Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Восстановление оксидов углерода иммобилизованными клетками термофильного ацетогена Thermoanaerobacter kivui

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Рябоконь, Анна Монолитовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Двухстадийный процесс получения уксусной кислоты с помощью дрожжей и аэробных бактерий.

1.1. Синтез уксусной кислоты с помощью свободных клеток аэробных бактерий.

1.2. Получение уксусной кислоты с помощью иммобилизованных аэробных уксуснокислых бактерий.

2. Анаэробные гомоацетогенные бактерии.

2.1. Общая характеристика гомоацетогенных бактерий.

2.2. Метаболизм гомоацетогенных бактерий.

2.2.1. Автотрофный путь фиксации СОг Вуда-Льюнгдала.

2.2.2. Биохимия образования ацетата.

2.2.3. Энергетика образования ацетата.

2.3. Ферментация органических и газовых субстратов гомоацетогенными бактериями.

2.3.1. Синтез уксусной кислоты из органических субстратов гомоацетогенными бактериями.

2.3.2. Ферментация целлюлозных материалов в ацетат бактериальными ассоциациями, включающими гомоацетогенные бактерии.

2.3.3. Получение Ca-Mg-ацетата с помощью гомоацетогенных бактерий.

2.3.4. Восстановление оксидов углерода до уксусной кислоты гомоацетогенными бактериями.

3. Иммобилизованные клетки в биотехнологии.

3.1. Методы иммобилизации клеток микроорганизмов.

3.2. Биологические свойства иммобилизованных клеток.

3.3. Получение уксусной кислоты с использованием иммобилизованных клеток анаэробных бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Восстановление оксидов углерода иммобилизованными клетками термофильного ацетогена Thermoanaerobacter kivui"

В последние годы большое внимание привлекают биотехнологические процессы, основанные на использовании микробных клеток, способных синтезировать различные химические соединения. Преимуществами таких процессов являются мягкие условия их осуществления, специфичность, возможность использования альтернативных источников сырья.

Уксусная кислота является важнейшей органической кислотой, получаемой в промышленности в крупных масштабах. Она используется при производстве резины, пластмасс, ацетатных волокон, фармацевтических препаратов, инсектицидов и т.д., а также в пищевой промышленности. В промышленном масштабе уксусная кислота производится путем энергоемкого двухстадийного химического синтеза при каталитическом карбонилировании метанола (процесс Монсанто). Пищевую уксусную кислоту (уксус) получают ферментативным путем из этанола при участии аэробных мезофильных бактерий из рода Acetobacter. В свою очередь, этанол получается при ферментации углеводсодержащих сред культурами дрожжей. Теоретический выход продукта - уксусной кислоты - из глюкозы при осуществлении такого процесса весьма низкий и составляет 67%.

Расширение сырьевой базы для производства уксусной кислоты за счет привлечения новой группы литотрофных микроорганизмов представляется весьма перспективным. Гомоацетогенные бактерии - это микроорганизмы, которые образуют ацетат как единственный или главный восстановленный продукт при автотрофном и гетеротрофном росте. Наблюдаемая стехиометрия ферментаций гомоацетогенных литотрофных бактерий предполагает почти 100%-ный выход при использовании в качестве субстратов органических соединений или газов - Н2, СОг и СО. Потребности

России в уксусной кислоте за счет микробиологического синтеза оцениваются в объеме около 20 тыс. тонн в год.

Создание экологически чистого производства, которое наряду с получением целевых продуктов позволяет утилизировать вредные выбросы различных производств, как-то попутный газ, нефтезаводской газ и т.д., является весьма актуальной задачей. Следует также отметить, что в настоящее время отсутствуют промышленные способы конверсии СО2 в какие-либо полезные продукты.

Однако ни один из описанных в настоящее время ацетогенов не может продуцировать более 0,8 М (48 г/л) уксусной кислоты. Выделение уксусной кислоты из ферментационного раствора представляет собой довольно дорогостоющую задачу. Поэтому перспективным представляется использование ацетатсодержащих растворов после микробных синтезов для получения ценных продуктов, например аминокислоты лизин, во второй стадии.

За рубежом промышленный потенциал гомоацетатных ферментации видят в использовании ацетатсодержащих растворов для получения Ca-Mg-ацетатов - нового экологически чистого антиобледенителя.

Эффективность процессов с использованием микробных клеток существенно повышается при их иммобилизации. Однако создание стабильной биокаталитической системы с нестабильным началом - бактериальными клетками - не до конца решенная задача, и таких процессов в настоящее время очень мало.

Наиболее перспективным методом иммобилизации живых микробных клеток можно считать включение в макропористую полимерную гелевую матрицу. В настоящее время широкое применение в качестве носителя получили альгинатные и каррагинановые гели. Но их механическая прочность и термостабильность недостаточны для длительного использования. Кроме того, природные полисахариды труднодоступны и имеют сравнительно высокую стоимость.

Весьма перспективным представляется использование криогелей поливинилового спирта (ПВС). ПВС - дешевый синтетический полимер, каждая его марка строго стандартизована. Криогели ПВС нетоксичны, химически и микробиологически стабильны, механически прочны при температурах до 70°С и в диапазоне рН от 2 до 10.

Целью настоящей работы явилось создание стабильной биокаталитической системы восстановления газовых субстратов - СОг и СО - в уксусную кислоту на основе иммобилизованных клеток анаэробной термофильной гомоацетогенной бактерии Thermoanaerobacter kivui.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рябоконь, Анна Монолитовна

выводы

1. Проведен скрининг гомоацетогенных микроорганизмов, способных к хемолитотрофному росту на газовых субстратах. Выбран анаэробный термофил Thermoanaerobacter kivui, обладающий наибольшей степенью конверсии субстрата. Данная культура, единственная из всех исследуемых, способна к росту на строго минеральной среде, не содержащей ростовых факторов.

2. Создана стабильная биокаталитическая система восстановления оксидов углерода до ацетата с близкой к 100% конверсией на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток анаэробного термофильного гомоацетогена Thermoanaerobacter kivui. Полученный биокатализатор может быть использован многократно, не требует создания низкого редокс потенциала в системе и нечувствителен к низким (до 0,1%) концентрациям кислорода в газовых субстратах. Катализатор обладает высокой операционной стабильностью при эксплуатации и хранении в течение нескольких лет.

3. Реализован непрерывный процесс восстановления двуокиси углерода в проточном реакторе колонного типа. Показано, что продуктивность непрерывного процесса более, чем в 20 раз превышает продуктивность периодического процесса.

4. Проведены ферментации с иммобилизованными клетками при повышенных парциальных давлениях газовых субстратов в периодическом реакторе. Показано, что повышение парциального давления газовых субстратов, улучшая массоперенос газов в системе, увеличивает максимальную скорость синтеза и объемную продуктивность процесса.

5. Показано, что свободные и иммобилизованные клетки Т. kivui способны использовать в качестве источника углерода окись углерода. Добавление СО к смеси газов H2/CO2 приводит к повышению конечной концентрации уксусной кислоты в ферментационной среде на 30%.

6. Осуществлен синтез 13С-уксусной кислоты из 13СОг с использованием

1 ^ иммобилизованных клеток Т. kivui. Обогащение продукта изотопом С увеличивается к каждому последующему циклу синтеза.

7. Показана принципиальная возможность использования ацетатсодержащих сред, полученных в результате ферментации газовых субстратов иммобилизованными клетками Т. kivui, для синтеза L-лизина бактериями С. glutamicum. Предложена модифицированная среда для последовательного культивирования бактерий Т. kivui и С. glutamicum.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

За последние 15 лет из самых разнообразных источников были выделены и в различной степени охарактеризованы свыше 30 из 40 известных видов ацетогенов, принадлежащих к 12 родам. Они способны к хемолитотрофному росту на Н2/СО2, метилотрофному и хемоорганотрофному росту. Главным, и часто единственным, продуктом ферментаций является ацетат. Изучена схема автотрофной фиксации оксидов углерода в ацетат у гомоацетогенных бактерий. Исследуется роль отдельных ферментов пути Вуда-Льюнгдала и механизм их действия.

Для понимания экономического потенциала данной группы микроорганизмов проводятся ферментации на различных субстратах, определяются параметры, положительно влияющие на процесс. Показано, что поддержание рН на оптимальном уровне является одним из основных факторов повышения концентрации ацетата в растворе и увеличения продуктивности системы. Используются также мутантные и генно-инженерные кислотоустойчивые штаммы гомоацетогенов.

Так как гомоацетогенные бактерии характеризуются невысоким выходом биомассы, их иммобилизация позволяет существенно повысить клеточную плотность в реакторе, что приводит к увеличению объемной продуктивности процесса. Для иммобилизации гомоацетогенов, в основном, используется метод включения клеток в матрицу носителя и метод мембранной фиксации клеток.

Проводится поиск новых дешевых субстратов для гомоацетогенных ферментаций. Использование совместного культивирования гомоацетогенов и молочнокислых бактерий позволяет получать ацетат из молочной сыворотки; целлюлолитические бактерии разлагают целлюлозосодержащее сырье для ацетогенов.

Но промышленное получение уксусной кислоты с помощью гомоацетогенных бактерий лимитируется невысокой концентрацией продукта в конечном ферментационном растворе, и его выделение представляет собой отдельную сложную задачу. В настоящее время гомоацетогенные бактерии рассматриваются зарубежными исследователями с точки зрения перспективы их использования для получения Ca-Mg-ацетата - экологически чистого, не вызывающего коррозию реагента-антиобледенителя.

Несмотря на то, что в настоящее время не существует крупномасштабного промышленного производства, включающего гомоацетогенные культуры, различные представители этой физиологической группы бактерий рассматриваются как "промышленные организмы".

Целью настоящей работы являлось создание стабильной биокаталитической системы восстановления газовых субстратов - СОг и СО - в уксусную кислоту на основе иммобилизованных клеток анаэробной термофильной гомоацетогенной бактерии Thermoanaerobacter kivui.

Задачи исследования заключались в следующем: - получение высокоэффективного технологичного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток Т. kivui; исследование термофильного ацетогенеза из углекислого газа и водорода в условиях периодического и непрерывного культивирования иммобилизованных клеток Т. kivui и факторов, регулирующих эти процессы; изучение возможности использования СО в качестве субстрата для синтеза ацетата свободными и иммобилизованными клетками Т. kivui; демонстрация возможности применения биокаталитической системы восстановления оксидов углерода для получения ценных продуктов - аминокислоты L-лизина и 13С-уксусной кислоты.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клетки микроорганизмов.

Объектами исследования служили термофильные и мезофильные гомоацетатные бактерии Clostridium thermoautotrophicum Z-99 [162] и типовые штаммы из коллекции культур лаборатории реликтовых микробных сообществ ИНМИ РАН: Clostridium thermoautotrophicum 1974, Thermoanaerobacter kivui 2030, Sporomusa sphaeroides 2875, Acetobacterium woodii 1030, Acetobacterium wieringae 1911.

Для синтеза лизина использовали культуру бактерии Corynebacterium glutamicum, ауксотрофную по гомосерину.

2. Состав сред и условия культивирования микроорганизмов.

С. thermoautotrophicum, штаммы Z-99 и DSM 1974 культивировали при 55°С на среде Пфеннига (г/л): NH4CI - 0,33; КН2Р04 - 0,33; MgCl2x6H20 - 0,33; NaHC03 - 2,0; Na2Sx9H20 - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,4; раствор микроэлементов по Липперту - 1 мл/л [110].

Т. kivui культивировали при 65°С на среде следующего состава (г/л): К2НРО4- 0,22; КН2Р04 - 0,22; NaH2P04x2H20 - 4,5; Na2HP04xl2H20 - 6,1; NH4C1 - 0,31; (NH4)2S04 -0,22; NaCl - 0,45; MgS04x7H20 - 0,09; CaCl2x2H20 - 0,006; FeS04x7H20 - 0,002; цистеин-гидрохлорид - 0,5; Na2Sx9H20 - 0,5; раствор микроэлементов - 10 мл/л [37].

A. woodii и A. wieringae культивировали при 30°С на среде (г/л): NE^Cl - 1,0; MgS04x7H20 - 0,1; К2НР04 - 0,45; КН2Р04 - 0,33; цистеин-НС1 - 0,5; Na2Sx9H20 - 0,5; ЫаНСОз - 1,0; пантотенат Са - 1,0; дрожжевой экстракт - 2,0; раствор микроэлементов - 1 мл/л [17].

S. sphaeroides культивировали при 37°C на среде следующего состава (г/л): К2НРО4 - 0,348; КН2Р04 - 0,227; NH4CI - 0,5; MgS04x7H20 - 0,5; СаС12х2Н20 - 0,25; NaCl - 2,25; FeS04x7H20 - 0,002; дрожжевой экстракт - 2,0; казитон - 2,0; NaHC03 - 4,0; NaHSe03 -10"7 М; L -цистеин • НС1 - 0,3; Na2Sx9H20 - 0,3; раствор витаминов по Волину - 10 мл/л [163]; микроэлементы - 1 мл/л [43].

С. glutamicum культивировали при 30°С на среде (г/л): глюкоза - 40; (NEL^SC^ - 15; КН2РО4 - 0,5; MgS04x7H20 - 0,3; дрожжевой экстракт - 10; рН 7,2-7,6.

Стерилизацию сред проводили автоклавированием в течение 30 мин. при 0,5 атм.

Для выращивания бактерий (кроме С. glutamicum) применяли технику строго анаэробного культивирования [162]. Посевным материалом служила культура, выращенная на смеси газов Н2/СО2. Объем вносимого посевного составлял 10% (об/об). Культивирование в атмосфере Н2/СО2 (80/20) осуществляли при нормальном давлении в сывороточных бутылках на 540 мл с герметичным затвором, объем жидкой фазы - 100 мл. Все культуры выращивали при оптимальной для данной бактерии температуре без перемешивания. Заполнение сосудов газовой смесью проводили путем продувки газов через среду в течение 10 мин. Для удаления следов кислорода газовую смесь пропускали через колонку с нагретым до 350°С медным катализатором.

При выращивании культуры Т. kivui на средах, содержащих СО, его вносили шприцем непосредственно в сывороточную бутылку.

3. Массовое культивирование бактерий Т. kivui.

Для получения биомассы бактерии культивировали в строго анаэробных условиях в 6,4 л ферментере "Biostat" (Германия). Параметры культивирования были следующие: скорость непрерывной подачи газовых субстратов в ферментер - 100 мл/мин; рН автоматически поддерживали на уровне 6,4 подтшровкой 5N NaOH; температура культивирования 65°С; перемешивание - 400 об/мин. Газовую смесь (Н2/СО2 80/20) перед подачей в ферментер освобождали от следов 02. Среду после автоклавирования охлаждали до 65°С под током N2. За ростом культуры следили по изменению оптической плотности при 600 нм. В середине экспоненциальной фазы роста клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин и использовали в экспериментах с клеточными суспензиями или для иммобилизации.

4.Получение иммобилизованных клеток и их культивирование.

4.1. Иммобилизация клеток бактерий в криогель поливинилового спирта.

Для иммобилизации влажную клеточную биомассу смешивали с 10% водным раствором поливинилового спирта (ПВС) в соотношении 1:10 (по весу) и суспендировали до получения однородной массы. Гомогенизированную смесь при помощи дозирующего насоса подавали в колонну, заполненную гидрофобной жидкостью (толуолом) с температурой -20°С, для получения гранулированной формы криогеля. Отрицательное значение температуры в колонне поддерживалось с помощью ультракриостата МК 70 (MLW). По окончании гранулирования замороженные гранулы средним диаметром 2-3 мм извлекали из сборника, находящегося в нижней части колонны, промывали от остатков толуола охлажденным (-40°С) пентаном и помещали в морозильную камеру при температуре -20°С на 12-16 часов, затем размораживали при +4°С в течение 5-6 часов [138]. Полученные гранулы криогеля ПВС с включенными клетками тщательно промывали физиологическим раствором и помещали в реактор.

4.2. Культивирование иммобилизованных клеток С. glutamicum.

Культивирование проводили при 30°С в колбах (750 мл) с 25 мл среды и 10% (по весу) гранул катализатора. Число оборотов качалки - 100 об/мин, время ферментации - 24 часа.

4.3. Культивирование иммобилизованных клеток Т. kivui в периодическом режиме при нормальном и повышенном давлении газовых смесей.

Ферментацию в периодических условиях проводили в сывороточных флаконах объемом 540 мл со 100 мл минеральной среды указанного выше состава. В среду аэробно вносили 2 г катализатора, герметично закрывали и затем заменяли газовую фазу на рабочую смесь Н2/СО2 (80/20). При использовании в качестве одного из субстратов окиси углерода, его вносили шприцем в виде чистого газа.

Ферментацию проводили при 65°С без перемешивания. Рабочую газовую смесь добавляли во флаконы до общего давления 1 атм ежедневно. Периодически (через 2-3 суток) отбирали пробы для определения рН и концентрации уксусной кислоты (ацетата). Перед заменой минеральной среды в реакторах на новую катализатор промывали стерильным физиологическим раствором.

Избыточное давление создавали с помощью специально сконструированной в Институте микробиологии РАН установки, позволяющей создавать давление до 16 атм.

4.4. Культивирование Т. kivui в периодическом режиме с рН-статированием и непрерывной подачей газовых субстратов.

Условия культивирования были те же, что и для культивирования свободных клеток, за исключением скорости перемешивания - 60 об/мин. Очистку газовой смеси от следов кислорода не проводили. Ферментер содержал 1,1 или 3,0 литра минеральной среды в различных опытых и 35 г катализатора.

4.5. Непрерывный синтез уксусной кислоты из газовых субстратов в проточном колонном реакторе клетками Т. kivui.

В непрерывном процессе был использован термостатируемый проточный колонный реактор объемом 60 мл, содержащий 30 г катализатора. Проток газовой смеси Н2/СО2 (80/20) осуществлялся со скоростью 150 мл/мин через входные отверстия, расположенные в нижней части колонки. Скорость подачи минеральной среды варьировали с помощью перистальтического насоса от 5,3 до 49,5 мл/ч.

5. Хранение иммобилизованных клеток.

По окончании экспериментов иммобилизованные клетки отделяли от культуральной среды декантированием, промывали 3 раза стерильным физиологическим раствором, помещали в свежую минеральную среду (или физиологический раствор) и герметично закрывали. Затем проводили замену газовой фазы во флаконах на N2. Хранили катализатор при температуре +4°С.

6. Аналитические методы.

6.1. Определение роста культуры.

Рост культуры определяли по изменению оптической плотности при 600 мкм на спектрофотометре "Specol-10" (Германия) с использованием 1- см кювет.

6.2. Определение рН и Eh среды.

Eh и рН минеральной среды определяли потенциометрически сразу же после отбора проб на ионометре ЭВ-74 с использованием платинового и стеклянного электродов, соответственно, электрод сравнения - каломельный.

6.3. Определение клеточного белка.

Клеточный белок определяли по методу Лоури [164].

6.4. Хроматографический метод определения уксусной кислоты (ацетата).

Ацетат в пробах культуральной жидкости определяли на газовом хроматографе Chrom-5 (Чехословакия) с пламенно-ионизационным детектором. Условия разделения: стеклянная колонка 0,9 м х 3 мм, заполненная Chromosorb-101 (Sigma, США). Газ-носитель - аргон, расход - 40 мл/мин, температура испарителя и детекторов 200°С, расход водорода - 25 мл/мин, температура колонки - 160°С. Пробу культуральной жидкости перед определением ацетата центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин для отделения клеток. Прозрачный супернатант подкисляли концентрированной НС1 до рН 2, после чего 2 мкл образца вводили в хроматограф.

6.5. Определение состава газовых субстратов Н?, СО2 и СО и расчет стехиометрических коэффициентов.

Процентное содержание Н2, СО2 и СО в газовой фазе определяли на газовом хроматографе "Chrom-5" (Чехословакия) с катарометром. Сорбент - активированный уголь; температура 25°С; газ-носитель - аргон.

Расчет стехиометрических коэффициентов проводили по данным состава газовой фазы и концентрации ацетата в жидкой фазе. Концентрации газов рассчитывали по формуле Менделеева-Клапейрона. Количество растворенного СОг определяли по формуле Гендерсона-Хассельбаха: lg[HC03"] = рН - рК + lgoc х (%С02) х 4,35 х 10"4 [165]. Концентрацией растворенного водорода пренебрегали из-за его низкой растворимости.

6.6. Методика выделения уксусной кислоты из разбавленного водного раствора.

В работе был использован экстрактор, принцип которого описан Neish [166], с модификацией для препаративного выделения уксусной кислоты.

Культуральную жидкость, содержащую около 3,6 г/л уксусной кислоты, центрифугировали для отделения фрагментов биокатализатора при 10000 об/мин в течение 15 мин. Затем супернатант подкисляли до рН 2 концентрированной соляной кислотой для перевода уксусной кислоты в неионизированную форму, которая легче поддается экстракции эфиром. Водная фаза после экстракции содержала лишь минеральные соли.

Процесс экстракции проходил следующим образом: в колбу заливали 100 мл культуральной среды, содержащей уксусную кислоту. Экстрактор через шлиф соединяли с 200-мл колбой Эрленмейера со 100 мл эфира. Экстракцию проводили при 60-70°С на водяной бане. Образующиеся пары эфира поступали по колонке в обратный холодильник, сконденсировавшийся эфир по трубке возвращался в водную фазу через отверстия на конце трубки. Система работала в замкнутом цикле. Уксусная кислота полностью экстрагировалась эфиром за 2-3 часа непрерывной работы экстрактора.

Полученный экстракт уксусной кислоты в эфире использовали для хромато-масс-спектрометрического определения изотопного состава продукта.

Для получения чистой уксусной кислоты эфирную фракцию подогревали на водяной бане до полного удаления эфира.

Концентрация уксусной кислоты, выделенной путем экстракции эфиром, составляла 99%.

6.1. Хромато-масс-спектрометрический метод определения изотопного состава уксусной кислоты.

Исследования образцов уксусной кислоты проводили методом газохроматографической масс-спектрометрии (ГХ-МС) на хромато-масс-спектрометре Varian MAT 112S [167]. Длина газохроматографической колонки составляла 60 м, внутренний диаметр - 0,25 мм, к внутренней поверхности химически привита жидкая фаза ДВ-1 (аналог SE-30). Перед вводом в хроматографическую колонку экстракты упаривали от 0,5 мл до 50 мкл. Образец объемом 0,1 мкл вводили микрошприцем через инжектор с разделением потока (1/20) в капиллярную колонку, параметры которой приведены выше.

Разделение проводили в режиме программирования температуры от 50°С (5мин) до 200°С со скоростью 20°С/мин. В качестве метода ионизации использовали электронный удар (ЭУ), энергия ионизирующих электронов составляла 70 эВ, температура ионизационной камеры 200-230°С. Измерение проводили в режиме циклического сканирования масс-спектров (скорость 0,7сек/декаду), которые поступали в память ПЭВМ через предпроцессор сбора данных фирмы MSS. Диапазон сканирования масс-спектров был выбран от 35 до 150 а.е.м.

Для количественной оценки содержания уксусной кислоты с разной степенью изотопного обогащения применяли методику селективного ионного детектирования по молекулярным ионам с m/z 61 и 62.

Расчет процентного содержания уксусной кислоты (Ri) (^СгЩОг; и 1 "3

С СН4О2; С2Н4О2) проводили по формуле:

Ri = Si/Si+S2+S3, где Si - площадь пика уксусной кислоты на масс-хроматограмме по m/z 60,

52 -------------------- « ------------------------------------------------по m/z 61,

53 -------------------- « ------------------------------------------------по m/z 62.

12

Учитывая незначительное содержание в пробах уксусной кислоты с С, поправку на естественное содержание изотопа 12С в пробах не проводили, так как погрешность экспериментального определения величины Ri (+1%) значительно превышает величину этой поправки.

6.8. Определение L-лизина с помощью ферментного анализатора.

Концентрацию L-лизина в культуральной среде определяли с помощью универсального ферментного анализатора "Multiferm" на основе колоночного миниреактора, заполненного иммобилизованной на силикагеле лизинмонооксидазой (JIMO). Принцип работы аппарата основан на амперометрической регистрации изменения концентрации кислорода, происходящего в ходе реакции, катализируемой JIMO [168].

Методика определения содержания лизина заключалась в следующем. Непрерывно аэрируемый кислородом воздуха 50 мМ калий-фосфатный буферный раствор (рН 8,2) подавали в гидравлическую систему анализатора и далее в специальный рессивер, обеспечивающий постоянство скорости протока буферного раствора в колонке. Используемый в аналитической системе миниколоночный реактор имел длину 100 мм и диаметр отверстия 4 мм, скорость прокачивания буферного раствора 5 мл/мин. Устройство ввода проб обеспечивало автоматическое дозирование и инжектирование 70±1,2 мкл образца в проток. Кислород, растворенный в протекающем буфере, диффундировал через мембрану детектора к платиновому катоду, на котором происходило электрохимическое восстановление кислорода до перекиси водорода. Возникающий при этом ток усиливался и регистрировался цифровым вольтметром. При прохождении лизинсодержащего образца через рабочий миниреактор с иммобилизованной JIMO происходило ферментативное окисление этого субстрата и, как следствие, содержание кислорода в буферном растворе уменьшалось пропорционально концентрации определяемого лизина в пробе. Содержание лизина в образце определяли с помощью калибровочной кривой.

Относительная ошибка метода не превышала 4%. Диапазон определения концентраций составил 0,2-1,0 г/л L-лизина. Время отклика анализатора 15-30 сек, полное время анализа не более 3 мин.

7. Расчет продуктивности процесса.

Продуктивность процесса в биореакторе по целевому продукту рассчитывали по следующим формулам [169]:

P=vxc/V = c/ i; = cxD, где: v - поток через биореактор, л/час; с - концентрация продукта в среде, мМ (г/л);

V - рабочий объем биореактора, л; т - среднее время ферментации, час;

D - скорость разбавления, час"1.

8. Определение ошибки измерений.

Представленные результаты являются средним значением 3 параллельных экспериментов, отклонение от среднего значения не превышало 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование параметров роста и физиологических особенностей гомоацетогенных бактерий.

1.1. Скрининг гомоацетатных микроорганизмов.

Скрининг гомоацетогенных бактерий проводили по нескольким критериям: 1) по скорости синтеза ацетата; 2) по составу питательной среды; 3) по выходу ацетата на моль потребленного водорода.

В результате скрининга шести культур мезофильных и термофильных гомоацетогенов, наиболее совместимых с предполагаемым технологическим процессом, было показано, что по скорости роста и выходу биомассы гомоацетатные бактерии, культивируемые в присутствии газов, уступают органотрофным бактериям, что согласуется с литературными данными [62]. Однако выход конечного продукта на грамм биомассы для органотрофных культур был значительно ниже. По мере накопления ацетата в среде рН снижался до значений, соответствующих нижнему пределу для роста данной бактерии. Параметры роста гомоацетогенов на газовых смесях Н2/СО2 приведены в Таблице 5. На основании полученных данных, для более детального исследования процесса синтеза ацетата, была выбрана термофильная неспорообразующая анаэробная бактерия Thermoanaerobacter kivui. Данная культура имела наибольший выход ацетата на моль потребленного водорода. Кроме того, Т. kivui была единственной из исследуемых культур, способной расти на строго минеральной среде без добавления ростовых факторов - дрожжевого экстракта, пептона, витаминов и т.д.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Рябоконь, Анна Монолитовна, Москва

1. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы технологии микробиологических производств//М.: Агропромиздат. 1990. С. 20-35.

2. Ciani М. Wine vinegar production using base wines made with different yeast species // J. Sci. Food Agricul. 1998. V. 78. P. 290-294.

3. Masai H., Kawamura Y., Yamada K. Developments of new production process and use of fermentation vinegar // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1978. V. 52. P. 59-65.

4. Park Y.S., Toda K., Fukaya M., Okumura H., Kawamura Y. Production of high concentration acetic acid by Acetobacter aceti using a repeated fed-batch culture with cell recycling // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. V. 35. P. 149-153.

5. Nishiwaki A. Analysis of a 2-stage fermenter with cell recycling for continuous acetic acid production// J. Ferment. Bioeng. 1997. V. 83. P. 565-570.

6. Navratil M., Gemeiner P., Sturdik E. Entrapment of yeast cells into pectate gels: continuous alcohol fermentation // Proc. Intern. Workshop Bioencapsul. IX, Warsaw. 2001. P. 14.

7. Wheals A.E., Basso L.C., Alves D.M.G., Amorin V. Fuel ethanol after 25 years // Trends Biotechnol. 1999. V. 17. P. 482-487.

8. Райнина Е.И., Бачурина Т.П., Махлис T.A., Синицын А.П., Клесов А.А. Использование бактерий Zymomonas mobilis для сбраживания целлюлозосодержащего сырья//Биотехнология. 1986. Т. 4. С. 65-70.

9. Saeki A., Theeragool G., Matsushita К., Toyama Н., Lotong N., Adachi О. Development of thermotolerant acetic acid bacteria useful for vinegar fermentation at higher temperatures //Bioscien. Biotechnol. Biochem. 1997. V. 61. P. 138-145.

10. Lu S.F., Lee F.L., Chen H.K. A thermotolerant and high acetic acid producing bacterium Acetobacter sp. 114-2 // J. Appl. Microbiol. 1999. V. 86. P. 55-62.

11. Caridi A., Crucitti P., Ramondino D. Winemaking of musts at high osmotic strength by thermotolerant yeasts // Biotechnol. Lett. 1999. V. 21. P. 617-620.

12. Galazzo J.L., Bailey J.E. Growing Saccharomyces cerevisiae in calcium-alginate beads induces cell alterations which accelerate glucose conversion to ethanol // Biotechnol. Bioeng. 1990. V. 36. P. 73-87.

13. Krouwel P.G., van der Lean W.F.M., Kossen N.W.F. Continuous production of л-butanol and isopropanol by immobilized, growing Clostridium butylicum cells // Biotechnol. Lett. 1980. V. 2. P. 253-258.

14. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // М.: Изд. МГУ, 1994. С. 288.

15. Balch W.E., Schoberth S, Tanner R.S., Wolfe R.S. Acetobacterium, a new genus of hydrogen-oxidizing, carbon dioxide reducing, anaerobic bacteria // Int. J. Syst. Bact. 1977. V. 27. P. 355-361.

16. Tanaka K., Pfennig N. Fermentation of 2-methoxyethanol by Acetobacterium malicum sp.nov. and Pelobacter venetianus // Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 181-187.

17. Rosencrants D., Rainey F.A., Janssen P.H. Culturable populations of Sporomusa spp. and Desulfovibrio spp. in the anoxic bulk soil of flooded rice microcosms // Appl. Environ. Microbiol 1999. V. 65. P. 3526-3533.

18. Geerlings G., Aldrich H.C., Harder W., Diekert G. Isolation and characterization of a carbon monoxide utilizing strain of a acetogen Peptostreptococcus productus II Arch. Microbiol. 1987. V. 148. P. 305-313.

19. Lorowitz W. H., Bryant M.P. Peptostreptococcus productus strain that grows rapidly with CO as the energy source // Appl. Env. Microbiol. 1984. V. 47. P. 961-964.

20. Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Новая экстремально-галофильная гомоацетатная бактерия Acetohalobium arabaticum gen. nov., sp. nov. // Докл. АН СССР. 1990. Т. 311. С. 745.

21. Peters V., Janssen P.H., Conrad R. Efficiency of hydrogen utilization during unitrophic and mixotrophic growth of Acetobacterium woodii on hydrogen and lactate in the chemostat // FEMS Microbiol.Ecol. 1998. V. 26. P. 317-324.

22. Frank C., Schwarz U., Matthies C., Drake H.L. Methabolism of aromatic aldehydes as cosubstrates by the acetogen Clostridium formicoaceticum //Arch.Microbiol. 1998. V. 170. P. 427-434.

23. Fischer F., Lieske R., Winzer K. Biologische gasreaktionen. П uber die bildung von essigsaure bei der biologischen umsetzung von kohlenoxyd und kohlensaure mit wasserstoff zu methan // Biochem. 1932. V. 245. P. 2-12.

24. Wieringae K.T. The formation of acetic acid from carbon dioxide and hydrogen by anaerobicspore-forming bacteria // Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. Seriol. 1940. V. 6. P. 251-262.

25. Fountaine F.E., Peterson W.H., McCoy E., Johnson M.J., Ritter G.J. A new type of glucose fermentation by Clostridium thermoaceticum n.sp. // J.Bacteriol. 1942. V. 43. P. 701-715.

26. Andreesen J.R., Gottschalk G., Schlegel H.G. Clostridium formicoaceticum nov. spec. Isolation, description, distinction from C. aceticum and C. thermoaceticum // Arch. Microbiol. 1970. V. 72. P. 154-174.

27. Adamse A.D. New isolation of Clostridium aceticum (Wieringa) II Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. Seriol. 1980. V. 46. P. 523-531.

28. Braun M., Mayer F., Gottshalk G. Clostridium aceticum (Wieringa), a microorganism producing acetic acid from molecular hydrogen and carbon dioxide // Arch. Microbiol. 1981. V. 128. P. 288-293.

29. Zeikus J.G., Lynd L.H, Tompson T.E, Krzycki J.A, Weimar P.L., Hegge P.W. Isolation and characterization of a new methylotrophic, acidogenic anaerobe, the Marburg strain // Curr. Microbiol. 1980. V. 3. P. 381-386.

30. Sharak-Genthner B.R., Davis C.L., Bryant M.P. Features of rumen and sewage sluge strains of Eubacterium limosum, a methanol and Hh/CCh-utilizing species // Appl. Env. Microbiol. 1981. V. 42. P. 12-19.

31. Иларионов C.A. Выделение анаэробного метилотрофного спорообразующего организма Clostridium thermoautotrophicum // Микробиология. 1985. Т. 54. С. 533547.

32. Wiegel J., Braun В., Gottschalk G. Clostridium thermoautotrophicum sp. nov. a thermophileproducing acetate from molecular hydrogen and carbon dioxide // Curr. Microbiol. 1981. V. 5. P. 255-260.

33. Leigh J.A., Mayeor F., Wolfe R.S. Acetogenium kivui, a new thermophilic hydrogen-oxidizing, acetogenic bacterium // Arch. Microbiol. 1981. V. 129. P. 275-280.

34. Braun M., Gottschalk G. Acetobacterium wieringae sp. nov., a new species producing aceticacid from molecular hydrogen and carbon dioxide // Zbl. Bakt. Hyg., 1. Abt. Orig. 1982. C3, P. 368-376.

35. Eichler В., Schink В. Oxidation of primary aliphatic alcohols by Acetobacterium carbinolicum sp. nov., a homoacetogenic anaerobe // Arch. Microbiol. 1984. V. 140. P. 147-152.

36. Breznak A., Switzer J.M., Seitz H.I. Sporomusa termitida sp. nov., an H2/C02-utilizing acetogen isolated from termites //Arch. Microbiol. 1988. V. 150. P. 282-288.

37. Dehning I., Stieb M., Schink B. Sporomusa malonica sp. nov., a homoacetogenic bacterium growing by decarboxylation of malonate or succinate // Arch. Microbiol. 1989. V. 151. P. 421-426.

38. Hermann M., Popoff M.-R., Sebald N. Sporomusa paucivorans sp. nov., a methylotrophic bacterium that forms acetic acid from hydrogen and carbon dioxide // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 93-101.

39. Moller E., Ossmer R., Howard B.H., Gottschalk G., Hippe H. Sporomusa, a new genus of gram-negative anaerobic bacteria including Sporomusa sphaeroides sp. nov., and Sporomusa ovata sp. nov. // Arch. Microbiol. 1984. V. 139. P. 388-396.

40. Mountfort D.O., Asher R.A. Isolation from a methanogenic ferulate-degrading consortium of an anaerobe that converts methoxyl groups of aromatic acids to volatile acids // Arch. Microbiol. 1986. V. 145. P. 55-61.

41. Ollivier В., Cord-Ruwish R., Lombardo A., Garcia J. Isolation and characterization of Sporomusa acidovarans sp. nov., a methylotrophic homoacetogenic bacterium // Arch. Microbiol. 1985. V. 142. P. 307-310.

42. Sleat R., Man R., Robinson R. Acetoanaerobium noterae gen. nov. sp. nov,: an anaerobic bacterium that forms acetate from H2 and C02 // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35. P. 1015.

43. Greening R.C., Leedle A.Z. Enrichment and isolation of Acetitomaculum ruminis, gen. nov., sp. nov.: acetogenic bacteria from the bovine rumene // Arch. Microbiol. 1989. V. 151. P. 399-406.

44. Tanner R.S., Miller L.M., Yang D. Clostridium ljungdahlii sp. nov., and acetogenic species in clostridial rRNA homology group I // Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. V. 43. P. 232-236.

45. Krumholz L.R., Bryant M.P. Clostridium pfennigii sp. nov. uses methoxyl groups of monobenzenoids and produces butyrate // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35. P. 454-456.

46. Krumholz L.R., Bryant M.P. Syntrophococcus sucromutans sp. nov. gen. nov. Uses carbohydrates as electron donors and formate, methoxymonobenzenoids or Methanobrevibacter as electron acceptor systems // Arch. Microbiol. 1986. V. 143. P. 313318.

47. Schink B. Clostridium magnum sp. nov. non-autotrophic homoacetogenic bacterium // Arch. Microbiol. 1984. V. 137. P. 250-255.

48. Drake H.L. Acetogenesis, acetogenic bacteria, and the acetyl-CoA "Wood/Ljungdahl" pathway: past and current perspectives // Acetogenesis / Ed. Drake H.L. N.Y., L.: Chapman and Hall, 1994. P. 3-62.

49. Lay J.J., Li Y.Y., Noike T. Interaction between homoacetogenens and methanogens in lake-sediments // J. Fermen. Bioeng. 1998. V. 86. P. 467-471.

50. Gottwald M., Andreesen J.R., LeGall J., Ljungdahl L.G. Presence of cytochrome and menaquinone in Clostridium formicoaceticum and Clostridium thermoaceticum II J. Bacteriol. 1975. V. 122. P. 325-328.

51. Fuchs G. Variations of the acetyl-CoA pathway in diversely related microorganisms that are not acetogens // Acetogenesis / Ed. Drake H.L. N.Y., L.: Chapman and Hall, 1994. P. 507-521.

52. Ragsdahl S.W. CO dehydrogenase and the central role of this enzyme in the fixation of carbon dioxide by anaerobic bacteria // Acetogenesis / Ed. Drake H.L. N.Y., L.: Chapman and Hall, 1994. P. 88-127.

53. Wood H.G., Ljungdahl L.G. Autotrophic character of the acetogenic bacteria // Variations in autotrophic life / Eds. J.M.Shively, L.L.Barton. San Diego, Academic press, 1991. P. 201-250.

54. Diekert G., Hansch M., Conrad R. Acetate synthesis from 2 C02 in acetogenic bacteria: is carbon monoxide an intermediate? // Arch. Microbiol. 1984. V. 138. P. 224-228.

55. Ma K., Siemon S., Diekert G. Carbon monoxide methabolism in cell suspensions of Peptostreptococcus productus strain Marburg // FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 43. P. 367-371.

56. Kerby R., Zeikus J.G. Growth of Clostridium thermoaceticum on H2/CO2 or CO as energy source // Curr. Microbiol. 1983. V. 8. P. 27-30.

57. Daniel S.L., Wu Z., Drake H.L. Crowth of thermophilic acetogenic bacteria on methoxylated aromatic acids // FEMS Microbial. Lett. 1988. V. 52. P. 25-28.

58. Yamamoto I., Saiki Т., Liu S.-M., Ljungdahl G.L. Purification and properties of NADP-dependent formate dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum, a tungsten -selenium-iron protein//J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 1826-1832.

59. Ljungdahl L.G. The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1986. V. 40. P. 415-450.

60. Peters V., Janssen P.H., Conrad R. Transient production of formate during chemolithotrophic growth of anaerobic microorganisms on hydrogen // Curr. Microbiol. 1999. V. 38. P. 285-289.

61. Clark J.E., Ljungdahl L.G. Purification and properties of 5,10-methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase from Clostridium thermoaceticum II J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 38333836.

62. Ragsdale S.W., Ljungdahl L.G. Hydrogenase from Acetobacter woodii II Arch. Microbiol. 1984. V. 139. P. 361-365.

63. Clark J.E., Ljungdahl L.G. Purification and properties of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, an iron-sulfur flavoprotein from Clostridium formicoaceticum И J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 10845-10849.

64. Drake H.L., Hu S.-I., Wood H.G. The synthesis of acetate from carbon monoxide plus methyltetrahydrofolate and the involvment of the nicel enzyme, CO dehydrogenase // Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1981. K142. P. 144.

65. Hu S.-I., Drake H.L., Wood H.G. Synthesis acetyl coenzyme A from carbon monoxide, methyltetrahydrofolate, and coenzyme A by enzymes from Clostridium thermoaceticum II J. Bacteriol. 1982. V. 149. P. 440-448.

66. Pezacka E., Wood H.G. The autotrophic pathway of acetogenic bacteria. Role of CO dehydrogenase disulfide reductase // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1609-1615.

67. Cheryan M., Parekh S., Shan M., Witjitra K. Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum II Adv. Appl. Microbiol. 1997. V. 43. P. 1-33.

68. Fuchs G. CO2 fixation in acetogenic bacteria: variations on a theme // FEMS Microbiol.

69. Rev. 1986. V. 39. P. 181-213.1.ungdahl L.G. Biochemistry and enerqetics of acetogenesis // Acetogenesis / Ed. Drake H.L. N.Y.-L.: Chapman and Hall, 1994. P. 63-88.

70. Weimer P.J. Use of thermophiles for the production of fuels and chemicals // Thermophiles. General molicular and applied microbiology / Ed. Brock T. Wiley & Sons, 1986. P. 217-255.

71. Terraciano J.S., Schreurs W., Kashket E. Membrane Yt conductance of Clostridium thermoaceticum and Clostridium acetobutylicum: evidence for electrogenic Na+/H+ antiport in Clostridium thermoaceticum II Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. P. 782-786.

72. Ljungdahl L.G., Eriksson K.E. Ecology of microbial cellulose degradation // Adv. Microb. Ecol. 1985. V. 8. P. 237-299.

73. Reed W.M., Keller F.A., Kite F.E., Bogdan M.E., Ganound J.S. Development of increased acetic acid tolerance in anaerobic homoacetogens through indused mutagenesis and continuous selection // Enzym. Microbiol. Technol. 1987. V. 9. P. 117-124.

74. Schwarz R.D., Keller F.A. Isolation of a strain of Clostridium thermoaceticum capable of growth and acetic acid production at pH 4.5 // App. Environ. Microbiol. 1982. V. 43. P. 117-123.

75. Yates R.A. Removal and concentration of lower molecular weight organic acids from dilute solutions // US Patent. 1981.4,282,323.

76. Nomura Y., Iwahara M., Hongo M. Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum in electrodialysis culture using a fermenter equipped with an electrodialyser // World J. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 10. P. 427-432.

77. Busche R.M. Extractive fermentation of acetic acid: Economic trade off between yield of Clostridium and concentration of Acetobacter II Appl. Biochem. Biotechnol. 1991. V. 28/29. P. 605-621.

78. Wang G., Wang D.I.C. Elucidation of growth inhibition and acetic acid production by Clostridium themoaceticum II Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 47. P. 294-298.

79. Parekh S., Cherian M. Fed bath fermentation of glucose by an improve strain of Clostridium thermoaceticum II Biotechnol. Lett. 1990. V. 12. P. 681-684.

80. Yang H., Drake H.L. Differential effects of sodium on hydrogen- and glucose-dependent growth of the acetogenic bacterium Acetogenium kivui II Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 81-86.

81. Reed W.M., Bogdan M.E. Application of cell recycling to continuous fermentative acetic acid production // Biotech. Bioeng. Symp. 1985. V. 15. P. 641-647.

82. Eysmondt von, J., Vasic-Racki Dj., Wandrey Ch. Acetic acid production by Acetogenium kivui in continuous culture-kinetic studies and computer simulations // Appl. Microbiol. Biothechnol. 1990. V. 34. P. 344-349.

83. Klemps R., Schoberth S.M., Sahm H. Production of acetic acid by Acetogenium kivui II Appl. Microbiol. Biothechnol. 1987. V. 27. P. 229-234.

84. Klemps R., Schoberth S., Sahm H., Swyzen W. Process for the microbial anaerobic production of acetic acid // US Patent. 1990. 4,935,360.

85. Bream P. Fermentation of single and mixed substances by the parent and an acid-tolerant, mutant strain of Clostridium thermoaceticum II Biotech. Bioeng. 1988. V. 32. P. 444-450.

86. Bream P., Datta R. Production of organic acids by an improved fermentation process // US Patent. 1985. 4,814,273.

87. Brownell J.E., Nakas J.P. Bioconversion of acid hydrolyzed poplar hemicellulose to acetic acid by Clostridium thermoaceticum 11 J. Ind. Microbiol. 1991. V. 7. P. 1-6.

88. Frier D. Wechselwirkungen von thermophilen anaeroben bacterien in cellulolytischen mischkulturen // M.D. thesis. 1981. University of Gottingen, Gottingen. Germany.

89. Симанькова M.B., Ножевникова A.H. Термофильное гомоацетатное сбраживание целлюлозы комбинированной культурой Clostridium thermocellum и Clostridium thermoautotrophicum II Микробиология. 1989. Т. 58. С. 897-902.

90. Parekh S.R., Cheryan M. Continuous production of acetate by Clostridium thermoaceticum in a cell-recycle membrane reactor //Enzyme Microb. Technol. 1994. V. 16. P. 104-109.

91. Marynowski C.W., Jones J.L., Boughton R.L., Tuse D., Corlopassi J.H., Gwinn J.E. Process development for production of calcium magnesium acetate (CMA) // FHWA/RD-82/145.1983. Federal Higway Administration, Washington, D.C.

92. Marynowski C.W., Jones J.L., Tuse D., Boughton R.L. Fermentation as an advantigeous route for the production of acetate salt for roadway de-icing // I&EC product Dev. 1985. V. 24. P. 457-465.

93. Lundie L.L., Drake H.L. Development of a minimal defined medium for the acetogen Clostridium thermoaceticum II J. Bacteriol. 1984. V. 159. P. 700-703.

94. Savage M.D., Drake H.L. Adaptation of the acetogen Clostridium thermoautotrophicum to minimal medium// J. Bacteriol. 1986. V. 165. P. 315-318.

95. Bock S.A., Fox S.L., Gibbons W.R. Development of a low-cost, industrially suitable medium for the production of acetic acid from Clostridium thermoaceticum II Biotechnol. Appl. Biochem. 1997. V. 25. P. 117-125.

96. Horner R., Brenner M., Wagner R., Walker R. Environmental evaluation of calcium magnesium acetate // Calcium Magnesium Acetate / Eds. Wise D.L., Lavendis Y.A., Metghalchi M. Amsterdam: Elsevier Science Publisher, 1991. P. 57-102.

97. Wise D.L., Augenstein D.C., Gresser J.D. Process for manufacture of alkaline earth acetates //US Patent. 1991. 5,068,188.

98. Hubred G.L. CMA production utilizing acetate ion exchange from fermentation broth // US Patent. 1992. 5,162,214.

99. Lynd L.H., Zeikus J.G. Metabolism of H2/CO2, methanol, and glucose de Butyribacterium methylotrophicum II J. Bacteriol. 1983. V. 153. P. 1415-1423.

100. Ma K., Wohlfarth G., Diekert G. Acetate formation from CO and C02 by cell extracts of Peptostreptoccusproductus (strain Marbyrg) // Arch. Microbiol. 1991. V. 156. P. 75-80.

101. Vega J.L., Clausen E.C., Gaddy J.L. Study of gaseous substrate fermentations: carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture // Biotechnol. Bioeng. 1989. V. 34. P. 774-784.

102. Schmidt R.L., Cooney C.L. Production of acetic acid from hydrogen and carbon dioxide by Clostridium species ATCC 29797 // Chem. Eng. Commun. 1986. V. 45. P. 61-73.

103. Chang I.S., Kim D.H., Kim B.H., Shin P.K., Sung H.C., Lovitt R.W. CO fermentation of Eubacterium limosum Kist612 // J. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 8. P. 134-140.

104. Efremenko E., Rainina E., Lozinsky V., Makhlis Т., Varfolomeyev S. Immobilized combined microbial preparation for organophosphates degradation // Proc. Intern. Workshop Bioencapsul. IX, Warsaw. 2001. S.VII-3.

105. Champagne C.P. et al. Immobilized cell technologies for the diary industry // Biotechnol. 1994. V. 14. P. 109-134.

106. Cassidy M.B., Lee H., Trevors J.T. Environmental applications of immobilized microbial cells: a review // J. Industrial Microbiol. 1996. V. 16. P. 79-101.

107. Березин И.В., Клесов A.A., Швядас B.K., Угарова Н.Н., Варфоломеев С.Д., Ярополов А.И., Казанская Н.Ф., Егоров A.M. Инженерная энзимология // Биотехнология / М.: Высшая школа. 1987. С. 27-28.

108. Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их применение // Иммобилизованные клетки микроорганизмов / Пущино. 1978. С. 5-36.

109. Hsiao H., Walter J.F., Anderson D.M., Hamilton B.K. Enzymatic production of amino acids // Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 1988. V. 6. P. 179-219.

110. Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии // М.: Мир. 1989. Ч. 2. С. 86102.

111. Кирстен М.П.Дж., Кафлэн М.П. Иммобилизация клеток и ферментов включением их в гель // Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Ред. Вудворд Д. М.: Мир, 1988. С. 53-64.

112. Beunink J., Baumgartl Н., Zimelka W., Rehm H.-J. Determination of oxygen gradients in single Ca-alginate beads by means of oxygen microelectrodes // Experimentia. 1989. V. 45. P. 1041-1047.

113. Kurosawa H., Matsumura M., Tanaka H. Oxygen diffusivity in gel beads containing viable cells // Biotechnol. Bioeng. 1989. V. 34. P. 926-932.

114. Plieva F.M., Lozinsky V.I. Poly(vinyl alcohol)cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. Basics and Applications // Enzyme Microbial. Technol. 1998. V. 23. P. 227-242.

115. Switzenbaum M.S. Anaerobic fixed film wastewater treatment // Enzyme Microbial Technol. 1983. V. 5. P. 242-250.

116. Miller A.O.A., Meozzi F.D., Dubois D. Microbeads and anchorage dependent eukaryotic cells; the beginning of a new era in biotechnology // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1985. V. 39. P. 73-95.

117. Jack T.R., Zajic J.E. The enzymatic conversion of L-histidine to urocanic acid by whole cells of Micrococcus luteus immobilized on carbodiimide activated carboxymethyl cellulose // Biotechnol. Bioeng. 1977. V. 19. P. 631-648.

118. Fukui S., Tanaka A. Application of biocatalysts immobilised by prepolymer methods // Adv. Biochem. Eng. 1984. V. 29. P. 1-33.

119. Gu Z., Rickert D.A., Glats C.E. Feasibility of propionic acid production by extractive fermentation//Lait. 1999. V. 79. P. 137-148.

120. Rickert D.A., Glatz C.E., Glatz B.A. Improved organic acid production by calcium alginate immobilized propionibacteria // Enzyme Microb. Technol. 1998. V. 22. P. 409-414.

121. Лозинский В.И., Вайнерман Е.С., Рогожин С.В. Метод получения иммобилизованных микроорганизмов//Авт. Свидет. СССР. 1986.1.400.071.

122. Lozinsky V.I., Plieva F.M. Cell entrapment within PVA-cryogel carriers: state of art and potentials // Procc. Int. Worksh. Bioencap. 1996. Potsdam. T3.

123. Belfort G. Membranes and bioreactors: technical challenge in biotechnology // Biotech. Biogen. 1989. V. 33. P. 1047-1066.

124. Atkinson В., Daoud I.S. Microbial floes and flocculation in fermentation process engineering // Adv. Biochem. Eng. 1976. V. 4. P. 41-124.

125. Shreve G.S., Vogel Т. M. Comparison of substrate utilization and growth kinetics between immobilized and suspended Pseudomonas cells // Biotechnol. Bioeng. 1993. V. 41. P. 370379.

126. Wada M., Kato J., Chibata I. Continuous production of ethanol using immobilized growing yeast cells // Eur. J. Appl. Microb. Biotech. 1980. V. 10. P. 275-287.

127. Shimyo A., Kimura H., Okada H. Phisiology of a-amylase production by immobilized Bacillus amylofiquefacieus И Eur. J. Appl. Microb. Biotech. 1982. V. 14. P. 7-12.

128. Baudet C., Barbotin J.N., Guespin-Michel J. Growth and sporulation of entrapped Bacillus subtilis cell // Appl. Environ. Microb. 1983. V. 45. P. 297-301.

129. Chen K.C., Huang C.T. Effects of the growth of Trichosporum cutaneum in Ca-alginate gel beads upon bead structure and oxygen transfer characteristics // Enz. Microb. Tech. 1988. V. 10. P. 284-292.

130. Doran P.M., Bailey J.E. Effects of immobilisation on growth, fermentation properties, and macromolecular composition of S. cerevisia attached to gelatin // Biotech. Bioeng. 1986. V. 28. P. 73-87.

131. Mori A., Matsumoto N., Imai C. Growth behavior of immobilized acetic acid bacteria // Biotech. Lett. 1989. V. 11. P. 183-188.

132. Anderson J.G. Immobilised cell physiology // Process engineering aspects of immobilized cells / Eds. Webb C., Black G.M., Atkinson B. N.Y.: Pergamon Press, 1986. P. 153-171.

133. Bang W.G., Behrendt U., Lang S., Wagner F. Continuous production of L-tryptophan from indole and L-serine by immobilised E.coli cells // Biotech. Bioeng. 1983. V. 25. P. 10131025.

134. Klibanov A.M. Enzyme stabilisation by immobilization // Anal. Biochem. 1979. V. 93. P. 1-25.

135. Forberg С., Enfors S.O., Haggstrom L. Control of immobilised, non-growing cells for continuous production of metabolites // Eur. J. Appl. Microb. Biotech. 1983. V. 17. P. 143147.

136. Deo Y.M., Gaucher G.M. Semi-continuous production of the antibiotic patulin by immobilized cells of Penicillium ultricase II Biotech. Lett. 1983. V. 5. P. 125-130.

137. Emery A.N., Mitchell D.A. Operational considerations in the use of immobilised cells // Process engineering aspects of immobilised cells / Eds. Webb C., Black G.M., Atkinson B. N.Y.: Pergamon Press, 1986. P. 87-97.

138. Wang G., Wang D.I.C. Production of acetic acid by immobilized whole cells of Clostridium thermoaceticum II Appl. Biochem. Biotechnol. 1983. V. 8. P. 491-503.

139. Morinaga Т., Kawada N. The production of acetic acid from carbon dioxide and hydrogen by an anaerobic bacterium // J. Biotechnol. 1990. V. 14. P. 187-194.

140. Talabardon M., Schwitzguebel J.P. Peringer P. Anaerobic thermophilic fermentation for acetic acid production from milk permeate // J. Biotechnol. 2000. V. 76. P. 83-92.

141. Huang Y.L., Mann K., Novak J.M., Yang S.T. Acetic acid production from fructose by Clostridium formicoaceticum immobilized in a fibrous-bed bioreactor // Biotechnol. Prog. 1998. V. 14. P. 800-806.

142. Huang Y., Yang S.T. Acetate production from whey lactose using coimmobilized cells of homolactic and homoacetic bacteria in a fibrous-bed bioreactor // Biotechnol. Bioengin. 1998. V. 60. P. 498-507.

143. Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Методы выделения и культивирования метанобразующих бактерий // Теоретические и методические основы изучения анаэробных микроорганизмов / Пущино. 1978. С. 68.

144. Wolin Е.А., Wolin M.J., Wolfe R.S. Formation of methane by bacterial extracts // J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 2882-2886.

145. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the folin reagent// J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

146. Костилоу P. Биофизические факторы // Методы общей бактериологии / Ред. Герхардт Ф. М.: Мир, 1983. С. 165-198.

147. Neish А.С. Analytical methods for bacterial fermentation. 1952. N.R.C.C. Report 46.8.3.

148. Вульфсои H.C., Заикии B.T., Микая А.И. Масс-спектрометрия органических соединений // М.: Химия. 1986. С. 310.

149. Simonian A.L., Tatikian S.Sh., Kchachatrian G.E., Avakian Ts.M., Badalian I.E. A flow-throw enzyme analyzer "ARFA" for determination of L-lysine concentration // Biosens. Bioelectr. 1991. V. 6. P. 93-98.

150. Быков B.A., Винаров А.Ю., Шерстобитов B.B. Расчет процессов микробиологических производств //Киев. Техшка. 1985. С. 260.

151. Берестовская Ю.Ю., Крюков И.Р., Боднар И.В., Пушева М.А. Культивирование гомоацетатной бактерии Clostridium thermoautotrophicum Z-99 // Микробиология. 1987. Т. 56. С. 642-647.

152. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов // М.: Высшая школа. 1990. С. 78-81.

153. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. 1978. С.24.

154. Slowinski W., Charm S.E. Glutamic acid production with gel-entrapped Corynebacterium glutamicum II Biotechnol. Bioeng. 1973. V. 15. P. 973-979.

155. Velizarov S.G., Rainina E.I., Lozinsky V.I., Zubov A.L., Sinitsyn A.P., Varfolomeyev S.D. L-lysine production by Corynebacterium glutamicum cells entrapped in PVA-cryogel // Biotechnol. Lett. 1992. V. 14. P. 291-296.

156. Лозинский В.И., Вакула A.B., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. IV. Обзор литературных данных // Биотехнология. 1992. Т. 4. С. 5-14.

157. Nambu М. Rubber-like polyvinyl alcohol) gel // Kobunshi Ronbunshu. 1990. V. 47. P. 695-703.

158. Ландау H.C., Егоров H.C., Горнова И.Б., Красовская С.Б., Вирник А.Д. Иммобилизация в волокнах и пленках из триацетата целлюлозы клеток Bacillus firmus и их использование для биосинтеза протеиназ // Прикл. Биохим. Микробиол. 1992. Т. 28. С. 108-113.

159. Райнина Е.И., Махлис Т.А., Бачурина Г.П. Определение жизнеспособности иммобилизованных микроорганизмов // Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Пущино, 1987. С. 140-149.

160. Walden W.C., Hentges D.J. Differential effects of oxygen and oxidation-reduction potential on the multiplication of three species of anaerobic intestinal bacteria // Environ. Microbiol. 1975. V. 30. P. 781-785.

161. Hungate R.E. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes // Methods in microbiology / Eds. Norris J.R., Ribbons D.W. N.Y. Inc.:Academic Press, 1969. P. 117132.

162. Carlsson J., Granberg G.P.D., Nyberg G.K., Edlund M.-B.K. Bacterial effect of cysteine exposed to atmospheric oxygen // Appl. Environ. Microbiol. 1979. V. 37. P. 383-390.

163. Padan E., Zilberstein D., Schuldiner S. pH homeostasis in bacteria // Biochem. Biophys. Acta. 1981. V. 650. P. 151-166.

164. Lawford H.G., Roussean J.D. Improving fermentation performance of recombinant Zymomonas in acetic acid-containing media // Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V.70-2. P. 161-172.

165. Caldwell P.C. Intracellular pH // Int. Rev. Cytos. 1956. V. 5. P. 229.

166. Baronofsky J.J., Schreurs J.A., Kashket E.R. Uncoupling by acetic acid limits growth of and acetogenesis by Clostridium thermoaceticum II Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 48. P. 1134-1139.

167. Phillips C.R., Poon Y.C. Immobilization of cells // Biotechnology monographs. Springer-Verlag, 1988. P. 167.

168. Muller V., Gottshalk G. The sodium ion cycle in acetogenic and methanogenic bacteria: generation and utilisation of a primary electrochemical sodium ion gradient // Acetogenesis / Ed. Drake H.L. N.Y., L.: Chapman and Hall, 1994. P. 127-165.

169. Davidova M.N., Tarasova N.B., Mukhitova F.K., Karpilova Y.U. Carbon monoxide in metabolism of anaerobic bacteria // Canad. J. Microbiol. 1994. V. 40. P. 417-425.

170. Martin D.R., Mistra A., Drake H.L. Dissimilation of carbon monoxide to acetic acid by glucose-limited cultures of Clostridium thermoaceticum II Appl. Environ. Microbiol. 1985. V. 49. P. 1412-1417.

171. Lynd L., Kerby R., Zeikus J.G. Carbon monoxide metabolism of the methylotropic acidogen Butyribacterium methylotrophicum //J. Bacteriol. 1982. V. 149. P. 255-263.

172. Savage M.D., Wu Z., Daniel S.L., Lundie L.L., Drake H.L. Carbon monoxide-dependent chemolithotrophic growth of Clostridium thermoautotrophicum II Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. P. 1902-1906.

173. Diekert G., Wohlfarth G. Energetics of acetogenesis from Ci units // Acetogenesis / Ed. Drake H.L. N.Y., L.: Chapman and Hall, 1994. P. 157-179.

174. Zeikus J.G. Chemical and fuel production by anaerobic bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1980. V. 34. P. 423-464.

175. Фальбе Ю. Синтезы на основе окиси углерода // Л. Химия. Ленингр. отд. 1971. С. 215.

176. Vega J.L., Antorrena G.M., Clausen Е.С., Gaddy J.L. Study of gaseous substrate fermentations: carbon monoxide conversion to acetate. 2. Continious culture // Biotech. Bioengin. 1989. V. 34. P. 785-793.

177. Brodelius P., Vandamme E. J. Immobilized cell systems // Biotechnology / Eds. Rehm H.J., Reed G. Weinheim: VCH, 1987. P. 653-684.

178. Vederas J.C. The use of stable isotopes in biosynthetic studies // Nat. Product Reports. 1987. V. 4. P. 277-337.

179. Саламаха O.B., Тихомирова Л.А., Рогатых Н.П., Зубарев Т.Н. Изменение размеров клеток Corynebacterium glutamicum при культивировании на среде с уксусной кислотой // Микробиология. 1986. Т. 55. С. 413-417.

180. Дроздов-Тихомиров JI.H., Серганова В.В., Скурида Г.И. Стационарные внутренние метаболические потоки в полиферментных системах: синтез лизина из ацетата культурой Corynebacterium glutamicum // Биотехнология. 1986. Т. 2. С. 28-37.

181. Лиепинып Г.К., Дунце М.Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии//Рига, Зинатне. 1986. С. 157.

182. Зайцева З.М. Биосинтез лизина промышленными микроорганизмами // Сер. Успехи микробиологии. 1976. Т. 11. С. 152-173.

183. Федоров А.И., Волченко Е.В., Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Хранение промышленных микроорганизмов, включенных в полимерные матрицы // Прикл. Биохим. Микроб. 2000. Т. 36. С. 59-67.

184. Riedel К., Huber Н., Kuhn М. Konservierung von mikroorganismen in polyvinylalkohol // Acta Biotechnol. 1989. V. 9. P. 197-200.