Биокаталитическое получение акрилата аммония

Полтавская, Светлана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биокаталитическое получение акрилата аммония
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биокаталитическое получение акрилата аммония"

На правах рукописи

Полтавская Светлана Викторовна

БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ АКРИЛАТА АММОНИЯ

| 03.00.07 - микробиология

| 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2005

Работа выполнена в ЗАО "БИОАМИД", г. Саратов

Научные руководители:

кандидат химических наук

Воронин Сергей Петрович

кандидат биологических наук

Козулин Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Синеокий Сергей Павлович

доктор химических наук, профессор Щеголев Сергей Юрьевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится " 28 " сентября 2005 г. в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д.002.146.01 в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Никитина Валентина Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Еще с конца XIX века микроорганизмы стали основой производства ряда полезных продуктов (органических кислот, этанола для технических целей, ферментов, витаминов и т.п.). В настоящее время они не только не утратили своего значения, но и спектр их использования все более расширяется. Методы промышленного получения органических соединений с использованием микроорганизмов условно можно разделить на две группы: биосинтетические и биокэталитические.

Метод биосинтеза представляет собой образование новых веществ, осуществляемое клетками в процессе роста на основе питательных компонентов среды. В результате синтезируются природные соединения, обычно в низких концентрациях и трудно выделяемые. Сегодня в промышленности этим методом получают многие аминокислоты, некоторые антибиотики, лимонную, ппоконовую, молочную, уксусную и другие органические кислоты.

Методы биокатализа предполагают использование клеток микроорганизмов, как источника ферментов, катализирующих специфические реакции трансформации субстрата. Общей чертой всех трансформаций является изменение молекулярной структуры трансформируемого вещества, а не синтез новой молекулы. Микробиологическая трансформация позволяет получать чистые вещества в мягких условиях, с высоким выходом, на основе неприродных субстратов.

В природе существуют бактерии, способные гидролизовать алифатические и ароматические нитрилы органических кислот, что делает их перспективными для получения соответствующих амидов и кислот. В 90-х годах XX столетия реализованы крупномасштабные биокаталитические процессы получения амидов, наиболее значимыми из которых являются акриламид и никотинамид (КоЬауавЫ е1 а!., 1992, Дебабов с соавт., 1997). Однако биотехнология получения акриловой кислота по причине тех или иных технологических недоработок находилась на лабораторном уровне.

Акриловая кислота и ее производные необходимы в производстве лаков, красок, стройматериалов, товаров бытовой химии. Полимеры акриловой кислоты находят применение в экологосберегающих технологиях: их используют для очистки сточных вод и укрепления поверхности горных отвалов, предотвращения выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв, обезвоживания активного ила очистных сооружений.

Аммонийная соль акриловой кислоты в виде сополимера с этилакрилатом и м етилм етакрилатом используется для шлихтования синтетических нитей и пряж, как загуститель при печатании обоев, для выделки натуральных кож.

Анионные полимеры, представляющие собой сополимеры акриламида и акриловой кислоты или ее солей, широко используются в калийной, нефте- и газодобывающей промышленности (флокулянты), в сельском хозяйстве, при производстве товаров бытового назначения (суперабсорбенты) (Полиакрил амид, 1995).

По прогнозу ведущих поставщиков спрос на акриловую кислоту на мировом рынке в ближайшее время будет увеличиваться на 3.5 - 5 % в год и к 2009 г. возрастет до 4 млн. т.

Завод по химическому производству акриловой кислоты начал работу в четвертом квартале 2004 года в г. Дзержинске. Технология получения акриловой кислоты базируется на использовании пропилена - продукта глубокой переработки нефти. Ежегодная проектная мощность завода должна составить 25 тыс. тонн сырой акриловой кислоты (эфирного сорта), из которых будет производиться около 2.5 тыс. тонн ледяной акриловой кислоты (полимерного сорта) и до 40 тыс. тонн эфиров. Однако пуск этого завода не решит в полном объеме проблему получения акриловой кислоты полимерного сорта, необходимой в производстве высокомолекулярных полимеров. К тому же химический процесс окисления пропилена на многокомпонентных катализаторах, являющийся основой промышленного способа получения акриловой кислоты, протекает при высокой температуре и требует достаточно сложного аппаратурного обеспечения (Беленький с соавт., 1989). Побочными продуктами этого производства являются акролеин, ацетальдегид, уксусная, пропионовая и малеиновая кислоты, оксид и диоксид углерода. Несмотря на то, что продукты окисления проходят несколько стадий разделения и очистки, получаемая акриловая кислота относится к эфирному сорту, то есть, непригодна для полимеризации и может использоваться, в основном, только для синтеза различных эфиров. Для получения высокоочищенного продукта полимерного сорта необходима дополнительная стадия ректификации.

Таким образом, современному промышленному способу получения акриловой кислоты присущи особенности, характерные для большинства химических процессов: высокая температура, многостадийность, отравление катализатора, полимеризация продуктов реакции и наличие побочных продуктов, создающих проблему их переработки.

В этой связи более перспективным, на наш взгляд, является биокаталитический способ производства акриловой кислоты с применением микроорганизмов, продуцирующих фермент нитрил азу.

Возрастающая потребность в высокомолекулярных соединениях акриловой кислоты и существенные энергетические, экономические и экологические проблемы, связанные с ее химическим синтезом, делают весьма актуальной задачу биотехнологического получения ее солей, в частности, акрилата аммония на основе использования оригинальных высокоактивных штаммов-трансформаторов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось создание высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка на его основе процесса получения водных растворов акрилата аммония.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи. 1. Создание коллекции микроорганизмов, трансформирующих нитрилы в соответствующие кислоты, селекция штамма с максимальной активностью.

2. Оптимизация условий культивирования штамма, обладающего максимальной активностью фермента нитрил азы.

3. Разработка ферментационного процесса промышленного получения биомассы штамма - продуцента нитрилазы.

4. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония.

5. Разработка технологии получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Создана коллекция микроорганизмов, отнесенных к родам Pseudomonas и Alcaligenes, способных трансформировать алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие кислоты.

Выделенные штаммы обладают высокой нитрилазной активностью и способны трансформировать нитрилы в широком диапазоне pH и температуры. Штамм Alcaligenes denitriflcans С-32, проявляющий максимальную нитрил аз ную активность, и условия его культивирования защищены патентом РФ № 2177034, приоритет от 03.04.2001.

Разработаны среда и условия культивирования для штамма Alcaligenes denitrificans С-32, не использующего углеводы и многоатомные спирты в качестве ростового субстрата.

Разработан биокаталитический способ получения водных растворов акрилата аммония с использованием биокатализатора на основе штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Разработаны подходы к конструированию сред для культивирования микроорганизмов, проявляющих нитрилазную активность и не использующих углеводы и многоатомные спирты в качестве источника углерода.

Реализованы в промышленном масштабе процессы получения биомассы клеток пггамма Alcaligenes denitrificans С-32 и биокатализатора С-32 на ее основе.

Разработана промышленная технология получения 20 % растворов акрилата аммония полимерного сорта с использованием биокатализатора С-32. С января 2005 г осуществляется плановый выпуск акрилата аммония в объеме нескольких десятков тонн в месяц.

Работа является частью комплексных исследований проводимых в ЗАО "Биоамид", направленных на создание биокаталитического способа получения акрилата аммония.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Создана коллекция микроорганизмов, относящихся к родам Pseudomonas и Alcaligenes, обладающих нитрилазной активностью.

2. Селектированный штамм Alcaligenes denitrificans С-32, обладающий конститутивной нитрилазой, метаболизирует алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие органические кислоты без промежуточного образования амидов.

3. Высокая нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 достигается при росте на оптимизированной среде, не содержащей дорогостоящих компонентов и дополнительных индукторов, 4 Разработаны условия культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания, позволяющие получать 9.3 г/л биомассы с удельной нитрилазной активностью до 5.7 ед/г.

5. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез", г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

6. Разработана технология получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора. Оптимизированные параметры процесса позволяют получать в лабораторных условиях растворы акрилата аммония концентрацией до 50%.

6. С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18-20% водных растворов акрилата аммония

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на Российских и Международных семинарах-презентациях, конференциях "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 2000, 2001, 2003 гг.; "Экологизация подготовки специалистов в ВУЗах. Утилизация и переработка отходов", Саратов, 2001 г.; на Первом и Третьем Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2002, 2005 гг.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе, 1 патент и 2 статьи.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 123 работы отечественных и зарубежных авторов, изложена на 135 страницах машинописного текста, включающего 7 рисунков и 19 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовано 156 штаммов грамположительных и Неотрицательных бактерий, из которых одна культура являлась коллекционной.

Материалом для выделения штаммов-трансформаторов акрилонитрила служили образцы почв (26), активного ила (5), пробы сточных вод (56).

Микроорганизмы хранили на агаризованной LB-среде (косяки, столбики) при температуре 4°С с пересевами через каждые три месяца.

В работе использовали следующие среды: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), перевар Хоттингера, LB-среда (г/л): пептон Bacto - 10.0; дрожжевой экстракт Bacto - 5.0; NaCl - 10.0.

Выделение микроорганизмов проводили на синтетических средах следующего состава (г/л): "СА": глицерин - 5.0, дрожжевой экстракт - 5.0, К2НРО4 - 0.1, MgS04 • 7Н20 - 0.1, рН среды 7.2±0.2; "СВ": глюкоза - 0.5, пептон - 1.0, К2НР04 - 0.1, MgS04 • 7Н20 - 0.1, рН среды 7.2±0.2.

В качестве селектирующего агента использовали акрилонитрил в концентрациях от 0.01 до 3.0 г/л.

Исследование спектра субстратов, утилизируемых выделенными микроорганизмами, проводили на жидкой среде "СС" (г/л): Ыа2НР04 • 12Н20 -6.0, КН2Р04 - 2.0,1^04 • 7Н20 - 0.7.

Выращивание штамма Alcaligenes (кгиМ/капа С-32 - продуцента фермента нитрил азы осуществляли на средах следующего состава (г/л): "АВ": №2НРО< ■ 12Н20 - 6.0, КН2Р04 - 2.0, МвБ04 • 7Н20 - 0.7, кукурузный экстракт -5.0, ацетат аммония - 5.0; "АС": КагНР04 • 12Н20 - 6.0, КН2Р04 - 2.0, Ь^БСи • 7Н20 - 0.7, кукурузный экстракт -10.0, ацетат аммония - 10.0.

Изучение влияния рН на нитрилазную активность интактных клеток проводили с использованием 0.1 М буферных растворов, цитрат-фосфатного (рН 4-6); фосфатного (рН 4.0 - 8.0); трис-солянокислого ( рН 8-12); ЫаОН -глицинового (рН 9.0 - 12.0).

При исследовании условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония, а также для определения нитрилазной активности клеток штамма йепИпАсат С-32 использовали 0.01 М калий-натрий фосфатный буферный раствор, рН 7.5.

В качестве субстратов и индукторов нитрил азной активности штамма Alcaligenes йепШАсапз С-32 в работе использовали следующие нитрилы: ацетонитрил, акрилонитрил, бутиронитрил, пропионитрил, изобугиронитрил, метакрилонитрил, бензонитрил, сукцинонитрил, цианопиридин

Выделение микроорганизмов проводили общепринятыми методами прямого высева и адаптивной селекции. Селекция проводилась в двух вариантах: методом накопительной культуры и методом ступенчатой адаптации к повышающимся концентрациям селектирующего агента - акрилонитрила в концентрациях от 0.01 до 3.0 г/л (Карасевич, 1975).

Идентификацию микроорганизмов проводили на основе изучения физиолого-биохимических и морфолого-культуральных свойств, используя тесты, предложенные в Определителе бактерий Берджи, 1997.

Урожай клеток в процессе ферментации и величину микробной нагрузки при изучении биотрансформации оценивали по значению оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 540 нм в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм, а затем пересчитывали на сухой вес (г/л) по предварительно построенной калибровочной кривой (для исследуемого штамма Alcaligenes (¡епИпАсат С-32 1 ед ОД соответствовала 0.58 г/л по сухому весу клеток).

Нитрилазную активность интактных клеток определяли следующим образом: суспензию клеток осаждали на лабораторной центрифуге Т230 при 6000 об/мин в течение 20 мин. Осажденные клетки отмывали 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.5±0.2, и ресуспендировапи в 1 мл этого же буфера до оптической плотности 1.0. В суспензию вносили акрилонитрил до концентрации 10.0 г/л. Трансформацию акрилонитрила проводили на водяной бане при 20°С и постоянном перемешивании. Реакцию останавливали через 15 мин внесением в реакционный раствор 6Н НС1 в объеме 0.05 мл. За единицу

нитрилазной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 ммоль акриловой кислоты за 1 минуту. Удельная нитрилазная активность выражалась числом единиц нитрилазной активности, приходящихся на 1 г сухого веса клеток. Общая нитрилазная активность определялась как число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мл культуральной жидкости (ед/мл).

Количественное определение образовавшейся акриловой кислоты проводили методом газовой хроматографии (стальная колонка 1 = 2 м, d = 5 мм, сорбент - Инертон NAW HMDS с 15 % Reoplex - 400, газ-носитель - азот) и спектрофотометрическим методом при длине волны 255 нм.

Изучение возможности использования нитрилов для роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили следующим образом- исследуемые соединения вносили в среду "СС", создавая концентрацию 1 г/л Суточную культуру бактерий суспендировали в стерильном физиологическом растворе Клеточную суспензию инокулировали в среду с исследуемыми соединениями Посевная доза составляла 0.1 ед оптической плотности Культивирование проводили в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/6 часть средой, при температуре 29±1°С и постоянном перемешивании. Через 48 ч инкубации по величине оптической плотности оценивали способность исследуемых субстратов выступать в качестве единственного источника углерода и азота

Способность различных нитрилов и е-капролактама выступать в роли индуктора нитрилазы штамма Alcaligenes denitrificans С-32 оценивали на среде "АВ". С этой целью исследуемые соединения вносили в среду культивирования, создавая концентрацию 1 г/л. Суточную культуру бактерий суспендировали в стерильном физиологическом растворе. Клеточную суспензию инокулировали в среду с нитрилом или £-капролакгамом, создавая концентрацию микроорганизмов, соответствующую 0.1 ед оптической плотности Культивирование проводили в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/6 часть средой, при температуре 29±1°С и постоянном перемешивании в течение 48 ч Периодически отбирали пробы культуральной жидкости для оценки роста клеток и нитрилазной активности.

Оптимизацию состава среды культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили на среде "АВ", поочередно меняя в ней концентрацию каждого из компонентов. С этой целью клетки штамма в течение суток подращивали в бактериологических пробирках с 10 мл мясопептонного бульона. Полученную культуральную суспензию вносили в колбы объемом 300 мл, содержащие по 50 мл среды "АВ" и исследуемые соединения в концентрации 0.1 - 20.0 г/л. Культивирование осуществляли при температуре 29±1вС и круговом перемешивании. Рост культуры оценивали по изменению оптической плотности в образцах культуральной жидкости, а нитрилазную активность - в реакции трансформации акрилонитрила в акрилат аммония.

Оптимизацию температурного режима культивирования клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили на среде "АС". Для этого клетки штамма, выращенные на МПБ в течение 24 ч, вносили в колбы Эрленмейера,

заполненные на 1/6 часть средой. Культивирование проводили в течение двух суток при перемешивании, соблюдая определенный температурный режим: 20, 25,30,35 и 42°С. Через 48 ч оценивали рост и нитрилазную активность клеток.

При определении оптимального значения рН для начального роста штамма С-32 среды "АВ" и "АС" перед инокулированием культурой подтитровывались 1 Н растворами ИаОН или НС1. Культивирование проводили в тех же условиях, оценивая через 24 и 30 часов рост и нитрилазную активность клеток.

Оптимизацию условий культивирования клеток штамма Ака^епей йепЫпАсст С-32 проводили в периодическом режиме, используя аппараты МиШдеп (модель Р-1000-Р-2000) и АК-203, 210 объемом 3 и 10 л. Стерилизацию ферментеров вместе со средой "АС", проводили в автоклаве при 1.0 атм, температуре 121°С в течение 1 ч. Компонент среды, сульфат магния, в виде 10 % раствора стерилизовали отдельно и вносили в аппараты перед началом ферментации. Посевной материал готовили выращиванием культуры в колбах Эрленмейера на среде "АВ" в течение суток. Полученную таким образом 24 часовую культуру инокулировали (100 мл на 1 л среды) в ферментер.

Культивирование проводили при контролируемом значении рН и небольшом избыточном давлении воздуха. Для подтитровки использовали 30 и 50 % растворы уксусной кислоты. При изучении влияния аэрации на рост и ферментативную активность клеток этот параметр изменяли. Для этого использовали разные системы аэрации. Первая система обеспечивала распределение подаваемого воздуха в среде с помощью механического перемешивания, вторая система кислородообеспечения -пневмосатурационная. Периодически из аппарата отбирали пробы культуральной жидкости для определения концентрации клеток, чистоты культуры и нитрилазной активности. Чистоту культуры оценивали по высевам отобранных проб на плотную питательную среду с последующим микроскопическим анализом. При достижении стационарной фазы роста клеток (48 - 72 ч) ферментацию останавливали. Отделение биомассы проводили центрифугированием. Наработанную в процессе культивирования биомассу хранили в замороженном виде.

Для изучения процесса трансформации акрилонитрила в акрилат аммония с использованием штамма А1са1^епех йепИпАсат С-32 была проведена оптимизация условий реакции гидролиза акрилонитрила и исследованы основные технологические параметры процесса получения акрилата аммония.

С целью оптимизации условий реакции было изучено влияние температуры, рН, солевого состава реакционного раствора, микробной нагрузки, начальной концентрации акрилонитрила; определены условия, необходимые для остановки реакции трансформации.

Для этого клетки птгамма Alcaligenes йтЫг'фсат С-32, полученные аэробным культивированием на среде "АС", отмывали 0.01 М фосфатным буферным раствором, рН 7.4±0.2 и ресуспендировали в буфере того же состава, создавая концентрацию клеток 0.1-5.0 г/л. Для проведения реакции

трансформации по 1 мл суспензии переносили в пластиковые пробирки, добавляли акрилонитрил и помещали их в водяную баню. Реакцию проводили при постоянном перемешивании Остановку процесса гидролиза осуществляли добавлением соляной кислоты. Условия трансформации изменяли в зависимости от изучаемого параметра. В случае исследования влияния солевого состава среды на нитрилазную активность клеток использовали фосфатный буфер, физиологический раствор, водопроводную и дистиллированную воду.

С целью исследования основных технологических параметров процесса получения акрилата аммония биомассу штамма Alcaligenes деп1М}1сат С-32, полученную в процессе аэробного культивирования на среде "АС", суспендировали в водной среде, рН 8.5±0.5, в количестве 0.3 - 30.0 г/л. Полученную суспензию вносили в реактор, представляющий собой термостатируемую емкость с мешалкой. Рассчитанное количество акрилонитрила добавляли в реакционный раствор разово в начале реакции трансформации, дробно или непрерывно на протяжении всего процесса так, чтобы его концентрация не превышала 0.1 - 2.0 %. Гидролиз акрилонитрила проводили при температуре от 20 до 50°С при постоянном перемешивании Время реакции варьировали от 30 мин до 24 часов. Концентрацию компонентов реакционной смеси определяли методами газо-жидкостной хроматографии. По окончании микробной трансформации клетки отделяли центрифугированием.

Результаты экспериментов обрабатывались статистически с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе работы были изучены культуры из лабораторной коллекции, способные трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту без образования акриламида в качестве промежуточного продукта Однако низкий уровень активности коллекционных культур и необходимость внесения казаминовых кислот в среду культивирования для достижения высокой активности даже наиболее активного из коллекционных штаммов А1саИ%епез вр. ВКПМ В-6706 (Пат. № 2081169, 1995) заставили отказаться от их использования.

Для создания эффективного биокатализатора нами был продолжен скрининг бактерий с высокой нитрил азной активностью в местах непосредственного контакта природной микрофлоры с токсичными соединениями данного класса (акрилонитрил, акриламид, акриловая кислота).

Для выделения штаммов из объектов окружающей среды, расположенных в районах производств, выпускающих или потребляющих акрилонитрил и акриловую кислоту, были использованы традиционные методы прямого высева, накопительной культуры и ступенчатой адаптации (Карасевич, 1982). Метод накопительной культуры с использованием акрилонитрила в концентрации 3.0 г/л в качестве селектирующего агента позволил выделить из почвы, сточной воды и активного ила 38 изолятов. Дальнейшее изучение микроорганизмов, выделенных с помощью метода накопительной культуры,

показало, что лишь 13 из них трансформировали акрилонитрил, причем у 11 из них в реакционном растворе выявлен как акриламид, так и акриловая кислота. Только два штамма, с лабораторным шифром PI и Р2, позднее отнесенных к роду Pseudomonas, трансформировали акрилонитрил в акрилат аммония без образования акриламида в качестве интермедиата.

В результате селекции при применении метода ступенчатой адаптации из тех же проб почвы, сточной воды и активного ила с использованием акрилонитрила в возрастающей концентрации (за месяц культивирования концентрация была увеличена с 0,01 до 3.0 г/л) нами изолированы 117 штаммов, устойчивых к акрилоиитрилу в концентрации 3.0 г/л. Более детальное исследование микроорганизмов, выделенных вышеуказанным методом, показало, что 64 изолята не деградируют акрилонитрил, хотя растут в его присутствии, используя дополнительные источники питания. Гидролиз акрилонитрила 49 культурами сопровождался образованием акриламида в качестве промежуточного продукта, то есть, видимо, проходил с участием ферментов нитр илгидратазы и амидазы.

И только четыре штамма, РЗ, Р4, С-23 и С-32 трансформировали акрилонитрил под действием фермента нитр ил азы в акрилат аммония, утилизируя последний в процессе дальнейшего роста. Акриламид как интермедиат трансформации выявлен не был. Штаммы РЗ и Р4 были отнесены к роду Pseudomonas, а штаммы С-23 и С-32 - к роду Alcaligenes.

Таким образом, при исследовании 26 проб почвы, 56 проб сточных вод и 5 проб активного ила было выделено 155 культур, устойчивых к акрилонитрилу в концентрации 0.01-3 г/л. Среди них только 6 штаммов обладали нитрилазной активностью.

Проведенный скрининг штаммов, трансформирующих акрилонитрил в акрилат аммония без образования промежуточных продуктов, показал, что наибольшее количество микроорганизмов, устойчивых к акрилонитрилу, и все культуры, обладающие нитрилазной активностью, изолированы из почвы, взятой вблизи расположения емкостей хранения нитрила акриловой кислоты. Это, видимо, связано с наличием в ней селектирующего агента - следов акрилонитрила.

Показано, что штаммы, принадлежащие к родам Pseudomonas и Alcaligenes, существенно различались по способности трансформировать акрилонитрил. Средняя нитрил азная активность представителей рода Alcaligenes более чем в 8 раз превышала таковую у псевдомонад. Наибольшей активностью обладал штамм Alcaligenes sp. с лабораторным шифром С-32. Его удельная шприлазная активность составляла 2.23 ед/г. Поэтому именно этот ппамм, Alcaligenes sp. С-32, послужил объектом наших дальнейших исследований.

С целью видовой идентификации вышеуказанного штамма были подробно изучены его биологические характеристики, в соответствии с которыми он был идентифицирован как Alcaligenes denitrißcans.

Штамм Ака^епей йгпНгфссть С-32 - продуцент нитрилазы депонирован в соответствии с условиями Будапештского соглашения во Всероссийской коллекции микроорганизмов (УКМ) под номером В-2243 О.

В ходе работ по идентификации штамма было показано, что он не использует в качестве питательного субстрата углеводы и многоатомные спирты, а это значительно затрудняло работу по оптимизации среды для получения высокого урожая клеток. Поэтому, используя в качестве питательной среды бульон на переваре Хоттингера, нами исследованы некоторые доступные вещества, которые могли бы быть использованы в качестве дополнительных ростовых субстратов. Таковыми оказались этиловый и пропиловый спирты, а также уксусная и пропионовая кислоты. В то же время бутиловый спирт и этнлацетат не использовались штаммом Alcaligenes с1епи^1сапз С-32 как ростовые субстраты.

Нитрилаза штамма А1са^епе5 <1епЫп[1сат С-32, как и другие описанные в литературе нитрилутилизирующие ферментные системы, обладает широким спектром субстратной специфичности. Было установлено, что клетки штамма Alcaligenes с1етМАсат С-32 за счет проявления нитрилазной активности могли расти на синтетической среде, содержащей ацетонитрил, акрилонитрил, бутиронитрил, пропионигрил, изобутиронитрил, метакрилонитрил, бензонитрил, сукцинонитрил или цианопиридин, используя их как единственные источники углерода, азота и энергии. Рост культуры сопровождался трансформацией нитрила, продуктом которой являлась аммонийная соль соответствующей кислоты, которая и выступала в роли ростового субстрата. Такие нитрилы, как адипонитрил, кротононитрил, лактонитрил и хлорацетонитрил, клетками штамма С-32 не утилизировались.

Анализ состава среды культивирования при использовании этилового спирта в качестве единственного источника углерода показал, что под воздействием ферментной системы клеток штамма

Alcaligenes ¿[епИ^сапв С-32 спирт постепенно превращался в уксусную кислоту, которая и усваивалась микроорганизмами.

Продуктом трансформации ацетонитрила при росте культуры являлась аммонийная соль уксусной кислоты, которая и выступала в роли ростового субстрата (рис. 1). Известно, что ацетат аммония является промышленным сырьем, которое широко используется в микробиологической промышленности для культивирования многих штаммОв-продуцентов. Это позволило нам включить в состав среды в качестве единственного источника углерода и азота аммонийную соль уксусной кислоты.

3,5-

3,5

О 8 16 24 32

Время культивирования, ч

Рис.1. Изменение параметров культивирования при выращивании клеток штамма А1са^епез скпНп/1сст С-32 на среде, содержащей ацетонитрил -•-концентрация клеток, г/л

концентрация ацетонитрила, г/л

Несмотря на то, что штамм А1саИ%епе$ (кпИгфсапв С-32 способен расти на синтетической минеральной среде, содержащей лишь ацетат аммония в качестве единственного источника углерода, азота и энергии, прирост биомассы в этих условиях культивирования невелик. Для улучшения количественных характеристик его роста и нитрилазной активности нами были использованы различные питательные смеси растительного и животного происхождения.

Максимальная плотность культуры и достаточно высокая специфическая активность клеток получены при использовании в качестве питательной основы дрожжевого и кукурузного экстрактов. Кукурузный экстракт является доступным, недорогим промышленным сырьем, что позволило нам использовать его в дальнейшем в качестве питательной основы для культивирования штамма А1са1щепея йепИгфсат С-32.

Проведенные эксперименты по оптимизации концентрации ростового субстрата в среде показали, что концентрация ацетата аммония 10 г/л создает в среде оптимальное количество как ацетат-ионов, так и ионов аммония, что

нитрилазная активность клеток концентрация уксусной кислоты, г/л

позволяет обеспечить максимальную скорость роста клеток и их нитрилазную активность.

Добавление в среду культивирования различных нитрилов не оказывает индуцирующего влияния на нитрилазную активность штамма С-32. Более того, а-замещенные нитрилы, такие как лактонитрил и хлорацетонитрил, существенно ингибируют как рост культуры, так и нитрилазную активность клеток. Сильный индуктор для многих нитрилазных штаммов, е-капролактам (Nagasawa е! а1., 1990) в наших экспериментах не только не увеличивал нитрилазной активности штамма С-32, но даже подавлял его рост. Тем самым, мы сделали предположение о том, что синтез фермента нитрилазы у штамма А1са1^епез (¡епИгфсат С-32 конститутивен.

В результате проведенных работ по оптимизации солевого состава среды для выращивания клеток штамма Ака^епея йепИгфсат С-32 нами предложен следующий состав среды культивирования (г): Ыа2НР04 • 12Н20 - 6.0, КН2Р04 -2.0, М§Б04 • 7Н20 - 0.7, кукурузный экстракт - 5.0, ацетат аммония - 10.0, дистиллированная вода -1000.

Эта питательная среда, оптимизированная на основе стандартного, широко используемого в микробиологической промышленности сырья, и не содержащая дорогостоящих компонентов и индукторов, послужила основой для разработки промышленных условий культивирования штамма Alcaligenes <1епипАсстз С-32.

Сбалансировав состав среды, мы перешли к изучению зависимости урожая клеток и их ферментативной активности от таких важнейших параметров среды, как температура и уровень кислотности. Они не только влияют на скорость роста и выход биомассы, но могут изменять метаболизм и биохимический состав бактерий.

Было показано, что оптимальным температурным интервалом для получения максимального урожая клеток с высокой нитрилазной активностью является 30-32 "С. При более низких температурах (26-28°С) уменьшается скорость роста, но сохраняется высокий урожай и юприлазная активность клеток. При более высоких (34°С) значительно падает удельная активность, а при температуре культивирования 36°С - сокращается и выход биомассы.

Во время культивирования штамма А1саИ§епея йепйгфсат С-32 на среде, содержащей ацетат аммония, происходит изменение рН среды с 7.4±0.2 до 9.0±0.2. Эти изменения связаны с неравномерным потреблением ацетат-ионов и ионов аммония. Хотя среда содержит калий, натрий фосфатный буфер, его емкости не хватает для поддержания рН в заданном интервале. Тем не менее, оптимальное начальное значение кислотности среды, а, именно, рН 7.6 - 8.2, позволяет достичь максимальной скорости роста (табл. 1). При этих значениях показателя концентрации водородных ионов уже за 24 ч культивирования достигается максимальный урожай клеток с высокой нитрилазной активностью.

Таблица 1

Влияние рН среды на урожай и нитрил аз ную активность клеток штамма А1са^епез ¿етМАсст С-32

Начальное значение рН среды культивирования Время культивирования, ч

24 30

Урожай клеток, г/л Бл\ ед/г Урожай клеток, г/л Бд, ед/г

6.5 0 0 0 0

6.8 0.3±0.05 0.9±0.08 1.4±0.1 1.5±0.1

7.2 1.6±0.08 1.5±0.1 2.2±0.1 1.7±0.1

7.4 1.8±0.09 1.7±0.1 2.2±0.1 2.1±0.1

7.6 2.0±0.1 1.9±0.1 2.2±0.1 2.1±0.1

7.8 2.2±0.1 2.1±0.1 2.1*0.1 2.1±0.1

8.0 2.1±0.1 2.2±0.1 2.1±0.1 2.2±0.1

8.2 2.0±0.1 2.3±0.1 1.9±0.1 2.3±0.1

8.4 1.9±0.1 2.3±0.1 1.7±0.1 2.3±0.1

8.6 1.4±0.1 2.3±0.1 1.6±0.1 2.6±0.2

9.0 0 0 0 0

Примечание: Ба - удельная нитрилазная активность клеток

Необходимо отметить тот факт, «по при увеличении щелочности среды (8.2 - 8.6) снижается прирост биомассы, но возрастает ее удельная нитрилазная активность. При уровне кислотности среды ниже 6.5 и выше 9.0 рост отсутствует.

Результаты наших исследований хорошо согласуются с известным фактом снижения токсичности органических кислот для бактерий при повышении значений рН среды (Шлегель, 1985). Это связано с тем, что внутрь клетки тяжелее проникнуть заряженным ионам. Недиссоциированные молекулы органических кислот, число которых увеличивается со снижением значений показателя водородного потенциала, беспрепятственно проходят через клеточную мембрану, вызывая гибель клетки.

Изучив основные закономерности культивирования штамма А1са1^епея сктМ/мш С-32 на среде, содержащей ацетат аммония, мы исследовали параметры роста на данной среде других, выделенных в нашей лаборатории штаммов, проявляющих нитрил аз ную активность.

Все выделенные штаммы с нитрилазной активностью хорошо растут на среде, содержащей в качестве субстрата ацетат аммония, проявляя при этом заметную скорость гидролиза акрилонитрила при дальнейшей трансформации его в акрилат аммония.

Таблица 2

Урожай и нитрилазная активность клеток штаммов, выращенных на среде содержащей в качестве источника углерода и азота ацетат аммония

Штамм Урожай клеток, г/л Удельная нитрилазная активность, ед/г

Pseudomonas sp. Р 1 3.1±0.3 0.6±0.02

Pseudomonas sp. Р 2 3.0±0.3 0.32±0.02

Pseudomonas sp. P 3 2.5±0.2 0.19±0.02

Pseudomonas sp. P 4 2.4±0.2 1.4±0.1

Alcaligenes sp. С -23 2.2±0.1 1.7±0.1

Alcaligenes sp. Ib-3 1.5±0.1 1.0±0.1

Alcaligenes denitriflcans C-32 2.2±0.1 2.1±0.1

Таким образом, установленный нами сбалансированный состав среды и условий культивирования штамма Alcaligenes denitriflcans С-32 могут быть рекомендованы для выращивания и других бактерий - продуцентов нитрил азы, относящихся к родам Pseudomonas и Alcaligenes и не использующих углеводы или многоатомные спирты в качестве источника углерода.

Оптимизация состава питательной среды, pH и температурных режимов культивирования штамма Alcaligenes denitriflcans С-32 в условиях эксперимента позволили нам перейти к следующему этапу исследований -отработке процесса выращивания клеток пггамма-продуцента нитрил азы в лабораторных и промышленных ферментерах.

Использование для культивирования полусинтетических сред, содержащих ацетат аммония, не давало возможности получать высокий урожай клеток в колбах из-за более интенсивной ассимиляции ацетат-ионов по сравнению с ионами аммония, и как следствие, быстрого сдвига значений pH в щелочную сторону. Чтобы избежать отрицательного воздействия изменений кислотности среды на скорость роста и образование целевого фермента во время культивирования, дальнейшие эксперименты проводили в ферментере с автоматическим контролем pH. Для сохранения максимальной скорости роста и достижения высокой нитрилазной активности клеток культивирование проводили при поддержании значений pH на уровне 8.2±0.2. Для этого в питательную среду вводили раствор уксусной кислоты, являющейся в том числе и хорошим ростовым субстратом, по принципу обратной связи. Периодически оценивали урожай и нитрилазную активность клеток, уровень кислотности среды, концентрацию уксусной кислоты и ионов аммония. При выходе культуры на стационарную фазу роста (72 ч) культивирование прекращали. Отделение биомассы от культуральной жидкости осуществляли центрифугированием. Изменение концентрации клеток, состава питательной среды и нитрилазной активности представлены на рис.2.

Время,ч

Рис.2. Изменение параметров культивирования при выращивании клеток штамма Alcaligenes ёепигфсапя С-32 на среде "АС" в лабораторном ферментере

-•-концентрация клеток, г/л -♦—концентрация уксусной кислоты,/г/л

* концентрация ионов аммония,г/л ——удельная нитрил азная активность активность.ед/г

Как видно из приведенных на рис. 2 данных, за 72 ч роста получен урожай клеток, составляющий 4.93 г/л (по сухому весу) с нитрилазной активностью клеток 3.7 ед/г. Это в 2.2 раза выше по выходу биомассы и в 1.8 раза выше по уровню нитрилазной активности клеток, чем при культивировании в колбах без поддержания значений рН на оптимальном уровне. Анализ кривых убыли ацетат-иона и иона аммония убедительно свидетельствует о том, что именно падение концентрации ацетат-иона практически до нуля является причиной остановки роста культуры. Поэтому, в последующих экспериментах в среду после 18-20 ч культивирования дополнительно вводили ацетат аммония в количестве 7.5 г/л. Подтитровка раствором уксусной кислоты не позволяла повысить или сохранить на постоянном уровне ее концентрацию в культуральной среде из-за более интенсивного потребления клетками ацетат-ионов по сравнению с ионами

аммония.

Дополнительное внесение ростового субстрата, ацетата аммония, во время культивирования позволило за 72 ч увеличить урожай клеток штамма Alcaligenes denitriflcans С-32 до 9.3 г/л. Их нитрилазная активность достигла 5.7 ед/г. Штаммов с подобной нитрилазной активностью ранее в литературе описано не было (Nagasawa et al„ 1988; US Patent 5998180, 1997). Результаты культивирования, проведенного в указанных условиях, представлены в таблице 3.

В ходе исследований было изучено влияние аэрации на выход биомассы и ее ферментативную активность. Показано, что интенсивное насыщение среды культивирования кислородом позволяет добиться высокой нитрил азной активности при максимальном выходе биомассы.

Таблица 3

Изменения параметров культивирования в процессе выращивания клеток штамма А1саИ%епез скпигфсапз С-32 в оптимальных условиях_

Исследуемые параметры Время lo (шьтивирования, ч

0 12 24 36 48 60 72

Урожай клеток, г/л 0.1 0.7±0.1 2.4±0.2 4,6±0.4 8.5±0.5 9.0±0.6 9.3±0.6

Удельная нитрилазная активность, ед/г 0.8±0.1 1.2±0.1 2.3±0.2 4.1±0.3 4.9±0.4 5.7±0.4

Проведенные эксперименты позволили перейти к отработке процесса культивирования штамма А1са^епез <1гпШ$сат С-32 в промышленных условиях. Наработку биомассы осуществляли на базе ОАО "Биосинтез", г. Пенза, в ферментере объемом 2 м3. Имеющееся промышленное оборудование потребовало корректировки условий культивирования штамма, а так же внесения некоторых изменений в состав среды. Так, для увеличения количества клеток в единице объема посевного материала культуру подращивали на МПБ, содержащем 4 г/л этилового спирта. Затем суспензию клеток вносили в 300 литровый ферментер, заполненный оптимизированной средой "АВ". Культивирование проводили в течение 24 ч. Затем выросшую культуру использовали как инокулят для засева промышленного ферментера объемом 2 м3, содержащего 1500 литров среды "АС".

В связи с тем, что промышленный ферментер не был оснащен блоком автоматического титрования, уксусную кислоту вносили дробно, поддерживая рН в интервале 7.5-8.5. По окончании культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости сепарированием.

За 36 ч роста урожай клеток составил 7.6 г/л, а их удельная нитрилазная активность - 3.5 ед/г. Эта показатели несколько ниже полученных ранее на лабораторной установке, что, возможно, связано с более интенсивным

массообменом в промышленном ферментере, приводящим к выдуванию аммиака из культуральной среды. Биомасса штамма Alcaligenes denitrificans С-32, выращенная в вышеназванных условиях, была использована для получения первых партий биокатализатора С-32 для отработки условий процесса получения акрилата аммония.

Дальнейшие промышленные испытания, адаптированные к условиям производства, позволили начать плановый выпуск биокатализатора на основе биомассы штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

На следующем этапе исследований нами были оптимизированы условия трансформации акрилонитрила. Известно, что основными факторами, оказывающими влияние на процесс микробиологической трансформации, являются рН среды, температура, концентрация субстрата и продукта реакции, количество микробных клеток, вносимых в реакционный раствор, а также, суммарное влияние всех этих факторов. Изучение процесса трансформации при изменении этих параметров позволили определить оптимальные условия проявления специфической активности биокатализатора.

Исследование основных параметров процесса биотрансформации показало, что штамм Alcaligenes denitrificans С-32 обладает высокой термостабильностью фермента, а наибольшая нитрилазная активность клеток отмечается при температуре 65°С. Быстрая инактивация фермента (5 мин воздействия снизили удельную нитрилазную активность клеток на 61 %) происходит только при 70°С. Сопоставляя полученные результаты с литературными данными, следует отметить, что подобная термостабильность нитрил азы наблюдалась только у штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833 (US Patent 5998180, 1997), но способы получения акрилата аммония при высоких температурах в литературе не описаны (World Patent 97/21827, 1997). Это связано с тем, что при повышении температуры синтеза усиливается негативное влияние на фермент таких факторов, как токсичность субстрата и концентрация конечного продукта, что делает невозможным получение акрилата аммония в температурных режимах с максимальной активностью фермента. Тем не менее, нами установлено, что высокая термостабильность нитрилазы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволяет получать концентрированные растворы акрилата аммония при 30-40°С.

Так как кислотно-основные группы фермента должны находиться в определенном состоянии ионизации, для каждого фермента существует область значений рН, в которой его активность является наиболее выраженной. Оптимальным диапазоном значений рН, в которой клетки штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проявляют максимальную нитрилазную активность, являлся интервал рН 7.8 - 11 (рис. 3). Это выгодно отличает штамм Alcaligenes denitrificans С-32 от зарубежных аналогов (штамм Rhodococcus rhodochrous Jl), которые, как правило, имеют узкий интервал значений рН, в котором активна нитрил аза их клеток. Это делает необходимой подтитровку щелочью во время биотрансформации с использованием их штаммов, что усложняет процесс и требует жесткого контроля за ходом реакции (Pat. 5135858 US, 1992).

РН

Рис. 3. Влияние рН на нитрилазную активность клеток штамма ¿епНпАсат С-32

Процесс синтеза акрилата аммония с использованием штамма Ака^епез йепПпАсаю С-32 можно проводить в дистиллированной воде, предварительно скорректировав значение рН. Такая технология дает возможность получения чистых растворов акрилата аммония, не содержащих примесей неорганических солей, способных в дальнейшем ухудшить качество конечного продукта -полимера.

Удельная нитрилазная активность клеток штамма Ака^епея йчпИп^сат С-32 практически не зависит от начальной концентрации нитрила акриловой кислоты в реакционной смеси в интервале от 2.6 г/л и вплоть до предела растворимости субстрата. Эта характеристика нитрил азы штамма Akaligгnes йепИгфсаю С-32, на наш взгляд, также является весьма важной, так как позволяет вести процесс синтеза акрилата аммония, как при высоких, так и низких концентрациях акрилонитрила.

Более того, даже при более низких концентрациях акрилонитрила (1.3 г/л) скорость гидролиза с использованием клеток штамма А1са1^епех йетМАсаю С-32 не падает ниже 90 % от максимально возможной. Это позволяет заканчивать процесс получения концентрированных растворов акрилата аммония с концентрацией акрилонитрила на уровне предела обнаружения.

Оптимизация условий проведения гидролиза акрилонитрила клетками штамма Alcallgenes dertitrificans С-32 позволила нам разработать промышленную технологию получения акрилата аммония. Она сводится к следующему.

Для проведения процесса получения акрилата аммония биокатализатор при перемешивании суспендируется в фосфатном буфере или дистиллированной воде в количестве от 0.025 до 3% в интервале рН 7.0-11.0 и температуре от 0 до 65°С. Суспензия вносится в стеклянный или стальной реактор, представляющий собой термостатируемую емкость, снабженную механической мешалкой. Объем лабораторных реакторов составлял от 50 мл до 3-х л Затем, при перемешивании, подается акрилонитрил. Внесение нитрила акриловой кислоты в реакционную смесь может осуществляться различными способами: разовым добавлением, дробным или плавным, чтобы его начальная и текущая концентрация не превышала 01% В результате трансформации можно получать 10-50% растворы акрилата аммония. Время процесса зависит от концентрации клеток штамма, температуры реакционной среды и концентрации акрилата аммония, получаемой в реакции трансформации После окончания синтеза клетки отделяют от раствора фильтрованием или центрифугированием.

Высокая активность и термостабильность нитрил азы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволяли вести процесс получения акрилата аммония при низких микробных нагрузках, используя для увеличения скорости биоконверсии повышение температуры реакции вплоть до 40"С. Дополнительных энергозатрат для поддержания температуры во время биотрансформации не требуется, так как процесс гидролиза экзотермичен.

Изучение процесса синтеза акрилата аммония при различных температурах показало, что хотя при 40°С скорость трансформации наибольшая, накопления продукта реакции выше 35% не происходит. При 35°С максимальная концентрация акрилата аммония составила 40%, при 30°С -49.8% Это практически максимальная концентрация конечного продукта, так как водные растворы акрилата аммония с концентрацией выше 50% получить невозможно из-за ограниченной растворимости соли в воде. Мы остановились на концентрации акрилата аммония - 20 %, так как ее достаточно для синтеза широкого спектра анионных марок полимеров, с одной стороны, а с другой, -это делает процесс рентабельным, не увеличивая расходы биокатализатора или времени реакции.

Описанные в литературе микробиологические способы получения акрилата аммония представлены в виде лабораторных экспериментов, объемы образцов не превышают 1 л. Перейти к опытно-промышленным испытаниям авторам не позволяли характеристики использованных ими штаммов и некоторые ограничения разрабатываемых процессов. К их числу можно отнести невысокую удельную нитрилазную активность клеток штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 (US Patent 5998180, 1997), что приводит к увеличению микробной нагрузки, необходимой для получения концентрированных растворов акрилата аммония. Это загрязняет раствор

клеточными компонентами, ухудшая качество продукта, что и требует введения дополнительных стадий очистки.

Разработка промышленного получения биокатализатора С-32 и лабораторная отработка технологии получения на его основе акрилата аммония 18-20 % концентраций позволили нам перейти к промышленному внедрению способа. Условия проведения процесса характеризуются порционной схемой подачи акрилонитрила в реактор, представляющий собой стальную емкость с механической мешалкой, заполненный суспензией клеток в обессоленной воде. Использовалась минимальная микробная нагрузка (6-10 г/л). Температура проведения процесса 36±1°С. В результате за 6-10 ч синтеза образуются 18-20% растворы акрилата аммония. Этот процесс был масштабирован на действующей промышленной установке объемом 5.3 м3 компании "MSP", г. Пермь. Параметры, отработанные в лаборатории, воспроизвелись в пилотных испытаниях и промышленных синтезах. В настоящее время в компании "MSP", г. Пермь, работает промышленная установка проектной мощности 500 т в год в пересчете на 100% акриловую кислоту.

Водные растворы акрилата аммония, полученные с использованием биокатализатора на основе клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 эквивалентны акрилату аммония полимерного сорта, приготовленному традиционными химическими способами. Полученный продукт может быть преобразован в иную химическую форму, например, в кислоту или соль щелочного металла. Чистота и качество мономеров позволяют синтезировать полимеры с заданными свойствами.

Таким образом, селекция штамма Alcaligenes denitrificans С-32 -продуцента фермента нитрил азы, оптимизация условий его культивирования, позволили создать высокоакпшный биокатализатор С-32, разработать промышленную технологию его получения и использования для создания биокаталитического процесса получения акрилата аммония.

Процесс синтеза растворов акрилата аммония с концентрацией 18-20 % внедрен в промышленное производство.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция микроорганизмов, обладающих нитрилазной активностью. Бактерии относятся к родам Pseudomonas и Alcaligenes,

2. Выделен и идентифицирован штамм бактерий Alcaligenes denitrificans С-32 - продуцент нитрилазы (патент № 2177034 РФ), обладающий высокой активностью фермента, на базе которого создан биокатализатор С-32 для промышленного получения акрилата аммония. Изучены индукция и субстратная специфичность нитрилазы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32, путь трансформации нитрилов.

3. Оптимизирована среда культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32. Основное преимущество среды - отсутствие токсичных и летучих нитрилов. Ростовыми и питательными субстратами является стандартное, широко используемое в микробиологической

промышленности сырье - ацетат аммония и кукурузный экстракт.

4. Оптимизированы условия процесса культивирования штамма Alcaligenes denitriflcans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания-рН, температура, аэрация, схема подачи ростового субстрата. Данные условия позволили увеличить урожай биомассы до 9.3 г/л, удельную нитрил аз ную активность до 5.7 ед/г.

5. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез", г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Alcaligenes denitriflcans С-32, которая используется компанией "Биоамид" для производства биокатализатора С-32.

6. Оптимизированы условия трансформации акрилонитрила клетками штамма Alcaligenes denitriflcans С-32, позволяющие получать в лабораторных условиях растворы акр штата аммония концентрацией до 50%.

7. С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18-20% водных растворов акрилата аммония.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Синолицкий М.К., Полтавская C.B., Рогачева С.М., Севрюгина И.В., Воронин С.П. Выделение нитрилгидратазы из клеток Rhodococcus rhodochrous М8 и определение N-концевой аминокислотной последовательности субъединиц // Прикл. биохим. микробиол. - 1997. - Т. 33, № 4. - С.383-387.

2. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин C.B., Воронин С.П. Выделение бактериальных штаммов-продуцентов амидазы и нитрилазы // Тез. докл. семинар-презентации "Биотехнология - 2000". -Пущино, 2000. - С. 86-87.

3. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин C.B., Воронин С.П. Оптимизация условий культивирования штамма Alcaligenes sp. -продуцента фермента нитрилазы // Тез. докл. семинар-презентации "Биотехнология - 2000". - Пущино, 2000. - С. 85-86.

4. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Воронин С.П. Разработка экологически безопасного биотехнологического способа получения акриловой кислоты // Сб. науч. тр. "Экологизация подготовки специалистов в ВУЗах. Утилизация и переработка отходов". - Саратов, 2001. - С. 67-71.

5. Полтавская C.B., Козулин C.B., Воронин С.П., Байбурдов Т.А., Ступенькова Л.Л., Хоркина Н.А. Биотехнология получения акрилата аммония // Тез. докл. "Биотехнологии - 2001". - Пущино, 2001. -С. 126-128.

6. Полтавская C.B. Биотехнологическое получение акрилата аммония // Матер. 1-го Московского международного конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития". - М., 2002. - С. 233-234.

7. Полтавская C.B., Сингирцев И.Н., Козулина Т.Н., Литвинов О.В., Козулин C.B., Воронин С.П. Биотехнологическое получение акрилата аммония // Тез. докл. семинар-презентации "Биотехнология - 2003". -Пущино, 2003. - С. 107-108.

8. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин C.B., Шуб Г.М., Воронин С.П. Разработка и внедрение биокаталитического способа получения акриловой кислоты. 1. Выделение штамма Alcaligenes denitrificans, трансформирующего акрилонитрил в акрилат аммония. Оптимизация среды культивирования // Биотехнология. - 2004. - № 1. - С. 62-70.

9. Полтавская C.B., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин C.B., Воронин С.П. Штамм бактерий Alcaligenes denitrificans С-32 - продуцент нитрилазы И Пат. N 2177034 РФ Cl 7 С 12 N 1/20, 9/78// (С 12 N 9/78, С 12 R 1:05).

Выражаем огромную признательность и искренне благодарим действительного члена РАЕН, доктора медицинских наук, профессора Геннадия Марковича Шуба за глубокий анализ нашей работы, за всестороннюю помощь в обсуждении и представлении полученных результатов.

Отпечатано в типографии ООО «Фиеста-2000». 410033, г. Саратов, ул. Панфилова,I, корп. 3 «А»

»14752

РНБ Русский фонд

2006-4 11852

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полтавская, Светлана Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Акриловая кислота. Ее свойства и области применения. Способы получения акриловой кислоты.

1.2. Микробная утилизация нитрилов: механизмы реакций микробной утилизации нитрилов. Характерисика ферментных систем. Промышленные аспекты применения нитрилутилизирующих микроорганизмов.

1.3. Микробиологическая трансформация акрилонитрила в акрилат аммония: характеристика штаммов, условий культивирования, параметров процесса биотрансформации.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Исследуемые объекты и штаммы микроорганизмов.

2.2. Среды.

2.3. Исследуемые соединения.

2.4. Методы выделения микроорганизмов, способных трансформировать акрилонитрил в акрилат аммония.

2.5. Идентификация культур.

2.6. Определение концентрации микробных клеток.

2.7. Изучение нитрилазной активности выделенных штаммов микроорганизмов.

2.7.1. Определение нитрилазной активности интактных клеток штаммов-продуцентов нитрилазы.

2.7.2. Изучение возможности использования нитрилов для роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.7.3. Изучение индуцирующей способности нитрилов.

2.7.4. Исследование влияния состава питательной среды на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.8. Исследование условий культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.8.1. Изучение физиологических параметров роста штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.8.2. Изучение процесса роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в ферментере с периодическим режимом культивирования.

2.9. Изучение процесса трансформации акрилонитрила в акрилат аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.9.1. Оптимизация условий реакции гидролиза акрилонитрила.

2.9.2. Исследование основных технологических параметров процесса получения акрилата аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АКРИЛОНИТРИЛ В АКРИЛАТ АММОНИЯ.

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА НИТРИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА С-32.

ГЛАВА 5. ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА ALCALIGENES DENITRIFICANS С-32 - ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТА НИТРИЛАЗЫ.

5.1. Изучение параметров роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на питательной среде, содержащей перевар Хоттингера.

5.2. Изучение параметров роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на среде, содержащей ацетонитрил в качестве единственного источника углерода, азота и энергии.

5.3. Влияние различных питательных основ на параметры роста культуры Alcaligenes denitrificans С-32.

5.4. Влияние концентрации ацетата аммония на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

5.5. Влияние неорганических солей на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

5.6. Влияние нитрилов на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes den itrificans C-32.

5.7. Изучение влияния температуры и кислотности среды на скорость роста и нитрилазную активность штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

5.8. Исследование роста коллекционных штаммов, обладающих нитрилазной активностью, на среде, содержащей ацетат аммония.

ГЛАВА 6. ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ШТАММА ALCALIGENES DENITRIFICANS С-32 В РЕАКТОРАХ С ПЕРИОДИЧЕСКИМ РЕЖИМОМ ВЫРАЩИВАНИЯ.

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛАТА АММОНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШТАММА ALCALIGENES DENITRIFICANS C-32 - ПРОДУЦЕНТА

ФЕРМЕНТА НИТРИЛАЗЫ.

7.1. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония клетками штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

7.2. Разработка процесса получения акрилата аммония.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биокаталитическое получение акрилата аммония"

Методы промышленного получения органических соединений с использованием микроорганизмов условно можно разделить на две группы: биосинтетические и биокаталитические [69]. Методы биосинтеза представляют собой образование новых веществ, осуществляемое клетками в процессе роста на основе питательных компонентов среды. В результате синтезируются природные соединения, в низкой концентрации и трудно выделяемые. Сегодня в промышленном масштабе этим методом получают многие аминокислоты, некоторые антибиотики, лимонную, глюконовую, молочную, уксусную и другие кислоты.

Методы биокатализа предполагают использование клеток микроорганизмов как источник ферментов, катализирующих специфические реакции трансформации субстрата, и предполагает проводить получение веществ in vitro. Общей чертой всех трансформаций является изменение молекулярной структуры трансформируемого вещества, а не синтез новой молекулы. С помощью данного подхода производят амиды (например, акриламид, метакриламид, никотинамид), органические кислоты (например, аспарагиновую и итаконовую), пептиды, витамины, коферменты; осуществляют трансформацию стероидов, алкалоидов, Сахаров и липидов, модифицируют природные антибиотики. Микробиологическая трансформация позволяет получать чистые вещества в мягких условиях, с высоким выходом, на основе неприродных субстратов.

Производство химических веществ биокаталитическими методами имеет целый ряд преимуществ: специфичность, работа при невысоких температурах, простота конструктивного оформления процесса, поэтому они начинают составлять серьезную конкуренцию традиционным химическим синтезам [15].

В последние десятилетия появились сообщения о возможностях использования бактерий, способных трансформировать алифатические и ароматические нитрилы органических кислот в практически важные продукты - амиды и кислоты [45]. Синтез акриламида с использованием микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью, реализован в Японии и России в промышленных масштабах [15, 52, 75]. Биотехнология получения акриловой кислоты находилась на лабораторном уровне.

Сополимеры акриламида, акриловой кислоты или ее солей широко используются как флокулянты, суперабсорбенты и диспергаторы. Полимеры акриловой кислоты находят применение в экологосберегающих технологиях: укрепления поверхности горных отвалов, предотвращения выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв, обезвоживания активного ила очистных сооружений. Акриловая кислота и ее производные необходимы в производстве лаков, красок, стройматериалов, товаров бытовой химии [3].

Примерно 55% производимой в мире акриловой кислоты используется для выработки акриловых эфиров. В последние годы мировые мощности по производству акриловой кислоты увеличивались в среднем на 400 тыс. т в год и к концу 2004 г., по оценке компании Technon Orbi-Chem, они достигли 3.4 млн. т в год. По прогнозу ведущих производителей спрос на акриловую кислоту в ближайшие годы будет увеличиваться на 3.5 - 5 % в год и к 2009 г. мировые потребности составят 4 млн. т.

В России потребление продуктов на основе акриловой кислоты и ее производных в последние годы стремительно растет. Единственный завод по химическому производству акриловых мономеров начал работу в четвертом квартале 2004 года в г. Дзержинске Нижегородской области. Технология получения акриловой кислоты основана на использовании пропилена, продукта глубокой переработки нефти, с последующим его окислением. Проектная мощность завода составила 25 тыс. тонн сырой акриловой кислоты (эфирного сорта) в год, из которых будет производиться около 2.5 тыс. тонн ледяной акриловой кислоты (полимерного сорта) и до 40 тыс. тонн эфиров. Но даже пуск этого химического производства не решает в полном объеме проблему получения акриловой кислоты полимерного сорта, необходимой в производстве высокомолекулярных полимеров. Именно они используются в нефтедобывающей отрасли, при производстве товаров бытового назначения (суперабсорбенты), в калийной промышленности.

Возрастающая потребность в акриловых полимерах и существенные энергетические, экономические и экологические проблемы, связанные с химическим синтезом акриловой кислоты, делают весьма актуальной задачу разработки биокаталитического способа получения акриловой кислоты, в частности, акрилата аммония на основе использования оригинальных штаммов микроорганизмов, обладающих высокой нитрилазной активностью. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

1. Создание коллекции микроорганизмов, трансформирующих нитрилы в соответствующие кислоты, селекция штамма с максимальной активностью.

2. Оптимизация условий культивирования штамма, обладающего максимальной активностью фермента нитрилазы.

3. Разработка ферментационного процесса промышленного получения биомассы штамма - продуцента нитрилазы.

4. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Выделенные штаммы обладают высокой нитрилазной активностью и способны трансформировать нитрилы в широком диапазоне рН и температуры. Штамм Alcaligenes denitrificans С-32, проявляющий максимальную нитрилазную активность, и условия его культивирования защищены патентом РФ № 2177034, приоритет от 03.04.2001.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Реализованы в промышленном масштабе процессы получения биомассы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 и биокатализатора С-32 на ее основе.

Работа является частью комплексных исследований проводимых в ЗАО

Биоамид", направленных на создание биокаталитического способа получения акрилата аммония.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

4. Разработаны условия культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания, позволяющие получать 9.3 г/л биомассы с удельной нитрилазной активностью до 5.7 ед/г.

7. С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18 - 20% водных растворов акрилата аммония.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на Российских и Международных семинарах-презентациях, конференциях "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 2000, 2001 и 2003 гг.; "Экологизация подготовки специалистов в ВУЗах. Утилизация и переработка отходов", Саратов, 2001 г.; на Первом и Третьем Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2002, 2005 гг.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 патент и 2 статьи.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Полтавская, Светлана Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция микроорганизмов, обладающих нитрилазной активностью. Бактерии относятся к родам Pseudomonas и Alcaligenes.

4. Оптимизированы условия процесса культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания: рН, температура, аэрация, схема подачи ростового субстрата. Данные условия позволили увеличить урожай биомассы до 9.3 г/л, удельную нитрилазную активность до 5.7 ед/г.

5. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез", г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Alcaligenes denitrificans

• С-32, которая используется компанией "Биоамид" для производства биокатализатора С-32.

6. Оптимизированы условия трансформации акрилонитрила клетками штамма Alcaligenes denitrificans С-32, позволяющие получать в лабораторных условиях растворы акрилата аммония концентрацией до 50%.

С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18-20% водных растворов акрилата аммония.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Акриловая кислота и ее соли служат сырьем для получения широкого спектра полимерных продуктов. Материалы на основе полимеров и сополимеров акриловой кислоты используются в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства. Они находят применение в экологосберегающих технологиях: очистка сточных вод, укрепление поверхности горных отвалов, предотвращение выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв, обезвоживание активного ила очистных сооружений. Анионные полимеры, представляющие собой сополимеры акриламида и акриловой кислоты, широко используются как флокулянты, суперабсорбенты и диспергаторы.

Современным промышленным способам получения акриловой кислоты присущи многие особенности, характерные для химических синтезов: высокая температура, многостадииность процесса, отравление катализатора, полимеризация продуктов реакции и наличие побочных продуктов, создающих проблему их утилизации. В связи с этим актуальна разработка биокаталитического способа производства, в частности, - с применением микроорганизмов, продуцирующих фермент нитрилазу.

В настоящее время известны бактерии, способные гидролизовать алифатические и ароматические нитрилы органических кислот, что делает их перспективными для получения важных продуктов - амидов и кислот. В 90-х годах XX столетия реализованы крупномасштабные * биокаталитические процессы получения амидов, наиболее ценными среди которых являются акриламид, метакриламид и никотинамид. Однако биотехнология получения органических кислот, в частности акриловой, по причине тех или иных недостатков находилась на лабораторном уровне.

Поэтому целью настоящей работы явилось выделение и микробиологическая характеристика штамма, обладающего нитрилазной активностью, создание на его основе высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка основанного на его применении процесса получения водных растворов акрилата аммония.

На первом этапе работы нами изучались культуры из лабораторной коллекции, способные трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту без образования акриламида в качестве промежуточного продукта. Однако низкий уровень активности коллекционных образцов и необходимость внесения казаминовых кислот в среду культивирования для достижения высокой активности даже наиболее активного из коллекционных штаммов Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 заставили отказаться от их использования.

Для создания эффективного биокатализатора нами проведен скрининг бактерий с высокой нитрилазной активностью, выделенных из мест непосредственного контакта природной микрофлоры с токсичными соединениями данного класса. Были использованы традиционные методы прямого высева, накопительной культуры и ступенчатой адаптации. Выделение штаммов вели из объектов окружающей среды, расположенных в районах производств, выпускающих или потребляющих акрилонитрил и акриловую кислоту.

Метод накопительной культуры с использованием акрилонитрила в концентрации 3.0 г/л в качестве селектирующего агента позволил выделить из почвы, сточной воды и активного ила таких производств 38 изолятов. В результате селекции при применении метода ступенчатой адаптации из тех же проб почвы, сточной воды и активного ила с использованием акрилонитрила в возрастающей концентрации (за месяц культивирования концентрация была увеличена с 0.01 до 3.0 г/л) нами изолированы 117 штаммов, устойчивых к акрилонитрилу в концентрации 3.0 г/л.

Скрининг микроорганизмов, выделенных с помощью метода накопительной культуры, показал, что лишь 13 из них трансформировали акрилонитрил, причем у 11 в реакционном растворе выявлен как акриламид, так и акриловая кислота. И только два штамма, с лабораторным шифром Р1 и Р2, позднее отнесенных к роду Pseudomonas, трансформировали акрилонитрил в акрилат аммония без образования акриламида в качестве интермедиата.

Детальное исследование 117 микроорганизмов, выделенных методом ступенчатой адаптации, показало, что 64 изолята не деградируют акрилонитрил, хотя растут в его присутствии, используя дополнительные источники питания. Гидролиз акрилонитрила 49 культурами сопровождался образованием акриламида в качестве промежуточного продукта. И только четыре штамма, РЗ, Р4, С-23 и С-32, трансформировали акрилонитрил в акрилат аммония, под действием фермента нитрилазы. Акриламид, как интермедиат трансформации, выявлен не был. Штаммы РЗ и Р4 были отнесены к роду Pseudomonas, а штаммы С-23 и С-32 - к роду Alcaligenes.

Таким образом, при исследовании 26 проб почвы, 56 проб сточных вод и 5 проб активного ила было выделено 155 культур, устойчивых к акрилонитрилу в концентрации 0.01-3 г/л. Среди них 6 штаммов обладали нитрилазной активностью.

Выделенные микроорганизмы, обладающие ферментом нитрилаза, были исследованы на способность трансформировать акрилонитрил.

Было показано, что штаммы, принадлежащие к родам Pseudomonas и Alcaligenes, существенно различались по биокаталитической активности. Средняя нитрилазная активность представителей рода Alcaligenes более чем в 8 раз превышала таковую у псевдомонад. Наибольшей активностью обладал штамм Alcaligenes sp. с лабораторным шифром С-32. Его удельная нитрилазная активность составляла 2.23 ед/г. Поэтому именно этот штамм, Alcaligenes sp. С-32, послужил объектом наших дальнейших исследований.

С целью видовой идентификации штамма С-32 были подробно изучены его биологические характеристики. Штамм с лабораторным номером С-32 был идентифицирован как Alcaligenes denitrificans.

Штамм Alcaligenes denitrificans С-32 - продуцент нитрилазы депонирован в соответствии с условиями Будапештского соглашения во Всероссийской коллекции микроорганизмов (VKM) под номером В-2243 D.

Проведенные работы по идентификации штамма показали, что он не использует в качестве питательного субстрата углеводы и многоатомные спирты, а это значительно затрудняло работу по оптимизации среды для получения высокого урожая клеток. Поэтому, используя в качестве питательной среды бульон на переваре Хоттингера, мы исследовали некоторые доступные вещества на их способность служить дополнительным ростовым субстратом. Было показано, что хорошими дополнительными субстратами для роста клеток являются этиловый и пропиловый спирты, а также уксусная и пропионовая кислоты.

Анализ состава среды культивирования при использовании этилового спирта в качестве единственного источника углерода показал, что он под воздействием ферментной системы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 постепенно превращается в уксусную кислоту, которая и усваивается микроорганизмами.

Продуктом трансформации ацетонитрила при росте культуры является аммонийная соль уксусной кислоты, выступающая в роли ростового субстрата. Известно, что ацетат аммония является промышленным сырьем, которое широко используется в микробиологической промышленности для культивирования многих штаммов-продуцентов. Это позволило нам использовать в качестве единственного источника углерода и азота аммонийную соль уксусной кислоты.

Хотя штамм Alcaligenes denitrificans С-32 способен расти на синтетической минеральной среде, содержащей лишь ацетат аммония в качестве единственного источника углерода, азота и энергии, прирост биомассы в этих условиях культивирования невелик. Максимальные показатели роста и достаточно высокой специфической активности клеток получены при использовании в качестве питательной основы дрожжевого и кукурузного экстрактов. Кукурузный экстракт является доступным недорогим промышленным сырьем, что позволило нам использовать его в качестве питательной основы для культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в дальнейшей работе.

Проведенные эксперименты показали, что концентрация ацетата аммония 10 г/л создает в среде оптимальное количество как ацетат-ионов, так и ионов аммония, что позволяет обеспечить максимальную скорость роста клеток и их нитрилазную активность.

Добавление в среду культивирования различных нитрилов не оказывает индуцирующего влияния на нитрилазную активность штамма С-32. Более того, а-замещенные нитрилы, такие как лактонитрил и хлорацетонитрил, существенно ингибируют как рост культуры, так и нитрилазную активность клеток. Сильный индуктор для многих нитрилазных штаммов, е-капролактам, в наших экспериментах не только не увеличивал нитрилазной активности штамма С-32, но даже подавлял его рост. Тем самым, мы подтвердили наше предположение о том, что синтез фермента нитрилазы у штамма Alcaligenes denitrificans С-32 конститутивен.

В результате проведенных работ по оптимизации солевого состава среды для выращивания клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 нами предложен следующий состав среды культивирования (г): Na2HP04 • 12Н20 -6.0, КН2Р04 - 2.0, MgSC>4 • 7Н20 - 0.7, кукурузный экстракт - 5.0, ацетат аммония -10.0, дистиллированная вода - 1000.

Ill для разработки условий промышленного культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

Сбалансировав состав среды, мы перешли к изучению зависимости роста клеток и их ферментативной активности от таких важнейших параметров, как температура и уровень кислотности. Эти параметры не только влияют на скорость роста и выход биомассы, но могут изменять метаболизм и химический состав бактерий.

Оптимальный температурный режим для получения максимального урожая клеток с высокой нитрилазной активностью составляет 30-32 °С. Во время культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на среде, содержащей ацетат аммония, происходит изменение рН среды с 7.4±0.2 до 9.0±0.2. Эти изменения связаны с неравномерным потреблением отдельных компонентов среды, а именно, ацетат-иона и иона аммония. Тем не менее, оптимальное начальное значение кислотности среды, позволяет достичь максимальной скорости роста. Максимальная скорость роста наблюдается в интервале значений рН 7.6 - 8.2. При этих значениях показателя концентрации водородных ионов уже за 24 часа культивирования достигается максимальный съем биомассы с высокой нитрилазной активностью.

Оптимизация состава питательной среды, рН и температурных режимов культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в условиях периодического культивирования в колбах позволила нам перейти к следующему этапу исследования - отработке процесса выращивания клеток штамма-продуцента нитрилазы в лабораторных, а в последствии, и промышленных ферментерах.

Использование для культивирования полусинтетических сред, содержащих ацетат аммония, не давало возможности получать высокий урожай клеток в колбах из-за быстрого сдвига значений рН в щелочную сторону в результате неравномерного потребления из среды ионов аммония и ацетат-ионов. Чтобы избежать отрицательного воздействия изменений показателя водородного потенциала на скорость роста и образование специфического фермента во время культивирования, в дальнейших экспериментах, проводимых в ферментере, контролировалось значение рН. Для сохранения максимальной скорости роста и достижения высокой нитрилазной активности клеток культивирование проводили при автоматическом поддержании значений рН на уровне 8.2±0.2. Для этого в ферментационную среду вводили раствор уксусной кислоты по принципу обратной связи. Уксусная кислота также являлась дополнительным ростовым субстратом.

В результате за 72 часа роста получен урожай клеток, составляющий 4.93 г/л (по сухому весу) с нитрилазной активностью клеток 3.7 ед/г. Анализируя изменение параметров культивирования, мы пришли к выводу, что именно падение концентрации ацетат-иона практически до нуля является причиной остановки роста культуры. Поэтому, в последующих экспериментах в среду после 18-20 часов культивирования дополнительно вводили ацетат аммония в количестве 7.5 г/л.

В ходе исследований было изучено влияние аэрации на выход биомассы и ее ферментативную активность. Показано, что интенсивное насыщение среды культивирования кислородом позволяет добиться высокой нитрилазной активности при максимальном выходе биомассы.

Оптимизация вышеуказанных параметров ферментации позволила за 72 часа культивирования увеличить урожай клеток штамма Alcaligenes

• denitrificans С-32 до 9.3 г/л, а нитрилазная активность достигла 5.7 ед/г. Штаммов с подобной нитрилазной активностью ранее в литературе описано не было.

Масштабирование процесса ферментации осуществляли на базе центральной лаборатории ОАО "Биосинтез", г. Пенза, в ферментере объемом 2 м . Посевной материал вносили в 300 литровый ферментер, заполненный оптимизированной средой. Культивирование проводили в течение 24 часов. Затем выросшую культуру использовали как инокулят для засева промышленного ферментера объемом 2 м3, содержащего 1500 литров среды. Уксусную кислоту вносили дробно, по мере сдвига значений рН выше 8.5. По окончании культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости сепарированием.

За 36 часов культивирования урожай клеток составил 7.6 г/л, а их удельная нитрилазная активность 3.5 ед/г. Эти показатели несколько ниже полученных ранее на лабораторной установке, что, возможно, связано с более интенсивным массообменом в промышленном ферментере, приводящим к выдуванию аммиака из культуральной среды.

Таким образом, в результате проведенного исследования была разработана среда и оптимизированы условия культивирования, позволившие начать промышленный выпуск биокатализатора на основе * штамма Alcaligenes denitrificans С-32 с января 2005 года.

Оптимальной областью значений рН, в которой клетки штамма т Alcaligenes denitrificans С-32 проявляют наибольшую нитрилазную активность, является интервал рН 7.8 - 11. Однако было показано, что начальный уровень кислотности среды при получении концентрированных растворов акрилата аммония не должен превышать значений 9.0.

Биосинтез акрилата аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32 можно проводить в дистиллированной воде, предварительно скорректировав значение рН. Такая технология дает возможность получения более чистых растворов акрилата аммония, содержащих минимальное количество примесей неорганических солей, способных в дальнейшем ухудшить качество конечного продукта -полимера.

Удельная нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 практически не зависит от начальной концентрации нитрила акриловой кислоты в реакционной смеси вплоть до предела растворимости субстрата. Выявленная характеристика нитрилазы штамма Alcaligenes denitrificans С-32 является, на наш взгляд, весьма важной, так как позволяет вести процесс синтеза акрилата аммония, как при высоких, так и низких концентрациях акрилонитрила. Более того, при низких концентрациях акрилонитрила -1.3 г/л, скорость гидролиза с использованием клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 не падает ниже 90 % от максимально * возможной. Это позволяет заканчивать процесс получения концентрированных растворов акрилата аммония с содержанием акрилонитрила ниже предела обнаружения.

Оптимизация условий проведения гидролиза акрилонитрила клетками штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволила разработать промышленную технологию получения акрилата аммония.

Для проведения процесса получения акрилата аммония клетки биокатализатора при перемешивании суспендировали в фосфатном буфере или дистиллированной воде в количестве от 0.025 до 3% в интервале » рН 7.0-11.0 и температуре от 0 до 65°С. Суспензия вносилась в стеклянный или стальной реактор, представлявший собой термостатируемую емкость, снабженную механической мешалкой. Затем, при перемешивании, подавали акрилонитрил. Внесение нитрила акриловой кислоты в реакционную смесь осуществляли различными способами: разовым добавлением, дробным или плавным, так, чтобы его начальная и текущая концентрация не превышала

0.1%. В результате трансформации можно получать 10-50% растворы акрилата аммония. Время процесса зависит от концентрации клеток штамма, температуры реакционной среды и концентрации акрилата аммония, получаемой в реакции трансформации. После окончания синтеза клетки отделяли от раствора фильтрованием или центрифугированием.

Высокая активность и термостабильность нитрилазы клеток штамма

Alcaligenes denitrificans С-32 позволяет вести процесс получения акрилата аммония при низких микробных нагрузках, используя для повышения скорости биоконверсии повышение температуры реакции вплоть до 40°С. Это можно сделать без дополнительных энергозатрат, так как процесс трансформации экзотермичен.

Условия проведения процесса в промышленных условиях характеризуются упрощенной схемой подачи акрилонитрила в реактор, заполненный суспензией клеток в деионизированной воде. Используется минимальная микробная нагрузка (2 г/л). Температура проведения процесса 36±1°С. В результате за 6-8 часов синтеза можно получить 18-20% растворы акрилата аммония.

Этот процесс был масштабирован на действующей промышленной установке объемом 5.3 м3 компании "MSP", г. Пермь. Опытные работы по получению 10-20 % растворов акрилата аммония в промышленных условиях с использованием биокатализатора С-32 оказались успешными и полностью воспроизводили результаты, полученные в лабораторных экспериментах. В настоящее время в компании "MSP", г. Пермь, работает промышленная * установка объемом выпуска 500 т в год в пересчете на 100 % акриловую кислоту.

Водные растворы акрилата аммония, полученные с использованием клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 эквивалентны акрилату аммония полимерного сорта, приготовленному традиционными химическими способами. Акрилат аммония может быть переведен в иную химическую форму, например, в свободную кислоту или соль щелочного металла. Чистота и качество мономеров позволяют синтезировать полимеры с заданными свойствами.

Таким образом, селекция штамма Alcaligenes denitrificans С-32 -продуцента фермента нитрилазы, оптимизация условий его культивирования, позволили создать высокоактивный биокатализатор С-32 и разработать промышленную технологию его получения.

С использованием этого биокатализатора разработан и внедрен в промышленность процесс синтеза растворов акрилата аммония с концентрацией основного вещества 18-20 %.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полтавская, Светлана Викторовна, Саратов

1. Акриловые олигомеры и материалы на их основе / Берлин А.А., Королев Г.В., Кефели Т.Я., Сиверчик Ю.М. // М: Химия. 1983. - 356 с.

2. Астаурова О.В., Погорелова Т.Е., Фомина О.Р. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у Rhodococcus rhodocrous МО / Биотехнология. 1991. -№ 5. - С. 10-14.

3. Беленький П.Г. Применение высокомолекулярных композиционных материалов для интенсификации технологических процессов и охраны окружающей среды / Научно-технический процесс в производственном объединении "Аппатит'7/ М.: Наука, 1989. 93 с.

4. Биотехнология. Принципы и применение; Пер. с англ. / Под ред. И. Хиггенса, Д. Беста, Дж. Джонса. М.: Мир, 1988. - 480 с.

5. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология: Кинетические основымикробиологических процессов: Учеб.пособие для биол. и хим. спец.вузов. М.: Высш.шк., 1990. - 296 с.

6. Забазная Е.В., Козулин С.В., Воронин С.П. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту // Прикладная биохимия и микробиология.- 1998.- Т. 34, № 4.- С. 377-381.

7. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982. - 179 с.

8. Келети Т. Основы ферментативной кинетики: Пер.с англ. М.: Мир, 1990. -350 с.

9. Марч Дж. Органическая химия: Пер. с англ. В 4-х т. М.: Мир, 1987.1. С. 356-358.

10. Ю.Методы общей бактериологии. В 3-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Ф.

11. Герхарда и др. М.: Мир, 1984. - Т.З. - 264 с. 11.Обзоры по отдельным производствам химической промышленности: Вып. 20. - М.: НИИТЭХим, 1978. - 67 с.

12. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса.- М.: Мир, 1997. -432 с.

13. Пат. 2081169 С 1 RU, МКИ6 С12 N 9/78, С12 Р7/40, 13/02, С12 R 1:05. Штамм бактерий Alcaligenes species продуцент нитрилазы / Забазная Е.В., Козулин С.В., Куликова JI.K., Воронин С.П. - 10 с.

14. Полиакриламид / Абрамова Л.И., Байбурдов Т.А., Григорян Э.П. // Под ред. Куренкова В.Ф. М.: Химия, 1992. - 192 с.

15. Темкин О.Н. Промышленный катализ и экологически безопасные технологии. М.: Химия, 1996.

16. Химическая энциклопедия / Под ред. Кнунянца И.Л. М.: Советская энциклопедия, 1988. - С. 117-118.

17. Химический энциклопедический словарь / Под ред. Кнунянца И.Л. М.: Советская энциклопедия, 1983. - С. 454.

18. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.: Мир, 1987. - 567 с.

19. Almatawah Q., Cramp R., Cowan D. Characterization of an inducible nitrilase from a thermophilic bacillus // Extremophiles. 1999. - N 3. - P. 283-291.

20. Amarant Т., Vered Y., Bohak Z. Substrates and inhibitors of nitrile hydratase and amidase of Corynebacterium nitrilophilus // Biotechnol. Appl. Biochem. -1989.-Vol. 11, N 1. P. 49-51.

21. Application 91/11527 WO. IPC 5 C12 P756, 7/62. Production of esters of lactic acid, esters of acrylic acid, lactic acid and acrylic acid / Walkup P.C., Rohrmann

22. Ch.F., Hallen R.T., Eakin D.T. 53 p.

23. Application 1-132392 Л5, Int.Cl4 C12 P 7/40, C12 Rl:05. Microbiological production of monocarboxylic acid / Kawakami K., Tanabe Т., Inoue Sh.-16 p.

24. Application Al-20030014193 US. Analysis of catalysed reactions by calorimentry // Ramsden, David Keith. 16.01.2003.

25. Asano Y., Ando S., Tani Y. Fungal degradation of triacrylonitrile // Agric. Biol. Chem. -1981. Vol. 45, N 1. - P. 57-62.

26. Asano Y., Tachibana M., Tani Y., Yamada H. Purification and characterization of amidase which participates in nitrile degradation // Agric. Biol. Chem. 1982. -Vol. 46, N 5. - P. 1175-1181.

27. Bandyopadhyay A.K., Nagasawa Т., Asano Y. Purification and characterization of benzonitrilases from Arthrobacter sp. strain J1 // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - Vol. 51, N 2. - P. 302-306.

28. Banerjee A., Sharma R., Banerjee U.C. The nitrile degrading enzymes: Current status and future prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. -Vol. 60. - P. 33-44.

29. Bengis-Garber C., Gutman A. L. Bacteria in organic synthesis: selective conversion of 1,3-dicyanobenzene into 3-cyanobenzoic acid // Tetrahedron Lett. 1988. - V. 29. - P. 2589-2590.

30. Bengis-Garber C., Gutman A. L. Selective hydrolysis of dinitriles into cyano-carboxylic acids by Rhodococcus rhodochrous NCIB 11216 // Appl. Microbiol. Biotech. 1989. - Vol. 32. - P. 11-16.

31. Bhalla T.C., Miura A., Wakamoto A., Ohba Y., Furuhashi K. Asymmetric hydrolysis of a-aminonitriles to optically active amino acids by a nitrilase of Rhodococcus rhodochrous PA-34 // Appl. Microbiol. Biotech. 1992. -Vol. 37.-P. 184-190.

32. Brennan B.A., Alms G., Nelson M.G., Durney L.T., Scarrow R.C. Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 contains a non-corrinoid cobalt with two sulfure ligands // J. Am. Chem. Soc. 1996. - Vol. 118. - P. 91949195.

33. Bunch A.W. Biotransformation of nitriles by rhodococci // Antonie van Leeuwenhoek. -1998. Vol. 74. - P. 89-97.

34. Cowan D., Cramp R., Pereira R., Graham D., Almatawah Q. Biochemestry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes // Extremophiles. 1998. - N 2. - P. 207-216.

35. Dadd M., Claridge Т., Pettman A., Knowles Ch. Biotransformation of benzonitrile to benzohydroxamic acid by Rhodococcus rhodochrous in the presence of hydroxylamine // Biotechnol. Lett. 2001. - Vol. 23. - P. 221-225.

36. Goldhust A., Bohac Z. Induction, purification and characterization of the nitrilase of Fusarium oxysporum f. sp. melonis // Biotechnol. Appl. Biochem. -Vol. 11.-P. 581-601.

37. Janet O.C., Strauss U., Kroutil W. Large-scale preparation of nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococcus R 312 (CBS 717.73) // J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1999. - N 6. - P.555-560.

38. Harper D.B. Microbial metabolism of aromatic nitriles. Enzymology of C-N cleavage by Nocardia sp. NCIB 11216 // Biochem. J. 1977. - Vol. 165. -P. 309-319.

39. Harper D.B. Fungal degradation of aromatic nitriles. Enzymology of C-N cleavage by Fusarium solani // Biochem. J. 1977. - Vol. 167. - P. 685-692.

40. Harper D.B. Purification and properties of an unusual nitrilase from Nocardia NCIB 11216 // Biochem. Soc. Trans. 1976. - Vol. 4. - P. 502-504.

41. Harper D.B. Characterization of a nitrilase from Nocardia sp. NCIB 11215, using p-hydroxybensonitrile as sole carbon source // Int. J. Biochem. 1985. -N17.-P. 677-683.

42. Hook R. H., Robinson W.G. Ricinine nitrilase. II. Purification and properties // J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239, N 12. - P. 4263-4267.

43. Hoyle A.J., Bunch A.W., Knowles Ch.J. The nitrilases of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 // Enzyme and Microbiol. Technology. 1998. -Vol. 23.-P. 475-481.

44. Hughes J., Armitage Y.C., Symes K.C. Application of whole cell rhodococcal biocatalysts in acrilic polymer manufacture // Antonie van Leeuwenhoek. -1998.-Vol. 74.-P. 107-118.

45. Hynes M.J. Amidase utilization in Aspergillus nidulans: Evidence for a third amidase enzyme // J. Gen. Microbiol. 1975. - Vol. 91. - P. 99-109.

46. Kakeya H., Sakai Т., Ohta H. Microbial hydrolysis as a potent method for the preparation of optically active nitriles, amides and carboxylic acids // Tetrahedron Lett. 1991. - Vol. 32. - P. 1343-1346.

47. Kaoken M.P., Segrai J.I., Duran R. Purification and properties of the nitrile hydratase of a new strain of Rhodococcus sp.// Zbl. Microbiol. 1991. - Vol. 146,N2.-P. 89-98.

48. Kelly M., Kornberg H.L. Purification and properties of acyltransferases from Pseudomonas aeruginosa // Biochem. J. 1964. - Vol. 93. - P. 557-566.

49. Klempier N., Raadt A., Faber K., Griengl H. Selective transformation of nitriles into amides and carboxylic acids by an immobilyzed nitrilase II Tetrahedron Lett. 1991. - Vol. 32. - P. 341-344.

50. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous Jl. Purification and characterization // Eur. J. Biochem. 1989. -Vol. 182.-P. 349-356.

51. Kobayashi M., Komeda H., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl: sequencing and overexpression of the gene and identification of an essential cysteine residue // J. Biol. Chem. 1992. -Vol. 267.-P. 20746-20751.

52. Kobayashi M., Shimizu S. Versatile nitrilases: nitrile-hydrolysing enzymes // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 120. - P. 217-224.

53. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yamada H. Enzymatic synthesis of acrilamide: A success story not yet over // Trends Biotechnol. 1992. - N 10. - P. 402-408.

54. Kobayshi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Purification and characterization of a novel nitrilase of Rhodococcus rhodochrous К 22 that acts on aliphatic nitriles // J. Bacterid. 1990. - Vol. 172, N 9. - P. 4807-4815.

55. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Hyperinduction of an alifatic nitrilase by Rhodococcus rhodochrous К 22 // FEMS Microbiol. Lett. -1991.-Vol. 77, N 1. P. 121-124.

56. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yanaka N., Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of p-aminobenzoic acid from p-aminobenzonitrile with Rhodococcus rhodochrous J 1 // Biotechnol. Lett. 1989. - N 11. - P. 27-30.

57. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of pyrazininoic acid, an antimicobacterial agent, from cyanopyrazine by resting cells of Rhodococcus rhodochrous J 1 // J. Antibiotics. 1990. -N43.-P. 1316-1320.

58. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yamada H. Regiospecific hydrolysis of dinitrilecompouds by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous J1 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. - Vol. 29. - P .231-233.

59. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Monohydrolysis of an aliphatic compound by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous К 22 // Tetrahedron. 1990. - V. 46. - P. 5587-5590.

60. Komeda H., Kobayashi M., Shimizu S. A novel gene cluster including the R. rhodochrous J1 nhiBA genes encoding a new low molecular mass nitrile hydratase (L-NHase) induced by its reaction product // J. Biol. Chem. 1996. -Vol. 271.-P. 15796-15802.

61. Layh N., Hirrlinger В., Stolz A., Knackmuss H. Enrichment strategies for nitrilehydrolysing bacteria // Appl. Microbiol. Biotech. Vol. 47. - P. 668-674.

62. Legras J.L., Chuzel G., Arnuad A., Galzy P. Natural nitriles and their metabolism // World J. Microbiol. Biotech. 1990. - N 6. - P.83-108.

63. Li W., Zhang H., Yang H. The production of acrylamide microbial conversion of acrylonitrile // Acta Microbiol. Sin. 1990. - Vol. 30, N 1. - P. 29-35.

64. Linton E.A., Knowles C.J. Utilization of aliphatic amides and nitriles by Nocardia rhodochrous LL100-21 // J. Gen. Microbiol. 1986. - Vol. 132, N 6. -P. 1493-1501.

65. Mahadevan S., Thimann K.V. Nitrilase: II. Substrate specificity and possible mode of action//Arch. Biochem. Biophys. 1964. - Vol. 107. - P. 62-68.

66. Mathew C.D., Nagasawa Т., Kobayashi M., Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of nicotinic acid from 3-cyanoyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 //Appl. Environ. Microbiol. 1988. - Vol. 54. - P. 1030-1032.

67. Miller J.M., Gray D.O. The utilization of nitriles and amides by a Rhodococcus species // J. Gen. Microbiol. 1982. - Vol. 128, N 8. - P. 1803-1809.

68. Mimura A., Kawano Т., Yamada K. Application of microorganisms to Petrochemical industry. I. Assimilation of nitrile compouds by microorganisms // J. Ferment. Technol. 1969. - Vol. 49, N 10. - P. 631-638.

69. Nagasawa Т., Yamada H. Microbial transformations of nitriles // Trends Biotechnol. 1989. - Vol. 7, N 6. - P. 153-158.

70. Nagasawa Т., Yamada H. Interrelations of chemistry and biotechnology. 6. Microbial production of commodity chemicals // Pure Appl. Chem. 1988. -N67.-P. 1241-1256.

71. Nagasawa Т., Mauger J., Yamada H. A novel nitrilase, arylacetonitrilase, of Alcaligenes faecalis JM3. Purification and characterization // Eur. J. Biochem. -1990. Vol. 194, N 3. - P. 765-772.

72. Nagasawa Т., Nakamura Т., Yamada H. Production of acrylic acid using Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. -Vol. 34.-P. 322-324.

73. Nagasawa Т., Kobayashi M., Yamada H. Optimum culture conditions for production of benzonitrilase by Rhodococcus rhodochrous J1 // Arch. Microbiol. 1988.-Vol. 150.-P. 89-94.

74. Nagasawa Т., Nanda H., Ryuno К. Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororafis B23. Purification and characterization // Europ. J. Biochem. 1987. -Vol. 162,N6.-P. 691-698.

75. Nagasawa Т., Ryuno K., Yamada H. Nitrile hydratase of Brevibacterium R 312. Purification and characterization // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1986. Vol. 139, N 3. - P. 1305-1312.

76. Nagasawa Т., Shimizu H., Yamada H. The supereority of the third-generation catalyst Rhodococcus rhodochrous J 1 nitrile hydratase, for industrial production of acrylamide // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - Vol. 40. - P. 189-195.

77. Nagasawa Т., Takeuchi K., Yamada H. Occurrence of a cobalt-induced and cobalt-containing nitrile hydratase in Rhodococcus rhodochrous J 1 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. - Vol. 155, N 2. - P. 1008-1016.

78. Nagasawa Т., Yamada H. Ферментативное производство никотиновой кислоты и никотинамида. // Biosci. Ind. 1988. - Vol. 46, N 8. - P. 3516-3518.

79. Nagasawa Т., Nakamura Т., Yamada H. e-Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase // Arh. Microbiol. 1990. - Vol. 155. - P. 13-17.

80. Nagasawa Т., Yamada H. Nitrile hydratase is a quinoprotein. A possible new function of pyrroloquinolin quinone activation of H20 in an enzymatic hydration reaction // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - Vol. 147, N 2. - P. 701709.

81. Nagasawa Т., Yamada H. Application of nitrile converting enzymes to the production of useful compounds// Pure Appl. Chem. 1990. - Vol. 62, N 7. - P. 1441-1444.

82. Nagasawa Т., Wieser M., Nakamura T. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous Jl. Conversion into active form by subunit association // Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267, N 1. - P. 138-144.

83. Pace H.C., Brenner C. The nitrilase superfamily: classification, structure and function // Biochem. Struct. Biol. 2001. -Vol.2, N 1.

84. Pat. 5998180 US. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous for converting acrylonitrile directly to acrylic acid / Armitage Y.Ch., Hughes J., Webster N.A. -7.12.1999.

85. Pat. 9858072 WO. Flocculation of biological material from organic acid-containing systems / Weir S., Hughes J., Moran P. 23.12.1998.

86. Pat. 245585 DE // Procede de preparation a acids organiques par hydrolysebiociques / A. Commeyras, A. Arnaud, P. Galzy J.C. Jallageas.

87. Pat. 0274856 EP // Microbial degradation of waste / C.J. Knowles, J.M. Wyatt.

88. Pat. 0188316 EP // Process for the preparation of amides using microorganisms /1. Watanabe, M. Okumura.

89. Pat. 61-43037 JP // Способ получения акриловой, (мет)акриловой кислоты. // Watanabe I. / 25.09.86. 6 p.

90. Pat. 5932454 US. Method of producing carboxylic acids / Matsuoka K., Matsuyama A. 3.08.1999.

91. Pat. 2182928 RU. Способ получения водного раствора (мет)акриловой кислоты или ее соли / Сайме К.Ч., Хьюс Д. 27.05.2002.

92. Pat. 6162624 US. Production of ammonium acrylate / Symes K.Ch., Hughes J.-19.12.2000.

93. Pat. 0444640 EP. Process for producing an elevated amount of nitrilase activity from a microbial strain of Rhodococcus / Yamada H., Nagasawa Т., Nakamura T.-04.09.1991.

94. Pat. 5135858 US. Process for biological production of organic acids / Yamada H., Nagasawa Т., Nakamura T. 04.08.1992.• 94. Pat. 6146861 US. Processes for the production of amidase / Armitage Y.,1. Hughes J. 14.11.2000.

95. Pat. 6251646 US. Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells // Ben-Bassat A., Dicosimo R., Fallon R. 26.06.2001.

96. Pat. 19848129 DE. New nucleic acid sequence encoding Alcaligenes faecalis nitrilase polypeptide useful for converting racemic nitriles to chiral carboxylicacids // Engels D., Mattes R., Hauer B. 20.04.2000.

97. Pat. 6066490 US. Nitrilase-producing acidovorax facilis // Gavagan J., Herces F., Di Cosimo R., Fallon R. 23.05.2000.

98. Pat. 1008655 EP. Process for producing malonic acid derivatives // Endo Т., Ozaki E., Enomoto K. 14.06.2000.

99. Pat. 11341979 JP. Production of bacterial cell body having high nitrilase productivity // Watabe Т., Ishikawa Т., Yokoyama M. 14.12.1999.

100. Pat. 9028382 JP. Microorganism constitutionally producing nitrilase, control factor related to constitution and gene therefor // Nakamura Т., Mizumura Yu., Kobayashi Y. 04.02.1997.

101. Pat. 0707061 EP. Method for preserving a suspension of cells or immobilized cells // Endo T, Hirata Y., Murao K. 17.04.1996.

102. Robinson W.G., Hook R.H. Ricinine nitrilase. I. Reaction product and substrate specificity // J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239, N 12. - P. 4257-4262.

103. Stalker D.M., Mc Bride K.E., Malyj L.D. Herbicide resistance in transgenic plants expressing a bacterial detoxification gene // Science. 1988. - Vol. 242. -P. 419-423.

104. Stalker D.M., Malyj L.D., Mc. Bride K.E. Purification and properties of a nitrilase specific for the herbicide bromoxynil and corresponding nucleotide sequence analysis of the bxn gene // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263, N 13. - P. 310-314.

105. Stevenson D.E., Feng R., Dumas F. at al. Mechanistic and structural studies on Rhodococcus ATCC 39484 nitrilase // Biotech. Appl. Biochem. 1992. -Vol. 15.-P. 283-302.

106. Stevenson D.E., Feng R., Storer A.C. Detection of covalent enzyme-substrate complexes of nitrilase by ion-spray mass spectroscopy // FEBS Lett. 1990. -Vol. 277.-P. 112-114.

107. Sugiura Y., Kuwahara J., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrile hydratase: The first non-hemoiron enzyme with a typical low-spin Fe(III) active center // J. Am. Chem. Soc. - 1987. - Vol. 109, N 19. - P. 5848-5850.

108. Sugiura Y., Kuwahara J., Nagasawa Т., Yamada H. Significant interaction between low-spin iron (III) site and pyrroloquinolin quinone in active center of nitrile hydratase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. - Vol. 154, N 2.1. P. 522-528.

109. Tani Y. Производство продажных химических реактивов и микробиологические процессы. // Biosci. Ind. 1990. - Vol. 48, N 7. - P. 635640.

110. Thompson A., Knowles C.J., Linton E.A., Wiatt J.M. Microbial Biotransformations of nitriles // Chem. in Britain. 1988. - N 9. - P. 900-902, 912.

111. US 6162624// Production of ammonium acrylate / Symes K.CH., Hughes J. // 19.12.00.

112. Watanabe I., Satoh Y., Enomoto K. Screening, isolation and taxonomical properties of microorganisms having acrylonitrilehydrating activity // Agric. Biol. Chem. 1987. - Vol. 51, N 12. - P. 3193-3199.

113. Webster N.A., Ramsden D.K., Hughes J. Comparative characterisation of two

114. Rhodococcus species as potential biocatalysts for ammonium acrylate production // Biotechnol. Lett. 2001. - Vol. 23. - P. 95-101.

115. Yamada H. Recent development in microbial transformation // Nippon Nogei Kagaku Kaishi. 1988. - Vol. 62, N 4. - P. 765-767.

116. Yamada H., Kobayashi M. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996. - Vol. 60. - P. 1391-1400.

117. Yamada H., Asano Y., Nino Т., Tani Y. Microbial utilization of acrylonitrile // J. Ferment. Technol. 1979. - Vol. 57, N 1. - P. 8-14.

118. Yamada H., Nagasawa Т. Промышленное производство акриламида с использованием ферментов. // Biosci. Ind. 1988. - Vol. 46, N 4. - P. 30633065.

119. Yamamoto К., Ueno Y., Otsubo K., Kawakami K., Komatsu K. Production of S-(+)- Ibuprofen from a nitrile compound by Acinetobacter sp. AK 226// Appl. Environ. Microbiol. 1990. -N 56. -P. 3125-3129.

120. Yamamoto K., Komatsu K. Purification and characterization of nitrilase responsible for the enantioselective hydrolysis from Acinetobacter sp. AK 226 // Agric. Biol. Chem. 1991. - Vol. 55. - P.1459-1466.

121. Yamamoto K., Oishi K., Fujimatsu I., Komatsu K. Production of R-(-)-mandelic acid from mandelonitrile by Alcaligenes faecalis ATCC 8750 // Appl. Environ. Microbiol. 1991. -N 57. -P. 3028-3032.

122. Yamamoto K., Fujimatsu I., Komatsu K-I. Purification and characterization of the nitrilase of Alcaligenes faecalis ATCC 8750 responsible for enantioselectective hydrolysis of mandelonitrile // J. Ferm. Bioeng. 1992. -N73.-P. 425-430.

Информация о работе

Полтавская, Светлана Викторовна
кандидата биологических наук
Саратов, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Биокаталитическое получение акрилата аммония - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы