Субпопуляции стареющих культур неспорообразующих бактерий: разделение в криогелях и морфо-физиологическая характеристика

Евтюгин, Владимир Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Субпопуляции стареющих культур неспорообразующих бактерий: разделение в криогелях и морфо-физиологическая характеристика
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Субпопуляции стареющих культур неспорообразующих бактерий: разделение в криогелях и морфо-физиологическая характеристика"

На правах рукописи

ЕВТЮГИН ВЛАДИМИР ГЕННАДЬЕВИЧ

СУБПОПУЛЯЦИИ СТАРЕЮЩИХ КУЛЬТУР ИЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ '¡БАКТЕРИЙ: РАЗДЕЛЕНИЕ В КРИОГЕЛЯХ И МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

" 9 2910

Казань-2010

004616368

Работа выполнена на кафедре микробиологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ильинская Ольга Николаевна

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Ившина Ирина Борисовна

доктор биологических наук, профессор Селивановская Светлана Юрьевна

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Казанский

институт биохимии и биофизики

Защита состоится " 23 " декабря 2010г. в_на заседании диссертационного совета

Д.212.081.08 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук в ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д. 18., главное здание, ауд. 211)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.Н.И. Лобачевского ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

Электронный вариант автореферата размещен на сайге ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" www.ksu.ru

Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, 18, ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

Автореферат разослан "_" ноября 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, / доктор биологических наук, профессор ^

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплена обширная информация о кардинальных перестройках метаболизма культур микроорганизмов при их длительном культивировании в питательной среде. Проблемы, связанные с изучением стареющей или отвечающей на воздействие стрессоров, например, таких как исчерпание в среде источников питания, микробной популяции являются предметом постоянного внимания исследователей. Следствием стресса является переход активно делящихся клеток к состоянию пролиферативного покоя или метаболического покоя у репродуктивно покоящихся форм. Анализ данных литературы позволяет сделать вывод о том, что гетерогенность стареющих культур неспорообразующих бактерий обусловлена разнообразием в популяции клеток различного физиологического состояния, таких как диссоциативные формы микроорганизмов, цистоподобные рефрактерные клетки [Дуда, Эль-Регистан 2001], гипометаболические, некультивируенмые формы [Kolter et al., 1993].

Пристальное внимание уделяется изучению внеклеточных ауторегуяяторов, обеспечивающих межклеточную коммуникацию при формировании стрессового ответа микробной популяции как единого организма. В аспекте проблематики контроля роста микробной популяции представляют интерес функции ауторегуляторов, выявленных у ряда бактерий и дрожжей (алкилоксибензолы (АОБ)) (Эль-Регистан, 1988; Батраков с соавт., 1993; Мулюкин с соавт., 1996). По достижении определенного концентрационного уровня АОБ влияют на переход микробной культуры к стационарной фазе и развитие в клетках гипометаболического, а затем анабиотического состояний, сопряженных с повышением устойчивости клеток к неблагоприятным и повреждающим воздействиям (Эль-Регистан, 1988; Демкина с соавт., 2000; Лойко с соавт., 2003).

Изменения условий среды обусловливают у популяций микроорганизмов мобилизацию потенциальных возможностей для формирования адаптивного ответа (Головлев, 1999; Феофилова с соавт., 2000). Следует отметить, что стратегия переживания микроорганизмами неблагоприятных воздействий не ограничивается образованием специализированных метаболически покоящихся форм (экзоспоры, цисты, акинеты, экзоспоры). В последние годы большое внимание уделяется изучению способов переживания неблагоприятных условий неспорообразующими бактериями за счет перехода их в состояние «вегетативного» покоя и образования цистоподобных форм [Мулюкин с соавт., 1997]. Однако остается еще недостаточно изученным вопрос о морфо-физиологических особенностях этих форм неспорообразующих микроорганизмов. Актуальным является выявление в стареющих микробных популяцях субпопуляций, изучение свойств субпопуляций клеток, полученных с помощью разделения, в частности, методом гель-хроматографии на различных видах криогелей с высокой разрешающей способностью. Данные этих исследований могут оказаться полезными для выяснения механизмов возникновения морфотипов разного физиологического и биохимического статуса под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды.

Цель и задачи исследований. Целью работы является выявление особенностей диссоциации стареющей культуры неспорообразующих бактерий с оценкой морфо-физиологических свойств субпопуляций и анализ хроматографического разделения клеток в соответствии с их физиологическим статусом в немодифицированных, гидрофобизованных и заряженных криогелях.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать морфотипы клеток и метаболическую активность стареющих популяции грамотрицательных (Escherichia coli К12, Salmonella typhimurium TA100) и грамположительных (Micrococcus luteus, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Staphylococcus epidermidis) неспорообразующих бактерий в соответствии с морфотипами и метаболической активностью и определить соотношение субпопуляций для различных бактерий в условиях длительного культивирования.

2. Выявить основные морфотипы, характеризующие субпопуляции в стареющих бактериальных культурах, методом газовой хроматографии проанализировать возможность синтеза ауторегуляторных факторов - индукторов гипометаболизма, в частности, гексилрезорцина, у исследуемых бактерий различной грампринадлежнос-ти.

3. Оценить возможность разделения смешанных культур бактерий на индивидуальные в криогелях на основе поливинилового спирта, модифицированого гидрофобными алифатическими группировками.

4. Изучить возможность разделения стареющей популяции бактерий на субпопуляции в агарозных криогелях с привитыми гидрофобными и зарядовыми группировками.

5. Охарактеризовать физиолого-биохимические и морфологические параметры бактерий в субпопуляции гипометаболических клеток, полученной после выделения гель-хроматографией на агарозных криогелях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стареющие популяции включают субпопуляции вегетативных, гипометаболических и мертвых клеток в различных соотношениях в культурах различных видов бактерий. Клетки гипометаболической субпопуляции характеризуются ультрамелкими размерам, конденсированной цитоплазмой, измененным элементным составом, снижением активности конститутивных ферментов, увеличением активности бета-галактозидазы и продукцией ауторегулятора- гексилрезорцина.

2. Модифицированный гидрофобными группировками криогель на основе поливинилового спирта позволяет эффективно разделять смесь разноразмерных клеток в смешанных культурах (бациллы/стафилококки), но не делит разноразмерные вегетативные и гипометаболические клетки в монокультурах бактерий.

3. Немодифицированный агарозный криогель эффективно разделяет гипометаболические и вегетативные клетки одной бактериальной культуры, гидрофобизация агарозы алифатическими группировками не влияет на эффективность разделения. Внесение зарядовых группировок увеличивает степень разделения субпопуляций.

Научная новизна.

1. Впервые проведена визуализация гипометаболических наноформ у бактерий (М luteus, L. plantarum 8Р-АЗ, Е. coliK12, St. epidermidis, S. typhimurium TA100) методами трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии.

2. Впервые показано образование капсулоподобных структур у клеток длительно инкубированных культур Е. coli.

3. Предложен и разработан метод гель-хроматографии клеток бактерий в криогелях, открывающий новые перспективы использования криотропного гелеобразования для решения задач как фундаментальной микробиологии, так и биотехнологии.

4. Впервые на криогелях достигнуто эффективное разделение клеток стареющей популяции в соответствии с их метаболическим статусом. Выявлена возможность разделения клеток бактерий на криогелях в зависимости от распределения гидрофобных зон и заряда на клеточной поверхности.

Практическая значимость работы.

1. Разработан новый метод гель-хроматографии в криогелях, который позволяет эффективно разделять клетки с разным метаболическим статусом в монокультурах, а также клетки разных видов бактерий из смешанных культур.

2. Разработана методология анализа стареющих культур бактерий и характеристики гипометаболического состояния, наиболее характерного для бактерий в условиях естественной среды их обитания.

3. Изучены процессы перехода к гипометаболизму, дающие ценные данные для оптимизации биотехнологических процессов как с известными микроорганизмами, так и с представителями еще не используемых видов бактерий в микробиологической промышленности.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась в 2004-2010 гг. в соответствии с планом НИР Казанского (Приволжского) федерального университета «Молекулярно-гепетические, клеточные и популяционные основы функционирования живых систем», федеральной программой «Развитие научного потенциала высшей школы», гранты № 2.1.1.1005, 2.1.1.3222, 2.1.1./920 и РФФИ 07-04-01051. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Часть электронно-микроскопических исследований проведена лично автором на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г.Пущино-на-Оке); в центральной биотехнологической службе (Zentrale Biotechnologishe Betrieb) Университета Юстуса-Либиха г. Гиссен, Германия, и на кафедре зоологии беспозвоночных биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета. Исследования на сканирующем электронном микроскопе проводили в лаборатории Центра электронной микроскопии КФУ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, 2005), XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), 60-й научной студенческой конференции биологического факультета ННГУ (Н.Новгород, 2007), VII Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), III международной конференции «Микробное разнообразие: нынешняя ситуация, стратегия взаимодействия, битехнологический потенциал» (ICOMID 2008) (Пермь - Н.Новород - Пермь, 2008), 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино-на-Оке, 2008), Всероссийской научной конференции «Изменяющаяся окружающая среда и устойчивое развитие регионов: новые методы и технологии исследований» (Казань, 2009), XIV международной конференции «Ферменты микроорганизмов в биотехнологии и медицине» (Казань, 2009), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из которых 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и одно методическое руководство для студентов и аспирантов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части - описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 123 наименования работ российских и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы и условия их культивирования. Микроорганизмы, использованные в работе, приведены в табл.1. Для моделирования условий естественного перехода в гипометаболическое состояние штаммы микроорганизмов культивировали в среде ЬВ (на 1000 мл дистиллированной воды: ЫаС1 - 5 г., дрожжевой экстракт - 5 г., пептон - 10 г.), разведенной 1:10. Газообмен с внешней средой блокировали стерильной полиэтиленовой пленкой. Культивирование вели в течение 6-9 месяцев при 37°С в термостате.

Таблица 1. Микроорганизмы, использованные в работе, приведены в таблице 1

Штамм Генотип Источник (коллекция)

Micrococcus hiteus дикий тип Музей каф. микробиологии КФУ

Lactobacillus plantarum 8P-A3 дикий тип Препарат «Лактобактерин сухой», ФГУП «Пермское НПО «Биомед», г. Пермь

Escherichia coli KI2 дикий тип Музей каф. микробиологии КФУ

Escherichia coli PQ37 sfiA::mud(Ap lac)cts, lac A U169, mal*, uvr A, gal Y, pho С, rfa Музей каф. микробиологии КФУ

Bacillus subiilis дикий тип Музей каф. микробиологии КФУ

Staphylococcus epiclermidis дикий тип Музей каф. микробиологии КФУ

Salmonella typhimurium ТА 100 His С46, rfa, uvr-, ркт 101, bio- НИИ по БИХС, Купавна

Регуляторные факторы микроорганизмов. В работе исследовали соединения класса алкилрезорцинов (Sigma), химические аналоги ауторегуляторных факторов di бактерий - метилрезорцин (Met) (Sigma, М.м. = 124) и гексилрезорцин (Hex) (Sigma, М.м. = 196). Исходный раствор алкилрезорцинов готовили в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 10 мг/мл, в экспериментах исследовали соединения в концентрациях от 10 до 1000 мкг / мл дистиллированной воды.

Полимерные криогели. В работе использовали ряд криогелей, содержащих алифатические цепи различной длины, а также заряженные группировки. Применяли гели агарозы и поливинилового спирта (ПВС), немодифицировапные (условное обозначение СО) и модифицированные алифатическими заместителями с длиной с 4, 7, 12 углеродных атомов (условные обозначение С4, С7 и С12 соответственно), а

также гели, несущие остаток трис-оксиметиламинометана (положительно заряженные группировки) и тиогликолевой кислоты (отрицательно заряженные группировки).

Определение активности щелочной фосфатазы проводили с помощью модифицированного SOS-хромотеста [Miller, 1976]. Культуры бактерий выращивали при 37° С в течение 18 ч для изучения вегетативных клеток и в течение 120-270 суток в условиях голодания для анализа гипометаболических клеток. По уровню экспрессии конститутивной щелочной фосфатазы определяли метаболическую активность гипометаболических и вегетативных клеток клеток.

Определение азоказеинолитической активности [Chomey J., 1947].

Субстратом служил 10% раствор азоказеина в 0.05 М трис-буфере, рН 7.2. Реакционная смесь состояла из 100 мкл субстрата и 50 мкл ферментного раствора. Культуры бактерий выращивали при 37 С в течение 18 ч для характеристики вегетативных клеток и в течение 120-270 суток в условиях голодания для гипометаболических клеток. Активность протеолитических систем клеток определяли по гидролизу азоказеина.

Определение активности р-галактозидазы. Культуры бактерий выращивали при 37° С в течение 18 ч для вегетативных клеток и в течение 120-270 суток в условиях голодания для гипометаболических клеток. После этого определяли активность р-галактозидазы, согласно методике [Miller, 1976].

Тест Kogure для определения числа жизнеспособных, но иекультивнруемых клеток. Число и процент жизнеспособных, но некультивируемых клеток определяли в модифицированном тесте Когуре [Kogure et al., 1979].

Хроматографическое определение гексилрезорцииа (Hex) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «Стайер-2» («Аквилон», Россия), с УФ-детектором при 254 нм, используя колонку Luna С18, длиной 15 см с внутренним диаметром 4.6 мм. Анализ проводили в течение 20 минут в обращено-фазовом режиме с программированием состава подвижной фазы (адетонитрил-вода) в градиенте от 40% об. до 100% об. Количественный расчет содержания гексилрезорцииа проводили с использованием метода абсолютной калибровки.

Гель-фильтрация бактерий в модифицированных полимерных криогелях. Культуры исследуемых штаммов выращивали на среде LB в течение 18*ч при температуре 37°С. Клетки от среды отделяли центрифугированием (8 000 об/мин., радиус ротора 8 см, 20 мин.). Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в 0.9% NaCl. Поверхность геля предварительно промывали 20 мл физиологического раствора (0.9 % NaCl), продували стерильным воздухом и пропускали через колонку геля 0.4 мл физиологического раствора в течение 40 с для заполнения пор геля. Далее на поверхность геля наносили 0.4 мл исследуемой микробной суспензии, пропуская её через колонку геля в течение 2.5 мин (плотность суспензий выравнивали добавлением физиологического раствора). Через гель пропускали 0.4 мл физиологического раствора для освобождения геля от клеток, не провзаимодействовавших с привитыми группировками. В ряде экспериментов процедуру смыва повторяли несколько раз.

Полученные в процессе гель-хроматографии образцы, а также суспензию измеряли на спектрофотометре СФ 2000 (490 нм) против физиологического раствора, используемого в качестве контроля. После работы гель во избежание контаминации

исследуемыми микроорганизмами промывали 20% этанолом и заливали азидом натрия.

Трансмиссионная электронная микроскопия. Образцы для

трансмиссионной электронной микроскопии фиксировали 2.5% раствором глутарового альдегида в 0.05 M какодилатном буфере. Дальнейшую обработку образцов проводили по методиками [Миронов с соавт., 1994; Гальченко, 2001]. Исследования бактерий проводили на трансмиссионных электронных микроскопах JEOL-JEM 100В, Carl Zeiss LEO. Цитохимическая реакция на щелочную фосфатазу проводилась контрастированием продуктов реакции солями кадмия и свинца

Сканирующая электронная микроскопия с элементным анализом. Пробу для сканирующей электронной микроскопии готовили путем нанесения капли суспензии микроорганизмов в 0.9% NaCl на покровное стекло с последующим высушиванием. Для контрастирования образца проводили вакуумное напыление золота. В работе использовали растровый сканирующий электронный микроскоп Phillips XL-30 с микрозондовым анализом (спектрометр EDAX EDX). Исследование проводили в режиме HIGH-VAC. Напыление золота проводили на вакуумной напылительной установке AGAR.

Статистическую обработку результатов проводили в компьютерных программах Microsoft Excel и Origin. При этом р < 0,05 принимали за достоверный уровень значимости. Статистическую обработку данных электронной микроскопии и элементного анализа проводили с помощью программного обеспечения приборов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В серии экспериментов первоначально из микробной популяции на различных этапах ее старения выделяли клетки с целью изучения их свойств. Для этого пять исследуемых культур микроорганизмов (М luteus, L. plantarum 8Р-АЗ, Е. coll К12, S. epidermidis, S. typhimurium TAI 00) были посеяны в колбы с обедненной питательной средой с ограничением газового обмена с внешней средой (инокулятом служила 18 часовая культура). На различных этапах эксперимента в соответствии с поставленными задачами проводили отбор клеток из жидких суспензий разного возраста (сутки, месяц, три, четыре, шесть, девять месяцев).

1. Изменение морфологии клеток при переходе в гипометаболическое состояние. Микрофотографии ультратонких срезов клеток стареющей популяции (150-180 суток) клеток Е. coli К12 приведены рис.1. Электронные микрофотографии клеток на промежуточном этапе перехода популяции в гипометаболическое состояние показывают, что популяция гетерогенна и состоит из вегетативных клеток нормальных размеров и мелких гипометаболических клеток. На фотографии в полях снимков присутствуют гипометаболическая клетка и вегетативная клетка, в частности видна вегетативная клетка находится в процессе деления (рис. 1).

Рисунок 1 - Сравнительный размер и морфология вегетативной (В) и гипометаболи-ческой (Г) клеток Е. coli К12 (популяция в процессе старения, 150-180 суток)

Клетка, перешедшая в гипометаболическое состояние, значительно уменьшилась в размере, сохранив при этом целостность оболочки и жизнеспособность. О последнем свидетельствует аналогичная вегетативной клетке электронная плотность содержимого. При этом кардинальных изменений в морфологии клеточной поверхности, как и утолщения клеточной стенки, не наблюдали.

На основании анализа представленных фотографий можно заключить, что стрессовые условия, примененные к исследуемым культурам микроорганизмов, достаточны для дестабилизации гомеостаза популяции с последующим переходом видов к политике переживания стрессовых условий. Расслоение популяции четко зафиксировано, для всех четырех видов исследованных микроорганизмов показано наличие активных, гипометаболических и мертвых клеток.

2. Определение Hex в суспензиях бактериальных клеток с помощью ВЭЖХ. Анализ образцов культуралыюй жидкости (КЖ) микробных клеток на возможное содержание гексилрезорцина (Hex) и его гомологов показал, что если к суспензии бактерий был изначально добавлен Hex (50 ООО нг/мл), то его содержание существенно снижалось за 60 суток культивирования. При дальнейшем культивировании (к 120 суткам) Hex снова появлялся в КЖ и его содержание достигало больших значений, чем в вариантах эксперимента, в которых Hex исходно не добавляли.

Определение концентрации алкилрезорципов в КЖ стареющих микробных популяций выявило, что наибольшее накопление Hex без добавления экзогенного ауторегулятора наблюдалось в суспензии М. Intens. В КЖ S. typhimurium на 120 сутки культивирования Hex обнаружен не был, наибольшее накопление Hex показано для L. plantarum (табл. 2).

Варианты с экзогенным внесением гексилрезорцина содержали наибольшее количество Hex. Условия длительного культивирования действительно сопровождаются эндогенным образованием гексилрезорцина. что было выявлено в контрольных образцах на больших сроках инкубирования. Однако в контрольном варианте концентрация образовавшегося Hex не столь значительная, как в опытном

варианте (Табл. 2), следовательно можно заключить, что Hex в большей степени способствует переходу в пшометаоолическое состояние на ранних этапах культивирования, чем условия голодания .

Таблица 2 - Содержание Hex в КЖ по данным ВЭЖХ на 120-е сутки инкубирования бактерий__

Содержание Hex, нг/мл

Штамм Без добавления С добавлением Hex

экзогенного Hex 50 000 нг/мл

E.coliKU 7100 12950

М. hiteus 14700 12560

L. plantarum 8Р-АЗ 8000 43280

S. typhimurium ТА 100 отсутствовал 11960

3. Физиологические изменения грамположительиых и грамотрицатсльных бактерий в условиях длительного культивирования в присутствии факторов анабиоза. С помощью теста Когуре [Kogure et al., 1979], в 60-ти и 180-суточных бактериальных культурах исследовали содержание клеток, «отзывчивых» на внесение питательного субстрата, а также присутствие и количество гипометаболических форм, индуцированных Hex, вносимом в концентрации 50 ООО нг/мл.

Таблица 3. Содержание клеток в 60-дневной суспензии гр+ и гр- микроорганизмов,

реагирующих на внесение экзогенного субстрата, %

Штамм Количество клеток, %*

Активные (вегетативные) клетки Гипометаболи ческие клетки Мертвые клетки

Е. со//К12 14+1 64+2 22±1

М. hiteus 14+1 72±2 13+1

L. plantarum 8Р-АЗ 20±1 5±1 70±6

S. typhimurium ТА 100 9+1 82±1 8±1

*) За 100% примято среднее число клеток при анализе 10-12 полей зрения в световом микроскопе при увеличении 1600 (объектив с иммерсией).

Результаты, приведенные в таблицах 3-5 свидетельствуют, что в суспензии грамположительиых и грамотрицательных бактерий существуют увеличенные в размерах за счет добавленного субстрата клетки (9-20%), обозначенные нами как «активные» и клетки, которые не реагировали увеличением размера на добавленный источник питания, так называемые «гипометаболические» (5-85% в зависимости от вида бактерий), а так же окрашенные метиленовым синим мертвые клетки (8-70%). Таким образом, в 60-суточных микробных культурах количество гипометаболических клеток было в 4-8 раз больше числа активных, за исключением I. р1ашапип, у которых наблюдалось только 5% клеток в гипометаболическом состоянии, в то время как основная часть популяции состояла клеток, окрашивающихся как мертвые (70%).

Следует отметить, что в культуре I. р1амагит количество гипометаболических клеток к 60 суткам было минимальным (4-5%), мертвые же клетки превалировали в стареющей популяции. Число активных клеток лактобацилл было несколько выше

(20-21%), чем у других исследованных микроорганизмов (Табл. 3). С пашен точки зрения более высокое число активных и большое число мертвых клеток, описанное для бацилл связано со значительно меньшей скоростью адаптации к агрессивным условиям среды. Однако данные анализа лактобациил на более поздних стадиях культивирования показали, что окончательной гибели популяции не происходит, популяция стабилизируется, приближаясь по показателям к остальным исследованным микроорганизмам, в частности Е. Coli.

К 180 дню культивироваиия число активных клеток уменьшилось, возросло число гипометаболических и мертвых клеток (Табл 4). Значительных различий в соотношении субпопуляций между исследованными микроорганизмами не обнаружено. Наибольшее число как гипометаболических, так и активных клеток выявлено для S.typhimurium.

Параллельно изучали зависимость перехода в гипометаболическое состояние от внесения Hex. Как и предполагалось, внесенный аутоиндуктор анабиоза изменил стратегию выживания популяций. Число вегетативных клеток к 120 дню культивирования было меньше, 3-12%, против 20-24% для суспензий, культивировавшихся без Hex. Число клеток в гипометаболическом состоянии значительно не изменялось, но число мертвых клеток возросло до 21-40% против 1522%. Hex на поздних этапах показал токсическое действие, что согласуется с данными литературы [Маргулис с соавт., 2006]. Можно сделать вывод, что популяция при длительном культивировании в стрессовых условиях является гетерогенной и разделяется по типам клеток на разных стадиях перехода от нормальной вегетации до исчезновения реакции на внесенный субстрат (Табл. 4).

Таблица 4. Содержание клеток (в %) в 180-дневпой суспензии гр+ и гр-

микроорганизмов, отвечающих на внесение экзогенного субстрата, %

Штамм Количество клеток, %*

Активные (вегетативные) клетки Гипометаболи- ческие клетки Мертвые клетки

E.coli К12 4+1 69±2 27+1

М. luteus 6+2 76+2 17+1

L. ptontarum 8Р-АЗ 4±1 69±1 26±3

S. typhimurium ТА 100 9+2 75±2 18±1

*) За 100% принято среднее число клеток при анализе 10-12 полей зрения в световом микроскопе при увеличении 1600 (объектив с иммерсией).

Влияния Hex па популяции после трех и шести месяцев культивирования показал смещение соотношения субпопуляций в сторону увеличения числа мертвых и уменьшения числа активных клеток. Отсутствие значительных изменений в числе гипометаболических клеток в присутствии Hex свидетельствует о незначительности его влияния на ускорение перехода к гипометаболизму в стареющих популяциях.

4. Изменение активности конститутивных ферментов в клетках стареющей популяции микроорганизмов, а так же при действии Hex. Активность клеточных протеаз значительно снижается уже к первому месяцу культивирования бактерий, оставаясь в последствии на очень низком уровне вплоть до 120 суток культивирования. Такая же картина наблюдалась в вариантах с добавленым гексилрезорцином (рис.2).

Резкое снижение активности протеаз после первого месяца культивирования связано с тем, что исследуемые популяции микроорганизмов плавно переходят в состояние гипометаболизма. Активной гибели клеток, а следовательно появления в среде дополнительного субстрата для проявления активности фермента не происходило. В таком случае мы наблюдали бы постепенное снижение активности фермента в течение нескольких месяцев. Таким образом факт резкого падения протеолитической активности может служить свидетельством перехода в гипометаболическое состояние.

А Б

П E.coi ioE.coiHa

18 часов 1 месяц 2 месяца 4 месяца Продолжительность культивирования

0,25

ä 0,2 I

го,15 [в Lact ;

з 0.1 Р (в Lact He«

»0,05 сЗ I

18 чвсое 1 месяц 2 месяца 4 месяца

Продолжительность культивирования

0,14 -

[

50,12-i 0.1 ■ El

;0,08 l^fi |DTA100

ä 0,06 J 0.04 «0,02 I IOTA 100 Hex

18 часов 1 месяц 2 месяца 4 месяца

Продолжительность культивирования

Рисунок 2 - Влияние Hex на протеазную активность у грамотрицательных (А - E.coli Kl 2, Б -S. typhimurium ТА 100) и грамположительных (В -L. plantariim 8Р-АЗ, Г-

М. Intens) бактерий.

Сходная динамика изменения активности щелочной фосфатазы за 120 суток культивирования установлена для бактерий разной грам-принадлежности. Ферментативная активность постепенно снижалась с переходом к гипометаболизму в ходе 120 суток инкубирования. Однако добавление Hex индуцировало снижение активности фермента за 60 суток культивирования инкубируемых микроорганизмов (рис. 3). Исключение составляет Е. coli. В этом случае Hex не оказывает ускоряющего действия на переход к гипометаболическому состоянию, регистрируемому по снижению активности конститутивной щелочной фосфатазы (рис. 3, А).

Как оказалось, при старении популяции активность щелочной фосфатазы постепенно снижалась, что свидетельствовало о снижении биохимической активности при переходе клеток к гипометаболизму. Исследования способности Hex оказывать влияние на активность щелочной фосфатазы у бактерий разной

грампринадлежности (S. typhimurium ТА 100, E. coli Kl2, L. plantanim 8P-A3 и M. lutens показали, что Hex в концентрации 50 ООО нг/мл снижает активность щелочной фосфатазы по сравнению с контролем, при этом наибольшее снижение активности происходит на первом месяце инкубирования микроорганизмов. Вероятно, это связано с более выраженным стрессовым состоянием микроорганизмов, культивируемых с Hex в сравнении с контролем.

0,25 £ 0,2 Е0,15 Л 0,1 «0,05

Ч LU

BE.cci □ E.coü Не*

18 часов 1 месяц 2 месяца 3 месяца 4 месяца Продолжительность культивирования

JSL

DTA1M

О ТА100 Hex

1В чассв 1 месяц 2 месяца 3 месяца 4 месяца Продолжительность культивирования

:о,з5 ° 0,3 «0,25 ™ 0,2 äO,15

I 0,1

ш0,05 О

ГО—

я Lact D Lact Hex

1 месяц 2 месяца 3 месяца 4 месяца

Прадяшевыдаь (ушшрошю

НМсг П Мег Hex

1 месяц 2 месяца 3 месяца 4 месяца Продолжительность культивирования

Рисунок 3 - Влияние Hex на активность щелочной фосфатазы у грамотрицательных (А - E.coli К12, Б - S. typhimurium ТА 100) и грамположительных и (В - L. plantaram 8Р-АЗ Г - М. luteus) бактерий

Начиная с 120 суток разница показателей активности фермента между вариантами с внесением и без внесения Hex уменьшается, что вероятно было связано с разрушением или утилизацией экзогенно внесенного гексилрезорцина. Снижение активности щелочной фосфатазы как конститутивного фермента в целом может свидетельствовать о переходе микроорганизмов в гипометаболическое состояние.

Сравнительная цитохимическая реакция на белок щелочной фосфатазы в гипометаболических и вегетативных клетках Е. coli Kl 2 выявила, что количество фермента в клетках не изменяется в зависимости от их физиологического состояния. Комплекс продукта реакции щелочной фосфатазы с субстратом, модифицированным солями кадмия и свинца, представляет собой электронно-плотные области на фотографии. Они по объему практически идентичны у вегетативных и

гипометаболических клеток, увеличение интенсивности электронно-плотных областей у гипометаболических клеток связано с более компактным расположением фермента в уменьшившемся внутреннем объеме этих клеток (рис. 4, А) по сравнению с вегетативными (рис. 4, Б).

Рисунок 4 - Локализация и сравнительный объем щелочной фосфатазы в клетках Е.соН К12; А - гипометаболические клетки, Б - вегетативные клетки (бар - 1 мкм).

Микроскопические исследования глобул фермента при помощи модифицированного тяжелым металлом субстрата дает возможность оценить локализацию и примерный сравнительный объем фермента (Рис. 4). Полученные данные подтверждают гипотезу об инактивации фермента при старении и переходе к гипометаболизму, о чем свидетельствует равный объем фермента в гипометаболических и активных клетках. Такая стратегия инактивации фермента с сохранением его в клетке свидетельствует о том, что клетка на средних этапах гипометаболизма сохраняет возможность более быстрой реверсии биохимической активности. Восстановление активности фермента предполагает значительно меньшие затраты энергии, чем требовалось бы при синтезе молекул фермента de novo.

5. Изменение активности и биосинтеза ß-галактозидазы при действии Hex.

Известно, что ß-галактозидаза является ферментом, сопутствующим старению эукариотических клеток [Лянгузова, 2007]. Однако для бактерий его роль в процессах их старения неизвестна. В связи с этим был поставлен ряд опытов по выявлению изменений активности ß-галактозидазы при старении бактериальных культур. Кроме того, для Е. coli PQ37, где ген ß-галактозидазы внесен в SOS-оперон, повышение ß-галактозидазной активности может свидетельствовать о наличии ДНК-повреждаюших факторов, приводящих к индукции SOS-ответа клетки. Именно поэтому данный штамм был выбран для оценки и сравнения активности этого фермента на поздних стадиях культивирования клеток. Эксперименты по измерению активности ß-галактозидазы в вариантах с Hex и без него показали рост активности фермента с течением времени и старением культур (рис 5). В присутствии Hex происходило значительное увеличение активности фермента на поздних этапах культивирования, особенно выраженное у М. Intens (рис. 5, Г).

0,0(6 го,ом Поли

£ 0,Of -0.00850,00620,002

J часов Змесяца 4 месяца Продолжительность культивирования

□Lact I Lact Hex

Продолжительность культивирования

Рисунок 5 - Влияние Hex на активность ß-галактозидазы у грамотрицательных (А -E.coli К12, Б - S. typhimurium ТА 100) и грамположительных и (В - L. plantariim 8Р-АЗ, Г - М. luteus) бактерий.

Полученные данные мы рассматриваем как дополнительное свидетельство перехода бактерий в гипометаболизм под действием стрессовых факторов. Для подтверждения нашей гипотезы было проведено сравнение динамики активности ß-галактозидазы исследованных микроорганизмов с активностью ее у рекомбипантного штамма Е. coli PQ37. Сравнение данных по динамике активностей показало, что все исследованные микроорганизмы в одинаковой степени обнаруживали увеличение активности ß-галактозидазы при старении популяции и переходе клеток бактерий к гипометаболизму.

6. Гель-хроматография клеток бактерий в ПВС криогелях с привитыми алифатическими группировками и разделение криогелями ПВС клеток без внесения ауторегуляторов. Для проведения экспериментов использовались смешанные культуры В. subtiUs и S. epidermidis в трех различных вариантах:

- две односуточные культуры;

- односуточная культура В. subtilis и семисуточная культура S. epidermidis;

- семисуточная культура В. subtilis и односуточная культура S. epidermidis.

При использовании немодифицированного криогеля ПВС ни одна из трех

смесей культур не разделялась по размерам клеток. Количество бацилл и стафилококков было одинаковым в исходном и пропущенном через гель образце.

Кроме того, при исследовании возможного влияния возраста культуры на ее прохождение через гель было выяснено, что при старении культура бацилл лучше задерживалась в геле. В отличие от бацилл, стафилококк всегда полностью сорбировался в гидрофобном геле. В экспериментах с внесением алкилрезорцинов результаты были аналогичными. Степень гидрофобности не оказывала значительного влияния на сорбцию.

Полученные данные мы объясняем тем, что стареющая культура накапливает эндогенные ауторегуляторы развития, которые, как будет показано далее на примере Е. coli, способны изменять гидрофобные свойства клеток. В течение 7 суток развития популяции вследствие начавшихся процессов старения начали вырабатываться эндогенные ауторегуляторы перехода бактерий в гипометаболическое состояние, одной из характеристик которого является изменение состава клеточной поверхности. Более значительная сорбция стафилококка в гидрофобизованных криогелях связана с возрастающей с по мере старения культуры гидрофобностью поверхности как отдельных клеток, так и их агрегатов. Это свойство также является клинической характеристикой, связанной со способностью эпидермального стафилококка вызывать поражения тканей.

7. Гель-хроматография клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий в агарозных криогелях с привитыми алифатическими группировками не выявила достоверной зависимости степени сорбции от длины привитой алифатической группировки, то есть степени гидрофобности (рис.6.).

Рисунок 6 -Сравнительная гистограмма, отражающая степень сорбции клеток бактерий в криогеле (обозначения вариантов геля приведены в материалах и методах)

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии зависимости сорбции клеток бактерий от длины алифатического хвоста как для 18-часовых культур, так и для 60-дневных культур. Степень гидрофобности внутренней поверхности криогеля не оказывает влияния на сорбцию клеток исследуемых микроорганизмов, статистически достоверной разницы и связи сорбции с длиной алифатической цепочки не обнаружено.

Сравнение результатов сорбции однодневных и шестидесятидневных культур микроорганизмов в агарозном криогеле показало, что старые клетки, перешедшие в гипометаболическое состояние, задерживаются в криогеле значительно лучше, чем клетки после однодневного культивирования. Такая закономерность, свидетельствующая о неспецифической сорбции, была характерна для всех исследованных бактерий (рис. 7).

СО С4 С7 С12

Варианты геля

СО С4 С7 С12

Варианты геля

ш 1дневная культура Escherichia coii Ш) бОдневная культура Escherichia сой

т 1днеемая культура Mcrococcus iuteus шз бОдневная культура Micrococcus iuteus

СО С4 С7 С12 _Варианты геля_

öS 1дневная культура Lactobacillus piantarum шбоднеаная культура Lactobacillus piantarum

Рисунок 7 - Сравнение сорбции в криогеле однодневных и шестидесятидневных культур Е. coli (А), М. lysodeikticus (Б), S. typhimvrium (В), L. piantarum (Г)

Не было выявлено достоверной зависимотст уровня сорбции от длины алифатического хвоста криогедя. Активные клетки в состоянии вегетации задерживались во всех исследованных криогелях значительно хуже, чем клетки в гипометаболическом состоянии, что говорит о низких значениях неспецифической сорбции клеток бактерий в гипометаболическом состоянии, в сравнении с активными клетками.

Наибольшую степень сорбции среди 60-дневных культур наблюдали для E.coli. Вероятно это связано с потерей клетками кишечной палочки густого фимбриального покрова, практически полностью покрывающего поверхность клетки в вегетативном состоянии. При потере слоя из фимбрий на поверхности клеток - процесса, характеризующего адаптацию к стрессовым условиям и потерю двигательной активности, открылся доступ к наружной мембране клетки. Возможно именно это событие, наряду с потерей способности к активному передвижению, повлияло на то, что именно клетки кишечной палочки лучше всего сорбировались при гель-хоматографии в криогелях.

я Чдневная культура Salmonella typhlmurium 3 бОдневная культура Salmonella typhlmurlum

СО С4 С7 С12 _Варианты геля_

Наименьшие значения сорбции для Ь. р1ап1агит являются следствием того, что клетки лактобацилл не переходили в гипометаболическое состояние, а в большинстве своем погибали при нарастании давления стрессовых условий. Как известно, мертвые клетки проявляют значительно меньшую степень сорбции на органических и неорганических материалах, в том числе и на криогелях.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют возможность эффективного и достоверного разделения активных и гипометаболических клеток при помощи как модифицированных, так и немодифицированных алифатическими цепочками криогелей.

8, Гель-хроматография в агарозных криогелях с привитыми заряженными группировками. Анализ данных сорбции 18-часовых культур микроорганизмов выявил, что число адсорбировавшихся клеток для исследуемых грамположительных кулмур, а так же для грамотрицательной 5. IурЫтигшм примерно одинаково (рис. 8).

Рисунок 8 - Сравнительная гистограмма прохождения через гель с привитыми зарядовыми группировками клеток культур микроорганизмов (контроль - гель без привитых группировок).

Для Е. coli наблюдали достоверное усиление сорбции при использовании криогеля с отрицательно заряженными привитыми группировками по сравнению с криогелями без привитых группировок и с положительно заряженными группировками.

Сравнение сорбции в агарозном криогеле клеток однодневной и четырёхмесячной исследуемых бактериальных культур с Plex и без него выявило снижение адсорбционной способности клеток бактерий, перешедших к гипометаболизму. Hex, как и предполагалось, способствовал более быстрому переходу к гипометаболическому состоянию (НФ-фенотипу), а следовательно, большей потере поверхностного заряда клетки, что отразилось в значительно меньшей сорбции гипометаболических клеток по сравнению с вегетативными. Аналогичные тенденции были обнаружены для грамотрицательных (рис. 9) и грамположительных (рис. 10) бактерий. Наибольшая разница в проценте задержавшихся и вышедших клеток при сравнении суточной и четырёхмесячной культур показана для Е. coli.

Рисунок 9 - Число адсорбировавшихся после прохождения через гель клеток L. plantarum 8Р-АЗ и М. Intens в опыте (% от общего числа нанесенных на гель клеток) (контроль -гель без привитых группировок).

гепь с привитыми "-"группировками

Вариант геля

!3Jlm. песо)!

I Salm.Ha< иЕсоННех

, ЕспП однодкевн. ■ &1т,одкоднеат.

с лривигыми "-"группировками Вариант геля

Рисунок 10 - Число адсорбировавшихся после прохождения через гель клеток 5. /урЫтигтт ТА 100 и Е. соИ К12 в опыте (% от общего числа нанесенных на гель клеток) (контроль - гель без привитых группировок)

9. Морфология гипометаболических клеток микроорганизмов после разделения в криогелях. Установлены достоверные изменения размера и морфологии клеток Е. coli в гипометаболическом и вегетативном состояниях. Так, первые имеют размер клетки 1500± 150 им в длину и 700±30 нм в диаметре (вытянутая палочковидная форма) и толщину клеточной стенки 5-11 нм, тогда как вторые - соответственно 350-370 нм в диаметре (сферическая форма) и стенки толщиной 30-40 нм. (рис 11, А, Б) Значительно увеличилось периплазматическое пространство гипометаболических клеток (30-39 мм) по сравнению с вегетативными (3-5 нм).

На электронных фотографиях ультратонких срезов видим ряд значительных изменений, которые принято считать характеризующими гипометаболическое состояние. Это значительное уменьшение размера клеток относительно вегетативных, шарообразная форма, изменение поверхностных структур. Последнее представляет наибольший интерес ввиду того, что именно характеристика поверхности клеток определяет выживание в агрессивной среде.

-яг А . --g

Рисунок 11 - Электронные микрофотографии клеток Е. coli А - гипометаболическая клетка (270 суток культивирования), Б - вегетативные клетки (18-часовая культура)(пп - периплазматическое пространство, вм - внешняя мембрана, цпм -цитоплазматическая мембра на ).

Особенно четко изменения в клеточной стенке Е. coli видны па рис.12, изображающем клетки, перешедшие в гипометаболическое состояние на поздних этапах культивирования (270 суток). Значительно увеличилась толщина покровов клетки, появились капсулоподобпые образования (80-240 нм), включая клеточную стенку (28-39 нм). Объем и относительный размер клеток на 270 сутках культивирования в условиях голодания уменьшился более чем в 5 раз относительно среднего размера вегетативных клеток в исследованных образцах.

Рисунок 12 - Морфология гипометаболической клетки Е. coli Kl2 (270 суток культивирования)(цпм - цитоплазматическая мембрана, кис - капсулоподобная структура, пп - периплазматическое пространство, вм - внешняя мембрана)

Вокруг клетки наблюдается зона высокой проходимости электронного пучка, что свидетельствует о наличии в этой области специального образования, не

пропускающего в себя электронно-плотные молекулы, контрастированные уранилаяетатом и свинцом. Это позволяет предположить наличие кашулоподобных образованиях, окружающих клетки в состоянии гнпометаболизма. Наличие таких структур для кишечной палочки детектировано впервые, анализ 35-40 клеток в более чем 20 полях зрения говорит о статистически достоверном присутствии этого образования у клеток Е. coli (рис. 12). Отсутствие подобных образований у мертвых клеток, присутствовавших в этих ультратонких срезах, говорит о связи образований с жизнедеятельностью микроорганизма в гипометаболическом состоянии.

10. Элементный анализ клеток бактерий в гипометаболическом состоянии после разделения в криогелях. Анализ отношения кальция к углероду в исследуемой области показал увеличение содержания кальция гипометаболическими формами Е. coli в сравнении с вегетативными формами (рис. 13). Для S. typhimurium уровень кальция хотя и превышал значения для кишечной палочки, но разницы между гипометаболическими и вегетативными формами выявлено не было.

30 25

S. Typhimurium Е. Coli

Микроорганизм

Рисунок 13 - Сравнительное содержание кальция в клетках бактерий относительно углерода в сканируемой области (исследовано 15-17 клеток). 100% соответствуют суммарному количеству всех элементов, выявленных элементным анализом в области сканирования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе анализа полученных результатов и данных литературы можно заключить, что для микробных сообществ в процессе старения характерно образование диссоциативных форм, различающихся по морфо-физиологическому статусу. Криогели благодаря возможности формирования пор заданного диаметра путем криотропного гелеобразования обеспечивают эффективное разделение субпопуляций. Разработанный метод гель-хроматографического разделения клеток гетерогенных популяций бактерий оказался эффективным для клеток с различным строением поверхности, исключая один вид, S. epidermidis, который образовывал плотные агрегаты клеток, блокирующие поры криогеля.

Полученные из культур разных возрастов фракции проанализированы методами трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии. Визуализация клеток, как не фракционированных на криогелях, так и фракций, обогащенных гипометаболическими формами, полученных с помощью гель-хроматографии,

_т щшж Q 1-сут. □ 6-мес.

—±—

щшШШ,

выявила устойчивые изменения морфологии клеток, перешедших в состояние гипометаболизма.

ВЫВОДЫ

, 1. Культуры веспорообразующих бактерий, как грамположительных (Micrococcus luteus, Lactobacillus plantarum, Staphylococcus epidermidis 8P-A3), так и грамотрицательных (Escherichia coli K12, , Salmonella typhimurium TA100) через 180 суток культивирования состоят из вегетативных, гипометаболических и мертвых клеток, в соотношении 1:7:2, соответственно. При переходе к гипометаболизму зафиксировано уменьшение размеров клеток в 5 раз, переход палочковидных форм в кокковидные, а также снижение метаболической активности бактерий.

2. Установлена возможность синтеза ауторегулятора гексилрезорцина (до 14 мкг/мл) стареющими бактериальными популяциями различной грампринадлежности на 120 сутки культивирования.

3. Смешанные популяции бацилл и стафилококков эффективно разделяются в криогелях поливинилового спирта, модифицированного гидрофобными группировками.

4. Агарозный криогель, модифицированный гидрофобными группировками, позволяет эффективно разделять стареющую культуру бактерий на субпопуляции вегетативных и гипометаболических клеток, вне зависимости от степени гидрофобности геля. Агарозный криогель с привитыми зарядовыми группировками позволяет эффективно разделять гетерогенные субпопуляции в зависимости от величины заряда геля.

5. В субпопуляции гипометаболических клеток, характеризующихся утолщением клеточной стенки, конденсацией цитоплазмы и формированием капсулоподобной стуктуры, зафиксировано снижение активности конститутивных щелочной фосфатазы и протеиназ, и увеличение активности индуцибельной (3-галактозидазы.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Евтюгин, В.Г. Сорбция микроорганизмов крупнопористыми агарозными криогелями, содержащими привитые алифатические цепи различной длины / В.Г.Евтюгин, А.Б.Маргулис, Л.Г.Дамшкалн, В.И.Лозинский, А.И.Колпаков, О.Н.Ильинская // Микробиология.- 2009.- Т.78, №5,- С.603-608.

2. Дмитриев, В.В. Методы электронной микроскопии в биологии / В.В.Дмитриев, О.Н.Ильинская, В.Г.Евпогин, А.А.Тойменцева, А.Б.Маргулис // Методическое руководство. -Казань: изд-во ЮГУ. -2005. -31с.

3. Асафова, А.С. Влияние универсальных индукторов гипометаболизма на динамику роста и состав микробного сообщества / А.С.Асафова, М.С.Щетинникова, В.Г.Евтюгин, А.Б.Маргулис // Материалы 60-й научной студенческой конференции биологического факультета ННГУ,- Н.Новгород.-12-13 апреля 2007.- С.121.

4. Маргулис, А.Б. Разделение бактерий в криогелях, содержащих алифатические цепи различной длины / А.Б.Маргулис, О.В.Бушманова, В.Г.Евтюгин, А.Н.Шарифуллина, О.Н.Ильинская II Тез. докладов VII Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века".- 2627 апреля 2007,- С. 73.

5. Евтюгин, В.Г. Сорбция микроорганизмов крупнопористыми криогелями с привитыми алифатическими цепями различной длины / В.Г.Евтюгин, А.Б.Маргулис, А.И.Колпаков, О.Н.Ильинская, Л.Г.Дамшкалн, В.И.Лозинский // Сборник трудов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов.- 11-15 мм 2008 г.- Новосибирск.- С.400.

6. Lozinsky, V.I. A new type of amphiphilic polymer sorbents based on supermacroporous cryogels and their implementation for hydrophobic chromatography of microbial cells / V.I.Lozinsky, L.G.Damshkaln, V.G.Evtyugin, E.N.Efremenko, R.V.Ivanov, I.B.Ivshina, O.N.Ilinskaya, M.S.Kuyukina, A.B.Margulis, O.V.Senko // III International Conference on Microbial diversity: current situation, conversation strategy and biotechnological potential ICOMID 2008".- Perm-N.Novgorod.- 28 сентября-5 октября

2008,-P. 172-173.

7. Евтюгин, В.Г. Анализ сорбции клеток Lactobacillusplantarum и Escherichia coli в криогелях с привитыми зарядовыми группировками / В.Г.Евтюгин, А.Н.Шарифуллина, А.Б.Маргулис, В.И.Лозинский, Л.Г.Дамшкалн, А.И.Колпаков, О.Н.Ильинская // Сборник тезисов 12-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».- 2008,- С. 264.

8. Евтюгин, В.Г. Новый метод микробной биотехнологии: разделение бактерий в криогелях, содержащих алифатические цепи различной длины / В.Г.Евтюгин,

A.Н.Шарифуллина, А.Б.Маргулис // Тез. докладов VIII Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI пека».-Казань,- 2008,- С. 31.

9. Маргулис, А.Б. Токсические эффекты гексилрезорцина - индуктора анабиоза у бактерий: изменение поверхностных структур клеток про- и эукариот / А.Б.Маргулис,

B.Г.Евтюгин, М.А.Копылова, И.В.Ожиганова, Р.Э.Давыдов, О.Н.Ильинская // Материалы Всероссийской научной конференции «Изменяющаяся окружающая среда и устойчивое развитие регионов: новые методы и технологии исследований». -Казань, 19-22 мая 2009 г. С.146-149.

10. Evtugyn, V.G. Enzyme activity and cell morphology on transition to hypometabolism / V.G.Evtugyn, A.N.Sharifullina, V.V.Dmitriev, A.B.Margulis // XIV International Conference «Microbial Enzymes in Biotechnology and Medicine».- 5-7 June,

2009,-Kazan.-P. 120-121.

11. Еллиева, А.А. Изменение физиолого-биохимических свойств бактерий на ранних этапах перехода к гипометаболизму / А.А.Еллиева, И.С.Захаров, В.Г.Евтюгин // Материалы XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов».- Секция «Биология»,- Москва: МГУ.- 12-15 апреля

2010,- с. 166-167.

12. Евтюгин, В.Г. Свойства поверхности клеток определяют разделение бактерий на гидрофобизованных производных широкопористого криогеля поливинилового спирта I В.Г.Евтюгин, А.Б.Маргулис, О.В.Бушманова, Е.В.Никитина*, А.И.Колпаков, Л.Г.Дамшкалн**, В.И.Лозинский**, О.Н.Ильинская // Вестник КХТИ. - 2010. - № 9. -

C. 85-88.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Казанского университета

Тираж 100 экз. Заказ 110/11 420008, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел.: (843) 233-73-59,292-65-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Евтюгин, Владимир Геннадьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ответ микроорганизмов на стрессовые воздействия.

1.1.1. Переход бактерий в гипометаболическое состояние при старении культур. Физиолого-биохимические и морфологические изменения.

1.1.2. Индукция покоящегося состояния у бактерий аутоиндукторами группы алкилрезорцинов.

1.1.3. Типы клеточных поверхностей бактерий в связи с их адгезивными свойствами.

1.2. Криотропное гелеобразование.

1.2.1. Криогели, образующиеся при реакциях поликонденсации.

1.2.2. Криогели с физической сеткой полимерной фазы.

1.3. Области применения материалов на основе полимерных криогелей.

1.3.1. Криогели в биологии.

1.3.2. Разделение бактериальных популяций в модифицированных криогелях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты и материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования

2.1.2. Ауторегуляторные факторы микроорганизмов.

2.1.3. Полимерные криогели.

2.2. Микробиологические и биохимические методы анализа.

2.2.1. Оценка жизнеспособности бактерий при длительном инкубировании и голодании.

2.2.2 Тест К

§иге для определения числа жизнеспособных, но некультивируемых клеток.

2.3. Химические методы анализа.

2.3.1. Хроматографическое определение алкилрезорцинов.

2.4 Физические методы анализа.

2.4.1 Электронная микроскопия.

2.4.2 Элементный анализ проб культуральной жидкости.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Изменение морфологии клеток при переходе в гипометаболическое состояние.

3.2. Определение гексилрезорцина в суспензиях бактериальных клеток с помощью ВЭЖХ.

3.3. Физиологические изменения грамположительных и грамотрицательных клеток в условиях длительного культивирования в присутствии факторов анабиоза.

3.4. Изменение активности конститутивных ферментов в клетках стареющей популяции микроорганизмов и при действии гексшрезоргщна.

3.5. Изменение активности и биосинтеза /?-галактозидазы при действии гексилрезорцина.

3.6. Гель-хроматография клеток бактерий в ЛВС криогелях с привитыми алифатическими группировками.

3.7. Разделение по гидрофобности криогелями ЛВС клеток с предварительным внесением алкилрезорцинов.

3.8. Гель-хроматография клеток бактерий в агарозных криогелях с привитыми алифатическими группировками.

3.9. Гель-хроматография в агарозных криогелях с привитыми заряженными группировками.

3.10. Морфология гипометаболических клеток микроорганизмов после разделения в криогелях.

3.11. Элементный анализ клеток бактерий в гипометаболическом состоянии после разделения в криогелях.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Субпопуляции стареющих культур неспорообразующих бактерий: разделение в криогелях и морфо-физиологическая характеристика"

Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплена обширная информация о кардинальных перестройках метаболизма культур микроорганизмов при их длительном культивировании в питательной среде. Проблемы, связанные с изучением стареющей или отвечающей на воздействие стрессоров, например, таких как исчерпание в среде источников питания микробной популяции, являются предметом постоянного внимания исследователей. Следствием стресса является переход активно делящихся клеток к состоянию пролиферативного покоя или метаболического покоя у репродуктивно покоящихся форм. Анализ данных литературы позволяет сделать вывод о том, что гетерогенность стареющих культур неспорообразующих бактерий обусловлена разнообразием в популяции клеток различного физиологического состояния, таких как диссоциативные формы микроорганизмов, цистоподобные рефрактерные клетки [Дуда, Эль-Регистан], гипометаболические, некультивируемые формы [Kolter et al., 1993].

Пристальное внимание уделяется изучению внеклеточных ауторегуляторов, обеспечивающих межклеточную коммуникацию при формировании стрессового ответа микробной популяции, как единого организма. В аспекте контроля роста микробной популяции представляет интерес функции ауторегуляторов (аутоиндукторы анабиоза - факторы di), выявленных у ряда бактерий и- дрожжей, представленные алкилоксибензолами (АОБ) (Эль-Регистан, 1988; Батраков с соавт., 1993; Мулюкин с соавт., 1996). По достижении определенного концентрационного уровня АОБ влияют на переход микробной культуры к стационарной фазе и развитие в клетках гипометаболического, а затем анабиотического состояний, сопряженных с повышением устойчивости клеток к неблагоприятным и повреждающим воздействиям (Эль-Регистан, 1988; Демкина и др., 2000; Лойко и др., 2003).

Изменения условий среды обуславливают у популяций микроорганизмов мобилизацию потенциальных возможностей для формирования адаптивного ответа (Головлев, 1999; Феофилова и др., 2000). Следует отметить, что стратегия переживания микроорганизмами неблагоприятных воздействий не ограничивается образованием специализированных метаболически покоящихся форм (экзоспоры, цисты, акинеты). В последние годы большое внимание уделяется изучению способов переживания, неблагоприятных условий неспорообразующими бактериями за счет перехода их в состояние «вегетативного» покоя и образования цистоподобных форм [Мулюкин с соавт., 1997]. Однако остается еще недостаточно изученным вопрос о морфо-физиологических особенностях этих форм неспорообразующих микроорганизмов. Актуальным является выявление в стареющих микробных популяциях гипометаболических клеток, изучение свойств фракций клеток в этих гетерогенных популяциях, полученных с помощью разделения, в частности, методом гель-хроматографии на различных видах криогелей с высокой разрешающей способностью. Данные этих исследований могут оказаться полезными для выяснения механизмов возникновения морфотипов разного физиологического и биохимического статуса под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды.

Цель и задачи исследований. Целью работы является выявление особенностей диссоциации стареющей культуры, неспорообразующих бактерий с оценкой морфо-физиологических свойств субпопуляций и анализ хроматографического разделения клеток в соответствии с их физиологическим статусом в немодифицированных, гидрофобизованных и заряженных криогелях.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать морфотипы клеток и метаболическую активность стареющих популяции грамотрицательных {Micrococcus'luteus, Lactobacillus plantarum, Staphylococcus epidermidis 8P-A3) и грамположительных неспорообразующих бактерий {Escherichiacoli К12, Salmonella typhimurium ТА 100) в соответствии с морфотипами и метаболической- активностью и определить соотношение субпопуляций для различных бактерий в условиях длительного культивирования.

2. Выявить основные морфотипы, характеризующие субпопуляции в стареющих бактериальных культурах^ Методом газовой хроматографии, проанализировать возможность синтеза ауторегуляторных факторов -индукторов гипометаболизма^. в частности, гексилрезорцина, у исследуемых бактерий различной грампринадлежности:

3. Оценить, возможность! разделения смешанных, культур бактерий на индивидуальные в криогелях на основе поливинилового спирта, модифицированного гидрофобными алифатическими группировками.

5. Охарактеризовать физиолого-биохимические и морфологические параметры бактерий в? субпопуляции гипометаболических клеток, полученной после выделения гель-хроматографией на агарозных криогелях

Положения, выносимые на защиту: 1. Стареющие популяции включают субпопуляции вегетативных, гипометаболических и мертвых клеток в различных соотношениях в культурах различных видов: бактерий. Клетки гипометаболической субпопуляции характеризуются ультрамелкими.размерам, конденсированной цитоплазмой, измененным элементным- составом, снижением^ активности конститутивных ферментов, увеличением активности бета-галактозидазы и продукцией ауторегулятора - гексилрезорцина.

3. Немодифицированный- агарозный криогель эффективно разделяет гипометаболические и вегетативные клетки одной бактериальной культуры, гидрофобизация агарозы алифатическими группировками не влияет на эффективность разделения. Внесение зарядовых группировок увеличивает степень разделения субпопуляций.

Научная новизна. Впервые проведена» визуализация гипометаболических наноформ у бактерий (.М. 1и1ет, Ь. р1ап1агит 8Р-АЗ, Е. соЫ К12, ££ ергйегтгсИз, & 1урЫтипит ТА100) методами трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии; Впервые показано образование капсулоподобных структур у клеток, длительно инкубированных культур Е. соН. Предложен и разработан новый метод гель-хроматографии клеток бактерий в криогелях, открывающий» новые перспективы использования криотропного гелеобразования для решения вопросов, как фундаментальной микробиологии, так и биотехнологии. Впервые на, криогелях достигнуто эффективное разделение клеток стареющей популяции в соответствии с их метаболическим статусом: Выявлена возможность разделения клеток бактерий на криогелях по распределению гидрофобных зон и заряда на клеточной поверхности.

Практическая значимость. Выполненные исследования позволили получить следующие практически значимые результаты. 1. Разработан новый метод гель-хроматографии в криогелях, который, позволяет эффективно разделять клетки с разным метаболическим статусом- в монокультурах, а также клетки разных видов бактерий из смешанных культур. 2. Разработана методология анализа стареющих культур бактерий' и гипометаболического состояния^ наиболее характерного для бактерий в условиях естественной среды их обитания, составлен протокол испытаний. Изучение процессов перехода к гипометаболизму дает ценные данные для оптимизации биотехнологических процессов, как с известными микроорганизмами, так и с представителями еще не используемых видов бактерий в микробиологической промышленности.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Электронно-микроскопические исследования проводили на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г.Пущино-на-Оке) в лаборатории цитологии микроорганизмов""; в центральной биотехнологической службе (Zentrale Biotechnologishe Betrieb) Университета Юстуса-Либиха г.Гиссен, Германия**, и на кафедре зоологии беспозвоночных биолого-почвенного факультета Казанского (приволжского) федерального университета. Исследования на сканирующем' электронном микроскопе проводили в лаборатории Центра электронной микроскопии КФУ. Работа в течение 20042010гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета «Молекулярно-генетические, клеточные и популяционные основы функционирования живых систем».

Автор выражает благодарность зав.лабораторией цитологии микроорганизмов ИБФМ РАН д.б.н. В.И.Дуде за предоставленную возможность проведения измерений и участие в обсуждении результатов.

Автор выражает благодарность д-ру М.Хардту за возможность проведения измерений в университете Юстуса-Либиха университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Ш международной конференции "Микробное разнообразие: нынешняя ситуация, стратегия взаимодействия, биотехнологический потенциал" (1СОМГО 2008) (Пермь-Н.Новород-Пермь, 2008), 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино-на-Оке, 2008), Всероссийской научной конференции «Изменяющаяся окружающая среда и устойчивое развитие регионов: новые методы и технологии исследований» (Казань, 2009), XIV международной конференции «Ферменты микроорганизмов в биотехнологии и медицине» (Казань, 2009), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из которых одна в журнале «Микробиология», одна принята к печати и одно методическое руководство.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части - описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 123 наименования российских и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Евтюгин, Владимир Геннадьевич

выводы

1. Культуры неспорообразующих бактерий как грамположительных (.Micrococcus luteus, Lactobacillus plantarum, Staphylococcus epidermidis 8P-АЗ), так грамотрицаетльных {Escherichia coli K12, Salmonella typhimurium TAJ 00) через 180 суток культивирования состоят из вегетативных, гипометаболических и мертвых клеток, в соотношении 1:7:2, соответственно. При переходе к гипометаболизму зафиксировано уменьшение размеров клеток в 5 раз, переход палочковидных форм в кокковидные, а также снижение метаболической активности.

3. Смешанные популяции бацилл и стафилококков эффективно разделяются в криогелях поливинилового спирта, модифицированных гидрофобными группировками.

4. Агарозный криогель, модифицированный гидрофобными группировками, позволяет эффективно разделять стареющую культуру бактерий на субпопуляции вегетативных и гипометаболических клеток, вне зависимости от степени гидрофобности геля. Агарозный криогель с привитыми зарядовыми группировками давал возможность эффективно разделять гетерогенные субпопуляции в зависимости от величины заряда геля.

5. В субпопуляции гипометаболических клеток, характеризующихся утолщением клеточной стенки, конденсацией цитоплазмы и формированием капсулоподобной структуры, зафиксировано снижение активности конститутивных щелочной фосфатазы и протеиназ и увеличение активности индуцибельной бета-галактозидазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе анализа полученных результатов и сравнения их с литературными данными мы пришли к ряду заключений. Для микробных сообществ в процессе старения характерно образование диссоциативных форм, отображающих различные этапы стратегии переживания неблагоприятных условий. Часть популяции гибнет, однако большая часть клеток бактерий постепенно встает на путь переживания неблагоприятных условий за счет перестройки метаболизма и адаптивных изменений морфологии клеток. Перестройка метаболизма проявляется в виде инактивации части ферментативных систем, запуском синтеза ауторегуляторных триггерных молекул, изменением молекулярного состава, зарядовых и гидрофобных характеристик клеточной поверхности. Данные литературы подтвердились в ряде биохимических, хроматографических и микроскопических тестов.

Морфологические изменения направлены в сторону уменьшения размеров, и как следствие площади поверхности клеток бактерий. Также начинаются перестройки клеточной оболочки, утолщение клеточной стенки, появление защитных образований вокруг клеток бактерий. Для всех четырех культур микроорганизмов проведена электронно-микроскопическая визуализация изменений состояния клеток.

Все вышеперечисленные изменения послужили основой разделения клеток на субпопуляции в соответствии с физиологическим статусом и, на более поздних этапах культивирования, с переходом к гипометаболизму. Криогели, благодаря возможности формирования пор заданного диаметра путем криотропного гелеобразования, стали основой эффективного разделения субпопуляций. Гель-хроматографическое разделение использует изменение поверхности клеток в состоянии гипометаболизма. Неспецифическая сорбция вегетативных клеток бактерий в криогелях более чем на 70% превышала ее значение у гипометаболических форм.

Разработанный метод гель-хроматографического разделения клеток гетерогенных популяций бактерий оказался эффективным для клеток с различным строением поверхности, исключая один вид микроорганизмов, & ер!с1егт1сИз, который, ввиду образования плотных агрегатов клеток, забивал поры криогеля. Все остальные исследованные микроорганизмы не имели ограничений проходимости через криогель в виде неподходящего диаметра пор.

Анализ полученных путем гель-хроматографии фракций клеток микроорганизмов на разных этапах старения популяции выявил значительные изменения в морфологии клеток, как и предполагалось ранее. Данные в основном соответствовали литературным источникам, однако для исследованных видов микроорганизмов отсутствовало описание гипометаболических форм.

Полученные из культур разных возрастов фракции анализировали методами трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии. Визуализировали как клетки, не фракционированные на криогелях, так и обогащенные гипометаболическими формами фракции, полученные после гель-хроматографии. Анализ многочисленных ультратонких срезов выявил стабильные изменения клеток, перешедших в состояние гипометаболизма. Значительные изменения размера и формы клеток, а также появление капсулоподобных защитных образований описано для кишечной палочки впервые.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евтюгин, Владимир Геннадьевич, Казань

1. Camper, А. Effects of Motility and Adsorption Rate Coefficient on Transport of Bacteria through Saturated Porous Media Text. / A. Camper, J. Hayes, P. Sturman, W. Jones // Applied and environmental microbiology.-1993.- V. 59, №10.- P. 3455-3462.

2. Caro, A. Viability and Virulence of Experimentally Stressed Nonculturable S. typhimurium Text. / A. Caro, P. Got, J. Lesne, S. Binard, B. Baleux // Applied and environmental microbiology.- 1999.- V. 65, №7.- P. 3229-3232.

3. Cascone, M.G Cryogenic approaches in protein engineering / M.G. Casgone, M. Laus, D Ricci, R.S. del Guerra // J. Mater Sei. 1995 Vol. 6. - P.71.

4. Chorney, J. A colorimetric method for the determination of the proteolytic activity of duodenaj juice / J. Chorney, K.M. Tomarelli // J.Biochem 1947. Vol. 177. P.501-505.

5. Daganl, R. High-swelling collagen sponges produced by the cryotropic gelation method / R. Dagani // Chem. Eng. News. 1997. Vol. 75 - P.26.

6. Fujimura T. Electron microscopic studies of cross-linked Polyacrylamide cryogels / T. Fujimura, I. Kaetsu // Bioengineering. 1982. Vol. 37 - P. 102.

7. Fujimura T. Study of cryogels systems / T. Fujimura, I. Kaetsu // Bioengineering. 1987. Vol. 29 - P. 71.

8. Fukushima, D. Poly(vinyl alcohol) cryogels / D. Fukushima // J. Am. Oil Chem. Soc. Vol. 58.- 1981.- P.346.

9. Ishihama, A. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria Text. / A. Ishihama// Curr.Opin.Genet.Develop.- 1997.- V.7.- P.582-588.

10. Kaprelyants, A.S. Dormancy in non-sporulating bacteria / A.S. Kaprelyants, J.C. Gottschal, D.B. Kell // FEMS Microbiol Rev. 1993. Apr; 10(3-4) - P. 27185.

11. Kogure, K. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria / K. Kogure, U. Simudu, N. Taga // Can. J. Microbiol.- 1979.- V. 25,- P. 415-420.

12. Kolter, R. The stationary phase of bacterial life cycle Text. / R. Kolter, D. Siegle, A. Torno //Ann.Rev.Microbiol.- 1993.- V.47.- P. 855-874.

13. Kudela, V. Encyclopedia of Polymer Science and Engineering. Vol. 7 Text. / V. Kudela. New-York : Wiley.- 1987. - P. 783.lö.Kaetsu, I. Cryostructuration of polymer systems /1. Kaetsu, M. Kumakura, M. Yoshida // Biotechnology. 1979. Vol. 21 - P. 34-45.

14. Kaprelyants A.S. Do bacteria need to communicate with each other for growth? / A.S. Kaprelyants, D.B. Kell // Trends Microbiol.- 1996.- V.4.- P. 237241.

15. Kolter, R. The stationary phase of bacterial life cycle / R. Kolter, D. Siegle, A. Torno // Ann.Rev.Microbiol.- 1993.- V.47.- P. 855-874.

16. Konstantinova, N.R. Cryotropic gelation of ovalbumin solutions / N.R. Konstantinova, V.l. Lozinsky // Food Hydrocolloids Vol.11, №2,- 1997. -P.113-123.

17. Kudela, V. Encyclopedia of Polymer Science and Engineering. Vol. 7 / V. Kudela. New-York : Wiley.- 1987. - P. 783.

18. Kumakura M. Polymeric cryogels in bioseparation / M. Kumakura, I. Kaetsu // J. Appl. Biochem. 1983. vol. 5 - P. 165, P. 348.

19. Kumakura M. Polymeric technology / M. Kumakura, I. Kaetsu // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1983. Vol. 33B - P. 95.

20. Kuraakura M. Dynamics of Biopolymers /M. Kumakura, I. Kaetsu // J. Appl. Plym. Science 1983. Vol. 28-P. 375.

21. Kumakura M. Polymeric cryogels / M. Kumakura, I. Kaetsu // Polymer. J. -1984. Vol. 16-P. 113.

22. Kumakura M. Polymeric cryogels for cell immobilization / M. Kumakura, I. Kaetsu, T. Kobayashi // Enzyme Microb. Technol. 1984. Vol. 6 - P. 23.

23. Kumakura M. Cryotropic gel-formation / M. Kumakura // Polymer. Adv. Technol.-2001. Vol. 12-P. 415.

24. Lozinsky, V.l. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments / V.l. Lozinsky, F.M. Plieva // Enzyme Microb. Technol. Vol. 23.- № 3/4.- 1998. - P. 227-242.

25. Lozinsky, V.l. Study of cryostructuration of polymer systems. XII. Poly(vinyl alcohol) cryogels: influence of low-molecular electrolytes / V.I.Lozinsky,

26. V.Domotenko, A.L.Zubov, LA.Simenel // J. Appl. Polym. Vol. 61, №11 .-1996.-P.1991-1998.

27. Lozinsky, V.I. Study of cryostructuration of polymer systems. XVTI. Poly (vinyl alcohol) cryogels: dynamics of the cryotropic gel-formation / V.I.Lozinsky, L.G. Damshkaln // J. Appl. Polym. Sci. Vol. 77, №9.- 2000.- P. 2017-2023.

28. Lozinsky, V.I. Study of cryostructuration of polymer systems. XXI. Cryotropic gel-formation of the water-maltodextrin systems / V.I. Lozinsky, L.G. Damshkaln, C.R.T. Brown, I.T. Norton // J. Appl. Polym. Sci. Vol. 83, №8.-2002.-P. 1658-1667.

29. Lozinsky, V.I. Swelling behavior of poly(vinyl alcohol) cryo-gels employed as matrices for cell immobilization / V.I. Lozinsky, A.L. Zubov, E.F. Titova. // Enzyme Microb. Technol.- Vol. 18, № 6.- 1996.-P. 561-569.

30. Lozinsky, V.I. The potential of polymeric cryogels in bioseparation / V.I. Lozinsky, F.M. Plieva, I. Yu. Galaev, B. Mattiasson // Bioseparation Vol. 10, №4-5.- 2002.- 163-188.

31. Masuda, K. Distribution and chemical characterization of regular arrays in the cell walls of strains of the genus Lactobacillus Text. / Masuda K. and T. Kawata // FEMS Microbiol.- 1983.- V. 20. P. 145-150.

32. Roszak, D.B. Survival strategies of bacteria in the natural environment / D.B. Roszak, R.R. Colwell // Microbiol. Rev.- 1987.- V.51, №3.- P.365-379.

33. Sâra, M. S-layer proteins Text. / M. Sara, U. B. Sleytr // Bacteriol. 2000. -P.859-868.

34. Smith, I. / I. Smith, R. Slepecky, P. Setlow (ed.). // American Society for Microbiology, Washington, D.C.- 1989.

35. Stammen, J.A. Effect of polymer architecture on the performance in bioseparation process / J.A. Stammen, S. Williams, D.N. Ku, R.E.Guldberg // Biomaterials.- Vol. 22.- 2001.- R 799.

36. Sutani K. Physico-chemical properties of cryotropic gel-formation / K. Sutani, I. Kaetsu, K Uchida // Radiat. Physical Chem., 2001. Vol. 61. - P. 49.

37. Suzuki, E. Bull. Chemical Science / E. Suzuki, N. Nagashima // Chemical Science.- Vol. 55.- 1982. P.44.

38. Tanaka, T. In structure and Dynamics of Biopolymers // T. Tanaka. Dordrecht : Martinus Nijhoff.- 1987. - P. 237.

39. Savina, I. N., Graft polymerization of acrylic acid onto macroporous Polyacrylamide gel (cryogel) initiated by potassium diperiodatocuprate / I. N. Savina, I. Y. Galaev, B. Mattiasson, // Polymer 2005,46, 9596 9603.

40. Svec, F. New designs of macroporous polymers and supports: from separation to biocatalysis / F. Svec, J. M. Frechet // Science 1996, 273, 205 211

41. Sonnenfeld, E.M. Structural differentiation of the Bacillus subtilis 168 cell wall / E.M. Sonnenfield, T.J. Beveridge, R.J. Doyle, (1985) // Can. J. Microbiol., 31, 875-877.

42. Stammen, J.A. Effect of polymer architecture on the performance in bioseparation process / J.A. Stammen, S. Williams, D.N. Ku, R.E.Guldberg // Biomaterials. 2001. Vol. 22 - P. 799.

43. Stolp, H. Bacteriolysis / H. Stolp, M.P. Starr // Annu. Rev. Microbiol.- 1965 -V. 19.-P. 79-105.

44. Strancar, A., CIM Convective Interaction Media: A New Stationary Phase for Biochromatography / A. Strancar, A. Podgornik, M. Barut // BlOforum Int. 2002,3, 152-153.

45. Suzuki, M. An approach to artificial muscle using polymer gels formed by micro-phase separation./M. Suzuki, O. Hirasa// Adv. Polym. Sci. 110, pp. 241-261.//Adv. Polym. Sci. 1993. V. 110. P. 241.

46. Yoshi, F. The influence of freezing of reacting mass on the properties of cross-linked gels // Appl. Biochem. Biotechnol. 1983. Vol. 8 - P. 115.

47. Батраков, С.Г. Тирозол — ауторегуляторный фактор dl Saccharomyces cerevisiae / С.Г. Батраков, Г.И. Эль-Регистан, Н.Н. Придачина, В.А. Ненашева, А.Н. Козлова, М.Н. Грязнова, И.Н. Золотарева // Микробиология.- 1993.- Т. 62, № 4.- С. 633-638.

48. Баукова, Е.Ю. Криоденатурация коллагена / Е.Ю. Баукова и др. // Высокомолекулярные соединения. 1993. Т. 35А- С.233.

49. Богданова, Т.И. Влияние состава среды и условий культивирования на спорообразование хемолитотрофных бактерий Текст. / Т.И. Богданова, А.Л. Мулюкин, И.А. Цаплина, Г.И. Эль-Регистан, Г.И. Каравайко // Микробиология.- 2002.- Т.71, №2.- С.187-193.

50. Бошнаков, Р.Х. Дифференциальная экспрессия генов в культивируемых и некультивируемых формах Salmonella typhimurium / Р.Х. Бошнаков, Ю.М. Романова, Н.А. Зигангирова, А.Л. Гинцбург // Вестник РАМН.- 2001.-№ 11 .- С.8-12.

51. Бутова, С.Н. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ Текст. / С.Н. Бутова,

52. И.А. Типисева, Г.И. Эль-Регистан. Под общей редакцией И.М. Грачевой // М.- Элевар.- 2003.- 554с.

53. Галаев, И.Ю. // Успехи химии. 1995. Т. 64. № 5. С. 505.

54. Головлев, ЕЛ. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / E.JI. Головлев // Микробиология.-1999.- Т.68, №5.- С.623-631.

55. Головлев, E.JI. Другое состояние неспорулирующих бактерий. / E.JI. Головлев // Микробиология.- 1998.- Т.67, №6.- С.725-735.

56. Головлев, ЕЛ. Метастабильность фенотипа у бактерий I E.JI. Головлев // Микробиология.- 1998.- Т.59, №2.- С.149-155.

57. Демкина, Е.В. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis / E.B. Демкина, B.C. Соина, Г.И. Эль-Регистан, Д.Г. Звягинцев // Микробиология.- 2000.- Т. 69, №3.- С. 377-382.

58. Иржак В.И. Сетчатые полимеры / В.И. Иржак, Б.А. Розенберг, Н.С. Ениколопян Москва: Наука, 1974. - 248 С.

59. Капрельянц, A.C. Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных мембранах под действием фенольных липидов / A.C. Капрельянц, М.К. Сулейменов, А.Д. Сорокина // Биол. Мембраны.- 1987.- Т. 4, № 3.- С. 254-261.

60. Куприянова-Ашина, Ф.Г. Действие мембранотропных физиологически активных веществ на рост культуры Saccharomyces cerevisiae Текст. / Ф.Г.

61. Куприянова-Ашина, А.И. Колпаков, А.Ю. Луцкая, Г.И. Эль-Регистан, А.Н. Козлова, М.В. Дужа//Микробиология.- 1995.- Т.64, №5.- С.596-600.

62. Лозинский, В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта / В.И. Лозинский // Успехи химии. Т67, №7.-1998.-С. 641-655.

63. Лозинский, В.И. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. IV. Обзор литературных данных / В.И. Лозинский, A.C. Вакула, А.Л. Зубов // Биотехнология. №4.- 1992. - С. 5-14.

64. Лозинский, В.И. Термочувствительные криогели на основе сшитого поли(МДЧ-диэтил-акриламида) / В.И. Лозинский, Е.А. Калинина, В.Я. Гринберг, Н.В. Гринберг, В.В. Чупов, H.A. Платэ // Высокомолекул. соед. -39А, №12.- 1997.-С. 1972-1978.

65. Лозинский, В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и применение / В.И. Лозинский // Дис. докт. хим. Наук М.: ИНЭОС РАН.- 1994. - 682с.

66. Лозинский, В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения / В.И. Лозинский // Успехи химии.- Т.71, №6.- 2002 С. 559-585.

67. Луста, К.А. Иммобилизация клеток E.coli в макропористые криогели на основе полиакриламида / К.А Луста, Н.Г. Старостина, Н.Б. Горкина и др. // Прикл. биохим. микробиол. 1988. Т.24, №4. С. 504-513.

68. Лянгузова, М.С. Роль МАРК- и Р13К-зависимых сигнальных каскадов в регуляции пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши / М.С. Лянгузова / С. Петербург 2007

69. Милько, Е. С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации / Е.С. Милько, Н.С. Егоров // МГУ. Электронный ресурс. -1991.- С. 143.- Режим доступа : www.chronos.msu.ru/RREPORTS.htm Дата доступа: 15.02.2009.

70. Мулюкин, А.Л. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus / А.Л. Мулюкин, А.Н. Козлова, А.С. Капрельянц, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.- 1996.- Т. 65, №1.- С. 20-25.

71. Мулюкин, А.Л. Образование покоящихся форм Bacillus subtilis и Micrococcus luteus / А.Л. Мулюкин, К.А. Луста, М.Н. Грязнова, А.Н. Козлова, М.В. Дужа, В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология,-1996.- Т. 65, №6.- С. 782-789.

72. Мулюкин, А.Л. Образование покоящихся форм у неспорообразующих микроорганизмов / А.Л. Мулюкин // Автореферат дисс. канд. биол. наук. М.: Ин-т микробиологии РАН.- 1998.- 26 с.

73. Николаев, Ю. А. Два новых внеклеточных адаптогенных фактора Escherichia coli К12 Текст. / Ю.А. Николаев // Микробиология.- 1997.- Т. 66, №6.- С. 785-789.

74. Николаев, Ю.А. Сравнительное изучение двух новых внеклеточных протекторов, образуемых клетками Escherichia coli при повышенной температуре / Ю.А. Николаев // Микробиология.- 1997.- Т. 66, №7.- С. 790795.

75. Осипов Г.А. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava / Г.А. Осипов, Г.И. Эль-Регистан, В.А. Светличный, А.Н. Козлова, В.И. Дуда, А.С. Капрельянц, В.В. Помазанов // Микробиология.- 1985.- Т. 54, №2.- С. 186-190.

76. Папков, С.П. Студнеобразное состояние полимеров / С.П. Папков. -Москва: Химия.- 1974 — 256 с.

77. Плиева, Ф.М. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. VI. Биоаффинные сорбенты на основе сверхмакропористого носителя для работы с вирусными частицами / Ф.М. Плиева, Е.И Исаева, В.И Лозинский // Биотехнология 1998. №5 - С. 3237.

78. Потехина Н.В. Тейхоевые кислоты актиномицетов и других грамположительных бактерий Текст. / Н.В. Потехина // Успехи биол.хим.-2006.- Т. 46.- С. 225-278.

79. Роговина Л.З. Основы криохимии полимеров / Л.З. Роговина, Г.Л. Слонимский // Успехи химии. 1974. Т 43 - С. 342-351.

80. Рогожин C.B. Нековалентное криоструктурирование в полимерных системах / С.В.Рогожин, В.И.Лозинский, Е.С.Вайнерман, Л.В.Домотенко, А.М.Мамцис, С.А.Иванова, М.И.Штильман, В.В.Коршак // Докл. АН СССР 1984. Т.278, №1 - С. 129-133.

81. Романова, Л. В. Некультивируемые формы Francisella tularensis Текст. / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, С.О. Водопьянов, С.Р. Саямов // Журнал микробиологии.- 2000.- №2.- С. 11-15.

82. Романова, Ю. М. Генетический контроль индукции некультивируемого состояния у патогенных бактерий Текст. / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Микробиология.- 1996.- № 3.- С. 16-18.

83. Романова, Ю.М. / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Молекулярная генетика.- 1993.- №6.- С.34-37.

84. Рихтер, М. Избранные методы исследования крахмала / М. Рихтер, 3. Аугустас, Ф. Ширбаум. Москва: Пищевая промышленность, 1975. - 65 С.

85. Светличный, В.А. Изучение содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava / В.А. Светличный, А.К. Романова, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.-1986.-Т. 55, № 1.- С. 55-59.

86. Слабова, О.И. Окисление водорода иммобилизованными в силикагель и криосиликагель клетками олиготрофных бактерий / О.И. Слабова, Д.И. Никитин, В.И. Лозинский, В.К. Кулакова, Е.С. Вайнерман, С.В. Рогожин // Микробиология. 1988. Т.57,№ 6 - С. 940-944.

87. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, М.А. Василевская // Киев.- Наукова Думка.- 1982.- 280 с.

88. Филиппова, О.Е. Высокомолекулярные соединения / О.Е. Филиппова. Б. м.: Б. и..- 2000. - 42 С.

89. Хохлов, А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы / А.С. Хохлов // М.- Наука.- 1988.

90. Черепнев, В.Г. Оценка токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на клетки Escherichia coli К 12 методом проточной цитофлуориметрии / В.Г. Черепнев, Б.М. Курененко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова // Микробиология 2007- Т.76.- N3 — С.1-6.

91. Щетинникова, М.С. Влияние алкилрезорцинов на состав и численность микробного сообщества Текст. / М.С.Щетинникова, А.С.Асафова, А.Б.Маргулис, О.Н.Ильинская // Материалы XIV

92. Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов».- Секция «Биология».- Москва: МГУ.- 11-14 апреля 2007.- С. 123-124.

93. Шиц А.А. Энцилопедия полимеров / А.А. Шиц // Советская энциклопедия, Москва 1972. - 594.

Информация о работе

Евтюгин, Владимир Геннадьевич
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Субпопуляции стареющих культур неспорообразующих бактерий: разделение в криогелях и морфо-физиологическая характеристика - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Субпопуляции стареющих культур неспорообразующих бактерий: разделение в криогелях и морфо-физиологическая характеристика - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы