Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика почвенных микроорганизмов, трансформирующих ароматические амиды и нитрилы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика почвенных микроорганизмов, трансформирующих ароматические амиды и нитрилы"

ЛУГОВСКАЯ Надежда Петровна

На правах рукописи

,/Г

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ

03.02.03. Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

28 ОКТ 2015

Пермь-2015

005563748

005563748

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Максимов Александр Юрьевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, начальник отделения препаратов бактериотерапии филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» Несчисляев Валерий Александрович

доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Немцева Наталия Вячеславовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049,

г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

Защита состоится "26" ноября 2015 г. в 1000 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342) 280 92 11

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и

микроорганизмов УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

генетики

Автореферат разослан

2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время одним из важных направлений микробиологических исследований является поиск активных штаммов для экологически чистых биокаталитических процессов (Patel, 2005; Кузнецов, 2006). Ароматические амиды и нитрилы являются сложными субстратами для микроорганизмов (Нестеров, 1991). Это разнообразные и, как правило, токсичные и устойчивые к биодеградации и биотрансформации неприродные соединения, которые используются как мономеры и полупродукты для производства полимеров и красителей, взрывчатых веществ и компонентов ракетного топлива, а также в качестве детергентов, растворителей, пестицидов, лекарственных веществ (Хоменков, 2008). Как известно, чем сложнее структура молекулы, тем меньшее число видов или даже штаммов микроорганизмов способно к ее утилизации (Карасевич, 1982; Смирнов, 2002). Источниками азотсодержащих ароматических соединений являются также нефтяная, угольная, деревообрабатывающая промышленность, выхлопы автотранспорта (Форстер, Вейз 1990).

В живом мире каждая химическая реакция катализируется своим ферментом (Quax, 2006). Вследствие универсальности и стабильности, одинаковые ферменты могут быть использованы в совершенно разных частях промышленных процессов (Brady et al., 2006). Часто ферменты демонстрируют высокий уровень энантиоселективности (Vink et al., 2006; Gao et al., 2015), что позволяет использовать их в фармацевтической промышленности для биокаталитического синтеза компонентов и предшественников лекарственных препаратов (Alcántara et al., 2000; Parshikov et al., 2014). Такие реакции протекают при нормальной температуре и давлении, что позволяет избежать более экстремальных условий, которые в свою очередь могут привести к проблемам изомеризации, рацемизации и реорганизации (Patel, 2005; Wang, 2005; Yeom et al., 2007). Биокаталитические процессы, как правило, осуществляется в водном растворе. Это позволяет избежать использования экологически вредных веществ, используемых в химических процессах (Patel, 2000; D'Arrigo, 2000). Ещё одно важное преимущество биокатализа перед химическим синтезом заключается в том, что в результате биотрансформации рацемического субстрата можно получить оптически чистый продукт.

Арилпропионамиды и арилпропионитрилы представляют интерес тем, что могут быть использованы в качестве субстратов для стереоселективных нитрилконвертирующих ферментов, потому что кислотные продукты, известные также как профены, представляют важный класс противоспалительных препаратов с активным (8)-изомером (Sonawane et al., 1992; Snell, Colby, 1999; Graham, Williams, 2004). Также перспективным направлением использования биокатализа может быть получение интермедиатов синтеза фторхинолонов (таких как левофлоксацин), одним из которых является (S)- 3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2//-[1,4]бензоксазин (Miyadera, Imura, 1999; Чулаков и др., 2015).

В связи с этим поиск активных культур бактерий-биотрансформантов и изучение их ферментных систем, разработка на их основе биокаталитических

технологий, являются перспективными для микробиологии и биотехнологии (Parshikov et al, 2014).

Цель настоящего исследования - выделение и характеристика почвенных микроорганизмов, активно метаболизирующих ароматические амиды и нитрилы.

Основные задачи исследования:

1) Исследовать биологическое разнообразие гетеротрофных аэробных микроорганизмов почв таёжной и степной зоны России и донных отложений.

2) Выделить и идентифицировать культуры микроорганизмов, метаболизирующих ароматические амиды и нитрилы. Выявить тип метаболизма нитрилов (нитрилазный и/или нитрилгидратазно-амидазный).

3) Исследовать способность активных изолятов к метаболизму ароматических амидов и нитрилов.

4) Определить способность изолятов к энантиоселекгивной биотрансформации амида ибупрофена и Д-ацсгил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2Я-[ 1,4]бензоксазина.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ содержания культивируемых гетеротрофных бактерий и изолятов, трансформирующих ароматические амиды и нитрилы, установлены их соотношения в почвах таёжной и степной зоны России и в донных отложениях. Обнаружено, что наибольшим количеством амид- и нитрилтрансформирующих бактерий отличаются пробы солончака, отобранные на территории Троицкого заказника Челябинской области, образцы из гумусового переходного горизонта дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (Краснокамский р-н Пермкого края).

Установлено преобладание амидтрансформирующих бактерий в верхних слоях увлажненных почв, связанное с высоким содержанием в них аэробных грамотрицательных бактерий. Показано преобладание среди прокариот, активно трансформирующих ароматические амидосоединения, представителей актинобактерий R. erythropolis, R. rhodochrous, Arthrobecter spp., а также протеобактерий Р. fluorescens, Р. pulida, других представителей рода Pseudomonas и бактерий родов Agrobacterium, Acinetobacter.

Установлено, что почвенные плесневые грибы, выделяемые на среде с амидами и нитрилами, проявляют высокую бензонитрилазную активность и способны к полной утилизации этих соединений. Выделен штамм Fusarium oxysporum, обладающий высокой нитрилазной активностью.

Определены оптимальные условия, обеспечивающие эффективную биотрансформацию амида ибупрофена с выходом 5-энантиомера более 95%. Установлено, что максимальный выход ибупрофена наблюдается при pH 8,3.

Впервые селекционированы культуры актинобактерий рода Rhodococcus, катализирующие реакцию биотрансформации jV-ацетильных производных бензоксазина (Дг-ацетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2Я-[1,4]бензоксазина) с энантиомерным избытком от 98 до 100%.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты диссертационной работы расширяют представления о процессах биотрансформации ароматических амидов и нитрилов. Исследовано биологическое разнообразие микроорганизмов естественных почв таёжной и

степной зоны России (поверхностно-подзолистая супесчаная, дерново-карбонатная, дерново-луговая глеевая почвы, солодь, каштановая почва степной зоны, солончак, грунт вблизи солеотвала, донные отложения рек Ива и Камы и биологических очистных сооружений), метаболизирующих амиды и нитрилы. Селекционированы и исследованы новые культуры бактерий - трансформанты ароматических амидов и нитрилов, перспективные для синтеза практически значимых соединений - составляющих и предшественников фармакологических препаратов (ибупрофена, левофлоксацина).

Результаты исследований используются в лекционных курсах «Промышленная микробиология», «Введение в биотехнологию» для студентов Пермского государственного национального исследовательского университета.

Основные положения, вымосимые на защиту:

1. Амидтрансформирующие бактерии составляют до 48% от общего числа культивируемых аэробных гетеротрофных почвенных микроорганизмов. Среди активных культур преобладают представители бактерий родов Rhodococcus, Pseudomonas, Agrobacterium, Acinetobacter и грибов рода Fusarium.

2. Культуры почвенных плесневых грибов, выделяемые на среде с амидами и нитрилами, проявляют высокую бензонитрилазную активность и способны к полной утилизации бензонитрила и структурно близких соединений.

3. Среди почвенных актинобактерий, способных к биотрансформации ароматических амидов, преобладают штаммы, содержащие гены амидаз, гомологичные последовательности R. rhodochrous N-774, и гены Fe- зависимой нитрилгидратазы.

4. Штаммы актинобактерий, активно гидролизующие ароматические амиды, обладают способностью к энантиоселективной трансформации этих соединений с высоким энантиомерным избытком.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на V молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2009), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2009" (Пермь, 2009), XIII ежегодном симпозиуме студентов-биологов Европы «Symbiose 2009» (Казань, 2009), VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2010), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2010" (Н. Новгород, 2010), VI молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2010), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2011" (Воронеж, 2011), II Всероссийской школе-конференции «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2011), III международной конференции «Техническая химия. От теории к практике» (Пермь, 2012).

Результаты проведенных исследований опубликованы в 16 научных работах: 5 статей, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 11 тезисов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и 24 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 147 наименований работ, в том числе 38 отечественных и 109 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0 406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 гг.)» и гранта поддержки молодых ученых УрО РАН.

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора и исследований в сотрудничестве при личном участии автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Объектом исследования являлись почвенные микроорганизмы таёжной и степной зоны России, имеющие нитрилконвертирующую ферментативную активность. Также использовали штаммы из коллекции лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН (R. rhodochrous 1185, R. erythropolis 416, 417, В15). Культуры почвенных плесневых грибов выделены и исследованы совместно с сотрудниками НИЛ «Бактерицид» ЕНИ ПГНИУ.

Образцы почв естественной среды Пермского края, Челябинской и Саратовской областей были взяты в качестве материала исследования. Исследовательской группой кафедры физиологии растений и микроорганизмов ПГНИУ под руководством д.б.н. О.З. Еремченко проведены описание и анализ образцов почв с повышенным засолением (солончак, солодь, грунт в 2 м от солеотвала СКРУ-2).

Среды и субстраты для культивирования. Для культивирования бактерий использовали минеральную солевую среду следующего состава (г/л): КН2РО4 -1.0; К2НРО4ХЗН2О - 1.6; NaCl - 0.5; MgS04*7H20 - 0.5; CaCh - 0.005; C0CI2X6H2O - 0.01; FeS04x7H20 - 0.005; pH 7.2 ± 0.2 (Максимов и др., 2003). Агаризованную среду получали добавлением бакто-агара (Sigma) до конечной концентрации 1,5 %.

Источником углерода служила глюкоза в конечной концентрации 0.1 %. В качестве субстратов также использовали 10 мМ ацетонитрил, ацетамид или пропионамид, которые служили единственными источниками азота. Ростовые субстраты асептически добавляли до конечной концентрации в

автоклавированную и охлажденную до 25°С среду. Чистота культур контролировалась высевом на агаризованную среду LB (Sigma).

Селекция штаммов-деструкторов ароматических амидов и нитрилов. Штаммы выделяли методом прямого высева (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Навеску почвы (1,0 г) суспендировали в 100 мл стерильного фосфатного буфера, оставляли при температуре 28°С при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об/мин на I час. На 3-7 сутки роста среди образовавшихся колоний наиболее крупные, а также морфологически различающиеся переносили на чашки Петри со свежей селективной средой. Очищенную культуру пересевали в колбы с жидкой средой аналогичного состава и культивировали в течение 5-7 суток. Исследовали способность изолятов к росту на токсичных субстратах, таких как бензамид и бензонитрил (конечная концентрация 10 мМ).

Определение ростовых характеристик. Плотность культуры оценивали по изменению оптической плотности суспензии клеток при >.=540 нм с учетом разведения, измеряемой на фотоэлектроколориметре КФК-3 либо на спектрофотометре Ultraspec 3300 pro с использованием кварцевой 1 см кюветы.

Определение ферментативной активности. Нитрилгидратазную активность культуры определяли по изменению на спектрофотометре Ultraspec 3000 оптической плотности реакционной среды при к=240 нм в течение одной минуты трансформации акрилонитрила (Максимов и др., 2003, Кузнецова и др., 2004). Амидазную активность определяли с помощью ВЭЖХ, а также кондуктометрически по повышению проводимости в течение 10 минут при добавлении 500 мкл 1М акриламидана 10 мл пробы.

Трансформацию нитрилов с использованием биомассы выделенных штаммов проводили в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7.2, при начальной концентрации нитрила 2%. Реакцию проводили параллельно при 25 и 50°С в течение 10 мин и останавливали добавлением концентрированной HCl до концентрации 2%. Пробы центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 5 мин. Продукты реакции анализировали спектрофотометрически ().=24() нм), методами газовой хроматографии и ВЭЖХ.

Концентрации алифатических амидов определяли по разности оптической плотности реакционной среды при Х=240 или 260 нм в начале и в конце реакции.

Удельную активность ферментов нитрилгидратазы и амидазы выражали в мкмоль продукта реакции (амида или кислоты), образуемой за 1 мин, в пересчете на 1 мг веса сухих клеток (мкмоль/мг/мин). Единица нитрилгидратазной активности (1 ЕД) соответствует I мкмоль амида/мг сухих клеток/мин.

Изучение влияния температуры и pH на удельную активность ферментов. Для изучения влияния температуры и pH на амидазную активность, бактерии культивировали в течение 2-3 сут. на минеральной среде N с добавлением субстрата. Клетки промывали калий-натриевым фосфатным буфером. Реакцию проводили в термостатах «Термит» и термошейкерах TS100C BIOSAN в диапазоне температур 5-80°С, с шагом 5°С.

Для изучения влияния кислотности среды на активность фермента конверсию акриламида проводили в калий-фосфатном буфере в диапазоне pH 3-12 с шагом рН=1. Продукты реакции анализировали с помощью газовой хроматографии.

Газовую хроматографию продуктов трансформации амида проводили на хроматографе GC-2014, Shimadzu, оснащенном пламенно- ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем полисорб-1, фракция 0,25-0,5 мм («Реахим», Россия). Газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 смЗ/мин. Температура термостата 190±3°С, температура испарителя 220±10°С. В качестве стандартов использовали растворы чистых акриламида и акриловой кислоты.

Идентификация выделенных культур. Таксономический анализ штаммов проводили на основании стандартных культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических характеристик по определителю бактерий Берджи (Определитель бактерий Берджи, 1997; Методы общей бактериологии, 1983), а также с использованием руководств O.A. Нестеренко и соавт. (Нестеренко и др., 1985) и И.Б. Ившиной (Ившина и др., 1987), (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Для видовой идентификации были использованы праймеры к консервативным участкам генов 16S рРНК на основе анализа нуклеотидных последовательностей, приведенных в базе данных GenBank. В качестве контрольных вариантов использовались штаммы R. erythropolis 7т, 17, 19, R. ruber 63, 72 и R. rhodochrous 67т из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов, предоставленные чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной (номер Всемирной федерации коллекций культур - WFCC 768).

Выделение ДНК и полимеразиая ценная реакция. При выполнении исследований использовали оптимизированные молекулярно-генетические методы (Павлова, 2012). Выделение ДНК из грамположительных бактерий проводили фенольным методом (Клонирование ДНК. Методы, 1988). ДНК грамотрицательных микроорганизмов выделяли методом кипячения (Соломенный и др., 2006).

Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере ТЗ (Biometra, Германия).

Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2 % агарозном геле в трис-боратном буфере (TBE, pH 8,0) при напряженности электрического поля 6 В/см. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры lkb и ЮОЬ (ООО «СибЭнзим»). Визуализацию полос осуществляли с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).

Секвенирование ДНК. Последовательность нуклеотидов анализировали с помощью системы секвенирования ДНК MegaBACElOOO (APBiotech) и APBisystems 3500 XL с использованием набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit.

Сравнительный анализ последовательностей ДНК. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с помощью пакетов программ MegaBACElOOO и Chromas lite 2.1. Поиск гомологичных последовательностей проводили с использованием базы данных GenBank. Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2.

Гидролиз ибупрофенамида. Л,5-ибупрофенамид синтезирован сотрудниками Лаборатории асимметрического синтеза Института органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН г. Екатеринбург под руководством д.х.н. В.П. Краснова. Продукты биотрансформации ибупрофенамида анализировали методами ВЭЖХ на базе ИТХ УрО РАН, а также методом хромато-масс-спектрометрии на аппарате 689/573Т MSD (Agilent-Hewlett Packard) на базе ИЭГМ УрО РАН, при следующих условиях: экстракция проб этилацетатом; капиллярная колонка HP 5MS, температура колонки начальная - 60° С (3 мин), нагрев до 315° со скоростью 7°/мин; температура испарителя 280°С, газ-носитель гелий.

Гидролиз Лг-ацетнл-3,4-дигндро-7,8-д||фтор-3-метил-2//-|1,4|бензоксазн11а (Ac-DBF). Синтез субстрата (Л'-ацетил -3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2//-[1,4] бензоксазина) и анализ продуктов его биотрансформации проведены на базе Лаборатории асимметрического синтеза Института органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН г. Екатеринбург под руководством д.х.н. В.П. Краснова.

Для проведения трансформации Ac-DBF культуры выращивали на трех вариантах агаризованной среды в течение 4 суток (среда Луриа-Бертани; минеральная среда, содержащая Ac-DBF; минеральная среда с Ac-DBF и ацетатом аммония). Реакцию проводили в микропробирках с добавлением калий-натрий фосфатного буфера (ЮмМ), Ac-DBF (50 мг/мл), ДМСО и живых клеток, общий объем пробы составлял 1 мл, в течение 5 суток при 30°С при 90 об/мин. Реакцию останавливали центрифугированием при 13 тыс. об./мин в течение 5 мин. Продукты трансформации анализировали методом ВЭЖХ.

Статистическая обработка. Все эксперименты проводились не менее чем в трехкратной повторное™. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительные интервалы. Достоверность различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990). Анализ результатов проводили с помощью прикладных программ MS Office Excel и Statistica 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение количества и соотношения гетеротротрофных аэробных бактерий почв и донных отложений. Исследовано биологическое разнообразие бактерий, способных активно метаболизировать амиды и нитрилы карбоновых кислот, в образцах 11 различных типов почв таёжной (Прикамье) и степной (Челябинская и Саратовская обл.) зоны России: поверхностно-подзолистая супесчаная, дерново-карбонатная, дерново-луговая глеевая почвы, солодь, каштановая почва степной зоны, солончак, грунт 2 м от солеотвала, а также

донные отложения рек Ива и Кама и в донные отложения БОС г. Перми. Исследованы наиболее богатые аэробными микроорганизмами верхние слои почв: дернина, гумусовый или элювиальный горизонт, образцы ризосферной зоны растений.

Выделено более 300 изолятов микроорганизмов, обладающих способностью к биотрансформации нитрилов и амидов, определено их количество, а также общее число гетеротрофов. Исследования показали, что культуры бактерий, способные активно трансформировать нитрилы и амиды, представлены во всех исследованных типах почв (Рисунок 1).

Наибольшее количество гетеротрофных микроорганизмов обнаружено в образцах, отобранных из гумусового дернового горизонта (на глубине 5 см) дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (2,93 х 1010 КОЕ). Много гетеротрофов содержалось также в пробах солончака, отобранных в Челябинской области (2,17хЮ10 КОЕ) и в пробах грунта в 2 м от солеотвала СКРУ-2 г. Соликамск (2,68 х 109 КОЕ).

1.00Е+11 1.00Е+10 1.00Е+09 1 ,ООЕ +08 1.00Е+07 1.00Е+06 1 .СОЕ+05 1,СОЕ+04 1.СОЕ+03

— ШИШ

> 'Л: >

на шшттт шш я тт

I? л к *

///// /////

у У

у /

ж л- V'

N з*

^ /

г

/ /

/ / / ///

■ фетжтацетоигтрип

СИЛА

Рисунок 1 - Соотношение общего количества культивируемых аэробных гетеротрофов и бактерий, утилизирующих нитрилы и амиды в почвах естественной среды и донных отложениях.

Вероятно, высокое содержание гетеротрофных микроорганизмов в грунтах с умеренным засолением является нормальным явлением. Согласно литературным

данным, солонцы и солончаки относятся к богатым почвам по обогащенное™ бактериями, высеваемыми на МПА (Даденко, Репях, 2006).

Бактерии, активно трансформирующие амиды и нитрилы, обнаружены во всех исследованных почвах и донных отложениях в количестве 105-107 КОЕ/г сухой почвы, что составляет от 0,05% (гумусовый дерновый горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб - 5 см) до 48,1% (переходный горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб 20 см) от общего числа гетеротрофов.

Наибольшим абсолютным количеством амидтрансформирующих бактерий отличались пробы солончака, отобранные в Челябинской области (3,11х107 КОЕ), образцы из гумусового переходного горизонта дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, г. Краснокамск (2,89* 107 КОЕ) и пробы грунта в около солеотвала (2,32х107 КОЕ), а наибольшее количество нитрилтрансформирующих бактерий обнаружено в последних двух из них (3,08х 107 и 7,50х107 КОЕ). В большинстве образцов почв количество амид- и нитрилтрансформирующих бактерий было примерно равным или соотносимым. Это свидетельствует в пользу координированного метаболизма нитрилов и амидов в экосистемах. Кроме того, было показано, что до 86% изолятов, трансформирующих амиды были способны к метаболизму и нитрильных соединений. Преобладание амидтрансформирующих бактерий наблюдалось в образцах гумусового горизонта дерново-луговой почвы и солончака, что может быть связано с повышенным увлажнением данных образцов почв, при котором образцы содержат большое количество грамотрицательных бактерий, среди которых распространена способность активно метаболизировать амидосоединения.

Однако в относительном выражении образцы солончака, гумусового горизонта дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением и солоди показали наиболее низкое процентное содержание нитрил- и амидтрансформирующих бактерий.

Фенилацетонитрил-утилизирующие бактерии представлены во всех типах почв. Наибольшее их количество обнаружено в образцах, отобранных на глубине 5 см дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (3,68><106), а также в пробах подзолистой супесчаной почвы (6,25 *105). Высокая степень встречаемости бактерий, вероятно, связано с тем, что растения продуцируют многие нитрильные соединения, в том числе и фенилацетонитрил (Banerjee et al., 2002; Howden, Preston, 2009; Chen et al., 2009).

Отбор культур, активно трансформирующих ароматические амиды и нитрилы. Исследовали способность 57 штаммов к росту на алифатических (ацетонитрил, пропионамид) и более токсичных ароматических (бензонитрил, бензамид и фенилацетонитрил) субстратах в концентрации 10 мМ.

Установлено, что наибольшее предпочтение исследуемые культуры отдавали минеральной среде с добавлением пропионамида в качестве источника азота. Наименьшее - средам с бензонитрилом, бензамидом и фенилацетонитрилом. Однако несколько штаммов (R. erythropolis 25, 26, Pseudomonas sp. ЗОф, 31ф, 34ф,

35ф) активно росли как на алифатических, так и на ароматических субстратах (Таблица 1).

Таблица 1 - Рост бактерий на различных субстратах (амидах и нитрилах)

Культура Ацето- Пропион- Бензамид+ БензонитршИ- Фенилацето-

нитрил амид глюкоза глюкоза нитрил+глюкоза

R. erythropolis 7-1 4- f+ 4- - 4-

R. erylhropolis 13 4-+ 4-+ ++ - 4-

R erylhropolis 5-212 4-+ 4-+ 4- - 4-

Ii. erylhropolis 2н - 4- - 4- +/-

R. erythropolis 25 4- 4-+ ■м- 4- ++

R. erythropolis 26 4- f+ ++ 4- 4-+

R. rhodochrous 37 f 4-+ 4- f 4-

R. rhodochrous 38 4- 4-+ -t- 4- 4-

R. rhodochrous 43 4- 4-+ 4- 4- 4-

Pseudomonas sp. ЗОф 4-+ 4-+ ++ 4- 4-+

Pseudomonas sp. 31ф 4- 4-+ ++ 4- 4-

Pseudomonas sp. 34ф 4-+ 4-+ ++ 4- ++

Pseudomonas sp. 35ф f+ 4-+ 4-+ 4- 4-+

Agrobacterium sp. M1 4- 4- +■/- 4- +■/-

Agrobacterium sp. M3 f+ 4-+ ■H- 4- 4-

Rhodococcus sp. M5 f+ 4- 4- 4- ■

Agrobacterium sp. M6 + ++ f + +/-

Rhodococcus sp. MIO + + 4- + +

R. rhodochrous M16 + - 4- + +

Agrobacterium sp. M19 + + 4- + 4-

Pseudomonas sp. Ф4 + + f - 4-

R. erythropolis 6РИ + + 4- + +

R. erythropolis 7РИ + ++ 4- + +

R. erythropolis Зн ++ ++ f + +/-

P.ßuorescens 9нх + + 4- + +/-

R. rhodochrous 1185* + + 4- - +/-

R. erythropolis 416* + + 4- - +

R. erythropolis В 15* + + 4- + +/-

+ рост бактерий; ++ активный рост; - отсутствие роста; +/- слабовыраженный рост.

Идентификация активных штаммов. По совокупности морфологических признаков, результатов теста с КОН, метода окраски по Граму, стандартных хемотаксономических и биохимических признаков, а также ПЦР-анализа установлено, что штаммы, имеющие высокую активность, представлены как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями.

Показано, что наибольшую часть активных изолятов составляли актинобактерии видов Л. ег^ИгороШ (20%), Я. гИоЛосИгоия (9%), а также рода Аг1ИгоЬес1ег (2%); среди грамотрицательных бактерий преобладали

представители P. fluorescens (7%), P. pulida (8%), а также другие представители рода Pseudomonas и бактерии рода Agrobacterium — 2%, Acinetobacter - 3%.

Принадлежность грамотрицательных штаммов 2нх, Знх, 9нх, Юнх, 105, 146, 31f, 34f, 35f к роду Pseudomonas была подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции с родоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК.

Методами полифазной таксономии, а также секвенирования генов 16S рРНК на аппарате MegaBACElOOO и APBisystems 3500 XL изоляты грамотрицательных бактерий идентифицированы как представители рода Pseudomonas, в частности, видов Р. fluorescens и Р. pulida, и рода Agrobacterium, в частности, A. tumefaciens. Штамм 22ио определен как представитель рода Acinetobacter. Последовательность 16S рДНК исследуемого штамма на 100% гомологична таковой из генома A. guillouiae (JQ446439.1, GenBank).

Таксономическая принадлежность грамположительных штаммов была подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции с видоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК R. rhodochrous, R. erythropolis и R. ruber. В качестве контроля использовали ДНК коллекционных штаммов R. erythropolis ИЭГМ 7Т, R. rhodochrous ИЭГМ 62Т и R. ruber ИЭГМ 70Т, полученных из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (WFCC 768), а также ДНК ранее идентифицированных сотрудниками лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН штаммов R. rhodochrous 1185, R. erythropolis 416 и В15. Штаммы 2н, Зн, 4РИ, 6РИ, 7РИ,25, 26, 37, 5212, 7-1, 13 отнесены к виду R. erythropolis, а штаммы 43, М16, 38, 12и идентифицированы как R.rhodochrous, а штаммы Мб и 21и - как R. fascians.

Анализ генов метаболизма амидов и нитрилов у исследуемых бактерий. С

помощью ПЦР-анапиза проведен скрининг последовательностей, гомологичных генам амидаз, нитрилгидратаз и нитрилаз известных типов (Таблица 2).

Таблица 2 - ПЦР-анализ генов амидаз, нитрилгидратаз и нитрилаз у штаммов

родококков

\^Праймеры к: Штаммы ......... генам амидаз генам нитрилгидратаз генам нитрилаз

AmiJl + AmiRhd + FeNHa ! FeNHb CoNHa CoNHb NitK22 NiUl

К rhodochrous 1185 + ! + - - -

R. erythropolis В 15 + i + - - +

R. erythropolis 416 - + + + - - - -

R. erythropolis 417 - + + + - - - -

R.erythropolis 2н - + + + - - - -

R. erythropolis 25 - + + + - - + -

R. erythropolis 26 - + + + - - + -

R. erythropolis 37 - + + + - - - -

R. rhodochrous 38 - + + + - - - -

R. rhodochrous 43 R. erythropolis 5212 _______ + + + + + + _______-____ - - -

- -

R. erythropolis 7-1 ____- _ + + - -_______ - - +

R. erythropolis 13 + ! + - - -

В результате ПЦР-анализа установлено, что гены субъединиц Fe-зависимой нитрилгидратазы (праймеры FeNH a/b) присутствуют в геноме всех активных штаммов родококков. У всех представителей видов R. rhodochrous и R. erythropolis обнаружены последовательности энантиоселективных амидаз, гомологичные ферменту из R. rhodochrous N-774 (праймеры AmiRhd), у штамма R. erythropolis В 15 детектированы последовательности, гомологичные генам амидазы (праймеры Ami J1) и нитрилазы (праймеры Nit J1) из штамма R. rhodochrous J1. У культур R. erythropolis 25 и 26 обнаружена нитрилаза, родственная ферменту из R. rhodochrous К22 (праймеры Nit К22). Гены кобальтсодержаших ферментов (праймеры CoNH a/b) не обнаружены ни у одной из исследуемых культур.

Скрининг изолятов почвенных грибов, утилизирующих нитрилы и амиды. У выделенных плесневых грибов исследована способность к росту на жидкой минеральной среде с добавлением ацетамида, ацетонитрила, бензамида или бензонитрила в концентрации 10 мМ в качестве единственного источника углерода и азота. Время инкубации составляло 144 ч. Установлено, что три штамма Blastomyces spp., Humicola grisea, Scopulariopsis spp. не способны утилизировать нитрилы и амидосоединния. Большинство исследуемых штаммов активно метаболизировали как нитрилы, так и амиды. Штаммы Cladosporium herbarum, Arthrinium phaeospermum, Aspergillus fumigatus утилизировали только амид (Четина и др., 2011).

У культур плесневых грибов, способных расти на среде с ацетамидом или ацетонитрилом, была определена нитрилгидратазная активность по отношению к акрилонитрилу и нитрилазная активность по отношению к бензонитрилу и к акрилонитрилу (Рисунок 2).

L sl i „ Й Ik m*.

I

11

Рисунок 2 - Нитрилгидратазная активность по отношению акрилонитрилу (А) и нитрилазная активность по отношению к бензонитрилу (Б) и акрилонитрилу (В) почвенных плесневых грибов, выращенных на ацетамиде (I) и ацетонитриле (II):

1 - Aphanocladium album; 2 - Cladosporium cladosporioides; 3 - Fusarium oxysporum; 4 - Aspergillus fumigatus; 5 - Cladosporium herbarum ; 6 - Pénicillium

solitum

Показано, что все культуры, трансформирующие нитрилы, проявляют нитрилазную активность. При этом скорость конверсии акрилонитрила

составляла лишь 32% от таковой по отношению к бензонитрилу. что согласуется с литературными данными о нитрилазах мицелиальных грибов (O'Reilly, Turner, 2003). Лишь часть культур плесневых грибов, способных к утилизации нитрилов и амидов, показала высокую нитрилгидратазную и нитрилазную активности. Это может быть связано с тем, что невысокая активность фермента достаточна для питания клетки. Максимальной нитрилгидратазной активностью отличались культуры F. oxysporum и A. album. Обнаружено, что нитрилгидратазная активность культуры F. oxysporum индуцировалась при росте на среде с ацетамидом, который является индуктором нитрилгидратазы и для многих бактериальных штаммов.

В целом, все исследуемые плесневые грибы показали нитрилгидратазную активность не более 3 мкмоль амида/1 мг сухого мицелия/мин. Показано, что ароматический субстрат бензонитрил, гидролизовался посредством нитрилазной активности (Таблица 3). 11ри этом культура F. oxysporum проявляла к нему высокую активность, достигающую 5.1 мкмоль/мг/мин, что превышает аналогичный показатель у ранее известных культур плесневых грибов (Yusuf el al., 2013).

Таблица 3 - Сравнение нитрилазной активности исследуемого штамма

Fusarium oxysporum и культур плесневых грибов, ранее описанных в литературе.

Вид Нитрилазная активность Субстрат Литературный источник

F. oxysporum 5.1 Бензонитрил Данная работа

F. oxysporium CCF 1414 0,12 Бензонитрил Kaplan et al. 2006

F. solani IM1 196840 1,5 Бензонитрил Vejvodaefa/. 2010

F. solani 01 3 Бензонитрил Vejvoda et al. 2008

F. proliferatum AUF-2 4 Бензонитрил Yusuf et al., 2013

Таким образом, исследуемые культуры плесневых грибов обладают выраженной способностью к гидролизу ароматических и алифатических амидов и нитрилов. Однако при длительной инкубации они не накапливают в среде продуктов трансформации нитрилов и амидов и могут быть использованы для полной биодеградации этих соединений.

Изучение активности ферментов в процессе роста кулыуры. Исследовано проявление нитрилгидратазной активности по отношению к акрилонитрилу в процессе роста изолятов на 10 мМ ацетонитриле.

Рисунок 3 — Зависимость нитрилгидратазной активности от стадии роста культур А — R. rhodochrous 1185; Б - Pseudomonas sp. 35ф;

Рисунок 3 - Зависимость нитрилгидратазной активности от стадии роста культур. В - R. erythropolis 13; Г— R. erythropolis 26

—Нитрилгидратазная активность

В

4 48 72 96

—♦— Нитрил гидратазная активность

Г

У штаммов R. erythropolis 5212 и 7-1 не обнаруживалось детектируемой нитрилгидратазной активности, что, возможно, связано с наличием нитрилазы. Штаммы R. rhodochrous 1185 (Рисунок 3-А), Pseudomonas sp. 35ф (Рисунок 3-Б), R. erythropolis 13 (Рисунок 3-В), R. erythropolis 26 (Рисунок 3-Г) проявили высокую нитрилгидратазную активность, которая была максимальна после 24 часов роста. После выхода культуры в стационарную фазу наблюдается резкое

снижение каталитической активности.

А

Б

В

Рисунок 4 - Зависимость амидазной активности от стадии роста культур А - R. rhodochrous 1185: Б - R. erythropolis 416; В - R. rhodochrous 38

Высокая амидазная активность была выявлена у штаммов R. rhodochrous 1185 (Рисунок 4-А), R. erythropolis 416 (Рисунок 4-Б), P. fluorescens 9нх, R. erythropolis 6РИ. Для данных культур характерно совместное действие нитрилгидратазы и амидазы в первые сутки культивирования и снижение активностей при выходе в стационарную фазу роста. Штаммы R. rhodochrous 38 (Рисунок 4-В), R. erythropolis 37, R. erythropolis 25 проявляли активность на 3 сутки роста.

Исследована амидазная активность по отношению к акриламиду. а также влияние на нее температуры. Установлено, что штаммы R. erythropolis 13, R. erythropolis BI5. R. erythropolis 26, R. rhodochrous 12и и R.fascians 21и имеют незначительную амидазную активность, либо она не детектируется. Штаммы R. rhodochrous 1185, R. erythropolis 416, /î. rhodochrous 43 и A. guillouiae 22ио имеют высокие значения активности по отношению к акриламиду. Для данных видов бактерий характерно повышение активности при 50°С, что говорит о термостабильности фермента. Также характерно снижение активности при выходе культур в стационарную фазу роста. Исключением является штамм R. rhodochrous 38, проявляющий максимум амидазной активности в стационарной фазе.

Определение температурной и pH-зависимости амидазной активности.

Проведены эксперименты по исследованию влияния температуры и кислотности реакционной среды на удельную активность фермента при конверсии акриламида целыми клетками. Трансформацию проводили в течение 10 мин. Установлено, что амидаза проявляет достаточно высокую термостабильность, не характерную для большинства ферментов мезофильных организмов. Высокая амидазная активность сохранялась в интервале температуры от 50° до 65°. Этот результат согласуется с данными об известных ферментах такого типа в других штаммах актинобактерий (Перцович и др., 2005). Максимум активности в условиях проводимого анализа проявлялся у штамма R. erythropolis 25 при 55°С (Рисунок 5-А). Подобный профиль сохранялся у большинства исследованных штаммов, имеющих амидазную активность.

Установлено, что амидазная активность Л. егу^гороИя 25 и большинства штаммов максимальна при рН=7. В то же время максимальная скорость гидролиза ибупрофенамида наблюдалась при рН 8,3, что, вероятно, связано со значительным увеличением его растворимости в щелочной среде (Рисунок 5-Б). Ферменты других штаммов проявляли сходные профили рН зависимости активности. Для реакций со всеми ферментами наблюдался подобный сдвиг активности в отношении ибупрофена, что также свидетельствует в пользу влияния на процесс его трансформации от большей растворимости.

А Б

Рисунок 5 - Температурная зависимость (А) и рН-зависимость (Б) амидазной активности при биотрансформации акриламида (А, Б) и ибупрофенамида (Б) в 10 мМ калий-натрий фосфатном буфере, катализируемой целыми клетками R. erythropolis 25, выращенными на минеральной среде N.

Таким образом, биокаталитическая реакция наиболее активно проходит в интервале температур 55-65°С. Так как термостабильность фермента обычно связана с технологической стабильностью, это качество свидетельствует о перспективности изучаемых штаммов для промышленного применения, (Cowan et al., 1998; Kotlova et al., 1999; Fournand, Arnaud, 2001; Максимов и др., 2003; Павлова, 2012; Bhatia et al., 2013; Mehta et al., 2013).

Ьиотрансформации амида ибупрофена. Проведен скрининг ранее выделенных микроорганизмов, трансформирующих фенилацетонитрил и нитрил миндальной кислоты, обладающих высокой активностью по отношению к акрилонитрилу, для отбора штаммов, способных к эффективной трансформации синтетических предшественников НПВС.

Исследовано влияние среды, на которой выращивалась культура, на процесс трансформации амида ибупрофена. Проведены трансформации различных концентраций субстрата при температуре 30 и 50° С (Таблица 4).

Установлено, что штамм R. rhodochrous 1185 наиболее активно трансформирует 2 мМ ибупрофенамид с образованием ибупрофена при повышенной температуре (Т=50°С). Небольшое содержание продукта реакции при низких концентрациях субстрата обусловлено его связыванием клетками. При экстракции продукта с клетками и анализе убыли субстрата показано, что конверсия последнего при низких концентрациях проходила максимально полно.

Штамм /?. егу/ИгороИ.ч 416 эффективно трансформировал субстрат с высоким выходом продукта при начальной концентрации 1.5 мМ и при температуре 30°С.

Таблица 4 - Количество ибупрофена, образующегося при трансформации ибупрофенамида клетками /?. гИо(1осИтш 1185, мкмоль/мл

Культурапьная С Количество вещества в реакционной среде, мкмоль/мл (% конверсии*)

среда 0,25 мМ 0,5 мМ 1 мМ 1,5 мМ 2 мМ

30° 0,0077 0,0184 0,0369 0,0992 0,0941

LB+ ацетонитрил (48,2) (43,5) (6,6) (6,6) (4,7)

50° 0,0089 0,0178 0,4760 0,7164 1,0062

(49,5) (48,1) (47,8) (47,8) (50,0)

30° 0,0074 0,0015 0,0108 0,0144 0,0234

ацетонитрил+ (28,9) (4,2) (1,2) (1) (1,17)

глюкоза 50° 0,0073 0,0123 0,0670 0,1211 0,3050

(28,7) (13,8) (6,9) (8,1) (15,3)

♦максимально возможное для S- энантиомера - 50%

Snell D. и Colby J. описали полный гидролиз ибупрофенамида в концентрации 0,25 мМ в течение 17 часов при 30СС (Snell, Colby, 1999). В сравнении с этим, при оптимальных условиях селекционированные нами штаммы трансформируют большую часть доступного субстрата в течение первых 6 часов биотрансформации.

Особенностью процессов биотрансформации ароматических соединений в водной фазе, в частности, производных арилпропионовых кислот, является низкая растворимость как субстрата - нитрила или амида, так и продуктов биокатализа - целевого продукта. Вследствие этого скорость биотрансформации невелика по сравнению с процессами, не ограниченными растворимостью и массопереносом. В этом случае ограничение растворимости субстрата также не является существенной проблемой, т.к. небольших растворённых концентраций достаточно для биокаталитической реакции, и в процессе синтеза по мере расходования происходит дорастворение субстрата, находящегося в реакционной среде в другой фазе - в виде суспензии или эмульсии, кристаллов или несмешивающейся жидкости. Намного больше скорость гидролиза субстрата ограничивается растворимостью конечного продукта, являющегося слабой кислотой (у ибупрофена, например, рКа = 4,4).

Вследствие того, что растворимость кислот в воде в большой степени зависит от рН, этот показатель можно существенно увеличить. Так, растворимость ибупрофена при значении рН 1,2 составляет 0,038 мг/мл, при рН 4,5 - 0,084, рН 6,8 - 3,4, а при 8 - 14,8 мг/мл. Так как фермент способен работать в слабощелочных условиях, биокаталитическую реакцию рациональнее проводить в слабощелочной среде.

Исследовано влияние кислотности среды на протекание реакции биотрансформации ибупрофена Трансформацию амидов арилпропионовых

кислот проводили в водной среде (дистиллированная или деионизованная вода), либо калий-фосфатном буфере pH 7,9-8,6. Амид как субстрат вносили до концентрации 1-20 мг/мл. По мере трансформации добавляли новые порции субстрата. Так, начальная концентрация ибупрофен амида составляла 1 мг/мл. Клетки, как биокатализатор, добавляли в реакционную среду из расчёта 1 г сухого веса на 100 мл среды. Трансформацию проводили при температуре 30°С и перемешивании 100 об/мин. При необходимости оценки активности биокатализатора реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 6н HCl. Концентрацию продукта в надосадочной жидкости анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате получали раствор ибупрофена с концентрацией до 4.5 мг/мл.

В данных условиях проверена возможность использования в биокаталитическом процессе 6 штаммов, трансформирующих производные арилпропионовых кислот (Таблица 5). Данная биотрансформация может быть использована для получения энантиомерно-чистых производных

арилпропионовой кислоты. Нетрансформированный R- энантиомер после рацемизации может быть повторно использован в процессе биотрансформации.

Таблица 5 - Штаммы, использованные для биотрансформации, и эффективность

процесса трансформации субстрата

Штамм % трансформированного субстрата за 6 часов биокаталитической реакции

A. tumefaciens М1 46,0±3,9

А. tumefaciens МЗ 8,8±1,9

R. rhodochrous 1185* 47,9±2,1

R. erythropolis 416* 48,7±1,3

R. erythropolis 2н 5,4±1,5

R. erythropolis Зн 2,1 ±0,7

R. erythropolis 6РИ 2,2±1,2

R. erythropolis 7РИ 7,1±1,4

R. erythropolis 25 48,2±1,8

R. rhodochrous 43 42,5±6,3

R. erythropolis 5212 23,3±6,9

"Штаммы лабораторной коллекции

Установлено, что наиболее активно трансформируют амид ибупрофена штаммы А. 1ите]ас1ет М1, Я. егучЪгороГк 25, 416, К. гкоЛосИгсии 1185. Выход продукта составлял более 46% за 6 часов биокаталитической реакции в слабощелочных условиях при 30°С. Проведено сравнение полученных результатов трансформации ибупрофенамида с данными, опубликованными ранее в литературных источниках (Таблица 6).

Показано, что клетки штамма И. егугИгороИъ 25, выделенного из образцов грунта 2 м от солеотвала и клетки штамма Я. егуШгороИз 416 из лабораторной

коллекции обладают более высокой конвертирующей способностью по сравнению с известными штаммами. Возможно, это связано с оптимизацией условий реакции трансформации: более щелочная среда, способствующая повышению растворимости субстрата, что приводит к увеличению скорости реакции.

Также важно отметить то, что наиболее активной группой бактерий в реакциях трансформации ибупрофенамида являются представители рода Rhodococcus, что согласуется с данными зарубежных коллег (Snell, Colby, 1999; Wieser, Nagasawa, 2000; Lievano et al., 2012).

Таблица 6 - Сравнение полученных данных по трансформации амида ибупрофена

с опубликованными в литературе

Штамм % конверсии рацемической смести* Условия реакции

R. rhodochrous 1185 47,9±2,1

R. erythropolis 416 48,7±1,3 рН 8,3 30°С

A. tumefaciens М1 R. erythropolis 25 46,0±3,9 48,2±1,8

R. rhodochrous 43 42,5±6,3

Rhodococcus sp. AJ270 (Snell, Colby, 1999) 35 рН=8; 30°С

R. rhodochrous ATCC21197 (Wieser, Nagasawa, 2000) Al Нет данных

R. erythropolis MP50 (Bauer, 1994) 47 Нет данных

Acinetobacter sp. AK226 (Yamamoto, Komatsu, 1991) 37 рН 8; 32°С

Rhodococcus sp. SP361 (Beard el al., 1993) 32 Нет данных

Nocardia corollina B-276 (Lievano et al, 2012) 36,5 рН 7,0; 30°; продукт-й-энантиомер

•Данные приведены к единой размерности: % конверсии от суммарного содержания Л- и 5-энантиомеров

Биотрансформация ЛГ-амида: /V-ацетил -3,4-днгндро-7,8-дифтор-3-метнл-2//-|1,4]бещокса1нпа. Для проведения трансформации /V-ацетил -3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2//-[1,4] бензоксазина культуры выращивали на трех вариантах агаризованной среды (среда Луриа-Бертани; минеральная среда N, содержащая Ac-DBF; минеральная среда N с Ac-DBF и ацетатом аммония) в течение 4 суток (Таблица 7).

Реакцию проводили в микропробирках с добавлением калий-натрий фосфатного буфера (ЮмМ), Ac-DBF (50 мг/мл), ДМСО и живых клеток, в течение 5 суток при 30°С при 90 об/мин. Общий объем пробы составлял 1 мл. Количество продуктов реакции определяли с помощью методов ВЭЖХ и ГХ-МС.

Таблица 7 - Влияние состава среды на биотрансформацию Л'-ацетил -3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2#-[1,4]бензоксазина (Ac-DBF), %

Штамм Среда культивирования

LB N+Ac-DBF N+Ac-DBF+NHiAc

R. erythropolis В15* 26 Нет роста Нет роста

R. erythropolis 7-1 2,5 0 34,3

R. rhodochrous 43 2,9 42,7 0

R. erythropolis 25 1,6 Нет роста 35,3

R. erythropolis 417* 3,6 0 35,7

R. erythropolis 5212 4,1 Нет роста Нет роста

R. erythropolis 13 3,2 4,3 0

R. rhodochrous 37 6,3 0 1,6

*- штаммы лабораторной коллекции

Показано, что гидролитическая активность в отношении Ac-DBF у ряда родококков выражается в значительной степени конститутивно: клетки, выращенные на полноценной среде LB при отсутствии субстрата или его структурных аналогов, достаточно активно его трансформировали. Однако при инкубации в присутствии субстрата выход продукта повышался в ряде случаев в 10 раз и более, что свидетельствует об индукции активности.

Таблица 8 - Штаммы Rhodococcus, активно трансформирующие Л'-ацетил -3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2//-[1,4]бензоксазин

Штамм R.erythropoiis 25 Тип почвы Место отбора Среда культивирования ее*, %

Солеотвал Соликамский р-н Пермского края минеральная среда + Ac-DBF + ацетат 99,12

R. rhodochrous 43 Солеотвал Соликамский р-н Пермского края минеральная среда + Ac-DBF 98,31

R. erythropolis 7-1 Подзолистая супесчаная с. Городище Соликамского р-на Перм. края минеральная среда + Ac-DBF + ацетат 100

R. erythropolis 417 Аллювиальная | Пойменная почва луговая кислая минеральная среда + Ac-DBF + ацетат 100

R erythropolis B15 Каштановая Саратовская обл. степная почва I LB 100

*) ее - энантиомерный избыток

В экспериментах по трансформации рацемической смеси Ac-DBF получен препарат 5-энантиомера 3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2//-[1,4]бензоксазина с энантиомерным избытком >98%. Высокую активность среди актинобактерий проявили штаммы R. erythropolis 25, 7-1,417, В15, R. rhodochrous 43 (Таблица 8).

Показано, что оптимальной для трансформации концентрацией Ac-DBF является 100 мкг/мл. Установлено, что при повышении концентрации Ac-DBF до 1000 мкг/мл выход продуктов биотрансформации для штаммов R. erythropolis 25 и 417 уменьшался в 2 и более раза. При дальнейшем увеличении концентрации

(2000 мкг/мл) выход продукта снижался еще в 2 раза, что было связано с уменьшением растворимости субстрата и продукта реакции.

Исследовано влияние среды культивирования на последующую трансформацию субстрата. При росте бактерий на минеральной среде с Ac-DBF в качестве ростового субстрата - источника углерода и энергии, активность культуры была сопоставима с таковой на варианте среды LB+ Ac-DBF.

Показано, что наиболее стабильно трансформировал Ac-DBF штамм R. erythropolis 25 (Чулаков и др., 2015). Изучено влияние среды культивирования на активность биотрансформации. Показано, что наибольшей активностью обладали клетки R. erythropolis 25, выращенные на минеральной среде N. Был проанализирован выход продукта в результате 120-часовой биотрансформации субстрата клетками R. erythropolis 25, выращенными на среде N (Таблица 10).

Показано, что в течение 24-48 часов клетки штамма R. erythropolis 25 стереоселективно осуществляют гидролиз Ac-DBF, далее происходит незначительная трансформация (Я)-эиантиомера субстрата, максимальная конверсия субстрата наблюдалась через 96 часов.

Таблица 10 - Результаты биотрансформации Ac-DBF клетками R. erythropolis 25

Время, ч (5)-амин ее, % (Я)-амид ее, % Конверсия С, %

0 0 0 0

24 100 12,4 11

48 100 44,6 30,8

72 99,0 69,2 40,9

96 99,2 77,8 43,7

120 98,8 76,4 43,7

Проведено сравнение результатов трансформации Д'-амидов фторированного и нефторированного производных дигидрометилбензоксазина (Таблица 11). При равных условиях скорость конверсии нефторированного производного была в 2,35- 30 раз ниже, чем для Ас-ОВР.

Таблица 11 - Трансформация Ы-амидов фторированного и нефторированного

производных дигидрометилбензоксазина (% деацетилированного продукта)

Л'-ацетил -3,4-днгидро-7,8- N - ацетил-3,4-дигидро-3-

Штамм дифтор-3 -мстия-2//- метил-4//-1,4-бемзоксазин

[1,4]бензоксазин

R. erythropolis 25 19,6 2,6

R. erythropolis 5212 7,7 1,9

R. erythropolis 13 26,4 1,6

R. erythropolis 416 33,3 1,1

R. erythropolis 37 13,8 1,9

R. erythropolis В15 23,5 10,0

Проведено сравнение, полученных результатов по трансформации Ac-DBF с данными, опубликованными ранее в литературе (Таблица 12).

Таблица 12 - Сравнение полученных данных по трансформации Ac-DBF с опубликованными ранее в литературе

Штамм ее, % Условия реакции

R. erythropolis В15* 100

R. erythropolis 7-1 100 120 ч 30°С

R. rhodochrous 43 98,31

R. erythropolis 25 99,12

R. erythropolis 417* 100

Bacillus sp. DSC 1012 (Miyadera, Imura, 1999) 99 120 ч 30°С

Dabaryomyces sp. IAM 1637 (Miyadera, Imura, 1999) 97

Dabaryomyces sp. IFO 3330 (Miyadera, Imura, 1999) 98

Обнаружено, что энантиомерный избыток в результате биотрансформации, катализируемой клетками штаммов R. erythropolis 7-1 и 25, выделенных из образцов почв Соликамского района, и клетками штаммов R. erythropolis 417 и В15 из лабораторной коллекции, был выше, чем у штаммов Bacillus sp. DSC 1012, Dabaryomyces sp. IAM 1637 и IFO 3330, ранее описанных A. Miyadera и A. Imura (Miyadera, Imura, 1999).

ВЫВОДЫ

1. Бактерии, трансформирующие амиды и нитрилы, обнаружены во всех исследованных образцах почв и донных отложений в количестве 105-107 КОЕ/г сухого вещества, что составляет до 48% от общего числа гетеротрофов. Большую часть активных изолятов составляли представители родов бактерий Rhodococcus, Pseudomonas Agrobacterium, Acinetobacter и грибов - Fusarium.

2. Нитрилтрансформирующие культуры почвенных плесневых грибов проявляли выраженную нитрилазную активность, специфичную к бензонитрилу и при длительной инкубации были способны к полной утилизации ароматических и алифатических нитрилов и амидов. Выделен штамм Fusarium oxysporum, обладающий высокой нитрилазной активностью (5,1 мкмоль/мг/мин), что превышает активность ранее известных культур плесневых грибов.

3. Показано, что в геноме всех активных штаммов Rhodococcus присутствуют гены Fe-зависимой нитрилгидратазы и энантиоселективных амидаз, в 4 штаммах R. erythropolis обнаружены последовательности, гомологичные генам нитрилаз.

4. Селекционированы высокоактивные штаммы R. erythropolis 416, 25, энантиоселективно трансформирующие амид ибупрофена, и определены оптимальные условия реакции (pH 8,3, Т=30°С), при которых выход S-энантиомера ибупрофена составляет более 95%.

5. Селекционированы штаммы бактерий R. erythropolis В15, 7-1, 25, 417, способные к энантиоселективной конверсии рацемического Л-ацетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2//-[1,4]бензоксазина с образованием 5-энантиомера со значением конверсии — до 50% и энантиомерным выходом более 99%. Показана эффективность их использования в качестве биокатализаторов для синтеза предшественника левофлоксацина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАКМинобрнауки РФ

1. Долгих (Луговская) Н.П. Биотрансформация ибупрофенамида штаммом Rhodococcus rhodochrous / Н.П. Долгих, К.С. Фролкова, АЛО. Максимов, В.А. Демаков // Вестник Уральской Медицинской Науки. - 2011. -№4/1. -С. 193-194.

2. Четина O.A. Нитрилгидратазная активность почвенных микромицетов в процессе биотрансформации производных карбоновых кислот / O.A. Четина, И.О. Крылова, И.Н. Кирьянова, А.Ю. Максимов, Н.П. Долгих (Луговская) // Вестник Уральской Медицинской Науки. -2011. -№4/1. - С. 205-206.

3. Чудаков Е. Н. Энантиоселективный микробиологический синтез (S)-3,4-дигидро-3-мстил-7,8-дифтор-2#-[1,4]бензоксазина / E.H. Чулаков, Г.Л. Левит,

A.A. Тумашов Н.П. Луговская, Н.Б. Ремезовская, А.Ю. Максимов, В.А. Демаков,

B.П. Краснов // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2015. - № 5. - С. 1097-1099.

Публикации в других журналах и сборниках

4. Долгих (Луговская) Н.П. ПЦР-идентификация актинобактерий рода Rhodococcus -биодеструкторов ароматических соединений / Н.П. Долгих (Луговская), Е.А. Кудрина, А.Ю. Максимов // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. Матер, конф. - Екатеринбург-Пермь. - 2007. - С. 56-58.

5. Долгих (Луговская) Н.П. Селекция бактерий-деструкторов 8-гидроксихинолина / Н.П. Долгих (Луговская), А.Ю. Максимов // Симбиоз Россия 2009. Матер. II Всеросс. с междунар. участ. конгр. студ. и аспир-биол. - Пермь. - 2009. - С. 19-21.

6. Долгих (Луговская) Н.П. Биотрансформация ароматических нитрилов и амидов бактериями почвенной среды / Н.П. Долгих (Луговская), А.Ю. Максимов // Актуальные аспекты современной микробиологии. Тез. V молод, шк.-конф. с междунар. участ. -Москва. - 2009. - С. 103-104.

7. Dolgikh (Lugovskaya) N.P. Biological degradation of nitrogen containing and dibenzotiophen by soil bacteria / N.P. Dolgikh (Lugovskaya), A.Yu. Maksimov // Abstracts of the 13th annual symposium for biology students of Europe "Symbiose 2009". - Kazan. - 2009. - P. 46-47.

8. Долгих (Луговская) Н.П. Скрининг фенилацетонитрил-утилизирующих почвенных бактерий / Н.П. Долгих (Луговская), А.Ю. Максимов // Симбиоз-Россия 2010. Матер. III Всеросс. с междунар. участ. конгр. студ. и аспир-биол. - Н. Новгород. - 2010. - С. 52.

9. Долгих (Луговская) Н.П. Селекция бактерий, трансформирующих фенилацетонитрил / Н.П. Долгих (Луговская), А.Ю. Максимов, М.В. Кузнецова // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Матер. VII Междунар. конф. - Минск. - 2010. - С. 25-26.

10. Долгих (Луговская) Н.П. Штаммы бактерий, трансформирующие производные арилпропионовой кислоты / Н.П. Долгих (Луговская), А.Ю. Максимов, К С. Фролкова// Актуальные аспекты современной микробиологии. Тез. VI молод, шк.-конф. с междунар. участ. - Москва. - 2010. - С. 103-104.

11. Долгих (Луговская) Н.П. Биотрансформация производных арилпропионовой кислоты / Н.П. Долгих (Луговская), А.Ю. Максимов, К.С. Фролкова // Симбиоз-Россия 2011 Матер. IV Всеросс. с междунар. участ. конгр. студ. и аспир-биол. - Воронеж. -2011.-С. 139-140.

12. Долгих (Луговская) Н.П. Биотрансформация ибупофенамида до ибупрофена почвенными бактериями / Н.П. Долгих (Луговская), К.С. Фролкова, А.Ю. Максимов // Биомика-наука XXI века. Матер. II Всероссийской школы-конференции. - Уфа. — 2011.— С. 34-35.

13. Фролкова К.С. Селекция нитрилутилизирующих бактерий, выделенных из речного ила и активного ила очистных сооружений / К.С. Фролкова, Н.П. Долгих (Луговская), А.Ю. Максимов // Биомика-наука XXI века. Матер. II Всероссийской школы-конференции. - Уфа. - 2011. - С. 133-134.

14. Максимов А.Ю. Энантиоселективная биотрансформация N-ацетил- 7,8-дифтор-2,3-дигидро-3-метил-4Н-1,4-бензоксазина / А.Ю. Максимов, Н.Б. Ремезовская, Н.П. Луговская, В.П. Краснов // III междунар. конф. Техническая химия. От теории к практике. - Пермь. -2012. - С. 197-201.

15. Луговская Н.П. Биоразнообразие бактерий подзолистых почв Прикамья, трансформирующих ароматические нитрилы и амидосоединения / Н.П. Луговская, Ю.А. Павлова, A.C. Литасова, А.Ю. Максимов // Российский иммунологический журнал. -2015. - Т. 9(18), № 2(1) - С.653-655.

16. Позюмко Э.Н. Метагеномная характеристика микроценозов суглинистых почв Пермского края и встречаемость в них эубактерий, обладающих высокой амидазной активностью / Э.Н. Позюмко, Н.П. Луговская, Ю.А. Павлова, А.Ю. Максимов // Российский иммунологический журнал. -2015. - Т. 9(18), № 2(1). - С.598-600.

Луговская Надежда Петровна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ

03.02.03 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ _._.201__Набор компьютерный.

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13