Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ АКРИЛАТА АММОНИЯ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ АКРИЛАТА АММОНИЯ"

/-¿ШГ

На правах рукописи

Полтавская Светлана Викторовна

БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ АКРИЛАТА АММОНИЯ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнологии

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2005

Работа выполнена в ЗАО "ШОАМИД", г. Саратов

Научны« руководителе

кандидат химических наук

Воронин Сергей Петрович

кандидат биологических наук

Козулин Сергей Владимирович

Официальн ыс оппоненты: доктор биологических наук

Синеокий Сергей Павлович

доктор химических наук, профессор Щеголев Сергей Юрьевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится " 28 " сентября 2005 г. в 13°" часов на заседании диссертационного совета Д.002.546.01 в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимия и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан " ш Ае^Ы/СЖ!2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

доктор биологических наук

Никитина Валентина Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Еще с конца XIX века микроорганизмы стали основой производства ряда полезных продуктов (органических кислот, этанола для технических целей, ферментов, витаминов и т.п.). В настоящее время они не только не утратили своего значения, но ; и спеюр их использования все более расширяется. Методы промышленного получения органических соединений с использованием микроорганизмов условно можно разделить на две группы: биосинтетические и биокаталитические.

Метод биосинтеза представляет собой образованно новых веществ, осуществляемое клетками в процессе роста на основе питательных компонентов среды. В результате синтезируются природные соединения, обычно в низких концентрациях и трудно выделяемые. Сегодня в промышленности этим методом получают многие аминокислоты, некоторые антибиотики, лимонную, глюконовую, молочную, уксусную и Другие органические кислоты.

Методы биокатализа предполагают использование клеток микроорганизмов, как источника ферментов, катализирующих специфические реакции трансформации субстрата. Общей' чертой всех трансформаций является изменение молекулярной структуры трансформируемого вещества, а не синтез новой молекулы. Микробиологическая трансформация позволяет получать чистые вещества а мягких условиях, с высоким выходом, на основе неприродных субстратов.

В природе существуют бактерии, способные гидролизовать алифатические и ароматические нитрилы органических кислот, что делает их перспективными для получения соответствующих амидов и кислот. В 90-х годах XX столетия реализованы крупномасштабные биокаталитнческие процессы получения амидов, наиболее значимыми из которых являются акрил амид и никотинамнд (КоЬауаяЫ еТ а!., 1992, Дебабоа с соавт., 1997), Однако биотехнология получения акриловой кислоты по причине тех или иных технологических недоработок находилась на лабораторном уровне.

Акриловая кислота и ее производные необходимы в производстве лаков, красок, стройматериалов, товаров бытовой химии. Полимеры акриловой кислоты находят применение в зкологосберегающих технологиях: их используют для очистки сточных вод и укрепления поверхности горных отвалов, предотвращения выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв, обезвоживания активного ила очистных сооружений.

Аммонийная соль акриловой кислоты в виде сополимера с этилакрилатом и метилметакрилатом используется для шлихтования синтетических нитей и пряж, как загуститель при печатании обоев, для выдел хи натуральных кож.

Анионные полимеры, представляющие собой сополимеры акриламида и акриловой кислоты или ее солей, широко используются в калийной, нефте- и газодобывающей промышленности (флокулянты), в сельском хозяйстве, при производстве товаров *------------------~ Юрбенты)

По прогнозу ведущих поставщиков спрос на акриловую кислоту на мировом рынке в ближайшее время будет увеличиваться на 3.5 - 5 % в год и к 2009 г. возрастет до 4 млн. т.

Завод по химическому, производству акриловой кислоты начал работу в четвертом квартале 2004 года в г. Дзержинске, Технология получения акриловой кислоты базируется на использовании пропилена - продукта глубокой переработки нефти. Ежегодная проектная мощность завода должна составить 25 тыс. тонн сырой акриловой кислоты (эфирного сорта), из которых будет производиться около 2.3 тыс. тонн ледяной акриловой кислоты (полимерного сорта) и до 40 тыс. тонн эфиров, Однако пуск этого завода не решит в полном объеме проблему получения акриловой кислоты полимерного сорта, необходимой в производстве высокомолекулярных полимеров. К тому же химический процесс окисления пропилена на многокомпонентных катализаторах, являющийся основой промышленного способа получения акриловой кислоты, протекает при высокой температуре и требует достаточно сложного аппаратурного обеспечения (Беленький с соавт., 1989). Побочными продуктами этого производства являются акролеин, ацетзльдегид, уксусная, пропионовая и малеиновая кислоты, оксид и диоксид углерода. Несмотря на то, что продукты окисления проходят несколько стадий разделения и очистки, получаемая акриловая кислота относится к эфирному сорту, то есть, непригодна для полимеризации и может использоваться, в основном, только для синтеза различных эфиров. Для получения высокоочищеиного продукта полимерного сорта необходима дополнительная стадия ректификации.

Таким образом, современному промышленному способу получения акриловой кислоты присущи особенности, характерные для большинства химических процессов: высокая температура, многостадийность, отравление катализатора, полимеризация продуктов реакции и наличие побочных продуктов, создающих проблему их переработки.

В этой связи более перспективным, на наш взгляд, является биокаталитический способ производства акриловой кислоты с применением микроорганизмов, продуцирующих фермент нитрилазу.

Возрастающая потребность в высокомолекулярных соединениях акриловой кислоты и существенные энергетические, экономические и экологические проблемы, связанные с ее химическим синтезом, делают весьма актуальной задачу. биотехнологического получения ее солей, в частности, шфилата аммония на основе использования оригинальных высокоактивных штамм ов-трансформ аторов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось создание высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка на его основе процесса получения водных растворов акр плата аммония.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи' 1. Создание коллекции микроорганизмов, трансформирующих нитрилы в соответствующие кислоты, селекция штамма с максимальной активностью.

J

2. Оптимизация условий культивирования штамма, обладающего максимальной активностью фермента нитрил азы.

3. Разработка ферментационного процесса промышленного получения биомассы штамма - продуцента нитрил азы.

4. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрнлэт аммония.

5. Разработка технологии получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Создана коллекция микроорганизмов, отнесенных к родам Pseudomonas и Alcaligenes > способных трансформировать алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие кислоты.

Выделенные штаммы обладают высокой юприлазной активностью и способны трансформировать нитрилы в широком диапазоне pH и температуры. Штамм Alcaligenes denilrißcans С-32. проявляющий максимальную нитрилазную активность, и условия его культивирования защищены патентом РФ Ка 2177034, приоритет от 03.04.2001.

Разработаны среда и условия культивирования для штамма Alcaligenes denilrißcans С-32, не использующего углеводы и многоатомные спирты в качестве ростового субстрата.

Разработан биокаталнточеский способ получения водных растворов акрилата аммония с использованием биокатализатора на основе штамма Alcaligenes denilrißcans С-32.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Разработаны подходы к конструированию сред для культивирования микроорганизмов, проявляющих нитрилазную активность и не использующих углеводы и многоатомные спирты в качестве источника углерода.

Реализованы в промышленном масштабе процессы получения биомассы клеток штамма Alcaligenes denilrißcans С-32 и биокатализатора С-32 на ее основе.

Разработана промышленная технология получения 20 % растворов акрилата аммония полимерного сорта с использованием биокатализатора С-32. С января 2002 г осуществляется плановый выпуск акрилата аммония в объеме нескольких десятков тони в месяц.

Работа является частью комплексных исследований проводимых в ЗАО "Биоамид", направленных на создание биокаталитического способа получения акрилата аммония.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Создана коллекция микроорганизмов, относящихся к родам Pseudomonas и Alcaligenes, обладающих шпрллазной активностью.

2. Селектированный штамм Alcaligenes denitrificans С-32, обладающий конститутивной юприлазой, метабол изнрует алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие органические кислоты без промежуточного образования амидов.

3. Высокая нитрил азная активность клеток штамма Alcaligenes denitriflcans С-32 достигается при росте на оптимизированной среде, не содержащей дорогостоящих компонентов и дополнительных индукторов.

4. Разработаны условия культивирования mrmuzAlcaligenes deniirificans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания, позволяющие получать 9.3 г/л биомассы с удельной нитрил азной активностью до 5.7 ед/г.

5. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез" г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Atcaligenes denitriflcans С-32.

6. Разработана технология получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора. Оптимизированные параметры процесса позволяют получать в лабораторных условиях растворы акрилата аммония концентрацией до 50%.

б, С использованием созданного биокаталнзатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18-20% водных растворов акрилата аммония. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на Российских и Международных семинарах-презентациях, конференциях "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 2000, 2001, 2003 гг.; "Экологизация подготовки специалистов в ВУЗах. Утилизация и переработка отходов", Саратов, 2001 г.; на Первом и Третьем Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2002,2005 гг. ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе, 1 патент я 2 статьи.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 123 работы отечественных и зарубежных авторов, изложена на 135 страницах машинописного текста, включающего 7 рисунков и 19 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовано 156 штаммов грамположител ьных и Неотрицательных бактерий, из которых одна культура являлась коллекционной.

Материалом для выделения штаммов-трансформаторов акридонитрнла служили образцы почв (26), активного ила (5), пробы сточных вод (56).

Микроорганизмы хранили на агаризовакной LB-среде (косяки, столбики) при температуре 4°С с пересевами через каждые три месяца.

В работе использовали следующие среды: мясо-пептокный бульон (МПБ), мясо-пептонный аггр (МПА), перевар Хоттингера, LB-среда (г/л): пептон Bacto -10.0; дрожжевой экстракт Bacto -5.0;NaCl- 10,0.

Выделение микроорганизмов проводили на синтетических средах следующего состава (г/л): "СА"; глицерин - 5.0, дрожжевой экстракт - 5.0, КаНРО< - 0.1, Mgí-Oi • 7Н20 - 0.1, рН среды 7.2±0.2; "СВ": глюкоза - 0,5, пептон - 1.0, KíHPO, - 0.1, MgSO* - 7HiO - 0.1, рН среды 7.2±0.2.

В качестве селектирующего агента использовали акрилоннтрил в концентрациях от 0.01 до 3.0 г/л.

Исследование спектра субстратов, утилизируемых выделенными микроорганизмами, проводили на жидкой среде "ОС" (г/л): Ш1НРО4 * 12Н10 -6.0, КН1РО4 - 2.0, Мв504 • 7Н1О - 0.7.

Выращивание штамма Л1са^епея <ип1Мрсаж С-32 — продуцента фермента нитрилазы осуществляли на средах следующего состава (г/л): "АВ": Ма2КГО4 • 12НгО - 6.0, КН2Р04 - 2.0, N^04 • 7Н1О - 0.7, кукурузный экстракт -5.0, ацетат аммония - 5.0; "АС": ИааНРО« • 12НгО - 6.0, КН,РО< - 2,0,• 7НгО - 0.7, кукурузный экстракт - 10.0, ацетат аммония -10.0.

Изучение влияния рН на нитрилазную активность интактных клеток проводили с использованием 0.1 М буферных растворов: цитрат-фосфатного (рН 4-6); фосфатного (рН 4.0 - 8.0); трис-солянокислого ( рН 8-12); ЙаОН -глицинового (рН 9.0 - 12.0),

При исследовании условий трансформации акрилонятрила в акрилэт аммония, а также для определения нитрилазной активности клеток штамма А1саИ&1гея ¿епМп/1$апз С-32 использовали 0.01 М калий-натрий фосфатный буферный раствор, рН 7.5.

В качестве субстратов и индукторов нитрилазной активности штамма AlcaIigefles ¿епМН/1С<т$ С-32 в работе использовали следующие нитрилы: ацетошггрил, акрнлонитрнл, бутирошприл, пропионитрил, изобутиронитрил, метакрилонитрил, бензо нитрил, сукцинонитрил, цианопиридин

Выделение мтфоорганизмов проводили общепринятыми методами прямого высева и адаптивной селекции. Селекция проводилась в двух вариантах: методом накопительной культуры и методом ступенчатой адаптации к повышающимся концентрациям селектирующего агента - акрилоннтрнла в концентрациях от 0.01 до 3.0 (/л (Карасевич, 1975).

Идентификацию микроорганизмов проводили на основе изучения фиэиолого-биохимических и морфолого-культуральных свойств, используя тесты, предложенные в Определителе бактерий Берджи, 1997.

Урожай клеток в процессе ферментации и величину микробной нагрузки при изучении биотрансформацик оценивали по значению оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 540 км в кювете с толщиной оптического слоя 5- мм, а затем пересчитывали на сухой вес (г/л) по предварительно построенной калибровочной кривой (для исследуемого штамма АкаИ^епех ¿¿ем1гу1сат С-32 1 ед ОД соответствовала 0.58 г/л по сухому весу клеток).

Нитрилазную активность интактных клеток определяли следующим образом: суспензию клеток осаждали на лабораторной центрифуге Т23Й при 6000 об/мин в течение 20 мин. Осажденные клетки отмывали 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.5±0,2, и ресуспендировали в 1 мл этого же буфера до оптической плотности 1.0, В суспензию вносили акрилонитрнл до концентрации 10,0 г/л. Трансформацию акрилонитрила проводили на водяной бане при 20°С и постоянном перемешивании. Реакцию останавливали через 15 мин внесением в реакционный раствор 6Н НС1 в объеме 0.05 мл. За единицу

нитрилазной активности принимали количество фермента, катализирующее образование I ммоль акриловой кислоты за 1 минуту. Удельная нитрилазная активность выражалась числом единиц нитрил азной активности, приходящихся на 1 г сухого веса клеток. Общая нитрилазная активность определялась как число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мл культуральной жидкости (ед/мл).

Количественное определение образовавшейся акриловой кислоты проводили методом газовой хроматографии (стальная колонка 1 = 2 м, d ■ 5 мм, сорбент - Инертон NAW HMDS с 15 % Reoplex - 400, газ-носитель - азот) и спектрофотометр нческнм методом при длине волны 255 им.

Изучение возможности использования нитрилов для роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили следующим образом: исследуемые соединения вносили в среду "СС", создавая концентрацию 1 г/л. Суточную культуру бактерий суспендировали в стерильном физиологическом растворе. Клеточную суспензию инокулировали в среду с исследуемыми соединениями. Посевная доза составляла 0,1 ед оптической плотности. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/6 часть средой, при температуре 29±1"С и постоянном перемешивании. Через 48 ч инкубации по величине оптической плотности оценивали способность исследусмых субстратов выступать в качестве единственного источника углерода и азота.

Способность различных нитрилов и е-капролактама выступать в роли индуктора нитрил азы штамма Alcaligenes denitrificans С-32 оценивали на среде "АВ". С этой целью исследуемые соединения вносили в среду культивирования, создавая концентрацию 1 г/л. Суточную культуру бактерий суспендировали в стерильном физиологическом растворе. Клеточную суспензию инокулировали в среду с нитрилом или Е-капролактам ом, создавая концентрацию микроорганизмов, соответствующую 0.1 сд оптической плотности. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/6 часть средой, при температуре 29±1°С и постоянном перемешивании в течение 48 ч. Периодически отбирали пробы культуральной жидкости для оценки роста клеток и нитрил аэноЙ активности.

Оптимизацию состава среды культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили на среде "АВ", поочередно меняя в ней концентрацию каждого из компонентов. С этой целью клетки штамма в течение суток подращивали в бактериологических пробирках с 10 мл мясолептонного бульона. Полученную культуральную суспензию вносили в колбы объемом 300 мл, содержащие по 50 мл среды "АВ" н исследуемые соединения в концентрации 0.1 - 20.0 г/л. Культивирование осуществляли при температуре 29±1®С и круговом перемешивании. Рост культуры оценивали по изменению оптической плотности в образцах культуральной жидкости, а нитрнлазную активность - в реакции трансформации акрилоннтрила в акрилат аммония.

Оптимизацию температурного режима культивирования клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили на среде "АС". Для этого клетки иггамма, выращенные на МПБ в течение 24 ч, вносили в колбы Эрленмейера,

заполненные на 1/6 часть средой. Культивирование проводили в течение двух суток при перемешивании, соблюдая определенный температурный режим: 20, 25,30,35 и 42°С. Через 48 ч оценивали рост и шприлазную активность клеток.

При определении оптимального значения рН для начального роста штамма С-32 среды "АВ" и "АС" перед инокулированием культурой подппровывались 1 Н растворами >1аОН или НС1. Культивирование проводили в тех же условиях, оценивая через 24 и 30 часов рост и нитрилазную активность клеток.

Оптимизацию условий культивирования клеток штамма А1саи£епе$ ¿епХп/гсапз С-32 проводили в периодическом режиме, используя аппараты МиШ^еп (модель Р-1000-Р-2000) н АК-203, 210 объемом 3 и 10 л, Стерилизацию ферментеров вместе со средой "АС**, проводили в автоклаве при ] ,0 атм, температуре 1214С в течение 1 ч. Компонент среда, сульфат магния, в виде 10 % раствора стерилизовали отдельно и вносили в аппараты перед началом ферментации. Посевной материал готовили выращиванием культуры в -колбах Эрленмейера на среде "АВ" в течение суток. Полученную таким образом 24 часовую культуру кнокулировали (100 мл на I л среды) в ферментер.

Культивирование проводили при контролируемом значении рН и небольшом избыточном давлении воздуха. Для подгитровки использовали 30 и 50 % растворы уксусной кислоты. При изучении влияния аэрации на рост и ферментативную активность клеток этот параметр изменяли. Для этого использовали разные системы аэрации. Первая система обеспечивала распределение подаваемого воздуха в среде с помощью механического перемешивания, вторая система кислородообеспечения -пневмосатурационная, Периодически из аппарата отбирали пробы культур альной жидкости для определения концентрации клеток, чистоты культуры и нитрилазной активности. Чистоту культуры оценивали по высевам отобранных проб на плотную питательную среду с последующим микроскопическим анализом. При достижении стационарной фазы роста клеток (48 - 72 ч) ферментацию останавливали. Отделение биомассы проводили центрифугированием. Наработанную в процессе культивирования биомассу хранили в замороженном виде.

Для изучения процесса трансформации акрилонитрила в акр штат аммония с использованием штамма А1саН§епех ¿етМ/капх С-32 была проведена оптимизация условий реакции гидролиза акрилонитрила и исследованы основные технологические параметры процесса получения акрилата аммония.

I С целью оптимизации условий реакции было изучено влияние температуры, рН, солевого состава реакционного раствора, микробной нагрузки, начальной - концентрации акрилонитрила; определены условия, необходимые для остановки реакшш трансформации.

Для , этого клетки штамма А1саИ%тех ¿епИп/капз С-32, полученные аэробным культивированием на среде "АС", отмывали 0.01 М фосфатным буферным раствором, рН 7.4±0.2 и ресуспендировали в буфере того же состава, создавая концентрацию клеток 0.1-5.0 г/л. Для проведения реакции

трансформации ло 1 мл суспензии переносили к пластиковые пробирки, добавляли акрилонитрил и помещали их в водяную баню. Реакцию проводили при постоянном перемешивании. Остановку процесса гидролиза осуществляли добавлением соляной кислоты. Условия трансформации изменяли в зависимости от изучаемого параметра. В случае исследования влияния солевого состава среды на нитрилазную активность клеток использовали фосфатный буфер, физиологический раствор, водопроводную и дистиллированную воду.

С целью исследования основных технологических параметров процесса получения акрилата аммония биомассу штамма А1са^епез 4епИгфсат С-32, полученную в процессе аэробного культивирования на среде "АС", суспендировали в водной среде, рН 8.5±0.5, в количестве 0.3 - 30.0 г/л. Полученную суспензию вносили в реактор, представляющий собой термостатнруемую емкость с мешалкой. Рассчитанное количество акрилокитрила добавляли в реакционный раствор разово в начале реакции трансформации, дробно или непрерывно на протяжении всего процесса так, чтобы его концентрация не превышала 0.1 — 2.0 %. Гидролиз акрнлонктрила проводили при температуре от 20 до 50"С при постоянном перемешивании. Время реакции варьировали от 30 мнн до 24 часов. Концентрацию компонентов реакционной смеси определяли методами газо-жидкостной хроматографии. По окончании микробной трансформации клетки отделяли центрифугированием.

Результаты экспериментов обрабатывались статистически с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе работы были изучены культуры из лабораторной коллекции, способные трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту без образования акр ил амида в качестве промежуточного продукта. Однако низкий уровень активности коллекционных культур и необходимость внесения казаминовых кислот в среду культивирования для достижения высокой активности даже наиболее активного из коллекционных штаммов Лка/фелез зр. ВКПМ В-6706 (Пат. № 2081169, 1995) заставили отказаться от их использования.

Для создания эффективного биокатализатора нами был продолжен скрининг бактерий с высокой нитрилазной активностью в местах непосредственного контакта природной микрофлоры с 'токсичными соединениями данного класса (акрилонитрил, акриламнд, акриловая кислота).

Для выделения штаммов из объектов окружающей , среды, расположенных в районах производств, выпускающих или потребляющих акрилонитрил и акриловую кислоту, были использованы традиционные методы прямого высева, накопительной культуры и ступенчатой адаптации (Карасевич, 1982). Метод накопительной культуры с использованием акрнлоннтрила в концентрации 3.0 г/л в качестве селектирующего агента позволил выделить из почвы, сточной воды и активного ила 38 нзолятов. Дальнейшее изучение микроорганизмов, выделенных с помощью метода накопительной культуры,

показало, что лишь 13 из них трансформировали акрилонитрил, причем у 11 из них в реакционном растворе выявлен как акрил амид, так и акриловая кислота. Только два штамма, с лабораторным шифром PI и Р2, позднее отнесенных к роду Pseudomonas, трансформировали акрилонитрил в акрилат аммония без образования акрил амида в качестве интермеди ата.

В результате селекции при применении метода ступенчатой адаптации из тех же проб почвы, сточной воды и активного ила с использованием акрилонитрила в возрастающей концентрации (за месяц культивирования концентрация была увеличена с 0.01 до 3.0 г/л) нами изолированы 117 штаммов, устойчивых к акрилоиитрилу в концентрации 3.0 г/л. Более детальное исследование микроорганизмов, выделенных вышеуказанным методом, показало, что 64 изолята не деградируют акрилонитрил, хотя растут в его присутствии, используя дополнительные источники питания. Гидролиз акрилонитрила 49 культурами сопровождался образованием а крил амида в качестве промежуточного продукта, то есть, видимо, проходил с участием ферментов юприлгидрзтазы и амидазы.

И только четыре штамма, РЗ, Р4, С-23 и С-32 трансформировали акрилонитрил под действием фермента нитрил азы в акрилат аммония, утилизируя последний в процессе дальнейшего роста. Акрилам ид как интермедиат трансформации выявлен не был. Штаммы РЗ и Р4 были отнесены к роду Pseudomonas, а штаммы С-23 и С-32 - к роду Alcaiigenes.

Таким образом, при исследовании 26 проб почвы, 56 проб сточных вод и 5 проб активного ила было выделено 155 культур, устойчивых к акрилоиитрилу в концентрации 0.01-3 г/л. Среди них только б штаммов обладали китрняаэной активностью.

Проведенный скрининг штаммов, трансформирующих акрилонитрил в акрилат аммония без образования промежуточных продуктов, показал, что , наибольшее количество микроорганизмов, устойчивых к акрилоиитрилу, и все культуры, обладающие нитрил азной активностью, изолированы из почвы, взятой вблизи расположения емкостей хранения нитрила акриловой кислоты. Это, видимо, связано с наличием в ней селектирующего агента - следов акрилонитрила.

Показано, что штаммы, принадлежащие к родам Pseudomonas и Alcaiigenes, существенно различались по способности трансформировать акрилонитрил. Средняя нитрвлазная активность представителей рода Alcaiigenes более чем в 8 раз превышала таковую у псевдомонад. Наибольшей активностью обладал штамм Alcaiigenes sp. с лабораторным шифром С-32. Его удельная юприлазная активность составляла 2.23 ед/r. Поэтому именно этот штамм, Alcaiigenes sp, С-32, послужил объектом наших дальнейших исследований.

С целью видовой идентификации вышеуказанного штамма были подробно изучены его биологические характеристики, в соответствии с которыми он был идентифицирован как Alcaiigenes denitrificans.

Штамм А1саИ$епе$ ¿епИЫ/1сап$ С-32 — продуцент нитрил азы депонирован а соответствии с условиями Будапештского соглашения во Всероссийской коллекции микроорганизмов (УКМ) под номером В-2243 О.

В ходе работ по идентификации штамма было показано, что он не использует в качестве питательного субстрата, углеводы и многоатомные спирты, а это значительно затрудняло работу по оптимизации среды для получения высокого урожая клеток. Поэтому, используя в качестве питательной среды бульон на переваре Хоттингера, нами исследованы некоторые доступные вещества, которые могли бы быть использованы в качестве дополнительных ростовых субстратов. Таковыми оказались этиловый и пропило вый спирты, а также уксусная и пропионовая кислоты. В то же время бутиловый спирт и этил ацетат не использовались штаммом А1саН$епез ¿епШ/гсапх С-32 как ростовые субстраты.

Нитрилаза ттшмаА1саИ%епе5 ¿¡епигфсам С-У2, как и другие описанные в литературе нитрилутилиэирующие ферментные системы, обладает широким спектром субстратной специфичности. Было установлено, что клетки штамма Ака^еп&х скпИг{/}сал5 С-32 за счет проявления нитрилазной активности могли расти на синтетической среде, содержащей ацетошприл, акрило нитрил, бутиронитрил, пропионигрил, изобутиронитрил, метакрилонитрил, бензонитрнл, сукциноннтрил или цианопириднн, используя их как единственные источники углерода, азота и энергии. Рост культуры сопровождался трансформацией нитрила, продуктом которой являлась аммонийная соль соответствующей - кислоты, которая и выступала в роли ростового субстрата. Такие нитрилы, как адипоншрил, кротононитрил, лактонитрил и хлорацетонитрил, клетками штамма С-32 не утилизировались.

Анализ состава среды культивирования при использовании этилового спирта в качестве единственного источника углерода показал, что под воздействием ферментной системы клеток штамма

А1саИ^епе$ 4епИгфсап$ С-32 спирт постепенно превращался в уксусную кислоту, которая и усваивалась микроорганизмами.

Продуктом трансформации ацетонитрила при росте культуры являлась аммонийная соль уксусной кислоты, которая и выступала в роли ростового субстрата (рис. 1), Известно, что ацетат аммония является промышленным сырьем, которое широко используется в микробиологической промышленности для культивирования многих штаммов-продуцентов. Это позволило нам включить в состав среды в качестве единственного источника углерода и азота аммонийную соль уксусной кислоты.

0 8 16 24

Время культивирования, ч

Рис.1. Изменение параметров культивирования при выращивании клеток штамма А1са1%епез ¿¡епип/каги С-32 на среде, содержащей ацетокитрил . -е-концентрация клеток, г/л

концентрация ацетонитрила, г/л —нитрилазная активность клеток

концентрация уксусной кислоты, г/л

Несмотря на то, что штамм А!са^еяез ¿¡епИгфсаю С-32 способен расти на синтетической минеральной среде, содержащей лишь ацетат аммония в качестве единственного источника углерода, азота и энергии, прирост биомассы в этих условиях культивирования невелик. Для улучшения количественных характеристик его роста и ннтрилазной активности нами были использованы различные питательные смеси растительного и животного происхождения.

Максимальная плотность культуры и достаточно высокая специфическая активность клеток получены при использовании в качестве питательной основы дрожжевого и кукурузного экстрактов. Кукурузный экстракт является доступным, недорогим промышленным сырьем, что позволило нам использовать его в дальнейшем в качестве питательной основы для культивирования шгшъ1а.А!са^епех ¿епШ/нхмх С-32,

Проведенные эксперименты по оптимизации концентрации ростового субстрата в среде показали, что концентрация ацетата аммония 10 г/л создает в среде оптимальное количество как ацетат-ионов, так н ионов аммония, что

позволяет обеспечить максимальную скорость роста клеток и их нитрилазную активность.

Добавление в среду культивирования различных нитрилов не оказывает индуцирующего влияния на нитрилазную активность штамма С-32. Более того, а-замещенные нитрилы, такие как лактонитрил и хлорацетоншрил, существенно ингибируют. как рост культуры, так и нитрилазную активность клеток. Сильный индуктор для многих нитрилазных ипаммов, е-халрол актам (Ыаёакгоа й а!., 1990) в наших экспериментах не только не увеличивал нитрилазной активности штамма С-32, но даже подавлял его рост. Тем самым, мы сделали предположение о том, что синтез фермента нотрнлазы у штамм а А1са1%епех ¿тИгфсат С-32 конститутивен.

В результате проведенных работ по оптимизации солевого состава среды для выращивания клеток штамма А1саИ^епех ¿епИгфсаж С-32 нами предложен следующий состав, среды культивирования (г): ЫазНРСи • ПНзО - 6.0, КН2РО4 -2.0, М^С^ • 7Н1О - 0.7, кукурузный экстракт - 5.0, ацетат аммония - 10.0, -дистиллированная вода -1000.

Эта питательная среда, оптимизированная на основе стандартного, широко используемого в микробиологической промышленности сырья, и не содержащая дорогостоящих компонентов и индукторов, послужила основой для разработки промышленных условий культивирования штамма А1са!^епе$ (кпИп/юзпз С-32,

Сбалансировав состав- среды, мы перешли к изучению зависимости урожая клеток и их ферментативной активности от таких важнейших параметров среды, как температура и уровень кислотности. Они не только влияют на скорость роста и выход биомассы, но могут изменять метаболизм к биохимический состав бактерий.

Было показано, что оптимальным температурным интервалом для получения максимального урожая клеток с высокой нитрилазной активностью является 30-32 "С. При более низких температурах (2б-28®С) уменьшается скорость роста, но сохраняется высокий урожай и ннтрнлазная активность клеток. При более высоких (34°С) значительно падает удельная активность, а при температуре культивирования Зб*С - сокращается и выход биомассы.

Во время культивирования штамма Л/са%етте$ йтйн^сат С-32 на среде, содержащей ацетат аммония, происходит изменение рН среды с 7.4±0.2 до 9.0±0.2. Эти изменения связаны с неравномерным потреблением ацетат-ионов и ионов аммония. Хотя среда содержит калий, натрий фосфатный буфер, его емкости не хватает для поддержания рН в заданном интервале. Тем не менее, оптимальное начальное значение кислотности среды, а, именно, рН 7.6 - 8.2, позволяет достичь максимальной скорости роста (табл. 1). При этих значениях показателя концентрации водородных ионов уже за 24 ч культивирования достигается максимальный урожай клеток с высокой нитрилазной активностью.

Таблица 1

Влияние pH среды на урожай и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrtficans С-32

Начальное значение pH среды культивирования Время культивирования, ч

24 30

Урожай клеток, г/л SA*. ед/г Урожай клеток, г/л Sa*, ед/г

6.5 0 0 0 0

6.8 0.3±0.05 0.9*0.08 1.4*0.1 1.5*0.1

7.2 1.6*0.08 1.5±0,1 2.2*0.1 1.7*0.1

7.4 1.8*0.09 1.7*0,1 2.2*0.1 2.1*0.1

7.6 2.0*0.1 1.9*0.1 2.2*0.1 2.1*0.1

7.8 2.2±0.1 2.1±0.1 2.1*0.1 2.1*0.1

8.0 2.1 ±0.1 2.2*0.1 2.1*0.1 2.2*0.1

8.2 2.0±0.1 2.3*0.1 1.9*0.1 2.3*0,1

8.4 1.9*0.1 2.3±0.1 1.7*0.1 2.3±0,1

8.6 1,4±0.1 2.3*0.1 1.6*0.1 2.6*0.2

9.0 0 0 0 0

Примечание: Sa - удельная шприлазная активность клеток

Необходимо отметить тот факт, что при увеличении щелочности среды (8.2 - 8.6) снижается прирост биомассы, но возрастает ее удельная ннтрилазиая активность. При уровне кислотности среды ниже 6.5 и выше 9.0 рост отсутствует.

Результаты наших исследований хорошо согласуются с известным фактом снижения токсичности органических кислот для бактерий при повышении значений pH среды (Щпегсль, 1985), Это связано с тем, что внутрь клетки тяжелее проникнуть заряженным ионам. Недиссоциированные молекулы органических кислот, число которых увеличивается со снижением значений показателя водородного потенциала, беспрепятственно проходят через клеточную мембрану, вызывая гибель клетки.

Изучив основные закономерности культивирования штамма Alcaligenes denürißcans С-32 на среде, содержащей ацетат аммония, мы исследовали параметры роста на данной среде других, выделенных в нашей лаборатории штаммов, проявляющих нитрил азную активность.

Все выделенные штаммы с нитрилазной активностью хорошо растут на среде, содержащей , в качестве субстрата ацетат аммония, проявляя при этом заметную скорость гидролиза акрилоншрила при дальнейшей трансформации его в ажрнлат аммония.

Таблица 2

Урожай и китрилазная активность клеток штаммов, выращенных на среде содержащей в качестве источника углерода и азота ацетат аммония

Штамм Урожай клеток, г/л Удельная китрилазная активность, ед/г

Pseudomonas sp. Р 1 3.1±0.3 0.б±0.02

Pseudomonas sp. Р 2 3.0±0.3 0.32±0.02

Pseudomonas sp. P 3 2.5±0.2 0.19±0.02

Pseudomonas sp. P 4 2.4±0.2 1.4±0,1

Alcaligenes sp. С -23 2.2±0.1 1,7±0,\

Alcaligfines sp. Ib-3 1.5±0,1 1.0±0.1

Aicaligenes denitrificcms C-32 2.2±0.1 2.1±0,1

Таким образом, установленный нами сбалансированный состав среды и условий культивирования штамма Л/са%еие1 <1&Шгфаия С-32 могут быть рекомендованы для выращивания и других бактерий — продуцентов нитрилазы, относящихся к родам Р$т<1отопси и А1саИёепе.г и не использующих углеводы или многоатомные спирты в качестве источника углерода.

Оптимизация состава питательной среды, рН и температурных режимов культивирования штамма ' А1саН$еггех ¿епМ/1сапз С-32 в условиях эксперимента позволили нам перейти к следующему этапу исследований -отработке процесса выращивания клеток штамма-продуцента нитрил азы в лабораторных и промышленных ферментерах.

Использование для культивирования полусиитетичесхих сред, содержащих ацетат аммония, не давало возможности получать высокий урожай клеток в колбах из-за более интенсивной ассимиляции ацетат-ионов по сравнению с ионами аммония, и как следствие, быстрого сдвига значений рН в щелочную сторону. Чтобы избежать отрицательного воздействия изменений кислотности среды на скорость роста н образование целевого фермента во время культивирования, дальнейшие эксперименты проводили в ферментере с автоматическим контролем рН. Для сохранения максимальной скорости роста и достижения высокой нитрнлазной активности клеток культивирование проводили при поддержании значений рН »а уровне 8,2±0.2, Для этого в питательную среду вводили раствор уксусной кислоты, являющейся в том числе и хорошим ростовым субстратом, по принципу обратной связи. Периодически оценивали урожай и нитрилазную активность клеток, уровень кислотности среды, концентрацию уксусной кислоты и ионов аммония. При выходе культуры па стационарную фазу роста (72 ч) культивирование прекращали. Отделение биомассы от культуралькой жидкости осуществляли центрифугированием. Изменение концентрации клеток, состава питательной среды и нктрилазной активности представлены на рис.2.

Время,ч

Рис.2. Изменение параметров культивирования при выращивании клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на среде "АС" в лабораторном ферментере

концентрация клеток, г/л —концентрация уксусной кислоты/г/л

концентрация ионов аммония,г/л —удельная нитрилазная активность аетивностъ,ед/г

Как видно из приведенных на рис. 2 данных, за 72 ч роста получен урожай клеток, составляющий 4.93 г/л (по сухому весу) с нитрилазной активностью клеток 3.7 ед/г, Это в 22 раза выше по выходу биомассы и в 1.8 раза выше по уровню нитрилазной активности клеток, чем при культивировании в колбах без поддержания значений рН на оптимальном уровне. Анализ кривых убыли ацетат-иона н иона аммония убедительно свидетельствует о том, что именно падение концентрации ацетат-нона практически до нуля является причиной остановки роста культуры. Поэтому, в последующих экспериментах в среду после 18-20 ч культивирования дополнительно вводили ацетат аммония в количестве 7.5 г/л. Подгитровка раствором уксусной кислоты не позволяла повысить или сохранить на постоянном уровне ее .концентрацию в культуральной среде из-за более интенсивного потребления клетками ацетат-ионов по сравнению с нонами

аммония.

Дополнительное внесение ростового субстрата, ацетата аммония, во время культивирования позволило за 72 ч увеличить урожай клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 до 9.3 г/л. Их нитрилазная активность достигла 5.7 ед/г. Штаммов с подобной нитрнлазной активностью ранее в литературе описано не было (Nagasawa et al., 1988; US Patent 5998180, 1997). Результаты культивирования, проведенного в указанных условиях, представлены в таблице 3.

В ходе исследований было изучено влияние аэрации на выход биомассы и ее ферментативную активность. Показано, что интенсивное насыщение среды культивирования кислородом позволяет добиться высокой нитрилазной активности при максимальном выходе биомассы.

Таблица 3

Изменения параметров культивирования в процессе выращивания клеток штамма Akatigenes denitrificans С-32 в оптимальных условиях_

Исследуемые параметры Время к; ш>тивирования, ч

0 12 24 36 48 60 72

Урожай клеток, г/л 0.1 0.7±0.1 2.4±0.2 4.6±0.4 8.5 ±0.5 9.0±0.б 9.3±0.6

Удельная нитрилазная активность, ед/г 0.8±0.1 1,2±0,1 2.3±0.2 4.1 ±0.3 4.9±0.4 5,7*0.4

Проведенные эксперименты позволили перейти к отработке процесса культивирования штамма А1саИцепех <кпип/1сапх С-32 в промышленных условиях. Наработку биомассы осуществляли на базе ОАО "Биосинтез", г. Пенза, в ферментере объемом 2 м\ Имеющееся промышленное оборудование потребовало корректировки условий культивирования штамма, а так же внесения некоторых изменений в состав среды. Так, для увеличения количества клеток в единице объема посевного материала культуру подращивали на МПЕ, содержащем 4 г/л этилового спирта. Затем суспензию клеток вносили в 300 литровый ферментер, заполненный оптимизированной средой "АВ'\ Культивирование проводили в течение 24 ч. Затем выросшую культуру использовали как инокулят для засева промышленного ферментера объемом 2 ы\ содержащего 1500 литров среды "АС".

В связи с тем, что промышленный ферментер не был оснащен блоком автоматического титрования, уксусную кислоту вносили дробно, поддерживая рИ в интервале 7.5-8.5. По окончании культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости сепарированием.

.За 36 ч роста урожай клеток составил 7,6 г/л, а их удельная нитрилазная активность - 3.5 ед/г, Эти показатели несколько ниже полученных ранее на лабораторной установке, что, возможно, связано с более интенсивным

ыассообменом в промышленном ферментере, приводящим к выдуванию аммиака из культураяьной среды. Биомасса штамма Alcaligenes denitrificans С-32, выращенная в вышеназванных условиях, была использована для получения первых партий биокатализатора С-32 для отработки условий процесса получения акрилата аммония.

Дальнейшие промышленные испытания, адаптированные к условиям производства, позволили начать плановый выпуск биокатализатора на основе биомассы штамма Alcatigenes denitrificans С-32.

На следующем этапе исследований нами были оптимизированы условия трансформации акрилонитрила. Известно, что основными факторами, оказывающими влияние на процесс микробиологической трансформации, являются рН среды, температура, концентрация субстрата и продукта реакции, количество микробных клеток, вносимых в реакционный раствор, а также, суммарное влияние всех этих факторов. Изучение процесса трансформации при изменении этих параметров позволили определить оптимальные условия проявления специфической активности биокатализатора.

Исследование основных параметров процесса биотрансформации показало, что иггамм Alcaligenes denitrificans С-32 обладает высокой термостабильностью фермента, а наибольшая нитрилазная активность клеток отмечается при температуре 65®С, Быстрая инактивация фермента (5 мин воздействия снизили удельную нитрил аэную активность клеток на 61 %) происходит только при 70°С. Сопоставляя полученные результаты с литературными данными, следует отметить, что подобная термостабильность иитрилазы наблюдалась только у штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833 (US Patent 5998180, 1997), но способы получения акрилата аммония при высоких температурах в литературе не описаны (World Patent 97/21827, 1997). Это связано с тем, что при повышении температуры синтеза усиливается негативное влияние на фермент таких факторов, как токсичность субстрата и концентрация конечного продукта, что делает невозможным получение акрилата аммония в температурных режимах с максимальной активностью фермента. Тем не менее, нами установлено, что высокая термостабшштость нитрил азы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволяет получать концентрированные растворы акрилата аммония при 30-40*С.

Так как кислотно-основные труппы фермента должны находиться в определенном состоянии ионизации, для каждого фермента существует область значений рН, в которой его активность является наиболее выраженной. Оптимальным диапазоном значений рН, в которой клетки штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проявляют максимальную нитрилазную активность, являлся интервал рН 7,8 - 11 (рис, 3). Это выгодно отличает иггамм Alcaligenes denitrificans С-32 от зарубежных аналогов (штамм Rhodococcus rhodochrous 31), которые, как правило, имеют узкий интервал значений рН, в котором активна нитрил аза их клеток. Это делает необходимой подтнтровку щелочью во время биотрансформации с использованием их штаммов, что усложняет процесс и требует жесткого контроля за ходом реакции (Pat. 5135858 US, 1992).

6.0-,

рН

Рис. 3. Влияние рН на нитрилазную активность клеток штамма А!саІі$епеі йепНгфсат С-32

Процесс синтеза акрилата аммония с использованием штамма А1са1і£епех (іепіШ/ісат С-32 можно проводить в дистиллированной воде, предварительно скорректировав значение рН. Такая технология дает возможность получения чистых растворов акр плата аммония, не содержащих примесей неорганических солей, способных в дальнейшем ухудшить качество конечного продукта -полимера.

Удельная нитрил азная активность клеток штамма АІсаІі£епе5 ёепИгфсат С-32 практически не зависит от начальной концентрации нитрила акриловой кислоты в реакционной смеси в интервале от 2.6 г/л и вплоть до предела растворимости субстрата. Эта характеристика ннтрилазы штамма Аіса^епех (іепіігі/ісапі С-32, на наш взгляд, также является весьма важной, так как позволяет вести процесс синтеза акрилата аммония, как при высоких, так и низких концентрациях акрилонитрила.

Более того, даже при более низких концентрациях акрилонитрила (1.3 г/л) скорость гидролиза с использованием клеток игтамма АІса^епез (іетігіАсапз С-32 не падает ниже 90 % от максимально возможной. Это позволяет заканчивать процесс получения концентрированных ■ растворов акрилата аммония с концентрацией акрилонитрила на ■ уровне' предела обнаружения.

Оптимизация условий проведения гидролиза акрилокитрила клетками штамма Alcaligenes deniiriflcans С-32 позволила нам разработать промышленную технологию получения акрилата аммония. Она сводится к следующему.

Для проведения процесса получения акрилата аммония биокатализатор при перемешивании суспендируется в фосфатном буфере или дистиллированной воде в количестве or 0,025 до 3% в интервале рН 7.0-11.0 и температуре от 0 до 65"С. Суспензия вносится в стеклянный или стальной реактор, представляющий собой термостатируемую емкость, снабженную механической мешалкой. Объем лабораторных реакторов составлял от 50 мл до 3-х л. Затем, при перемешивании, подается акрилонитрил. Внесение нитрила акриловой кислоты в реакционную смесь может осуществляться различными способами: разовым добавлением, дробным или плавным, чтобы его начальная и текущая концентрация не превышала 0.1%. В результате трансформации можно получать 10-50% растворы акрилата аммония. Время процесса зависит ■от концентрации клеток штамма, температуры реакционной среды и концентрации акрилата аммония, получаемой в реакции трансформации. После окончания синтеза клетки отделяют от раствора фильтрованием или центрифугированием.

Высокая активность и термостабильность нитрил азы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволяли вести процесс получения акрилата аммония при низких микробных нагрузках, используя для увеличения скорости биоконверсии повышение температуры реакции вплоть до 40°С. Дополнительных энергозатрат для поддержания температуры во время биотрансформацин не требуется, так как процесс гидролиза экзотермичен.

Изучение процесса синтеза акрилата аммония при различных температурах показало, что хотя при 40°С скорость трансформации наибольшая, накопления продукта реакции выше 33% не происходит. При 35°С максимальная концентрация акрилата аммония составила 40%, при 30"С -49.8%. Это практически максимальная концентрация конечного продукта, так как водные растворы акрилата аммония с концентрацией выше 50% получить невозможно из-за ограниченной растворимости соли в воде. Мы остановились на концентрации акрилата аммония - 20 %, так как ее достаточно для синтеза широкого спектра анионных марок полимеров, с одной стороны, а с другой, -это делает процесс рентабельным, не увеличивая расхода биокаталнзатора или времени реакции.

Описанные в литературе микробиологические способы получения акрилата аммония представлены в виде лабораторных экспериментов, объемы образцов не превышают 1 л. Перейти к опытно-промышленным испытаниям авторам не позволяли характеристики использованных ими штаммов и некоторые ограничения разрабатываемых процессов. К их числу можно отнести невысокую удельную нитрнлазную активность клеток штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 (US Patent 5998180, 1997), что приводит к увеличению микробной нагрузки, необходимой для получения концентрированных растворов акрилата аммония. Это загрязняет раствор

клеточными компонентами, ухудшая качество продукта, что и требует введения дополнительных стадий Очистки,

Разработка промышленного получения биокэггализэтора С-32 и лабораторная отработка технологии получения на его основе акрнлата аммония 18-20 % концентраций позволили нам перейти к промышленному внедрению способа. Условия проведения процесса характеризуются порционной схемой подачи акрнлонитрнла в реактор, представляющий собой стальную емкость с механической мешанкой, заполненный суспензией клеток в обессоленной воде. Использовалась минимальная микробная нагрузка (6-10 г/л). Температура проведения процесса Зб±1вС. В результате за 6-10 ч синтеза образуются 18-20% растворы акрнлата аммония. Этот процесс был масштабирован на действующей промышленной установке объемом 5.3 м3 компании "MSP", г. Пермь. Параметры, отработанные в лаборатории, воспроизвелись в пилотных испытаниях и промышленных синтезах. В настоящее время в компании "MSP", г. Пермь, работает промышленная установка проектной мощности 500 т в год в пересчете на 100% акриловую кислоту.

Водные растворы акрилата аммония, полученные с использованием биокатализатора на основе клеток штамма Alcaltgenes denitrificans С-32 эквивалентны акрилату аммония полимерного сорта, приготовленному традиционными химическими способами. Полученный продукт может быть преобразован в иную химическую форму, например, в кислоту или соль щелочного металла. Чистота и качество мономеров позволяют синтезировать полимеры с заданными свойствами.

Таким образом, селекция штамма Alcaltgenes denitrificans С-32 -продуцента фермента нитрил азы, оптимизация условий его культивирования, позволили создать высокоактивный биокатализатор С-32, разработать промышленную технологию его получения и использования для создания биокаталигического процесса получения акрилата аммония.

Процесс синтеза растворов акрилата аммония с концентрацией 18*20 % внедрен в промышленное производство.

ВЫВОДЫ .

1. Создана коллекция микроорганизмов, обладающих ннтрилазной активностью. Бактерии относятся к родам Pseudomonas и Alcaligenes.

2. Выделен и идентифицирован штамм бактерий Alcaltgenes denitrificans С-32 - продуцент нктрилазы (патент № 2177034 РФ), обладающий высокой активностью фермента, на базе которого создан биокатализатор С-32 для промышленного получения акрилата аммония. Изучены индукция и субстратная специфичность нитрил азы клеток штамма Alcaltgenes denitrificans С-32, путь трансформации нитрилов.

3. Оптимизирована среда культивирования штамма Alcaltgenes denitrificans С-32. Основное преимущество среды - отсутствие токсичных и летучих нитрилов. Ростовыми н питательными субстратами является стандартное, широко используемое в микробиологической

M

промышленности сырье - ацетат аммония и кукурузный экстракт,

4. Оптимизированы условия процесса культивирования штамма Alcaligenes denitriflcans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания: pH, температура, аэрация, схема подачи ростового субстрата. Данные условия позволили увеличить урожай биомассы до 9.3 г/л, удельную нитрилазную активность до 5.7 ед/г.

5. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез", г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Alcaligenes denitrißcans С-32, которая используется компанией "Биоамид" для производства биокатализатора С-32.

6. Оптимизированы условия трансформации акрилонитрила клетками штамма Alcaltgenes deniirißcans С-32, позволяющие получать в лабораторных условиях растворы акрилата аммония концентрацией до 50%.

7. С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18-20% водных растворов акрилата аммония.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сннолицкий MJK., Полтавская C.B., Рогачева С.М., Севрюгина И.В., Воронин СП. Выделение нитрил гидратазы из клеток Rhodococcus rhodochrous MS и определение N-концевой аминокислотной последовательности субъединиц// Прикл. биохим. микробиол. - 1997. - Т. 33, Ха 4. - С.383-387.

2. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев H.H., Козулин С.В,, Воронин С.П. Выделение бактериальных штаммов-продуцентов амидазы и нитрил азы // Тез. докл. семинар-презентации "Биотехнология - 2000™. -Пущино, 2000. - С. 86-87,

3. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин C.B., Воронин С.П. Оптимизация условий культивирования штамма Alcaligenes sp. • продуцента фермента нитрил азы // Тез. докл. семинар-презентации "Биотехнология - 2000", - Пупшно, 2000. - С. 85-86.

'4. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Воронин С.П. Разработка экологически безопасного биотехнологического способа получения акриловой кислоты // Сб. науч. тр. "Экологизация подготовки специалистов в ВУЗах. Утилизация и переработка отходов". - Саратов, 2001, - С. 67-71.

5, Полтавская C.B., Козулин C.B., Воронин С.П., Байбурдов Т.А., Ступенькова ЛЛ., Хоркина H.A. Биотехнология получения акрилата аммония it Тез. докл. "Биотехнологии - 2001". - Пущино, 2001. -С. 126-128.

6. Полтавская C.B. Биотехнологическое получение акрилата аммония // Матер. 1-го Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М„ 2002. - С. 233-234.

и

7. Полтавская C.B., Сингирцев И.Н., Козулина Т.Н., Литвинов О.В., Козулин C.B., Воронин С.П. Биотехнологическое получение акрилата аммония // Тез. докл. семинар-презентации "Биотехнология - 2003". -Пущино, 2003. - С. 107-108.

8. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин C.B., Шуб Г.М., Воронин С.П. Разработка и внедрение биокаталитического способа получения акриловой кислоты. 1. Выделение штамма Aicaligenes denitrificans, трансформирующего акр ил он игр ил в акр штат аммония. Оптимизация среды культивирования // Биотехнология. - 2004. - Ks 1. - С. 62-70.

9. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин C.B., Воронин С.П. Штамм бактерий Aicaligenes denitrificans С-32 - продуцент нигрилазы // Пат. N 2177034 РФ Cl 7 С 12 N 1/20, 9/78// (С 12 N 9/7S, С 12 R 1:05).

Выражаем огромную признательность и искренне благодарим действительного члена РАЕН, доктора медицинских наук, профессора Геннадия Марковича Шуба за глубокий анализ нашей работы, за всестороннюю помощь в обсуждении и представлении полученных результатов.

Отпечатано в типографии ООО «Фиеста-200СЬ>, 410033, г. Саратов, ул. Панфилова, 1, корп. 3 «А»