Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль системы токсин-антитоксин vapBC в формировании состояния покоя Mycobacterium smegmatis

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль системы токсин-антитоксин vapBC в формировании состояния покоя Mycobacterium smegmatis"

На правах рукописи

ДЕМИДЁНОК Оксана Игоревна

РОЛЬ СИСТЕМЫ ТОКСИН-АНТИТОКСИН vapBC В ФОРМИРОВАНИИ СОСТОЯНИЯ ПОКОЯ MYCOBACTERIUM SMEGMATIS

Специальность 03.01.04 Биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

23 ОКТ 2014

Москва 2014

005553791

005553791

Работа выполнена в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Гончаренко Анна Владимировна

Официальные Игнатов Сергей Георгиевич

оппоненты: доктор биологических наук.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», заведующий лабораторией Остерман Илья Андреевич кандидат химических наук.

Федеральное государственное

образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова", химический факультет, кафедра химии природных соединений, лаборатория химии нуклеопротеидов, научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт

микробиологии им. С.Н. Виноградского» Российской академии наук

Защита состоится «11»декабря 2014 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук; 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологической литературы Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1 и на сайте института www.inbi.ras.ru

Автореферат разослан октября 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф.Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Туберкулёз является одной из самых распространённых причин смерти от инфекционных заболеваний. Недостаточная эффективность лечения туберкулеза зачастую связана с существованием латентной формы инфекции. Развитие латентной стадии заболевания обусловлено способностью возбудителя Mycobacterium tuberculosis (MTB) формировать так называемые покоящиеся (дормантные) формы, которые характеризуются устойчивостью к действию антибактериальных препаратов. Для борьбы с туберкулезом необходимо понимание механизмов перехода его в латентную форму. К настоящему моменту накоплено большое количество данных, описывающих физиологию покоящихся микобактерий, однако механизмы, запускающие переход бактерий в покоящееся состояние и их реактивацию, до настоящего времени не ясны.

Значительный интерес с этой точки зрения представляют системы токсин -антитоксина (ТА), обнаруживаемые в геномах подавляющего большинства архей и бактерий, в особенности у MTB (до 80 пар генов). Все ТА системы функционируют по одному принципу: стабильный токсин блокирует важнейшие клеточные функции, такие как механизмы репликации и трансляции (большинство токсинов являются РНКазами), лабильный антитоксин связывает токсин и тем самым инактивирует его. Столь разнонаправленное действие токсинов предоставляет бактериальной клетке возможность глобальной перестройки метаболизма, что позволяет рассматривать ТА системы в качестве индукторов перехода микобактерий в покоящееся состояние. В качестве объекта исследования был выбран ТА локус vapBC Mycobacterium smegmatis, близкого к MTB микроорганизма и широко используемого в качестве модельного объекта при исследованиях физиологии возбудителя туберкулёзной инфекции.

Целью данного исследования стало изучение роли системы токсин-антитоксин vapBC в формировании покоящегося состояния Mycobacterium smegmatis. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Получить рекомбинантные штаммы М. smegmatis с гиперэкспрессией белков токсина VapC и антитоксина VapB;

2. Получить мутантный штамм М. smegmatis с делецией локуса vapBC;

3. Получить рекомбинантный белок VapC и поликлональную сыворотку к нему;

4. Оценить возможность образования полученными рекомбинантными и мутантными штаммами М. smegmatis покоящихся форм в различных моделях;

5. Оценить возможность реактивации покоящихся форм, образованных полученными рекомбинантными и мутантными штаммами М. smegmatis;

6. Изучить биохимические и микробиологические характеристики покоящихся форм рекомбинантного штамма М. smegmatis с гиперэкспрессией токсина VapC;

7. Оценить уровень экспрессии белка VapC в условиях перехода в покоящееся состояние методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна. В настоящей работе подробно исследована роль генов системы токсин-антитоксин vapBC в формировании дормантного состояния М. smegmatis.

Впервые было продемонстрировано, что гиперэкспрессия токсина VapC в клетках М. smegmatis приводит к изменению клеточной морфологии (образованию овоидных форм), снижению уровня метаболизма и дыхания. Полученные овоидные клетки характеризуются большей устойчивостью к воздействию стрессовых факторов (повышенные температуры и

резистентность к воздействию антибиотика) по сравнению с вегетативными клетками, что позволяет отнести их к покоящимся формам бактерий.

Впервые было показано, что гиперэкспрессия антитоксина VapB в клетках М. smegmatis приводит к потере ими способности переходить в дормантное состояние.

Впервые с помощью модели получения некультивируемых форм и метода ПЦР в реальном времени было установлено, что при переходе клеток М. smegmatis в покоящееся состояние происходит увеличение количества мРНК vapBC локуса.

Таким образом, впервые экспериментально доказано участие системы токсин-антитоксин в образовании покоящегося состояния у бактерий.

Няучнп-пряктичргкяя пряность. Данные, полученные в ходе работы, значительно расширяют представления об особенностях механизмов формирования покоящегося состояния бактерий, и могут быть использованы для разработки принципиально новых антибактериальных препаратов, препятствующих переходу острой туберкулёзной инфекции в хроническую форму, для создания новых вакцинных препаратов на основе живых бактерий с низким потенциалом реактивации, а также для дополнительной аттенуации противотуберкулезной вакцины путем удаления определенных ТА локусов, что сможет предотвратить развитие осложнений, связанных с реактивацией бактерии.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях и симпозиумах: III международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия выживания, биотехнологический потенциал», ICOMID, Пермь, 2008; IV международная конференция молодых ученых «От молекулы до биосферы», Харьков, 2009; IV Европейский конгресс микробиологов (FEMS), Женева, Швейцария, 2011; Международная конференция «Туберкулёз: биология, патогенез, стратегия внедрения», Париж, Франция, 2012; V Европейский конгресс микробиологов (FEMS), Лейпциг, Германия, 2013; Международная конференция Федерации Европейских Биохимических Обществ (FEBS), Париж, Франция, 2014.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, и 7 тезисов в материалах конференций. Получены два патента на изобретения.

Структур я диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 252 ссылки. Работа изложена на 141 листе печатного текста, иллюстрирована 50 рисунками и 7 таблицами.

Сокращения, принятые в тексте. КОЕ - колониеобразующие единицы; OD6oo -оптическая плотность при длине волны 600 нм; НВЧК - наиболее вероятное число клеток; НК - «некультивируемые» клетки; ТА - токсин-антитоксин;

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В обзоре литературы приведены данные о структуре, типах, распространении и функциях систем токсин-антитоксин (ТА) бактерий. Особое внимание уделено ТА системам микобактерий, подробно рассмотрена их роль в процессе формирования стрессового ответа и адаптации к изменению условий окружающей среды.

Материалы и методы.

Объекты исследования. Штаммы и конструкции. В качестве объекта исследования был выбран штамм дикого типа Mycobacterium smegmatis mc2155 (wt), а также полученные

на его основе мутантные и рекомбинантные штаммы (таб. 1,2). Таблица 1. Генетические конструкции, используемые в ходе работы

pMind Кт', Нд', Те1КО Blokpoel etai, 2005

pMind - vapB дериват рМ^, несущий ген уарВ получен в ходе данной работы

pMind - vapC дериват рММ, несущий ген \*арС получен в ходе данной работы

pMind - vapBC дериват рМ^, несущий локус уарВС получен в ходе данной работы

Kmr - устойчивость к канамицину; Hgr - устойчивость к гигромицину;Те1Я0 - промоторная область под регуляцией Tet_

Таблица 2. Штаммы М. smegmatis, полученные в ходе работы

Wt mc2155 дикого muña

wt- pMind штамм шс2155 (и^), с пустой плазмидой рМ^ получен в ходе данной работы

штамм тс2155 (шЦ с получен в ходе данной работы

wt - pMind - vapB плазмидой pMind, несущей ген уарВ штамм тс2155 (уЛ) с

wt - pMind- vapC плазмидой рММ, несущей ген vapC штамм шс2155 (wt) с получен в ходе данной работы

wt - pMind - vapBC плазмидой рММ, несущей локус уарВС получен в ходе данной работы

штамм ДуарВС с делецией получен в ходе данной работы

й vapBC локуса \rapBC

штамм йуарВС с плазмидой, получен в ходе данной работы

AvapBC-pMind-vapB несущей ген vapB

¿vapBC - pMind - vapBC штамм ¿IVарВС с плазмидой, несущей локус уарВС получен в ходе данной работы

Штамм М. smegmatis дикого типа mcz155, а также штаммы, полученные при трансформации плазмидой pMind и делеции локуса vapBC, стандартно поддерживали на чашках Петри с твердой агаризованной средой (1.5% агара] NB (Nutrient Broth, HiMedia Laboratories, India). Для поддержания плазмиды в клетках использовались растворы антибиотиков: канамицина (Km) и гигромицина (Hg) в концентрациях 50 мкг/мл.

Клонирование. Выделение ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью набора DNA Purification systems («Promega», США). Для этой цели использовали суточную культуру £ coli (объёмом 4 мл), выращенную на среде Nutrient Broth ("Himedia", Индия). Выделение плазмиды проводили в соответствии с протоколом DNA Purification systems («Promega», США). Качество и количество выделенной плазмиды проверяли при помощи электрофореза в агарозном геле.

Клонирование a pGF.M-T flUP-прпдуктов. Клонирование проводили с использованием штамма Е- coli TGI. Амплификацию локуса vapBC M. smegmatis осуществляли с использованием праймеров 5'GGfiGATCCTGAAGGCGATCTATCAAGGTCGTATAG3' и

УГ.П ACTA GTCCGACACGGCGTGGTGATCTGATC3'. (сайты рестрикции BamHI и Spei подчеркнуты). ПЦР-продукты клонировали в вектор pGEM-T (Promega), затем подвергали расщеплению по сайтам BamHI и Spei, далее лигировали в вектор pMind, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Правильность клонированных нуклеотидных последовательностей подтверждали секвенированием.

Аналогичным образом осуществляли клонирование гена vapC в вектор pMind , для амлификации использовали npafiMepbiS'GGGGATCCGGAGGAATAATGGTTATCGACACTTCTGC 3' [Robson et al., 2009] и -VGCTGCAGCGCGGCGTTGGGGTTGGACTGACC3' (сайты рестрикции BamHI и Spei подчёркнуты).

Вектор pMind с клонированном геном vapB был получен следующим образом: ПЦР-продукт локуса vapBC первоначально клонировали в вектор pGEM-T (Promega), Гидролизовали по сайтам BsaBI, затем лигировали (удаляли большую часть vapC гена), подвергали расщеплению по сайтам BamHI и Pstl, после чего лигировали в вектор pMind, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Правильность клонированных нуклеотидных последовательностей подтверждали секвенированием.

Для получения рекомбинантного белка VapC ген vapC был амплифицирован с использованием праймеров 5' GTCCATATGGTTATCGACAC1TCTGCCCTC 3' и 5' GGATCCTGACCTCGTTCAGTGGACC З'(сайты рестрикции Ndel и BamHI подчёркнуты). Очищенный ПЦР продукт был обработан рестриктазами Ndel и BamHI, лигирован в рЕТ19Ь и трансформирован в клетки Exoli ВМН. Конструкция, содержащая правильную последовательность гена vapC была отоброна секвенированием и трансформирована в £ coli BL21DE3.

Получение покоящихся форм M. smegmatis. Для получения покоящихся «некультивируемых» (НК) форм М. smegmatis 30 - часовую культуру М. smegmatis me2155 и полученные на его основе рекомбинантные штаммы инокулировали в колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл модифицированной среды Hartmans-de Bont (HdB). Для получения НК клеток к модифицированной среде HdB добавляли стерильный раствор БСА (Cohn Analog) («Sigma», США) до конечной концентрации 0,5%. При выращивании штаммов, трансформированных плазмидой, к среде добавляли канамицин (Km) или гигромицин (Hg) в концентрации 50 мкг/мл.

Для получения покоящихся культивируемых овоидных форм клетки суточных культур М. smegmatis me2155 и полученных на его основе рекомбинантных штаммов инокулировали в колбы объемом 150 мл, содержащие по 50 мл среды Nutrient Broth ("Himedia", Индия) и 0.05 % Твина-80, и инкубировали при 37°С на орбитальной качалке (200 об/мин) в течение 72 часов. Далее клетки осаждали центрифугированием (4000 об/мин, 20 мин), супернатант пропускали через стерильный 0.2 мкм фильтр («Corning»). В отфильтрованный супернатант вносили суточные культуры M. smegmatis me2155 и полученные на его основе рекомбинантные штаммы, выращенные на среде Nutrient Broth ("Himedia", Индия) с 0.05%

Твина-80 (соотношение свежей культуры и фильтрата - 1:25). Колбы инкубировали на орбитальной качалке (37°С, 200 об/мин) в течение 120 часов, после чего они хранились при комнатной температуре без перемешивания до 1,5 месяцев.

Реактивация «некультивируемых» клеток. Для оценки числа реактивировавших клеток использовали метод конечных разведений (MKPJ, заключающийся в приготовлении серии последовательных 10-кратных разведений в свежей питательной среде с разбавлением бактериальной суспензии до концентрации 1 клетка в мл. Процедуру реактивации проводили в 48-луночном пластиковый планшете ("Corning", США), каждая лунка которого содержала 0,9 мл синтетической среды Sauton с добавлением 0,05% дрожжевого экстракта и белка RpfSm (5 нг/мл). Полученный раствор был доведен до pH 7,0 с помощью NaOH. Лунки содержали также по 0,1 мл соответствующих серийных разведений клеток. Каждое разведение было представлено в 3-х повторностях. Плашки инкубировали в течение 6-10 суток при 370 С на орбитальной качалке (120 об/мин).

Также процедуру реактивации проводили в колбах объёмом 100 мл, содержащих 50 мл синтетической среды Sauton с 0,05% дрожжевого экстракта. Колбы инкубировали в течение 6 суток при 37°С на орбитальной качалке (120 об/мин).

При подсчете наиболее вероятного числа (НВЧ) реактивированных клеток учитывали лунки с видимым бактериальным ростом. Значение вероятного количества реактивируемых клеток в 1 мл определяли по стандартным статистическим таблицам [de Man, 1975].

Включение радиоактивной метки. Уровень синтеза РНК и ДНК в клетках определяли по включению меченного по водороду урацила. К 1 мл суспензии клеток добавляли 1 мкл [5,6 3Н] урацила (в виде растворов с радиоактивностью метки 40 Мбк/мл в 50% этаноле) и инкубировали в течение 4 часов при 37°С при постоянном перемешивании. Далее 0.2 мл полученного образца переносили в 15 мл ТХУ (20 мин., 0°С). Затем клетки, после нанесения на стеклянный фильтр GFC («Whatman»), отмывали 3 объёмами 10% ТХУ и 96% этанола. После высушивания фильтры помещали в сцинтилляционную жидкость (10мл). Уровень радиоактивности измеряли на счётчике LS6500 «Beckman Coulter» (USA).

Определение дыхательной активности. Дыхательную активность клеток измеряли по скорости поглощения ими кислорода в термостатируемой полярографической ячейке (рабочий объём 1 мл) с закрытым кислородным электродом типа Кларка. Реакционная смесь содержала 50мМ фосфатный буфер pH 7,0 и клеточный компонент. Исследуемый материал вносили в объёме 1 мл. Температура измерения 25°С.

Изучение чувствительности клеток к действию стрессовых факторов. Термоустойчивость клеток определяли по соотношению КОЕ после прогревания 1-мл аликвот культур в диапазоне температур от 60°С до 80°С в течение 10 минут. Долю устойчивых к антибиотику клеток определяли по соотношению КОЕ после 24 - часовой инкубации клеток в присутствие различных концентраций антибиотика рифампицина (25, 50 и 100 мкг/мл). Перед высевом обработанные клетки отмывали 50мМ фосфатным буфером (pH 7,0) Для определения числа КОЕ клетки высевали на чашки Петри с твёрдой питательной средой (1,5% агара).

Основный результаты исследования и их обсуждение.

1. Образование покоящихся форм рекомбинантным штаммом М. smegmatis wt -pMind - vapC с гиперэкспрессией токсина VapC.

Для подтверждения гипотезы об участии токсина VapC в процессе перехода микобактерий в покоящееся состояние, был получен штамм wt - pMind - vapC,

осуществляющий гиперэкспрессию токсина VapC в клетках. Для подтверждения экспрессии гена токсина vapC в клетках M.smegmatis был проведён ПЦР в реальном времени (RT - PCR], Согласно результатам RT - PCR в клетках штамма wt - pMind - vapC М. smegmatis происходило повышение уровня экспрессии гена vapC по сравнению с клетками контрольного штамма wt - pMind как в условиях индукции промотора, так и без неё. При добавлении индуцирующих концентраций Tet (20 нг/мл) к суспензии клеток штамма wt -pMind - vapC, уровень мРНК vapC возрастал более чем в 600 раз по сравнению с контрольным штаммом. Некоторое повышение уровня транскрипции vapC в условиях отсутствия индуктора объясняется «текучестью» Tet промотора плазмиды pMind.

Было показано, что после индукции Tet экспрессии токсина vapC в клетках М. smegmatis рост культуры рекомбинантного штамма wt - pMind - vapC останавливался, о чём свидетельствовали изменения значения оптической плотности исследуемой культуры (рис. 1) и числа КОЕ при высеве культуры на чашки Петри с питательной средой.

2-

-1 I 1-1 I-1-1-1-1-1-1

0 10 20 30 40 50

время культивирования, ч

Рис. 1. Изменение оптической плотности культур клеток wt - pMind и wt -

pMind - vapC (-*—) после добавления индуктора (Tet). Клетки штаммов wt - pMind uwt-pMind - vapC культивировали в течение 6 часов на среде NB, затем вносили 20 нг Tet. Эксперимент проводили 5 раз. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Также было обнаружено, что экспрессия токсина VapC приводит к образованию морфологически измененных овоидных клеток М. smegmatis (рис. 2]. Количество измененных клеток в культуре варьировало от 20% до 90%. Изменения происходили в течение 120 часов; далее, если клетки оставляли при комнатной температуре неподвижными, они сохраняли измененную морфологию в течение месяца наблюдений.

добавление —■—wt - pMind

индуктора (Tet) —•—wt - pMind - vapC

а) клетки штамма нЧ - рМшс! - уарС б) клетки штамма яЛ- рМпн! - уарС до индукции токсина УарС после индукции токсина УарС

в) клетки штамма wt - pMind - vapC после индукции токсина VapC (окраска по PI)

Рис. 2. Световая и флуоресцентная микроскопия образования морфологически дифференцированных овоидных форм рекомбинантного штамма wt - pMind - vapC М. smegmatis. (а) - клетки 6 - часовой культуры wt - pMind - vapC до внесения индуктора (Tet) токсина VapC; (б) - клетки wt - pMind - vapC М. smegmatis через 120 часов после внесения индуктора Tet. При окраске культуры овоидных форм по PI (в) 80 % - 90 % клеток не прокрашивалось, что указывало на целостность их мембраны.

Важно отметить, что полученные овоидные формы сохраняли способность к восстановлению роста на твёрдых питательных средах, таким образом, демонстрируя обратимость действия токсина VapC, что соответствует нашему представлению о роли токсина при переходе клеток в состояние покоя. Ранее в нашей лаборатории было показано, что подобные формы образуются при переходе клеток М. smegmatis и МТБ в покоящееся состояние [Anuchin et al., 2009; Shleeva et al., 2011]. Такие же формы наблюдались в гистологических образцах тканей, пораженных туберкулезом [Khomenko and Golyshevskaya, 1984]. Образование клеток с изменённой морфологией, так называемых «лимоноподобных» форм, было также зафиксировано при гиперэкспрессии токсинов YeeV [Tan et al., 2011] и CptA (YgfX) [Masuda et al, 2012] в клетках E coli. Однако жизнеспособность и метаболическая активность этих клеток не была изучена. Существуют данные о том, что изменение размеров клеток является одной из универсальных реакций микроорганизмов на неблагоприятные условия [Klieneberg-Nobel, 1951; Holmquist and Kjelleberg, 1933]. Можно предположить, что «округлая» форма покоящихся бактерий имеет физиологический смысл, поскольку приводит к уменьшению соотношения площади поверхности к объему, что, вероятно, более выгодно с энергетической точки зрения.

2. Биохимические свойства овоидных форм рекомбинантного штамма wt - pMind -

vapCM. smegmatis.

Для оценки уровня метаболической активности овоидных форм, полученных при индукции токсина VapC (рис. 2), в клетки был введён радиоактивный предшественник нуклеиновых кислот - [5,6 3Н] урацил. Было показано, что по сравнению с логарифмическими и стационарными клетками, метаболическая активность которых находилась на довольно высоком уровне, овоидные формы штамма wt - pMind - vapC характеризовались низким уровнем включения радиоактивного предшественника, что свидетельствовало о снижении уровня транскрипции в клетках (рис.3).

Рис. 3. Включение меченного [5,6 3Н] урацила клетками М. зтедтаНз различного физиологического состояния. 1 - логарифмические клетки штамма wt - рММ М.зтедтаиз; 2 - стационарные клетки штамма wt-pMind М. зтедтайБ; 3 ~ овоидные клетки штамма - рМтй - марС М. БтедтаЫз с гиперэкспрессией токсина УарС под индукцией Те1 Включение меченного [5,6 3Н]урацила проводили, как описано в «Материалах и методах» п. 13. Эксперимент проводили 5 раз. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Уровень дыхательной активности клеток штаммов иЛ: - рМтс! и - рМтс! - гарС М. зтедтаЫз определяли полярографически с использованием электрода типа Кларка. Согласно полученным экспериментальным данным, овоидные клетки штамма уЛ - рМш(1 -уарС не демонстрировали дыхательной активности (рис. 4), о чём свидетельствовало отсутствие изменения концентрации кислорода. В то же время, логарифмические и стационарные клетки контрольного штамма - рМшс1 характеризовались высокой дыхательной активностью, что выражалось в уменьшении концентрации кислорода в среде.

Овоидные формы, образованные в результате индукции токсина УарС обладали повышенной устойчивостью к действию высоких температур в диапазоне 60 - 80°С по сравнению с вегетативными клетками стационарной фазы. Так, при прогревании суспензий клеток при 70°С в течение 10 минут доля неповрежденных овоидных клеток была на 2 порядка больше, чем вегетативных клеток (рис. 5). Также овоидные клетки продемонстрировали большую устойчивость к воздействию антибиотика рифампицина: при воздействии 100 мкг/мл антибиотика на стационарные клетки штамма - рМтс! М^тедтаНя в течение 24 ч количество выживших клеток падало на 4 порядка, тогда как количество овоидных форм штамма иш - рМш<1 - чарС оставалось практически неизменным (рис. 6].

250-

-1 0123456789 время, мин

Рис. 4. Измерение дыхательной активности клеток М. втедтаНь различных физиологических состояний в полярографической ячейке. (—) логарифмические клетки штамма и/С - рМтс!;(—) - стационарные клетки штамма - рМт<1; {—) - овоидные клетки штамма wt - рМтс! - марС с гиперэкспрессией токсина УарС под индукцией Те1. Клетки в объёме 1 мл вносили в термостатируемую полярографическую ячейку и измеряли дыхательную активность клеток в течение 8 минут. Эксперимент был проведён в 5-ти повторностях. На рисунке представлен типичный результат.

60 70 80

температура, °С

Рис. 5. Устойчивость стационарных клеток штамма - рМтд (серые колонки) и овоидных форм - рМтс1 - марС (белые колонки)М. БтедтаИэ к воздействию высоких температур. Суспензии 48-часовых клеток \vt-pMind и - рМт<1 - уарС прогревали в течение 10 минут при 60-80°С. Число КОЕ определяли как среднее из результатов подсчета, сделанного в 3-х повторностях. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

I I wt - pMind I I wt - pMind - vapC

i_ri

4-

f

f

ч , ■ ! 10 1

ы

_L

10

20

50

100

концентрация антибиотика мкг/мл

Рис.6. Устойчивость стационарных клеток штамма wt - pMind (серые колонки) и овоидных форм wt - pMind - vapC (белые колонки)М. smegmatis к воздействию различных концентраций антибиотика рифампицина. Клетки 48-часовых культур wt -pMind и wt- pMind - vapC инкубировали в присутствии антибиотика рифампицина в течение 24 часов. Затем клетки отмывали 50мМ фосфатным буфером и высевали на чашки Петри. Число КОЕ определяли как среднее из результатов подсчета, сделанного в 3-х повторностях. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Таким образом, обнаружено, что гиперэкспрессия токсина VapC приводит к переходу клеток в покоящееся состояние с характерным изменением клеточной морфологии, снижением уровня метаболической активности и дыхания, а также вызывает повышение их устойчивости к таким неблагоприятным внешним факторам как антибиотики и повышенная температура.

3. Изменение уровня экспрессии локуса vapBC при переходе клеток М. smegmatis штамма дикого типа в покоящееся состояние.

Ранее в нашей лаборатории была разработана модель получения покоящихся «некультивируемых» (НК) форм в условиях лимитированной по источнику К* среды Harmons-de Bont (HdB) [Shleeva et al., 2004]. В данной модели при культивировании на модифицированной среде HdB клетки М. smegmatis переходили в состояние покоя с низким уровнем метаболизма и потерей способности культивирования на твердых питательных средах. Однако при проведении реактивирующих процедур [Shleeva et al„ 2004] бактериальные клетки частично восстанавливали способность к культивированию.

В рамках указанной модели vapBC локус был исследован на предмет изменения уровня экспрессии методом RT-PCR (рис. 7). Было обнаружено, что у стационарных (30-часовых) клеток транскрипция vapBC локуса находится на низком уровне, тогда как для клеток, находящихся в процессе перехода из активного в дормантное состояние, было характерно более чем 20-ти кратное увеличение количества мРНК локуса vapBC. У

дормантных клеток транскрипция мРНК локуса vapBC была ниже в 6 раз, чем у стационарных и в 118 раз ниже, чем у клеток, переходящих в покоящееся состояние.

* 200-, О Е-0)

5

о

> 150 -

о

гн

X g-

100-

а. £

ч

bs активные переходные дормантные

Рис. 7. Изменение уровня транскрипции локуса vapBC в клетках M. smegmatis штамма дикого типа при переходе в покоящееся некультивируемое состояние. Каждая точка представляет собой среднее из результатов 5-ти экспериментов по 3 технических повтора каждый. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение значений. Статистическая значимость изменения экспрессии локуса vapBC в клетках различных физиологических состояний была проверена по критерию Ньюмена-Кейла (*, р<0,01). Переход клеток в покоящееся состояние оценивался путём подсчёта КОЕ.

Иммуноблоттинг с использованием антисыворотки к белку VapC позволил детектировать продукцию токсина VapC в клетках штамма wt - pMind - vapC. Однако в клетках М. smegmatis дикого типа при переходе в дормантное состояние в условиях модели получения покоящихся «некультивируемых» форм [Shleeva étal., 2004] обнаружить белок VapC не удалось, несмотря на то, что RT-PCR показал 20-кратное увеличение мРНК vapBC локуса в клетках, переходящих в состояние покоя (рис.7]. Видимо, это связано с относительно низким количеством VapC белка. Подтверждением этому может служить тот факт, что детектируемое иммуноферментным методом количество белка VapC, продуцируемое штаммом М. smegmatis wt - pMind - vapC, соответствовало значительно большему количеству транскрипта (в 180 раз] по сравнению с уровнем мРНК локуса vapBC у переходящих в состояние покоя клеток штамма дикого типа.

4. Гиперэкспрессия антитоксина VapB препятствует образованию покоящегося

состояния клетками М. smegmatis.

Согласно гипотезе об участии ТА локуса в формировании состояния покоя действие токсина является пусковым механизмом образования покоящихся форм у микобактерий. Следовательно, инактивация токсина должна привести к потере бактериальными клетками способности переходить в дормантное состояние. Ингибировать токсин можно несколькими способами, один из которых - инактивация токсина избытком родственного

белка антитоксина. Для проверки данного предположения был получен штамм wt - pMind -vapB М. smegmatis, осуществляющий гиперэкспрессию антитоксина VapB.

Для подтверждения факта экспрессии гена токсина vapB в клетках M.smegmatis был проведён RT - PCR, согласно результатам которого в клетках штамма wt - pMind - vapB М. smegmatis экспрессия гена vapB по сравнению с клетками контрольного штамма wt -pMind возрастала в 27 раз, а при добавлении индуктора Tet (20 нг/мл) количество мРНК vapB возрастало в 63 раза.

Культивирование штаммов в модифицированной среде HdB в рамках модели получения покоящихся НК форм показало, что клетки штамма wt - pMind - vapB теряют способность образовывать покоящиеся формы. На протяжении эксперимента (более 120 часов) количество КОЕ штамма с гиперэкспрессией антитоксина VapB оставалось практически на одном уровне, в то время как штамм дикого типа к 72 часам роста продемонстрировал полную потерю «культивируемости» (рис.8).

—■—wt - pMind

время культивирования, ч

Рис. 8. Динамика роста и образования НК форм контрольным wt - pMind ( " ) и рекомбинантнъш wt - pMind - vapB ( штаммами М. smegmatis. В течение 120 часов культивирования количество КОЕ штамма wt - pMind - vapB оставалось на уровне 10е - 109 клеток в то время как число КОЕ wt - pMind после 72 часов культивирования падало до нуля. Число КОЕ определяли как среднее из результатов подсчета, сделанного в 5-ти повторностях. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Помимо модели получения покоящихся «некультивируемых» (НК) форм М. smegmatis в условиях лимитированной по источнику калия среды HdB [Shleeva et. al., 2004], в данном исследовании использовалась ещё одна модель для тестирования способности клеток переходить в покоящееся состояние [Anuchin et al., 2010]. Согласно этой модели, в результате переноса клеток экспоненциальной культуры М. smegmatis (16-18 часов) в супернатант стационарной (48 - 52 часовой) культуры происходит образование морфологически дифференцированных (овоидных) форм, которые отвечают всем критерия

покоя. Следует отметить, что покоящиеся клетки, получаемые в условиях указанной модели, морфологически совпадали с описанными выше овоидными формами, которые образовывались при экспрессии токсина УарС (рис. 2).

При культивировании клеток штамма иЛ- рМшс! - гарВ М. зтедтаЫБ в условиях описанной выше модели было обнаружено, что клетки - рМтс! - \rapB теряли способность образовывать характерные для данной модели покоящиеся овоидные формы (рис. 9].

т-1-1-•-1-'-1-1-г

1 2 3 4 5

время культивирования, дни

Рис.9. Образование покоящихся культивируемых овоидных форм клетками рекомбинантных штаммов wt - pMind М. smegmatis ( и wt - pMind - vapB

Логарифмические клетки штаммов wt - pMind и wt - pMind - vapB инокулировали в супернатант стационарной культуры М. smegmatis и культивировали в течение 5 дней. Эксперимент повторяли 5 раз. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

В то же время клетки контрольного штамма wt - pMind сохраняли способность переходить в дормантное состояние, что подтверждалось образованием клетками штамма дикого типа овоидных форм на протяжении всего времени культивирования.

Очевидно, что эффект антитоксина VapB связан с нарушением баланса между антитоксином и токсином, поскольку гиперэкспрессия всего локуса не влияет на способность клеток переходить в покоящееся состояние. Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными работами, посвященными изучению эффектов токсинов на клетки £ coli [Gotfredsen and Gerdes, 1998], M. smegmatis [Robson et al., 2009] и MTB [Sharp et al., 2012], которые устранялись ко-экспрессией родственного антитоксина. Таким образом, инактивация токсина избытком антитоксина приводит к потере клетками способности переходить в дормантное состояние, что указывает на существенную роль VapC в формировании дормантности микобактериями.

5. Клетки М. smegmatis с делецией локуса vapBC теряю'г жизнеспособность при культивировании на модифицированной среде HdB.

Помимо ингибирования токсина избытком антитрксина, -возможен альтернативный вариант инактивации токсина путём удаления (делеции] всего локуса vapBC, кодирующего синтез родственных белков VapC и VapB. Для проверки данного предположения был получен штамм с делецией локуса vapBC - AvapBC. Помимо штамма с делецией локуса, в исследовании использовались три других независимо полученных штамма AvapBC/Z, AvapB/Z [Victor Arcus, Новая Зеландия) и AvapBC/A (Bavish Капа, ЮАР]. В штамме AvapB/Z делетирован только ген антитоксина vapB, штаммы AvapBC/Z и AvapBC/А аналогичны полученному нами делеционному штамму AvapBC. Сравнение штаммов из разных источников было необходимо в силу разных методов их получения, с которыми могут быть связаны случайные повреждения других генов.

При исследовании AvapBC на способность к образованию «некультивируемых» (НК) форм оказалось, что клетки делеционного штамма теряли способность к «культивируемое™» после 63 - 64 часов роста на среде HdB, лимитированной по калию, т.е. на 5-6 часов раньше, чем клетки штамма дикого типа (рис.10).

время культивирования, ч

Рис. 10. Динамика роста и образования «некультивируемых» (НК) форм клетками мутантного ДуарВС ( * ) и контрольного и^ - рМЫ<1 ( ' ) штаммов М. зтедтаИэ на модифицированной среде Н<1В. Клетки делеционного мутанта AvapBC теряли способность к «культивируемости» на модифицированной среде НбВ на 5 - 6 часов раньше по сравнению с клетками контрольного штамма - рМ1пс1. Число КОЕ определяли как среднее из результатов подсчета, сделанного в 5-ти повторностях. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Аналогичные результаты были получены при изучении динамики роста и образования НК форм штаммов AvapBC/Z, AvapB/Z и AvapBC/А, полученных в зарубежных лабораториях. Потеря культивируемости делеционными мутантами, как и в случае со

штаммом ДvapBC, происходила через 63-64 часа после засева на модифицированную среду HdB. Сходство фенотипа штамма AvapB/1 с делетированным геном антитоксина vapB с фенотипом штаммов, лишенных всего локуса vapBC, можно объяснить тем, что vapBC локус локализован в опероне, где ген антитоксина находится перед геном токсина и частично с ним перекрывается: стоп - кодон TGA гена антитоксина перекрывается на один нуклеотид со старт - кодоном АТС токсина в ATGA последовательности [Pullinger and Lax, 1992]. Вероятно, при удалении гена антитоксина нарушилась структура всего оперона, и мутантный штамм AvapB/Z являлся фактически AvapBC мутантом и, соответственно, имел тот же фенотип, что и штаммы, лишённые локуса vapBC.

6. Клетки М. smegmatls с делецией локуса vapBC теряют способность к реактивации.

Процесс реактивации клеток М. smegmatis можно осуществить двумя способами:

1) провести реактивацию в колбах, содержащих синтетическую среду Sauton для реактивации с добавлением 0,05% дрожжевого экстракта;

2) провести реактивацию в 48-луночном пластиковом планшете засевая клетки методом предельных разведений в синтетической среды Sauton с добавлением 0,05% дрожжевого экстракта и в присутствии белка RpfSm [Resuscitation promoting factor).

При попытке реактивировать в колбах «некультивируемые» (НК) формы, образованные делеционным штаммом AvapBC, было показано, НК клетки AvapBC не были способны к восстановлению метаболической активности (рис. 11). Низкий уровень включения радиоактивного предшественника нуклеиновых кислот, а также отсутствие роста на чашках Петри на протяжении всего времени реактивации (6 суток) указывало на неспособность клеток штамма AvapBC к возобновлению метаболической активности и росту, что говорит о нежизнеспособности культуры. В то же время накопление [5,6 3Н] урацила клетками контрольного штамма wt - pMind детектировалось через 10 часов после инокулирования культуры в среду для реактивации, что свидетельствовало о постепенном восстановлении метаболических процессов. Переход клеток штамма wt - pMind в активную фазу роста был отмечен после 30 часов культивирования.

мл - рМтс!

\vapBC

10 -

10'-:

10',

изменение числа КОЕ

включение меченного [5,6 3Н] урацила

-1

20

т 40

~г 50

время культивирования, ч

время культивирования, ч

Рис. 11. Реактивация НК форм штаммов Ш - рМт(1 и ЛуарВС М. ¡тедтаИз. Клетки штаммов •мЬ - рМШ и АуарВС инокулировали в колбы объёмом 100 мл, содержащие 50 мл среды 5аиШ с 0,05% дрожжевого экстракта. Клетки инкубировали в течение 6 суток при 37°С на орбитальной качалке (120 об/мин) Клетки штамма - рМ1пс! демонстрировали способность к реактивации, на что указывало постепенное увеличение уровня включения радиоактивного предшественника нуклеиновых кислот и увеличение числа КОЕ. В то же время клетки АмарВС оказались не способными к восстановлению метаболической активности и роста. Число КОЕ и СРМ определяли как среднее из результатов подсчета, сделанного в 5-ти повторностях. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Аналогичные результаты были получены при попытке реактивировать клетки в 48-луночном пластиковом планшете в присутствие различных концентраций стимулирующего фактора ИрВш. В отличие от контрольного штамма Ш - рМтс},, НК формы ЬмарВС не были способны к восстановлению процессов деления и роста в присутствии Е^Бт.

Следовательно, несмотря на то, что клетки штаммов \лЛ - рМт<1 и А\/арВС были способны формировать «некультивируемое» (НК) состояние в модели получения НК форм, клетки делеционного мутанта, в отличие от культуры штамма дикого типа, необратимо теряли способность к культивированию после 64 часов инкубации на модифицированной среде МВ, о чём свидетельствовало накопление Р1 в процессе реактивации культуры на среде Баийт (рис. 12).

б

Рис. 12. Световая и флуоресцентная микроскопия «некулътивируемых» форм штамма АуарВС М. хтедта^'х после 50 часов реактивации, (а) - клетки 50 - часовой культуры AvapBC/ (б) - клетки 50 - часовой культуры АчарВС, окрашенные по Р1. 80 % - 90 % клеток прокрашивалось, что указывало на гибель клеточной популяции.

7. Клетки М. $тедтаИ$ с делецией локуса уарВС не теряют способности

формировать овоидные формы. При культивировании делеционного штамма ДмарВС в условиях модели получения покоящихся морфологически дифференцированных форм клетки также оказались способными формировать овоидные формы (рис. 13). Стоит отметить, что образование овоидных форм в случае делецинного мутанта Д\/арВС происходило интенсивнее по сравнению с контрольным штаммом - рМтс!, и уже к 96 часам (по истечении 4-х суток культивирования) процентное содержание овоидных форм, образованных мутантным штаммом ДуарВС, достигало практически 100%. Однако эксперименты по определению интактности клеточной стенки показали, что большая часть овоидных клеток ДгарВС (около 80%) окрашивалась пропидиумом йодида, что указывало на гибель большей части клеточной популяции.

—•— - рМтс! —•— А уарВС

-I->-1-'-1-■-1---г

12 3 4 5

время культивирования, сутки

Рис. 13. Образование покоящихся культивируемых морфологически дифференцированных форм клетками рекомбинантного штамма - рМ/пс! М. ьтедтаиа ( ■ ) и делеционного штамма \vapBC (—*—). Образование овоидных форм клетками штамма АуарВС происходит быстрее по сравнению с клетками штамма wt -рМтд. Окраска овоидных клеток делеционного штамма по Р1 показала, что 80% овоидных форм оказались Р1 - положительными. Эксперимент повторяли 5 раз. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения. Масштаб -6 мкм.

Аналогичные результаты были получены при культивировании делеционных штаммов АчарВС/%, А\/арВС/А и ЬиарВ/Х в условиях модели получения покоящихся овоидных форм. Образование и накопление в среде культивирования овоидных форм указанными штаммами происходило быстрее по сравнению с контрольным штаммом - рМтс!.

8. Гиперэкспрессия антитоксина УарВ препятствует переходу клеток делеционного штамма АуарВС в покоящееся состояние.

Формирование некультивируемых и покоящихся овоидных форм клетками делеционного мутанта АуарВС на используемых моделях позволило предположить участие другого/других токсинов на процесс формирования состояния покоя помимо изучаемого белка УарС. Для проверки данного предположения был получен штамм AvapBC - рМт<1 -\/арВ, осуществляющий гиперэкспрессию антитоксина УарВ на фоне делеции локуса АчарВС. Для получения указанного рекомбинантного штамма клетки делеционного мутанта А\/арВС были трансформированы плазмидой рМтс! с клонированным геном \iapB. Кроме того, плазмида рМтс!^арВ была введена в предоставленный нам штамм с делецией локуса \rapBC \apBjZ.

Исследование динамики роста AvapBC - рМтс! - vapB и АуарВС/2 - рМтс! - \/арВ на модели получения покоящихся некультивируемых форм показало, что бактериальные клетки делеционных штаммов, осуществляющих гиперэкспрессию белка антитоксина УарВ, теряли способность к образованию покоящихся НК форм на протяжении всего времени культивирования, также как и контрольный штамм уЛ - рМтс! - \/арВ (рис.14). Делеционный мутант ЛуарВС в то же время сохранял способность образовывать НК состояние.

о а

10%

10% ----—I : ""—я г f

10% г , ■ AvapBC

10% ▼ wt - pMind - vapB

—*— AvapB/Z - pMnd - vapB

10% * AvapBC- pMind - vapB

10%

10%

10%

10%

10°- -1-1-1-1-1-1-1-1-г- I.......*..

20 30 40 50 60 70 80 90 100 время культивирования, ч Рис. 14. Динамика роста и образования НК форм штаммами AvapBC (—« vapB ( ▼ ), AvapBC - pMind - vapB[ ), AvapB/Z - pMind - vapB ( -*-

-), wt - pMind -") M. smegmatis.

Клетки штаммов с гиперэкспрессией антитоксина на фоне делеции локуса vapBC, также как и штамм с гиперэкспрессией белка УарВ на фоне интактной хромосомы, теряли способность переходить в покоящееся НК состояние в отличие от контрольного делеционного штамма AvapBC. Число КОЕ определяли как среднее из результатов подсчета, сделанного в 3-х-повторностях для рекомбинантных штамма А\/арВ/2 - рММ - \арВ и в 7 - ми повторностях для штаммов А\/арВС - рММ - vapB и - рМтй - vapB. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

При культивировании клеток штамма А\/арВС - pMind - марВ с гиперэкспрессией антитоксина в условиях модели получения покоящихся овоидных форм также наблюдалась потеря клетками способности формировать дормантное состояние в отличие от контрольного штамма с делецией локуса А\/арВС (рис. 15).

- ¿1 vapBC

- Л vapBC-pMind - vapB

20-

—I-.-1-.-1-1-1-1-1-1

Ь 1 2 3 4 5

С

время культивирования, дни Рис. 15. Образование покоящихся овоидных форм клетками контрольного мутантного штамма AvapBC ( —*—) и делеционного мутанта AvapBC - pMind - vapB( -*-) с гиперэкспрессией антитоксина VapB. Клетки штамма с гиперэкспрессией антитоксина VapB на фоне делеции локуса vapBC теряли способность формировать овоидные формы в отличие от клеток делеционного мутанта AvapBC. На графике приведены кривые роста для одного рекомбинантного штамма AvapBC - pMind - vapB. Характер роста рекомбинантного штамма AvapBC/Z - pMind - vapB был таким же. как и AvapBC - pMind -vapB. Эксперимент повторяли 3 раза. На рисунке представлен типичный результат. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Предположительно, полученные результаты объясняются действием других токсинов, помимо VapC. Действительно, в хромосоме M. smegmatis, кроме локуса vapBC, располагаются ещё два ТА локуса, принадлежащих к семействам mazEF и phd/doc [Robson et al. 2009; Pandey and Gerdes 2005]. Косвенным подтверждением данного предположения может являться тот факт, что при гиперэкспрессии антитоксина VapB на фоне делеции локуса (штамм AvapBC - pMind - vapB) наблюдалась потеря способности клетками указанного штамма формировать покоящееся «некультивируемое» состояние (рис. 14), а также образовывать покоящиеся овоидные формы (рис. 15). Такой результат можно объяснить тем, что антитоксин VapB взаимодействует не только с родственным токсином VapC, но и с «чужим» токсином MazF. Действительно, было продемонстрировано, что гиперэкспрессия токсина MazF приводит к гибели клеточной популяции £. coli [Engelberg-Kulka et al., 2005] и M. smegmatis [Frampton et al., 2012]. Более того, было показано, что рекомбинантный белок VapB Е coli связывался с рекомбинантным белком MazF in vitro [Zhu et al., 2010].

Учитывая это, а также принимая во внимание генетическую организацию локуса vapBC и тот факт, что антитоксин является легко деградируемым белком, можно предположить, что антитоксин VapB в клетке синтезируется в большем количестве, чем токсин VapC и, следовательно, его должно быть достаточно для нейтрализации действия,

как родственного токсина, так и токсинов других семейств. Вероятно, именно поэтому отсутствие антитоксина VapB у штаммов с делецией ТА локуса vapBC является причиной более раннего образования «некультивируемого» состояния по сравнению с контрольным штаммом wt - pMind. Вполне вероятно, что по той же причине клетки мутантного штамма не способны к реактивации. По-видимому, в нормальном состоянии количества антитоксина VapB в клетке должно быть достаточно для нейтрализации действия родственного токсина VapC, а также полной или частичной нейтрализации MazF токсина. В то же время при удалении локуса нарушается равновесие этой системы, что приводит к накоплению избыточного количества MazF и гибели клеток в условиях моделей перехода в покоящееся состояние.

ВЫВОДЫ

1. Гиперэкспрессия гена, кодирующего синтез токсина VapC в клетках Mycobacterium smegmatis, приводит к образованию овоидных покоящихся форм, характеризующихся сниженным уровнем метаболической активности, дыхания и повышенной устойчивостью к антибиотикам и высоким температурам.

2. Гиперэкспрессия гена, кодирующего синтез антитоксина VapB, приводит к потере способности клеток М. smegmatis штамма дикого типа wt и делеционного мутанта AvapBC переходить в дормантное состояние.

3. Мутантный штамм AvapBC с делецией локуса vapBC способен образовывать метаболически неактивные формы, однако такие формы теряют жизнеспособность.

4. Делеция локуса vapBC не препятствует переходу клеток в «некультивируемое» состояние, однако гиперэкспрессия антитоксина VapB на этом фоне блокирует формирование «некультивируемых» форм, что может свидетельствовать об участии антитоксина VapB в инактивации неродственного токсина в процессе формирования покоящихся форм М. smegmatis.

5. При переходе клеток М. smegmatis в дормантное состояние повышается уровень мРНК локуса vapBC.

6. Полученные результаты подтверждают гипотезу об участии системы токсин-антитоксин vapBC в регуляции перехода клеток М. smegmatis в покоящееся состояние.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Demidenok O.I., Kaprelyants A.S., Goncharenko AV. Toxin-antitoxin vapBC locus participates in formation of the dormant state in Mycobacterium smegmatis//FEMS Microbiol. Lett 2014.V.352. №1. P.69-77.

2. Демидёнок О.И., Гончаренко A.B. Системы токсин-антитоксин бактерий и перспективы их использования в медицине//Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т.49. № 6. стр. 539-546.

3. Демидёнок О.И., Гончаренко А.В., Салина Е.Г., Капрельянц А.С. Бактериостатический эффект антибиотиков зависит от активности токсина УарС//Вестник Уральской Медицинской Академической науки (УМАН). 2011. № 4/1. стр. 29-30.

4. Анучин А.М., Гончаренко А.В., Галон И.В., Демидёнок О.И., Кудыкина Ю.К., Мойсенович М.М., Мулюкин АЛ., Капрельянц А.С. Модель покоящихся форм микобактерий для тестирования химиопрепаратов против латентных форм туберкулеза//Прикладная биохимия и микробиология, 2010. Т. 46. № 3. стр. 28-34.

5. Анучин А.М., Гончаренко АВ., Демидёнок О.И., Карпельянц А.С. Гистоноподобные белки бактерий//Прикладная биохимия и микробиология, 2011.Т. 47. № 6. стр. 635641.

Материалы конференций:

1. Demidenok O.I.,Goncharenko AV., Kaprelyants AS. A new rapid procedure of obtaining morphologically altered dormant forms of Mycobacterium smegmatis. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS), 2011, Geneva, Switzerland.

2. Goncharenko A.V., Demidenok O.I., Kaprelyants A.S. Is the Toxin - Antitoxin gene family (yapBC] a global regulator physiological state in Mycobacteria? 4th Congress of European Microbiologists (FEMS), 2011, Geneva, Switzerland.

3. Gonchrenko A V., Demidenok O.I., Anuchin A. M., Galon I. A, Ostrovsky D. N., Kaprelyants A. S. A new toxin-antitoxin gene family (ТА), a global regulator of the physiological state in Mycobacterium: from dormancy to a programmed cell death. ICOMID, 2008, Perm, Russia, p. 151.

4. Goncharenko AV., Shleeva M.O., Demidenok O.I., Kaprelyants AS. Toxin-antitoxin gene family [vapBC) is the regulator of Mycobacteria physiological state. Tuberculosis: biology, pathogenesis, intervention strategies, 2012, Paris, France, p. 26.

5. Goncharenko AV., Demidenok O.I., Kaprelyants A.S. Tetracycline promotes VapC toxin depended development of non-replicating state in Mycobacterium smegmatis. 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Leipzig, Germany,2013.

6. Goncharenko AV., Demidenok O.I. Transition to NC state is accompanied by increase of vapC toxin expression level. FEBS EMBO, 2014, FEBS Journal, №281, p. 673-674.

7. Анучин А. M., Гончаренко А.В., Демидёнок О.И., Капрельянц А.С. Новая модель образования покоящихся форм Mycobacterium smegmatis. Роль гистоноподобного белка Hip в процессе образования покоящихся форм. 4 Международная конференция молодых ученых «От молекулы до биосферы», Харьков, Украина, 2009, стр.163.

Патенты:

1. Патент на изобретение № 2524143 от 30 мая 2014 г. Рекомбинантная плазмидная ДНК рМ'тА^арС, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую ген I>арС М5МЕС_1284. Демидёнок О.И., Гончаренко А.В., Капрельянц А.С.

2. Патент на изобретение № 2524148 от 30 мая2014 г. Рекомбинантная плазмидная ДНК рМт<1-уарВ, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую ген уарВ М5МЕС_1283. Гончаренко АВ, Демидёнок О.И., Капрельянц АХ.

Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2011-2013 годы» (№ контракта 14.740.11.0801).

Формат 60x90/16. Заказ 1780. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96