Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение бактериофага Desulfovibrio desulfuricans и создание на его основе биопрепарата профилактики коррозии металлов в нефтяной промышленности

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Выделение бактериофага Desulfovibrio desulfuricans и создание на его основе биопрепарата профилактики коррозии металлов в нефтяной промышленности"

На правах рукописи

Карамышева Наталья Николаевна

Выделение бактериофага Вези1/оу1Ьгю ¿ези1/иг1сат и создание на его основе биопрепарата по профилактике коррозии металлов в нефтяной промышленности

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 — микробиология

т 2013

Саратов-2013

005049043

005049043

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич

доктор биологических наук Семёнов Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

Дыкман Лев Абрамович доктор биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН», ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Плотников Олег Петрович доктор медицинских наук, старший научный сотрудник ФКУЗ Российский научно - исследовательский противочумной институт «Микроб», заведующий лабораторией коллекционных штаммов Государственной коллекции патогенных бактерий

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»

Защита диссертации состоится «21» февраля 2013 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Автореферат диссертации разослан «'и » января 2013 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сульфатредуцирующие бактерии, в частности Оет1/о\'1-Ъг'ю с]е.,т1/иг1сап! являются достаточно распространённой физиологической группой, характеризующейся способностью к образованию сероводорода из сульфата. Наиболее значимыми процессами жизнедеятельности рода ВезиуМЬгю являются: биоми-нерализациия, круговорот серы в природе и биокоррозиия металлов. Наибольший урон процесс биокоррозии, с участием Ое5и1/о\чЬпо ¿езиЦипсат наносит нефтедобывающей промышленности. Основная контаминация нефти микроорганизмами происходит в процессе закачки в пласт воды без соответствующей антибактериальной обработки (Каменщиков, 2007).

Активный рост сульфатредуцирующих бактерий приводит к резкому увеличению скорости коррозии (примерно в 24 раза), а наличие застойных зон к добавочному усилению активности сульфатредуцирующих бактерий, то есть увеличению скорости локальной коррозии (Антоновская, 1985). В настоящее время для борьбы с сульфатредуцирующими бактериями в нефтяных пластах используются ингибиторы. В основном это бактерициды, относящиеся к классам неорганических и органических соединений. Однако этот метод оказывает негативное влияние на качество нефти (Белоглазов, 1987; Смородин, 1983). Поэтому актуальной является задача создания бактериофагового биопрепарата, позволяющего обеспечивать уменьшение численности сульфатредуцирующих бактерий и понижение степени их коррозионного воздействия на металл нефтедобывающего оборудования с одновременным сохранением качества добываемой нефти.

Цель работы - создание биопрепарата на основе бактериофагов бактерий £>е-$и^о\чЪг1о ¿¡еБиЦипсат для профилактики коррозии металла.

Задачи исследования:

1. Разработать схемы ускоренной идентификации бактерий рода

£>. ¿¡езиЦипсат выделенных из вод, используемых при технологических процессах добычи нефти.

2. Разработка тест - системы для молекулярно-генетической идентификации £>. с1е$и1/иг1сапз с применением метода ПЦР (подбор и дизайн праймеров, подбор концентрации и температуры отжига праймеров, оптимизация программы амплификации).

3. Выделить бактериофаги £>. с1е$ч1/ипсат и изучить их биологические свойства.

4. Отобрать бактериофаги со свойствами необходимыми для создания биопрепарата, лизирующего сульфатредуцирующие бактерии в природных условиях.

5. Разработать методику изготовления бактериофагового биопрепарата для ис-

пользования в целях предупреждения коррозии металла.

6. Изучить эффективность воздействия биопрепарата бактериофага на показатели коррозионного поражения металла.

Научная новизна работы. Разработаны схемы ускоренной бактериологической идентификации бактерий рода £>. (¡еииЦипсат. Предложенная и апробированная система праймеров доказала высокую специфичность и чувствительность метода ПЦР для индикации и идентификации бактерий О. ¿еЫ/ипсапя. Получены бактериофаги £>. АетЦипсат с широким спектром литической активности. Разработана методика конструирования бактериофагового биопрепарата с высокой эффективностью при подавлении коррозионной активности бактерий £>. с1е$и!/иг1сат Разработана лабораторная схема тестирования применения защитных действий фагов в отношении коррозийной активности О. с1ези1/ипсап5 в водно - нефтяной среде.

Практическая значимость работы. На основе выделенных фагов бактерии О. desulfuricans разработаны параметры изготовления биопрепарата, который может быть использован как средство защиты металла от коррозии на нефтедобывающих и нефтеперерабатывающих предприятиях.

По материалам диссертационной работы разработаны методические рекомендации «Испытания биопрепарата на основе бактериофагов Оезн//оУ1'Ыо (¡езЫ/иНсат для защиты металла от биокоррозии в лабораторных условиях» и «Изготовление и контроль биопрепарата на основе бактериофагов Оени^отЬг'ю (1е$и1]иг1сап$ для защиты металла от биокоррозии», которые размещены в виде электронного ресурса на сайте научной библиотеки ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», предназначенные для аспирантов, специализирующихся в области биотехнологии и микробиологии. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по биотехнологии и проведении практических занятий со студентами факультета ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложенная бактериологическая схема позволяет сократить сроки видовой идентификации бактерий рода ¿)аш//отг'Мо из вод (используемых в нефтяных технологических процессах) и объектов внешней среды с 96 до 72 часов.

2. Разработанная тест - система для молекулярно-генетической идентификации И. Ыеьи1/ипсат, основанная на использовании метода ПЦР, позволяет проводить дифференцировку штаммов £>. ¿ет^ипсапэ Бискр. с!еаи1/ипсап.ч на основе наличия ампликонов, размером 224 пар нуклеотидов;

3. Предложенные схемы индукции профага в бактериях £>. с/е^мТ/мпсога путем воздействия УФ и рентген излучения позволяют получить штаммы бактериофагов с широким спектром литической активности;

4. Предложенный метод обнаружения наследственного материала индуцированных бактерифагов - нуклеиновых кислот с помощью электрофореза в агарозном геле, позволяет подтвердить наличие искомых бактериофагов.

5. Разработанный биопрепарат на основе бактериофагов Оёг 57 - УГСХА и Б(1и 48 - УГСХА приводит к значительному снижению неравномерной коррозии металла на 97,4%. и 98,7 % соответственно.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина».

Апробация работы:

Материалы диссертационной работы были представлены на: II 1-й Международной научно - практической конференции молодых учёных «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010); Международной научно - практической конференции Ульяновской ГСХА им. А.П. Столыпина (Ульяновск 2011; 2012); IV Международной научно-практической конференции Ульяновской ГСХА им. А.П. Столыпина «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя состоит в планировании и проведении экспериментальных исследований в рамках диссертационной работы, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов, списка литературы. Материалы диссертации изложены на 100 страницах, включают 14 таблиц и 20 рисунков. Список использованных литературных источников включает 165 наименований, в том числе -88 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты н методы исследований

Объекты исследований: В работе использованы референс - штаммы бактерий: Desulfovibrio desulfiiricans subsp. desulfuricans (Beijerinck, 1895) Kluyver et van Niel 1936 VKM В - 1799, Desulfovibrio gigas VKM В - 1759, Desulfovibrio sulfodismutans VKM В - 1764, Desulfovibrio vulgaris VKM В -1760, Desulfovibrio sp. VKM В - 2200, полученные из музея ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино Московская обл.), а также 9 штаммов бактерий (Р,, Р2, Р3, Р4, Р5, Сж, 3,, 32, ВО, выделенных из объектов окружающей среды, типирование которых позволило отнести их к роду Desulfovibrio. Кроме того, для изучения специфичности бактериофагов использовали 5 штаммов бактерий: Clostridium petfringens А - 33, Fusobacterium nucleatum JI - 77, Lactobacillus spp Ф - 102, Bacillus cereus С - 44, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГБОУ ВПО Ульяновской ГСХА. Представленные штаммы обладали типичными биологическими свойствами.

Методы: Культивирование анаэробных микроорганизмов по Постгейту (1984); окраску микроорганизмов по Граму (1884); определение подвижности микроорганизмов по Пешкову (1972); биохимическую идентификацию по Герхарду (1984) и Widdel (1992); индукцию профага бактерий УФ облучением по И. Беляевой (1978); индукцию профага бактерий рентген-облучением по Adams V. (1973); моле-кулярно-генетический - ПЦР; электрофоретический метод по Лэммли (1970); определение активности фага по методу Аппельмана; агаровых слоев по Грациа; определение спектра литической активности; определение типоспецифичности литического действия фага по методам, предложенным М. Адамсом (1956), Д.М. Гольдфарбом (1961), И.М. Габриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (2007); металлографическую оценка коррозионных поражений; определение показателей коррозионной стойкости: количественные и качественные показатели по ГОСТ 9.506 - 87.

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами (Ашмарин, Воробьёв 1962; Бейли, 1962). Обработку результатов осуществляли с помощью программы SPSS statistics 17.0.

Результаты исследований и их обсуждение

Разработка схемы выделения и идентификации бактерий D. desulfuricans из объектов внешней среды

Были изучены морфологические и физиолого - биохимические свойства референс - штамма Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans VKM В-1799. На основании полученных результатов и данных литературных источников была предложе-

на и апробирована схема выделения бактерий вида Desulfovibrio desulfuricans состоящая из четырех этапов и семи тестов.

Для выделения и идентификации культур сульфатредуцирующих бактерий нами была предложена схема, показанная на рисунке 1.

Для получения чистой культуры проведены пересевы с жидкой накопительной среды Постгейта «В» на модифицированные твёрдые питательные среды, в том числе авторские СРБ .№ 32, СРВ № 33, СРБ № 36 модификации НИИЦБиМ, основанные на введении в состав среды дополнительных источников энергии, задерживающих почернение среды до 48 ч, вместо обычных 24 ч. На всех предложенных средах рост референс - штамма Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans VKM В - 1799 сульфатредуцирующих бактерий наблюдался уже через 72 ч вместо 96 ч на ранее предлагаемых исследователями питательных средах. По наличию в мазках из культуры грамотрицательных неспорообразующих вибрионов, почернению придонного осадка, положительной реакции на сероводород, наличию пигмента десульфовири-дина, выявленной подвижности, роста на лактате, цитрате и малате, отсутствия роста на сукцинате и ацетате, роста серебристо - белых колоний на фоне почернения ага-ризованной питательных среды в строгих анаэробных условиях выделенная культура сульфатредуцирующих бактерий была отнесена к D. desulfuricans subsp. desulfuricans (Bergey's Manual of Determinative, 1974) (таблица 1).

Малаг Сгцикл Цитрат Ацетат

Рисунок 1 - Схема выделения и идентификации бактерий D. desulfuricans

Результаты физиологе - биохимических тестов отражены в таблице 2. На основании проведенных собственных физиолого - биохимических исследований, рекомендованных в оригинальных публикациях и определителях и посвя-

щенных идентификации £>. с1е5и1/ипсап$ физиолого - биохимическая идентификация сложна и не надёжна, так как результаты для многих видов бактерий £>е.™//т>/йпо получаются идентичными. Следовательно, наряду с физиолого - биохимическими методами нужно применять молекулярно - биологические методы, основанные на генетической идентификации £>. ¿еаи^ипсап*.

Таблица 1 - Идентификация выделенных штаммов бактерий D. desulfuricans

№ Назва звание штам ма Объект выделения Окраска по Граму Наличие пигмента десульфо-виридина Подвижность Рост на сукци-нате Рост на цитрате Рост на ма-лате Рост на ацетате

1 Pi Вода технологическая - + + — + + —

2 Р 2 Вода технологическая - + + — + +

3 Рз Вода технологическая - + + — + +

4 Р 4 Вода технологическая - + + — + +

5 Р5 Пластовая вода - + + - + + -

6 С.-* СОЖ - + + - + + -

7 3| Колодезный ил _ + + - + + -

8 32 Озерный ил - + + - + + -

9 Bi Образцы глубинной воды пресных водоёмов + + + +

Примечание - «+» положительный результат; «-» отрицательный результат

Молекулярно-генетическая идентификация бактерий D. desulfuricans с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Для того чтобы разработать оптимальные параметры проведения ПЦР для идентификации D. desulfuricans необходимо было: 1) провести подбор праймеров для идентификации D. desulfuricans; 2) определить оптимальные концентрации праймеров для проведения ПЦР; 3) оптимизировать протокол проведения ПЦР (температура отжига, количество циклов) при использовании данной системы праймеров.

Для анализа нуклеотидного состава ДНК D. desulfuricans были использованы ресурсы базы данных GeneBank. Поиск уникальных последовательностей специфического гена проводили с использованием приложения GeneBank - on-line Blast nucleotides. Подбор праймеров проводили с помощью программы Gene Runner Version 3.05 и Primer Blast (ресурсы GeneBank). Апробацию предложенной методики проводили с использованием штаммов D. desulfuricans музея НИИЦМБ Ульяновской

УГСХА. После ряда проведённых анализов программами Gene Runner v.3.05 и Primer-Blast (в режиме on-line) были определены праймеры, фланкирующие участок размером 224 пар нуклеотидов (п.н.) (таблица 3).

Таблица 2 - Сравнение биохимических свойств сходных видов бактерий

Свойства Desulfovibrio desulfuricans VKMB-1799 Desulfovibrio vulgaris VKMB-1760 Desulfovibrio gigas VKMB-I759 Desulfovibrio sp. VKMB-2200 Desulfovibrio sulfodismutans VKMB-1764

дегидрогеназа + + + + +

формиат + + + + _

фумарат + + + + _

сероводород + + + + +

цитрат натрия + + + + +

гидролиз ДНК + + + + +

подвижность + + + + +

липаза + + + + +

десульфовиридин + + + + +

лактат + + + + +

малат + - - - +

Примечание - «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат

Таблица 3 - Праймеры для участка гена липополисахарида

Последовательность 5-3' Длина, пар оснований Температура плавления, °С GC состав, %

Прямой праймер -LipF CCCGTAACGGCCTGCAGGTT 20 59,34 65,00

Обратный праймер - LipR CAGGGGCATGACCGTACGCG 20 60,18 70,00

Размер продукта амплификации 224 пар оснований

После ряда экспериментов по оптимизации температурного режима специфического отжига праймеров (рис. 2) и подбора их концентраций были определены следующие параметры проведения ПЦР:

- концентрация каждого праймера - 5 pmol / реакцию (25 мкл);

- режим ПЦР 1) 95° С - 5 минут 1 цикл

2) 95° С-10 сек "L

_____I 5 циклов

60° С-10 сек -J

3) 95° С - 5 сек "V ,п

' Г 40 циклов

65° С-15 сек

Расчётная величина размера ампликона (224 п.н.) наблюдалась только у 9 штаммов D. desulfuricans. У остальных штаммов D. desulfuricans присутствовали специфические амплификаты размером 150 п.н, что может быть использовано при

индикации и идентификации бактерий данного вида, поскольку остальные виды использованных бактериальных культур таких полос не образуют. Вероятно, наличие специфической полосы размером 224 п.н. имеют штаммы, сходные со штаммом D. desulfuricans subsp. desulfuricans sir. АТСС 27774, единственный полный геном которого представлен в базе данных GeneBank.

Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов амплификации участка гена липополисахарида D. desulfuricans

Примечание-М-маркер молекулярного веса (100-1000 п.н.), 1 -Я desulfuricans la. 2 - Я desulfuricans P3, 3-Я desulfuricans la, 4 - Я desulfuricans Сж. 5 -Я desulfuricans 2/P2a, 6 - Я desulfuricans РЗа, 7 - Я desulfuricans P4, 8 - Я desulfuricans lb, 9 - Я desulfuricans 3/1 b. 10 - Я desulfuricans 2/P2b, 11 - K. pneumoniae, 12 - Clostridium spp., 13 - отрицательный контроль.

Выделение бактериофага D. desulfuricans методами индукции и изучение его основных биологических свойств

Метод индукции профага бактерий D. desulfuricans УФ облучением

Выделение бактериофага бактерии D. desulfuricans проводили по усовершенствованному нами методу И. Беляевой (1978). В опытах была использована модифицированная среда СРБ № 36. Источник УФ - облучения - лампа фирмы «Philips» с длиной волны 250 нм и мощностью излучения 60 Вт. При наличие фага в суспензии спустя 24 часа, на сплошном газоне культуры бактерий можно наблюдать дорожку сплошного лизиса. В контроле наблюдался сплошной газон культуры. Время, необходимое на индукцию профага и визуализацию его наличия в субстрате, составляет 72 ч (3 суток).

Опыт был повторён в трёхкратной последовательности для достоверности полученных результатов. Время индукции, расстояние до облучаемого объекта, длина волны рассчитаны экспериментально. Схема индукции представлена на рисунке 3.

SoJtticTiat Vidian ' • ЮЛИИ 350 HI

Рисунок 3 - Схема индукции профага бактерий D. desulfuricans УФ-облучением

Метод индукции профага бактерий D. Desulfuricans рентгеновским облучением

Нами была разработана схема индукции рентгеновским излучением. Дозы облучения бактерий устанавливали экспериментально по расчетной таблице поглощённых доз при рентгеновских исследованиях.

Для получения активной накопительной культуры делали 3-4 пересева на жидкую среду Постгейта 4 — 5 суточным посевным материалом. Полученная чистая культура, была подвергнута облучению на рентгеновской установке в «жёстком» режиме, составляющем 0,86 мЗв. Параметры электротехнических показателей: анодное напряжение при всех исследованиях составляло 63 kV (киловольт) сила тока составляла 250 тА (миллиампер), а экспозиционное время изменяли в зависимости от поставленной задачи.

В первой серии опытов проведен один период облучения в течение 1,6 сек., доза облучения составила 2,0 мЗв (миллизиверта) - полученный результат не удовлетворительный, так как на опытных чашках нет зон лизиса и при электрофоретиче-ском исследовании полученного биологического субстрата не выявлено наличие участков нуклеиновых кислот размером около 1000 п.н. Во второй серии опытов время составило два периода каждый по 1,6 сек. (доза 4,0 мЗв) - результат частичное разрушение бактериальных клеток, что подтверждается наличием зон отсутствия роста культуры и на электрофореграме выявлено наличие участков нуклеиновых кислот размером около 1000 п.н... В третьей серии опытов три периода каждый по 1,6 сек. с перерывом в 1 мин, суммарная доза облучения составила 6,0 мЗв — результат бактериальные клетки погибли, что подтверждается отсутствием роста культуры.

Наиболее оптимальным является для получения фагов является режим облучения, использованный во второй серии опытов, что подтверждается электрофореграммами фаговых нуклеиновых кислот.

Электрофорез ДНК фагов, экстрагированных из штаммов бактерий О. йсъиЦипсат

После проведения опытов по индукции профага сульфатредуцирующих бактерий необходимо найти методы которые могли бы свидетельствовать о наличии бактериофагов в субстрате. Одним из таких методов является обнаружение индуцированных бактерифагов с помощью электрофореза. Суть метода состоит в детекции фрагментов ДНК размером значительно меньше размеров хромосомной ДНК самой бактерии после экстракции тотальной ДНК бульонной культуры й. с/е.т1/ипсап.ч с культурой бактериофага. В качестве контролей были использованы: 1) культура О. (НеэиУипссш без бактериофага (чистая культура); 2) бактериофаги коммерческого производства (синегнойный и сальмонелезный). Учет результатов состоял в следующем: наличие фрагментов ДНК длиной меньше длины хромосомной ДНК самих бактерий в пробах с профагом и отсутствие таковых в пробе с чистой культурой (без воздействия на нее бактериофагов), на наш взгляд, свидетельствует о наличии в исходных пробах бактериофагов.

■*-10000 п.н.

1500 п.н. 1000 п.н. 500 п.н.

Рисунок 4 - Электрофореграмма ДНК бактериофагов О. ¿етЦипсат. Примечание - 1,8 - маркер молекулярного веса; 2-6 - ДНК предположительного фага в бактериальной культуре О. с1еяи1/игюат\ 1 - ДНК чистой культуры £>. ВезиЦппсат

1 2 3 4 5 6 7 8

ani •• кав

10000 п.н.

1500 п.н. ЮООп.н. 500 п.н.

Рисунок 5 - Электрофореграмма ДНК бактериофагов D. desulfuricans, коммерческих синегнойного и сальмонеллезного бактериофагов.

Примечание -1,8- маркер молекулярного веса; 2-4 - ДНК бактериофагов D. desulfuricans проба № 2, №3, №4; 5 - синегнойный фаг; 6 - отрицательный контроль;7 - сальмо-нелёзный фаг

В качестве подтверждения этого, а также для сопоставления размеров ДНК бактериофагов, были использованы в качестве положительных контролей бактериофаги коммерческого производства (синегнойный и сальмонеллезный) с содержанием бактериофагов 109/мл. Результаты показаны на рисунках 4, 5.

В результате проведенных экспериментов по электрофорезу ДНК бактериофагов, полученных с использованием индукции, а также коммерческих бактериофагов Pseudomonas aeruginosa и Salmonella spp. мы обнаружили во всех пробах с предположительным бактериофагом

D. desulfuricans фрагменты нуклеиновых кислот размером около 10000 п.н.; ДНК коммерческих синегнойного и сальмонеллезного бактериофагов также имеют длину около 10000 п.н. Таким образом, фрагменты нуклеиновых кислот размером около 10000 п.н. в исходных пробах, на наш взгляд, свидетельствуют о наличии бактериофагов D. desulfuricans.

Отбор бактериофагов с заданными для целей исследования свойствами, необходимыми для создания биопрепарата

Изучение биологических свойств выделенных бактериофагов проводили по методам, предложенным И.М. Габриловичем (1973), Е.П. Розановой (1978), С.Н. Золотухиным (2007).

Определение активности фага по методу Аппельмана - 10"'; - 10"8.

Негативные колонии бактериофагов характеризовались следующими параметрами: колонии диаметром 6 - 8 мм полностью прозрачны, без зоны вторичного лизиса и с зоной вторичного лизиса на периферии;

Фаги устойчивы к воздействию температуры до 75 °С. При температуре от 76 °С теряют активность и полностью погибают при температуре выше 80°С. Получены данные об устойчивости бактериофагов к воздействию хлороформа в течение 20 - 30 мин.

Результаты опытов показали, спектр литической активности 60% и 80%.

Опыт по определению специфичности бактериофагов (Ddr 57 - УГСХА, Ddu 48 - УГСХА) показал, что оба бактериофага строго специфичны по отношению к D. desulfuricans и не лизируют другие виды и роды бактерий.

Разработка технологических параметров изготовления бактериофагового биопрепарата

Температурные показатели культивирования бактериофагов Ddr 57 -УГСХА и Ddu 48 - УГСХА составляют 30 - 36°С. Оптимальным соотношением бактериофага и культуры является 1:1, т.е. 0,2 мл фага х 0,2 мл индикаторной культуры. Оптимальное соотношение между временем пассажа и активностью фага при температуре 30°С составляет 24 часа. Литическая активность по Грациа от 7x108 до 109.

Определение влияния бактериофагов бактерии D. desulfuricans на степень коррозии металла

Образцы стали размером 2x1,5 см вырезали из насосно-компрессорной трубы, отшлифовали и отполировали до 12 класса чистоты. Маркировка образца - по ГОСТ 9.905. В ходе эксперимента в 4 видах коррозионной среды были имитированы приблизительные условия эксплуатации нефтепроводов: 1 - в качестве контроля были созданы условия без дополнительных факторов коррозии; 2-е присутствием активных коррозионных агентов, представленных бактериями вида D. desulfuricans-, 3-е присутствием бактерий вида D. desulfuricans и с добавлением биопрепарата бактериофага Ddu - 48 УГСХА (титр 10"9); 4-е присутствием бактерий вида D. desulfuricans и с добавлением биопрепарата бактериофага Ddr - 57 УГСХА (титр 10'8). Опыт повторяли в трёхкратной повторности. В ёмкости с коррозионными средами были внесены образцы металла и помещены в термостат на 20 дней при температуре 30°С. Дальнейшие испытания включали в себя определение и оценку типа коррозии, формы коррозионного поражения и его распределения в металле на металлографическом шлифе под микроскопом при увеличении в 100 раз. Как видно на рисунке 6 на по-

верхности контрольного образца развивается сплошная (равномерная) коррозия, тогда как в среде № 2 можно наблюдать коррозию пятнами, то есть образуются углубления неправильной формы различного размера (рисунок 7). Коррозионные пятна неравномерно распределены по поверхности металла, их глубина достигает 2 мкм в среднем поражено 57,3% площади поверхности стали. На рисунке 8 представлена поверхность стали в среде № 3 наблюдается равномерная коррозия и незначительные коррозионные пятна - площадь поражения составляет 12,0%. Сходная картина (рисунок 9.) наблюдается в среде № 4, где при незначительной глубине площадь поражения пятнами составляет 10,7%.

Скорость коррозии (Ук) рассчитывают по формуле (Гуекоп , 1972):

V* = (пи - т2)/ 8 г, где V* - показатель коррозии массы, г/ (м "2-ч"'); Ш1- начальная масса образца, г; ш2 — масса образца после испытаний, г; 8 - площадь поверхности образца, м2; г - время испытаний, ч.

Защитную эффективность биопрепарата от общей коррозии (г%) определяли, согласно ГОСТ 9.506-87, по скорости коррозии (г/м"2-ч"') образцов в среде без биопрепарата (Ук0) и в той же среде содержащей биопрепарат для защиты от коррозии (Ук!) по формуле (Мудрецова-Висс, 1978):

100%

При расчёте скорости коррозии относительная ошибка измерений не превышала 3 %. Данные по результатам измерений отображены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты испытаний образцов стали

№ Коррозионная среда Время испытаний, г(ч) Площадь поверх верхности, 8(м2) Потери массы образца т 1- т 2. (г) Скорость коррозии V, г/м2-ч Эффективность Ъ (%)

1 №1 нефть - вода (контроль) 240 0,003 0,002 ± 0,0002 0,0103 ±0,0007 -

2 № 2 нефть — вода -О. ¿ези^ипсат 240 0,003 0,006 ± 0,0002 0,0311 ±0,0012 -

3 № 3 нефть - вода -О. (1с5и1/иг1сап.ч - бактериофаг 0(1и 48 - УГСХЛ 240 0,003 0,001 ±0,0001 0,0050 ± 0,0005 97,4

4 № 4 нефть — вода - £>. с1еьи1/иг '1сап8- бактериофаг Ос1г 57 - УГСХА 240 0,003 0,0011± 0,0001 0,0053 ± 0,0006 98,7

Рисунок 6 - Поверхность стали (а) и поперечный разрез образца (б) после коррозии в среде: нефть - вода х 100 (контроль)

Рисунок 7 - Поверхность стали (а) и поперечный разрез образца (б) после коррозии в среде: нефть - вода в присутствии бактерий вида £>. х 100, стрелкой отмечены

коррозионные углубления

Рисунок В - Поверхность стали (а) и поперечный разрез образца (б) после коррозии в среде: нефть - вода в присутствии бактерий вида й. ¿еяиуипсам и бактериофага 0<1и 48-УГСХАх 100

Рисунок 9 - Поверхность стали (а) и поперечный разрез образца (б) после коррозии в среде: нефть - вода в присутствии бактерий вида А ¿еви^ипсапв и бактериофага ХЗАг 57-УГСХАх 100

Согласно ГОСТ 9.506-87 реагенты, показавшие при испытаниях в водно -нефтяной эмульсии защитный эффект, не менее 90%, при испытаниях в водной части водно - нефтяной среды не менее 80% могут быть рекомендованы к стендовым испытаниям.

В результате проверки бактериофагов Оёи 48 - УГСХА и Бёг 57 - УГСХА на степень защиты металлических поверхностей было выявлено:

— поверхность насосно-компрессорных труб, используемых в нефтедобывающей промышленности, подвергается двум видам коррозии равномерной и неравномерной;

— введение бактериофага Бс1и 48 - УГСХА и Бс1г 57 - УГСХА в нефтеводную среду, содержащую СРБ, приводит к значительному снижению неравномерной коррозии на 97,4%. и 98,7 % соответственно;

— указанные бактериофаги подавляют активность СРБ вида й. е]е5и1/ипсап.

Выводы

1. Для ускоренной видовой идентификации бактерий рода £>а?н#Ьуг6га> предложена последовательность бактериологических тестов, включающих посевы на разработанные питательные среды СРБ № 32, СРБ № 33, СРБ № 36 модификации НИИЦБиМ, изучение тинкториальных свойств, реакции на сероводород, наличие дисульфовиридина, выявленние подвижности, наличие роста на лактате, цитрате и малате, отсутствие роста на сукцинате и ацетате, образование серебристо-белых колоний на фоне почернения агаризованной питательных среды в строгих анаэробных условиях;

2. Разработана тест - система для молекулярно-генетической идентификации £>. Ле$и1/иг1сап$ с применением метода ПЦР (подбор и дизайн праймеров, подбор концентрации и температуры отжига праймеров, оптимизация программы амплификации);

3. С целью получения искомого фага предложены методы индукции профага в бактериях О. с1ези1/иг'1сап5 путем воздействия УФ - излучения в режимах: длина волны 250 нм, мощность 60 Вт, расстояние до объекта 38 см, время экспозиции 10 мин., а также рентген излучения в режимах: расстояние до объекта 1 м, время экспозиции два периода по 1,6 е., суммарная доза 4,0 мЗв;

4. Выделены 2 культуры бактериофагов Бёг 2 - УГСХА и Ос1и 1 - УГСХА бактерий £>. с!ехи!/ипсат и изучены их основные биологические свойства (спектр литической активности 60 - 80%; титр бактериофагов составляет 10"9 и 10"8 по методу Аппельмана, и от 7x108 до 109 по методу Грациа);

5. Разработаны параметры изготовления биопрепарата на основе бактериофагов Ddr 57 - УГСХА и Ddu 48 - УГСХА, включающие: температуру культивирования 30 - 36 °С в течение 24 часов, оптимальное соотношение бактериофага и культуры 1:1, т.е. 0,2 мл фага х 0,2 мл индикаторной культуры;

6. Экспериментально доказана целесообразность использования биопрепаратов бактериофагов Ddu 48 - УГСХА и Ddr 57 - УГСХА сульфатредуцирующих бактерий для профилактики коррозии металла в режимах, рекомендуемых для данной обработки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Разработка параметров ПЦР для идентификации Desulfovibrio desulfuricans / H.H. Карамышева, Д.А. Васильев, A.M. Семёнов, [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2012. -№ 2 (18). - С. 45-49.

2. Карамышева, H.H. Культивирование сульфатредуцирующих бактерий на плотных средах / H.H. Карамышева, Д.А. Васильев, А.Г. Шестаков // Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии: Материалы III Международной научно-практической конференции молодых учёных Молодёжь и наука XXI века. - Ульяновск. - 2010. - Т. 3. - С. 30.

3. Подавление коррозии стали биопрепаратом бактериофага сульфатредуцирующих бактерий Desulfovibrio desulfuricans в условиях модели имитирующей эксплуатацию нефтепроводов / H.H. Карамышева, Д.А. Васильев, A.M. Семёнов [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2012.-№4(20).-С. 45-49.

4. Индикация профага бактериальной клетки бактерии Desulfovibrio desulfuricans методом электрофореза геномной ДНК / H.H. Карамышева, Д.А. Васильев, A.B. Мастиленко [и др.] // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: материалы междунар. науч. практ. конф. Ульяновск.-2012.-Т. 1.-С. 271.

5. Выделение профага бактерий Desulfovibrio desulfuricans методом индукции рентгеновским облучением / H.H. Карамышева, Д.А. Васильев, Ю.В. Пичугин [и др.] // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: материалы междунар. науч. практ. конф. Ульяновск. - 2012. - Т. 1. -С. 267.

Подписано в печать 14.01.2013. Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура тайме. Печать офсетная.

Усл. печ. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 159. 432072, Ульяновск, пр-кт Ленинского Комсомола, 51.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карамышева, Наталья Николаевна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Распространение бактерий Оет^отЪпо с1е5и1/иг1сат и их роль в природе

1.1.1. Таксономия бактерии Веьи^отЪгю йеъиЦипсат и краткая морфологическая характеристика.

1.1.2. Биохимические свойства ОеБи^оугЬгю <3ези1/игюат.

1.1.3. Физиология и экология Вези^омгЬгю с1е8и1/ипсат.

1.1.4. Современные методы индикации бактерий ВетЦоч&по <Ле8и^ипсат.

1.1.5. Биогенная сульфатредукция в нефтяных пластах

1.1.6. Влияние сульфатредуцирующих бактерий на степень коррозии металла.

1.1.7. Явление лизогении у сульфатредуцирующих бактерий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Штаммы бактерий

2.1.2. Питательные среды и реактивы.

2.1.3. Оборудование.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1. Выделение бактерий ВеьиЦоугЬНо йеъи^иНсат из объектов исследования.

2.2.1.1. Идентификация бактерий Ве$и1^1Ъгю. ¿ези^ипсат по культуральным свойствам.

2.2.1.2. Молекулярно-генетической идентификации бактерий Веяи^оу^по с1е8и1/ипсат с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.1.3. Выделение бактериофага £)&ш//оу/6г/о с1ези1/иг1сат методами индукции и изучение его основных биологических свойств.

2.2.1.4. Электрофорез ДНК фагов экстрагированных из штаммов бактерий Ое8и1/оу1Ьгю (Леъи^ыгхсат.

2.2.1.5. Отбор бактериофагов с заданными для целей исследования свойствами необходимыми для создания биопрепарата.

2.2.1.5.1. Определение активности фага по методу Аппельмана.

2.2.1.5.2. Морфология негативных колоний по методу агаровых слоев по Грациа.

2.2.1.5.3. Определение устойчивости бактериофага к нагреванию.

2.2.1.5.4. Определение чувтсвительности бактериофага/). с1е5и1/ипсат к хлороформу.

2.2.1.5.5. Определение спектра литической активности выделенных бактериофагов /).

2.2.1.5.6. Определение специфичности действий исследуемых бактериофагов бактерий И. с1е8и1/ипсат.

2.2.1.6. Разработка технологических параметров изготовления бактериофагового биопрепарата для использования в целях профилактики коррозии металла.

2.2.1.6.1. Температурные показатели культивирования бектериофага.

2.2.1.6.2. Количественные соотношения фага в культере при культивировании.

2.2.1.6.3. Оптимальное соотношение между временем пассажа и активностью фага.

2.2.1.7. Определение влияния биопрепарата бактериофагов бактерии йези^иНсат на степень коррозии металла.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение бактериофага Desulfovibrio desulfuricans и создание на его основе биопрепарата профилактики коррозии металлов в нефтяной промышленности"

Актуальность темы. Сульфатредуцирующие бактерии, в частности Desulfovibrio с1е8и1/ипсат являются достаточно распространённой физиологической группой, характеризующейся способностью к образованию сероводорода из сульфата. Наиболее значимыми процессами жизнедеятельности рода ОеБъй/оугЬгю являются: биоминерализациия, круговорот серы в природе и биокоррозиия металлов. Наибольший урон процесс биокоррозии, с участием Ве8и1/оу1Ьгю с1ези1/иг1сат наносит нефтедобывающей промышленности. Основная контаминация нефти микроорганизмами происходит в процессе закачки в пласт воды без соответствующей антибактериальной обработки [25]. В скважине создаются практически идеальные условия для развития анаэробных микроорганизмов: наличие пластовой воды, питательные вещества (содержащиеся в воде и остаточной нефти), оптимальная температура и отсутствие кислорода [41, 42]. Среди образующихся бактерий наибольшей агрессией по отношению к металлическим конструкциям обладают сульфатредуцирующие бактерии, которые являются продуцентами коррозионных агентов (органических кислот, ферментов, сероводорода) [2, 18, 20]. Реакция сероводорода с металлом приводит к образованию сульфида железа (БеЗ) и накоплению его на внутренней поверхности труб и другого оборудования [73, 74].

Активный рост сульфатредуцирующих бактерий приводит к резкому увеличению скорости коррозии (примерно в 24 раза), а наличие застойных зон к добавочному усилению активности сульфатредуцирующих бактерий, то есть увеличению скорости локальной коррозии [7]. В настоящее время для борьбы с сульфатредуцирующими бактериями в нефтяных пластах используются ингибиторы. В основном это бактерициды, относящиеся к классам неорганических и органических соединений. Однако этот метод оказывает негативное влияние на качество нефти [10, 69]. Поэтому актуальной является задача создания бактериофагового биопрепарата, позволяющего обеспечивать уменьшение численности сульфатредуцирующих бактерий и понижение степени их коррозионного воздействия на металл нефтедобывающего оборудования с одновременным сохранением качества добываемой нефти.

Цель работы - Создание биопрепарата на основе бактериофагов бактерий Ое8и1/оуЛгю с1е8и1/ипсат для профилактики коррозии металла.

Задачи исследования:

1. Разработать схемы ускоренной идентификации бактерий рода О. с1е8и1/ипсат выделенных из вод, используемых при технологических процессах добычи нефти.

2.Разработка тест-системы для молекулярно-генетической идентификации В.с1е8и1/иНсат с применением метода ПЦР (подбор и дизайн праймеров, подбор концентрации и температуры отжига праймеров, оптимизация программы амплификации).

3. Выделить бактериофаги £>. с1е8и1/ипсат и изучить их биологические свойства.

4. Отобрать бактериофаги со свойствами необходимыми для создания биопрепарата, лизирующего сульфатредуцирующие бактерии в природных условиях.

5. Разработать методику изготовления бактериофагового биопрепарата для использования в целях предупреждения коррозии металла.

6. Изучить эффективность воздействия биопрепарата бактериофага на показатели коррозионного поражения металла.

Научная новизна работы. Разработаны схемы ускоренной бактериологической идентификации бактерий рода £). йези^ипсат. -Предложенная и апробированная система праймеров доказала высокую специфичность и чувствительность метода ПЦР для индикации и идентификации бактерий В. с1е8и1/ипсат. - Получены бактериофаги £). с1е8и1/ипсат с широким спектром литической активности. - Разработана методика конструирования бактериофагового биопрепарата с высокой эффективностью при подавлении коррозионной активности бактерий П. йет^ипсат. - Разработана лабораторная схема тестирования применения защитных действий фагов в отношении коррозийной активности И. с1е8и1/ипсат в водно - нефтяной среде.

Практическая ценность работы. Оптимизированные параметры изготовления биопрепарата на основе выделенных фагов бактерии £>. с1ет\$иг1сат могут быть использованы в производстве биотехнологических средств защиты металла от коррозии на нефтедобывающих и нефтеперерабатывающих предприятиях.

Разработанная лабораторная схема тестирования защитных действий фагов в отношении коррозийной активности £>. с1е8и1/ипсат в водно -нефтяной среде может быть использована при производстве соответствующих биопрепаратов.

Модифицированная среда, основанная на добавлении в неё дополнительного источника питания, и позволяющая сократить время идентификации бактерий £). с1е8и1/ипсат до 72 часов, может быть рекомендована для внедрения в лабораторную практику нефтедобывающих и нефтехимических производств.

Разработанная тест-система молекулярно-генетической идентификации П. <Ае8и1/ипсат с применением метода ПЦР (подбор и дизайн праймеров, подбор концентрации и температуры отжига праймеров, оптимизация программы амплификации) позволяет использовать её для идентификации бактерий в лабораторной практике нефтяной промышленности.

По материалам диссертационной работы предложены и утверждены ректором Ульяновской ГСХА им. А.П. Столыпина «Методические рекомендации по испытанию биопрепарата на основе бактериофагов О. йези^иггсат для защиты металла от биокоррозии в лабораторных условиях» и «Методические рекомендации по изготовлению и контролю биопрепарата на основе бактериофагов О. йезиЦипсат для защиты металла от биокоррозии».

Методические рекомендации используются в учебном процессе при чтении лекций по «Материаловедению и технологии машиностроения» Ульяновской ГСХА им. А.П. Столыпина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложенная бактериологическая схема позволяет сократить сроки видовой идентификации бактерий рода Ое$и1/оУ1Ьгю из вод (используемых в нефтяных технологических процессах) и объектов внешней среды с 96 до 72 часов;

2. Разработанная тест-система для молекулярно-генетической идентификации £). йеьи^ипсат, основанная на использовании метода ПЦР, позволяет проводить дифференцировку штаммов О^езШ/ипсат зис18р. с1е8и1/ипсат на основе наличия ампликонов, размером 224 пар нуклеотидов;

3. Предложенные схемы индукции профага в бактериях £). с1е8и1/ипсат путем воздействия УФ и рентген излучения позволяют получить штаммы бактериофагов с широким спектром литической активности;

4. Разработанный биопрепарат на основе бактериофагов Бёг 57-УГСХА и Оёи 4 8-УГСХА приводит к значительному снижению неравномерной коррозии металла на 97,4%. и 98,7 % соответственно.

Апробация работы:

Материалы диссертационной работы были представлены на: Международной научно - практической конференции Ульяновской ГСХА им. А.П. Столыпина (Ульяновск, 2011); (Ульяновск, 2012); Ш-й Международной научно - практической конференции молодых учёных «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П. А. Столыпина».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных литературных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на 105 страницах, включают 14 таблиц и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 165 наименования, в том числе - 88 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Карамышева, Наталья Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Предложена последовательность тестов для ускоренной видовой идентификации при выделении бактерий рода Desulfovibrio из вод, используемых в нефтедобывающих технологических процессах.

2. Разработана тест-система для молекулярно-генетической идентификации D.desulfuricans с применением метода ПЦР (подбор и дизайн праймеров, подбор концентрации и температуры отжига праймеров, оптимизация программы амплификации).

3. Создана технология индукции профага в бактериях D. desulfuricans путем воздействия УФ-излучения в режимах: длина волны 250 нм, мощность 60 Ватт, расстояние до объекта 38 см, время экспозиции 10 мин., а также рентген излучения в режимах: длина волны нм, расстояние до объекта 1 м, время экспозиции два периода по 1,6 сек., суммарная доза 4,0 мЗв.

4. Выделены 2 культуры бактериофагов Ddr 2-УГСХА и Ddu 1-УГСХА бактерий D. desulfuricans и изучены их необходимые биологические свойства.

5. Оптимизированы параметры изготовления биопрепарата на основе бактериофагов Ddr 57-УГСХА и Ddu 48-УГСХА (спектр литической

9 8 активности 60 -80%; титр бактериофагов составляет 10" и 10" по методу о О

Аппельмана, и от 7x10 до 10 по методу Грациа) для использования в нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности.

6. Доказана целесообразность использования биопрепаратов бактериофагов Ddu 48-УГСХА и Ddr 57-УГСХА сульфатредуцирующих бактерий для профилактики коррозии металла.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Предложена технология производства биопрепарата на основе выделенного фага бактерии ОезиЦотЪгю (ЛезиЦиНсат, который предлагается для использования его в нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности для профилактики коррозии металла в водно - нефтяной среде.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карамышева, Наталья Николаевна, Ульяновск

1. Аббасов В.М. Защита стали от сероводородной коррозии с применением бактерицидов / В.М. Аббасов, И.А. Мамедов, Е.Ш. Абдуллаев // М.: Защита металлов. 1995. Т.31. №2. С.206 208.

2. Агаев Н.М. Влияние сульфатвосстанавливающих бактерий накоррозию стали и методы защиты / Н.М. Агаев, И.А. Мамедов, P.P.

3. Мамедова и др. // М.: Защита металлов. 1977. Т. 13 №4. С. 445 448.

4. Агаев Н.М. Влияние УФ облучения на жизнедеятельность сульфатвосстанавливающих бактерий / Н.М. Агаев, А.Е. Смородин, М.М. Гусейнов// М.: Защита металлов. 1985. Т.21. №1. С. 126

5. Акшенцева А.П. Металлография коррозионностойких сталей и сплавов / А.П. Акшенцева // М.: Металлургия. 1991. 288 с.

6. Андреюк Е.И. Микробная коррозия и ее возбудители / Е.И. Андреюк // Киев: Наук, думка. 1987. 287 с.

7. Антоновская Н.С. Распределение сульфатредуцирующих бактерий в грунте вблизи газопровода / М.С. Антоновская, И.А. Козлова, Е.И. Андреюк // Микробиология журнал. 1985. Т. 47. №2. С.93 94.

8. Антоновская Н.С. Коррозия малоуглеродистой стали в культуре Desulfovibrio desulfuricans / Н.С. Антоновская, И.А. Козлова, Е.И. Андреюк // Микробиологический журнал. 1985. Т. 47. Вып. 1. С. 13 -17.

9. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев // М.: Медгиз. 1962. 179 с.

10. Багаева Т.В. Способность сульфатвосстанавливающих бактерий различных таксономических групп к синтезу внеклеточных углеводородов / Т.В. Багаева // Микробиология. 1997. Т. 66. С. 796 -799.

11. Белоглазов С. М. Микробиологическая коррозия нержавеющей сталимартенситного класса в водносолевой среде с СРБ / С. М. Белоглазов, Е.М. Кондрашева.// М.: Практика противокоррозионной защиты. 1999. №3. С. 28-34.

12. Беляева М. И. Явление лизогении у сульфатвосстанавливающих бактерий / М. И. Беляева, Ф. Г. Студеникина, И. Ю.Карпилова, А. 3. Горейшна // М.: Сознефтехимпром. 2007. С. 63.

13. Возная Н.Ф. Химия воды и микробиология/ Н.Ф. Возная / М.: Высшая школа. 1979. С. 340.

14. Воинцева И.И. Борьба с микроорганизмами: современный этап / И.И. Воинцева, Г.М. Цейтлин, О.Н. Скорохожова // М.: Наука в России. 2003. № 6. С. 18-23.

15. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов. Основы бактериофагии/ И.М.Габрилович // Минск. 1973. 56 с.

16. Герасименко A.A. Исследование микробной коррозии металлоконструкций нефтедобывающей промышленности / A.A. Герасименко, Г.В. Матюша, С.Н. Иванов, Ю. В. Плаксин // М.: Защита металлов. 1998. Т.34. №1. С.51 58.

17. Герхарда Ф. Общая микробиология/ Ф. Герхарда // М.: Мир. 1984. Т.З -С. 356-358.

18. Гоник A.A. Динамика и предупреждение нарастания коррозийности сульфатсодержащей пластовой жидкости в ходе разработки нефтяных месторождений / A.A. Гоник // М.: Защита металлов. 1998. Т.34. №6. С.656 600.

19. Гориленко H.H. Влияние железа на развитие сульфатредуцирующих бактерий в морской воде. / H.H. Гориленко // В кн.: Коррозия и защита металлов. Калининград. 1983. Вып.6. С.138 144.

20. Гориленко H.H. Влияние физикохимических факторов на биокоррозию стали в присутствии накопительной культуры сульфатвосстанавливающих бактерий/ H.H. Гориленко // Дис. канд. тех. наук. М.: ГАНГ им. И.М. Губкина. 1994. 178 с.

21. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. 1961. 297 с.

22. Давыдова М.Н. Анаэробная трансформация нефти под действием экстрактов клеток Desulfovibrio desulfuricans / М.Н. Давыдова, Ф.К. Мухитова, P.P. Ибатуллин // Микробиология. 1998. Т. 67. С. 202 207.

23. Йофа З.А. Влияние сероводорода, ингибитора и pH среды на скорость электрохимических реакций и коррозию железа / З.А. Йофа, Ф. JI. Кам // М.: Защита металлов. 1974. Т. 10. №3. С.ЗОО 303.

24. Йофа З.А. О механизме действия сероводорода и ингибиторов на коррозию железа в кислых растворах / З.А. Иофа // М.: Защита металлов. 1980. Т. 16. №3. С. 295 300.

25. Каменщиков Ф.А Борьба с сульфатвосстанавливающими бактериями на нефтяных месторождениях / Ф.А. Каменщиков, H.JI. Черных// ИКИ . 2007. 412 с.

26. Каневская И.Г. Биологическое повреждение промышленных материалов / И.Г. Каневская // Л.: Наука. 1984. 231 с.

27. Карначук О.В Процесс бактериальной сульфатредукции и его роль в разложении органического вещества в осадках прибрежных районов Японского моря / О.В. Карначук, Б.Б. Намсараев, М.В. Иванов, И.А. Борзенков // Микробиология. 1990. Т.59. Вып.1. С. 140 147.

28. Кашеварова Н.М. Оценка численности сульфатредуцирующих и метанобразующих бактерий в донных отложениях водоема охладителя Белорусской АЭС // Конф. молодых ученых и специалистов Экология98: Тез. докл. Архангельск. 1998. С.81.

29. Квасников Е.И. Биология микроорганизмов, ассимилирующих газообразные углеводороды / Е.И. Квасников, Ю.Р. Малашенко и В.А.

30. Романовская // Успехи микробиологии 1974. Т. 9. С. 125 152.

31. Кондратьева E.H. Автотрофные прокариоты / E.H. Кондратьева // М.: МГУ. 1996. 312 с.

32. Кондратьева E.H. Хемолитотрофы и метилотрофы / E.H. Кондратьева / М.: МГУ. 1983. 172 с.

33. Кузнецов С. И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность / С.И. Кузнецов // Л: Наука. 1970. 440 с.

34. Кузнецов С.И. Микробиологические процессы круговорота углерода и азота в озерах / С.И. Кузнецов, А.И. Саралов, Т.Н. Назина // М.: Наука. 1985. 129 с.

35. Кузнецов С.И. Роль микроорганизмов в круговороте веществ в озерах/ С.И. Кузнецов / Л.: Наука. 1970. 205с.

36. Кузнецов Ю.И. О защите стали в сероводородсодержащих средах летучими ингибиторами / Ю.И. Кузнецов, Р.К. Вагапов // М.: Защита металлов. 2000. Т.36. №5. С. 520 524.

37. Липович Р.Н. Методы борьбы с деятельностью СВБ и микробиологической коррозией /Липович Р.Н.,. Асфандияров Ф.А.// В кн.: Особенности заражения нефтяных пластов микроорганизмами. М.: ВНИИОЭНГ. 1980. С. 96 102.

38. Лосева Р.П., Распределение серосодержащих веществ в водоемеприемнике сточных вод целлюлознобумажного комбината/ Р.П. Лосева Н.И. Хотинович // Проблемы экологии Прибайкалья. Иркутск. 1988. С.40.

39. Митяшина С.Ю. Изменение цитохромного состава клеток Desulfovibrio desulfuricans под влиянием окиси углерода / С.Ю.

40. Митяшина, М.Н. Давыдова // Микробиология. 1996. Т.65. №1. С.140 -141.

41. МудрецоваВисс К.А. Микробиология, санитария и гигиена / К.А. МудрецоваВисс // М.: Деловая литература. 2001. 378 с.

42. Мунбаева О.Т. Микрофлора подземных вод нефтегазоносного Мангышлака / О.Т. Мунбаева, В.Б. Колпаков // Микробиология. 1975. Т. Вып.2. С. 321 -324.

43. Назина Т.Н. Биологическое и метаболическое разнообразие микроорганизмов нефтяных месторождений / Т.Н. Назина, С.С. Беляев // Труды Института микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН. М.: Наука. 2004. Т. XII. С. 289 316.

44. Назина Т.Н. Микробиологическая и геохимическая характеристика карбонатных нефтяных коллекторов Татарии/ Т.Н. Назина, А.Е. Иванова, B.C. Ивойлов, Ю.М. Миллер, P.P. Иватуллин, С.С. Беляев, М.В. Иванов // Микробиология. 1998. №5. С. 694 700.

45. Назина Т.Н. Фиксация молекулярного азота сульфатвосстанавливающими бактериями из нефтяных пластов/ Т.Н. Назина, Е.П. Розанова, Т.А. Калининская // Микробиология. 1979. Т. 48. N. 1.С. 133 136.

46. Назина Т.Н. Распространение сульфат и железоредуцирующих бактерий / Т.Н. Назина // Юбилейный сборник Института микробиологии им.С.Н. Виноградского. М.: Наука. 2004. Т. XII. С. 289 -297.

47. Низамов K.P. Борьба с коррозией нефтепромыслового оборудования в условиях бактериального заражения / K.P. Низамов, Р.Н. Липович, Ф.А. Асфандияров, A.A. Гоник // М.: Нефтяное хозяйство. 1978. №4. С 40 -42.

48. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А. Остерман // М.: Наука. 1983. 304с.

49. Пиневич A.B. Микробиология биология прокариотов / А. В. Пиневич // Изд. С Петербургского университета. 2007. Т.2 С.80 258.

50. Питрюк A.B. Различие в ионной специфичности синтеза АТФ у "экстремально алкалофильных сульфатредуцирующих и ацетогенных бактерий/ A.B. Питрюк, М.А. Пушева // Микробиология. 2001. №4. С. 459 464.

51. Работнова И.Л. Роль физикохимических условий (pH и Eh) в жизнедеятельности микроорганизмов/ И.Л. Работнова // М.: Издво АН СССР. 1957. 275 с.

52. Радкевич А.И. Коррозионное растрескивание мартенситных нержавеющих сталей в сероводородсодержащих средах / А.И. Радкевич, В.П. Коваль, Т.Н.Каличак // М.: Коррозия и защита в нефтегазовой промышленности. 1974. №11. С. 3 5.

53. Раутенштейн Я. И. Микробиология / Я. И. Раутенштейн, Э. С. Хавина, Н. Я. Соловьева // М.: Наука. 1978. Т. 1. С. 41 42

54. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени /Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, А.М. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов// М.: Бином. Лаборатория знаний. 2009.

55. Резяпова И.В. Мониторинг биообразований оборотного водоснабжения нефтеперерабатывающих заводов / И.В. Резяпова, H.H. Силищев, Р.Р.Хазипов, Р.Я. Нучаев// Уфа: Башкирский химический журнал. 1998 Т. 4. С. 62-63.

56. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике/И.П. Ревенко//Киев: Урожай. 1978. 87 с.

57. Розанова Е. П. Успехи микробиологии / Е. П. Розанова / М.: Наука. 1978. Т. 13. С. 164.

58. Розанова Е.П. Возбудители биогенной сульфатредукции / Е.П. Розанова, Кузнецова Е.С.//М.: Наука. 1980. С. 188.

59. Розанова Е.П. Закономерности развития сульфатредукции в заводняемом карбонатном нефтяном коллекторе / Е.П. Розанова, В.Н.

60. Быков, A.JI. Балдина.// Микробиология. 1973. Т. XI1. С.347 - 353.

61. Розанова Е.П. Метаболизм низших спиртов, ацетата и бикарбоната в заводняемых нефтяных пластах / Е.П. Розанова, И.А. Борзенков, С.С. Беляев, М.В. Иванов //Микробиология. 1993. Т.62. С. 574 582.

62. Розанова Е.П. Микроорганизмы в тепловых сетях и внутренняя коррозия стальных трубопроводов / Е.П. Розанова, Г.А. Дубинина, Е.В. Лебедева и др. // Микробиология. 2003. Т. 72. №2. С. 112 220.

63. Розанова Е.П. Микрофлора нефтяных месторождений / Е.П. Розанова, С.И. Кузнецов // М.: Наука. 1974. С. 156 198.

64. Розанова Е.П. Распространение сульфатвосстанавливающих бактерий в трубопроводах тепловой сети и причины появления в воде сероводорода / Е.П. Розанова, Л.А. Ентальцева // Микробиология. 1999. Т. 68. №1. С. 100- 106.

65. Розанова Е.П., Сульфатвосстанавливающие бактерии (систематика и метаболизм) / Е.П. Розанова, Т.Н. Назина // Успехи микробиологии. М.: Наука. 2009. С. 232.

66. Розанова Е.П. Методы культивирования и идентификации анаэробных бактерий, восстанавливающих серу и ее окисленные соединения// Теоретические и методические основы изучения анаэробных организмов. Пущино. 1978. С. 123 136.

67. Розанова Е.П. Новые данные о сульфатвосстанавливающих и метанобразующих бактериях. Успехи микробиологии. М.: Наука. 1978. С. 164- 187.

68. Розанова Е.П. Микробиологические процессы и коррозия металлического оборудования в заводняемом нефтяном пласте/ Е.П. Розанова, Н.А Мехтиева // Микробиология. 1979. № 5. С.860 867.

69. Романенко В.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов / В.И. Романенко, С.И. Кузнецов // Л.: Наука. 1974. С.86.

70. Рубенчик Л.М. Сульфатвосстанавливающие бактерии / Л.М. Рубенчик /Киев: АН СССР. 1947.carbon dioxide levels / G.J. (Ed.) MacDonald // Ballinger. Cambridge. Mass. USA. 1982. P. 252.

71. Martens C.S. Berner Methane production in the interstitial waters of sulfatedepleted marine sediments / C.S. Martens and R.A. Berner // Science. 1974. V. 185. P. 167- 169.

72. Miettinen I.T. Phosphorus and bacterial growth in drinking water / I.T.Miettinen, T.Vartiainen, P.J. Martikainen // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 63 P. 242-245.

73. Miller J.D.A. Infrared spectra of some sulphatereducing bacteria / J.D.A. Miller, G.H. Booth, R.M Paisley, A.M. Saleh // J. Gen. Microbiol 11. 1966. T. 4. P. 83 87.

74. Morris W. Foster Race, Ethnicity, and Genomics: Social Classifications as Proxies of Biological Heterogeneity Genome Res / W.Morris and. R. Richard // Microbiol. 2002. V. 12. P. 844 850.

75. Naguib M. Overal metabolic regulations in cultures of the obligate methaneoxidizing strain M102 Microbial growth on Ci compounds / M.Naguib //. Proc.Int.Sympos. Tokyo. 1975. P. 203-212.

76. Oberhoter T.R. J.Clin Microbiol / T.R. Oberhoter // Microbiol.2008. V.7. P. 312-313.

77. Phillips L.E. Enrichment and characterisation of sulfatereducing bacteria from sands tone rock cores from the UK continental shelf / L.E. Phillips, M. M. LapprSeatt //FEMS Microbiology. 1997. N. 374. P.415 424.

78. Postgate J.R. The sulfatereducing bacteria / J.R. Postgate // Cambridge university Press.Cambridge. Ingland. 1979. 151 p.

79. Postgate J.R. Classification of Desulfovibrio species the now sporulating sulfatereducing bacteria / J.R. Postgate, L.L. Campbell // Bacteriol. Revs. 1966. V.30.N. 4. P.728 738.

80. Postgate J.R., Nitrogen fixation by Desulfovibrio Nitrogen and sulfur cycles: 42nd Symp./ J.R. Postgate, M. Kent Helen, L. Robson Robert // Soc. Gen. Microbiol. South Ampton Jan. Cambridge. 1988. P.457 471.

81. Sass H. Isolation of sulfatereducing bacteria from the terrestrial deep subsurface and description of Desulfovibrio cavernae sp. no v./ H. Sass, H. Cypionka. // System. Appl. Microbiol. 2004. V. 27. P.541 548.

82. Sorokin Yu.I.On the carbon and sulphurmetalbolism in the meromictic Lake Faro (Sicily) / Yu.I Sorokin, N. Donato // Hydrobiologia. 1975. No. 47. P. 241 -252.

83. So C.M. Isolation and characterization of a sulfatereducing bacterium that anaerobically degrades alkanes / C.M So, L.Y. Young // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. P. 969 976.

84. Thauer P.K. Energy Conservation in chemotropic Anaerobic Bacteria / P.K. Thauer, K.lungerman, K. Decher // Bact. Rev., Mar. 1977. P. 100 180.

85. Trinkerl M. Desulfovibrio termitidis sp. nov. a carbony drate degradincs sulfatereducing bacterium from the : hindgut of a termite / M. Trinkerl, A. Breuning, R. Shauder, H. Konig // Syst. and Appl: Microbiol. 1990. V. 13. N. 4. P. 372-377.

86. Wagner M. Functional marker genes for identification of sulfatereducing prokaryotes / M. Wagner, A. Loy, M. Klein, N. Lee, N. B. Ramsing, D.A. Stahl, M.W Friedrich // Methods Enzymol. 2005. V.397. P. 469 89.

87. Wagner M. Methods Enzymol. Functional marker genes for identification of sulfatereducing prokaryotes / M. Wagner, A. Loy, M. Klein. N. Lee // Ramsing NB. Stahl DA. Friedrich MW! 2005. V. 89. P. 397 469.

88. Walch M. Microbiological influences on Marine Corrosion / M.Walch // Technology. August. 1999. P.31 -34.

89. Wawer C. Genetic diversity of Desulfovibrio spp. in environmental samples analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis of NiFe. hydrogenase gene fragments / C. Wawer and G. Muyzer // Appl. Environ. Microbiol. June. 1995. V. 61. P. 203.

90. Widdel F Bergey's manuel of systematic bacteriology / F. Widdel, N. Pfening // Ed. N.A.Krieg. Baltimore; L.: Williams and Wilkins. 1984. V.l. P. 663 -679.

91. Widdel F. Studies on dissimilatory sulfatereducing bacteria that decompose fatty acids II. Incomplet oxidation of propionate by Desulfobulbus propionics gen. nov. sp. nov / F Widdel, N. Pfening // Archives of Microbiology. 1982. V. 131. P. 360-365.

92. Widdel F. Gramnegative mesophilic sulfatereducing bacteria / F. Widdel F. Bak // The Prokaryotes. 2gd edn. 1992. Vol.4. P. 400 .

93. Zellner G. Desulfovibrio simpex spec. nov. a new sulfate reducing bacterium from a sour whey digester / G. Zellner, P. Messner, M. Kneiffl, J. Winter // Archives Microbiology. 1989. 152. P.329 334.

94. Zo Bell C.E. Ecology of sulfste reducing bacteria / C.E. Zo Bell // Producer's Monthly. 1958. V. 22. P. 22 29.