Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение субпопуляционной структуры бактериальных культур и способов управления межпопуляционными клеточными переходами

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение субпопуляционной структуры бактериальных культур и способов управления межпопуляционными клеточными переходами"

На правах рукописи

Березинская Татьяна Леонидовна

Изучение субпопуляционной структуры бактериальных культур и способов управления межпопуляционными клеточными переходами

03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биопогических наук

Москва

2005

Работа выполнена на кафедре биологии и общей генетики Российского университета дружбы народов.

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор

Иткес Александр Веньяминович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор

Дорожкова Инна Рафаиловна

кандидат биологических наук

доцент

Кравцов Эдуард Григорьевич

Ведущая организация: Государственный научный цетр «Институт прикладной микробиологии»

на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6

Автореферат разослан « (ЖуГчЯл^с! 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Защита диссертации состоится «

2005 г. в /<Г час.

доцент

Гигани О Б.

Актуальность проблемы

Решение проблем адаптации, то есть раскрытие структурно-функциональных основ жизни организма и его взаимодействия со средой, неразрывно связано со специализацией клеток, и, как следствие, с образованием полицеллюлярных форм. Адаптация прокариот обычно связывается с их генетической лабильностью и высокой скоростью приспособительных процессов (таких как возникновение резистентности) и рассматривается с точки зрения филогении. Между тем, учитывая высокую степень полиморфности многих бактериальных культур, у прокариот следует ожидать реализации всего многообразия механизмов адаптации, начиная от изменений формы отдельных клеток и заканчивая формированием единого ответа целостной клеточной популяцией.

Такое явление, как изменение формы и размеров эукариотических клеток под действием химических и физических факторов, хорошо известно. Так, при неблагоприятных условиях в культуре Saccharomyces cerevisiae образуются гигантские клетки, что способствует снижению соотношения поверхность/объем (Yabe I et al., 1999). Формообразование эукариотичских клеток является функцией химического состава среды (Сыроешкин A.B. и др., 2002; Богомолова Е. В., 2000; Панина JI.K., 2000). Для бактериальных клеток, вследствие особенностей строения и метаболизма, подобные переходы затруднены, и при реализации аналогичных механизмов формообразования у прокариот следовало бы ожидать не изменений морфологии отдельной клетки, а объединения клеток в ассоциаты и полицеллюлярные формы, либо образования специализированных форм, устойчивых к внешним воздействиям.

В целом процессы ассоциации в сообществах микроорганизмов обеспечивают их высокую устойчивость к воздействию внешних факторов и приводят к формированию

бактериальных пленок, исследованию которых ныне уделяется большое внимание (O'Tool, G. et al, 2000). Поскольку прокариотические клетки в биопленках тесно связаны друг с другом и объединены в целостную структуру (Webb, S.J. et al, 2003), это явление позволяет говорить о «ложной многоклеточности», возникающей конвергентно колониальным и многоклеточным эукариотическим организмам.

Образованию и роли бактериальных ассоциатов уделяется пристальное внимание (Waters, С.М. et al, 2001; Schembri М.А. et al., 2003). Процессы ассоциации бактериопланктона прослеживаются в водных гетеротрофных бактериоценозах, от чего зависит скорость процессов естественной переработки загрязняющих веществ в водоемах (Ильинский В.В., 2000). Тем не менее, оценка такого важного параметра, как численность бактерий в среде, остается нерешенной проблемой, поскольку, вследствие ассоциации, не все клетки способны образовывать колонии на твердых средах.

Кроме того, с формообразованием болезнетворных бактерий непосредственно связаны проблемы патогенеза и персистенции микроорганизмов. Обязательным условием существования паразитарных систем в биологически агрессивной среде является гетерогенность популяций патогена и их динамическая изменчивость (Бухарин О.В , 1999). Так, Mycobacterium tuberculosis могут образовывать ультрамелкие формы, способные к длительному персистированию при неблагоприятных условиях, L-формы, затрудняющие ответ иммунной системы (Дорожкова И.Р. и др., 1995), а также ассоциаты разного размера, затрудняющие макрофагальный ответ (Сыроешкин A.B., 2001). Агрегация Escherichia coli, патогенных стафилококков, менингококков под действием лизоцима способствует колонизации бактерий в организме и обеспечивает их лекарственную устойчивость (Афанасьева Т.И. и др, 1975, Костюкова H.H., 1981). Таким образом, успешная диагностика и эффективность лечения многих заболеваний может быть тесно связана с возможностью контроля субпопуляционных перестроек патогенных микроорганизмов. В настоящей работе мы разработали новый количественный метод исследования субпопуляционного состава бактериальных культур и применили его для кинетического описания межпопуляционных переходов.

рос национальная] j БИБЛИОТЕКА i

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы являлось создание модели межпопуляционных переходов в бактериальных сообществах на основе кинетики перераспределения биомассы между субпопуляциями.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод количественной оценки субпопуляционного состава клеточных суспензий.

2. Изучить субпопуляционную структуру ряда бактериальных культур.

3. Выяснить, обратимы ли межпопуляционные клеточные переходы в бактериальных культурах с точки зрения кинетического способа описания.

4. Изучить сопряжение процессов межпопуляционных переходов с изменением элементных профилей бактериальных культур.

5. Исследовать возможность управления межпопуляционными клеточными переходами при различных воздействиях факторов физической и химической природы.

Научная новизна.

Впервые к описанию бактериальных культур в суспензии применен подход химической кинетики, позволяющий говорить об обратимом явлении формирования «ложной многоклеточности» в популяциях прокариот. Метод малоуглового рассеяния лазерного излучения предложен в качестве количественного метода оценки субпопуляционного состава бактериальных культур. Проанализированы количественные характеристики перераспределения биомассы в клеточных суспензиях. С помощью данного метода проанализирована субпопуляционная структура суспензий Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Rhodococcus rhodochrous и показано существование в бактериальных суспензиях полнцеллюлярных форм различного функционального значения. Выяснено, что субпопуляционные переходы «одиночные клетки - полицеллюлярные формы» являются обратимыми и контролируются генетически. Впервые установлено, что изменение субпопуляционного состава культуры является функцией ее физиологического состояния и сопряжено с изменением элементных профилей. Исследованы возможности управления межпопуляционными клеточными переходами с помощью методов физического (ультразвук, обработка тепловыми нейтронами) и химического (действие антибиотиков, ионов металлов, изменение изотопного состава среды) воздействия.

Практическая значимость работы:

По результатам исследований разработан новый метод количественной оценки перераспределения биомассы в клеточных популяциях. Метод малоуглового рассеяния лазерного излучения позволяет получать данные о морфофункциональном состоянии бактериальных популяций, что может быть использовано для широкого спектра микробиологических исследований, как фундаментальных, так и прикладных: в пищевой промышленности, в медицине при работе с изолятами патогенных микроорганизмов, в экологических исследованиях водных бактериоценозов.

Показана возможность управления межпопуляционными клеточными переходами, что позволяет разработать новое поколение фармпрепаратов, не обладающих бактериостатическим или бактерицидным действием, но переводящих популяцию патогенных микроорганизмов в форму, более доступную действию иммунной системы.

Разработан способ применения малоуглового измерителя частиц (particle sizer) для исследований клеточных популяций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Показана возможность использования метода лазерной дифракции и, соответственно, малоугловых измерителей дисперсности для количественной характеристики перераспределения биомарсы в суспензиях бактериальных клеток.

• ✓ ; I»" 1 - 2

2. Установлен факт присутствия в бактериальных суспензиях поликеллюлярных форм, от временных ассоциатов до облигатных клеточных агрегатов, которым может принадлежать до 95% биомассы всей популяции.

3. Выявлена обратимость субпопуляционных переходов «одиночные клетки -полицеллюлярные формы» в бактериальных суспензиях, что позволяет рассматривать бактериальную культуру как систему в состоянии динамического равновесия.

4. Показана видоспецифичность субпопуляционного состава ряда бактериальных культур: В. subtilis, Е. coli, М. tuberculosis, Rh. rhodochrous.

5. Обнаружено, что изменение субпопуляционного состава клеточных суспензий (в частности, образование полицеллюлярных форм, спор или дормантных форм) сопряжено с изменением элементных профилей культур.

6. Продемонстрирована возможность направленного регулирования межпопуляционных клеточных переходов посредством различных методов физико-химического воздействия.

' Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: X I международный симпозиум "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2001), XI международный симпозиум «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, • 2003), XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», (Москва, 2004), Вторая

международная конференция «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004) ■ Публикации: по теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на/$2? страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы, библиографический список (¿¿¿""источников, из них на русском иностранных языках) и приложения.

Работа содержит ^"таблиц, JA рисунков.

Содержание работы

Методы исследований и выращивания бактериальных культур.

1. Измерение численного и объемного распределения клеток

Распределение клеток по размерам и форме регистрировали с помощью дифракции лазерного света на лазерном дифракционном определителе размером частиц (particle sizer) «Malvern 3600 Ее». Принцип работы заключается в следующем. Маломощный гелий-неоновый лазер излучает монохроматический пучок света (Хтах=бЗЗ нм), который проходит через экспериментальную ячейку. С помощью линз Фурье дифракционная картина фокусируется на мультиэлементном фотоэлектрическом детекторе. Детектор непосредственно связан с компьютером, I осуществляющим весь комплекс обработки данных, начиная от интегрирования набора дифракционных картин, отражающих мгновенное распределение частиц по размерам. В экспериментальном образце все частицы проходят освещенную зону за счет непрерывного перемешивания. Объем пробы составляет 3 мл. Таким образом, количество частиц (клеток), одновременно подвергающихся статистической обработке, достигает 108 - 109 . Для анализа распределений клеток по размерам и форме были использованы два вида зависимостей: h,=f(ri) и vrf(rj, где п, и v, - соответственно численные и объемные доли размерной группы /у Кроме того, метод позволяет точно оценить суммарный объем клеток в суспензии и удельную площадь поверхности дисперсной фазы (Сыроешкин А.В. и др., 2002).

Измерения проводились в конце логарифмической фазы роста клеточной культуры и повторялись троекратно. Контроль за гомогенностью бактериальных суспензий (практически отсутствовали примеси посторонних включений), помимо указанного метода, осуществляли микроскопически. Параллельно культура высевалась на чашки и проводился подсчет КОЭ.

2. Культуру Escherichia coli выращивали в суспензии, как описано в работе «Копонеобразование у прокариот как проблема инфекционной патологии» (Сыроешкин А В. и др., 2001).

3. Культуру Bacillus subtilis выращивали в суспензии, как описано в работе «Колонеобразование у прокариот как проблема инфекционной патологии» (Сыроешкин А.В и др., 2001).

4. Культуру Mycobacterium tuberculosis выращивали в суспензии, как описано в работе «Явление обратимости межпопуляционных клеточных переходов Mycobacterium tuberculosis как основа создания новых противотуберкулезных лекарственных препаратов» (Березинская Т.Л. и др., 2004).

5. «Оживление» дормантной культуры Mycobacterium tuberculosis

В три разные колбы объемом по 100 мл было добавлено по 50 мл стандартной питательной среды, содержащей supplement в соотношении 1:10, и по 5 мл инокулята. Во всех колбах культура выращивалась на качалке (200 оборотов/мин) при t=37°C в течение двух недель. Из полученной растущей культуры в стерильных условиях отбирались образцы для исследований (Шлеева М.О. и др., 2003).

7. Культуру клеток Rhodococcus rhodochrous выращивали в суспензии, как описано в работе «Элементные профили металлов как векторная характеристика вида и физиологического состояния» (Матвеева И.С. и др., 2003).

8 . Пробоподготовка образцов для элементного анализа.

Осадок клеток инкубировали в царской водке (6 мл) в течение 1 суток в тефлоновых бомбах. Далее минерализацию образцов проводили под давлением в микроволновой печи MDS2000 при следующем режиме: 2 мин. 20 сек. - при 80% мощности, 5 мин. - при 100% мощности.

9 Определение металлов методой атомно-абсорбционной спектрометрии. Содержание металлов в минерализованных образцах определяли с помощью атомно-адсорбционного спектрометра «SpectrAA-800» с электротермической атомизацией и эффектом Зеемана по протоколу фирмы "Varian" с модификациями по результатам международной интеркалибрации с лабораторией MEL МАГАТЭ (Монако) (Матвеева И.С. и др., 2003). Средняя относительная ошибка анализа параллельных проб указана на рисунках.

10 Обработка суспензии ультразвуком

Суспензию обрабатывали ультразвуком (дезинтегратор MSE, Soniprep 150) 17 кГц при максимальной мощности два раза по 10 секунд с перерывом в одну минуту. Во время обработки ультразвуком суспензию охлаждали, пропуская воду через рубашку рабочей ячейки. Параллельно контролировали pH и температуру.

11 Экспозиция образцов в нейтронном потоке (Матвеева И.С. и др, 2003). Источник нейтронов ИНК 1-06 (2529gCf) (активность на 23.10 1986 - 1,03-106 (± 8%) н/сек, расчетная активность на 28.08.2002 - 1,62-104 н/сек.) располагали в 5,5 см от середины края 50 мл Пробирки с суспензией бактерий. Между образцом и источником нейтронов располагали 5-см слой свинца и 15-см слой полипропилена. Экспозицию бактериальной суспензии проводили течении 2 часов без перемешивания при 20°С. На удалении 3 м от источника в том же помещении проводили контрольную и инкубацию бактериальной суспензии в идентичной постановке.

Результаты я обсуждение

Размерные спектры клеточных популяций эукариот (Каменир Ю.Г., 1987, Сыроешкин A.B. и др., 2002) зависят от вида и физиологического состояния клетки. Бактериальные популяции не обладают такой лабильностью формы, поэтому для них должны быть характерны иные виды формообразования: образование физиологически инертных (споры и т.п.) и полицеллюлярных форм.

Для исследований были выбраны как стандартные гетеротрофные бактериальные культуры, рутинно используемые в микробиологии, молекулярной генетике, молекулярной биологии (Escherichia coli, Bacillus subtilis), так и культуры Rhodococcus rhodochrous и Mycobacterium tuberculosis (штамм Academia), отличающиеся наличием большого числа субпопуляций в бактериальной суспензии.

1. Бактериальные культуры в суспензии содержат полицеллюлярные формы.

1.1. Mycobacterium tuberculosis (сем Nocardiaceae) - тонкие, прямые или слегка изогнутые

палочки длиной 1-4 мкм, шириной 0,2 - 0,6 мкм, гомогенные или зернистые, с незначительно

закругленными концами (Хоменко и др., 1996). Кроме выраженного многообразия форм существования, микобактерии характеризуются, как известно, большим полиморфизмом и плеоморфизмом, то есть широким диапазоном изменчивости биологических свойств. Так как основным фактором противоинфекционной защиты при патогенезе туберкулеза на первых этапах является макрофагальный ответ, отсутствие биологического излечения от туберкулеза легких (то есть неполнота протекания процессов фагоцитоза) объясняется именно множественностью форм микобактерий туберкулеза, отличных от классической палочковидной (L-формы, ультрамелкие, нитевидные, мицелиеподобные и т.п.), а также способностью данных патогенов к длительному внутриклеточному персистированию в дормантном состоянии (Дорожкова И.Р. и др., 1995, Сыроешкин A.B. и др., 2001). Охарактеризовав культуру М. tuberculosis (штамм Academia) с помощью указанного метода (рис.1 А), мы обнаружили как одиночные палочковидные клетки (rmax численного распределения ~ 2-3 мкм), так и клеточные агрегаты (Ттах объемного распределения ~ 40 мкм). Микроскопически агрегированные формы выявляются крайне редко в виде характерных кос при увеличении х40. Оказалось, что численное соотношение (агрегированные формы)/(одиночные клетки) стремится к нулю, тогда как объемная доля агрегированных форм составляет почти 90% (от общего объема всех клеточных форм).

В отличие от логарифмической культуры, субпопуляционный состав культуры М. tuberculosis в постстационарной фазе изменен: 95% количественно принадлежит одиночным клеткам размером менее 1 мкм (рис.1 Б). По данным световой микроскопии, такие клетки представлены овоидными и коккоидными формами небольшого размера (0,6-0,8 мкм). Так как такие клетки полностью теряют способность формирования колоний на твердых средах, очевидно, что это -дормантные, «некультивируемые» формы (Шлеева М.О. и др., 2003).

Рис 2 Численное и объемное распределение клеток и ассоциатов в клеточных суспензиях А-в культуре В. subtilis;B - в культуре Е. coli. В- в культуре Rh rhodochrous

1.2. Escherichia coli (сем Enterobacteriaceae) представляют собой грамотрицательные подвижные и неподвижные палочки длиной 2-6 мкм, толщиной 1,1 - 1,5 мкм (Беркли Р. и др., 1997). Бактериальная культура Е coli традиционно считается состоящей из одиночных клеток. Однако при исследовании было выяснено, что при максимуме численного распределения клеток < 1 мкм, соответствующего одиночным клеткам, объемное распределение имеет максимум около 2 мкм, то есть в культуре имеются клеточные ассоциаты (рис. 2Б), соответствующие, по данным световой микроскопии, гексамерным упаковкам.

1.3. Bacillus subtilis (сем. Bacillaceae) - грамположительная аэробная подвижная палочка длиной 1,2 - 7 мкм и толщиной 0,5 - 2,5 мкм, образующая споры (Беркли Р. и др., 1997). На графике усредненные размеры одиночных клеток В subtilis не превышают 1 мкм. Из данных рис. 2А можно определить объемную и численную долю таких клеток: график численного распределения отсекает ее по оси ординат. Так, численная доля одиночных клеток составляет около 90 % . Однако распределение клеточной популяции по объему выявляет наличие более крупных частиц - клеточных ассоциатов, которые характеризуют максимумы, соответствующие размеру ~2 мкм и 6,2 мкм. Высота максимума соответствует объемной доле ассоциатов данного размера, которая составляет, соответственно, около 50% и 30%. Следует подчеркнуть, что основной субпопуляции ассоциатов принадлежит большая часть суммарного объема цитоплазмы.

1.4. Rhodococcus rhodochrous (сем. Nocardiaceae) - аэробная грамположительная неподвижная бактерия, не образующая капсул. При росте способна образовывать мицелиеподобные формы с дальнейшей фрагментацией на палочковидные и коккоидные клетки (Беркли Р. и др., 1997). Размерные спектры культуры Rh rhodochrous также демонстрируют присутствие клеточных ассоциатов разного размера: максимумы численного и объемного распределений - 2,5 мкм; 5 мкм и 20 мкм (рис. 2В). Несмотря на то, что абсолютная численность крупных (20 мкм) ассоциатов невелика, им принадлежит значительная доля объема цитоплазмы (более 30%).

2. Переходы «одиночные клетки — полицеллюлярные формы» являются обратимыми. 2.1. Культура В. subtilis, выращенная в суспензии, была исследована при различных концентрациях клеток, при этом для контроля наряду с методом лазерной дифракции применялись методы световой микроскопии. На рис. 3 представлены размерные спектры: численные (черные кружки) и объемные (белые кружки) распределения.

Хотя численная доля одиночных клеток (менее 1мкм) при любой концентрации составляет около 90 %, график объемного распределения демонстрирует постоянный характер максимумов, соответствующих размерам 2 мкм и 6,2 мкм, и присутствие клеточных ассоциатов промежуточных размеров, от 2 мкм до 4 мкм. Эти данные и результаты световой микроскопии позволяют охарактеризовать ассоциаты с линейными размерами > 4 мкм как временные, образовавшиеся вследствие адгезивного слипания, когда концентрация клеток в культуре достаточно высока. Постоянные ассоциаты, состоящие из неразошедшихся клеток, соответствуют субпопуляциям при максимумах 3,5 мкм.

Рис. 3 Численное и объемное распределение клеток и ассоциатов культуры В зиЬЫи при различных концентрациях клеток Измерения проведены в среде роста

2.2. Исследование бактериальной культуры Е. coli при различных концентрациях клеток (рис. 4) также демонстрирует частичную дезагрегацию клеточных ассоциатов при разбавлении.

а

к мкм

Рис. 4 Численное и объемное распределение теток и ассоциатов культуры Е. coli при разных концентрациях клеток. А - исходная культура; Б - разведение 3:500

Однако максимум объемного распределения около 2 мкм сохраняется, при этом высота его понижается с 45% до 15%. Таким образом, растущая культура практически полностью состоит из временных ассоциатов размером около 2-2,5 мкм. С помощью микроскопических исследований установлено: наблюдаемые ассоциаты представляют собой упаковки в основном по 6 клеток. При разбавлении культуры происходит постепенный распад временных ассоциатов на отдельные клетки, что также подтверждается подсчетом КОЕ на чашках - концентрация отдельных частиц в культуре снижается незначительно, ее значение не соответствует тому, что могло бы получиться при механическом разбавлении смеси (табл.1).

Табл. 1. Изменение КОЕ при разбавлении культуры Е. coli (средняя относительная ошибка составила не

РАЗВЕДЕНИЕ Ю-9 10"8 ю-7 10"4 10» ю-4

КОЕ 0 0 2 77 81 740

КЛЕТОК В МЛ 2*106 3,2*106 1,4*107 2*107 3*107 108

2.3. В отличие от вышеописанных, культура ЯИ. гИо^сИгош демонстрирует большее постоянство субпопуляционного состава при изменении концентрации клеток в среде (рис. 5). Максимумы размерного распределения, соответствующие 7 мкм и 20 мкм, в стационарной фазе остаются неизменными. Такие клеточные ассоциаты, присутствующие в культуре независимо от концентрации клеток, не разрушаются при стандартных условиях выращивания культуры и могут являться характеристикой ее видовой принадлежности (Сыроешкин А.В. и др., 2000). В дальнейшем мы будем называть такие клеточные агрегации постоянными ассоциатами, или полицеллюлярными формами.

Рис. 5. Численное и объемное распределение ЛА. гИое/осИгош при различных концентрациях клеток в культуре.

Как и для многих бактериальных культур, для медленнорастущей М tuberculosis и для быстрорастущей Rh rhodochrous характерна постстационарная фаза с переходом в дормантное состояние. Исследования данных культур с помощью лазерной дифракции позволяют проследить за изменениями и превращениями клеток в процессе роста и созревания культуры.

%

Рис. 6. Изменение численного и объемного распределения клеток и ассоциатов ЯИ гЫх1осЬ-ои5 в процессе роста.

ш uní uro

Рис 7 Переход дормантной культуры к активному размножению Культура М tuberculosis, не подвергавшаяся фильтрации. Численное распределение клеток и ассоциатов культуры М. tuberculosis показано на основных графиках, объемное распределение - на вставках сверху. А- в момент посева, Б -через 3 суток, В - через 14 суток.

При росте культуры Rh rhodochrous происходит реаранжировка клеточных субпопуляций (рис. 6). Так, постепенно полностью исчезают ультрамелкие «некультивируемые» формы, в то время как полиморфизм культуры возрастает: через 16 часов наблюдается присутствие клеточных ассоциатов самого разного размера - от 2 до 35 мкм. Заметно возрастает объемная и численная доля крупных ассоциатов (rmax объемного распределения= 30 мкм), и через 18 часов наблюдается характерный спектр, где максимумы 3,5мкм; 7 мкм и 30 мкм хорошо дифференцированы.

2.4. Клеточные ассоциаты М. tuberculosis также носят постоянный характер: снижение концентрации клеток не вызывает дезагрегации полицеллюлярных форм. При переходе культуры М tuberculosis из дормантного состояния в состояние активного роста наблюдаются значительные изменения ее популяционной структуры (рис. 7).

В исходной дормантной культуре 95% количественно принадлежит одиночным клеткам размером менее 1 мкм. На 4-й день после посева процент мелких одиночных форм резко

8

снижается, появляются максимумы, соответствующие размерам 2-3 мкм, 5-7 мкм и 15-17 мкм, что говорит об образовании ассоциатов и полицеллюлярных форм. Высота максимумов, характеризующая объемную долю структур данного размера, составляет, соответственно, 1.5%, 7% и 22%. По причине заметного полиморфизма исходной культуры момент начала клеточной агрегации не так ярко выражен, но, тем не менее, хорошо заметен. Для того, чтобы ответить на вопрос, какие именно клетки способны к аутоагрегации (палочковидные или дормантные формы), и оценить способность перехода «некультивируемых» форм в активное состояние, ультрамелкие клетки были отделены двукратным фильтрованием через фильтр 2 мкм. В этом случае дормантная культура, посеянная после фильтрации, достаточно гомогенна и представлена одиночными «некультивируемыми» клетками. «Оживление» культуры сопровождается принципиальными изменениями структуры клеточной популяции: культура приобретает гетерогенность, клетки образуют ассоциаты характерной формы, хорошо различимые при больших увеличениях светового микроскопа (рис. 8).

Рис 8 Переход дормантной культуры к активному размножению Профильтрованная культура М tuberculosis Численное распределение клеток и ассоциатов культуры М tuberculosis показано на основных графиках, объемное распределение - на вставках сверху А - в момент посева, Б - через 3 суток, В - через 6 суток; I - палочковидные формы, 2 - малоклеточные ассоциаты, 3 -многоклеточные ассоциаты.

Поскольку исходная культура практически гомогенна, процесс клеточной агрегации хорошо заметен (рис. 8, В). С помощью светового микроскопа в этот момент можно пронаблюдать небольшие ассоциаты коккоидных форм, классические палочковидные формы и их агрегаты. По мере роста культуры происходит перераспределение клеточных субпопуляций в сторону дальнейшей аутоагрегации клеток. На И - 12 сутки вновь появляются мелкие коккоидные формы, и двухнедельная культура уже демонстрирует полную гетерогенность - присутствуют как полицеллюлярные формы разного размера (от 10 до 50 мкм), так и палочки, и ультрамелкие одиночные клетки.

Параллельный подсчет КОЕ позволил достоверно подтвердить тот факт, что рост культуры на чашках начинается во время значительного перераспределения клеточных субпопуляций и образования ассоциатов/полицеллюлярных форм.

В результате мы непосредственно пронаблюдали межпопуляционные клеточные переходы как в сторону клеточной ассоциации (от ультрамелких форм к палочковидным через агрегацию, и зарождение истинных полицеллюлярных форм) (рис. 7,8), так и в обратном направлении (появление в гетерогенной бактериальной культуре ультрамелких одиночных форм) (рис. 7).

Следовательно, данные позволяют считать полностью доказанным предположение о существовании любой бактериальной культуры в форме динамического равновесия «одиночные

клетки/полицеллюлярные формы». Описанное явление можно представить в виде следующей схемы (рис. 9).

3. Изменение элементных профилей при межпопуляционных клеточных переходах.

3.1. Явление постоянства элементных профилей.

Элементные профили, как способ представления в виде линейчатых спектров мультиэлементной композиции живого вещества, хорошо известны в биогеохимии и нашли свое применение в экологической токсикологии при изучении накопления в биоте тяжелых металлов (Плетенева Т.В., 1993; Ершов Ю.А., Ппетенева Т.В , 1989). Исследования элементных профилей были проведены для В subtilis, М tuberculosis, R. rhodochrous фис. 10) Культивирование прокариот в супензии в колбах с выщелоченным стеклом или из полимерных материалов (типа «Falcon») позволяет рассматривать такую систему как изолированную по массобмену металлами. Отбор аликвот (1 мл из 50 - 300"мл суспензии) на анализ металлов при постоянном перемешивании при концентрации кяе9ок порядка 10 - 109 клеток на 1 мл позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты. Идентичность дисперсного состава аликвот специально контролировалась" с йййощью лазерной дифракции. При культивировании В. subtilis и М. tuberculosis пробы были^тобраны на анализ в различное время развития культур из одной и той же колбы.

Относительное содержание металлов в культурах В subtilis, М. tuberculosis, Rh. rhodochrous, представленное на рис 10, наглядно демонстрирует строгую специфичность элементных профилей для биологического вида.

3.2. Изменение элементного статуса при межпопуляционных переходах.

При дефиците глицерина в среде культивирования клетки В subtilis образуют споры, что сопровождается характерным изменением элементного профиля (рис. 10). Мы исследовали перераспределение элементов между бактериями и средой культивирования, измеряя методом атомной абсорбции содержание металлов в осадке клеток и супернатанте. Оказалось, что соотношение содержания пяти элементов Cr:Mn:Ni:Cd:Pb остается неизменной величиной, строго характерной для активно делящихся клеток или для спор*. / cr:680181 1 Орь и Зсг:300мп-'4м:20с(1-'2рь, соответственно. Важно отметить, что некоторые (в пределах порядка) вариации в фоновом суммарном содержании металлов в среде культивирования не влияли на соотношение содержания Cr:Mn:Ni:Cd:Pb у логарифмической культуры и спор, что позволяет рассматривать относительные элементные профили как векторную метаболическую постоянную. Зависимость элементного профиля: РСГЧМА), Мсг, ММП, Mn„ МС„, Mz„, Mea, МРЬ),

где Mei - относительное содержание металла, от физиологического статуса демонстрирует и его изменение при росте культуры М tuberculosis, штамм Academia (табл. 2). Действительно, увеличение клеточной биомассы сопровождается коренными изменениями как физиологического состояния каждой отдельной клетки, так и формы клеток и клеточных субпопуляций. Таким образом, можно ожидать изменения суммарного содержания металлов

Рис. 9 Схема возможных субпопуляционных клеточных переходов в бактериальной культуре.

С - одиночная активная клетка с - покоящиеся формы Ас- постоянные ассоциаты Сп - временные малоклеточные

ассоциаты ___J 2С - деление клетки

при резких изменениях формы, что является следствием нового состояния межфазных границ, резко различающихся в субпопуляциях микобактерий туберкулеза.

AI CiMnNi CuZnCdPb

AI CrMnNiCuZnCdPb

Рис. 10. Сравнительная

характеристика межвидовых и физиологических функциональных различий в безразмерных элементных профилях (соотношениях) родов Mycobacterium, Bacillus, Rhodococcus * - величина не определялась V - вариабельная величина (1-200) о - нет данных.

М. tuberculosis

ii ...II

AI CrMnNiCuZnCdPb

Rh rhodochrous

,а.а,й,0 ,

AI CrMnNiCuZnCdPb

Таблица 2. Коэффициенты накопления (убыли) общего содержания металлов при росте М tuberculosis

МЕТАЛЛ Al Cr Mn Ni Cu Zn Cd Pb

КОЭФФИЦИЕНТ НАКОПЛЕНИЯ (УБЫЛИ) 1,65 озз 1,60 2,40 >20 5,0 1,5 >4

Переход культуры в постстационарное состояние также должен был бы сопровождаться изменением элементного профиля. Поскольку переход в дормантное состояние для М tuberculosis - процесс очень длительный (4 месяца), подобный эффект был подтвержден экспериментально для родственного вида: Mycobacterium smegmatis (рис 11).

Рис 11 Изменение содержания металлов при переходе культуры М зтецтаНь в дормантное состояние

Контроль за субпопуляционным состоянием культуры микобактерий с помощью размерных спектров (как показано на рис. 7) позволяет утверждать, что все взаимно обратимые клеточные

11

переходы (рис. 8) происходят с непосредственным участием индуцирующих лигандов (в данном случае ионов металлов и их комплексов с органическими лигандами). 4. Способы регуляции межпопуляциопиых клеточных переходов.

Рассматривая любую бактериальную культуру как динамическую равновесную систему, где переходы клеток из одного состояния (одиночные клетки) в другое (полицеллюлярные то обратимы (см. выше), можно представить ее в виде уравнения:

Поскольку описываемые переходы сопряжены с изменением элементных профилей, то есть с накоплением (убылью) металлов, то

Тогда, согласно 2-му закону термодинамики и вытекающему из него принципу Ле-Шателье, равновесие в системе «одиночные клетки - полицеллюлярные формы» будет смещаться при внесении в среду культивирования тех или иных ионов металла. Кроме того, учитывая тот факт, что константа равновесия данного процесса является функцией температуры, давления и т.п., можно говорить о различных способах индукции межпопуляционных клеточных переходов.

Временные клеточные ассоциаты, образующиеся вследствие адгезивного слипания, могут быть также диспергированы простым разбавлением клеточной культуры. Переходы от ассоциатов к одиночным формам вследствие понижения концентрации клеток в культуре наблюдаются у В. subtilis и К coli (рис.5,6).

Результаты исследований межпопуляционных клеточных переходов «одиночные клетки/полицеллюлярные формы» представлены в таблице 5.

Обнаруженное постоянство элементных профилей для физиологического состояния клетки означает, что введение в среду культивирования значительного (по сравнению с его концентрацией в биомассе) количества элемента должно драматически сказываться на изменении физиологического статуса клетки, так как повлечет за собою перестройку метаболизма многих металлов. Например, внесение соли соответствующего металла (0,8шМ (52 мкг/мл) сульфата цинка) в культуральную среду роста М tuberculosis приведет к смещению динамического равновесия в сторону палочковидных форм (Матвеева И.С. и др., 2002). С нашей точки зрения, использование нетоксичных солей металлов в сочетании с известными медикаментозными способами активации макрофагов может стать новым способом лечения некоторых форм туберкулеза, поскольку металлсодержащий препарат обладает потенциально противотуберкулезным действием (Балышев A.B. и др., 2004). Поданы патенты России и Украины на фармкомпозицию, действующую по принципу индукции межпопуляционных клеточных переходов (Балышев A.B. и др., 2004).

Процессы транспорта металлов через мембрану клеток обеспечиваются за счет трансмембранного электрохимического потенциала (по Н+, К+, Na+ и др.), поддерживаемого клетками в стационарном режиме за счет непрерывной затраты энергии. Предположив, что увеличение захвата тепловых нейтронов обусловлено особенностями строения межфазных слоев, следует ожидать влияние слабого потока тепловых нейтронов на метаболизм металлов в живых клетках, и, как следствие, на субпопуляционный состав бактериальной суспензии. Соответствующий результат был получен при экспозиции бактериальной суспензии Е. coli (штамм DH5a) в потоке нейтронов: в культуре зарегистрировано изменение содержания Cd и РЬ (Матвеева и др., 2004) и увеличение удельной площади поверхности при неизменной объемной концентрации взвешенного вещества (0,0054%), что говорит о диспергировании

М,

клеточных ассоциатов. По литературным данным (Сыроешкин A.B. и др., 2001; Drenkard Е. et al, 2002), последнее указывает на стимулирующее (в физиологическом отношении) действие слабого потока тепловых нейтронов на бактериальную культуру.

Табл.5. Способы управления переходами «одиночные клетки - полицеллюлярные формы» в клеточных суспензиях_

ТИП ВОЗДЕЙСТВИЯ МЕТОД ОБЪЕКТ АССОЦИАЦИЯ ДИСПЕРГИРОВ АНИЕ

ХИМИЧЕСКИЕ 1. ионы металлов в токсичной концентрации Си2+ Е. coli, Sacchoromyces cerevisiae + -

2. ноны металлов в нетоксичных концентрациях гп2+ Mycobacterium tuberculosis - +

3.аитибиотики ампициллин (0,2 мкг/л) E. coli + -

4. изменение изотопного состава воды тяжелая вода E. coli + -

МЕТОДЫ БИОИНЖЕНЕРИИ трансформация с плазмидой устойчивости к ампициллину E. coli (ппазмида pGEM (Promega)) - +

ФИЗИЧЕСКИЕ акустические Mycobacterium tuberculosis - +

тепловые нейтроны E. coli - +

Изменение изотопного состава среды ( при росте культуры Е. coli (штамм ТОРЮ) в тяжелой воде) приводит к изменению как элементного профиля, так и размерного спектра культуры: происходит агрегация культуры с образованием ассоциатов размером 4 мкм, 10 и 70 мкм. Подобный эффект оказывает введение в среду культивирования ионов Cu2+ (Glushchenko N.N. et al, 1989).

Инкубация культуры Е coli с ампициллином (0,2 мкг/л) привела к исчезновению одиночных форм и образованию популяции с узким (полуширина ~ 0,3 мкм) максимумом при гтах~2 мкм. Такие изменения можно объяснить формированием клеточных агрегаций, в которых внутренние клетки, оставаясь относительно интактными и поддерживая необходимый состав среды, защищены от токсического соединения. Однако при трансформации штамма с плазмидой, содержащей ген устойчивости к ампициллину, доля объема цитоплазмы, принадлежащая ассоциированным формам, сокращается с 20% (исходный штамм DH5a) до 2%, что указывает на то, что способность к аутоагрегации контролируется генетически.

5. Заключение

Таким образом, продемонстрирован факт присутствия в бактериальных культурах клеточных ассоциатов и полицеллюлярных форм, различных по своему происхождению и адаптационному значению:

5.1. Обратимое адгезивное слипание одиночных клеток, соответственно, зависящее от концентрации клеток. Этот механизм обнаружен в культуре В. subtilis.

5.2. Лигацд-зависимое образование временных клеточных агрегатов, вероятно, вследствие незавершенного деления клеток. Этот механизм обнаружен в культурах В. subtilis и К coli.

5.3. Генетически детерминированное (зависящее от вида) образование полицеллюлярных форм уже не как субпопуляции. Этот механизм реализуется и у £ coli, и у М. tuberculosis, и у Rh. rhodochrous.

Следует подчеркнуть, что полицеллюлярным формам во всех случаях принадлежит более 50% суммарного объема цитоплазмы клеток популяции.

При более подробном изучении образования полицеллюлярных форм у М. tuberculosis достоверно выяснено, что:

5.3.1 в дормантной культуре М tuberculosis преобладают одиночные клетки размером менее 1 мкм;

5.3.2 при переходе культуры от дормантной к активно делящейся форме ее субпопуляционная структура претерпевает коренные изменения: уже на 3-4 день начинаются процессы клеточной * агрегации и/или образования полицеллюлярных форм;

5.3.3 культура переходит к фазе логарифмического деления только после того, как образуется * достаточное количество клеточных ассоциатов (на 7-9 день), причем во время деления процессы клеточной агрегации продолжаются, что придает культуре характерную гетерогенность.

5.4 Культура М. tuberculosis может быть охарактеризована как динамическая система, в которой *

присутствуют взаимно обратимые межпопуляционные клеточные переходы «некультивируемые» формы - палочковидные формы - полицеллюлярные формы.

5.5. Продемонстрированы способы управления клеточными переходами «одиночная клетка -полицеллюлярные формы (табл. 5).

Образование колониальных форм широко распространено в органическом мире, и адаптивно-приспособительная роль данного процесса у эукариот хорошо известна (Иванов П.Л. , 1962.). Описано явление формирования гифоподобных колониальных форм у S. cerevisiaea, как защитная реакция на токсическое действие ионов rf-элементов за счет уменьшения

Рис. 12. Схема возможных изменений клеточных форм у прокариот и эукариот. С - исходная клетка 2С - деление клетки Ас - полицеллюлярные формы

Сп - временные ассоциаты Ос - гигантские клетки О - гибель клетки с — дормантные формы. Следует отметить, что путь Ос на рис. 5 с увеличением линейных размеров до 1 порядка(например, образование гигантских дрожжевых клеток) вероятно присущ только эукариотической клетке.

*

соотношения поверхность/объем (A.V. Syroeshkin et al, 2000). He вызывает сомнений, что образование ассоциатов и полицелтолярных форм у прокариот контролируется генетически и является ответом на изменение состава внешней среды (Voloshin S.A. et al, 2004). Взаимные межпопуляционные переходы и образование новых клеточных форм может быть обобщенно представлено в виде схемы (рис. 12). При этом обеспечивается механизм защиты от воздействия токсических соединений либо по пути уменьшения соотношения поверхность/объем (рис. 12, с - например, образование спор) либо за счет псевдомногоклеточности - создания защитного слоя клеток или внеклеточных выделений (рис. 12, Сп, Ас). Сдвиг равновесия у прокариот «одиночная клетка<-»полицеллюлярная форма» в сторону последней может играть очень интригующую роль в вопросах патогенности возбудителей инфекционных заболеваний, таких как возникновения лекарственной устойчивости или неэффективности клеточного и гуморального иммунитета. Кроме того, ложная многоклеточность у прокариот может (конвергентно к эукариотам) использоваться для обеспечения устойчивости бактериальных популяций в природных биогеоценозах. В частности, периодичность субпопуляционных перестроек Mycobacterium tuberculosis, скорее всего, соответствует времени развития иммунного ответа в организме, подобно тому, как связаны жизненные циклы паразита и хозяина.

Выводы

1. Метод лазерной дифракции и, соответственно, малоугловой измеритель дисперсности могут быть использованы для количественной характеристики перераспределения биомассы в суспензиях бактериальных клеток.

2. Бактериальные сообщества формируют в суспензиях полицеллюлярные формы, от временных ассоциатов до облигатных форм, которым может принадлежать до 95% биомассы всей популяции.

3. Субпопуляционные переходы «одиночные клетки - полицеллюлярные формы» в бактериальных суспензиях являются обратимыми, так что бактериальная культура может быть охарактеризована как система в состоянии динамического равновесия.

4. Образование полицеллюлярных форм, по данным исследований суспензий клеток В subtihs Е. coli, М. tuberculosis, Rh. rhodochrous, видоспецифично.

5. Образование спор у В subtilis, дормантных форм у М. tuberculosis и М smegmatis, колоний у Ы tuberculosis сопряжено с изменением элементных профилей культур.

6. Возможно направленное регулирование межпопуляционных клеточных переходов при акустических воздействиях, изменении плотности потока тепловых нейтронов, изменении микроэлементного состава среды, наличия токсичных для бактерий соединений, изменении изотопного состава среды.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сыроеппшн А.В., Плетенева Т.В., Гребенникова Т.В., Березинская Т.Д., Глущенко Н.Н. Образование ассоциатов и колоний у прокариот как ответ на изменение состава окружающей среды// Материалы X международного симпозиума "Эколого-физиологические проблемы адаптации". - 29-31 января 2001 г. - М., Изд-во РУДН, 2001. - С.513-514.

2. Сыроешкин А.В., Березинская Т.Л., Долгополова В.А., Ковалева А.А., Бикетов С.Ф., Плетенева Т.В. Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений// Электронный журнал "Исследовано в России". - 2001. - 112. - С.1204-1214. http://zhunial.ape.relarn.ru/articles/2001/112.pdf

3. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Березинская Т.Л., Плетенева Т.В, Глущенко Н.Н., Аветисян А., Бикетов С.Ф. Колонеобразование у прокариот как проблема инфекционной патологии// Вестник РУДН. - 2001. - № 3. - С. 17-24. http://med.pfii.edu.ru/ new/russian/win/librarv/vestnik/vO 13/03 2001.html

4. Шлеева М.О., Мукамолова Г.В., Телков М.В., Березинская Т.Л., Сыроешкин А.В., Бикетов С.Ф., Каприльянц А.С. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление// Микробиология. - 2003. - Т.72. - №1. - С1-8. http://mars.udsu.ru/cei-bin/cls/ioumal content?7202

5. Сыроешкин А.В., Суздалева О.С., Быканова С.Л., Березинская Т.Л.,Каприльянц А.С., Шлеева М.О., Матвеева И.С., Плетенева Т.В. Сопряжение метаболизма микроэлементов и клеточного формообразования как основа усиления противобактериальной защиты человеческого организма // Материалы XI международного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации». - 27-28 января 2003 г. - М., Изд-во РУДН, 2003. - С. 518-519.

6. Матвеева И.С., Плетенева Т.В., Березинская Т.Л., Аветисян А., Шлеева М.О, Каприльянц А.С., Лебедев И.М, Колесников М.Н., Бикетов С.Ф., Сыроешкин А.В. Элементные профили металлов как векторная характеристика вида и физиологического состояния// Микроэлементы в медицине. - 2003 - № 4. - С.15-21. http://www.microelements.ni/t04rus3.shtml

7. Березинская Т.Л., Шлеева М.О., Капрельянц А.С., Иткес А.В., Матвеева И.С., Лебедев И.М., Ильин В.А., Сыроешкин А.В. Явление обратимости межпопуляционных клеточных переходов Mycobacterium tuberculosis как основа создания новых противотуберкулезных лекарственных препаратов// Вестник РУДН. - 2004. - № 4 (28). - Сер. Медицина Специальность «Фармация». - С. 262-267.

Березинская ТЛ.

Изучение субпопуляционной структуры бактериальных культур и способов управления межпопуляционными клеточными переходами.

Результаты исследований суспензий бактериальных культур методом малоуглового рассеяния лазерного излучения позволяют рассматривать бактериальную культуру как систему, существующую в форме динамического равновесия «одиночные клетки/полицеллюлярные формы» и применять лазерные малоугловые измерители дисперсности (particle sizers) для количественной оценки субпопуляционного состава клеточных суспензий. Показано, что межпопуляционные переходы в клеточных суспензиях взаимно обратимы и тесно сопряжены с изменением элементных профилей бактериальных культур, что дает возможность применить к такой системе законы химической кинетики. Продемонстрирована возможность направленного регулирования межпопуляционных клеточных переходов, в частности, путем внесения в культуральную среду нетоксичных солей металлов. Обнаружено, что рост и развитие бактериальной культуры неразрывно связаны с субпопуляционными перестройками, поэтому использование металлосодержащих препаратов в сочетании с известными медикаментозными способами активации макрофагов может стать новым способом лечения некоторых форм туберкулеза. Berezinskaya T.L.

The research of bacterial population structure and ways of control of the 'changes between cell populations.

The using of the laser diffraction method in the investigation of some cell suspensions allows to consider a bacterial culture as a dynamic system «single cells / polycellular forms». The laser diffraction (with device «Particle sizer») is shown to apply to make an appraisal of a quantitative structure of cellular population. As reversible changes between cell populations are revealed to intimately connect with element proportion, so, the laws of chemical kinetics are applicable. The growing and development of the bacterial culture depends on balance between «single cells/associations and (or) colonial forms» It has been proved the controlled changes between cell populations are possible, and specifically the advances have come about through the insertion of the non-toxic metal salts into the bacterial culture.

So we consider that the using of metal-containing compounds in conjunction with well-known medical methods of macrophage activation is able to be a new way of treatment of some tuberculosis forms.

1

I

I

I

Гарнитура Times. Формат 60V90/16. Бумага офсетная 80 г. Печать офсетная. Уч .-изд. л 1,0 Усл.печ.л 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового Оригинал-макета в ООО "Знаменка".

РНБ Русский фонд

2006-4 17369

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Березинская, Татьяна Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Морфологическая дифференцировка прокариот

1.1. Репродуктивные покоящиеся формы бактерий

1.2. Стационарные покоящиеся формы бактерий

II. Уровни клеточной организации прокариот

II. 1. Морфология колоний на твердых средах

11.2. Биопленки

11.3. Механизм кворум-зависимости у микроорганизмов 33 ^ II.3. Агрегация бактерий в жидких средах

III. Применение подходов химической кинетики к описанию роста клеточных популяций

IV. Характеристика объектов исследования

IV.l. Escherichia coli

IV.2. Bacillus subtilis

IV.3. Rhodococcus rhodochrous

IV.4. Mycobacterium tuberculosis

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 97 I. Бактериальные культуры в суспензии содержат полицеллюлярные формы 97 ♦ II. Переходы «одиночные клетки - полицеллюлярные формы» являются обратимыми

III. Изучение элементных профилей при межпопуляционных клеточных переходах

IV. Способы регуляции межпопуляционных клеточных переходов

V. Механизмы образования полицеллюлярных форм

VI. Адаптивное значение образования полицеллюлярных форм 150 V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 162 ВЫВОДЫ 164 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение субпопуляционной структуры бактериальных культур и способов управления межпопуляционными клеточными переходами"

Решение проблем адаптации, то есть раскрытие структурно-функциональных основ жизни организма и его взаимодействия со средой, неразрывно связано со специализацией клеток, и, как следствие, с образованием полицеллюлярных форм. Адаптация прокариот обычно связывается с их генетической лабильностью и высокой скоростью приспособительных процессов (таких как возникновение резистентности) и рассматривается с точки зрения филогении. Между тем, учитывая высокую степень полиморфности многих бактериальных культур, у прокариот следует ожидать реализации всего многообразия механизмов адаптации, начиная от изменений отдельных клеток и заканчивая формированием единого ответа целостной клеточной популяцией.

Такое явление, как изменение формы и размеров эукариотических клеток под действием химических и физических факторов, хорошо известно. Так, при неблагоприятных условиях в культуре Saccharomyces cerevisiae образуются гигантские клетки, что способствует снижению соотношения поверхность/объем [194]. Формообразование эукариотичских клеток является функцией химического состава среды [7, 55]. Для бактериальных клеток, вследствие особенностей строения, подобные переходы затруднены, и при реализации аналогичных механизмов формообразования у прокариот следовало бы ожидать не изменений морфологии отдельной клетки, а объединения клеток в ассоциаты, образования клеточных агрегатов и полицеллюлярных форм, либо образования специализированных форм, устойчивых к внешним воздействиям.

В целом процессы ассоциации в сообществах микроорганизмов обеспечивают их высокую устойчивость к воздействию внешних факторов и приводят к формированию бактериальных пленок, исследованию которых ныне уделяется большое внимание [154]. Поскольку прокариотические клетки в биопленках тесно связаны друг с другом и объединены в целостную структуру [190], это явление позволяет говорить о «ложной многоклеточности», возникающей конвергентно колониальным и многоклеточным эукариотическим организмам.

Образованию и роли бактериальных ассоциатов уделяется пристальное внимание [172, 187]. Процессы ассоциации бакгериопланктона прослеживаются в водных гетеротрофных бактериоценозах, от чего зависит скорость процессов естественной переработки загрязняющих веществ в водоемах [35]. Тем не менее, оценка такого важного параметра, как численность бактерий в среде, остается нерешенной проблемой, поскольку, вследствие ассоциации, не все клетки способны образовывать колонии на твердых средах.

Кроме того, с формообразованием болезнетворных бактерий непосредственно связаны проблемы патогенеза хронических инфекций и персистенции микроорганизмов. Обязательным условием существования паразитарных систем в биологически агрессивной среде является гетерогенность популяций патогена и их динамическая изменчивость [9]. Так, Mycobacterium tuberculosis способны образовывать ультрамелкие формы, способные к длительному персистированию при неблагоприятных условиях, L-формы, невидимые для иммунной системы [32], а также ассоциаты разного размера, затрудняющие макрофагальный ответ [54]. Агрегация Escherichia coli, патогенных стафилококков, менингококков под действием лизоцима способствует колонизации бактерий в организме и обеспечивает их лекарственную устойчивость [39]. Таким образом, успешная диагностика и полнота излечения многих заболеваний может быть тесно связана с возможностью контроля субпопуляционных перестроек патогенных микроорганизмов. В настоящей работе мы разработали новый количественный метод исследования субпопуляционного состава бактериальных культур и применили его для кинетического описания межпопуляционных переходов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бактериальная клетка a priory отличается от эукариотической меньшей лабильностью формы. Тем не менее, малые размеры прокариотических клеток, обеспечивающие крайне высокое соотношение «поверхность/объем», приводят к интенсивнейшему взаимодействию с внешней средой и определяют необходимость гибкой адаптации. В связи с этим рассмотрим основные универсальные адаптивные стратегии микроорганизмов, как правило, подразумевающие ту или иную форму клеточной дифференцировки.

I. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ПРОКАРИОТ Понятие дифференцировки определяется следующим: «одну клетку следует считать дифференцированной по сравнению с другой, если при одинаковых геномах набор белков, синтезированных в этих клетках, различен" [120].

Несмотря на огромное разнообразие физиологических процессов прокариот, их морфологическая дифференцировка, казалось бы, весьма ограничена. Тем не менее, для эубактерий характерно образование дифференцированных клеточных форм. Это могут быть вегетативные клетки измененной формы, клеточные структуры с четко выраженной функциональной специализацией и различные многоклеточные образования. Поскольку основной функцией бактериальной клетки является самовоспроизведение, функциональная дифференцировка подразумевает, как правило, состояние более или менее глубокого метаболического покоя. Способность прокариот к цитодифференцировке проявляется, прежде всего, в цикличности воспроизведения покоящихся клеток, образующихся в результате экспрессии регулонов, контролирующих процессы образования специфических клеточных структур и развития свойств покоя [10]. Поэтому, говоря о морфологически дифференцированных клетках, выделяют два функциональных состояния: пролиферативного и репродуктивного покоя. И пролиферативно, и репродуктивно покоящиеся формы образуются в ответ на действие факторов, неблагоприятных для роста, и имеют адаптивное значение, однако состояние пролиферативного покоя отличается детектируемой метаболической активностью [10].

Общие формы защиты покоящихся клеток в неблагоприятных условиях следующие [67, 117]:

1) синтез молекулярных шаперонов (белки теплового шока и др.) и стабилизация ферментов;

2) стабилизация ферментов природными химическими шаперонами;

3) суперспирализация ДНК;

4) синтез «споровых» липидов, углеводов и других низкомолекулярных метаболитов с функциями адаптогенов;

5) поликристаллизация мембранных липидов и стабилизация мембран;

6) протекторная защита мембран;

7) антиоксиданты системы неферментативной антирадикальной защиты;

8) дегидратация клетки.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Березинская, Татьяна Леонидовна

ВЫВОДЫ

1. Метод лазерной дифракции и, соответственно, малоугловой измеритель дисперсности могут быть использованы для количественной характеристики перераспределения биомассы в суспензиях бактериальных клеток.

2. Бактериальные сообщества формируют в суспензиях полицеллюлярные формы: от временных ассоциатов до облигатных колоний, которым может принадлежать до 95% биомассы всей популяции.

3. Субпопуляционные переходы «одиночные клетки - полицеллюлярные формы» в бактериальных суспензиях являются обратимыми, так что бактериальная культура может быть охарактеризована как система в состоянии динамического равновесия.

4. Образование полицеллюлярных форм, по данным исследований суспензий Е. coli, видоспецифично.

5. Образование спор у В. subtilis, дормантных форм у М. tuberculosis и М. smegmatis, колоний у М. tuberculosis сопряжено с изменением элементных профилей культур.

6. Возможно направленное регулирование межпопуляционных клеточных переходов методами физического и химического воздействия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты исследований наглядно демонстрируют факт присутствия в бактериальных культурах клеточных ассоциатов и полицеллюлярных форм, различных по своему происхождению и адаптационному значению:

1. Обратимое адгезивное слипание одиночных клеток, соответственно, зависящее от концентрации клеток. Этот механизм обнаружен в культуре В. subtilis.

2. Лиганд-зависимое образование временных клеточных агрегатов, в частности, вследствие незавершенного деления клеток. Этот механизм обнаружен в культурах В. subtilis и Е. coli.

3. Генетически детерминированное (зависящее от вида) образование полицеллюлярных форм уже не как субпопуляции. Этот механизм реализуется и у Е. coli, и у М. tuberculosis, и у Rh. rhodochrous.

Следует подчеркнуть, что полицеллюлярным формам во всех случаях принадлежит более 50% суммарного объема цитоплазмы.

При более подробном изучении образования полицеллюлярных форм у М. tuberculosis достоверно выяснено, что:

3.1 в дормантной культуре М. tuberculosis преобладают одиночные клетки размером менее 1 мкм;

3.2 при переходе культуры от дормантной к активно делящейся форме ее субпопуляционная структура претерпевает коренные изменения: уже на 3-4 день начинаются процессы клеточной агрегации и/или образования полицеллюлярных форм;

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Березинская, Татьяна Леонидовна, Москва

1. Авцын А.П. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. - 1991. - 494 с.

2. Бабский В.Г. Явление самоорганизации у бактерий на клеточном ипопуляционном уровнях // Нелинейные волны. Динамика и эволюция. 1989. - С. 299-303.

3. Балышев А.В., Тимаков А.А., Гаврилова М.М., Смирнов А.Н., Матвеева И.С.,

4. Лебедев И.М., Лапшин В.Б., Сыроешкин А.В. Биологическая активность воды с изменененным соотношением H/D: является ли дейтерий компонентом минерального питания?// Вестник РУДН. Сер. Фармация. 2004. = №4 (28). -С. 262-268.

5. Балышев А.В., Гребенникова Т.В., Плетенева Т.В., Коломин В.Ю., Сыроешкин

6. А.В. Фармацевтическая композиция для профилактики и дополнительной химиотерапии туберкулеза// Патентная заявка № 2004135345/15(038452) от 03.12 2004. Положительное решение ФИПС от 26.01.05.

7. Бациллы: генетика и биотехнология/ под ред. К. Харвуда. М.: Мир. - 1992.

8. Богомолова Е.В., Власов Д.Ю., Панина Л.К. Морфометрическое сравнениесерии штаммов литобионтных черных дрожжей Phaeococcomyces exophialae/l Микология и фитопатол. 2000. - Т. 34. - № 2. - С. 40-47.

9. Будрене Е.О. Образование пространственно упорядоченных структур вколониях подвижных бактерий на агаре// Докл. АН СССР. 1985. - Т. 283. - № 2.-С. 470-473.

10. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина. - 1999. - 366с.

11. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмывыживания бактерий. М.: Медицина. - 2005. - 367 с.

12. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основымикробиологических процессов. М.: Наука. - 1990. - 260 с.

13. Вернадский В.И. Химическое строение биосферы Земли и ее окружения. М.:1. Наука. 1987. - 340 с.

14. Весталл Ф., Велш М. Ископаемые бактерии и бактериальные биопленки//

15. Бактериальная палеонтология. М.: ПИН РАН. - 2002. - С. 84-90.

16. Волошин С.А., Капрельянц А.С. Межклеточные взаимодействия вбактериальных популяциях// Биохимия. 2004. - V. - 69. Р. 1555-1564.

17. Вотякова Т.В., Мукамолова Г.В., Штейн-Марголина В.А., Попов В.И., Дэви

18. Х.М., Келл Д.Б., Капрельянц А.С. Исследование гетерогенности культуры Micrococcus luteus, пребывающей длительное время в стационарной фазе. Разделение и характеристика субпопуляций// Микробиология. 1998. - Т. 67. -№ 1. - С. 85-92.

19. Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. Физико-химическиезакономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов // Физическая химия. 2002. - № 1. - С. 32-37.

20. Голубева И.В., Килессо В.А., Киселева Б.С. и др. Энтеробактерии/ под ред.

21. В.И.Покровского. М.: Медицина. - 1985. - 321 с.

22. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий//Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т. 48. - № 10. - С. 32-39.

23. Дженкс П. Катализ в химии и энзимологии. М.: Мир. - 1978. - 543 с.

24. Дорожкова И.Р., Николаева Г.М. Способ ускоренной реверсии L-форм микобактерий//Открытия. 1990. - № 12. - С.45.

25. Дорожкова И.Р., Федосеев B.C., Керимжанова Б.Ф., Айтжанов Б.Д. О персистенции L-форм микобактерий в организме инфицированных животных // Соврем, пробл. профилактики зооноз. болезней и пути их решения. Минск, 1987. - С. 84.

26. Дуда В.И. Особенности цитологии спорообразующих бактерий// Успехи микробиол. 1982. - Вып. 17. - С. 87-116.

27. Дуда В.И., Выпов М.Г., Сорокин В.В., Митюшина Л.Л., Лебединский А.В. Образование бактериями экстрацеллюлярных структур, содержащих гемопротеины // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 1. - С. 69-73.

28. Дуда В.И., Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Шорохова А.П., Мишина Г.В. Ультраструктурная организация газовых баллонов и поверхностных пленок в колониях у грамотрицательной бактерии Alcaligenes sp., штамм d2// Микробиология. -1996. Т. 65. - № 2. - С.222-227.

29. Ершов Ю.А. Квазихимические модели динамики клеточных популяций под действием ингибиторов и активаторов роста// Прикл. биохим. микробиол. -1999. Т. 35. - № 3. - С. 275-281.

30. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы токсического действиянеорганических соединений. М.: Медицина. 1989. - 272 с.

31. Ершов Ю.А. Квазихимические модели роста биологических популяций поддействием ингибиторов и промоторов// Ж. физ. химии. 1998. - Т. 72. - №3 -С. 553-559.

32. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. М.: КМК Scientific Press. - 1997.144 с.

33. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Регуляторные механизмыпролиферации клеток. М.: ВИНИТИ. - Итоги науки и техники. - 1988. - т. 10.

34. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. М.:1. Наука. 1983.-215 с.

35. Жилина Т.Н., Турова Т.П., Кузнецов Б.Б. и др. Osenia sivashensis sp. nov. новаяумеренно галофильная анаэробная бактерия из лагун Сиваша// Микробиология. 1999. - Т. 68. - №4. - С. 519 - 527.

36. Земская З.С., Дорожкова И.Р. Скрыто протекающая туберкулезная инфекция.

37. М.: Медицина. 1984. - 83с.

38. Иванов П.Л. Происхождение многоклеточных животных. М.: Наука. - 1962.407 с.

39. Ившина И.Б., Пшеничнов Р.А., Оборин А.А. Пропанокисляющие родококки.

40. Свердловск: УНЦ АН СССР. 1987. - 124 с.

41. Ильинский В.В. Гетеротрофный бактериопланктон: экология и роль в процессахестественного очищения среды от нефтяных загрязнений// автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. М., 2000. - 53 с.

42. Инкина Г.А., Остапеня А.П. Агрегированность озерного бактериопланктона//

43. Микробиология. 1984. - Т.53. - вып. 4. - С. 686-693.

44. Какалуцкий JI.B., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. М.: Наука. - 1977. - 286с.

45. Каменир Ю.Г., Хайлов К. М. Метаболические параметры и сводная поверхностьживого вещества океана: сопоставление размерных спектров// Океанология. -1987.- 27, вып. 4. С. 656 - 661.

46. Костюкова Н.Н. Начальный этап инфекционного процесса — колонизация и путиее предотвращения// Журн. микробиол. 1989. - № 9. - С. 103-109.

47. Мартынкина Л.П., Милько Е.С. Ультраструктурные особенности диссоциантов

48. Rhodococcus rubropertinctus и Streptococcus lactisll Микробиология. 1991. - Т. 60.-№2.-С. 334-338.

49. Матвеева И.С., Плетенева Т.В., Березинская Т.Л., Аветисян А.В., Шмелева

50. М.О., Капрельянц А.С., Колесников М.В., Бикетов С.Ф., Сыроешкин А.В. Элементные профили металлов как характеристика вида и физиологического состояния// Микроэлементы в медицине. 2003. - №4(3). - С. 6-12.

51. Микрюков К.А. Изучение ультраструктуры и сравнение генов рРНК как методыпостроения системы протистов// Зоологический журнал. 1999. - Т. 79. - Вып. 8.-С. 1-15.

52. Могильная О.А., Милько Е.С., Медведева С.Е. Сравнительное электронномикроскопическое изучение колонии и клеток диссоциантов родококка// Прикл. Биохим. Микробиол. 1994. - Т.30. - № 6. - С. 877-882.

53. Мулюкин A.JI., Луста К.А., Грязнова М.Н. и др. Образование покоящихся формв автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 1996. - Т. 66. - №1. - С. 42-49.

54. Олескин А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробныхпопуляциях// Микробиология. 1993. - Т.62. - № 3. - С. 389-403.

55. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т./Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снитаи др. Т. 1. М.: Мир. - 1997.-432 с.

56. Павлова И.Б., Куликовский А.В., Ботвинко И.В., Джентемирова К.М., Дроздова

57. Т.И. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях. Морфология колоний бактерий// Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. 1990. - № 12. - С. 15-20.

58. Печуркин Н.С., Тарсков И.А. Анализ кинетики роста и эволюции микробныхпопуляций. Новосибирск: Наука. - 1975. - 287 с.

59. Плетенева Т.В. Прогнозирование экологической опасности неорганическихсоединений по их физико-химическим свойствам: Автореф. дис. . д-ра химических наук. М., 1993. - 84 с.

60. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерийсубмикроскопическая организация и некоторые биохимические особенности). М.: Медицина. - 1981. - 238 с.

61. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Диденко Л.В., Константинова Н.Д.,

62. Пономарева Л.В., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л. Покоящиеся формы Yersinia pseudotuberculosis при взаимодействии с зелеными водорослями и их экзометаболитами (популяционная динамика и ультраструктура)// ЖМЭИ. -1998.-№5.-С. 9-13.т

63. Сиволодский Е.П. Систематика и идентификация энтеробактерий. СПб. - 1998.-36 с.

64. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука. - 1989. - С. 2075.

65. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Березинская Т.Л., Плетенева Т.В.,

66. Глущенко Н.Н., Аветисян А., Бикетов С.Ф. Колонеобразование у прокариот как проблема инфекционной патологии// Вестник РУДН. 2001, № 3. - С. 1724.

67. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Байкова В.Н., Ковалева А.А., Лебедев

68. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae впатологии. М.: Медицина. - 1973. - 392 с.

69. Торможение жизнедеятельности микроорганизмов// Ред. М.Е. Беккер, А.И.

70. Рапопорт, Л.В. Какалуцкий и др. Рига: Зинатие, - 1987.

71. Туберкулез/под ред. А.Г. Хоменко. М.: Медицина, 1992. - 312 с.

72. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./ Под ред. Барри Р.

73. Блума.-М.: Медицина, 2002.- 697с.

74. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз// Микробиология. 1992. - Т.61.5.- С. 739-753.

75. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир. - 1988. - 568 с.4

76. Шапиро Дж.А. Бактерии как многоклеточные организмы// В мире науки. 1988.- № 8. С. 46-54.

77. Allan E.J. Induction and cultivation of a stable L-form of Bacillus subtilis!I

78. J. Appl. Bacteriol. 1991. - V. 70. - N. 4. - P. 339-343.

79. Allan E.J., Amijee F., Tyson R.H., Strang J.A., Innes C.M., Paton A.M. Growth andphysiological characteristics of Bacillus subtilis L-forms// Appl. Bacteriol. 1993. - V. 74. - N. 5. - P. 588-594.

80. Angert E.R., Losick R.M. Propagation by sporulation in the guinea pig symbiont

81. Metabacterium polysporall Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. V. 95. N. 17. -P. 10218-10223.

82. Araujo Z., Waard J.H., Fernandes de Larrea С .III Study of the antibody responseagainst Mycobacterium tuberculosis antigens in Warao Amerindian children in Venezuela// Met. Inst. Oswaldo Cruz. 2004. - V. 99. - N. 5. - P. 517-524.

83. Azam T.A., Iwata A., Nishimura A. et al. Growth phasedependent variation in proteincomposition of the Escherichia coli nucleoid // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - N. 20. - P. 6361-6370.

84. Bahat-Samet E., Castro-Sowinski S., Okon Y. Arabinose content of extracellularpolysaccharide plays a role in cell aggregation of Azospirillum brasilensell FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 237. - N. 2. - P. 195-203.

85. Barksdale L., Kim K.S. Mycobacterium // Bacter. Rev. 1977.- №41.- P.217-232.

86. Beveridge T.J., Murray R.G.E. Uptake and retention of metals by cell walls of

87. Bacillus subtilis!I J. Bacteriology. 1976. - V. 127. - N. 3. - P. 1502-1518.

88. Beveridge T.J., Koval S.F. Binding of metals to cell envelopes of Escherichia coli K12//Appl. Environ. Microbiol. 1981. - V. 42. - N. 2. - P. 325-335.

89. Biebl H., Schwab-Hanisch H., Sproer С., Lunsdorf H. Propionspora vibriodes, nov.gen. sp., a new gram-negative, spore-forming anaerobe that ferments sugar alcohols// Arch. Microbiol. 2000. - V. 174. - P. 239 - 247.

90. Binkhuysen F., Das P.K. Ultrastructural characteristics of Mycobacterium bovis and

91. Mycobacterium leprae II Int. J. Lepr. 1982.- №50. - P.76-82.

92. Birdsell D.C., Doyle R.J., Morgenstern M. Organization of teichoic acid in the cellwall of Bacillus subtilis!I J. Bacteriol. 1975. - V. 121. -N. 2. -P. 726-734.

93. Boivin M.E., Massieux В., Breure A.M., van den Ende P.P., Greve G.D., Rutgers M.,

94. Admiraal W. Effects of copper and temperature on aquatic bacterial communities// Aquat Toxicol. 2005. - V. 71. - N. 4. - P. 345-356.

95. Branda S.S., Gonzalez-Pastor J.E., Dervyn E., Ehrlich S.D., Losick R., Kolter R.

96. Genes involved in formation of structured multicellular communities by Bacillus subtilisII J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - N. 12. - P. 3970-3979.

97. Braun V., Gnirke I.H., Henning U., Rehn K. Model for the structure of the shapemaintaining layer of the Escherichia coli cell envelope// J. Bacteriol. 1973. - V. 114. - N. 3. - P. 1264-1270.

98. Carstensen E. L. Passive electrical properties of microorganisms. II. Resistance of thebacterial membrane// Biophys. J. 1967. - V. 1. - P. 493-503.

99. Chan J., Brennan P., Bloom R. Lipoarabinomannan, a possible virulence factorinvolved in persistence of Mycobacterium tuberculosis within macrophages // Infect. Immun. 1991. - №59. - P. 1755-1761.

100. Chan S., Gerson В., Subramaniam S. The role of copper, molybdenum, selenium, andzinc in nutrition and health// Clin. Lab. Med. 1998. - V. 18. - N. 4. - P. 673-685.

101. Collins МЮ., Goodfellovv M., Minnikin D.E., Aldcrson G. Menaquinone compositionof mycolic acid-containing actinomycetes and some sporoactinomycetes// J. Appl. Bacteriol. 1985. - V. 58. - N. 1. - P. 77-86.

102. Colwell R.R., Brayton P.R., Grimes D.J. Viable but nonculturable Vibrio choleraeand related pathogens in the environment: implication for the release of genetically engineered microorganisms // Bio. Technology. 1985. - V. 3. - P. 817 - 820.

103. Costerton J.W. Microbial interactions in biofilms // Beijerinck Centennial. Microbial

104. Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications. Book of Abstracts /Ed. W.A. Scheffers, J.P. van Dijken. Delft. Delft. Univ. Press. - 1995. -P.20-21.

105. Cross Т., Atwell R.W. Actinomycetes spores// Spores VI/ Eds. P. Gerhardt, R.N.

106. Costinlow, H.L. Sadoff. Washington D.C.: Amer. Soc. Microbiol. - 1975.

107. Daffe M., McNeil M., Brennan P.J. Major structural features of the cell wallarabinogalactans of Mycobacterium, Rhodococcus, and Nocardia spp.ll Carbohydr. Res. 1993. - V. 249. - N. 2. - P. 383-398.

108. Dashper S.G., O'Brien-Simpson N.M., Cross K.J., Paolini R.A., Hoffmann В.,

109. Catmull D.V., Malkoski M., Reynolds E.C. Divalent metal cations increase the activity of the antimicrobial Peptide kappacin// Antimicrob Agents Chemother. -2005. V. 49. -N. 6. - P. 2322-2328.

110. Del Re В., Busetto A., Vignola G., Sgorbati В., Palenzona D.L. Autoaggregation andadhesion ability in a Bifidobacterium suis strain// Lett. Appl. Microbiol. 1998. -V. 27. -N.5.-P. 307-310.

111. Demchick P., Koch A.L. The permeability of the wall fabric of Escherichia coli and

112. Bacillus subtilis// J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - N. 3. - P. 768-773.

113. Doyle R.J., McDannel M.L., Helman J.R., Streips U.N. Distribution of teichoic acidin the cell wall of Bacillus subtilisII J. Bacteriol. 1975. - V. 122. - N. 1. - P. 152158.

114. Drapper P. The anatomy of mycobacteria // The Biology of micobacteria.- 1982.vol.l.- P.9-52.

115. Drenkard E., Ausubel F. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance arelinked to phenotypic variation// Nature. 2002. - V. 416. - P. 740-743.

116. Driks A. Bacillus subtilis spore coatII Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 1999. - V. 63.- № l.-P. 1-20.

117. Dufrene Y.F., Boonaert C.J.P., van der Mei H.C., Busscher H.J., Rouxhet P.G.

118. Probing molecular interactions and mechanical properties of microbial cell surfaces by atomic force microscopy// Ultramicroscopy. 2001. - V. 86. - N. 1-2. - P. 113120.

119. Dworkin M., Gibson S.M. A system for studying rapid microbial morphogenesis:

120. Rapid formation of mycrocysts in Myxococcus xanthus II Science. 1964. - V. 146. -P. 243-245.

121. Ehrstrom M., Goiran Eriksson L. E., Israelachvii J., Ehrenberg A. The effects ofsome cations and anions on spin labeled cytoplasmic membranes of Bacillus subtilis II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. V. 55. P. 396-402.

122. Einolf C. W., Jr., Carstensen E. L. Passive electrical properties of microorganisms.1.. Studies of the protoplasts of Micrococcus lysodeikticusll Biophys. J. 1969. V. 9. P.634-643.

123. Emanuel N.M. Kinetics and free-radical mechanisms of ageing and carcinogenesis//

124. RC Sci. Publ. 1985 - V. 58. - P. 127-150.f • 98. Flaherty С., Minnikin D.E., Sutcliffe I.C. A chemotaxonomic study of the lipoglycansof Rhodococcus rhodnii N445 (NCIMB 11279)// Zentralbl. Bakteriol. 1996. - V. 285.-N. l.-P. 11-19.

125. Francesca В., Ajello M., Bosso P., Morea C., Andrea P., Giovanni A., Piera V. Bothlactoferrin and iron influence aggregation and biofilm formation in Streptococcus mutansll Biometals. 2004. - V. 17. - N. 3. P. 271-278.

126. Freestone P., Grant S., Trinei M., Onoda Т., Norris V. Protein phosphorylation in

127. Escherichia coli L-form NC-7// Microbiology. 1998. - V. 144. - Pt. 12. - P.3289-3295.

128. Garrison R.G., Mirikitani F.K., Lane J.W. Fine structural studies of Rhodococcusspecies//Microbios.- 1983.-V. 36.-N. 145-146.-P. 183-190.

129. Gerhardt P., Scherrer R. Porosities of microbial cell walls and protoplastmembranes//Proc. Intersect. Cong. I.A.M.S. 1974. V. 1. - P. 506-513.

130. Gibson K.J., Gilleron M., Constant P., Puzo G., Nigou J., Besra G.S. Structural andfunctional features of Rhodococcus ruber lipoarabinomannan// Microbiology. -2003. V. 149. - Pt. 6. - P. 1437-1445.

131. Gonzales-Pastor J.E., Hobbs E.C., Losick R. Cannibalism by sporulating bacteria//

132. Science. 2003. - V. 301. - P. 510 - 513.

133. Graham L.L., Beveridge T.J. Structural differentiation of the Bacillus subtilis 168 cellwall// J. Bacteriol.- 1994.- V. 176.-N. 5. -P. 1413-1421.

134. Greenberg E.P., Winans S., Fuqua C. Qworum sensing by bacteria// Ann. Rev.

135. Microbiol. 1996. - V. 50. - P. 727-751.

136. Goodfellow M., Alderson G., Chun; J. Rhodococcal systematics: problems anddevelopments// Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. - N. 1-3. - P. 3-20.

137. Gygi D., Rahmen M.M., Lai H.-C., Carlson R., Guard-Petter J., Hughes C. A cellsurface polysaccharide that facilitates rapid population migration by differentiated swarm cells of Proteus mirabilisll Mol. Microbiol. 1995. - V.17. - P.1167-1175.

138. Harshey R.M. Bees aren't the only ones: swarming in Gram-negative bacteria// Mol.

139. Microbiol. 1994. - V.16. -N. 3. - P. 389-394.

140. Hasman H., Chakraborty Т., Klemm P. Antigen-43-mediated autoaggregation of

141. Escherichia coli is blocked by fimbriation// J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - N. 16. -P. 4834-4841.

142. Heptinstall S., Archibald A. R., Baddiley J. Teichoic acids and membrane function inbacteria. Selective destruction of teichoic acid reduces the ability of bacterial cell walls to bind Mg2+ ions// Nature (London). 1970. - V. 225. - P. 519-521.

143. Hirschfield G.R., Brenan P.G. Peptidoglycan-associated polypeptides of

144. Mycobacterium tuberculosis II J. Bacteriol. 1990,- №172.-P. 1005-1013.

145. Honma Y., Nakasone N. Pili of Aeromonas hydrophila: purification, characterization,and biological role// Microbiol. Immunol. 1990. - V. 34. - N. 2. - P. 83-98.

146. Horsburgh G.J., Atrih A., Foster S.J. Characterization of LytH, a differentiationassociated peptidoglycan hydrolase of Bacillus subtilis involved in endospore cortex maturation // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - N. 13. - P. 3813-3820.

147. Hoylet В., Beveridge T.J. Binding of metallic ions to the outer membrane of

148. Escherichia coli!/ Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 46. - N. 3. - P. 749-752.

149. Ihihama A. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria// Curr. Opin. Genet. Develop. 1997. - V. 7. - P. 582-588.

150. Innes C.M., Allan E.J. Induction, growth and antibiotic production of Streptomyces viridifaciens L-form bacteria// J. Appl. Microbiol. 2001 - V. 90. - N. 3. - P. 301308.

151. Irving C.S., Lapidot A. The dynamic structure of the Escherichia coli cell envelope as probed by 15N nuclear magnetic resonance spectroscopy// Biochim. Biophys. Acta. 1977. - V. 470. - N. 2. - P. 251-257.

152. Jacob F., Monod J. Biochemical and genetic mechanisms of regulation in the bacterial cell. Bull Soc Chim Biol (Paris). 1964. - V. 46. - P. 1499-1532.

153. Jann K., Jann В. Polysaccharide antigens of Escherichia coli// Rev. Infect. Dis. — 1987. V. 9. - Suppl. 5. - P. 517-526.

154. Kaprelyants A.S., Kell D.B. Do bacteria need to communicate with each other for growth?// Trends Microbiol. 1996. - V.4. - P.237-241.

155. Kaprelyants A.S., Kell D.B. Rapid assessment of bacterial viability and vitality using rhodamine 123 and flow cytometry// J. Appl. Microbiol. 1992. - V.72. -P.410-422.

156. Kaprelyants A.S., Mukamolova G.V., Kormer S.S., Weichart D.H., Young M., Kell D.B. Intercellular signalling and the multiplication of prokaryotes// Microbial Signalling and Communication. Society for General Microbiology Symposium 57.

157. Ed. R. England, G. Hobbs, N. Bainton, D. McL. Roberts. Cambridge: Cambridge University Press. - 1999. - P.33-69.

158. Kim S.H., Kim Y.H. Escherichia coli 0157:H7 adherence to HEp-2 cells is implicated with curli expression and outer membrane integrity// J. Vet. Sci, 2004. -V. 5.-N.2.-P. 119-124.

159. Kjelleberg S., Hermansson M. Starvation-induced effects on bacterial surface characteristics// Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48. - P. 497-503.

160. Klemm P., Hjcrrild L„ Gjermansen M., Schcmbri M.A. Structure-function analysis of the self-recognizing Antigen 43 autotransporter protein from Escherichia coliII Mol. Microbiol. 2004. - V. 51. - N. 1. - P. 283-296.

161. Koch A.L. Orientation of the peptidoglycan chains in the sacculus of Escherichia colill Res. Microbiol. 1998.-V. 149.-N. 10.-P. 689-701.

162. Kos В., Suskovic J., Vukovic S., Simpraga M., Frcce J., Matosic S. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92// J. Appl. Microbiol. 2003. - V. 94. - N. 6. - P. 981-987.

163. Krasovec R., Jerman I. Bacterial multicellularity as a possible source of antibiotic resistance// Med. Hypotheses. 2003. - V. 60. - N. 4. - P. 484-488.

164. Kubica G., Wayne G. The Mycobacteria a Source Book. -1984- Marcel Dekker, Inc. New York.

165. Laarmann S., Schmidt M.A. The Escherichia coli AIDA autotransporter adhesin recognizes an integral membrane glycoprotein as receptor// Microbiology. 2003. -V. 149. -Pt. 7.-P. 1871-1882.

166. Lang S., Philp J.C. Surface-active lipids in rhodococci// Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. - N. 1-3. - P. 59-70.

167. Lambert P. A., Hancock I. C., Baddiley J. The interaction of magnesium ions with teichoic acid// Biochem. J. 1975. - V. 149. - P. 519-524.

168. Leduc M., Rousseau M., van TIeijenoort J. Structure of the cell wall of Bacillus species C.I.P. 76-111// Eur. J. Biochem. 1977. - V. 80. -N. 1. - P. 153-163.

169. Legroux R., Magrou J. Etat organise des colonies bacteriennes// Ann. Inst. Pasteur. 1920.-V. 34.-P. 417-431.

170. Leong J., Neilands J. B. Mechanisms of siderophore iron transport in enteric bacteria// J. Bacteriol. 1976. - V. 126. - P. 823-830.

171. Losick R., Kaiser D. Why and how bacteria communicate// Sci. Amer. 1997. -Feb.-P. 68-73.

172. Macham L. P., Ratledge C. A new group of water-soluble, iron-binding compounds from Mycobacteria: the exochelins// J. Gen. Microbiol. 1975. - V. 89. -P. 379-382.

173. Marcelis J. H., denDaas-Slagt H. J., Hoogkamp-Korstanje J. A. A. Iron requirement and chelator production of staphylococci, Streptococcus faecalis and Enterobacteriaceaef! Antonie Leeuwenhoek J. Microbiol. 1978. - V. 44. - P. 257267.

174. McCullough W. G., Merkal R. S. Iron-chelating compound from Mycobacterium avium!I J. Bacteriol. 1976. - V. 128. - P. 15-20.

175. McKay A.M. Nonviable bacterial pathogens// Lett. Appl. Microbiol. 1992. - V. 14.-P. 129-135.

176. McNeil M., Daffe M., Brennan P. Evidence for the nature of the link between the arabinogalactan and peptidoglycan of mycobacterial cell walls // J. Biol. Chem.-1990. -№265.-P.200-218.

177. Monod J., Changeux J.P., Jacob F. Allosteric proteins and cellular control// J.

178. Mol. Biol. 1965. - V. 6. - P. 12-34.

179. Muris M., Delolme C., Gaudet J.P., Spadini L. Assessment of biofilm destabilisation and consequent facilitated zinc transport// Water Sci. Technol. -2005. V. 51. - N. 2. - P. 21-28.

180. Nelson D. E., Young K. D. Penicillin binding protein 5 affects cell diameter, contour, and morphology of Escherichia coli/I J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1714-1721.

181. Nicaido H., Rosenberg E. Physical organization of lipids in the cell wall of

182. Mycobacterium chelonae //Mol. Microbiol. 1993.- №8.- P.1025-1030.

183. Nicholos J.M., Carr N.G. Akinetes of cyanobacteria // Spores VII / Eds. G. Chambliss, J.C. Vary. Washington D.C. Amer. Soc. Microbiol. 1978. - P. 335 -343.

184. Nicholson W.L., Munakata N., Homeck G. et al. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments// Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - V. 64. - N. 3. - P. 548-572.

185. Nishiuchi Y., Baba Т., Yano I. Mycolic acids from Rhodococcus, Gordonia, and DietziaH J. Microbiol. Methods. 2000. - V. 40. - N. 1. - P. 1-9.

186. O'Connor K.A., Zusman D.R. Development in Myxococcus xanthus involves differentiation into two cell types, peripheral rods and spores// J. Bacteriol. 1991. -V. 173.-P. 3318-3333.

187. Onoda Т., Enokizono J., Kaya H., Oshima A., Freestone P., Norris V. Effects of calcium and calcium chelators on growth and morphology of Escherichia coli Inform NC-7//J. Bacteriol. 2000. - V. 182.-N. 5.-P. 1419-1422.

188. СГToole G., Kaplan H. В., Kolter R. Biofilm formation as microbial development// Ann.Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 49-79.

189. Orme I.M. Immunity to mycobacteria// Current Opinion in immunology. 1993. -N. 5.-P. 497.

190. Ou L.T., Marquis R. E. Electromechanical interactions in cell walls of gram-positive cocci // J. Bacteriol. 1970. - V. 101. - P. 92-101.

191. Pitt W.G., Ross S.A. Ultrasound increases the rate of bacterial cell growth // Biotechnol Prog. 2003. - V. 19. - N. 3. - P. 1038-1044.

192. Plomp M., Leighton T.J., Wheeler K.E., Malkin A.J. The high-resolution architecture and structural dynamics of Bacillus spores// Biophys. J. 2005. - V. 88. -N. 1.-P. 603-608.

193. Pugsley A. P., Reeves P. Iron uptake in colicin B-resistant mutants of Escherichia coli K-12// J. Bacteriol. 1976. - V. 126. - P. 1052-1062.

194. Rastogy N., David H. Growth and cell division of Mycobacterium avium II J. Gen. Microbiol. 1981. - № 126. - P.77-84.

195. Rayman M. K., MacLeod R. A. Interaction of Mg+ with peptidoglycan and its relation to the prevention of lysis of a marine pseudomonad// J. Bacteriol. 1975. -V. 122.-P. 650-659.

196. Rcisncr Л., Haagcnscn J .Л., Schcmbri М.Л., Zcclincr E.L., Molin S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms// Mol. Microbiol. 2003. - V. 48.-N. 4.-P. 933-46.

197. Reusch R.N., Sadoff H.L. Novel lipid components of the Azotobacter vinelandii cyst membrane// Nature. 1983. - V. 302. - № 5905. - P. 268 - 270.

198. Risco C., Pinto da Silva P. The fracture-flip technique reveals new structural features of the Escherichia coli cell wall// J. Microsc. 1998. - V. 189. - Pt. 3. - P. 213-218.

199. Roberts G.D., Kim Y.K. Mycobacterium // Manual of Clinical Microbiology. -1991.- №5. P.304-339.

200. Schembri M.A., Christiansen G., Kleinm P. FimH-mediated autoaggregation of Escherichia colill Mol. Microbiol. 2001. - V. 41. - N. 6. P. 1419-1430.

201. Seki H., Barber R.T. Interaction of bubbles and bacteria in the formation of organic aggregates in seawater// Nature. 1966. - N. 211. - P. 257-258.

202. Shafikhani S.H., Partovi A.A., Leighton T. Catabolite-induced repression of sporulation in Bacillus subtilis!I Curr. Microbiol. 2003. - V. 47. - N. 4. - P. 300308.у *

203. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns// BioEssays. 1995. - V. 17.-N7.-P. 597-607.

204. Sherlock O., Vejborg R.M., Klemm P. The TibA adhesin/invasin from enterotoxigenic Escherichia coli is self recognizing and induces bacterial aggregation and biofilm formation// Infect. Immun. 2005. - V. 73. - N. 4. - P. 1954-1963.

205. Stewart P.S. Diffusion in biofilms// J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185. - N. 5. - P. 1485-1491.

206. Sutcliffe: I.C. Cell envelope composition and organisation in the genus Rhodococcus// Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. - N. 1-3. - P. 49-58.

207. Sutcliffe I.C. Macroamphiphilic cell envelope components of Rhodococcus equi and closely related bacteria// Vet. Microbiol. 1997. - V. 56. - N. 3-4. - P. 287299.

208. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrastructural features of microbial colony organization// J. Basic. Microbiol. 1990. -V. 30. -N. 8. - P. 597-607.

209. Tomich M., Mohr C.D. Adherence and autoaggregation phenotypes of a Burkholderia cenocepacia cable pilus mutant// FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 228.-N. 2.-P. 287-297.

210. Trais J., Benz R. Porins in the cell wall of mycobacteria // Science. 1992.- №258.-P.1470-1481.

211. Wakano J.Y., Macnosono S., Komoto A., Eiha N., Yamaguchi Y. Self-organized pattern formation of a bacteria colony modeled by a reaction diffusion system and nucleation theory// Phys. Rev. Lett. 2003. - V. 90. - P. 1-25.

212. Wang Y., Ilemmingsen L., Gicdroc D.P. Structural and functional characterization of Mycobacterium tuberculosis CmtR, a Pbll/CdII-sensing SmtB/ArsR metalloregulatory repressor// Biochemistry. 2005. - V. 28. - N. 44(25). - P. 8976-8988.

213. Warth A.D., Strominger J.L. Structure of the peptidoglycan from vegetative cell walls of Bacillus subtilis// Biochemistry. 1971. - V. 10. - N. 24. - P. 4349-4358.

214. Waters C.M., Dunny G.M. Analysis of functional domains of the Enterococcus faecalis pheromone-induced surface protein aggregation substance// J. Bacteriol. -2001.-V. 183.-N. 19.-P. 5659-5667.

215. Watnick P., Kolter R. Biofilm, City of Microbes// J. Bacteriol. 2000. V. 182. - N. 10.-P. 2675-2679.

216. Wayne L.G., Kubica P.G. Mycobacteria// Bergey's Manual of systematic Bacteriology. 1986. - V.2. - P. 1436-1457.

217. Webb, S. J., Thompson, S. J., Charlton, Т., Tolker-Neilsen, Т., Koch, В., Givskov, M., Kjelleberg, S. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 4585-4592.

218. Williams R. J. P. Nature and properties of metal ions of biological interest and their coordination compounds// Fed. Proc. 1961. - V. 20. - Suppl. 2. - P. 5-14.

219. Winans S.C., Bassler B.L. Mob Psychology// J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - N. 4. - P. 873-883.

220. Whittenbury R., Davis S.L., Davey J.F. Exospores and cysts formed by methane-utilizing bacteria // J. Gen. Microbiol., 1970. V. 61. P. 219 226.