 22.1
Масс-спектр внеклеточных углеводородов Desulfovibrio vulgaris BKM 1760 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Но + СОо
t00 800 300 400
I.I.I.I. I.I.!■■■.1.1.I.I.I.I.l.l.l ■■■I.I.I.1.1.1. 1.1.1. 1.1.
J i I. I£9 171 207 236280 335 m> I ' ■ ■ ■ >—iujiL-—
12-5 256 | 157185213 I 280 325
^ "I '' " ' ■'
281 341 ji!) i
x'->7 236
186 227 1 £90
l,iiiij.it.li8i?2Л i. 1.1 11
H?ifc3 г07еэз I 290 3£4 360
mi ill i i. 1 i. I ■> ■ чlL
^.■i^imtV.
356 тЧччч
SAMPLE NO. SCAN NO. TIMEOIIN. )
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME <MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIKE<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SCAN NO. TIME<MIN.)
« 51 : 230 : 13.8
: 51 : £90 : 16.0
s 51 : 330 t 18.2
i SI t 370 г 20.4
J SI : 410 : 22.6
J 51 x 440 i 24. 3
• 51 s 470 : 25.9
: 51 < 510 J 28. 1
Масс-спектр внеклеточных углеводородов Desulfotomaculum nigrificans ВКМ 1492 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Hz + СО2
100 200 300 400 500
.11 111 11 I 11
221 282 JjI I
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<hIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIMECMIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN. )
i 59 i 280 : 15.4
J 59 > 300 t 16.5
« 59 t 320 i 17.6
i 59 : 340 s 18.7
J 59 J 360 J 19.8
I 59 : 380 : 21.0
s 59 : 400 : 22.1
i 111 111 11 111 111 111 11 11 i и i 11 11 i и i 111 11 i п и i 11
100 200 300. 400 300
Рис. 13 Масс-спектр внеклеточных углеводородов
Desulfotomaculurn kuznetsovii BKM 1805 про росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Hz + СО2
■ i.i.i.i.i.t,hf. ■.i.i.i.t.i. i Л. 1.1.i.i.i.i.i.i.i. 1.1.1.i.i. i. i.i. ■■■
Ы i"»'.г.9.
171 207 256280 355 JLilb-j-1I---i
1.1'lffl. ',57'.8",13 I »«»
I ■» • П >3*1
341 —It. J-
Ш186 227 L S90 "I ■!.t.tJiii,
ill! If! ^802102,3*1
illli lL.itЛ", J i. 1. \
I1J ^2147 180-07 г39 г'80 316
147i68 207a33 ll> I ■■ t ii
" I' «HI III I ■■ t M I I
67 96 гбг
It J ||.^{иК.11• ■ ■ Л, ■ I >11 ■. ■ ■
290 324 360 JLJl il
чЧччч1
SAMPLE N0 Щ 1 51
SCAN НО. • • 250
TIME<MIN. ) i 13.8
SAMPLE NO • 5 51
SCAN HO. • • 290
TIME<MIN. > • • 16.0
SAMPLE NO m • • 51
SCAN NO. ■ • 330
TI ME < MIN ) t 18.2
SAMPLE NO • t SI
SCAN NO. 1 370
TIME<MIN. ) • 20.4
SAMPLE NO : 51
SCAN NO. • 410
TIME<MIN. > • • 22.6
SAMPLE NO » • 51
SCAN NO. : 440
TIME<MIN. ) 1 24.3
SAMPLE NO • I 51
SCAN NO. 1 470
TIME<MIN. ) 1 25.9
SAMPLE NO « 1 51
SCAN NO. 1 510
TIMECMIN. ) s 28. 1
Рис. 14 Масс-спектр внеклеточных углеводородов
Desul fomi crobi um baculatus BUM 1378 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Hz + ОО2
100 I м 1111111111111
300 ■'■1 ■■ ■
I (,J 1.£9 17*07239 280 335
•L-h- ■ ■ > ■1 •1-i—1-к--—
. 1 1 1 1 1 1
5|[82 I I 1118 1
llHJlllllii
49 I 849 1111-1—
123151 207.1b
I 310 355 412 J1L-11
J.I I. 1 32733.6 412 ■ -I' 'I 'llLiL-U
281 355 I 3261
Пл.» I L.
249 j 341 416
200 300 400
SAMPLE NO. SCAN NO. TIMECMIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. Т1МЕ<МЩ. )
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
1 60 1 100 » 5.5
I 60 J 140 i 7.7
: 60 : 180 1 9.9
: 60 > 220 : 12.1
: 60 i 260 : 14.3
: 60 : 300 J 16.5
i 60 : 340 « 18.7
: 60 : 380 : 21.0
Масс-спектр внеклеточных углеводородов Desulfobacterium macestii BKM 1598 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Н2 + СО2
100 £00' 300 400 500
17Ж07239 290 355
^ 249 *ll <41. i If. Ill
I Л831,51, £07 2f31310 355 412
iinUn.i 'ii,Lu■»Ziiz.
98 14? I I 17?
I.1. i I 1.
| 32 735 6 412 ' * ' ■ i II I. '
■.Э-8*1 I
1,110145 j £.81
lllil.li» IIti,.1
1, r. I r-.
131 £07 281 355
I HI)L!JI I Iu
SAMPLE NO. SCAN NO. TIMECMIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TI ME < MIN. )
SAMPLE NO. SCAN NO. T I ME < MIN
SAMPLE NO. SCAM NO. TIMECMIN. )
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME <MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN N0. TIME<MIN.)
i 60 i 100 J 3.5
t 60 : 140 : 7.7
: 60 : 220 : 12. 1
60 260 14.3
t 60 i 300 J 16.5
: 60 : 340 i 18.7
Масс-спектр внеклеточных углеводородов Thermodesulfobacterium mobile BKM 1128 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Hz + СОг
loo гоо зоо 4oo
55 84 110137 * ^ ^
£3149 207 26*84
i g3 ■ 151
££0 280 ■L
Ullll Л^7 ™ 223 ■
180207 [ ?в4
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
SAMPLE NO. SCAN NO. TIM£<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.)
SAMPLE NO. SCAN NO. TIME<MIN.>
s S3 t 60 » 3.3
5 53 ; 90 : 4.9
J 33 : 150 i 8.2
: 53 : 210 : 11.6
: 53 i £40 : 13.2
: 53 s 270 J 14.9
Масс-слевдр внеклеточных углеводородов Desulfobacter postgetGi ВКМ 1643 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере + С02
Таблице 6
Характеристика внеклеточных углеводородов продуцируемых различными видами сульфатредуцирующих бактерии
Вид микроорганизмов h
Количеотво углеводородов, % отн
L Cn-Ciel Е C19-C24I £ С норм | £ С изо
£ Снеч/Счет
1 j Desulfovibrio | desulfuricans ВКМ 1799
2 | Desulfovibrio I gig-as BKM 1382
3 1 Desulfovibrio I vulgaris BKM 1670
4 I Desulfotomaculum I nigrifioans BKM 1492
5 I Desulfotomaculum j kuznetsovii BKM 1805
6 I Desulfobacterium I macestii BKM 1598
7 j Desulfomicrobium i baculatus BKM 1378
8 I Thermodesulfobacte-| rium mobile BKM 1128
9 j Desulfobacter
I postgatei BKM 1643 1«
Cig-C24> основная доля алканов находится в области Сад-Сгг-Таким образом, наибольшее количество углеводородов, синтезируемых сульфатредуцирующими бактериями, приходится на область Ciq-Czz. Более активным продуцентом внеклеточных углеводородов является культура Desulfovibrio desulfuricans. Отношение нечетных углеводородов к четным у изучаемых видов близко к единице, хотя для некоторых видов бактерий количество четных углеводородов несколько больше, чем нечетных.
4.4 Способность сульфатредушруищих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях жиюгетеротрофного роста
Как отмечалось в обзоре литературы, помимо органических соединений многие сульфатредуцирующие бактерии используют в качестве донора электронов молекулярный водород, который в • условиях хемолитогетеротрофного роста является единственным источником энергии. Использование молекулярного водорода происходит согласно реакции:
4Н2 + S042" + 2Н+ -»— H2S + 4Н20
Д Go1 = -152,2 кДж/моль SO4
В этих условиях на ассимиляционные нужды сульфатредуцирующие бактерии потребляют ацетат+СОг или компоненты дрожжевого экстракта (Badziong, Thauer, 1978; Badziong, Ditter, Thauer, 1979; Klemps et.al., 1985).
Представляло интерес выяснить будет ли происходить образование углеводородов в отсутствие лактата при наличии в газовой фазе Н2 как донора электронов, а дрожжевого экстрак-
та и СОг, как материала обеспечивающего синтез веществ клеток.
В работе использовали культуры сульфатредуцирующих бактерий D. desulfuricans ВКМ 1388 и ВКМ 1799, которые изучались нами на способность к образованию углеводородов в условиях литогетеротрофного роста, поскольку известно, что ряд штаммов Desulfovibrio desulfuricans способны использовать Н2 в качестве донора электронов (Сорокин,1966; Brandis,Thauer,1981).
Бактерии выращивали на минеральной среде Постгейта В и модифицированной среде Постгейта Д, поскольку, на этой питательной среде в гетеротрофных условиях роста количество синтезируемых бактериями углеводородов увеличивалось, но в отсутствии в этих средах - лактата. Дрожжевой экстракт вносили в концентрации 1,0 г/л для обеспечения активного роста бактерий. Соотношение питательной среды и газовой фазы, как и в. опытах при гетеротрофном росте бактерий, было 1:2.
Опыты проводили как в пенициллиновых флаконах, так и в герметично закрытых флаконах большого объема (500 мл),,позволяющих увеличить объем СОг в газовой фазе, без изменений в соотношении с молекулярным водородом (Н2:С02 = 19:1).
Контролем служили пробы, взятые после добавления в питательную среду дрожжевого экстракта и посевного материала, результаты которых отражены при построении графиков в нулевой точке.
Данные о накоплении биомассы и углеводородов на питательной среде Постгейта В (в отсутствии лактата) D. desulfuricans ВКМ 1388 и D. desulfuricans ВКМ 1799 в условиях хемо-литогетеротрофного роста представлены на рис. 18.
Как видно из результатов исследований, культуры сульфат-
И11111|1И11Н|111.111|11|1111|111|1Н|ПМИ1|
12 24 36 48 60 72
о-J час
1111111|1111111|11111|[|1111111|1111111|1ПП11|
12 24 36 48 60 72
a) Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 б) Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
ftic. 18 Дмямива poena Desulfovibrio desulfuricans и образования ввеклевдшнх углеводородов при росте на среде Постгейта В (без латаяа), в лтогеяероярофвых условиях; 1 - биомасса, иг балла /л, 1е, 2 - сероводород, мг/л, 3 - углеводорода, мг/л
редуцирующих бактерий росли в опытных флаконах, однако, рост был в 1,2-1,5 раза слабее по сравнению с ростом этих культур при наличии в питательной среде лактата кальция. Прирост биомассы по белку на период стационарной фазы составлял 107,1±1,2 мг/л (lg + 2,03) для D. desulfuricans ВКМ 1388 и 166,7 ± 2,0 мг/л (lg * 2,22) для D.desulfuricans ВКМ 1799. Количество сероводорода на этот период роста культур было 267,5±2,5 мг/л и 349,0±2,4 мг/л соответственно.
Анализ хлороформной вытяжки из культуральной жидкости после удаления сульфатредуцирующих бактерий показал присутствие в ней парафиновых углеводородов (рис. 19). Увеличение количества углеводородов наблюдалось в процессе роста бактерий и достигало максимального значения при переходе культуры в стационарную фазу, что совпадает с данными для культур Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 и Desulfovibrio desul-• furicans ВКМ 1799 при росте в гетеротрофных условиях в атмосфере Н2+СО2. После прекращения роста бактерий в стационарной фазе содержание углеводородов сохраняется на одном уровне.
Аналогичные результаты получены для культур D. desulfuricans ВКМ 1388 и D. desulfuricans ВКМ 1799 при росте на модифицированной среде Постгейта Д в принятых нами условиях культивирования (рис. 20). Прирост биомассы ( по белку) на период стационарной фазы роста в этом случае несколько меньше, чем на питательной среде Постгейта В в связи с более низким содержанием сульфатов и составляет 100,0±1,5 мг/л (lg + 2,00) для D. desulfuricans ВКМ 1388 и 125,0±1,9 мг/л (lg + 2,10) для D. desulfuricans ВКМ 1799. Соответственно, меньше образовалось сероводорода 35,6±2,3 и 43,2±2,0 мг/л, что составляет 60-70% от теоретически возможного.
'■Ч ВО
<Ъ <1
. (N N M M M N
и/лк 'ал |—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—}
О <м «-Н
if/ак 'S«H
«П Ч П ^ <3
, N (M « N « M -
и/лп ал Г
i—i—i—i—i—i—i—i—Г" о о
Количество углеводородов в данном варианте опыта по сравнению с количеством углеводородов на среде Постгейта В возрастало в 1,7 раза, что несколько меньше, чем при гетеротрофном росте бактерий.
Спектры углеводородов, полученные при росте D.desulfuricans ВКМ 1388 и D.desulfuricans ВКМ 1799 на модифицированной среде Постгейта Д, представлены на рис. 21.
Как видно из хроматограмм, это парафиновые углеводороды по составу близкие к углеводородам, продуцируемым D.desulfuricans при росте в хемолитотрофных условиях на среде Постгейта В.
Сравнительные данные, по образованию внеклеточных углеводородов в условиях хемолитогетеротрофного роста на минеральной среде Постгейта В и модифицированной среде Постгейта Д показали, что наиболее благоприятными условиями для образования внеклеточных углеводородов является модифицированная среда Постгейта Д с уменьшенным содержанием сульфатов при наличии в газовой фазе Н2+СО2 (табл. 9). В этих условиях повышается продуктивность углеводородов клетками, что составляет 0,07 мкг/мг белка.
Углеводороды, синтезируемые сульфатредуцирующими бактериями, во всех вариантах опыта относятся к алифатическим углеводородам нормального и изостроения с длиной цепи СЦ-С24. По сравнению с гетеротрофными условиями роста бактерий в качественном составе углеводородов отмечаются лишь изменения в концентрации отдельных фракций углеводородов и небольшое уменьшение изоформ алканов. На спектрах нет четко выраженных концентрационных максимумов. Изопреноиды не обнаружены. Коэффициент нечетности близок к 1. Масс-спектрометрический анализ
a) Desulfovibrio desulfuricans BKM 1380 6) Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799
Oneнары внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans (BKM 1388 и ЯКM 1799) при росте ва ыодифищрояаввои среде Посгяеейта. Д (беа яаяяаяа) в литогетеротрофных условиях
подтвердил однотипность спектров углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 и Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в условиях гетеротрофного и литогетеро-трофного роста.
Таблица 9
Количество внеклеточных углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans в условиях хемолитогетеро-трофного роста в атмосфере Н2+СО2
1 | Варианты Штамм 1 |*Углеводоро- 1 | Продуктив- 1 Углеводоро-|
I опыта | ды, мг/л | ность, УВ ДЫ, % от 1
1 ] |мкг/мгбелка биомассы |
1 среда ВКМ 1388 1 | 3,8+0,3 [ 0,04 3,55±0,24 |
| Постгейта В ВКМ 1799 ! 5,0±0,3 1 | 0,03 3,00+0,14 |
| модифицир. ВКМ 1388 1 | 6,6±0,4 1 0,07 6,60+0,30 |
1 среда ВКМ 1799 | 8,5+0,5 1 0,07 6,-80±0,29 |
| Постгейта Д 1 1 | | |
*3а вычетом компонентов, содержащихся в питательной среде до начала опыта.
4.5 Способность сульфатредуцирукщимх бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях автотрофного роста
Способность сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в хемолитогетеротрофных условиях, особенно в атмосфере Н2+С02 позволила предположить воамож-
ность данного процесса метаболизма в автотрофных условиях куль тивирования.
Эти исследования представляли интерес не только в плане изучения физиологии сульфатредуцирующих бактерий, но и в плане выяснения возможности синтеза углеводородов сульфатредуци-рующими бактериями только на минеральном субстрате.
Среди многообразной группы сульфатредуцирующих бактерий имеется лишь небольшая часть бактерий, способных к росту в автотрофных условиях. К таким видам относятся Desulfotomaculum orientis ВКМ 1628 и Desulfotomaculum kuznetsovii ВКМ 1805, которые были использованы нами в настоящем разделе работы.
Поскольку, все бактерии рода Desulfotomaculum чувствительны к присутствию в газовой фазе Н2З (Cord-Ruwisch, Garcia, 1985; Klemps et.al.,1985), в работе использовали модифицированную среду Постгейта Д, обедненную сульфатами.
Для создания автотрофных условий из состава среды исключили лактат и дрожжевой экстракт. Питательная среда содержала NaHC03 в количестве 2,2 г/л, что соответствовало условиям автотрофного роста при изучении физиологии Desulfotomaculum kuznetsovii (Назина ссоавт., 1988). ЫаНСОз использовался бактериями как для роста, так и для синтеза органических кислот, что отмечалось в работе с Dtm.orientis при росте в автотрофных условиях и лимите сульфатов в питательной среде (Klemps et.al., 1985; Cypionka, Pfennig, 1986). В качестве энергетического материала в газовую фазу вводили молекулярный водород.
Опыты проводили в герметично закрытых пенициллиновых флаконах, либо во флаконах объемом 75 мл, при отношении питательной среды и газовой фазы 1:2. Температура культивирования
Результаты исследований по накоплению биомассы и синтезу углеводородов Dtm. orientis в условиях автотрофного роста представлены на рис. 22.
Как видно из данных, Dtm.orientis имела прирост биомассы по белку на период стационарной фазы 125,0±1,8 мг/л (lg+2,10), что свидетельствует о нормальном росте бактерий. Однако лаг-фаза была более продолжительной, чем у сульфатредуцирующих бактерий, растущих в гетеротрофных условиях, что соответствует данным, полученным для Dtm.orientis при выращивании в атмосфере Н2+СО2 (Cypionka, Pfennig, 1986). Удельная скорость роста составляет 0,06 ч-1. Количество H2S - 38,5±3,0 мг/л.
Как отмечалось выше, основными продуктами метаболизма Dtm. orientis в условиях автотрофного роста являются органические кислоты. Нами обнаружены дополнительно внеклеточные углеводороды (рис. 24а).
Способность сульфатредуцирующих бактерий к синтезу углеводородов в автотрофных условиях культивирования была подтверждена в опытах с Desulfotomaculum kuznetsovii (рис. 23). Бактерии росли также медленно, как и Desulfotomaculum orientis. Удельная скорость роста 0,05 ч"1. Количество биомассы, определяемой по приросту белка, к началу стационарной фазы составляет 112,0±2,0 мг/л (lg*2,05) - несколько меньше, чем у Desulfotomaculum orientis. Меньше бактерии продуцируют и сероводорода - 34,5±2,8 мг/л. Внеклеточные углеводороды в культуральной жидкости также были обнаружены (рис. 246).
Рис. 22 Дшашка роста Desulfotomaculum orientis Ш1 1628 и обрааовашш ввеклетощна углеводородов, в аввю-профвых условиях; 1 - биомасса, иг белка/л, lgt 2 - сероводород3 иг/л, 3 - углеводорода, мг/л
JIHIH ЩI ^ ЦП III It ifTTlTl I НИ Ц III Л111111 |l I f III lltl 111IUII Jl I >. IШИIIJ H {II11 in IIЩ 12 24 36 48 60 72 84 96
Рис. 23 &шамияа pocaa Desul totamculum kuznetsovi I BKM i80B и образования ввекаеяочвых углеводородов, в автотрофтлх условиях;
1 - биомасса, мг бежа/я, lg,
2 - сероводород, кг/я,
3 - углеводороды» мг/л
Расчет количества синтезированных бактериями углеводородов с учетом прироста биомассы показал, что продуктивность Desulfotomaculum orientis u Desulfotomaculum kuznetsovii в условиях автотрофного роста составляет 0,06-0,07 мкг/мг белка (табл. 10), что близко к полученным нами показателям синтеза углеводородов в хемолитогетеротрофных условиях роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 и Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799.
Таблица 10
Количество внеклеточных углеводородов, синтезированных сульфатредуцирующими бактериями в условиях автотрофного роста
Бактерии
| Углеводоро-1 ды, мг/л
Desulfotomaculum |
orientis ВКМ 1628 | 7,2+0,4 Desulfotomaculum |
kuznetsovii ВКМ 1805 | 8,1±0,5
Продуктивность, УВ мкг/мг белка
Углеводороды, % от биомассы
Поскольку, в питательной среде углерод содержался только в виде ЫаНСОз, это позволило определить количество углерода СОг, использованного бактериями на синтез углеводородов в условиях автотрофного роста бактерий. Полученные нами показатели составляют 2,4-2,7% для культур Dtm.orientis u Dtm. kuznetsovii соответственно. Основная доля углерода, по-види-
мому, используется бактериями на синтез клеточного материала и образование кислородсодержащих соединений, как и в случае хемоорганотрофного роста Desulfovibrio desulfuricans.
Углеводороды, синтезируемые Desulfotomaculum orientis u Desulfotomaculum kuznetsovii в автотрофных условиях роста, относятся к алифатическим углеводородам, в основном, нормального строения с длиной цепи С11-С24 (рис. 24). На спектрах нет концентрационных максимумов. Изопреноиды не обнаружены. Коэффициент нечетности близок к 1,0. Спектры углеводородов Dtm.orientis и Dtm.kuznetsovii близки между собой. Основное отличие - в величине пиков отдельных фракций углеводородов. Масс-спектрометрический анализ подтвердил образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями в условиях автотрофного роста.
ГЛАВА 5 ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА РОСТ И ОБРАЗОВАНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ
5.1 Влияние различных источников углерода и энергии на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfricans ВКМ 1799
Основными источниками углерода и энергии для роста Desulfovibrio desulfuricans являются 3-х и 4-х углеродные органические кислоты, такие как: лактат, пируват, а также спирт -этанол (Gibson, 1990).
В главе 4 настоящей работы показана способность Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте на модифицированной среде Постгейта Д, содержащей лактат (3,5 г/л), в атмосфере Н2+СО2, синтезировать внеклеточные углеводороды. Представляло интерес продолжить эти исследования, увеличив концентрацию лактата в питательной среде, а также заменив лактат на пируват или этанол. Результаты исследований сопоставлялись с данными, полученными нами на модифицированной среде Постгейта Д в атмосфере Н2+СО2 при концентрации лактата 3,5 г/л, используемые в качестве контроля.
Влияние лактата на рост и образование углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
В экспериментах с повышенной концентрацией лактата использовали те же условия культивирования бактерий, которые описаны в разделе "Объекты и методы исследований". Концентрацию лактата в питательной среде увеличили до 5 г/л, про-
должительность опыта - 66 часов.
Результаты исследований показали, что увеличение концентрации лактата вызывало прирост биомассы Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799. Количество белка на период стационарной фазы роста культуры составляло 215,0±3,0 мг/л (lg * 2,33) (рис. 25). Удельная скорость роста - 0,12 ч-1.
По мере роста бактерий осуществлялось окисление лактата в питательной среде, однако, полного потребления субстрата за 66 часов роста бактерий не наблюдалось, по-видимому, в связи с высокой концентрацией лактата, вносимого в среду. Количество синтезированных углеводородов составляло 23,4 ±0,6 мг/л (табл.11).
Наблюдаемое увеличение углеводородов в данном опыте вызвано, по-видимому, повышением количества биомассы, так как по продуктивности углеводородов на мг белка эти показатели равны контрольному варианту.
Характеристика спектров углеводородов, синтезированных Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в этом опыте, представлена в таблице 12. Из таблицы видно, что увеличение концентрации лактата в питательной среде не оказывает существенного влияния на качественный состав углеводородов.
Таким образом, повышение концентрации лактата в питательной среде до 5 г/л при росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в атмосфере Н2+СО2 приводило к увеличению количества клеток и количества синтезированных углеводородов в 1,2-1,3 раза.
1|П|1||1М1111|)1МН1|ЦМ111|М111М| llllllll
12 24 36 4B 60 72
Рис.25 Дцвашта poena Desulfovibrio desulfuricans ЯКИ 1799 и образования ввеклеяашшх углеводородов я аавишмо-cffii от новцешврацци лаянала в пияаоельвой среде; 1 - биомасса, иг белиа/ля1е* 2 - углеводорода, мг/л 3 - лашпав, г/л
Влияние пируват на рост и образование углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Опыты с использованием пирувата в качестве донора электронов проводили в тех же условиях культивирования Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, как и в случае роста бактерий на среде с лактатом. Концентрация пирувата составляла 3,5 г/л, газовая фаза содержала Н2+СО2, взятых в соотношении 19:1.
Как показали исследования, культура сульфатредуцирующих бактерий в принятых нами условиях хорошо росла. Удельная скорость роста - 0,10ч"1 (рис.26). Прирост биомассы на период стационарной фазы роста бактерий составлял 165,0±2,4 мг/л (lg + 2,22). Эти показатели близки к результатам, полученным нами при росте D.desulfuricans ВКМ 1799 на лактате с той же концентрацией субстрата. Окисление пирувата осуществлялось D. desulfuricans ВКМ 1799 с той же интенсивностью, что и лактата. Однако количество потребленного бактериями пирувата за 66 часов роста клеток было большим по сравнению с лактатом, по-видимому, в связи с меньшим содержанием в пирувате Н+, необходимых в энергетическом процессе (Sun, Akagi,1966; Post-gate, 1984).
Количество синтезируемых D.desulfuricans ВКМ 1799 углеводородов при росте на среде с пируватом незначительно меньше (в 1,1 раз) по общему количеству, чем при росте этих бактерий на среде с лактатом, но продуктивность клеток на пирувате равна контрольному варианту (табл. 11).
Спектр углеводородов D.desulfuricans ВКМ 1799 при росте на среде с пируватом отличается от спектра углеводородов при росте на среде с лактатом несколько большим содержанием углеводородов с длиной цепи C1Q-C24, в основном, за счет уг-
П И 11 j 11 N 11111111111111 П 1111 П 1111111П 11111
Рис.Zd Дшвамина роста Desulfovibrio desulfuricans BKM 1798 и образования внеляелючных углеводородов ва тщательной среде с пируваяюм;
1 - биомассаt мг белка/я, 1е*
2 - углеводороды* мг/л,
3 - нирувак, г/я
леводородов С19-С22, а также увеличением количества изоформ (табл. 12).
Влияние этанола на рост и образование углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans ВНМ 1799
Этанол является донором электронов для большинства сульфатредуцирующих бактерий (Розанова, Назина, 1989).
Как показали исследования, при замене в питательной среде лактата на этанол (3,5 г/л) существенных изменений в процессе роста бактерий не наблюдалось (рис. 27). Период лаг-фазы как и при культивировании клеток на лактате (контроль), составляет 6-10 часов, стационарная фаза наступает через 34-36 часов. Удельная скорость роста - 0,10 ч-1, что соответствует скорости роста D.dsulfuricans ВКМ 1799 на пиру-вате, но несколько меньше, чем на лактате. Прирост биомассы на период стационарной фазы роста культуры - 160,0 ±2,2 мг/л (lg + 2,20), т.е. соответствует результатам, полученным при росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на лактате и пирувате.
По мере роста бактерий происходит интенсивное потребление этанола и образование внеклеточных углеводородов, количество которых в 1,1-1,2 раза меньше, чем на среде с пирува-том или с лактатом (табл. 11).
Спектр углеводородов по составу значительно ближе к спектру углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте на среде с лактатом. Однако в составе углеводородов обнаруживается увеличение количества изоформ (табл. 12).
П1И1||1М 1111)11. Ill Ц1М IUI[ltl)lll| III 1)11[
J 12 24 36 48 60 72
о-1 час
Рис. 27 Динамика poena Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и обдазошм ввеклеаочвих углеводородов аа лияа-шельвой среде с апаяажж: 1 - биомасса, иг белка/л,1ц, Z - углеводороды, иг/л 3 - аманал, г/л
Таким образом, исследование показало, что на всех изученных нами основных для сульфатредуцирующих бактерий источниках углерода и энергии (лактат, пируват, этанол) D.desulfuricans ВКМ 1799 способен расти и синтезировать углеводороды. Большее количество углеводородов синтезируется сульфатредуци-рующими бактериями на лактатсодержащих средах, однако расчет количества углеводородов с учетом прироста биомассы штамма показал, что замена лактата на пируват или этанол приводит к незначительному снижению продуктивности углеводородов бактериями.
Таблица 11
Количество внеклепючных углеводородов, продуццруених Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в присутствии разлитых доноров электронов
| элект- | рация ве-| роды, мг/л| ность УВ, | ды, % от |
| ронов | 1 I ществ,г/л| 1 |мкг/мг белка| 1 | биомассы |
|(контроль)| 1 1 1
| лактат | 5,0 } 23,4*0,6 1 0,11 | 10,88*0,13 |
| пируват | 3,5 | 17,6*0,2 1 0,11 | 10,66*0,10 [
Таблица 12
Характеристика внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте в атмосфере Н2 + СО2 с различными донорами электронов
1 ч f 1
| Доноры | Конц. 1 Количество углеводородов, % OTH
| электронов ] в-ва,
1 1 1 l 1 I
1. 1.1 1 1 1 1 «
5.2 Влияние неорганических акцепторов электронов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Одним из важнейших факторов, влияющих на рост и метаболизм сульфатредуцирующих бактерий, является присутствие в питательной среде того или иного акцептора электронов. Как отмечалось выше, среди известных неорганических акцепторов электронов сульфатредуцирующих бактерий имеются серосодержащие соединения (Badziong,Thauer,1978; Domka, Szulozynski,1981; Cypionka,1987; Bak,1992). Обнаружена способность сульфатредуцирующих бактерий к восстановлению нитратов (Liu et.al.,1980; Keith, Herbert,1983; Seitz, Cypionka, 1986), а также - C02 (Klemps et.al.,1985; Cypionka, Pfennig, 1986).
Представляло интерес провести сравнительное изучение влияния на рост и образование углеводородов Desulfovibrio de-sulfuricaus ВКМ 1799 наиболее распространенных в природе неорганических акцепторов электронов: сульфатов, нитратов, карбонатов.
Опыты проводили на модифицированной среде Постгейта Д. В качестве акцепторов электронов использовали сульфат - MgS04 или FeS04 в концентрации - 2,0 г/л, нитрат - в виде NaN03 -0,8 г/л, карбонат - Ыа2С0з или ИаНСОз - 2,0 г/л. Газовая фаза в первых двух вариантах состояла из Н2 + С02, а при использовании карбонатов - из Н2+Аг, взятых в отношении 19:1.
Все операции по подготовке сред и анализу углеводородов осуществляли выше указанными методами. В работе использовали сульфатредуцирующие бактерии после предварительной адаптации штамма (3-4 пассажа) к соответствующим неорганическим акцепторам электронов.
Влияние сульфатов на рост и образование углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Процесс окисления органического вещества при сопряженном восстановлении сульфатов до сероводорода является естественным физиологическим процессом сульфатредуцирующих бактерий.
Как видно из рис. 28, D.desulfuricans ВКМ 1799 на средах с сульфатами хорошо растет. Прирост биомассы по белку на 66 час достигает 350,0±2,4 мг/л (lg * 2,54) на среде с сульфатом железа и 220,4±2,5 мг/л (lg + 2,34) на среде с сульфатом магния. Больший прирост биомассы на среде с сульфатом железа объясняется, по-видимому, тем, что образующийся при этом сульфид железа, отрицательно влияющий на рост бактерий, быстро выпадает в осадок. Кроме того, ионы железа входят в состав ряда ферментов, в том числе и гидрогеназ, оказывая положительное действие на активность ферментов (Кондратьева, Гоготов, 1981), что также способствует росту бактерий.
Наличие и восстановление в питательной среде сульфатов способствовало активному образованию Desulfovibrio desulfuricans сероводорода. На среде с FeS04 количество сероводорода составляло 225,0±3,2 мг/л, с MgSO^ - 210,0±3,0 мг/л.
Количество синтезированных бактериями углеводородов в присутствии сульфатов невелико и составляет на среде с сульфатом железа - 6,0±0,4 мг/л, с сульфатом магния - 5,9±0,2 мг/л. Как отмечалось выше, это объясняется, вероятно, тем, что в присутствии сульфатов, поток электронов распределяется между процессами восстановления сульфата железа или сульфата магния с восстановлением СОг.
Таким образом, процесс восстановления сульфатов является конкурирующим процессу образования углеводородов в резуль-
1ПМ||Ц||11|1П1И1|НПП(||1|1111|11111М|
12 24 36 48 60 72
о —1 час
•'[|11ТТП|Ш[1М|||||Ш|1ШГ1|||
11111II111 60 72
о-1 час
Рис. 28 Дшашка росиа Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и образования шчгдлпггпвпг углеводородов в присутствии сульфатов в пиаательвой среде.- а; - FeSD4, 6) - UgS04; i- биомасса, мг беж /л. 10, 2- сероводород, мг/л, 3- углеводород, мг/л. 4- сульфат, г/л
тате чего углеводородов образуется меньше.
Влияние нитратов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при культивировании на среде с лактатом кальция в атмосфере Я2+СО2
Нитраты рассматриваются в литературе как альтернативные акцепторы электронов для сульфатредуцирующих бактерий. Как отмечалось выше, они могут заменить сульфаты у отдельных штаммов Desulfovibrio desulfuricans (Liu, Der Vartanian, Peck, 1980; Steenkamp, 1980; Keith, Herbert, 1983). Диссимиляторное восстановление нитратов до аммония происходит как в присутствии сульфатов, так и в их отсутствии. Золотухина (1985) показала, что Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388, при наличии небольшого количества сульфатов в среде (0,01 %), растет и осуществляет нитратное дыхание. Аналогичные данные получены для культуры Desulfovibrio desulfuricans sp.(Мс Cready, Guld, Cook, 1983). Однако проверка многих штаммов сульфатредуцирующих бактерий на способность к диссимиляторной нитратредукции показала, что этим свойством обладает сравнительно небольшое количество сульфатредуцирующих бактерий (Мс Cready, Gould, Cook, 1983). Проведенные нами исследования показали, что Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в присутствии нитратов в атмосфере Н2+СО2 растет хуже, чем на средах с сульфатами (рис. 29). Прирост биомассы по белку на 66 часов составляет 65,4±1,2 мг/л (lg * 1,82). Параллельно с ростом бактерий происходит понижение концентрации нитратов, что свидетельствует об использовании их Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 как для-ростовых процессов, так и для осуществления нитратного дыхания, что соответствует данным Золотухиной (1985).
Количество внеклеточных углеводородов несколько больше
11111111111111111111111JII11!1111M11111III M II |
0.0 -час
Рис.29 Динамика poena Desulfovibrio desulfuricans BKH 1799 и образования внеклеточных углеводородов в присувь-спвии штравов в лияапеяыюй среде; 1 - биомасса, иг бежа/я, lg, 2 - углеводороды, мг/л 3 - виярап, г/л
(8,5±0,3 мг/л), чем на средах, содержащих сульфаты, что, по-видимому, объясняется более продуктивной утилизацией энергии бактериями.
Таким образом, нитраты ингибируют рост Desulfovibrio desulfигians ВКМ 1799, но они являются менее эффективными акцепторами электронов, чем сульфаты, что позволяет клеткам увеличить синтез углеводородов.
Влияние карбонатов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Влияние карбонатов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями при культивировании на среде с лактатом кальция изучали в присутствии ИагСОз и NaHC03. Учитывая, что ионы бикарбоната находятся в равновесии с двуокисью углерода, растворенной в воде, газовая фаза сос-' тояла из смеси молекулярного водорода и аргона, взятых в соотношении 19:1. В процессе роста сульфатредуцирующих бактерий на среде, содержащей лактат кальция, образуются кислые'продукты метаболизма (СОг, СНзСООН). Это ведет к возрастанию активности Н+ и, как следствие, к растворению карбонатов (Германов, Борзенков, Юсупова, 19816).
Результаты исследований по влиянию карбонатов на рост Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и образование углеводородов приведены на рис. 30.
Как видно из рисунка, в присутствии карбонатов натрия сульфатредуцирующие бактерии росли нормально, хотя несколько слабее, чем на средах с сульфатами. В присутствии ЫагСОз количество биомассы (по белку) на 66 час роста бактерий составляет 85,0±1,3 мг/л (lg + 1,93). По мере роста бактерий коли-
Рис. 30 Дшамика роста Desulfovibrio desulfuricans fifflf 1799 и образования ввеклеяючпых углеводородов в присутствии варбовавов в тщательной среде; а) - Ма2С03, б) - НаНСОЗ; 1 - биомасса, иг белка /л, lg, 2 - углеводорода, иг/л, 3 - карбоваш, г/л
чество №2С0з уменьшается. Синтез углеводородов резко возрастает и достигает 22,8±1,2 мг/л.
В присутствии ИаНСОз Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 росла хуже, несмотря на то, что среда была забуферена. Прирост биомассы по белку составляет 73,1±1,2 мг/л (lg * 1,86). Потребление NaHC03 было достаточно активным. Количество синтезированных бактериями углеводородов составляло 19,6±0,9 мг/л.
Более слабый рост сульфатредуцирующих бактерий на среде с бикарбонатом по сравнению с карбонатом натрия, возможно, объясняется его худшей растворимостью в воде. Количество синтезированных углеводородов на средах с карбонатом и бикарбонатом, с учетом прироста биомассы по белку, было одинаковым, однако значительно больше, чем с другими неорганическими акцепторами электронов. Следовательно присутствие карбонатов в питательной среде способствует увеличению синтеза углеводородов.
Таким образом, исследования показали, что каждый из изучаемых нами неорганических акцепторов электронов обладает специфическим воздействием на рост и образование внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans в условиях культивирования на органическом субстрате в атмосфере Н2+СО2.
Полученные результаты согласуются с данными Бонч-Осмоло-/ вской с соавторами (1970), изучавшими влияние неорганических акцепторов на бактериальное образование метана.
Наибольший ингибирующий эффект на синтез углеводородов оказывают сульфаты (5,9-6,0 мг/л), в меньшей степени - нитраты (8,2-8,3 мг/л). Их ингибирующее действие проявляется на
Таблица 13
Характеристика внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 в присутствии акцепторов электронов
Акцепторы электронов
Количество углеводородов,
L СЦ - Cie
£ Gig - С24
L С норм
Z С иго
L С неч/Счет
NagCCk МаНСОз
63,8 ± г,8 52,8 ± 3,0 71,2 ± 3,0 68,0 ± 2,6 58,2 ± 2,4
48,8 ± 3,8 47,2 ± 3,5 28,8 ± 2,8 32,0 ± 2,2 41,8 ± 3,0
76.7 ± 2,3
64.8 ± 2,2 82,5 ± 2,5 79,5 ± 2,4
13.2 ± 2,0
23.3 ± 2,0 35,2 + 2,2 17,5 + 1,9 20,5 ± 2,2
1,04 ± 0,04 1,07 ± 0,02 1,20 + 0,08 0,95 + 0,06 1,10 ± 0,03
различных участках метаболическогопути. Если нитраты отрицательно влияют на рост сульфатредуцирующих бактерий, то сульфаты являются конкурентами эа восстановитель. Карбонаты стимулируют синтез углеводородов (19,6-22,8 мг/л).
Спектры углеводородов D.desulfuricans ВКМ 1799 в присутствии различных акцепторов электронов изменяются незначительно (табл. 13). Это преимущественно н-алканы. В присутствии сульфатов несколько больше углеводородов о длиной цепи Cig --С24- Нитраты и карбонаты способствуют увеличению углеводородов с длиной цепи Сц-С^д. Коэффициент нечетности близок 1,0.
5.3 Влтяие физико-химических факторов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирую-щцми бактериями 5.3.1 Влияние рН среди на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 Одним из важнейших факторов, влияющих на жизнедеятельность сульфатредуцирующих бактерий, является рН среды (Brown, Groves, Miller, 1973; Сунрун, Руденко, Улановский, 1979; Domka, 5chula2inski,1979; Mahmand et.al.,1979). Поддержание определенного уровня рН во время роста бактерий важно прежде всего для микроорганизмов, продуцирующих кислоты, к которым относятся сульфатредуцирующие бактерии (Postdate, 1984). Кроме того на процесс роста сульфатредуцирующих бактерий влияет начальное значение рН среды (Горленко, Белоглазов, 1989).
Проведенные нами исследования показали, что культура Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 растет в широком интервале рН 5,5-9,0 (рис. 31). Оптимальный рост D.desulfuricans ВКМ
1799 наблюдается при рН 7,0 и составляет 170,5±1,9 мг/л (lg*2,23) на период стационарной фазы, Эти данные близки к результатам, полученным в ранее опубликованных работах (Widdel, 1980; Postdate, 1984; Widdel, Pfennig, 1984) При выделении и изучении свойств культуры D.desulfuricans. Изменение рН среды к кислотным значениям приводит к достаточно резкому снижению прироста биомассы, который составляет при рН 5,5 -55,0±2,8 мг/л (lg 1,70). Рост сульфатредуцирующих бактерий при значениях среды рН 8,0-9,0 в 1,2-1,3 раза выше и составляет - 68,0-69,6 мг/л (lg +1,80-1,84).
В экспериментах было отмечено, что процесс роста D.desulfuricans ВКМ 1799 сопровождался смещением кислых или щелочных начальных значений рН среды к нейтральным показателям, что соответствует результатам, полученным ранее Горленко и Белоглазовым (1989) при исследовании роста накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий из пресноводного источника.
Поскольку кислородсодержащие соединения могут быть предшественниками в синтезе углеводородов было изучено влияние рН среды на накопление этих веществ. Начальные значения рН влияя на рост бактерий, изменяют и содержание кислородсодержащих продуктов в культуральной жидкости. Наибольшее количество кислородсодержащих продуктов (700,0±2,8 мг/л) синтезируется при рН 7,0. При начальных значениях рН 6,5 и рН 7,5 кислород-содержащие продукты в культуральной жидкости составляют достаточно высокую величину (425,0-471,5 мг/л).
Максимальное накопление углеводородов.(18,9*0,8 мг/л) в••
культурапьной жидкости наблюдается при росте D.desulfuricans ВКМ 1799 на среде с начальным значением рН 7,0. Изменение рН"
100-1 40п 2.5 —
75- 30- 2.1 -
50- 20- 1.8 1.7 -
25- 1С- 1.4 -
> 1.1 -
: 11111111111111111111 и \ | s 111111
5.0 5.5 6.0 $.5 7.0 7.5 8.0
l i | l l l I |
Рис. 31 Влияние рН питательной среды ва рост, образование углеводородов и кислородсодержащх продуктов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799; 1 - биомасса, ыг белка/л,1е, 2 - углеводороды, мг/л
3 - гоююродоодермащие продуты, шв/л
среды к кислым значениям активно снижает синтез углеводородов количество которых при рН 5,5-6,0 составляет 4,5-5,9 мг/л. При рН 8,0-9,0 количество углеводородов в 1,5-1,8 раз выше, чем при кислых значениях рН среды и составляет 7,0-9,0 мг/л. Наблюдаемое небольшое повышение синтеза углеводородов и кислородсодержащих продуктов при рН 8,5, коррелирующее с увеличением биомассы, по-видимому, объясняется активизацией гидрогеназ, оптимум действия которых находится в области рН 8,5 (Кондратьева, Гоготов, 1980).
Расчет количества углеводородов с учетом накопления биомассы представлен на диаграммах (рис. 32). Полученные результаты показали, что область активной продукции углеводородов (85-100Х) соответствует рН 7,0-8,5 питательной среды, а кислородсодержащих продуктов (82-100%) - рН 5,5-7,5.
Исследуемые нами начальные значения рН питательной среды не значительно влияют на характеристику внеклеточных углеводородов (табл. 14). При рН 7,0-7,5 углеводороды имеют более разнообразный состав в связи с наличием в спектрах изоформ углеводородов. В интервале рН 6,0-8,5 наблюдается небольшое преобладание углеводородов с длиной цепи Сц-Giq и только резкое изменение рН среды в кислотную (рН 5,5) или в щелочную область (рН 9,0) приводит к увеличению углеводородов с длиной цепи. C1Q-C24* Коэффициент нечетности углеводородов остается близким к 1,0.
Таким образом на основании полученных результатов можно сказать, что наиболее оптимальным начальным значением среды для роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и накопления углеводородов в культуральной жидкости является рН 7,0.
1 1 m н 1 1 1 1 |/| 1
1 1 |/| 1 и 1 и и
17] | |/| 1 |/| 1 1/1 1/1
и 1 |/| 1 |/| 1 |/|
1—1 и 1 l/l 1 |/| 1 |/п
1 и ! и! l/l 1 i/i 1 и 1 |/| 1 и 1 1/1 1
1 и 1 1/1 ! 1/11 i/i 1 и 1 и 1 1/1 1 и 1
Рис. 32 Лппгряий иаыевеашй количества шешкнш продуктом иеааболиаша
Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте ва среде с раалршш аамаяывши авачевшши рВ: (7)- углеводород*,Q - кислородсодержащие продуюш
Таблица 14
Характеристика внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1789 при росте на среде с различными начальники значениями рН
1 | Газовая 1 1 } Начальные) Количество углеводородов, % отн. 1
( фаза 1 7Т ^ТТДГТТХЯ 1
1 значения | 1 1 1 1 1
1 1 1 ( г Г 1
1 5,5 | 37,0 ± 2,5 | 57,0 ± 3,3 | 90,5 ± 2,5 1 9,5 ± 2,0 | 1,13 ± 0,04 |
1 н2 1 6,0 | 57,6 ± 3,0 | 42,4 ± 2,5 1 89,1 ± 2,6 1 10,9 ± 1,2 | 1,07 ± 0,04 |
1 6,5 | 54,9 ± 3,0 | 45,1 ± 2,6 | 88,8 ± 2,6 I 11,2 ± 2,0 | 1,06 ± 0,03 |
1 7,5 | 58,0 ± 3,2 j 42,0 ± 2,2 | 85,0 ± 2,4 | 15,0 ± 2,5 | 0,95 ± 0,02 |
1 8,5 | 52,3 ± 2,9 | 47,7 ±2,8 | 89,3 ± 2,8 | 10,7 ± 1,9 | 1,03 ± 0,02 |
1 9,0 | 37,1 ± 2,4 | 62,9 i 3,0 Г 90,4 1 2,9 | 9,6 ± 1,4 | 1,11 ± 0,03 |
5.3.2 Влияние окислительно-восстановительного потен циала среди на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
01сислительно- восстановительный потенциал среды является одним из основных факторов, влияющих на рост и распространение сульфатредуцирующих бактерий (ZoBell, 1958; Mahmand et.al.,1979; Каравайко и др., 1976; Вайнштейн и др., 1985). Влияние его на метаболизм сульфатредуцирующих бактерий изучено в меньшей степени (Brown, Groves, Miller, 1973; LeGall et.al., 1982; Вайнштейн, Гоготова, 1987).
В задачу наших исследований входило изучение влияния окислительно-восстановительного потенциала среды на синтез внеклеточных продуктов метаболизма при росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на модифицированной среде Постгейта Д в атмосфере Н2+СО2, используемой нами при изучении образования углеводородов этими бактериями.
Исходные значения Eh среды создавали используя принцип действия устройства, предложенного Работновой (1951), Вайн-штейном и Гоготовой (1987), основанного на снижении потенциала среды активным водородом, который образуется в результате электролиза воды, а также действием химических соединений (дитионитом или марганцово-кислым калием).
Величина исходного значения Eh питательной среды после посева Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 составляла -55±10 мВ. Введение в опытные флаконы газовой смеси (Н2+СО2) снижало окислительно-восстановительный потенциала среды, а дополнительная обработка флаконов способствовала созданию исходных значений Eh среды в интервале (-100)-(-400) мВ, в ко-
торой и определяли область синтеза углеводородов (рис. 33).
Как показали исследования D.desulfuricans ВКМ 1799 растет в широком диапазоне Eh от -100 до -400 мВ. Наиболее интенсивный рост данного штамма наблюдается при значении Eh среды -290 мВ. Прирост биомассы на период стационарной фазы роста составлял 198,0±2,3 мг/л (lg + 2,29). Увеличение потенциала среды до -190 мВ и выше приводило к постепенному уменьшению прироста биомассы, однако даже при Eh -100 мВ его значения были достаточно велики и составляли 127,5±2,0 мг/л (lg+2,11). Снижение потенциала среды до -400 мВ вызывало резкое уменьшение накопления биомассы, количество которой на начало стационарной фазы роста D.desulfuricans ВКМ 1799, составляло 55,0±1,8 мг/л (lg*l,74). Данные результаты свидетельствуют о том, что дальнейшее снижение окислительно-восстановительного потенциала среды ведет к ограничению роста штамма.
При росте D.desulfuricans ВКМ 1799 на средах с различными значениями Eh изменялась и интенсивность синтеза кислородсодержащих продуктов (кислот, спиртов). Максимальное образование этих соединений (750,0±3,0 мг/л) наблюдалось при Eh -100 мВ, где рост штамма был достаточно активен. Более восстановленные условия питательной среды приводят к уменьшению количества кислородсодержащих продуктов, содержащихся в куль-туральной жидкости. Это объясняется, по-видимому, снижением прироста биомассы, а также вовлечением данных соединений в восстановительные процессы.
Максимальный синтез углеводородов (25-27 мг/л) наблюдается в интервале Eh среды (-290)-(-360) мВ. Изменение значений Eh среды выше -290 мВ, приводило к резкому снижению син-
о v (X 4>
Рис. 33 Влияние Eh питательной среди на роса, образование углеводородов и кислородсодержащх продуивюв Desulfovibrio desulfuricans MM 1799; 1 - биомасса» иг белка/л,lg, 2 - углеводороды, мг/л 3 - кислородсодержащие продукты, т/л
[ \ хТ X. \ X X ^ ^ X
Таблица 15
Характеристика внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте на среде с различными начальными значениями Eh
| Газовая ) Начальные! Количество углеводородов, % отн. |
| фаза j значения 1-:——i-1-\-1-1
I CO2 1-260 I 54,2 ± 3,3 | 45,8 ± 2,8 | 86,0 ± 2,5 | 14,0 ± 2,0 | 1,04 ± 0,03 |
11i 1-1-,-1-1-1
теза углеводородов, что объясняется, по-видимому, активизацией окислительных процессов. При Eh питательной среды (-100) мВ синтез углеводородов прекращается.
Расчет продуктивности штамма с учетом накопления биомассы показал, что наиболее активно (93-100%) кислородсодержащие продукты синтезировались при Eh (-100)-(-160) мВ. Синтез углеводородов (48-100%) наблюдался в интервале Eh питательной среды (-260)-(-400) мВ (рис. 34).
Синтезируемые Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 углеводороды, по мере понижения окислительно-восстановительного потенциала среды характеризовались увеличением количества ал-канов с более короткой длиной цепи (Cu-Cie), а также небольшим увеличением количества изоформ (табл. 15). Изменение Eh среды не оказывало значительного влияния на коэффициент не-, четности углеводородов.
Таким образом результаты исследований показали, что наиболее благоприятными условиями для роста и синтеза углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 является Eh питательной среды интервала (-290)-(-360) мВ.
5.3.3 Влияние соотюшения Hz ; COz в газовой фазе на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Поскольку, окислительно-восстановительные условия питательной среды зависят не в малой степени от введения в опытные флаконы смеси газов (Нг + СОг), определяли изменения в составе газовой фазы и в синтезе внеклеточных продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте на модифицированной среде Постгейта Д в атмосфере Н2+СО2.
В первой серии опытов изучали изменения в составе газовой фазы в процессе роста Desulfvibrio desulfuricans ВКМ 1799 в принятых нами условиях (соотношение Н2+СО2 = 19:1).
Результаты исследований показали, что рост бактерий сопровождается потреблением как водорода, так и углекислого газа (рис. 35). Концентрация газов уменьшается По мере накопления внеклеточных продуктов метаболизма. Наиболее активно происходит потребление СОг. К концу стационарной фазы роста бактерий (66 час) СО2 составляет не более 0,3% от исходного объема. Из литературы известно, что СОг может использоваться сульфатредуцирующими бактериями на биосинтетические процессы (Badziong, Ditter, Thauer, 1979).
Потребление водорода происходит медленнее и не полностью. Способность сульфатредуцирующих бактерий использовать водород, как источник энергии из окружающей среды, отмечалась в ранее опубликованных работах (Odom, Peck, 1981; Widdel, Hansen,1992).
Сравнительные данные по образованию углеводородов D.desulfuricans ВМК 1799 в зависимости от влияния индивидуальных газов, входящих в состав газовой смеси (Н2+СО2 =19:1), с сохранением их концентраций и последовательной заменой одного из них на аргон, представлены в таблице 16.
Как видно из результатов исследований, синтез внеклеточных углеводородов происходит и без введения молекулярного водорода в состав газовой фазы, когда газовая фаза содержит.только 5% СОг. Однако количество продуцируемых бактериями углеводородов в этом случае в 1,6 раза меньше, по сравнению с количеством углеводородов, синтезируемых сульфатредуцирующи-
✓ О о (Ь о
С 12 24 36 48 60 72 час * с учетом газов образующихся на лактате в атмосфере Аг
Рис.35 Изменения в составе газовой фазы в процессе роста и образования ввекяваючшас продуктов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 ва среде с лактатом в сфере Иг/СОг (19:1): 1 - биомасса, мг бета /л, lg, г - внеклеточные продукты, мг/л,
3 - яшвдеящрация Jfe* Z,
4 - концатрация 00%, %
Таблица 16
Влияние молекулярного водорода и СО2, входящих в состав газовой фазы, на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 (34-36 чао)
1 (19 : 1) 1 1
I Нг : Аг 174,9+2,4 | 8,0+0,2 1 0,05 | 4,57+0,05 1
| (19 : 1) 1
ми бактериями в присутствии в газовой фазе Н2+СО2. Количество внеклеточных углеводородов в культуральной жидкости при росте сульфатредуцирующих бактерий в атмосфере газовой смеси состоящей из Н2+СО2, приведено в таблице 4. Введение в газовую фазу только молекулярного водорода, который, как отмечалось выше, способствует более интенсивному росту D.desulfuricans ВКМ 1799, не оказывает заметного влияния на синтез углеводородов, по сравнению с образованием углеводородов в атмосфере аргона (табл. 4).
Следующая серия опытов была посвящена изучению действия различного соотношения Н2+СО2 в газовой фазе на образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 (рис.36). Как показали результаты исследований, более интенсивный синтез углеводородов происходит при увеличении концентрации молекулярного водорода в газовой фазе. Присутствие в газовой фазе молекулярного водорода способствует созданию низкого потенциала питательной среды, благоприятного для роста бактерий и для синтеза клетками восстановленных продуктов, к которым относятся углеводороды. Наибольшее количество углеводородов синтезируется сульфатредуцирующими бактериями при концентрации водорода - 90% и СОг - 10% (соотношение Н2:С02= 9:1). Увеличение концентрации СО2 в газовой фазе выше 25% с соответствующим уменьшением концентрации Н2 усиливает синтез кислородсодержащих продуктов (спирты, органические кислоты).
Максимальное образование общего количества внеклеточных экзометаболитов происходит при росте D. desulfuricans ВКМ 1799 на минеральной среде с лактатом при концентрации Н2 -75% и С02 - 25% (соотношение Н2:С02=3:1) (табл. 17).
i и ц 11 и | ni ц i M ц 111 ц ч м 111111 и 111 m щ м ц и mini |
15 20 85 gO
30 35 70 65
55 60 45 40
Puc. 36 Влияние соотношения B^iCOz на образование внеклеточных продуктов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799;
1- углеводороды, мг/л,
2- кислородсодержащие продукт, мг/л
Таблица 17
Влияние различных соотношении Н2:С02 на рост и образование внеклеточных продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 (34-36 час)
Общий выход экзометаболитов,
1<£Г/Л
Варианты опыта
Н2%+С02% I Н2 : 002
Белов, мг/л
Концентрация, % отн.
кислородсодержащие продукты
углеводороды
сг\ » сто • 4
UU + iJU { 1
170,5 ± 1,9 170,0 ± 2,0 158,0 ± 2,2 154,0 ± 1,8 152,0 ± 2,0 148,2 ± 2,4 144,0 i 2,5
718,9 ± 2,5 737,0 ± 2,0 775,6 i 3,2 795,6 ± 3,2 772,5 i 2,2 645,3 ± 2,4 639,9 ± 2,4
97.4 96,1 97,7 98,1
98.5 98,4 98,7
2,6 3,9 2,3 1,0
Таблица 18
Характеристика внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuncsns ВКМ 1799 при росте на среде с лактатом в атмосфере Нг + СОг, взятых в различных соотношениях
» Варианты 1 Количество углеводородов , % OTH
опыта !
1 1 i i 1 \
Синтезируемые D.desulfuricans ВКМ 1799 углеводороды расположены в области С11-С24. Изменение соотношения Н2 и СОг в газовой фазе оказывает влияние, как на общее количество продуцируемых сульфатредуцирующими бактериями углеводородов, количество которых повышается при увеличении концентрации водорода, так и на соотношение нормальных и изоформ углеводородов. Показано, что при концентрации С02 -25-35% несколько увеличивается количество углеводородов с длиной цепи Сц-Сае, а также количество изоформ (табл. 18). Соотношение четных и нечетных углеводородов близко к 1.
Таким образом, изменение состава газовой смеси (Н2:СС>2) позволяет регулировать процесс образования Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 более окисленных (органические кислоты, спирты), либо восстановленных продуктов метаболизма (углево-^ дороды) при росте на минеральной среде с лактатом (модифицированная среда Постгейта Д). Наиболее благоприятное для активного синтеза клетками углеводородов - соотношение Н2:С02 =9:1.
5.4 Влияние других факторов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
5.4.1 Влияние органического азота на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Известно, что на сверхпродукцию микробных липидов оказывает влияние достаточное количество азота и других элементов в питательной среде (Rezanka, 1991). На синтез метана метаногенами также влияет концентрация и соотношение углерода и азота используемого бактериями (Панцхава, 1989).
Некоторые сульфатредуцирующие бактерии, в частности, Desulfovibrio sp., используют в качестве углерода и энергии -аминокислоты (Stams, Hansen, 1985).
Наиболее распространенной формой органического азота является казеин. Гидролиэат казеина служит источником аминокислот и пептидов. Кроме того, в качестве примесей в гидроли-затах казеина имеется фактор роста для микроорганизмов (Мейнелл, 1967).
Мы предположили, что казеин окажет влияние как на рост Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, так и на синтез ими углеводородов.
В работе использовали модифицированную среду Постгейта Д с заменой неорганического источника азота (NH4CI) на казеин в концентрациях 1 г/л, 5 г/л, 10 г/л, 15 г/л. Газовая фаза содержала Нг:С0г в отношении 19:1.
Как показали исследования, наибольший прирост биомассы -190,0±£,0 мг/л наблюдался в случае присутствия в питательной среде 5 г/л казеина. Дальнейшее увеличение концентрации казеина (10-15 г/л) тормозило рост Desulfovibrio desulfuricans, по-видимому, из-за нарушения соотношения между углеродом и азотом в среде культивирования. Прирост биомассы на период стационарной фазы роста бактерий при концентрации казеина 15 г/л составляет 110,5*2,5 мг/л, что в 1,6 раза меньше, чем при росте на среде с 5 г/л казеина.
Количество углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, также изменялось в зависимости от концентрации казеина в среде. При соотношении С:N=8:1 (1 г/л казеина) количество синтезируемых углеводородов увеличивается
|/[- = 1 *|
и- = j а)
1/1- = 1 *|
1 • г1- Н*г1
1 1/1- 1-1*1 1
1 1/1- 1=1*1 1
1 и- 1-1*1 1
1 |/|- 1=1*1 1.
1 |/|- 1=1*1 1
1 1/1- 1=1*1 г
1 1/1- 14*1 1
1 и- м*ы
Углеводороды, мг/л
Продуктивность, мкг УВ/мг белка
в 1,2 раза по сравнению с контрольным вариантом и составляет 22,4±1,6 мг/л. Наибольшее количество углеводородов продуцируется бактериями при концентрации казеина 5г/л, что соответствует весовому соотношению углерода и азота как 2:1 (рис.37).
Эти данные отличаются от результатов по сверхпродукции липидов с использованием бактериальных культур, а также микроводорослей, дрожжей, плесневых грибов, где предпочтительным является соотношение C:N = 50:1 (Rezanka, 1991), а также синтеза метана, где предпочтительно соотношение C:N = (11-16):1 (Панцхава, 1989).
Спектр углеводородов при замене неорганического азота на органический для Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 изменяется незначительно. Он представлен, в основном,алканами нормального строения, расположенными в области Си-С24- Увеличение количества углеводородов происходит за счет синтеза нормальных алканов Cu-Cis и Cig-C24>
• Таким образом, замена неорганического азота на органический (казеин) в концентрации 5 г/л способствует увеличению количества биомассы Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и синтезируемых ими углеводородов.
5.4.2 Влияние фосфатов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирующцми бактериями
Физиологическая роль фосфатов у микроорганизмов проявляется в ряде важных биохимических процессов, преимущественно связанных с получением энергии (Forrest, Walker, 1965; Wood, 1987). Фосфорный обмен сульфатредуцирующих бактерий, также изучался, в основном, в плане выяснения их значения в
энергетическом метаболизме. Использование пирофосфата как источника энергии бактериями рода Desulfotomaculum, показано в работе Лиу с соавторами (Liu, Peck,1982). Клемпс с соавторами (Klemps et.al.,1985) высказывают сомнение по этому вопросу. В более поздних работах (Wood, 1987) отмечается, что у анаэробов пирофосфаты могут обеспечивать ряд энергозависимых реакций, заменяя АТФ. Показано, что добавление неорганического фосфата в питательную среду может обеспечить энергетические потребности анаэробов и, следовательно, их рост. Активация ростовых процессов сульфатредуцирующих бактерий в присутствии неорганического фосфата отмечалась и в работах Постгейта (Postgate, 1959, 1984). Ряд штаммов сульфатредуцирующих бактерий способны извлекать фосфор из FeP04 (Banik, Ninawe, 1989). В связи с этим, нами изучалось влияние неорганических фосфатов на рост Desulfovibrio desulfuricans и образование ими внеклеточных углеводородов.
В работе использовали культуру Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799. Опыты проводили на модифицированной среде Постгейта Д, обогащенной фосфатами за счет К2НРО4 или КН2РО4, в концентрации 0,5 г/л, 1,0 г/л, 2,0 г/л. В среде Постгейта Д лактат кальция заменен на лактат натрия, чтобы избежать осаждение фосфатов ионами кальция. Контролем являлась ранее использованная среда, содержащая 0,5 г/л КН2РО4. Газовая фаза -Н2+СО2 в соотношении 19:1. Методика проведения опытов и анализ продуктов метаболизма описаны в разделе "Объекты и методы исследования".
Как показали полученные результаты, при концентрации КН2РО4 - 1,0 г/л прирост биомассы составляет 190,0±1,8 мг/л, что выше показателей прироста биомассы в контрольной среде.
Дальнейшее увеличение фосфатов до 2,0 г/л свидетельствует о насыщении питательной среды фосфатами и оказывает менее значительное влиянияние на рост бактерий (табл. 19).
Добавление КН2РО4 в питательную среду вызывает увеличение количества синтезируемых бактериями углеводородов, особенно, при концентрации КН2РО4 - 1,0 г/л. Показатель продуктивности углеводородов возрастает в 1,3 раза по сравнению с контролем и составляет в этом случае 0,14 мкг на мг синтезированного бактериями белка.
Внесение в питательную среду фосфата в виде К2НРО4 несколько снижает прирост биомассы сульфатредуцирующих бактерий при одновременном повышении синтеза углеводородов. Показатель продуктивности углеводородов на мг белка при концентрации К2НРО4 1,0 г/л составляет 0,18 мкг, что в 1,6 раза выше показателя при росте бактерий в контрольном варианте.
Таким образом, увеличение в питательной среде концентрации фосфата в виде КН2РО4 приводит к активации ростовых процессов в клетках Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, что соответствует результатам, полученным ранее (Postdate,1984), а также к некоторому увеличению синтеза углеводородов. В присутствии К2НРО4 в различных концентрациях D. desulfuricans растет слабее, однако, количество синтезируемых бактериями углеводородов на мг белка в 1,3-1,6 раз больше, чем в опытах с КН2РО4.
Дополнительное внесение в питательную среду фосфатов не вызывает существенного изменения в спектрах углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799. Спектры их располагаются в области С11-С24 • Однако, если замена сульфатов в питательной среде на нитраты или карбонаты
Таблица 19
Влияние неорганических фосфатов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 (34-36 час)
Газовая
Концентрация фосфатов, г/л
Продукты метаболизма
Белок мг/л
Углеводороды, мг/л
Продуктивность, углеводороды мкг/мг белка
Углеводороды, % от биомассы
Н2+СО2 | КН2РО4
0,5 (контроль) 1,0 2,0
170,5+2,9 190,0+1,8 186,2+2,0
18,9+0,8 25,9±0,5 19,8+0,4
0,11 0,14 0,11
11,09+0,34 13,63±0,13 10,69±0,10
0,5 1,0 2,0
164,6+1,8 150,0±1,2 145,0+1,0
24,2+0,4 26,4+0,6 20,4±0,9
0,15 0,18 0,14
14,70+0,18 17,60+0,26 14,07+0,52
Таблица 20
Характеристика внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВШ 1799 при внесении фосфатов в питательную среду
Концентр, фосфатов, г/л
Количество углеводородов, % отн
£ Си - Cia
L С19 - Cg4
L С норы
Z С изо
Z С неч/Счет
КН2РО4 2,0 1,0 0,5 КЙНР04 2,0 1,0 0,5
17,2 ± 2,0 41,9 ± 3,2 54,2 ± 3,3
29,2 1 3,0 42,1 ± 2,8 55,9 ± 2,8
82,8 i 3,6 58,1 ± 3,0 45,8 ± 2,8
70.8 ± 2,2
57.9 ± 2,2 43,1 ± 2,0
89.4 ± 2,4 69,1 ± 3,0
86.0 ± 2,5
80,0 ± 2,0
77.1 ± 2,3
78.5 ± 2,2
10,6 ± 2,5 30,9 + 1,0 14,0 i 2,0
20,0 ± 3,4 22,9 ± 2,8 21,5 ± 2,6
0,85 ± 0,05 0,92 ± 0,06 1,04 ± 0,03
0,88 ± 0,06 0,90 + 0,05 0,97 ±0,04 |
приводит к повышению количества более низкомолекулярных углеводородов, то увеличение концентрации фосфатов вызывает повышение доли углеводородов с длиной цепи С19-С24 (табл. 20).
5.4.3 Синтез углеводородов Dessulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при выращивании бактерий в лабораторном биореакторе
Исследования показали, что в процессе роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 происходит потребление газовой смеси 150-200 мл в сутки. В связи с этим, биореактор ежедневно дополняли новой порцией газа (Нг:С02 = 9:1).
В процессе ферментации культуральную жидкость анализировали на содержание углеводородов по принятой нами методике.
Как показали результаты исследований, количество углеводородов в процессе роста бактерий постоянно увеличивалось и достигало к концу опыта 85,2±2,4 мг/л.
Синтезируемые штаммом углеводороды определялись в основ-
Рис. 38 Схема биореактора примененного в лабораторном эксперименте для получения углеводородов при выращивании бактерий Desulfovibrio desulfuricans
Таблица SI
Характеристика внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в процессе роста в условитях биореактора
i 1 —. 1
| Время, | час Количество углеводородов, % отн
| 43 j 54,0 ± 3,2 I 46,0 ± 2,8 | 85,8 ±2,3 1 14,2 ± 2,8 | 1,04 ± 0,03 |
1 72 | 53,8 ± 3,0 | 46,2 ± 2,5 | 85,0 ± 2,9 1 15,0 ± 2,6 | 1,04 ± 0,02 |
| 120 | 50,3 ± 2,4 | 49,7 ± 2,4 ! 79,8 ± 2,4 | 20,2 ± 2,8 | 0,95 ± 0,02 j
| 144 | 46,8 ± 2,2 | 53,2 ± 2,6 | 75,0 ±2,4 | 25,0 ± 2,6 | 0,80 ± 0,03 |
1!- I | • | | 1
ном в области С11-С24. По мере роста клеток отмечалось увеличение во времени как нормальных, так и изоформ углеводородов с длиной цепи С19-С24 (табл. 21). Соотношение четных и нечетных углеводородов в процессе роста бактерий изменялось незначительно и было близко к 1,0.
Таким образом, увеличение объема питательной среды и, особенно, объема газовой фазы способствует увеличению не тол-ко общего количества синтезируемых сульфатредуцирующими бактериями углеводородов, но и алканов с большей длиной цепи, а также количеству изоформ.
5.4.4 Моделирование образования углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при росте культуры в биореакторе Математическое моделирование процессов, осуществляемых сульфатредуцирующими бактериями, сосредоточено, в основном, на моделировании скорости сульфатредукции и роста бактериальных клеток (Okabe, Characklis, 1991; Okabe et.al.,1992; Oka-be, 1994). Изучены потребности D. desulfuricans (шт.1359) в лактате и сульфате в процессе периодического и хемостатного культивирования в биореакторах (Herгага et.al., 1991).
Как было указано выше, синтез углеводородов начинается с момента прироста биомассы и образования кислот. В процессе образования углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 нет четко выраженной двухфазности процесса, характерного для многих бродильных процессов, однако, зависимость синтеза углеводородов бактериями от накопления в среде органических кислот имеется.
Кроме того, по данным наших исследований образование уг-
леводородов сульфатредуцирующими бактериями находятся в прямой зависимости от окислительно-восстановительного потенциала среды и происходит только при низком окислительно-восстановительном потенциале, соответствующем (-290)-(-360) мВ. При Eh -100 мВ синтез углеводородов прекращается.
Изучение механизма взаимосвязи показателей рН и Eh среды в процессе роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 является важным этапом в синтезе углеводородов.
Для экспериментов использовали сконструированный нами биореактор, позволяющий регистрировать изменения, происходящие в процессе культивирования бактерий.
Проведенные нами исследования показали, что в процессе роста сульфатредуцирующих бактерий происходит образование кислот и рН среды снижается. Наблюдаемое изменение кислотности среды приводит к изменению в ней окислительно-восстановительного потенциала. Так в наших экспериментах при снижении рН среды в процессе роста D.desulfuricans ВКМ 1799 до 6,0 наблюдалось увеличение значений Eh среды до -190мВ. В даннных условиях еще наблюдается незначительное образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями. Дальнейшеее повышение кислотности среды сульфатредуцирующими бактериями сопровождается понижением рН среды до 4,5 и процесс образования углеводородов прекращается, так как кислая среда, создаваемая жирными кислотами, делает невозможным их восстановление до углеводородов, благодаря повышению окислительно-восстановительного потенциала среды до -100 мВ.
Такая же закономерность наблюдается при метаногенезе, где снижение величины рН среды связано с нарушением скоростей
Рис. 40 Спектр углеводородов синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799:
а) - хромалюграмма без дополнительного внесения
жирной кислоты в среду культивирования,
б) - хромалюграмма с добавлением олеиновой
кислоты
Таблица 22
Влияние олеиновой кислоты на синтез углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
образования летучих жирных кислот и дальнейшим их превращением в метан (Чан Динь Тоай, Хлудова, Панцхава, 1983).
Поскольку процесс образования углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, повидимому, завершается восстановлением жирных кислот, представляло интерес изучить возможность вовлечения в синтез углеводородов экзогенно внесенной жирной кислоты, обладающей малой растворимостью в воде и не влияющей на подкисление среды.
В опытах была использована олеиновая кислота, которую вносили в питательную среду в концентрации 50 мл/л. Олеиновая кислота не является субстратом для роста D.desulfuricans (Розанова, Назина, 1989). Однако добавление ее в модифицированную среду Постгейта Д, где росли сульфатредуцирующие бактерии, в атмосфере Н2+СО2 увеличивало синтез углеводородов в пять раз (рис. 40).
В этих условиях, по-видимому, происходил процесс совос-становления олеиновой кислоты до углеводородов наряду с другими жирными кислотами, присутствующими в культуральной жидкости.
Анализ спектров. углеводородов показал прирост как углеводородов с длиной цепи Cu-Ciq» так и в большем количестве углеводородов Cig-C24 (табл. 22). Количественное преимущество нормальных углеводородов остается без изменений. Коэффициент нечетности близок к 1.
Таким образом, приведенные результаты подтверждают возможность моделирования синтеза углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при участии жирных кислот.
ГЛАВА 6 МЕХАНИЗМ СИНТЕЗА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ DESULFOVIBRIO DESULFURICANS ВКМ 1799
Изучение механизма образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями является важным этапом в выяснении их геохимической деятельности и возможности применения в биотехнологии.
В работе использовали Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, как наиболее активный штамм способный расти и продуцировать внеклеточные углеводороды в гетеротрофных и хемолито-гетеротрофных условиях (в атмосфере Н2+С02). Этот вид сульфатредуцирующих бактерий широко распространен в природе.
При изучении механизма синтеза углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 основное внимание в исследованиях было направлено на выяснение роли отдельных соединений, входящих в состав питательной среды на которой культивировали штамм, а также на участие в образовании углеводородов промежуточных продуктов метаболизма бактерий.
6.1 Участие лактата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Опыты проводили на модифицированной среде Постгейта Д в условиях гетеротрофного и литогетеротрофного роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в атмосфере Н2+СО2.
С целью изучения участия лактата в синтезе внеклеточных углеводородов в фазу экспоненциального роста популяции (18-20 часов с момента посева бактерий) в питательную среду вносили молочную кислоту меченую 14С по первому, либо по третьему по-
ложению атома углерода.
Результаты исследований представлены в таблицах 23, 24.
Таблица 23
Включение 14С в углеводороды Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при внесении лактат в питательную среду меченого по карбоксильной группе СН^СН(ОН)14С00Н
Условия опыта
Время экспозиции
Доля потребленного вещества, %
Распределение 14С, % от введеного вещества
биомасса |углеводороды
литоге-теро-трофные
гетеротрофные
18,97+0,02 38,77±0,22
18,19+0,04 37,67+0,12
0,78+0,06 1,10±0,10
5,25+0,05 ■10,98±0,08
4,32+0,02 9,15+0,06
0,93+0,03 1,83+0,02
Результаты исследований показали, что лактат меченный по карбоксильной или метильной группе активно используется суль-фатредуцирующими бактериями. Количество потребленного 14С значительно больше при внесении меченного лактата в питательную среду бактерий, растущих в литогетеротрофных условиях. Это объясняется, по-видимому, тем, что рост Desulfovibrio de-
sulfuricans ВКМ 1799 в гетеротрофных условиях является предпочтительным и добавление меченного лактата в среду культивирования штамма, приводит к активному вовлечению его в метаболизм бактерий.
Таблица 24
Включение 14С в углеводороды Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при внесении в питательную среду лактата меченого по метальной группе 1АСНзСН(0Н)С00Н
Условия опыта
Время экспозиции, час
Доля потребленного вещества, %
Распределение 14С, % от введенного вещества
биомасса |углеводороды
литоге-теро-трофные
гетеротрофные
21,26*1,03 45,75±0,15
4,69+0,10 11,08+0,30
20,57+1,23 44,90*0,01
0,68*0,01 0,84*0,16
3,96*0,01 9,52*0,03
0,73*0,01 1,54*0,06
Основная доля потребленного меченного лактата (82-98%) обнаруживается в биомассе Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 отмытой от внеклеточных продуктов метаболизма, независимо от условий культивирования штамма. Остальная часть (2-18%) 14С лактата используется клетками на синтез углево-
дородов. При гетеротрофном росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 меченой углерод лактата обнаруживается в углеводородах в 1,2-1,8 раз больше, чем при литотрофном росте штамма, что связано с более активным синтезом углеводородов в данных условиях.
Меченый углерод обнаруживается в углеводородах, как из метильной, так и карбоксильной групп лактата. Количество 14С незначительно (в 1,2-1,3 раза) выше при использовании лактата меченого по карбоксильной группе (табл.25).
Таблица 25
Включение 14С в углеводороди Desulfovibrio desulfuricans
ВКМ 1799 из меченого лактат
Условия опыта
Время экспозиции
Количество 14С в углеводородах,MMKCi
СН3СН(0Н)14С00Н
14СНзСН(0Н)С00Н
литогете-трофные
гетеротрофные
3,41±0,30 5,50±0,50
4,65+0,15 9,17+0,12
3,90+0,04 4,18+0,83
3,65±0,05 7,74±0,30
Таким образом, лактат используется сульфатредуцирующими бактериями как для синтеза самих углеводородов, так и для накопления биомассы, участвующей в этом процессе.
6.2 Участе ацетата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Ацетат является одним из конечных продуктов окисления лактата Desulfovibrio desulfuricans, 10% которого вовлекается сульфатредуцирующими бактериями в конструктивный метаболизм клеток (Badziong et.al.,1979). Являясь жирной кислотой, ацетат может участвовать в синтезе углеводородов.
Опыты проводили на модифицированной среде Постгейта Д в условиях гетеротрофного и литогетеротрофного роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в атмосфере Н2+СО2.
Для доказательства участия ацетата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в фазу экспоненциального роста популяции (18-30 часов с момента посева бактерий) в питательную среду вносили 14СНзС00Н или СНз14С00Н с целью определения меченного углерода ацетата в составе синтезируемых бактериями углеводородов (табл. 26, 27).
Результаты исследований показали, что меченный углерод 14СНзС00Н и СНз14С00Н обнаруживается в биомассе бактерий и синтезируемых ими углеводородах при росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 как в гетеротрофных, так и литогетерот-рофных условиях. Общее потребление 14СНзС00Н и СНз14С00Н от количества вещества, внесенного в культуральную среду выше для штамма, растущего в гетеротрофных условиях, и составляет 20-83% в зависимости от длительности экспозиции клеток с меченным ацетатом. В литогетеротрофных условиях роста D.desulfuricans ВКМ 1799 эти показания составляют 36-40%. Количество 14С в биомассе и внеклеточных углеводородах штамма увеличива-
ется в зависимости от времени роста бактерий в присутствии меченного ацетата.
Таблица 26
Включение 14С в углеводорода Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при внесении в питательную среду ацетата меченого по карбоксильной группе СЯз14С00Я
Условия опыта
Время экспозиции
Доля потребленного вещества, %
Распределение 14С, % от введенного вещества
биомасса
углеводороды
лито-гете-трофные
гетеротрофные
Зб,78±1,49 40,30+0,31
36,10+1,48 38,92±0,28
0,68±0,01 1,38±0,02
20,96±0,46 69,30±1,03
2,72±0,42 15,50+0,54
18,24+0,04 53,80±1,99
При литогетеротрофном росте штамма основное количество потребленного меченого ацетата (91-98%) обнаруживается в биомассе, поскольку Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в этих условиях использует углерод ацетата как из метильной, так и карбоксильной групп на конструктивный метаболизм, что соответствует данным литературы (Badziong, Ditter, Thauer, 1979; Klemps et.al.,1985). На синтез углеводородов используется 2-9% меченного углерода ацетата.
Таблица 27
Включение 14С в углеводороды Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при внесении ацетата в питательную среду меченого по метальной группе 14СНзС00Н
Условия опыта
Время экспозиции
Доля потребленного вещества, %
Распределение 14С, % от введеного вещества
биомасса |углеводороды -Н-
литоге теро-трофные
гетеротрофные
35,86±0,43 39,30±0,49
30,04+0,84 83,19±0,68
35,04±0,40 37,64±0,34
2,30+0,59 17,03±0,03
0,82±0,02 1,66±0,15
27,25+0,44 66,16±0,15
При гетеротрофном росте D.desulfuricans ВКМ 1799 основная доля потребленного меченого углерода ацетата (54-92%) обнаруживается в углеводородах, что связано с большим накоплением биомассы и активным синтезом углеводородов в данных условиях. Интересно отметить, что из экзогенно внесенного ацетата на синтез углеводородов, как и в случае с 14С-лактатом, используется меченый углерод как карбоксильной, так и метальной групп. Однако в данном варианте опытов наблюдается более активное (в 1,2-1,5 раз) включение в синтез углеводородов ацетата меченного по 14С-метильной группе, что свидетельствует об участии в этом процессе реакций декарбоксилирования (табл. 28).
Таблица 28
Сравнительные данные количества 14С ацетата используемого Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 для синтеза углеводородов
I Время | Количество 14С в углеводородах,mmkCi|
условия [ экспо- i-:-|-;-1
опыта | зиции | СНз14С00Н | 14СН3С00Н |
Таким образом, результаты исследований подтвердили участие ацетата в синтезе углеводородов D.desulfuricans ВКМ 1799.
6.3 Участие СОг ® синтезе углеводородов Desulfo-
vibrio desulfuricans ВКМ 1799
Сравнительное изучение синтеза внеклеточных углеводородов D.desulfuricans ВКМ 1799 на лактатсодержащей среде в атмосфере аргона и Н2+СО2, показало увеличение количества углеводородов в культуральной жидкости в присутствие газовой смеси. Показано активное потребление бактериями СО2 в процессе роста штамма. На основании полученных результатов можно предположить, что С02 участвует в синтезе углеводородов сульфат-ре дуцирующими бактериями.
Опыты проводили на модифицированной среде Постгейта Д с внесением меченного бикарбоната в фазу экспоненциального роста D.desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 (18-20 часов с мо-
мента посева бактерий), при культивировании штамма в гетеротрофных и литогетеротрофных условиях, в присутствии молекулярного водорода (95%) в газовой фазе.
Как показали исследования, активное включение меченюго углерода бикарбоната во внеклеточные продукты метаболизма (кислородсодержащие соединения и углеводороды), а также в биомассу D.desulfuricans ВКМ 1799 наблюдается как в гетеротрофных, так и литогетеротрофных условиях роста бактерий. Общее количество потребленного 14С от введенного в культуральную среду меченного бикарбоната составляет 59-75% (табл.29).
Таблица 29
Включение МаН14С0з во внеклеточные продукты метаболизма Desulfovibrio desulfur cans ВКМ 1799 в атмосфере Hz
Условия опыта
Время экспозиции, час
Доля потребленного вещества, %
Распределение 14С, % от введенного NaH14C03
Углеводороды
Кислород-содержащ. соединения
Биомасса
литоге-теро-трофные
гетеротрофные
62,34±0,12 74,94+0,33
59,29+0,66 72,33±0,33
3,76+0,06 4,95±0,05
12,19±0,19 13,75±0,25
28,89+0,09 34,15+0,15
16,86±0,06 26,33+0,32
9,75±0,05 35,85±0,15
30,39+0,28 32,25±0,25
В процессе роста D.desulfuricans ВКМ 1799 с меченным бикарбонатом в гетеротрофных и литогетеротрофных условиях культивирования штамма количество потребленного 14С увеличивается, что свидетельствует об использовании СОг растущими клетками сульфатредуцирующих бактерий в метаболических процессах. Участие СОг в метаболизме сульфатредуцирующих бактерий отмечалось в ранее опубликованных статьях (Сорокин,19666; Badziong et.al.,1979).
Как видно из таблицы, меченый углерод бикарбоната обнаруживается в углеводородах, кислородсодержащих продуктах и в биомассе. Основная доля меченого углерода обнаруживается в кислородсодержащих соединениях и в биомассе. На долю углеводородов в гетеротрофных условиях роста сульфатредуцирующих бактерий приходится 19-20% от потребленного меченого бикарбоната. В литогетеротрофных условиях роста штамма на синтез углеводородов используется 6% меченого углерода, поскольку основная часть С02 вовлекается бактериями в конструктивные процессы.
Аналогичные результаты по влиянию ИаНСОз на синтез углеводородов в гетеротрофных условиях роста были получены и для Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1388 (Беляева и др., 1992).
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют об активном участии С02 в процессах синтеза внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799.
6.4 Участие форииапа в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Способность к образованию формиата из СОг прямым восстановлением была установлена для некоторых видов бактерий рода
Clostridium (Thauer, 1970; Andercen, Ljungdahl, 1974; Ljung-dahl, 1986). Поскольку, как отмечалось выше, в атмосфере Н2+СО2 происходит увеличение синтеза углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, можно предположить, что одним из промежуточных продуктов, участвующим в синтезе этих соединений, является формиат.
Опыты проводили на модифицированной среде Постгейта Д в гетеротрофных и литогетеротрофных условиях культивирования-бактерий, в присутствии Н2+СО2. Для доказательства участия формиата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, в фазу экспоненциального роста штамма вносили Н14С00Н.
Результаты включения меченого формиата в углеводороды D.desulfuricans ВКМ 1799 представлены в таблице 30.
Исследования показали, что формиат ассимилируется клетками как в гетеротрофных, так и в литогетеротрофных условиях роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799. Количество потребленного Н14С00Н в гетеротрофных условиях роста штамма было в 1,5 раза выше, чем при литогетеротрофном культивировании бактерий, что связано с более активным накоплением биомассы Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на среде с лактатом.
В литогетеротрофных условиях роста бактерий 78-84% меченного углерода формиата определяется в биомассе D.desulfuricans ВКМ 1799, а 16-22% обнаруживается в углеводородах. Активное включение формиата в биомассу объясняется недостатком органического углеродного питания для роста штамма в этих условиях.
При росте сульфатредуцирующих бактерий на лактатсодержа-
щей среде включение метки из Н14СООН в углеводороды достигает 95% уже в первые часы экспозиции формиата с D.desulfuricans ВКМ 1799 и сохраняется в процессе роста штамма.
Таблица 30
Включение меченого формиата в углеводорода Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при различных условиях кулытвирования
Условия
Время экспозиции
Доля потребленного вещества, X
Распределение 14С, %
Углеводороды J Биомасса
литоге-теро-трофные
гетеротрофные
54,87+0,13 58,90+0,10
11,71±0,29 12,75±0,25
43,16±0,16 44,15±0,15
84,71+0,19 87,24+0,56
80,35±0,55 81,32±0,68
4,36±0,36 5,92±0,12
Таким образом, формиат является наиболее активным соединением, участвующим в синтезе углеводородов сульфатредуцирующими бактериями.
Следующая серия опытов по изучению влияния формиата на синтез углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 была проведена при дополнительном внесении формиата в питательную среду для культивирования клеток. Культуру Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 выращивали в принятых нами условиях гетеротрофного роста бактерий. Газовая фаза содержала Н2+СО2 в
соотношении 9:1. Данные условия культивирования являлись контрольным вариантом. В опытном варианте в состав питательной среды вносили формиат в концентрации 2 г/л.
Как видно из полученных результатов, дополнительное внесение в питательную среду формиата увеличивает прирост биомассы на период стационарной фазы роста бактерий в опытном варианте до 195,0±2,5 мг/л (lg - 2,29) за счет использования формиата, как дополнительного источника питания, что соответствует данным литературы (Jansen et.al., 1984; Розанова, Га-лушко, 1987) (рис. 41). Количество синтезируемых бактериями углеводородов при дополнительном внесении формиата, также увеличивается в 1,3-1,5 раз (табл. 31).
Таблицу 31
Синтез углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при дополнительном внесении формиата в питательную среду
Условия опыта
без внесения формиата
(контроль) с добавлением формиата
Газовая фаза
Углеводороды, мг/л
Продуктивность, углеводороды мкг/мл белка
Углеводороды, Z от биомассы
Рис. 41 Динамика роста и образования внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в условиях гетеротрофного роста (в авносфере B2:C0Z-9:1)
a) при долошительном ввесевии формиата,
b) на лактате (контроль);
1 - биомасса, мг белка/л, lg,
2 - углеводорода, мг/л
Сравнение расчетов продуктивности углеводородов на мг белка, при дополнительном внесении формиата в питательную среду, по сравнению с контрольным вариантом показало, что этот показатель возрастает в 1,4 раза.
Таким образом, результаты данных экспериментов подтверждают участие формиата в синтезе углеводородов сульфатреАудирующими бактериями.
Присутствие формиата в питательной среде способствует не только увеличению количества углеводородов, но и изменению их спектра. Формиат способствует увеличению количества углеводородов с более короткой длиной цепи (Сц-Сав), как и в случае роста Desulfovibrio desulfuricans в атмосфере Н2+СО2. Кроме того, возрастает количество нечетных форм углеводородов.
Поскольку формиат используется Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, на синтез углеводородов, клетки сульфатредуцирующих бактерий были проверены на формиатдегидрогеназную активность. Установлено, что частично очищенные препараты фор-миатдегидрогеназы, были получены из D. gigas (Rieder-Henderson, Peck, Harry, 1986) u D. vulgaris (Yagi, 1969).
В опытах использовали клетки сульфатредуцирующих бактерий, находящиеся в начале стационарной фазы роста. Активность фермента изучали спектрофотометрическим методом по редукции метилвиологена в бесклеточных экстрактах Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 и в культуральной жидкости (табл. 32).
Как видно из результатов, клетки Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 содержат формиатдегидрогеназу, которая может участвовать в синтезе формиата. В культуральной жидкости активность фермента не обнаружена.
Таблица 32
Активность формиатдегидрогеназы Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
1 г | Варианты опыта | 1 1 Метилвиологен, мкМ/мин/мг белка 1
1 1 | Бесклеточный | 2,43 + 0,20
| экстракт |
| Культуральная | не обнаружено
1 среда | | | 1
6.5 Распределение меченого углерода в продуктах
метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при синтезе углеводородов
С целью определения меченого углерода в промежуточных продуктах синтеза углеводородов из культуральных жидкостей, после четырех часов роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 с мечеными веществами (лактат, бикарбонат, формиат) в литогетеротрофных условиях, выделяли гидразоны, присутствующих в них кислот, и исследовали их методом тонкослойной хроматографии (рис. 42). Гидразоны органических кислот были получены из культуральных жидкостей, при внесении лактата меченого по карбоксильной группе, поскольку участие углерода из метильной группы лактата в образовании ацетата было показано ранее (Postgate,1951), при внесении 14С-бикарбоната и 14С-формиата. В качестве контролей использовали гидразоны кислот, полученные из стандартных растворов.
Как видно из результатов хроматографии наибольшее коли-
ацетат
формиат
лактат пируват
Рис. 42 Тонкослойная хроматография кислот, продуцируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1790 при внесении: 1 - СНзСН(0Н)1/кС00Н, 2 - МДН14С0Э, з - Н1АСООН Газовая фаза U2+CO2, лi6o В2 в случае с МаН14Срз
чество кислот определяется в культуральной жидкости при росте бактерий в присутствии 14С-лактата. Обнаружены следующие соединения: лактат - Rf 0,62; пируват - Rf 0,55; ацетат - Rf 0,87. Формиат не имел четко выраженного пятна, но радиоактивный счет в этой области (Rf 0,80) обнаруживался. Эти данные соответствуют показаниям Rf исследуемых органических кислот, полученных ранее в работе Прея с соавторами (Prey, Berbalk, Kausz, 1962). Меченый углерод карбоксильной группы лактата был обнаружен во всех перечисленных соединениях. Основное количество 14С (98,9%) определяется в пирувате (табл. 33). В ацетате и формиате содержание меченого углерода составляет менее 1%. Эти результаты соответствуют схеме окисления лактата сульфатредуцирующими бактериями (Чеботарев, Вербина, 1978; Postgate, 1984).
Распределение С в продуктах метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при синтезе углеводородов
Таблица 33
Экзогенные
Распределение 14С, % отн.
субстраты
формиат
ацетат
пируват
37,0+0,50 | 41,0+0,40 | 22,0±0,60
27,5±0,30 | 78,5+0,50
СН3СН(0Н)141С00Н | 0,5±0,01
0,6+0,02 | 98,9*1,00
При внесении в питательную среду меченого бикарбоната выявляются пятна, соответствующие ацетату, формиату, а также пирувату. Появление пирувата связано, по-видимому, с образованием его в конструктивном процессе с участием СОг, что соответствует результатам полученным ранее (Badziong et. al., 1978, 1979; Badziong, Thauer, 1980).
Наиболее активно меченый углерод из бикарбоната включается в формиат (37%) и ацетат (41%), что свидетельствует об участии СОг в метаболизме этих соединений. Поскольку меченый углерод бикарбоната, как было показано ранее (табл.33), обнаруживается в углеводородах, можно было предположить, что формиат и ацетат являются промежуточными продуктами метаболизма СОг в синтезе этих соединений. Несколько большее количество 14С в ацетате, чем в формиате, связано, по-видимому, с более активной реакционной способностью последнего.
При внесении в культуральную среду меченого формиата выявлялись пятна соответствующие ацетату и формиату. В ацетате обнаруживалось в 3 раза больше меченого углерода (78-79%), чем в формиате. Следовательно, формиат используется Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 для синтеза ацетата в процессе роста культуры. Это соответствует результатам полученным для клостридиальных форм микроорганизмов (Datta, Zeikus,1983).
Среди внеклеточных продуктов метаболизма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на лактатсодержащей среде в атмосфере Нг + С02 были обнаружены спирты. Образование этанола при росте D.vulgaris на лактате отмечалось также в работе Траоре с сотрудниками (Traore et.al., 1981).
Присутствие спиртов в культуральной жидкости определяли с помощью тонкослойной хроматографии, анализируя их эфирные экстракты. Эфиры спиртов получали из культуральных жидкостей после четырех часов роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на модифицированной среде Постгейта Д в атмосфере Н2+СО2, с 14С-лактатом, меченым по карбоксильной группе, 14С-формиатом или 14С-бикарбонатом. В качестве контролей использовали эфиры этилового и метилового спиртов.
Как показали исследования, во всех изученных вариантах опытов имелись пятна, соответствующие этим спиртам (рис. 43). Rf метилового и этилового спиртов - 0,50 и 0,62 соответственно, что совпадает с показателями Rf для данных соединений, представленных в работе Шталя (1965).
Кроме того, в пятнах принадлежащих спиртам, обнаруживалась радиоактивность (табл. 34).
Таблица 34
Распределение 14С в метаноле и этаноле при синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799
Экзогенные
Распределение % отн.
субстраты
метанол
этанол
ЫаН14С0э Н14С00Н
СН3СН(0Н)14С00Н
65,0±0 > 32 63,0+0,25 19,4±0,50
35,0+0,28 37,0±0,30 80,6+1,00
этанол метанол
Рис. 43 Тонкослойная хроматография спиртов, продуцируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 при внесении: 1 - СНзСНСОН^СООВ, 2 - *Ш14С0з, 3 - Л14С00Я Газовая фааа Н2+СО2, либо Hz в случае с МаИ14С©з
Результаты исследований показали, что при внесении в питательную среду меченного лактата, 14С преимущественно обнаруживается в этаноле, а при внесении в питательную среду бикарбоната или формиата - в метаноле. Следовательно, этанол и метанол являются промежуточными продуктами в трансформации этих соединений в углеводороды.
В синтезе углеводородов микроорганизмами возможно участие и других веществ, например кетонов. Их роль окончательно не выяснена. Возможное образование кетонов из жирных кислот отмечается в работе Торнабене (Tornabene, 1982). Блокирование синтеза углеводородов при помощи Pbz+ в микрококках приводило к синтезу длинноцепочечных кетонов, в точности соответствующих химической структуре углеводородов (Peterson et.al.,1975). На основании этого авторы считают, что кетоны являются конечными продуктами метаболизма, а не предшественниками в синтезе углеводородов. Петров (1984) сообщил, что исследование продуктов реакции свидетельствует о том, что основным процессом в превращении жирных кислот в углеводороды является дегидратационная циклизация, осуществляющаяся по схеме: кислота —■— лактат —— кетон —углеводороды
В наших исследованиях добавление ацетона в питательную среду для роста D. desulfuricans ВКМ 1799 в атмосфере (Н2+СО2), где происходил синтез углеводородов, не вызывало увеличения количества продуцируемых углеводородов.
Таким образом, проведенные исследования позволили выявить основной путь образования внеклеточных углеводородов, осуществляемый сульфатредуцирующими бактериями Desulfovibrio desulfuricans, который включает образование ацетата из СО2, по-видимому по восстановительному СО-дегидрогеназному пути и
дальнейшему восстановлению жирных кислот и их конденсацией в углеводороды.
6.6 Участие молекулярного водорода и водорода
води в синтезе углкводородов Desailfavibrio desulfuricans ВКМ 1799 Для решения вопроса о происхождении атомов водорода, входящих в состав внеклеточных углеводородов при росте Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на среде с лактатом, в первой серии опытов использовали газообразный тритий, заменив часть Н2, входящего в состав газовой фазы (Н2+СО2) при культивировании Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799.
Как показали результаты исследования, по мере роста и образования внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans, происходит постепенное включение метки газообразного трития в их состав (рис.44). Молекулярный водород является инертным газом и неспособен активно включаться в метаболические процессы, что подтверждается полученными результатами и обсуждается в ряде работ (Кондратьева, Гоготов,1981; Варфоломеев, Калюжный, Медман, 1988).
В период стационарной фазы роста культуры, когда синтезируется максимальное количество углеводородов 19,6±0,4 мкг/мл, потребление газообразного трития составляет 1,2мк(Л, т.е. 0,06 MKCi на 1 мкг углеводородов.
Во второй серии опытов исследовали роль водорода воды, используя для этой цели тритиевую воду. Включение трития в углеводороды из тритиевой воды изучали в двух вариантах, как в присутствии немеченного водорода в газовой фазе, так и без него, с целью сравнения интенсивности использования трития в данных вариантах.
2.0 -1 20-1
rH I П 11 \ И in И \ П И u 1 И И и Ч1 '■ И И Ч п 1U Г11
12 24 36 48 60 72 чао
Рис. 44 Дшамика накопления углеводородов в условиях гетеротрофного poena DesuJfoWbrio desulAiricans ЯКИ 1799 и шипения газообразного вривия в их состав; i - углеводорода, мкг/л, 2 - тритш!, tMCi/нл
i/я/аятгдд |—I—|—I—|—I—\
urr/юяэт |—1—|—I—|—1—1—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—1
со см о со
п/ля ГС
Результаты исследований показали, что тритий из воды активно используется клетками для синтеза углеводородов (рис. 45). Интенсивность включения трития в углеводороды на период экспоненциальной фазы роста Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 в 2,0-2,5 раза выше в варианте опытов без введения молекулярного водорода в газовую фазу. На период стационарной фазы роста бактерий количество трития используемого на синтез углеводородов в присутствии водорода в газовой фазе и без него снижается в 1,2 раза и составляет 1,4 MKCi на 23,5±0,4 мкг/мл или 0,06 MKCi на 1 мкг углеводородов, что соответствует количеству потребленного газообразного трития используемого Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799.
Несмотря на то, что количество синтезируемых углеводородов в отсутствии молекулярного водорода накапливается в среде в 1,6 раз меньше, чем в его присутствии и составляет 14,7±0,4 мкг/мл, включение метки в их состав в 1,2 раза выше и составляет 1,7 MKCi. Расчет количества потребленного трития в этом случае составляет 0,12 MKCi на 1 мкг синтезированных углеводородов, что в 2 раза больше количества трития потребленного при добавлении в среде культивирования газообразного водорода. Участие водорода воды (Н+) в синтезе углеводородов, в частности метана, обсуждается в ранее опубликованных работах (Fuchs et.al.,1979; Варфоломеев, Калюжный, Медман, 1988).
Общая доля потребленного трития Desulfovibrio desulfuricans в изучаемых экспериментах достаточно высока (40-50%) (табл. 35). Часть газообразного трития (18%) и трития из три-тиевой воды (15-16%) обнаруживается в биомассе Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799. В углеводородах, меченого трития в
1,8-2,0 раза больше, чем в биомассе. Высокая степень включения трития из воды в углеводороды свидетельствует о том, что генерация восстановителя из воды является необходимой стадией в синтезе углеводородов.
Таблица 35
Включение трития из газообразного состояния и трите-вой воды, в биомассу и углеводороды Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, в период стационарной фазы роста культуры (34-36 час)
Варианты опыта
Доля потребленного трития, %
Распределение трития, %
Углеводороды
Биомасса
3Т2 + С02
Ч2О+Н2+СО2
эТ20+Аг+С0г
42,97±0,10
50,09±0,15
21,62±0,07
33,33±0,06
18,00±0,02
1б,76±0,04
Таким образом из полученных результатов видно, что на синтез углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 равнозначно может использоваться как газообразный тритий, так и тритий из тритиевой воды. В случае отсутствия в атмосфере роста и синтеза углеводородов сульфатредуцирующих бактерий газообразного трития его количество в синтезе углеводородов полностью компенсируется тритием воды.
ГЛАВА 7 ПРИМЕНЕНИЕ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЩШИ БАКТЕРИЯМИ В РАЗЛИЧНЫХ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТАХ
В последнее время Кузнецовым и Дубининой (1989) - в иловых отложениях, Ивановской, Цинбер, Беляевым (1991) - в опытно-промышленной установке микробиологической очистки сточных вод газоперерабатывающего завода, был предложен газохрома-тографический метод определения интенсивности бактериального метаногенеза.
Задачей наших исследований являлось выявление возможности использования газохроматографического метода для определения интенсивности образования жидких углеводородов сульфатредуцирующими бактериями в различных природных объектах.
Материалом для исследований служили: илы Балтийского моря; образцы грунта Прикаспийской впадины; пластовые воды нефтяных месторождений, образцы кернов газонефтеносных пластов, любезно предоставленные нам сотрудниками институтов Океанологии, ВНИЙЯГ, института ПО Татнефть.
Образцы ила Балтийского моря были взяты по профилю залегания морских осадков, в основном, верхнеголоценового возраста (табл. 36).
Как показали исследования, общая численность микроорганизмов в изучаемых нами образцах составляет 3,6-6,4х109 кл/г сырого ила.
Таблица 36
Характеристика образцов ила Башийского моря на содержание микрооганиамов (в расчете на сирой ил)
1 | Номер 1. | Горизонт ■ Общее количество - i Количество сульфат- |
|станции | отбора микроорг анизмов редуц. бактерий на |
I проб, см х109 кл/г ила среде Постгейта В, |
1 кл/г ила |
14967 1. I 0-10 6,4 104 |
14967 | 40 - 50 4,5 104 |
14967 |100 - 110 3,6 102 |
14973 I 0-10 4,1 104 |
Станция 4973 расположена в области кратера Станция 4967 - вне кратера
Балтийское море - водоем с высокой биопродуктивностью и большим содержанием органического вещества (Лейн А.Ю. и др., 1986). Этим объясняется большое количество микроорганизмов в донных осадках. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается в поверхностных слоях ила. С увеличением глубины, количество микроорганизмов уменьшается. Выделенный из образцов ила наиболее активный штамм сульфатредуцирующих бактерий (БИ) проверяли на способность синтезировать внеклеточные углеводороды в гетеротрофных условиях роста на среде Постгейта В в атмосфере Н2+С02. Анализ продуктов метаболизма показал, что бактерии продуцируют внеклеточные углеводороды 8,5±0,5 мг/л, в несколько большем количестве по сравнению с музейным
штаммом Desulfovibrio desulfuricans на данной среде.
Для определения интенсивности образования углеводородов газохроматографическим методом непосредственно в образцах ила, содержащих сульфатредуцирующие бактерии, пробы помещали в стерильные склянки (объем 75 мл). Исследуемый материал вносили по 20 г, вводили газовую смесь, состоящую из Н2+СО2 в соотношении 9:1 и закрывали резиновыми пробками с завинчивающимися крышками. Модельные опыты содержали два опытных и два контрольных варианта.
Опытные варианты :
1. исходный образец в атмосфере Нг+СОг,
2. исходный образец в атмосфере аргона.
Контрольные варианты:
1. образец, прогретый 2 часа в автоклаве при 1,5 атм. к опыту первого варианта
2. образец, прогретый в автоклаве при 1,5 атм. к опыту второго варианта.
Предварительно контрольные варианты проверяли на отсутствие жизнеспособных микроорганизмов и их спор.
Как видно из хроматограмм, через месяц инкубации было отмечено увеличение количества углеводородов в 4-5 раз, в диапазоне С18-С24» в обР5131*3* ила (станция 4973, глубина -0-10 см), где присутствовали сульфатредуцирующие бактерии
HCi2 HCi6 HC20 HC24
Рис. 46 Спектры углеводородов ила Балтийского моря (ст. 4973): а - опытный вариант - исходный образец в атмосфере Н2+СО2; б - опытный вариант - исходный образец + аргон; в - контрольный вариант - образец в отсутствии шзнеспособных микроорганизмов + (Hz+COz)
НС12 HCi6 НС20 НС24
Рис. 47 Спектры углеводородов ила Балтийского моря (cm. 4967J; а - опытный вариант - исходный образец в атмосфере Н2+СО2; б - опытный вариант - исходный образец + аргон; в - контрольный вариант - образец в отсутствии жизнеспособных микроорганизмов + (Н2+СО2)
б атмосфере Н2+СО2. В атмосфере аргона увеличение количества углеводородов было незначительным. В спектрах контрольных вариантов имеются углеводороды, которые по-видимому присутствовали в образцах до начала опытов.
Такая же зависимость наблюдается при использовании образцов ила со станции 4967 (глубина - 0-10 см). Количество углеводородов, получаемых из образцов, содержащих сульфатредуцирующие бактерии, и инкубированных в атмосфере Н2+СО2, было больше, по сравнению с контрольными вариантами.
Больших различий в накоплении углеводородов в образцах ила, взятых из участков кратера и вне его, не наблюдалось, по-видимому из-за равного содержания в образцах сульфатредуцирующих бактерий (104 кл/г ила).
Образца грунт Прикаспийской впадины исследовали из зон нефтяных месторождений и вне их.
Общее количество микроорганизмов в образцах грунта Прикаспийской впадины составляет 0,6-1,2 х108 кл/г грунта. Сульфатредуцирующих бактерий в контуре месторождения нефти несколько больше, чем вне контура, что объясняется, по-видимому, более интенсивными био-и геохимическими процессами, проходящими в этих зонах (табл. 37). Выделенный из образца грунта Ащисайской перспективной структуры штамм сульфатредуцирующих бактерии (БГ) синтезирует внеклеточные углеводороды в количествах 7,4±0,4 мг/л.
Интенсивность образования углеводородов в образцах грунта, взятых в контуре месторождений и содержащих сульфатредуцирующие бактерии, с помощью газохроматографического метода определяли по методике описанной выше для анализа образцов ила Балтийского моря.
Таблица 37
Характеристика образцов грунта Прикаспийской впадины на содержание микроорганизмов
1 1 1 Горизонт ■ Общ. числ. 1 Колич. СРВ |
1 N | Образцы грунта отбора микроорг. на среде |
1 проб, хЮ8 кл/г Постгейта В|
1 см грунта кл/г грунта]
1 1 | Ащисайская перспектив.
| структура 0-20 0,8 103 |
1 2 | Ащисайская перспектив.
| структура 0-20 0,6 102 |
1 з | Дивнопольская перспект
[ структура 0-20 1,1 102 |
1 4 | Дивнопольская перспект
| структура 0-20 1,2 102 |
L. | !. 1
1.3 - в контуре месторождения,
2.4 - вне контура месторождения.
Исследования показали, что интенсивность образования углеводородов в образцах грунта Ащисайской перспективной структуры выше, по сравнению с Дивнопольской структурой (рис. 48). Это соответствует результатам численности сульфатредуцирующих бактерий в изучаемых образцах. Количество углеводородов больше в грунтах, содержащих сульфатредуцирующие бактерии и культивируемых в атмосфере Н2+СО2.
"1-i •t-n—I—I—I—Г-
HC12 HCl6 НС20 HC24
•--< ' i" i > i—r—i—1—;—1-
HC12 HC16 HC20 HC24
Рис.48 Спектры углеводородов образцов грунта Прикаспийской впадины:
1 - Дцвнопольская перспективная структура,
2 - Ащисайская перспективная структура,
а - опытный вариант - исходный образец в
атмосфере Н2+СО2; б - контрольный вариант - образец в отсутствии жизнеспособных микроорганизмов * (Н2+СО2)
Керны из нефтегазоносных районов Татарстана и Западной Сибири исследовали на содержание сульфатредуцирующих бактерий.
Предварительно исследуемые керны хорошо обжигали в пламени газовой горелки для того, чтобы избежать загрязнения их микрофлорой с поверхности. Затем керны раскалывали на отдельные куски в стерильных условиях и только внутренюю их часть размельчали до порошкообразного состояния, так же соблюдая стерильные условия. Результаты исследования приведены в таблице 38.
Таблица 38
Характеристика образцов кернов на присутствие сульфатредуцирующих бактерий
1 1 1 1 | Северо-Филиановская | 1 1
| площадь j 2230-2231 | 20-24 |
| (битуминозный сланец)\
1 2 \ Западная Сибирь | | Ем-Егов. (боженит) | 2344-2351 | 15-20 |
1 з | Западная Сибирь | 2344-2351 | 25-27 |
1 I (доломит) 1 1 1 ! 1
Как видно из таблицы, все исследуемые образцы независимо от структур содержат сульфатредуцирующие бактерии, однако, количество их невелико.
—I-1—i i i 4**f ч i1 i—r—i-
HC12 HCi6 HC20 HC24
L ' i " i 1—:—:—r"
HCl2 HCl6 HC20 HC24
Рис.49 Спектры углеводородов образцов кернов:
1 - Западная Сибирь (боженит)3
2 - Северо-Филиановская площадь (битуминозный
сланец),
а - опытный вариант - исходный образец в
атмосфере Hz+COz; б - контрольнш вариант - образец в отсутствии жизнеспособных микроорганизмов * (М2+СО2)
Газохроматографический метод анализа не выявляет процесс образования углеводородов в исследуемых образцах кернов несмотря на то, что сульфатредуцирующие бактерии (штамм БК),выделенный из битуминозного сланца в лабораторных условиях проявлял высокую активность к образованию углеводородов (7,8±0,2 мг/л) (рис.49). Это объясняется, по-видимому, отсутствием в кернах достаточного количества доступного для сульфатредуцирующих бактерий питательного субстрата.
Пластовые води Ромашкинского и Бавлинского месторождений нефти Татарстана имели рН 6,8-7,2 и содержали различное количество сульфатов (табл. 39).
Таблица 39
Характеристика образцов пластовых вод на содержание микроорганизмов
1 ! 1 1 1 Содер- I |Общее коли 1 Количество|
| Образцы пластовой | рН жание |чество мик СРВ на сре|
1 N 1 воды | IS042", i роорганиз- де Постгей|
1 1 1 1 | г/л 1 |мов, кл/л та В,кл/мл|
1 1 1 1 | Ромашкинское мест.| 1 1
| (Азнакаевская пл.)| 7,2 1 0,1 ! 315 7-9 !
1 2 j Ромашкин.месторож.| 1
| (Турнейский ярус) | 6,8 1 0,5 | 340 15-17 |
1 з | Бавлинское мест. | 1
| (Бобриков гориз.) | 7,0 1 0,4 I 325 12-14 |
1 i i 1 I \ i * i—i-
HC12 HCie HC20 HC24
1 ■ i1 iiv—1 1 i
HC12 HCie HC20 HC24
Рис. 50 Спектры углеводородов пластовой воды:
1 - спектры Бавлинского нефтяного месторождения,
2 - спектры Ромашкинского нефтяного месторождения, а - опытный вариант - исходный образец в атмосфере
б - контрольный вариант - образец в отсутствии жизнеспособных микроорганизмов + (Н2+СО2)
Как видно из приведенных в таблице данных, общее количество микроорганизмов в пластовых водах составляет 315-340 клеток в 1 мл. Сульфатредуцирующих бактерий - 7-17 клеток в 1 мл. Интересно отметить, что количество сульфатредуцирующих бактерий несколько больше в образцах, содержащих сульфаты.
Газохроматографический анализ пластовой воды не выявил заметного увеличения углеводородов в исследуемых образцах, что объясняется, по-видимому, небольшим количеством в них сульфатредуцирующих бактерий (рис. 50). Выделенный штамм сульфатредуцирующих бактерий из пластовой воды (БП) Ромашкинского месторождения синтезировал внеклеточные углеводороды при росте на среде Постгейта В в атмосфере Н2+С02 в концентрации 8,0+0,2 мг/л.
Необходимо отметить, что во всех исследованных нами природных объектах содержащих углеводороды определяются спектры аяканов от Сц до С24> характерные для деятельности сульфатредуцирующих бактерий.
Таким образом, проведенные исследования показали возможность использования газохроматографического метода для выявления количественных и качественных изменений в содержании углеводородов, в различных природных объектах.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Образование углеводородов, основанное на жизнедеятельности микроорганизмов, является одним из источников накопления энергетических ресурсов в природе.
Анализ литературы по анаэробной биоконверсии углеродсо-дежащих соединений показал, что, наряду с метаногенами, в процессе образования углеводородов могут участвовать сульфатредуцирующие бактерии. До последнего времени сульфатредуцирующие бактерии привлекали внимание исследователей главным образом, как продуценты сероводорода, вызывающего серьезные нарушения в природных экосистемах, а также коррозию промышленного оборудования. Ведется интенсивная разработка методов борьбы с возбудителями этого процесса. Другие стороны метаболизма сульфатредуцирующих бактерий, и, в частности, их способность синтезировать внеклеточные углеводороды, оставались до настоящего времени невыясненными.
Для решения данного вопроса была выбрана культура Desulfovibrio desulfuricans, так как эти бактерии наиболее широко распространены в природе и постоянно обнаруживаются в нефтяных месторождениях (Бирштехер,1957; Zobell, 1958; Розанова, Кузнецов, 1974; Hamilton, 1983; Postgate, 1984; Widdel, 1988; Розанова и др.,1993).
Изучая метаболизм D.desulfuricans при росте на лактате в атмосфере Нг+СОг» мы обнаружили, что эти бактерии синтезируют внеклеточные углеводороды. Синтезированные углеводороды представлены алканами Сц-С24 нормального и изостроения. Исследование способности сульфатредуцирующих бактерий продуцировать углеводороды показало, что синтез может проходить в
условиях гетеротрофного, литогетеротрофного (Desulfovibrio desulfuricans) и автотрофного роста (Desulfotomaculum orientis, Desulfotomaculum kuznetsovii). Большее количество углеводородов синтезируется сульфатредуцирующими бактериями в условиях гетеротрофного роста. Это объясняется более интенсивным ростом бактерий в присутствии органического вещества ( количество биомассы в данном варианте синтезируется в 1,5 раза больше, чем в других вариантах), а также вовлечением лактата в синтез углеводородов, поскольку количество синтезируемых углеводородов в расчете на мг белка в гетеротрофных условиях в 1,6-2,2 раза выше, чем при литогетеро-трофном росте и в сравнении с культурами, растущими в авто-трофных условиях.
Способность сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов поставила ряд вопросов, один из которых не являются ли обнаруживаемые углеводороды результатом разрушения клеток. Одним из доказательств, что внеклеточные углеводороды продуцируются бактериями, является образование этих соединеий в процессе роста Desulfovibrio desulfuricans. Другим - различия, обнаруживаемые при изучении спектров внутри- и внеклеточных углеводородов, синтезируемых данной культурой. Основная доля внутриклеточных углеводородов приходится на высокомолекулярную часть (нС25"Сз5 70-80% отн.), а внеклеточных - на более низкомолекулярную область (нСц-С24 80% отн.), что объясняется, по-видимому, более легкой проницаемостью их через клеточные мембраны. Изопреноиды и изомеры присутствуют в незначительном количестве. Коэффициент нечетности близок к 1.
Проверка других видов сульфатредуцирующих бактерий на
способность продуцировать углеводороды показала, что этой способностью обладают, по-видимому, многие виды, особенно относящиеся к группе А (по классификации Розановой и Назиной,1989), т.е.окисляющие органические субстраты в процессе роста до ацетата и СО2, которые, являясь конечными продуктами окисления лактата могут, при наличии Н2 в газовой фазе, вовлекаться в процесс синтеза углеводородов.
Спектры внеклеточных углеводородов различных видов сульфатредуцирующих бактерий имеют большое сходство. Незначительные отклонения в них у отдельных видов могут быть результатом несоответствия фаз роста и параметров окружающей среды с синтезом углеводородов, а также различной активностью ферментов, участвующих в данном процессе.
Интересные данные были получены нами при изучении влияния различных источников углерода и энергии (лактат, пируват, этанол), а также неорганических акцепторов электронов (сульфатов, нитратов, карбонатов) на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans. Показано, что если замена лактата на пируват или этанол незначительно влияет на эти процессы, то каждый из изученных акцепторов электронов обладает специфическим действием на них. Общим необходимым условием для образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями при росте на органическом субстрате является отсутствие конкурирующих с С02 акцепторов электронов.
Исследования показали, что при культивировании на синтетической среде, содержащей лактат кальция и миниральные соли, в состав которых входят сульфаты, в атмосфере аргона культура D.desulfuricans способна продуцировать внеклеточные углеводороды, но в следовых количествах, поскольку нет соответ-
ствующих для данного процесса условий и достаточного количества соединений, участвующих в этом метаболизме. Уменьшение концентрации сульфатов в питательной среде способствует синтезу углеводородов, количество которых возрастает до 6,0--8,0 мг/л. Указанные различия особенно хорошо видны в случае культивирования бактерий в атмосфере Нг+СОг, где уменьшение сульфатов ведет к увеличению синтеза углеводородов в 3 раза, количество которых составляет 15,0-19,0 мг/л для изучаемых штаммов.
Необходимо отметить, что введение Н2+СО2 в атмосферу роста сульфатредуцирующих бактерий способствует увеличению синтеза внеклеточных углеводородов, особенно более низкомолекулярных форм. Наиболее благоприятное для синтеза углеводородов соотношение Нг:С02 =9:1. Наличие в газовой фазе до 90% водорода по данным литературы должно было отрицательно влиять нарост Desulfovibrio desulfuricans (Bryant et. al., 1977), однако этого не происходит, поскольку присутствие СОг (10%) и небольших количеств (0,5 г/л) сульфатов снижает парциальное давление водорода за счет взаимодействия с ним, что отражено в результатах работы. по изучению влияния неорганических акцепторов электронов на рост и образование углеводородов D.desulfuricans.
Изучение изменений, происходящих в газовой фазе, в процессе роста культуры показало, что происходит потребление н*2 и СО2, которое коррелирует с увеличением биомассы и образованием углеводородов. Следовательно, кроме трансформации органических соединений в процессе образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями, важную роль играет углекислота и молекулярный водород.
Основываясь на данные литературы, можно было предположить, что у сульфатредуцирующих бактерий усвоение углекислого газа в присутствий свободного водорода идет через процесс восстановления С02 до формиата, который затем вовлекается в синтез углеводородов. Подтверждением сказанному является обнаружение формиата в качестве промежуточного продукта метаболизма лактата меченого по карбоксильной группе, а также NaH14COs. Показано, что 1% меченого углерода 14С-лактата и 377а. меченого углерода бикарбоната обнаруживается в формиате. Кроме того, сам 1^С-формиат активно включается в углеводороды в процессе роста D.desulfuricans. Дополнительное внесение формиата в питательную среду при росте культуры в гетеротрофных условиях роста способствует увеличению количества углеводородов, особенно в их низкомолекулярной области (Cii-Cie), что наблюдается и при введении в питательную среду газовой фазы (Н2+СО2). Следовательно между процессами трансформации формиата и газовой смеси (Нг+С02) в углеводороды имеется взаимосвязь.
Необходимо отметить, что в процессе роста и образования углеводородов сульфатрёдуцирующими бактериями в гетеротрофных условиях культивирования клеток, во внеклеточных продуктах метаболизма происходит значительное накопление кислородсодержащих соединений, основным из которых является ацетат, обнаруживаются этанол и на определенных этапах метаболизма - формиат и метанол.
Известно, что механизм синтеза углеводородов у микроорганизмов связан с восстановлением жирных кислот (Albro, Meechan, Ditttmer, 1970; дедюхина, Желифонова, Ерошин, 1980; Tornabene 1982), поэтому для установления этапов синтеза уг-
леводородов, прежде всего, было исследовано действие меченых органических кислот, являющихся субстратом для роста D.desulfuricans, либо продуктом их метаболизма.
В результате экспериментов с С14-лактатом нами было установлено, что лактат, присутствующий в питательной среде, используется клетками сульфатредуцирующих бактерий (Desulfovibrio desulfuricans), в основном, в энергетическом и конструктивном метаболизмах и лишь незначительная его часть расходуется на синтез углеводородов. В процессе образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями принимает участие меченый углерод лактата как карбоксильной, так и мети-льной групп.
Этапы окисления лактата сульфатредуцирующими бактериями хорошо изучены (Postdate, 1984):
СНЭСН(0Н)С00Н —2СН+]
СНзСОСООН -— 2СН+]
Т СН3СО-С0А
в биомассу 20-30% |
(Badziong, Thauer, 1981) CH3COG-P
j в биомассу клеток 10%
СН3СООН (Badziong; et.al., 1979)
Рассматривая путь перемещения меченого углерода метиль-ной группы лактата, можно сказать, что она должна была быть обнаружена в метильной группе ацетата, что и было подтверждено нами при исследовании продуктов метаболизма методом тонкослойной хроматографии.
Углерод меченый по карбоксильной группе оказывается в
СОг после декарбоксилирования пирувата. Далее 14С из углекислого газа, образованного при окислении лактата, меченого по карбоксильной группе, либо меченого' бикарбоната, вносимого в питательную среду, обнаруживается в углеводородах. Этот этап синтеза углеводородов вызвал наибольший интерес, поскольку, соответствует результатам активизации синтеза углеводородов в присутствии Н2+СО2 в газовой фазе при культивировании Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799.
Исследуемый нами механизм трансформации СОг в углеводороды тесно связан с работами, посвященными биоконверсии одно-углеродных соединений анаэробными бактериями. Среди работ, посвященных этому вопросу, нами была использована схема предложенная Датта и Зейкусом (Datta, Zeikus, 1982) для анаэробной биоконверсии одноуглеродных соединений растущими культурами метаногенов, ацетогенов и сульфидогенов в вещества с большим количеством атомов углерода в молекуле, созданную на основе работ по трансформации Ci-соединений у Bacterium mety-lotrophicum:
НООС - х С02
ОНС - х —СО
0Н2С - х
СНзОН"
нсоон со >
НэС - х СНзОН
СН3С0-СоА
бутират
ацетат
клеточный углерод
В ней конденсация С1-соединений в микроорганизмах, по мнению авторов, идет через активированные производные муравьиной кислоты.
Данная схема соответствует результатам, полученным нами в процессе экспериментов с помощью радиоивотопных веществ. Участие СОг в образовании формиата было отмечено выше. Среди промежуточных продуктов метаболизма лактата, меченого по первому углеродному атому, формиата и бикарбоната, были определены спирты (этанол и метанол), а также ацетат. Обнаружение меченого углерода из карбоксильной группы и СО2, перечисленных соединений, в ацетате, свидетельствует, что указанный выше путь может существовать у сульфатредуцирующих бактерий.
Следующим этапом синтеза углеводородов является превращение сульфатредуцирующими бактериями жирных кислот в углеводороды. Использование Н14С00Н и СН3СООН меченого по карбоксильной или метильной группам показало, что данные соединения интенсивно включаются в этот процесс. Наиболее активен в синтезе углеводородов формиат, поскольку 80% меченого углерода этого соединения уже в первые часы экспозиции с клетками определяется в углеводородах. Уксусная кислота более инертное соединение, чем формиат, но и она участвует в синтезе углеводородов, поскольку до 64-76% меченого углерода ацетата в течение времени взаимодействия с клетками обнаруживается в углеводородах.
Разнообразие получаемых соединений позволяет предположить, что синтез углеводородов связан с процессом конденсации промежуточных продуктов метаболизма клеток.
Учитывая схему предложенную выше, наиболее вероятно, что
в этом процессе участвует формальдегид. Не исключено и образование из уксусной кислоты под действием водорода - ацет-альдегида. Кроме того, синтез углеводородов сопровождается, по-видимому, реакциями декарбоксилирования, поскольку в составе углеводородов отмечалось преимущество 14С-ацетата метальной группы.
Образующиеся альдегиды далее могут вступать в процесс альдольной или кротоновой конденсации с наращиванием углеродной цепи.
Однако при кротоновой конденсации в состав получаемых углеводородов должны входить в значительном количестве ненасыщенные углеводороды, тогда как получаемые нами углеводороды - алканы, поэтому альдольная конденсация более вероятна. Этот процесс объясняет и наличие в спектрах углеводородов почти равных количеств синтезируемых четных и нечетных углеводородов, так как конденсация ацетальдегида будет приводить к синтезу четных углеводородов, а конденсация с формальдегидом как к четным, так и нечетным углеводородам.
Рассматриваемый процесс не исключает и возможности взаимодействия альдегида с другими соединениями и, в частности, с жирными кислотами, по механизму, предложенному Альбро и Дитмером (Albro, Dittmer, 1969). Согласно этой схемы жирные кислоты (лактат, пируват, образующаяся уксусная кислота) в виде производных взаимодействуют с формальдегидом, либо ацет-альдегидом с образоваванием спиртов, а затем углеводородов.
Все рассмотренные пути конденсации, могут быть использованы Desulfovibrio desulfuricans в процессе синтеза углеводородов.
Таким образом, синтез углеводородов сульфатредуцирующими
бактериями осуществляется путем образования жирных кислот, с последующим их восстановлением и конденсацией до углеводородов.
Синтез углеводородов сульфатредуцирующими бактериями (Dtm. orientis, Dtm.kuznetsovii) осуществляется и в условиях автотрофного роста, однако, механизм этого процесса детально нами не исследовался. Предполагается, что в процессе роста данных культур функционирует цепь образования формиата с последующим его превращением в углеводороды.
На основании полученных результатов можно представить общую схему образования углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799:
Н2 (газ)
СН3СН(0Н)С00Н
СН3СО-С0А
' 2СН+] НСО 0Н2С-х
СНзСОО-Р
СНзСООН
НзС-х —- СНзОН
СНз-СНО
СНзСООН
процесс конденсации
углеводороды
Проведенные нами исследования на культуре Desulfovibrio desulfuricans показали, что этот процесс весьма динамичный и определяется, в основном, соотношением продуцируемых бактериями жирных кислот и уровнем окислительно-восстановительного потенциала среды. Показано, что образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями происходит только в присутствии доноров водорода, обеспечивающих низкий редоке-потенциал среды (Eh (-290)-(-360) мВ), при котором возможно получение энергии за счет сопряжения процессов окисления высоковосста-новленных органических субстратов с восстановлением СОг, что определяет скорость всего процесса в целом. При Eh -100 мВ синтез углеводородов прекращается. Видимо поэтому среди продуктов метаболизма сульфатредуцирующих бактерий, культивируемых обычно при Eh (-100)-(-ИО)мВ, углеводороды не были ранее обнаружены.
Интересным представляется факт способности сульфатредуцирующих бактерий к вовлечению в процесс синтеза углеводородов кислот, не являющихся субстратом для жизнедеятельности клеток. Так введение в питательную среду олеиновой кислоты, которая не является субстратом для роста D.desulfuricans, вызывает заметное увеличение количества всего спектра углеводородов, особенно его высокомолекулярной области, синтезируемых бактериями, по-видимому, в результате процесса совосстановле-ния кислоты и ее конденсации.
Большинство органических кислот и, в частности, уксусная кислота трудно восстанавливающиеся соединения. Газообразный водород является веществом инертным. В связи с этим интересным представлялся вопрос о роли воды в процессе образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями, поскольку в
синтезе метана у метанобразующих бактерий он играет основную роль (Fuchs et.al., 1979;Варфоломеев, Калюжный, Медман,1988).
Проведенные нами исследования показали высокую скорость включения трития в углеводороды из тритиевой воды. Это свидетельствует о том, что генерация восстановителя из воды является необходимым процессом в синтезе углеводородов сульфатредуцирующими бактериями. Однако водорода воды для гидрогенизации органических кислот, образующихся в процессе роста культур, недостаточно и требуется дополнительное введение в реакционную среду активного водорода (Н+).
Синтезу углеводородов сульфатредуцирующими бактериями способствует и присутствие в питательной среде гидролизата казеина (1-5 г/л), повидимому как дополнительного источника аминокислот, а также фосфатов, активирующих метаболические процессы.
Процесс синтеза углеводородов сульфатредуцирующими бактериями возможен и в природных условиях, поскольку изучаемые нами микроорганизмы широко распространены в природе, и накопительные культуры, выделенные из образцов ила, грунта, кернов и пластовой воды, обладают способностью к указанному выше метаболизму. Кроме того, подтверждением этого предположения являются результаты модельных опытов с образцами, содержащими значительное количество сульфатредуцирующих бактерий и инкубированных в атмосфере Нг+СОг.
В нефтяных пластах благоприятные условия для синтеза углеводородов создают,по-видимому, сообщества микроорганизмов. Наличие значительного количества органических веществ, являющихся субстратами для роста сульфатредуцирующих бактерий и бактерий-спутников, анаэробные условия существования - все
это способстует возможности современного образования углеводородов в природе.
Синтез сульфатредуцирующими бактериями внеклеточных углеводородов, по-видимому, связан в основном со способностью клеток к формированию капсул на поверхности клеточной стенки, которые могут осуществлять различные функции, одной из которых является их защитная функция от высоких концентраций образующейся в процессе метаболизма клеток уксусной кислоты, (Stevenson et.al., 1962).
Таким образом, проведенные исследования позволяют шире осветить роль сульфатредуцирующих бактерий в круговороте углерода в природе, в частности, их участие в синтезе углеводородов и тем самым дополнить имеющиеся сведения по физиологии этих бактерий.
Возможно это не единственный путь в образовании углеводородов микроорганизмами, но для Desulfovibrio desulfuricans, он представляется наиболее вероятным.
Результаты исследований являются также основанием для разработки промышленного способа получения жидких углеводородов.
1. На 15 штаммах сульфатредуцирующих бактерии, принадлежащих к разным метаболическим типам, показана способность синтеза внеклеточных углеводородов, включающих широкий спектр соединений от Сц до С24-
2. Методами газожидкостной хроматографии и масс-спект-рометрического анализа установлено, что углеводороды, синтезируемые Desulfovibrio desulfuricans, представлены, в основном, алканами нормального строения. В отличие от внутриклеточных углеводородов, состоящих из высокомолекулярных соединений С25 " Сз5 70-80% отн., максимальное количество внеклеточных углеводородов содержит более низкомолекулярные вещества Сц - С24 80% отн.
3. Синтез углеводородов осуществляется сульфатредуцирую-щими бактериями в условиях гетеротрофного, литогетеротрофно-го и автотрофного роста.
4. С помощью меченых соединений ( 14СНэСН(0Н)С00Н, СН3СН(0Н)14С00Н, Н14СООН, 14СНэС00Н, СНз14СООН, NaH14C03, 3Т20, 3Т2) показано, что углерод этих соединений включается в углеводороды, а водород используется как газообразный, так и из воды.
5. На основании определения промежуточных продуктов метаболизма сульфатредуцирующих бактерий установлено, что синтез углеводородов этими бактериями осуществляется путем образования жирных кислот (формиата, ацетата) с последующим их восстановлением и конденсацией до углеводородов.
6. Условия, необходимые для синтеза углеводородов суль-
фатредуцирующими бактериями, включают:
• полноценную питательную ореду, обеспечивающую хороший рост бактерий и образование жирных кислот,
• низкий окислительно-восстановительный потенциал среды (Eh - (-290)-(-360) мВ),
• оптимальное значение рН среды (рН = 7,0),
• соответствующую штамму температуру роста.
7. Количество углеводородов, синтезируемых сульфатредуцирующими бактериями, зависит также от присутствия активирующих и ингибирующих факторов:
• наличия в газовой фазе Нг+СОг, обеспечивающих синтез углеводородов. Оптимальное соотношение На и СОг для синтеза углеводородов 9:1.
• присутствия в среде биологически активного водорода (Н+), фосфатов, органических форм азота в необходимых концентрациях,
• отсутствия конкурирующих с СОг акцепторов электронов (SO4, доэ).
8. В лабораторных экспериментах показана возможность применения газохроматического метода для определения интенсивности образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями в различных природных объектах.
9. Способность сульфатредуцирующих бактерии продуцировать внеклеточные углеводороды делает вполне реальным разработку микробиологического синтеза углеводородов в условиях производства.
Автор глубоко признателен академику РАН, профессору МГУ Е.Н.Кондратьевой за помощь, оказанную при выполнении работы.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Багаева, Татьяна Вадимовна, Казань
1. Алимова В.К. Синтез, метаболизм и роль углеводородов в живых системах / Тезисы докладов. Пущино,1977.- С.6.
2. Асатиани B.C. Ферментативные методы анализа.-М.: Наука, 1969.- 740 с.
3. Беляев С.С. Метанобразующие бактерии: биология, систематика, применение в биотехнологии // Успехи микробиол.-1988.- Т.22.- С.169-206.
4. Беляев С.С., Лейн А.Ю., Иванов М.В. Деструкция органического вещества при микробиологических процессах образования H2S и СН4 в современных осадках.- В сб.тез.: Органическое вещество в современных ископаемых осадках (седикахиты).М.:1979, С.45-46.
5. Беляев С.С., Лейн А.Ю., Иванов М.В. Роль метанобразую-щих и сульфатредуцирующих бактерий в процессах деструкции органического вещества // Геохимия 1981.- N3.- С.473-445.
6. Беляева М.И., Мухитова Ф.К., Золотухина Л.М., Кияшко С.В., Багаева Т.В., Карпилова И.Ю. Внеклеточные продукты метаболизма сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfovibrio // Микробиол.- 1992.- Т.61.- Вып.2.- С.194-200
7. Бинюков В.И., Коронелли Т.В., Красильников И.А., Иванов В.П., Островский Д.Н. Исследование методом парамагнитного зонда механизма взаимодействия с субстратом клеток углеводо-родокисляющих микобактерий //Докл. АН СССР.- 1972.-Т.203.-N2.- С.467-470.
8. Бирштехер Э. Нефтяная микробиология. Л.: Гос. науч. -техн. изд-во нефтяной и горно-топливной литературы, 1957.--314 с.
9. Бонч-Осмоловская Е.А. Последовательность образования газообразных продуктов при анаэробном разложении целлюлозы вприсутствии нескольких акцепторов электронов // Микробиол.- 1970.- Т.47.-Вып.6.- С.1112-1114.
10. Вайнштейн М.Б., Намсараева Б.Б., Самаркин В.А.,Лейн А.Ю. Иванов М.В. Геохимия диагенеза осадков Индийского океана.--М.: ИО АН СССР, 1985.- С.45-54.
11. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И. Влияние окислительно-восстановительного потенциала среды на образование сероводорода су ль (^восстанавливающими бактериями //Микробиол. -1987. Т. 56. -N1.-С.31-35.
12. Вайнштейн М.Б., Намсараев Б.Б., Самаркин В.А., Большаков A.M. Учет микрофлоры, образующей углеводородные газы // Прикл. биохимия и микробиол.- 1989.- Т.25.- N5.- С.707-714.
13. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В., Медман Д.Я. Химические основы биотехнологии получения топлив // Успехи химии.- 1988. -Т.57.- Вып.7.- С.1201-1231.
14. Вяхирев Д.А., Шушунова А.Ф. Руководство по газовой хроматографии.- М.: Высш.школа, 1987.-334 с.
15. Германов А.И., Борзенков И.А., Юсупова И. Ф. Биогенные процессы сульфатредукции и метанообразования в системе подземные воды породы // Сов. геолог. - 1981a.-N8.-С.116-121.
16. Германов А.И., Борзенков И.А., Юсупова И.Ф. Преобразование карбонатных пород на участках развития биогенных сульфат-редукции и метанообразования // Изв.АН СССР, сер.геол.-19816.- N5.- С.106-113.
17. Горина М.А., Яковлева В.И. Быстрый метод определения содержания белка в клетках микроорганизмов // Прикл. биохимия и микробиол. 1980. - Т.16. - N6.- С.936-939.
18. Горленко Н.И., Белоглазов С.М. Развитие накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий в зависимости от начальных значений рН среды // Гидробиол. ж.- 1989.- Т.25.- N2. -С.46-48.
19. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий.- М.: Мир, 1982.-310 с.
20. Давыдова М.Н., Тарасова Н.Б., Мухитова Ф.К., Золотухина Л.М., Карпилова И.Ю. Новые аспекты метаболизма СО у Desulfovibrio desulfuricans // Тез. конф. Автотрофные микроорганизмы. -М: Диалог-МГУ, 1996.- с.69.
21. Дедюхина Э.Г., Андреев Л.В., Попков Г.П., Ерошин В.К. Биосинтез углеводородов алканокисляющими микроорганизмами // Микробиол.- 1972.- Т.41.- С.664-667.
22. Дедюхина Э.Г., Ерошин В.К. Биосинтез углеводородов микроорганизмами // Успехи современной биологии 1973.- N76.--С.351-362.
23. Дедюхина Э.Г., Желифонова В.П., Ерошин В.К. Углеводороды микроорганизмов // Успехи микробиол.-1980.-Т.15.-С.86-99.
24. Донец А.Т., Котелев В.В., Бехтерева М.Н. Качественный состав и количественное содержание липидов у микобактерий // Микробиол.- 1970.- T.39.-N2.- С.300-304.
25. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии.- М.: МГУ, 1983.- 213 с.
26. Егоров A.M., Авилова Т.В., Петухова М.И.} Биокаталитическое получение водорода из муравьиной кислоты // Прикл.биохимия и микробиология. -1990. V.26.-N2.-с.147-156.
27. Ерошин В.К., Дедюхина Э.Г. Углеводороды, синтезируемые микроорганизмами. В кн: Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей.- М.: Наука, 1972.- С.71-74.
28. Желифонова В.П., Ильина В.И., Дедюхина Э.Г., Ерошин В.К. Состав липидов и углеводородов у Candida tropicalis при росте на средах с органическими кислотами // Микробиол.- 1974.-Т.43.- Вып.6.- С.804-808.
29. Желифонова В.П., Гимадеева С.И., Дедюхина Э.Г., Ерошин В.К. Изменение состава внутриклеточных липидов и углеводородов Candida tropicalis при отсутствии роста // Микробиол. -1975.-Т.44.- Вып.6.- С. 1041-1045.
30. Заварзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы.- М.: Наука, 1972.- 323 с.
31. Заварзин Г.А., Бонч-Осмоловская Е.А. Синтрофные взаимодействия в сообществах микроорганизмов // Изв. АН СССР. Сер. Биол. -1981.-N2.-С.165-173.
32. Золотухина Л.М. Взаимодействие сульфатредуцирующих и водородных бактерий в искусственной ассоциации.- Дис.на соискание уч.степени канд.биол.наук, Казань, 1985.- 147 с.
33. Иванов М.В., Беляев С.С., Лауринавичус К.Г. и др. Микробиологическое образование сероводорода и метана в современном и четвертичном отложениях Каспийского моря // Геохим. -1980. -N3.- С.416-422.
34. Иванов М.В., Намсараев Б.Б.,Нестеров А.И., Карначук О.В. Борзенков И.А., Большаков A.M. Участие микроорганизмов в разрушении органического вещества в прибрежных донных осадках Японского моря // Микробиология. -1990. -Т.59.-N2.-С.321-329.
35. Ивановская И.Б., Цинберг М.Б., Беляев С.С. Применение газохроматографического метода для определения интенсивности бактериального метанообразования // Микробиол.- 1991.- Т.60.-Вып.2.- С.383-386.
36. Каравайко Г.И., Ляликова Н.И., Пивоварова Т.А. Микроорганизмы рудных месторождений, их физиологическая и геохимическая деятельность.-В сб: Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов.- Пущино, 1976.- С.25-57.
37. Карпилова И.Ю. Вопр.физиол. и биохимии сульфатредуцирующих бактерий, Казань, 1987.- С.7-14.
38. Кондратьева Е.Н., Гоготов И.Н., Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов.- М.: Наука, 1981.- 342 с.
39. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов.- М.; МГУ, 1984." 158 с.
40. Красильников Н.А., Степанова Л.Н., Коронелли Т.В., Дуда В.И. О новом виде парафинокисляющих микобактерий // Микробиол.- 1971.- Т.40.- Вып.6.- С.1040-1045.
41. Красильников Н.А., Коронелли Т.В., Дуда В.И. Поверхностные структуры клеток парафинокисляющей микобактерии Mycobacterium paraffinicum // Микробиол. 1972. - Т.41.- Вып.2.--С.313-317.
42. Кузнецов С.И. Развитие идей С.Н.Виноградского в области экологической микробиологии.- М.: Наука, 1974.- 63 с,
43. Кузнецов С.И., Саралов А.И., Назина Т.Н. Микробиологические процессы круговорота углерода и азота в озерах.- М.: Наука, 1985.- 213 с.
44. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов.- М.: Наука, 1989.-288 с.
45. Лапидус А.Л., Мухитова Ф.К., КияшкоС.В., Гробовен-ко С.Л., Беляева М.И. Ферментативный синтез углеводородов и кислородсодержащих соединений из СО и Нг //Докл. АН СССР-1988 -Т.300.-N2.-С.368-371.
46. Лейн А.Ю., Вайнштейн М.Б., Кашпарова Е.Р., Матросов А.Г., Намсараев Б.Б., Бондарь В.А., Шишкина О.В. Биогеохимия анаэробного диагенеза и материально-изотопный баланс серы и углерода в осадках Балтийского моря. М.: Наука, 1986 -с.155-176
47. Логинова Л.Г. Анаэробные термофильные бактерии. -М.: Наука, 1982.- 100 с.
48. Лурье Ю.Ю., Рыбников А.И. Химический анализ производственных сточных вод.- М.: Химия, 1966.- С.72-75.
49. Максимова Г.И., Воробьева Г.И. Распространение углеводородов в живой природе // Микробиол.промышленность.- 1971. -N11.-С.1-4.
50. Мейнелл Д., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология /Теория и практика/.- М.: Мир, 1967.- 347 с.
51. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Канчавели Л.П., Розанова Е.П. Новая спорообразующая термофильная метилотрофная сульфатвос-станавливающая бактерия Desulfotomaculum kuznetsovii sp.nov. // Микробиол.-1988.-Т.57.-Вып.5.- С.823-828.
52. Назина Т.П., Розанова Е.П., Беляев С.С., Иванов М.В. Химические и микробиологические методы исследования пластовых жидкостей и кернов нефтяных месторождений, Пущино, 1988.-24с.
53. Панцхава Е.С. Получение газообразного и жидкого топлива. В кн. Промышленная микробиология.- М.: Высшая школа, 1989.-С.617-634.
54. Панцхава Е.С., Зиновьева М.Е., Юхневич М.Г. Локализация коферментов метаногенеза в клеточных структурах Methano-sarcina barkeri штамм MS. Фотосенсибилизирующие свойства ко-фермента F420 //Архебактерии, Пущино, 1988.-с.95-104.
55. Петров А.А. Углеводороды нефти.- М.: Наука, 1984.-263 с.
56. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии.-М.: МГУ, 1978.- 263 с.
57. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий (рН и гНг) в жизнедеятельности микроорганизмов. М.: Изд-во АН СССР, 1957.- 275 с.
58. Работнова И.Л. Промышленная микробиология.-М.:Высшая школа, 1989.- С.113-139.
59. Родионов Ю.В. Метаболизм формиата у микроорганизмов // Успехи микробиол.- 1981.- Т.16.- С.104-139.
60. Розанова Е.П. Методы культивирования и идентификации анаэробных бактерий, восстанавливающих серу и ее окисленные соединения.-В кн:Теоретические и методические основы изучения анаэробных микроорганизмов.- Пущино, 1978.-С.123-136.
61. Розанова Е.П., Кузнецов С.И. Микрофлора нефтяных место-рождений.- М.: Наука, 1974.- 196 с.
62. Розанова Е.П., Галушко А.С. Образование формиата Methy-losinus trichosporium и использование его Desulfovibrio desulfuricans // Микробиол.- 1987.- Т.56.- Вып.5.- С.886-887.
63. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Сульфатвосстанавливающие бактерии (систематика и метаболизм) // Успехи микробиол.-1989.- Т.23.- С. 191-226.
64. Розанова Е.П., Борзенков И.А., Беляев С.С., Иванов М.В. Метаболизм низших спиртов, ацетата и бикарбоната в заводняемых нефтяных пластах // Микробиол.-1993.-Т.62.-Вып.3.-С.574--582.
65. Романенко В.И., Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресноводных водоемов.- Л.г Наука, 1974.- 193 с.
66. Сорокин Ю.И. Источники энергии и углерода для биосинтеза у сульфатредуцирующих бактерий // Микробиол.-1966а.-Т.35. -N5. С.761-766.
67. Сорокин Ю.И. О роли СОг и ацетата в биосинтезе у сульфатредуцирующих бактерий // Докл. АН СССР, сер.биол.,19666.- Т.168.- N1.- С.199-201.
68. Сунрун Е.А., Руденко Е.К., Улановский И.Б. Исследования зависимости электрокинетических свойств некоторых бактерий влияющих на коррозию металлов, от рН среды.- В кн: Методы определения биостойкости материалов.-М.: Наука, 1979.-С.46-54.
69. Тарасова Н.Б., Мухитова Ф.К., Рязанцева И. Н., Беляева М.И. С0-дегидрогеназная активность экстрактов клеток Desulfovibrio desulfuricans // Биохимия. 1985. - Т.50.-ВЫП.З.-С.454-458.
70. Тиссо Б., Вильте Д. Образование и распространение нефти. -М.: Мир, 1981.- 501 с.
71. Чан Динь Тоай, Хлудова М.С., Панцхава Е.С. Биогенез метана // Итоги науки и техники. Сер.Биотехнол.- М.:-1983.- С.5-54.
72. Чеботарев Е.Н., Вербина И.М. Биохимия сульфатвосстанав-ливающих бактерий // Итоги науки и техники, Сер. Микробиол.--1978.- Т.7.- С.5-49.
73. Чернова Т.Г., Сафарова С.А. Алканы в пыльце и спорах различных растений // Химия природных соединений. -1989. -N1.-С.135-136.
74. Шлегель Г.Г. Общая микробиология.- М.: Мир, 1987.-566 с.
75. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях.- М.: Мир, 1965.- 508 с.
76. Abdollahi Н., Wimpenny J.W.T. Effects of oxigen on the growth of Desulfovibrio desulfuricans // J.Gen.Microbiol.- 1990.- V.136.- N6.-P.1025-1030.
77. Adams M.W.W., Mortenson L.E., Chen I.S. Hydrogenase // Biochim. et biophys. acta.-1980.-V.594. -N2-3. -P.105-176.
78. Aeckeresbery F., Bak F., Widdel F. Anaerobic oxidation of saturated hydrocarbons to СОг by a new type of sulfate-reducing bacterium //Arch.Microbiol.-1991.-V.156.-P.5-14.
79. Aeckeresbery F., Rueter P., Rabus R., Widdel F. Hydrocarbon degradation by anaerobic bacteria / Beyerinck Centen. Microbial Physiol. 6en. Regul. : Enver. Pr. and Appl. Haque, Netherland, 1995.- P.70-71.
80. Albro P.W., Dittmer J.C. The biochemistry long-chain, nonisoprenoid hydrocarbons.1. Characterization of the hydrocarbons of Sarcina lutea and the isolation of possible intermediates of biosynthesis//Biocheniistry.-1969.-V.8.-P.394-404.
81. Albro P.W., Dittmer J.G. Bacterial hydrocarbons: occurrence, structure and metabolism // Lipids. 1970. - V.5.- P.320-325.
82. Albro P.W., Meehan T.D., Dittmer J.C. Intermediate steps in the incorporation of fatly acids into long-chain, nonisoprenoid hydrocarbons by lysates of Sarcina lutea //Biochemistry. -1970.- Y.9.- P. 1893-1898.
83. Andreesen J.R.Ljungdahl L.G. Nicotinamide adenine Di-nucleotide Phosphate dependent formate dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum: purification and properties //J. Bacteriol.-1974.-V.120.-Nl.-P.6-14.
84. Asselineau J. The bacterial lipids.-Holden Day Inc.USA,1966.-402 p.
85. Badziong W.,Thauer R.K. Growth yields and growth rate of Desulfovibrio vulgaris (Marburg) growing on hydrogen plus sulfate and hydrogen plus thiosulfate as the sole energy sources //Arch.Microbiol.- 1978.-V.117.-TN2.-P.209-214.
86. Badziong W., Thauer R.K., Zeikus I.G. Isolation and characterization of Desulfovibrio growing on hydrogen plus sulfate as the sole energy sources // Arch.Microbiol.-1978. -V.116.-Nl.-P.41-47.
87. Badziong W., Ditter В., Thauer R.K. Acetate and carbon dioxide assimilation by Desulfovibrio vulgaris (Marburg) growing on hydrogen and sulfate as sole energy sources //Arch.Microbiol.- 1979.-V.123,-N3.-P.301-305.
88. Badziong W., Thauer R.K. Vectorial electron transport in Desulfovibrio vulgaris (Marburg) growing on hydrogen plus sulfate as sole energy sources // Arch. Microbiol. --1980.-V.125, N 1. P. 167-174.
89. Bailliez C.,Largeau C., Casadevall E. Growth and hydrocarbon production of Botryococcus braunii immobilized in calcium alginate gel // Appl.Microbiol.Biotechnol.- 1985.- V.23.- P.93-95.
90. Bailliez C., Largeau C., Casadevall E., Yang L.W., Ber-kaloff C. Photosynthesis, growth and hydrocarbon production of Botryococcus braunii // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1988.- V.29.- P.141-147.
91. Bak F.The fermentation of inorganic sulfur compounds by sulfate reducing bacteria / 6th Int. Symp. Microb. Ecol. (ISME-G), Barcelona, 1992.- P.28.
92. Bak F., Widdel F. Anaerobic degradation of indolic compounds by sulfate-reducing enrichment cultures, and descrip-tion of Desulfobacterium indolicum gen. nov., sp.nov.// Arch. Microbiol.- 1986a.- V.146.-P.170-176.
93. Bak F., Widdel F. Anaerobic degradation of phenol derivatives by Desulfobacterium phenolicum sp. nov. // Arch. Microbiol.- 1986b.- V.146.- P.177-180.
94. Banik S., Ninawe A. Diazotrophic activity and ferric-phosphate mineralizing ability in estuarine sulfate reducing bacteria // Indian. J.Sci.- 1989.-V.18.- N4.-P.238-241.
95. Barker F.D., Papiska H.R., Campbell L.L. Cholin fermentation by Desulfovibrio desulfuricans // J. Bacteriol.-1962. -V.84.-N5.-P.973-978.
96. Barton L.L., LeGall J., Peck H.D.J. Phosphorylation coupled to oxidation of hydrogen with fumarate in extracts of the sulfate reducing bacterium Desulfovibrio gigas //BioChem. Biophys.Res.Commun.-1970.-V.41.-P.1036-1042.
97. Barton L.L., Bryant R.D.,Laishley E.J. Hydrogenase as a multifunctional metal-ion reductase / Beyerinck Centen. Microbial Physiol. Gen. Regul. : Enver. Pr. and Appl. Haque,Nether-land, 1995.- P.201-201.
98. Bell G.R., LeGall I., Peck H.D.I. Evidence for the periplasm! с localization of hydrogenase in Desulfovibrio gigasJ. Bacterid.- 1974.-V. 120.-N2.- P.994-997.
99. Bhatnagar L.,Jain M.K.,Zeikus J.G. Metanogenic bacteria // Var.Autotroph.Life, London, 1991.- P.251-270.'
100. Biebl H.,Pfennig N. Growth of sulfate reducing bacteria with sulfur as an electron acceptor // Arch. Microbiol.-1977. V.112.- P.115-117.
101. Bird C.W., Lynch J.M. Formation of hydrocarbons by mioroorganisms // Chem.Soc.Rev.- 1974.- V.3.- N3.- P.309-328.
102. Brandis A.,Thauer R.K. Growth of Desulfovibrio species on hydrogen and sulfate as sole energy source // J.Gen.Microbiol.- 1981.-Y.126.- N1.-P.249-252.
103. Braun M., Stolp H. Degradation of methanol by sulfate reducing bacterium //Arch.Microbiol.-1985.-V.142.-P.77-80.
104. Brill J.H.,Bertsch W. Comparison of cuticular hydrocarbon profiles of fire ants Solenopsis richteri from the same colony, using capillary column gas chromatography with pattern recognition //J.Chromatogr.-1990.-V.517.-P.95-101.
105. Brown C.M., MacDonald-Brown D.S.,Stanley S.O. Inorganic nitrogen metabolism in marine bacteriua: nitrogen assimilation in some marine pseudomonads //J.Mar.Biol.Assoc.U.K.-1972.-V.52.- P.793-804.
106. Brown D.E., Groves G.R.,Miller J.D.A. pH and Eh control of sulfate-reducing bacteria //J. Appl. Chem. and Biotechnol. -1973.-V.23.-N2.-P.141-149.
107. Brown W.V., Sparadbery J.P., Lacey M.J. Changes in the cuticular hydrocarbon composition during development of the social wasp, Vespula germanica (F.) (Hymenoptera : Vespidae) //Compar. Biochem. and Physiol.B.-1991.-V.99.-N3.-P.553-562.
108. Bruschi M.The primary structure of the tetrahaem cyto-chrom C3 from Desulfovibrio desulfuricans (strain Norway). Description of a new class of low potential cytochrome СBiochim. Biophys. Acta. 1981.- V.671.- N2.- P.219-226.
109. Bryant M.P., Campbell L.L., Reddy C.A., Crabill M.R., Growth of Desulfovibrio in lactate or ethanol media low in sulfate in association with H2 utilizing methanogenic bacteria // Appl. and Environ. Microbiol. - 1977. - V.53.--P.1162-1169.
110. Brysch K.,Schneider C.,Fuchs G., Widdel F. Lithoauto-trophic growth of sulfate-reducing bacteria, and description of Desulfobacterium autotrophicum gen.nov.,sp.nov. //Arch. Microbiol. -1987.-V.148.-N4.-P.264-274.
111. Campbell L.L.,Postgate J.R. Classification of the spore forming sulfate-reducing bacteria // Bacterid. Reviews.- 1965.- V.29.- P.359-363.
112. Cataldo D.A.,Hatoon M.,Schauder I.E., Younger V.I. Ra-pus colorimetric determination of nitrate plant by nitration of salicylic acid //Commun. Soil. Sci. Plant Anal.-1975.-V.6.- P.21-80.
113. Cord-Ruwisch R.,Garcia J.L. Isolation and characterization of an anaerobic benzoatedegrading spore forming sulfate-reducing bacterium, Desulfotomaculum sapomandens sp.nov.FEMS Microbiol. Lett.- 1985.- V.29.- P.325-330.
114. Cord-Ruwisch R., Ollivier В.,Garcia J.L. Fructose degradation by Desulfovibrio sp. in pure culture and in cocultu-re with Methanospirillium hungatei //Curr.Microbiol. 1986.V.13.- N5.- P.285-289.
115. Cypionka H. Uptake of sulfate, sulfite and thiosulfate by proton-anion simport in Desulfovibrio desulfuricans //Arch. Microbiol.-1987.- V.148.-P.144-149.
116. Cypionka H. Characterisation of sulfate transport in Desulfovibrio desulfuricans // Arch. Microbiol.- 1989.-V.152. -P.237-243.
117. Cypionka H., Dilling W. Energy metabolism of Desulfovibrio strain // FEMS Microbiol.Lett.-1986.-V.36.-P.257-260.
118. Cypionka H.,Pfennig N. Growth yields of Desulfotomaculum orientis with hydrogen in chemostat culture // Arch. Microbiol.- 1986.-V.143.- N4.- P.396-399.
119. Datta R., Zeikus J.G. Anaerobic bioconversion of one-carbon compounds // Dev. Ind. Microbiol.- V.24: Proc. 39th Gen. Meet. Soc.Int.Microbiol., Arlington, 1983.- Va.-Ch.10 --P.131-140.
120. Davis J.B. Paraffinic hydrocarbons in the sulfate-redu-cing bacterium Desulfovibrio desulfuricans // Chem.Geol.-1968. -V.3.-P.155-160.
121. Devereux R., HeS-H., Doyle C.L., Orkland S., Stahl D.A., LeGall J., Whitman W.B. Diversity and origin of Desulfovibrio species: Phylogenetic definition of a family // J. Bacterid.- 1990.- V.172.- N7.- P.3609-3619.
122. Diekert G. C02 reduction to acetate in anaerobic bacteria //FEMS Microbiol.Rev.-1990.-V.87.-N3-4.-P.391-395.
123. Diekert G., Wohlfarth G. Kohlenmonoxid in Stoffwechsel strikt anaerober Bakterien // Bioengineering.- 1994.-V.10.-N. 1.- P.25-32.
124. Dilling W.,Cypionka H. Aerobic respiration in sulfatereducing bacteria // FEMS Microbiol.Lett.- 1990.- V.71.-N1-2. -P.123-127.
125. Domka F.Schulazinski M.The effect of organic substrate concentration on activity for microbiological reduction of sulfate //Acta.Microbiol.Pol.-1979.-V.28.- N3-4.-P.237-244.
126. Domka F.,Szulozynski M.Studies on sulfite reduction by Desulfovibrio vulgaris // Acta. Microbiol.pol.-1981.- V.30.-- N3.- P.247-253.
127. Fabre-Joneau M.,Baraud J.,Cassagne C, Nature et repartition des hydrocarbures chez la levuze Candida utilis //C.r. Acad.Sc i.-1969.-V.D268.-N18.-P.2282-2285.
128. Fatma T. Micro-algallipids // Everyman's Sci.- 1989.--V.24.- N5.- P.159-163.
129. Fauque G.,LeGall J.,Barton L.L. Oxidative phosphorylation linked to the dissimilatiry reduction of elemental sulfur by Desulfovibrio.- In: Sulfur in Biol., Ciba Found. Symp.72, Excerpta Medica, Amsterdam, 1979.- P.71-79.
130. Faugue G., LeGall J., Barton L.L. Sulfate-reducing and sulfur-reducing bacteria .- In: Var. Autotrophic Life.- Acad.Press, 1991.-P.271-337.
131. Ferry J.G. Formate dehydrogenase //FEMS Microbiol.Lett. -1990.-V.87.- N3-4.-P.377-382.
132. Ferry J.G. Methane from acetate // J.Bacteriol.-1992.--V.174.- N17.- P. S489-S495.
133. Folkerts M., Ney U., Kneifel H., Stackebradt E., Witte E.G., Forstel H., Schoberth S.M., Sahm H. Desulfovibrio furfuralis sp.nov., a furfuran degrading strictly anaerobic bacterium // System. Appl. Microbiol.- 1989.- V.11.-P.161-169.
134. Forrest W.W., Walker D.J. Control of glycolysis in washed suspensions of Streptococcus faecalis // Nature. -1965.- V.207.- N4992.- P.46-48.
135. Fuchs G., Stupperich E. Energy metabolism of Methano-genic bacteria //Arch.Microbiol.- 1979.-V.120.- P.135-140.
136. Fuchs G., Stupperich E. СОг fixation pathways in bacteria //Physiol.Veg.-1983.-V.21.-N5.-P.845-854.
137. Fuchs G. Alternatives to the Calvin-cycle and the Krebs-cycle in anaerobic bacteria: pathways with carbonylati-on chemistry //Biol.Chem.-1990.-V.371.- P.173.
138. Fukuda H., Fujii Т., Ogava T. Microbial production of C2 hydrocarbons, ethane, ethylene and acetylene // Agr.and Biol. Chem.-1984a.-V.48.-N5.-P.1363-1365.
139. Fukuda H., Fujii T.} Ogawa T. Microbial production of C3 and C4- hydrocarbons under aerobic conditions // Agr.and Biol. Chem.-1984b.-V.48.- N6.-P.1679-1682.
140. Fukuda H. Microbial production of gaseous insaturated hydrocarbon and its metabolism ethylene, propylene - and buteneforming enzymes and their reactions // Karaky To сзйбу-цу.-1990.-V.28.-N8.-P.506-514.
141. Gebhart N.A., binder D., Thauer R.K. Anaerobic acetate oxidation to CO2 by Desulfobacter postgatei. 2.Evidence from 14C- labelling studies for the operation of the citric acid cycle // Arch. Micribiol.- 1983.-V.136.- P.230-233.
142. Gibson G.R. Physiology and ecology of the sulfate-reducing bacteria // J. Appl. Bacterid. -1990.-V. 69.-N6.-P. 769--797.
143. Ginkel C.G.V., Weyers C.A.G.M., Nachtegael H., Bont J.A.M. de. Continuous production of chiral epoxyalkanes from alkenes by growing micro-organisms / Proc. 4th Eur.Congr.Biotechnol.- Amsterdam, 1987.-V.2.-P.269-272.
144. Glick B.R., Martin W.G., Martin S.M. Purification and properties of the periplasmic hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans // Can.J.Microbiol.- 1980.- V.26.- N10.-P.1214--1223.
145. Goodloe R., Smith L., Robley J. Structure and composition of hydrocarbons and fatty acids from a marine blue-green alga, Synechococcus sp. // Biochim. Biophys. Acta.- 1982.- V.710.- N3.- P.485-492.
146. Gottschalk G. Bacterial metabolism.- 2nd ed.N.Y.: B.Heidelberg Tokyo, 1986.- P.260-264.
147. Grossman I.P., Postgate J.R. Cultivation of sulfate-reducing bacteris // Nature (Long).- 1953. V.171. - P.600--605.
148. Gudin C., Thepenier C. Bioconversion of solar energy into organic chemical by microalga // Adv. Biotechnol.Processes.-1986.- V.6.- P.73-100.
149. Gulz P.G., Muler E., Herrmann T. Epiculticular leaf waxes of the hop (Humulus lupulus). Chemical composition andsurface structures // Z.Naturforsch C.-1993.-V.48.-N9-10.-P. 689-696.
150. Guo L., Blomquist G.J. Identification, accumulation, and biosynthesis of the cuticular hydrocarbons of the southern armyworm, Spodoptera eridania (Gramer) (Lepidoptera : Noctuidae) // Arch. Insect. Biochem. and Physiol. 1991. -- V.16.- N1. - P.19-30.
151. Hamilton W.A. Sulfate-reducing bacteria and the offshore oil industry //Treds Biotechnol.-1983.-V.1.-N2.-P.36-40.
152. Han J., Calvin M. Hydrocarbon distribution of algae and bacteria, and microbiological activity in sediments // Proc. Nat. Acad.Sciences.-1969.-V,64.-P.436-443.
153. Han J., Chan H.W.S., Calvin M. Biosynthesis of alka-nes in Nostoc muscorum //J.Amer.Chem.Soc.-1969.-V.91.-P.5156--5159.
154. Hansen T.A. Physiology of sulfate-reducing bacteria // Microbiol. Sci.-1988.-V.5.-N3.-P.81-84.
155. Hatchikian E.C., Chaigheau M., LeGall J. Analysis of gas production by growing cultures of three species of sulfa-tereducing bacteria / Symp.on Microbial Production and Utiliz. of Gases (Нг, CH4, CO).- Gottingen, 1976.-P.109-118.
156. Hatchikian E.C., Bruschi M., LeGall J. Characterization of the periplasmic hydrogenase from Desulfovibrio gigas // Biochem. and Biophys. Res.Communs.- 1978.-V.82.-N2.-P.451--461.
157. Hatchikian E.C., Forget N., Fernandez V.M., Williams R., Cammack R. Further characterization of the CFeDehydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757 // Eur.J. Biochem. -1992.- V.209.- N1.- P.357-365.
158. Hayward H.R., Stadtman Т.О. Anaerobic degradation of choline // J. Biol. Chem.- I960.-V.235.- P.538-543.
159. Herrera L.L., Hernandez J., Ruiz P., Gantenbein S. Desulfovibrio desulfuricans growth kinetics // Envir.Toxicol, and Water Quality -1991.- V.6.-P.225-237.
160. Huisman C.W., Leeuw 0., Eggink G., Witholt B. Syntesis of poly-3hydroxyalkanoates is a common feature of fluorescent pseudomonads//Appl.Environ.Microbiol.-1989.-V.55.-P.1949-1945.
161. Imhoff-Stuckle D., Pfennig N. Isolation and characterization of a nicotinic acid degrading sulfate-reducing bacterium, Desulfococcus niacini sp.nov.//Arch. Microbiol.-1983. -V.136.- P.194-198.
162. Jankowski G.J., ZoBell C.E. Hydrocarbon production by sulfatereducing bacteria //J.Bacteriol.-1944.-V.47.-P.447-452.
163. Jansen K., Thauer R.K., Widdel F., Fuchs G. Carbon assimilation pathway in sulfate reducing bacteria. Formate, carbon dioxide, carbon monoxide, and acetate assimilation by Desulfovibrio baarsii // Arch. Microbiol.-1984.-V.138.-N3.-P. 257-262.
164. Jansen K., Fuch G., Thauer R.K. Autotrophic С02 fixation by Desulfovibrio baarsii: demonstration of enzyme activities characteristic for the acetyl CoA pathway // FEMS Microbiol. Lett.-1985.-V.28.-N3.-P.311-315.
165. JettenM.S., StamsA.J.M., Zehnder A.J.B. Methanoge-nesis from acetate: a comparison of the acetate metabolism in Methanothrix soehngenii and Methanosarcina spp. // FEMS Microbiol.Rev.-1992.-V.88.-N3-4.- P.181-198.
166. Joneau M.F., Baraud J., Cassagne C. Nature et reparation des hydrocarbures chez la levure Candida utilis //С.R.Acad.Sc.- 1969.- V.268.- P.2282-2285.
167. Jones J.G. Studies on lipids of soil microorganisms with particular reference to hydrocarbons // J.Gen.Microbiol. -1969.-V.59.-P.145-152.
168. Jorgensen B.B. The sulfur cycle of a coastal marine sediment (Limfjorden, Denmark)// Limnol. 0ceanogr.-1977.-V.22.- P.814-831.
169. Jorgensen B.B. Mineralization of organic matter in the sea bed- the role of sulphate reduction // Nature.-1982.--V.296.- P.643-645.
170. Joubert W.A., Britz T.J. Isolation of saccharolytic dissimilatory sulfate-reducing bacteria //FEMS Microbiol.Lett. -1987.-V.48.-Nl-2.-P.35-40.
171. Keith S.M.,Herbert R.A. Dissimilatory nitrate reducing by a strain of Desulfovibrio desulfuricans //FEMS Microbiol. Lett. -1983.-V.18.-N12.-P.55-59.
172. Klemps R., Cypionka H., Widdel F., Pfennig N. Growth with hydrogen and further physiological characteristics of Desulfotomaculum species // Arch.Microbiol.- 1985.-V.143.-N2. -P.203-208.
173. Kloos W.E.,Tornabene T.G., Schleiffer K.H. Isolation and characterization of micrococci from human skin, including two new species: Micrococcus lylae and Micrococcus kristinae //Inter.J.Systematic Bacterid.-1974.-V.24.-P.79-101.
174. Knorr M., Schenk D. Zun Frage der Synthese polyzykisc-her Aromate durch bakterien //Arch.Hyd.und Bakteriol.-1968.- V.152.-N3.-P.282-285.
175. Kolattukudy P.E. Chemistry and biochemistry of natural waxes, Amsterdam, Elsevier, 1976.- 419 p.
176. Kremer D.R., Nienhuis-Kuiper H.E., Hansen T. A. Ethanol dissimilation of Desulfovibrio // Arch. Microbiol.- 1988.- V.150.- P.552-557.
177. Kremer D.R., Nienhuis-Kuiper H.E., TimmerC.J., Hansen T.A. Catabolism of malate and related dicarboxylic acid in various Desulfovibrio strains and the involvement of an oxygen-labile NADPH dehydrogenase // Arch. Microbiol.- 1989.- V.151.- P.34-39.
178. Kunow J., Schworer В., Stetter K.O., Thauer R.K. F420-dependent NADP reductase in the extremely thermophilic sulfate reducing Archaeoglobus fulgidus // Arch. Microbiol.-1993. -V.160.- N3.-P.199-205.
179. Laanbroek H.L., Abee Т., Vooga I.L. Alcohol conversions by Desulfobulbus propionicus Lindhorst in the presence and absence of sulfate and hydrogen // Arch. Microbiol.-1982.- V.133.- P.178-184.
180. Laanbroek H.L., Geerligs H.I.Influence of clay particles (ilite) on substrate utilisation by sulfate-reducing bacteria // Arch.Microbiol.-1983.-V.134.-N2.-P.161-163.
181. Langworthy T.A., Tornabene T.G., Holzer G. Lipids of archaebacteria // Zbl. Bakteriol.- 1982.- V.1C.- N3.- N2.- P.228-244.
182. Lapidus A.L., Grobovenko S.Y., Mukhitova F.K.,Kiyashko S.V. Enzyme-catalyxed synthesis of hydrocarbons and oxygencontaining compounds from CO and H2 //J.Mol.Catal.-1989.-V.56. -P.260-265.
183. LeGall J., Moura J.J.G., Peck H.D., Xavier A.V. Hydrogenase and other iron-sulfur proteins from sulfate-reducing and methane-forming bacteria.- In: Iron-sulfur proteins, New York, 1982.- P.240-248.
184. Liu M.C., Der Vartanian D.V., Peck H.D. On the nature of the oxidation-reduction properties of nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans//Biochem.Biophys.Res.Commun.- 1980.- V.96.- N1.- P.278-283.
185. Liu C.L., Peck H.D. Comparative bioenergetics of sulfate- reduction in Desulfovibrio and Desulfotomaculum spp. //J.Bacteriol.-1981.-V.145.-N2.-P.966-973.
186. Liu M.C., Peck H.D. Inorganic phoshate: energy source for sulfate reducing bacteria // Science. - 1982. -V.217. -N4557.-P.363-364.
187. Ljungdahl L.G.The autotrophic pathway of acetate synte-sis in acetogenic bacteria // Arch. Microbiol.- 1986.- V.40.- P.415-450.
188. Lovley D.R., Widman P.K., Woodward J.C., philips E.J.P. Reduction of uranium by cytochrome C3 of Desulfovibrio vulgaris // Appl.Environ.Microbiol.- 1993.-V.59.-P.3572-3576.
189. Lupton F.S., Conrad R., Zeikus G. Physiological funciuu ui ПуиГОцеп nicuduuiQui nig giuwLii Oi iiun iUUgciJiL; Dduteria on organic substrates // J.Bacteriol.-1984a.-V.159.-N3. -P.843-849.
190. Lupton F.S., Conrad R., Zeikus J.Y. CO metabolism of Desulfovibrio vulgaris strain Matchison: physiologycal function in the absence or presence of exogeneous substrates // FEMS Microbiol.Lett.- 1984b.- V.23.- P.263-268.
191. Magee E.L., Ensley B.D., Barton L.L. An assessment of growth yields and energy coupling in Desulfovibrio // Arch. Microbiol.-1978.-V.117.-Nl.-P.21-26.
192. Mahmand S.A.Z., El-Damaty A.A., Metwelly A.A. et al. Effect of phisico-chemical factors on total microbial flora and sulfate-reducing bacteria // Egipt.J.Microbiol.- 1979.--V.12.- N1-2.- P.1-14.
193. Marshall C., Frenzel P., Cypionka H. Influence of oxygen on sulfate reduction and growth of sulfate-reducing bacteria // Arch. Microbiol.- 1993.- V.159.- N2.- P.168-173.
194. Martin S.M., Glick B.R., Martin W.G. Factors affecting the production of hydrogenase by Desulfovibrio desulfuricans // Can.J.Microbiol.- 1980.- V.26.- P.1209-1213.
195. Mc Cready R.G.L.Gould W.D.,Cook F.D. Respiratory nitrate reduction by Desulfovibrio //Arch.Microbiol.-1983.-V.135. -N3.-P.182-185.
196. Miller J.D.A., Wakerley D.S. Growth of sulfate-redu-cing bacteria by fumarate dismutation // J. Gen. Microbiol.-1966.- V.43.- P.101-107.
197. Miller J.D.A., Neuwann P.M., Elford L., Wakerley D.S. Malate dismutation by Desulfovibrio // Arch. Microbiol.- 1970. V.71.- P.214-219.
198. Mitchell G.L., Jones J.G., Code J.A. Distribution andregulation of nitrate and nitrite reduction by Desulfovibrio and Desulfotomacu1urn spec i es // Arch. Mi crobiol.- 1986.-- V.144.- P.35-40.
199. Nilsen R.K., Beed J., Rosnes J.T.,Torsvik Т., Lein T. Archaeoglobus sp. isolated from produced oil field waters / Int. Conf. Thermophil.Sci. and Tehnol, Reykjavik, 1992.--P.72.
200. Oakwood T.D. Review on API Research Project 43 B. Fundamental research on occurrence and recovery of petroleum. Amer. Petrol. Institute. New York,1944-1945.
201. Odom T.M., Peck H.D.T. Localizat i on of dehydrogena-ses, reductases, and electron transfer components on the sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio gigas //J.Bacterid. -1981.-V.147.-Nl.-P.161-169.
202. OdomJ.M., Peck H.D. Hydrogenase, electron-transfer proteins and energy coupling in the sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio // Annual Rev.Microbiol.-1984.-V.38.-P.551--592.
203. Ogata M., Arichara К.,Yagi Т. D-Lactate dehydrogenase of Desulfovibrio vulgaris // J. Biochem. 1981.- V.89.- N5.- P.1323-1331.
204. Okabe S., Nilsen P.H., Characklis W.G. Factors affecting microbial sulfate-reducing by Desulfovibrio desulfuricans in continuous culture:limiting nutrients and sulfite concentration // Biotechnol.- 1992a.-V.40.-P.725-734.
205. Okabe S., Characklis W.G. Effects of temperatura and phosphorous concentration on microbial sulfate reduction by Desulfovibrio desulfuricans // Biotechnol. and Bioeng.-1992b.- V.39.- N10.- P.25-34.
206. Okabe S. Effects of limiting nutrients and sulfide concentration on kinetics and stoichiometry of Desulfovibrio desulfuricans, Miyazaki Univ.- 1994.- N23.-P.49-68.
207. Oppenheimer C.H.F. Bacterial production of hydrocarbon- like materials // Z.Allg.Microbiol.-1965.-V.5.-P.284-307.
208. Oro J., Laseter J.L., Weber D. Alkanes in fungal spores // Science.- 1966.- V.154.- P.400-401.
209. Pankhania J.P., Gow L.A., Hamilton W.A. The effect of hydrogen on the growth of Desulfovibrio vulgaris ( Hilden-borough) on lactate // J. Gen.Microbiol.- 1986.-V.132.-N2.- P.3349-3356.
210. Pankhania I.P., Gow L.A., Hamilton W.A. Extraction of periplasmic hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hilden-borough) // FEMS Microbiol. Lett.-1986.- V.35.- N1.- P.l-4.
211. Parkes R.J., Buckingham W.J. The flow of organic carbon through aerobic respiration and sulphate-reduction in inshore marine sediments // Proceeding of the Fouth International Congress on microbial Ecol.- 1386.- P. 617-624.
212. Peck H.D. Comparative metabolism of inorganic sulphur compounds in microorganisms // Bacteriol.Rev.- 1962.- V.26.--P.67-94.
213. Peck H.D.,LeGall J.Biochemistry of dissimilatory sulphate reduction //Phil.Trans.Roy.Soc.-1982.-V.298.- P.361-363.
214. Peterson S.L., Bennett L.G., Tornabene T.G. Effects of lead on the lipid composition of Micrococcus lutea cells // Appl. Microbiol.- 1975.- V.29.- N5.- P.669-679.
215. Pfennig N. Metabolic diversity among the dissimilatory sulfate-reducing bacteria.Albert Jan Kluyver Memorial lecture // Antonie van Leeuwenhoek.- 1989.- V.56.- N2c.- P.127- 138.
216. Platen H., Temmes A., Schink B. Anaerobic degradation of acetone by Desulfococcus biacutus spec.nov. //Arch. Microbiol. -1990.-V.154.-N4.-P.355-361.
217. Postgate J.R. The reduction of sulphur compounds by Desulfovibrio desulfuricans //J. Gen.Microbiol.- 1951.- V.5.--P.725-738.
218. Postgate J.R. Growth of sulfate-reducing bacteria in sulfate-free media // Research (London).- 1952.- V.5.-N2.--P.189-190.
219. Postgate J.R. Media for sulphur bacteria // LaboratoryГЧ v.4- ■? Л Г1С С W НС Л Л OH ООП Н П Л АГ1 eU^LUJC. хэии. - Y.1U.- 1ЧА-1.-Г. АЛО»- .
220. Postgate J.R. Economic importance of sulphur bacteria // Philosophical Transactions of the Royal Society of London.- 1982.- V. В 298.-P.583-600.
221. Postgate J.R. The sulfate-reducing bacteria. 2nd.ed. Cambridge: Cambridge Univ.Press,1984.-208 p.
222. Prey V., Berbalk U., Kausz M. Beitrage zur Papierchro-matographia organischer substrauzen. Die Diinnschichtchroma-tographie einiger Kohlehydratderivate und Abbauprodukte // Mikrochim. Acta.- 1962.-P.449-454.
223. Rabus R., Nordhaus R., Ludwig W., Widell F. Comlete oxidation of toluene under strictly anoxic conditions by a new sulfatereducing bacterium // Appl. Environ. Microbiol.-1993. -V.59.-P.1444-1451.
224. Rezanka T. Overproduction of microbial lipids and lipases //Folia microbiol.-1991.-V.36.-N3.-P.211-224.
225. Rieder-Henderson M.A., Peck H.D.,Harry D.J. Properties of formate dehydrogenase from Desulfovibrio gigas // Can. J. Microbiol.- 1986.-V.32.-N5.-P.430-435.
226. Rueter P.,Rabus R.,Wilker H.,Aeckerberg F.,Rainey F.A., Jannasch H.W., Widdel F. Anaerobic oxidation of hydrocarbons in crude oil by new types of sulfate-reducing bacteria // Nature.-1994.-V.372.-P.455-458.
227. Samain E., Dubourgier H.C., Albagnac G. Isolation and characterization of Desulfobulbus elongatus sp. nov. from a mesophilic industrial digester // System, and Appl.Microbiol.- 1984.- V.5.- P.391-401.
228. Samain E., Dubourgier H.C., LeGall J., Albagnac G. Regulation of hydrogenase activity in the propionate oxidizing sulfate-reducing bacterium Desulfobulbus elongatus.-In:Biology.of anaerobic bacteria. Oxford,N.Y.:Elsevier, Amsterdam, 1986.-P.23-27.
229. Schauder R.,Eikmanns В.,Thauer R.K.,Widdel F.,Fuchs G. Acetate oxidation to CO2 via a novel pathway not involving reactions of the citric acid cycle // Arch. Microbiol.- 1986. -V.145.-P.162-172.
230. Schauder R.,Widdel F.,Fuchs G. Carbon assimilation pathway in sulfate-reducing bacteria. Enzymes of a reductive citric acid cycle in the autotrophic Desulfobacter hydroge-nophilus. // Arch.Microbiol.-1987.-V.148.-N3.-P.218-225.
231. Seitz H-J., Cypionka H. Chemolitotrophyc growth of Desulfovibrio desulfuricans with hydrogen coupled to ammonifi-cation of nitrate or nitrite // Arch. Microbiol.-1986.-V.146. P.63-67.
232. Senez J.C., Leroux-Gilleron J. Note preliminaire sur la degradation anaerobie de la cysteine et de la cystine par les bacteries sulfato-reductrices // Bull. Soc. Chim. Biol.--1954.-V.36.- P.553-559.
233. Sisler F.D., Zobell C.E. Hydrogen utilization by some marine sulfate-reducing bacteria // J.Bacterid.- 1951.-V.62. -P.117-127.
234. Sorensen J., Christensen D., Jorgensen B.B. Volatile fatty acids and hydrogen as substrates for sulfate-reducinguduiei ш in cuicieruuiu nicu iHc acuiitkJiiL / / appl. 3iiu cnv . wliCu uui"ol.-1981.-V.42.-P.5-11.
235. Spormann A.M., Thauer R.K. Anaerobic acetate oxidation to CO2 by Desulfotomaculum acetoxidans // Arch. Micribiol.-1989.- V.152.- P.189-195.
236. Stams A.J.M., Kremer D.R., Nicolay K., Weenk 6.H.,Hansen T.A. Pathway of propionate formation in Desulfobulbus propionicus //Arch.Microbiol.-1984.-V.139.-P.167-173.
237. Stams A.J.M., Hansen T.A., Skyring G.W. Utilization of amino acids as energy substrates by two marine Desulfovibrio strains //FEMS Microbiol. Ecol.- 1985.- V.31.- P.11-15.
238. Stevenson D.P., Finnerty W.R., Kallio R.E. Esters produced from n-heptadecane by Micrococcus cerificans //Biochem. Biophys.Res.Commun.- 1962.- V.9.- N5.- P.426-429.
239. Steenkamp D.J., Peck H.D. The association of hydrogenase and dithionite reductase activity with the nitrite reductase of Desulfovibrio desulfuricans // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1980.- V.94.- N1.- P.41-48.
240. Steenkamp D.J., Peck H.D. Proton translocation associated with nitrite respiration in Desulfovibrio desulfuricans //J.Biochem.Biophys.Research.- 1981.- V.256.- P.5450-5458.
241. Suh В., Akagi J.M. Pyruwate carbon dioxide exchange reaction of Desulfovibrio desulfuricans // J.Bacteriol.-1966. - V.91.- P.2281-2285.
242. Szewzyk R., Pfennig N. Complete oxidation of catechol•by the strictly anaerobic sulfate-reducing bacterium Desulfobacterium catecholicum sp. nov. // Arch. Microbiol.- 1987.-- V.147.- P.163-168.
243. Tasaki M., Kamagata Y.,Nakamura K., Mikami E. Utilisation of methoxylated benzoates and formation of intermediates by Desulfotomaculum thermobenzoicum in the presence or absence of sulfate //Arch.Microbiol.-1984.-V.139.-P.167-173.
244. Thauer R.K. Energy metabolism sulfate-reducing bacteria.- In; Autotrophyc bacteria, Sci.Tech.Publis.,1989.-P.397--413.
245. Thauer R.K. Energy metabolism of methanogenic bacteria // Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg.-1990.- V.1018. N 2-3.--P.256-259.
246. Thauer R.K., Rupprecht E., Jungermann K. Separation of14c-formate from СОг fixation metabolites by isoionic-exchange chromatography // Anal.Biochem.- 1970.- V.38.- P.461-468.
247. Thauer R.K., Jungermann K., Decker K. Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria // Bacterid. Revs.-1977.- V.41.-N1.-P.100-180.
248. Thauer R.K.Badziong W. Dissimilatiry sulfate reduction, energetic aspect // Biol. Inorg. Nitrogen and Sulfur. -Berlin e.a., 1981, P.188-198.
249. Thauer R.K., Widdel F., Fuchs G. Formate, carbon dioxide, carbon monoxide, and acetate assimilation by Desulfovibrio baarsi // Arch.Microbiol.-1984.-V.138.-N3,- P.257-263.
250. Thauer R.K., Moller-Zinkhan D., Spomann A.M. Biochemistry of acetate catabolism in anaerobic chemotrophic bacteria // Annu. Rev. Microbiol.- 1989.- V.43.- P.43-46.
251. Tomei F.A., Barton L.L., Lemanski C.L., Zocco T.G., Fink N.H., Sillerud L.O. Transformation of selenate and se-lenite to elemental selenium by Desulfovibrio desulfuricans //J.Indust. Microbiol.- 1995.- V.14.- P.329-336.
252. Tornabene T.G. Microbial formation of hydrocarbons /Gottingen seminar on Microbial Energy Conversion, Oxford, 1976.- P.281-299.
253. Tornabene T.G. Formation of hydrocarbons by bacteria and algae / Trends. Biol. Ferment Fuels and Chem. Proc. Symp., Upton, N.Y. 1980, New York:London 1981.- P.421-438.
254. Tornabene T.G. Microorganisms as hydrocarbon producers // Experientia.-1982.-V.38.-P.43-46.
255. Tornabene T.G., Bermett E.O., Oro J. Fatty acid and aliphatic hydrocarbon composition of Sarcina lutea grown in three different media // J.Bacterid.-1967.- V.94.-P.344-348.
256. Tornabene T.G., Oro J. 14C incorporation into the fatty acids and aliphatic hydrocarbons of Sarcina lutea //J.Bacterid.- 1967.- V.94.- P.349-358.
257. Tornabene T.G., Morrison S.J., Kloos W.E. Aliphatic hydrocarbon contents of various member of the family Micrococ-caceae // Lipids.-1970.-V.5.-P.927-937.
258. Tornabene T.G., Lloyd R.E., Holzer G., Oro J. Lipids as a principle for the identification of archaebacteria Life Sci. and Space Res.-V.18., Proc. Open. Meet. Work. GroupSpace Biol. 22nd Plenary Meet. COSPAR, Bangalore, 1976, Oxford, 1980.- P.109-121.
259. Tornabene T.G.,Peterson S.L. Pseudomonas malthophilia: Identification of the hydrocarbons, glycerides, and glycolo-proteins of cellular lipids // Can. J. Microbiol.-1978.-V.24. N5.- P.525-532.
260. Traore A.S., Hatchikian C.E., Belaich J.P., LeGall J. Microcalorimetric studies of the growth of sulfate-reducing bacteria : energetics of Desulfovibrio vulgaris growth // J.Bacterid.- 1981.-V.145.-Nl.- P.191-199.
261. Ueki A.,Azuma R., Suto T. Characterization of sulfate-reducing bacteria isolated from sewage digestor fluids //J. Gen. and Appl. Microbiol.- 1981.- V.27.- N6.- P.457-464.
262. Van Der Westen H.M., Mayhew S.G., Veeger G. Separation of hydrogenase from intact cell of Desulfovibrio vulgaris // FEBS Lett.-1978.-V.86.-N1.-P.122-126.
263. Weete J.D., Weber D.J., Laseter J.L. Lipid of Rhizopus arrhizus Fisher //J.Bacteriol.- 1970.-V.103.-P.536-540.
264. Weete J.D., Candhi S. Potential for fungal lipids in biotechnology //Handbook of Appl.Micol.V.4.Fungal.Biotechnol. -N.Y., 1992.- P.377-400.
265. Widdel F. Anaerober abban von fettsauren und benzoesau-re durch new isolierte arten sulfat-reduziender bacterien // Dissertation. Universitat, Gottingen, 1980.'-P.373-390.
266. Widdel F. New types of acetate-oxidizing sulfate-reducing Desulfobacter species, D.hydrogenophilus sp.nov.,D.latus sp.nov.,and D.curvatus sp.nov.//Arch.Microbiol.-1987.- V.148. -P.286-291.
267. Widdel F. Microbiology and ecology of sulfate and sulfur reducing bacteria. In: Biology of Anaerobic Microorganisms. New York, 1988.-Ch.10.- P.469-586.
268. Widdel F., Pfennig N. A new, anaerobic, sporing, aceta-teoxidizing sulfate-reducing bacterium Desulfotomaculum aceto-xidans (emend) // Arch. Microbiol.- 1977.- V.112.- P.119-122.
269. Widell F.Pfennig N. Dissimilatory sulfate- or sulfur-reducing bacteria.- In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Baltimore:Williams, Wilkins, 1984.- P.663-679.
270. Widdel F., Hansen T.A. The dissimilatory sulfate- and sulfur-reducing bacteria.- In: The prokaryotes, 2nd ed.,1992.-Y.2.- Ch.24.- P.583-625.
271. Wolfe R.S. Biochemistry of methanogenesis: Njvel coenzymes in Archaebacteria // Biol.Chem.-1990.-V.371.-N3.-P.173.
272. Wood H.G. Phosphate reserves and energy storage:pyrophosphates." In: Phosphate Metab. and Regul. Microorganisms.-Washington D.C., 1987.- 245 p.
273. Yagi T. Enzymic oxidation of carbon monoxide // J.Biochem. -1959.-V.46.-N7.-P.949-955.
274. Yagi T. Formate : cytochrome oxidoreductase of Desulfovibrio vulgaris // J.Biochem.- 1969.- V.66.-P.473-478.
275. Yagi T., Tamiya N. Enzymic oxidation of carbon monoxide. 3. Reversibility // Biochim. Biophys Acta.-1962.- V.65. -N2.- P. 508-509.
276. Yagi T.t Honya M., Tamiya N. Purification and properties of hydrogenases of different origins //Biochim. Biophys. Acta. 1968.-V.158.-P.699-705.
277. Yagi Т., Endo A., Tsuji K. Properties of hydrogenase from particular fraction of Desulfovibrio vulgaris.- In; Hydrogenases: their catalytic activity, structure and function. -Gottingen: Gotze E.,1978.-P.107-124.
278. Yamaqucehi I.,Mega N. Sanada H. Components of the gel of Aloe vera (L.) Burm.f // Biosci. Biotechnol. and Biochem.--1993.- V.57.- N8.- P.1350-1352.
279. Yochkova Y., Mladenova K., Stoianjva I.B. Compositionof waxes from Fi-hybrids of Rosa centifolia and Rosa gallica, Sof.Univ., 1992,- V.80.-P.202-204.
280. Zellner G., Messner P., Knelfell H., Winter J. Desulfovibrio simplex spec.nov., a new sulfate-reducing bacterium from a sour whey digester // Arch.Microbiol. 1989.- V.152.--P.329-334.
281. Zeng Y.B.,Ward D.M., Brassell S.C., Eglinton G.Biogeo-chemistry of hot spring environments.3. Apolar and polar lipids in the biologically active layers of a cyanobacterial mat // Chem. Geol.-1992.-V.95.- N3-4.- P.347-360.
282. Zhou D.,White R.H. Ealy steps of isoprenoid biosynthesis in Escherichia coli // Biochem. J.- 1991.- V.273.- N3.-- P.627-634.
283. ZoBell C.E. The role of bacteria in the formation and transformation of petroleum hydrocarbons //Science.-1945.-V. 109.-P.364-368.
284. ZoBell C.E. Ecology of sulfate-reducing bacteria //Oil Prod. Associat., 1958.- V.22.- P.12-29.
-
Багаева, Татьяна Вадимовна
-
доктора биологических наук
-
Казань, 1998
-
ВАК 03.00.07
- Сульфатредуцирующие бактерии - продуценты углеводородов
- Выделение бактериофага Desulfovibrio desulfuricans и создание на его основе биопрепарата профилактики коррозии металлов в нефтяной промышленности
- Трансформация нитроэфира целлюлозы сульфатредуцирующей бактерией Desulfovibrio desulfuricans 1388
- Сопряжённость процессов бактериального окисления углеводородов и сульфатредукции в грунтах пресноводного водохранилища
- Синтез внеклеточных углеводородов бактериями рода Clostridium и рода Desulfovibrio
