Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная детекция и новые фенотипические свойства термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярная детекция и новые фенотипические свойства термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter"
На правах рукописи
КОЗИНА Ирина Владимировна
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ И НОВЫЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ ТНЕЖОШАЕЮВАСТЕЯ И САиМШЕЯОВЛ СТЕЯ
Специальность 03.00.07-микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ООЭ44ьао
Москва 2008
003446961
Работа выполнена в Институте микробиологии им С Н Виноградского РАН
Научный руководитель
Официальные оппоненты
доктор биологических наук Е.А. Бонч-Осмшкюская
доктор биологических наук
профессор
A.C. Яненко
доктор биологических наук А.Н. Ножевникова
Ведущая организация Биологический факультет
Московского Государственного Университета им М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится «13» октября 2008 г в 44 ч на заседании Диссертационного совета Д 002 224 01 в Институте микробиологии им СН Виноградского РАН по адресу 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д 7, к 2
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им С Н Виноградского РАН
Автореферат разослан ÍO сентября 2008 г
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук
Т.В. Хижняк (Jí>
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Интерес к термофильным микроорганизмам, которые активно исследуются последние два десятилетия, определяется задачами как фундаментальною, так и прикладного характера Последние в основном связаны с наличием у термофильных прокариот термостабильных ферментов и возможностью их применения в различных областях биотехнологии Многие микробиологические и биохимические исследования посвящены органотрофным термофильным бактериям, в том числе обладающим способностью к гидролизу различных биомолекул К ним относятся анаэробные умеренно-термофильные органотрофные бактерии, впервые описашше как представители рода Clostridium, но затем отнесенные к родам Thermoanaembacterium и Thermoanaerobacter (Lee, 1993) В настоящее время в род Thermoanaembactei входит 14 видов, выделенных из различных мест обитания горячих источников (Zeikus et al, 1979), цианобактериальных матов (Бонч-Осмоловская и др, 1997), вулканических озер (Slobodkin et al, 1999), высокотемпературных нефтяных пластов (Cavol et al, 1995) и др Ого умеренные термофилы, облигатные анаэробы с бродильным типом метаболизма, способные в процессе брожения восстанавливать различные неорганические акцепторы электронов - серу, тиосульфат, окионое железо Экстремально- термофильные организмы, первоначально отнесенные к этому роду (Xue et al, 2001, Kim et al, 2001), впоследствии реклассифицированы как представители нового рода Caldanaei obactei (Fardeau et al, 2004) Представители родов Thermoanaerobacter и Caîdanaeiobactei оказались способными к синтезу протеиназ с новыми, ценными для биотехнологии свойствами (Riessen et al, 2001, Jang et al, 2002) Однако можно предположить, что разнообразие метаболических свойств и биотехнолошческий потенциал этих микроорганизмов еще далеко не исчерпаны Это делает актуальным детальное исследование распространения и метаболического разнообразия термофильных бактерий, относящихся к родам Thennoanaeivbacter и Caldanaei obacter
Цель работы. Целью данной работы являлось исследование распространения и разнообразия бактерий рода Thermoanaerobacter и Caîdanaerobacler молекулярно-биологическими методами
Основные задачи исследования состояли в следующем
1 Разработка методов молекулярной детекции и/или идентификации термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter il Caldanaerobacter,
2 Детекция термофильных бактерий рода Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных культурах и природных образцах,
3 Идентификация изолятов, фенотипически сходных с Thermoanaewbactei и Caldanaerobacter, но имеющих новые для этих родов свойства,
4 Выделение и характеристика новых представителей этих таксонов,
5 Характеристика ферментативных активностей и/или генов, кодирующих новые ферменты, у бактерий группы Thermoanaerobacter/Caldanaetobacter
Научная повита. Впервые разработаны олишнуклеотидные зонды для детекции и идентификации бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter Доказана их высокая специфичность, что позволяет детектировать представителен Thermoanaerobacter и Caldanaembacter непосредственно в накопительных культурах и природных образцах, а также идентифицировать штаммы без необходимости культивирования
Полученные результаты расширяют представление о распространении и физиологии термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter В то время как все известные ранее виды родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter являлись пейтрофилами с минимальным рН роста 4 7, нами были идентифицированы как представители рода Thermoanaembacter два анаэробных ацидофильных штамма, способные развиваться при рН 3 5 Впервые бактерии рода Thermoanaerobacter были обнаружены в пробах из глубоководных гидротерм Впервые для термофильных прокариот установлена способность микроорганизмов родов Thermoanaembacter и Caldanaerobacter к гидролизу агарозы
Установлено, что некоторым представителям рода Caldanaerobacter свойственна способность к анаэробном)' использованию СО с образованием водорода Сравнительное исследование генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии, проведенное с помощью ПЦР с разработанными нами нраймерами, показало их своеобразие у представителей Caldanaembacter на фоне единства организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов Полученные данные подтверждаются результатами анализа полных геномов анаэробных карбоксидотрофов
Практическая ценность работы. Разработанные нами олигонуклеогидные зонды позволяют идентифицировать представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных и чистых культурах, минуя стадии определения фенотипических дескрипторов, а также детектировать их в природных образцах Полученные данные важны для разил ия представлений о распространении и физиологии родов Thermoanaeiobacter и Caldanaeiobacter Разработанный нами метод может быть использован для экспресс-детекции изолятов, в том числе при поиске представителей новых филогенетических групп
Описанные нами ai аролитические штаммы могут быть использованы для получения термостабильной агаразы с целью ее применения в молекулярной биологии для освобождения нуклеиновых кислот и белков из тугоплавких агарозных гелей
Разработанные нами методы детекции генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии могут быть использованы для исследования экологии и распространения водородобразующих СО-трофов
Апробация рабогы. Результаты исследований дотожены на IV Международном Конгрессе «Экстремофилы-2002» (Италия, Неаполь, 2002), 1-ом Международном FEMS Конгрессе Европейский микробиологов (Словения, Любляна, 2003), XV Международной зимнеи молодежной научной школе (Москва, 2003), VII Международной конференции «Термофилы-2003 (Экзетер, Англия),
V Международном Конгрессе «Экстремофнлы-2004» (США, Мэрилэнд, 2004), VIII Международной конференции «Термофилы-2005» (Серфере Парадайс, Австралия, 2005)
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 9 тезисов, 1 статья находится в печати
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей глав обсуждения и выводов, ¡итоженных на страницах печатного текста, и включает таблиц и рисунков
Месю проведения работы н благодарности Работа выполнялась в лаборатории пшертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С H Вшюградского РАИ Некоторые этапы работы были выполнены в лаборатории Центра Биоинженерии РАН под руководством к б н Банниковой Г А Подбор олшхшуклеотидных праимеров и зондов был проведен совместно с кбн А В Лебединским (ИНМИ РАН) Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК -ДНК гибридизацию выполняли совместно с к б н НА Черных и к б н AM Лысенко (ИНМИ РАН) Анализ последовательностей 16 S рРНК чистых культур микроорганизмов, а также ПЦР продуктов проводили совместно с кбн ТВ Колгановой (Центр Биоинженерии РАН) Электронную микроскопию чистых культур микроорганизмов выполнила H А Кострикина (ИНМИ РАН)
Автор выражает благодарность кбн НА Черных за помощь в освоении молекулярных методов, а также кбн AB Лебединскому за постоянное внимание, советы и помощь на этапах молекулярной работы Особенно признателен автор научному руководителю д б н Е А Бонч -Осмоловской за интересную тему, обсуждение результатов, ценные советы и замечания на всех этапах работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обьекты исследования. В работе использовали чистые и накопительные культуры анаэробных термофильных микроорганизмов из коллекции Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С H Вшюградского РАД а также природные образцы из гидротермальных источников кальдеры Узон и Долины гейзеров на Камчатке
В качестве реперных организмов использовали типовые штаммы Thermoanaembacter sidemphüus (DSM 12299т), Thermoanaerobacter sulfumphilus (DSM 11584T), Thermoanaembacter wiegeln (DSM 10319T), Thermoanaerobacter mathrann (DSM 11426T), Thermoanaerobacter italiens (DSM 9252T), Caldoanaerobacter subteiraneus subsp subteiraneus (DSM 13054T), Caldoanaerobacter subtertaneus subsp yonseiensis (DSM 13777r), Caldanaerobacter subteiraneus subsp tengcongensis (DSM 15242T), Caldanaerobacter subterraneus subsp pacifiais (DSM 12653 ), Mooiella glycerinn (DSM 11254T ), Thermoterrabactenum (-Carboxydothermus) ferrireducens (DSM 11255т) и Thermotoga maritima (DSM 3109T)
В исследованиях генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии использовали СО-окисляющие бактерии Carboxydothernius hydrogenoformans (DSM 6008т), Catboxydocella therrnautotrophica (DSM12356T), Thermostnus carboxydivorans (DSM 148861), Thermincola caiboxydiphda (DSM 17129T) и Thermohthobacter carboxydivorans (DSM 7242т), а также Bacdhis subtdis BKM B-720 в качестве отрицательного контроля
Условия культивирования. Культивирование анаэробных термофильных бактерий проводили в герметично закрывающихся флаконах объемом 10 мл на модифицированной среде Пфеннига, приготовленной согласно методам анаэробной техники (Hungate, 1966, Жилина, Заварзин, 1978) и содержащей (г/л) NH4CI - 0 33, КН2Р04 - 0 33, MgCl - 0 33, СаС12 хб Н20 - 0 33, NaHC03 - 1 0, Na2Sx9 Н30 -0 5, резазурин 0 001, дрожжевой экстракт - 0 05 - 0 5, 1 мл /л раствора микроэлементов (Pfennig, Lippert, 1966), 1 мл/л раствора витаминов (Wolin et al, 1963)
Для органотрофных преде гавител ей родов Thermoanaembacter и Caldanaerobacter в качестве субстратов добавляли мальтозу или сахарозу (2 0 г/л. рН среды 6 5-7 0), культивирование проводили в атмосфере N2 или С02
Накопительные и неидентифшдарованные чистые культуры выращивали анаэробно согласно ранее описанной методике на среде 1 (минеральный фон среды Пфеннига, микроэлементы, витамины, Piokofeva, 2000) с различными донорами и акцепторами электронов Органические субстраты добавляли в концентрации 3 г/л, железоредуцирующие микроорганизмы культивировали на той же среде с добавлением 10 г/л пептона и 0 2 г/л дрожжевого экстракта, Fe(III) добавляли в среду в виде оксида Fe(III) (конечная кощен грация 90 мМ), Штаммы, выделенные из морских местообитаний, выращивали на среде 2 следующего состава (г/л) КС1 -0 325, MgCl - 2 75, MgS04 - 3 45, NH4CI - 0 25, СаС12 2Н20 - 0 15, К2НР04 - 0 15, NaCl -18, Nal ICO3 - 1, Na2S - 0 25, микроэлементы, 1 мл/л, витамины, 1 мл/л, в среду добавляли 2 i/л мальтозы и 2 г/л тиосульфата или 10 г/л серы и, при необходимости, дрожжевой экстракт, рН среды был о г б 8 до 7 0
Ацидофильные штаммы и накопительные культуры растили на среде 1 с рН от 3 5 до 5 7
Карбокеидотрофные штаммы культивировали на среде 1 с добавлением 0 5 i/л дрожжевого экстракта в атмосфере 100% окиси ушерода, рН 6 8-7 0 Накопительную культуру GB2 растили на морской среде с СО в газовой фазе (Sokolova, 2001)
Все чисгые и накопительные культуры инкубировали при 60°С, кроме накопительных культур К44,432, 416, Каг (70°С), штамма 2707 (80°С) и штамма 711 (55°С)
Микроскопические методы. Культуры наблюдали в световом микроскопе с фазово-контрастным устройством прн увеличении 90x10 (JIOMO АУ-12, Россия) Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием ультрамикрогома LKB 3R и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Tokyo, Japan)
Подбор ПЦР-праймеров и зовдов. ДНК, выделяли из чисгых и накопительных кулыур н природных образцов, амплификацию генов 16 S рРНК проводили с прямым
бактериальным нраимером Bact 8F и обратным универсальным обратным праимером 1492R (Lane, 1991) Праймеры, специфичные к генам СО-дегвдрогеназ (СО-ДО 11 гидрогеназы и к генному кластеру, включающему гены гидрогеназы и СО-ДГ, разрабатывали на основания выравнивания с помощью программы MultAlin (Corpet, 1988) фрагментов последовательностей геномов Carboxydothermus hydmgenoformans DSM 6008т (номер NC_007503 в базе данных GcnBank) и Rhodospirilhim rubrum UR1 (U65510)
Для разработки олиюнуклеотидных зондов использовали нуклеотидные последовательности 16S рДНК всех валидных видов Thermoanaewbacter и Caldanaerobacter, взятые из базы данных GenBank Поиск зондов проводили с помощью программы ProbeDesigner (Субботина и др , 2003, Лебединский и др, 2007) Специфичность выбранных зондов дополнительно проверти, используя программу NCB1 BLAS Ш (http //www nebí nlm mh gov/blast/Blabt cgi)
Молскулирно-биологическис мсгоды. Выделение и очиснсу геномной ДНК из биомассы бактерий проводили по метод)' Мармура (Marmur, 1961) ПЦР проводили по стандартному протоколу Boehnnger Mannheim с небольшими модификациями, используя прибор Perkm Elmer Cetus DNA Thermal C\ cler модель 480 или многоканальный амплифнкатор ДНК Терцик ("ДНК-технология", Россия) Гель-электрофорез и перенос по Саузерну проводили, следуя общепринятым методикам (Маниатис и др , 1984) Гибридизацию с олигонуклеотидными зондами и детекцию сигнала проводили согласно протоколам из лабораторного руководства Boehnnger Mannheim (http//vw¿roch^-aj)j?Jied-_science com/fst/proiuctsjijmj^^ С
небольшими модификациями, все реактивы были производства Boehnnger Mannheim Гибридизацию проводили в течение 12 часов при температуре, рассчитанной по формуле Тт-10°С, где Тт=81 5+16 61М+0 41 [G+C]-820/n
Для тестирования специфичности зондов в качестве контрилеи использовали ПЦР-продукт, полученный с праймерами Bact 8F и 1492R (Lane, 1991) на ДНК типовых штаммов ряда видов родов Thermoanaewbacter 'Г sidewphüus, Т sulfurophüns, Т wiegeln (1я труппа), Т mathranu, Т itahcus (2я группа) и Caldanaerobactei subteiraneus subsp yomeiensis, С subterraneus subsp pacificas, С suhtertaneus subsp tengcongensis (Зя группа) ПЦР продукты ДИК штатов, относящихся к различным группам, служили отрицательными юнтролями для зондов на группы рода Thermoanaembacter Продукты амплификации, полученные на ДНК Moorella glycerimi и Thermotetrabacterium ferrireducens, служили отрицательным контролем для родового зонда и зондов на каждую и з групп
При подборе условий проведения ПЦР с праймерами, специфичными к генам СО-дегидрогеназ и гидрогеназы и к генному кластеру, включающему гены гидрогеназы и СО-ДГ, использовали ДНК Carboxydothennus hydmgenoformam в качестве положительного контроля и Bacillus subtihs как отрицательный контроль
Секвенирование 16S рДНК и генов СО-ДГ проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™Termmator v 3 0c последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant Филогенетические деревья генов 16S рРНК и генов СО-ДГ исследуемых бактерий
были построены с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994)
Определенно агаразной активности. Клетки агаролитических шгаммов и остатки агара отделяли в процессе центрифугирования в течение 20 мину г при 12000 об/ мил, и супернагант использовали для определения агаразной активности Осадок отмывали 0 1 M ацетатом натрия и затем центрифугировали в течение 20 минут при 12000 об/мин Все процедуры проводили при комнатной температуре (20-25°С) Содержание белка определяли с Coomassie Blue (метод Бредфорда) Агаразную активность измеряли путем определения концентрации восстанавливающих Сахаров с дшштросалициловой кислотой (DNSA)
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Детекция представителей родов Thermoanaerobacter и Cadanaerobacter с помощью олшонуклеотидных зондов 2.1.1. Проверка специфичности зондов
Анализ филогенетического положения и структуры рода Thermoanaerobacter с помощью пакета программ TREECON показал (рис 1 ), что род хорошо обособлен от других родов и может быть подразделен на три филогенетические группы Первая подгруппа включала Т wiegeln, Т siderophilus, Т sulfurophilus, Т brocku, Т kivui, Т ethanolicus, Т acetoethyhcus, Т thermohydrosulfuricus, вторая подгруппа Т thermocopriae, Т mathrami и Т italiens, третья подгру ппа Т tengeongensis, Т yonseiemis и 'Г subterraneus Анализ последовательное гей 16S рДНК выявил, что третьей подгр} ппе рода Thermoanaerobacter близкородственен грамположительныи СО-окисляющий, (^-образующий термофил Caí boxydobiahium pacificus (Sokolova et al, 2001) Позднее виды третьей подгруппы были выделены в новый род Caldanaembacter, состоящий из одного вида и четырех подвидов Caldoanaerobacter subterraneus subsp subten aneus, С subterraneus subsp tengeongensis, С subterraneus subsp yonseiensis, С subterraneus subsp pacificus (Fardeau et al, 2004)
Были подобраны следующие зонды, специфичные для рода Thermoanaembacter в целом и для трех его подгрупп (табл 1 )
Таблица 1 Олягонуклеотидные зонды на род Thermoanaerobacter и группы его видов
Группа, являющаяся мишенью Зонд
Название Последовательность нуклеотидов, 5' —> 3'
Род ПегтоапаеюЬаШг Tab 827 GCT TCCGCDYCCCACACCTA
Первая группа видов Tab 1 844 TTAACTACGGCACGRAATGCTTC
Вторая группа видов l ab 2 424 CACTAMYGGGGTTTACAACC
Третья группа видов (ныне род Са1<ктаеюЬас1ег) Tab J 184 TCCTCCATCAGGATGCCCTA
ТИегтоапаегоЬас+ег мпеде!»
г| Т зи^игорМиз
100
" Е со!|
100'—у 3|с|егорЬ||из Т е'ЖапаЬсиз "Т асеТое1Иу1|сиз ■ЖепиоКус^зи^ипсиз Г кмл
Т Ьгоскп гиЬгр ^^е'НчуЬсиз Т Ьгоскп гиЬгр f^nnl^ Т Ьгоскп
О-Т гГаЬам
ц—Т ¿Негтосорпае Т пийЬгапн
ЮО(-СаМапаегоЬасТгг зиЬ1еггапеиз гиЬзр зиЬ+еггапеиз
[г-С 5иЬ1еггопеи5 гиЬгр +епдсопдеп5к \~С ¿иЬ+егголеиг эиЬзр раа^сиэ С зиЬ1еггапеиз гиЬэр +епдсопделз1з 100—СЬзТпбшт ^егтоатуЫуПсит —И ТЬегтоапаегоЬшт 'Час+ое+ЬуЬсит"
ТЬегтоапоегоЬос+епит +Ьегтози^ индепея
---Ь|^од1отиз ^гторМит
А штоп^ех аедепэи
-ТЬегтоТеггаЬас+епит feггlreducenз
"ТЪегтаегоЬас+ег тапапепзв МоогеНа 1Ъегтоасе+1са
Ьези1^1отаси1ит шдг^ 1сапв — Брого+отасиЬт Ь^гохуЬепгоюит Ьези^о+отаси1ит +ЬегтоЬеп201сит ТИегтозуп1торЬа 1|ро1у1-|са — 5уп1торНотопаз ~ БугигорЬозрога Ьгуати А паегоЬгапса ЬзпкозЬп
----ОеЬа1ососсо^ез Е|Ьеподегез
~С1оз+пс1шт Ьи+упсит
Рис. 1 Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения нуклеотндных последовательностей гена 168 рРНК, показывающее положение и структур> родои ТкегтоапаегоЪа<Лег и СаЫапаегоЪас1ег
Для проверю! специфичности зондов их гибридизовшш с типовыми штаммами видов рода Т1кгтоапаегоЬас1ег, принадлежащих к различным группам, и с представителями близких к роду ТИеппоапаеюЬаЫсг родов МоогеНа и ТЬе1то1еггаЬас1епит (сейчас СмгЬохускяЬегтиъ) /етгейисет в качестве отрицательных кот ролей (рис 2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1) 12 13
б
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
12 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12 13
Рис.2 Идентификация представителей рода Thermoanaerobacter после электрофореза продуктов ПЦР, полученных с праймерами Нас Г 8F и Unív 1492 R (а), с помощью родоспецифичиого зонда Tab 827 (б), м группоспецифичных зондов Tab l 844 (в), l it h 2 424 (г) и Tab 3 184 (д). Дорожки: M - маркер молекулярного веса (2000,1200, 800, 400, 200,100 п.н.); 1 -T. sulfurophilus; 2 - T. italiens', 3 — С. pacificas; 4 - шт амм В5; 5 - штамм К14; 6 - штамм К67; 7 - ш гамм 518; 8 - штамм 711 ; 9 - штамм 761;
10 - накопительная культура 816;
11 - Moorela glycerinï,
12 - Thermoterrabacteriwn
(Carboxydothermus) ferrireducens-,
13 - н2о.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Общегрупповой зонд прореагировал со всеми ШДР-продуктами, полученными с бактериальными праймерами на ДНК всех представителей рода Thermoanaerobacter и; Caldanaerobacter. С 1 ШР-продуктами, полученными с использованием ДНК '
отрицательных контролей, зонд сигнала не дал.
Зонд Tab_l 844, специфичный к первой группе рода Thermoanaerobacter, дал положительный сигнал с ампликоном T. sulfurophilus. С ПЦР-продуктами | отрицательных контролей зонд не реагировал.
Зонд Tab_2 424, специфичный ко второй группе рода Thermoanaerobacter дал-положительный сигнал с T. italiens. С ПЦР-продуктами отрицательных контролей зонд не реагировал.
Зонд Tab_3 184, специфичный к третьей группе рода Thermoanaerobacter дал положительный сигнал с С. subterraneus sub sp. pacificus. С отрицательными контролями зонд не реагировал.
Таким образом, результаты гибридизации подтвердили специфичность зондов и послужили основанием для и\ использования при анализе природных проб и накопительных культур Разработанный нами метод позволил достоверно детектировать бактерии родов ТИеппоапаеюЬаМсг и Са1с!апаеп>Ьас1е1, а также определять их принадлежность к одной из внутриродовых групп видов
2.1.2. Идентификация чистых культур микроорганизмов
С помощью ПЦР с бактериальными праймерами и последующей гибридизации с разработанными зондами были проанализированы неидентифицированные штаммы анаэробных термофильных микроорганизмов, морфологически сходных с ТИеппоапаетЬаМсг Получение ПЦР-продукта с использованием бактериальных праимеров показало, что все исследуемые штаммы относятся к бактериям Метод гибридизации с олигануклеотидными зондами позволил не только отнести ряд штаммов к роду ТИеппоапаетЬсШег. но и установить принадлежность штаммов к той или иной из трех групп (табл 2)
Таблица 2 Идентификация анаэробных термофильных бактерий иVIем гибридизации с олигонуклеотидными зондами на роды ТкегтоапаегоЪшЛег и СаЫапаегоЬаЫег
Штамм Источник выделения Фснотипичес- кис особенности ПЦР с Bact8F и Univ 1492R Гиб ридтания с зондами
ТаЬ 827 ТаЬ 1 844 ТаЬ 2 424 ТаЬ 3 184
В5 Байкал Способность к гидролизу агарозы + + + j 1
К14 Камчатка « + + + ! - -
К67 Камчатка « + + - +
518 Восточное тихоокеанское поднятие Рост на морской среде, оптимум рН б 0 минимум рН 3 8 + + +
711 Камчатка, До тина Гейзеров, осадки Температурный оптимум 55 'С, оптимум рН 5 7, минимум рН 3 8 + +
761 Камчатка, Оранжевое ноте, осадки Температурный оптимум 60 "С, оптимум рН 5 0, минимум рН 3 2 + Н 0 н о н 0
2707 Остров Кунашир Анаэробный рост на СО с образованием н2 f + +
107 Морские гидротермы Рост на морской среде + + + - -
Примечание «+», положитетьная реакция, «-», отсутствие положительной реакции, "но" не определячи
Было показано, что два организма, способных к гидролизу агарозы, относятся к первой группе рода Thennoanaembacter, а один - к третьей группе этого рода (ныне род Caldanaerobacter) Способность к гидролизу агарозы - свойство, впервые обнаруженное у термофильных анаэробов
Все известные до сих пор виды рода Thennoanaembacter являлись нейтрофилами с минимальным рН роста 4 7 Мы обнаружили, что к роду Thermoanaerobacter относятся два анаэробных ацидофильных штамма, которые способны расти при рН 3 8 (штамм 518, выделенный из глубоководных гидротерм, и штамм 711, полученный из гидротерм Камчатки) Два штамма (518 и 107), выделешше из гидротерм Восточно-Тихоокеанского поднятия, оказались представителями 1 -ой группы рода Thermoanaembacier Ранее представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter не обнаруживали в глубоководных шдротермах, единственным исключением является Caldanaerobacter subterraneus subsp pacifiais Этот же организм отличался способностью к анаэробному росту с СО, сопряженному с образованием водорода из воды (Sokolova et al, 2001) Такой же тип метаболизма свойственен и штамму 2707, который был идентифицирован нами как представитель рода Caldanaeiobacter
2.1.3. Детекция представителей Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных культурах и природных образцах
Присутствие представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных культурах железовосстанавливающих, СО окисляющих и ацидофильных органотрофных термофильных прокариот было исследовано с помощью ПЦР с бактериальными праймерами и гибридизации с олигонуклеотидными зондами, приведенными выше (табл 3)
Таблица 3 Детекция бактерий p. Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в анаэробных накопительных Kj.n.Tvpax, полученных в различных условия
Обозначение накопительной культ>ры Источник Фенотипическне особенности ПЦР с Bact 8Fn Univ 1492R Гибридизация с зондом Tab 827
816 Камчатка, вулкан Мутновский Рост на дрожжевом экстракте с 5,Т60°С,рНЗ,5 + -
GB2 Гуайамская впадина Анаэробный рост на СО с образованием 1Ь + -
Kar Камчатка Анаэробный рост на СО с образованием 1Ь + -
746 Камчатка, Эранжевое поле, эсадки Рост на ацетате в присугствии ЕеШ1),Т60'€,рН4, +
К44 416 Камчатка, Долина Гейзеров Курильские острова Восстановление Ре(Ш) в присутствии Н2 Т 70° С, рН 6 8 Восстановление Ее(Ш) в присугствии Н2, Т 70° С. рН 6 8 + + +
432 Курильские острова Восстановление Ее(Ш) в присугствии На, Т 70°С, рН 6 8, + -
Во всех исследованных накошпельных культурах присутствовали бактерии Однако при гибридизации с зондом Tab 827, общим для родов Thermoanaewbatter и Caldanaerobacter, положительный сигнал был получен лишь с ПЦР-продукгом из одной железовоссганавлившощеи накопительной культуры (К44) Таким образом, в остальных термофильных накопительных культурах исследуемые процессы осуществляют иные, чем Thermoanaeiobactcr и Caldoanaembacter организмы, что делает перспективным их последующее выделение и характеристику
Метод гибридизации с зондами на роды Thennoanaeiobacter-Caldoanaeiobacter был использован для обнаружения представителен этих родов в образцах из гидротермальных источников кальдеры Узон и Долины Гейзеров па Камчатке Продува амплификации ДНК, выделенной из этих проб, с бактериальным и праимерами был получен в 13 образцах из 20 проанализированных При анализе продукта ПЦР методом гибридизации со специфическими олиюпукдеотидными зондами, описанными выше, положительные сигналы с зондом на Thermommerbactet-Ccildanaerobactei были полечены в трех образцах В этих же образцах детектировались представители первой ipyinru рода Thermoanaembacter (табл 4) Таблица 4 Детекция бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в пробах из наземных горячих источников_
Обозначение природного образца Характеристики mccj а отбора пробы Гибридизация с зондами
Tab 827 Tab 1 844
Узон
1222 рЕ1 5 3, 56 °С - II д
1208 рН 5 5,63 °С f +
1209 рН 6 7, 74 °С + ь
1211 рН 5 0, 68 °С + +
1212 рН 6 0, 83 °С - н д
1213 рН 5 5, 77 °С - НД
1220 рН 5 9, 57 °С - нд
NTP1 рН 7 0,99 °С - НД
47К рН 7 4, 99 °С - 11 д
Долина Гейзеров
1310 рН 8 3, 71 °С - нд
1311 рН 8 2,78 °С - нд
1307 рН 8 4, 57 °С - нд
Примечание ид - нет данных (гибридизация не проводилась)
Таким образом, представители рода ТкеппоапаеюЪаиег были обнаружены в природных пробах с рН от 5 0 до 6 7 и температурой от 63 до 74 °С, что соответствует физиологическим характеристикам рода Все детектированные
микроорганизмы относились к I группе рода Thermoanaerobacter, что свидетельствует о ее широкой распространенности в наземных горячих источниках
2.2. Характеристика представителей родов Thermoanaerobacter и Caldctnaerobacter, обладающих новыми свойствами
У идентифицированных нами методом гибридизации с олигонуклеотидными зондами представителей группы Thennoanaerobacter - Caldanaerobacter был выявлен ряд новых свойств способность к гидролизу агарозы, рост на СО с образованием Н2 Микроорганизмы, обладающие этими свойствами, были исследованы нами детально
2.2.1. Характеристика представителей родов Thermoanaerobacter и Caldoanaerobacter с агаролитической активностью
Путем гибридизации с олигонуклеотидными зондами агаролитические штаммы В5 и К14 были идентифицированы как представители первой группы рода Thermoanaerobacter Анализ последовательности генов 16S рРНК показал, что штамм В5 относится к виду Thennoanaerobacter wiegeln (99 8 % сходства) а штамм К14 наиболее близок к Thermoanaerobacter sulfurophilus (99 6% % сходства) Принадлежность штамма К67 к роду Caldanaerobacter, установленная на основании гибридизации с группоснецифичными зондами, была подтверждена анализом последовательности гена 16S рРНК, показавшим 95 1 - 96 3 % сходства с представителями рода Caldanaerobacter, чхо позволило отнести изолята К67 к новому виду этого рода
В настоящее время род Caldoanaerobacter представлен четырьмя подвидами одного вида - Caldoanaerobacter sitbterraneus (Fardeau et al, 2004) Бактерии вида С subten aneus выделены из подземных местообитаний или из глубоководных гидротерм Штамм К67 является первым представителем рода Cadlanaembacter, выделенным из наземных гидротерм (из пробы цианобактериального мата источника Термофильный кальдеры Узон)
Ряд фенологических признаков нггамма К67 является общим для рода Caldoanaerobacter (табл 5) Однако от подвидов С sitbterraneus его отличаег более низкий температурный оптимум и максимум роста, иной спектр используемых субстратов и одновременное образование водорода, этанола и лакгата при брожении глюкозы Процент ДНК-ДНК гибридизации штамма К67 с С subtenaneous subsp tencongensis составлял 51+0 5 %, а с типовым штаммом Сsubterraneus subsp subtenaneus (DSM 13054х) - 21+0 5 %, что подтверждает принадлежность штамма К67 к новому вид}' Положение штамма К67 на филогенетическом дереве показано на рис 3
I а блина 5 Диагностические признаки штамма К67 и других нидон рода Caldoanaerobacter
Признак С зиЫеггапеиз БиЬчр 1спсоп%епш С subterranem Mibsp yonsiensus С subterraneus subsp pacifiais С тЫеггапси}. хи 1жр яиЫеггапеи!, Штамм К 67
Форма и размер клеток Палочки одиночные или в цепочках. Тонкие длинные палочки Вствящиеся палочки Одиночные ити двойные палочки Одиночные палочки, шкида двойные 0 30 5x2 -15 'т
Наличие жгутиков - h - "г
Температура, °С мин /опт /макс 50/75/80 50/75/85 50/70/80 40/65-75/80 50/62-70/76
рн мин /опг /макс 5 5/7 0/9 0 4 5/6 5/9 0 5 8/6 8-7 2/7 6 5 7/7 0-7 5/9 2 4 8/6 8/8 0
Субстраш Сахара, полисахариды необходим дрожжевой экстракг Сахара, пептиды, полисахариды необходимы дрожжевой экстракт СО в присутствии пептона, ацетата, или дрожжевой экстракта, сахара, полисахариды, пептиды Сахара, полисахариды пептиды, для роста необходим дрожжевой экстракт Сахара, пептиды, потисахлриды тугоплавкая агароза
КаС1% мин/опт/макс 0/0 2/2 5 0/0/4 -/2-2 5/- 0/0/3 0/0 5/2
Рост па СО - - + - -
Основные продукты метаболизма Ацетат, этанол, СО:. Н; Лакгат, ацетат, этанол, СО?, Ацетат, С02 Ацетат, Ь-хтанин, лакгат, Ш, С02 Ацетат, лактат, Н2, С02, этанол
Г+Ц состав ДНК, мол % 33 37 33 38 4-41 32-34 2
0.05
CatAmcerohothr vilncmiwrn SL9. AY21t>59"
liw
Cpímmaerdww v/nmwi* «р. тЬ',чгмеч$ SEBR ?S5g*. AFll>5?
Cahlamatihücter subtemineas ssp. pacificas 2707, F.FS54S91)
Califamreivbt'ch'r rubh'mtwti\ ~г.1ър. nwrieim KB-r.
CaWanaeróbecter subtemineas SP 47, EF554598
- ( Vrhyt lillirin. \-]> ,V»o¡"<
С oÜíil'l-Ji'lvlh'Cfer UiOli?!T¡¡h'CÍ!-S >sp •Mcifian DSM 12о55т. AF:"4-IX-I i CaMmuwrobticler wnensis IW HI К \ 119. EFS300ÓS CttUUmnmbaaer tizoiwim K67T. EF195126
СвМшлтЫмкг и'.Ь'ссппе'и OCA i. AY2lo596
IA.M 135"1 . L09Uv ГмгтаклегоЫгсм ,Wra D.SM 2rt.í(tT f.iwjft'l L. ni!'n4-.«iimtr<iíiíi:(«-iiwíiiDSM 145"'. II*) 165 ш -— Tbennoamiavhtaer «kmifícti» Jtt 2WT. Х58л4: • ШптжпЫтш -.liegcHi DSM Í0519T. ,V2?i3 —— Tiu'rnmumroh'.uiíriiim йшяЛлум) ЛТ( С l.iWI"
Рис. 3 . Положение штамма К67 на филогенетическом j дереве, построенном основании сравнени нуклеотидных последовате.; п>н осте! 16S рРНК.
. aostñ-Mm Ытгк mu А1СС 19»'. М5ШУ
ertebta cob АКТ I! :от. Xs0~25
2.2.2. Описание новою вида Caldanaerobacter uzonensis К67
Caldanaerobacter uzonensis (uzo.nen'sis N.L. masc adj. uzonensis, выделенный из Кальдеры Узон, Камчатка).
Клетки представлены палочками размером 0.3-0.5 х 2 -15 мкм, одиночными или1 в парах. Рост происходит в интервале температур 50-76 °С с оптимумом при 62-70 °С: и в диапазоне рН 4.8-8.0 с оптимумом при 6.8. Строгий анаэроб, органогетеротроф,' способен расти на различных сахарах, полисахаридах и пептидах. Использует1 лактозу, арабинозу, глюкозу, сахарозу, галактозу, ксилозу, декстрин, пируват, декстрозу, трегалозу, пептон, фруктозу, сорбит, крахмал. Слабый рост наблюдается на пектине, целлюлозе (фильтровальная бумага). Не растет на рамнозе, казеине,! цистеине, рибозе, ксилане (рис. 4). Тиосульфат стимулирует рост, восстанавливаясь в сероводород. В процессе брожения на пептоне происходит восстановление I слабокристаллического оксида Fe(III).Элементная сера, сульфат, сульфит, нитрат не | восстанавливаются и на рост не влияют. Основными продуктами метаболизма при брожении на глюкозе являются ацетат, лактат, Н г, С02 , этанол.
Типовой штамм К67 т (08М2 18923т, УКМ В-2408т) выделен из цианобактериального мата источника Термофильный Кальдеры Узон, Камчатка.
50
0 крахмал
□ кератин Шсорбит 13 фруктоза
□ целлобиоза
□ хитин Оксилан
□ пептон 0 рибоза Ятрипалоза Вдекстроза 3 целлюлоза йпируват
0 цистеин □декстрин
100 клетки, х10'
Рис. 4. Использование субстратов штаммом К67
2.2.3 Способность штаммов рода СаЫапаегоЬасгег к росту на СО
Штамм 2707 был идентифицирован как представитель рода Сак1апаегоЬас(ег. Это второй член этого рода, помимо СаШапаегоЬас1ег тЫеггапеш зиЬзр. расфсыз | (8око1оуа е1 а!., 2001; Рагс1еаи е£ а!., 2004), способный к росту на СО с образованием ' водорода. Анализ последовательности гена 168 рРНК подтвердил принадлежность I штамма 2707 к роду СаМоапаеюЬас1ег. Высокий уровень сходства I последовательности 16Э рРНК (98.6 %) и высокий уровень ДНК-ДНК гибридизации I (80±0.5%) с С, зиЫеггапеих яиЫеггапеия позволяег отнести штамм 2707 к виду С. 1 ьиЫеггапеш. Таким образом, способпость к анаэробному росту с СО характерна для ряда штаммов этого вида.
2.3 Характеристика агаразной активности штаммов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter
Штаммы К67 и В5 хорошо росли на среде с агарозой (от 0,3 до 2% ) как единственным субстратом роста. Однако наилучший рост наблюдался при добавлении от 1 г/л до Зг/л галактозы. Агаролитическую активность измеряли при различных концентрациях агарозы в среде, с внесением дополнительного субстрата и без него. Наибольшая активность наблюдалась при выращивании на 0.6% агарозе в присутствии 3 г/л галактозы. Из трех агаролитических штаммов (К67, К14 и В5)1 наиболее активным агаролитиком оказался штамм Т. wiegeln В5. В процессе его роста агаролигическая активность была детектирована как в супернатанте, так и в1 осадке неразложившейся агарозы. Через 2-3 дня культивирования агаролитическая : активность в супернатанте достигала 0.12-0.17 ед/мл; в осадке она обычно не превышала 18-20% от активности в супернатанте. Для выделения агаразы использовали кулыуральную жидкость штамма В5. Для выделения активною белка был использован препаративный электрофорез. После фильтрования и концентрирования был получен раствор фермента с суммарной активностью 18.8 ед. при содержании белка 50 мкг (удельная активность 376 ед/мг).
Характеристика термостабильной агаразы. Молекулярная масса агаразы Thermoanaerobacter В5 была определена с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и составила около 67 кДа. Изоточка фермента оказалась равна 4.2. Ферментативная активность проявлялась в диапазоне pH от 3.5 до 7.0 с максимумом при pH 5.2 (рис. 5). Ферментативная активность наблюдалась в интервале температуры от 50 до 80 °С с максимумом при 70°С (рис. 6). При инкубации при 90°С в течение 60 мин агаразная активность не уменьшалась.
Рис. 5. Влияние pH на активность агаразы штамма Т. wiegeln В5 (в 100 мМ буфере *>аЛ1РО_!-.111Шшная кислота)
За единицу агаразной активности принимают такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 мкмоля галактозы за 1 мин.
Таким образом, нами была выделена первая термостабильная агараза, продуцируемая анаэробной термофильной бактерией Thermoanaerobacter wiegeln штамм В5.
Рис 6 Влияние температуры на агаратную актииность Т wiegeln В5
2.4. Исследование карбокеидотрофии у представителен рода Caldoanaerobacter и детекция генов фермент нон» комплекса, ее об} сдавливающего
Анаэробное окисление СО с образованием водорода известно для нескольких мезофильных бактерий, наиболее изучена среди них фотогрофная альфа-протеобактсрия Rhodospirillum rubrum (Kerby et al, 1995) Первым термофильным микроорганизмом, способным к осуществлению этого процесса был Carboxydotheimus hydmgenofonnans (Svetlichny et al, 1991) Из клеток С hydmgenoformans были выделены и очищены три Ni-содержащие СО-дегидрогеназы СО-дегидрогеназа 1 оказалась частью ферментного комплекса, осуществляющего окисление СО с образованием Н2 и генерацией трансмембранного потенциала СО-дегидрогеназа 2 участвует в восстановлении НАДФ СО-дегидрогеназа 3 входит в энзиматический комплекс, осуществляющий ассимиляционный синтез ацетил-КоА из С-1 единиц (Svetlitchny et al , 2001, Dobbek et al, 2001, Sobo et al, 2002, Svetlitchny et al, 2003) При анализе полного генома Carboxydothermus hydmgenofonnans помимо генов cooSl, cooS2, cooS3 обнаружено присутствие еще двух генов, кодирующих анаэробные СО-ДГ с неизвестным пока функциями (cooS4, cooS5), а также показано значительное сходство генных кластеров, включающих ген cooSl С hydmgenoformans и ген cooS R rubnim (у R rubrum этог генный кластер получил название кластера соо) Оба эти генных кластера содержат, помимо генов cooS, ген cooF ферредоксин-подобнош переносчика электронов и гены мембраносвязанной гидрогеназы, состоящей из нескольких субъединиц, включая ген каталитической единицы сооН
Предположив, что ключевую роль в процессе гидрогеногешюи карбокеидотрофии играет энзиматический комплекс, кодируемый генным кластером соо, мы решили проверить его присутствие у способных к этому процессу представителей рода Caldanaembacter, а также у других гидрогеногенных карбоксидотрофов, имеющихся в коллекции лаборатории Для этого нами были
разрабоганы пары праймеров cooS-I_160F - cooS-I_1804R на основе шнсенсусной последовательности нуклеотидов генов СО- дегидрогеназ cooS R rubrum и cooSl С hydmgenoformam, пара праймеров cooH_35F - cooH_963R на основе консенсусной последовательности нуклеотидов генов гидрогеназы сооН этих организмов, а также для выявления возможного присутствия этих генов в составе единых генных кластеров, пара праймеров cooH_963F - cooS-I_160R, из которых один отжигался бы на гене СО-ДГ, а другой - на гене гидрогеназы сооН (табл 6)
Таблица 6 Праймеры, использовавшиеся для ПЦР-амплифпкации соо генов
Названия Пуклеотидные последовательности, 5'->3' Мнигепь
cooS-IJ60F cooS-I 1804R CCYTGTCGYATCGATCCM iTTGGC AATAACCGCCCASCAARTCYTTSGC Ген СО-дегвдрогеназы соо£-7
cooH_35F + cooIl_963R ATG'I GGCCCTKGAAGAGCCGATGTA CCAGTTCATAIARG TKGGWACSCGC Ген гидрогеназы сооН
сооН 963F + cooS-I 160R GCGSGTWCCMAC YTATATGAAC1GG GCCAAAKGGATCGATRCGACARGG Кластер генов сооН соо$-1
cooF_475F + cooS-I 1304R ATGCTGGTRGATTMCGAAAGYTATCG GCAATRCCYTGAÄTGTTRCCGTTAA Субкластер генов спо1< - сооБ-!
cooS-II_140F + cooS-II 1840R GCTGCCGSCACTGCCTGCARGGC GGAGCTT WTCGGC CGCKGWYTCGGG Ген СО-дегидрогеназы сооБ-Ц
cooS-III_267F + cooS-IIl 1723R YGGMGCITCYGCSTGGACCAT i"G TTACCGCTCATRGCTTCMGGRGCYG Ген СО-дегидрогеназы соо8-Ш
cooS-IVJ67F + cooS-IV 864R GGATMGACCC YTTYGGRGAAGG А GGTACARCAWATCCCRGCAASATTG Ген СО-дегидрогеназы соо$-1¥
cooS-V_142F 4 cooS-V 1663R CAGCTYTGCWSTAAYGGTCCT1GCGTC WATRGTAGCTTTYTGTTCCÄT Ген СО-дегндрогеназы сооХ-У
cooS-II 1226R TGAGAGCATTGATGATGGCTTCCG Ген СО-дегидрогеназы сооЗ-11
cooS-IIIJ256R CCAGCTACAAC1TTATGITTAACC Ген СО-дегвдрогеназы соо8-Ш
Кроме того, на основании анализа пуклеотидных последовательностей генов соо£2, сооЗЗ, сооБ4 и сооЯ5 СО-ДГ СагЬохуйгЯкеппих hydrogenoformans и генов родственных им СО-ДГ других организмов были разработаны пары праймеров для поиска подобных генов у гидрогеногетшых карбоксидотрофов (табл 6)
Полученные на первом этапе результаты показаны на рис 7, из которого видно, чю у представителей рода СаЫстаегоЬасгег выявить гены СО-ДГ не удалось
Рис 7 Электрофорез в агарозиом геле проектов ПЦР сп ран морами на i сны СО-ДГ 1 - Carboxydothermus hу drogenofomans, 2 - Bacillus subttlis\
3 - Thennohthobacter carboxy divorans\
4 - Carboxydocclla thermautotrophica,
5 - Thermohthobacter carboxy divorans\
6 - Caldanaerobacier sublerraneus subsp. patificum .IMT; 7 - Caldanaerobacier sublerraneus subsp y onseiensw,
8 - Carboxydothermus femreducensfpAuee Thermoterrabactenumfernreducens),
9 -II20,10 - Carboxy dothermu s hydrogenofomans-, 11 -Bacillus subtilis,
12 - Thermohthobacter carboxy di\orans,
13 - Carboxy docella thermautotrophica;
14 - Thermosuius carboxy divorans,
15 - Caldanaerobacier sublerraneus subsp pacifiais; 16- Caldanaerobactcr subterraneus subsp yunseiensisi
17 - Carboxydothermus ferrtredu cv/nfpuucc Thermoterrabactenum ferrireducens), I8-II2O,
M - маркер молекулярного веса X
В ю же время гены СО-ДГ типа cooSl выявились у гидрогеногенных карбоксидотрофов Therniolithobacter carboxydivorans и Therniosinus carboxydtvorans На основании вновь определенных нуклеотидных последовательностей нами были разработана еще одна пара праймеров на генный субкластер cooF - cooSl Все полученные результаты представлены в таблице 7
Таким образом, наши результаты показали своеобразие генетических детерминант i идрогеногенной карбоксидотрофшг у представителен рода Caldanaerobacter па фоне единства их организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов В дальнейшем анализ полного генома С subterraneus subsp pacificus подтвердил иную, чем у Carboxydothermus, организацию генного кластера, ответственного за процесс гидрогеногенной карбоксидотрофии у представителей род Caldatwembacter Генный кластер С subtenaneus subsp pacificus включает гены, гомологичные генам кластера соо, однако они расположены в другом порядке, а кодируемые ими белки имеют существенно отличную перви чную структуру
M 1234567 8 9 10 11 12 13 1415 161718М
СО-ДГ 1 со-дг H
M 1234567 89 10 И 12 13 14 IS 16 17 18 M
--v-
СО-ДГ HI
СО-ДГ IV
M 1 2 3 4 S 6 7 8 9 M
СО-ДГ V
Таблица. 7. Детекция генов, обуславливающих способность к анаэробному окислению СО с образованием во дорода у коллекционных
штаммов термофильных представителей ПггтсШез
Штаммы cooS-l_160F L-ouS-I 18U4R cooF_475F cooS-I_1304R cüoHJSF cooH_965R cooH 963 F cooS-I_160R coüS-[(_ cooS-H_ 140 F 1840R cooS-IH cooS-III „267F _1723R iiiiiii couS-IVJ67F caoS_IV_864R CooS-V_ CooS-V_ 142F 1663R
к 1 rfr U rma* у »liili Щ§§|;|| II illtl Ш iiilül lililí!!
Cavboxydothemius ferrireditcens - ND - +(97.1) +(98.2) +(99.5) +(97.3)
iüsimmmm <nrlnnnfariw -i4«l lili W II III Ihit IIIIIIÉ! ||| ЩМШШЩ *
rttrftótyh* .'fct tksrm. mnrt,opino, y .45 Íiíl-lif ill
Шк j íSiftíS f ' ipis
lt>< 1 in'th 1<¡4 . ,1/rr и U¡ r: ) i ' -i- X: Ж йй
tiMU «iithrnu. tu caritaxt'i-'cs ■<S<>¡ ¡ ll 111 III (Si) lililí 111 рАУЙАУА'АВДййА; iiiii
< 'i ' í U f о'Шчшип put f/'t И-Л í üllÍMUh nrftíii l f \uhttrn »•, íV i!§i ¡i lililí II lili Щ 11 1 $111 'M-'-M lili ||§|g |l| 11 1 1 II üil i i III И III ¡§ij¡ #11 1 Ш ■ШШШ*?
'Caldanaerobacter uzonensis' K67 - ND - - - -
Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis ND ; + (ND)
Caldanaerobacter subterraneus subsp. yonseiensis ND I
Bacilhis subtilis - ND ¡ - - - - -
Примечания: Серым цветом выделены гидрогепогенные карбоксидотрофы. В скобках указаны результаты ЫаяТЫ -поиска в геноме СагЬохусЬЛеггт в кус1го£епоГогтип.\
ю о
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Примененный нами метод гибридизации с олишнуклеотидными зондами позволил не только отнести ряд штаммов к группе Thermoanaembacter-Caldanaerobacter, но и дифференцировать штаммы по принадлежности к родам или одной из двух групп внутри рода Thermoanaerobacter Полученные результаты расширяют представления о распространении и физиологических свойствах исследуемой группы термофильных прокариот Впервые нами были обнаружены представители рода Thermoanaembacter в глубоководных гидро!ермах Восточно-Тихоокеанского поднятия Обнаружено, что к роду Thermoanaetobacter, ранее включавшему только ней грофилов, относятся два ацидофильных im амма способных расти при pH 3 5
Установлено, что зри штамма, относящиеся к родам Thermoanaembacter и Caldanaerobacter, способны к гидролизу агарозы (свойство, впервые обнаруженное у термофильных анаэробов) Ранее микроорганизмы с агаролитической активностью выделяли из морских местообитаний, где источником агара как субстрата для mix служили морские красные водоросли Наши данные указывают на то, что агаролитические прокариоты мог\ т населять также наземные горячие источники, где субстратами для них могут являться полисахариды цианобактерий, образующих цианобактериалыгые маты (Герасименко и др, 1983, Намсараев и др, 200б) Агаролитическая активность бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaetobacter охарактеризована на примере штамма В5, идентифицированного нами как Thermoanaembactet wiegeln Ферменг отличается высокой удельной активностью, высоким температурным оптимумом и может быть использован в препаративной молекулярной биологии
Реклассифицированный французскими исследователями род Caldanaetobactet до настоящего времени содержи только один вид В данной работе описана анаэробная термофильная бактерия (штамм К67), выделенная из горячего источника Камчатки, представляющая второй вид рода Caldanaembacter - Caldanaembacter uzonensis, sp nov
Способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода свойственна многом термофильным прокариотам (Sokolova et al, 2002, 2004 a,b, 2005, 2006, 2007) Мы установили, что способный как к росту на СО, так и к органотрофному росту штамм 2707, выделенный из гидротерм Камчатки, относится к роду Caldanaembacter Таким образом, это второй представитель этого рода, способный к анаэробному росту на СО с продукцией водорода
Анализ функциональных генов, обуславливающих способность к росту на СО с образованием водорода у ряда анаэробных филогенетически разнообразных представителей Firmicutes, позволил установить ключевую роль в этом процессе генного кластера, кодирующего ферментный комплекс СО -дегидрогеназы и гидрогеназы Разработанный нами метод может быть применен для экологических исследовании природных образцов и накопительных культур Кластирование генов специализированной гидрогеназы и СО-дегидрогеназы может рассматриваться как
специфический признак и геномный маркер филогенетически разнообразных гидроге но генных карбоксидотрофов
ВЫВОДЫ
1 Показано, что род ТкеппоапаетЬаЫе» может быть разделен на три филогенетические подгруппы, одна из которых была впоследствии реклассифицирована как новый род СаИапаегоЬаЫег
2 Разработан метод идентификации и детекции представителей родов ТИеппоапаеюЬаМег и СаЫапааоЬаЫег, основанный на ДНК-ДНК гибридизации на мембранах с помощью высокоспецифичных отигонуклестидных зондов
3 Установлено присутствие бактерий рода ТкегтпоапаегоЬаМег в глубоководных гидротермах Восточно-Тихоокеанского поднятия
4 Среди идентифицированных представителей родов ТИегтоапаегоЬас!е> и Са1ск»ше> оЬас1а обнаружены штаммы, обладающие новыми для этих родов свойствами - способностью к гидролизу агарозы (Т\кгтоапаегоЪасХег и СаЫапаеюЬасШ) и ацидотолерантностью (ТИегтоапаетЬас(ег), что расширяет представления о физиологии этих родов
5 Впервые выделены термофильные агаролитические бактерии Они идентифицированы как представит ели родов ТЬегтоапаегоЬас!ег и СаШапаетоЬас1ег Описан новый вид СаШапаегоЬаМег топетш, латающийся вторым видом этого рода
6 Охарактеризована агаролигическая активность штаммов 7Ъетоапаего/>ае/ег и Сак/апао оЬасЛа - первых продуцентов термостабилыюй агаразы
7 Установлено, что некоторым представителям рода СаЫапаегоЬаМег свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода
8 Показано своеобразие генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии у представителей рода Са1сктаегоЬас1ег на фоне единства их организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов
Список публикаций
1 Субботина И В , Черных Н А, Лебединский А D , Кубланов И В , Бонч-Осмоловская Е А Олию!7уклеотидные зонды для детекции представителей рода Tiiermoanaerobacter Микробиология 2003 1 72 С 374-382
2 Ьаниикова Г А, Субботина И В, Лопатин СВ, Варламоп ВВ, Боич-Осмоловская ЕА Агаролитические термофильные бактерии р Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter и характеристика термостабильной агаразы из Thermoanaerobacter megelii В5 Прикл биохим микробиол,2008 Т 44 С 404-409
3 Kozina I Hodges М Lec К, Wagner I, Wiegcl J, Slobodkin A, Tourova T, Bonch-Osmolovskaya E , Sokolova T Isolation of Caldanaerobacter strains from terrestrial hot springs and description oiCaldanaerobacter itzonerms sp nov Int J Syst Evol Microbiol, in press
4 Kublanov IV, Prokofeva MI, Subbotina IV, Tourova ГР, Bonch-Osmolovskaya EA Anaerobic thermophilic moderately acidophilic bacteria from Kamchatka hot springs Book of abstracts «The 4th International Congress on Extremophiles» September 22-26, 2002, Naples, Italy
5 Subbotina I V, Chernyh NA, Lebedmskn AV, Kublanov IV, Bonch -Osmolovskaya EA Oligonucleotide probes tor the dctcction and identification of the members of the genus Thermoanaerobacter Book of abstracts «The 4th International Congress on Extremophiles» September 22-26 2002, Naples, Italy
6 Субботина ИВ, Черных HA, Лебединский AB, Бонч-Осчоловская EA Олионуклеотидные зонды для детекции представителей рода Thermoanaerobacter Тезисы стендовых сообщений XV международной зимней научной школы «» 10-14 февраля 2003 г-Москва, 2003, стр
7 Kublanov I V, Prokofev а М I , Subbotina I V, Turova 1 P, Bonch-Osmolov skay a E A Moderately acidophilic, thermophilic, anaerobic bacteria from Kamchatka hot springs //Book
of abstracts «I9 FEMS Congress of European Microbiologists», June 29- July 3, 2003 Slovema, 2003 - P 180
8 Subbotina I V. Chernyh N A, Lebedinskn AV, Kublanov IV, Bonch-Osmolovskaya EA Detection of members of the genus Thennoamerobacter using oligonucleotide probes // Book ot abstracts «Ist FEMS Congress ofEuropean Microbiologists», June 29- July 3, 2003 Slovenia, 2003 - P 181
9 Lcbedmsky AV, Subbotina IV. Chernyh NA, Sokolova TG, Robb FT, Bonch-Osmolovskaya EA Molecular markers of hydrogenogenic carboxydotrophy// 10th International Symposium on Microbial Ecology, Cancun, Mexico, August 22 - 27 2004 Abstracts, p 258
10 I ebedmskv A, Subbotina I. Chernyh N , Sokolova T, Robb F, Bonch-Osmolovskaya E Is the metabolism of diverse hydrogenogenic carboxydotrophs determined by specific-type carbon monoxide dehydrogenases and hydrogenasesWBook of abstracts «The Vth International Congress on Extremophiles», September 12-23, 2004 - P 54
11 Slepova TV, Subbotina IV. Chernyh NA, Tourova TP, Kostrikma NA, Sokolova I G Carboxydocella spomforma sp nov, a novel anaerobic, thermophilic, CO-utilizmg hydrogenogenic bacterium from a Kamchatka hot spring // Book of abstracts «The Vth International Congress on Extremophiles», September 12-23, 2004-P 113
12 Lebedinsky AV, Subbotina IV . Slepova TV, Chernyh N A, Sokolova TG, Occunence of coo-Type Gene Clusters in Phylogenetically Diverse Thermophilic CO-Oxidizing H2-Producmg Prokaryotes// Thermophiles 2005, 8th Int Conf on Thermophiles Research, Gold Coast, Australia, September 18-22, 2005, Program and Abstracts, Griffith University, P46, pp 125-126
Отпечатано в печатном сатане ГРиДА принт г Дубна, ул Кирова, д 26 Тираж 100 экз
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козина, Ирина Владимировна
ВВЕДЕНИЕ 5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Термофильные грамположительные анаэробные бактерии
1.1. Местообитания
1.2. Морфология и физиологические свойства
1.3. Филогения и таксономия
Глава 2. Род ТНегтоапаегоЬас1ег
2.1. Таксономия и ареал обитания
2.2. Фенотипические характеристики
Глава 3. Представители рода СаШапаегоЬас1ег
3.1. Таксономия и местообитания
3.2. Фенотипические характеристики
Глава 4. Ферменты термофильных прокариот и их практическое использование
4.1. Ферменты представителей родов СаШапаегоЬа^ег и ТкегтоапаегоЬа^ег
4.2. Агаразы
4.3. СО-дегидрогеназы
Глава 5. Молекулярно-биологические методы исследования микробных сообществ
5.1. Общая схема исследования микробных популяций молекулярно-биологическими методами
5.2. 168 рРНК и филогенетический анализ
5.3. Выделение ДНК
5.4. Полимеразная цепная реакция
5.5. Метод гибридизации с олигонуклеотидными зондами, in situ гибридизация
5.6. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле
5.7. Недостатки молекулярно-биологических методов в исследовании экологии термофильных прокариот
5.7.1. Выделение нуклеиновых кислот
5.7.2. ПЦР, клонирование
5.7.3. In situ гибридизация 55 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 6. Материалы и методы исследования
6.1. Объекты исследования
6.2. Условия культивирования
6.3. Микроскопические методы исследования
6.4. Выделение и амплификация ДНК
6.5. Подбор олигонуклеотидных праймеров, зондов, гибридизация и детекция сигнала
6.6. Секвенирование и анализ последовательностей генов 16S рРНК и СО-ДГ
6.7. Биохимические методы исследования
Глава 7. Детекция и идентификация представителей рода Thermoanaerobacter
7.1. ПЦР детекция бактерий с общими бактериальными праймерами
7.2. Детекция и идентификация представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter с родоспецифичным зондом и зондами на группы внутри рода
7.2.1. Подбор зондов
7.2.2. Проверка специфичности зондов
7.2.3. Идентификация чистых культур
7.2.4. Детекция представителей Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в природных образцах и накопительных культурах
Глава 8. Поиск новых термостабильных агараз
8.1. Культивирование штамма, способного к росту на агарозе
8.2. ПЦР амплификация и сиквенс 16S рРНК агаролитической культуры
8.3. Физиологические характеристики роста штамма К
8.4. Выделение и очистка термостабильной агаразы
8.4.1. Агаролитическая активность
8.4.2. Характеристика термостабильной агаразы
Глава 9« Поиск СО-дегидрогеназиого комплекса у бактерий родов Caldanaerobacter и Thermoanaerobacter с помощью специфичных групп праймеров
9.1. Способность штаммов рода Caldanaerobacter к росту на СО
9.2. Исследование карбоксидотрофии у представителей рода Caldanaerobacter и детекция генов ферментного комплекса, обуславливающего гидрогеногенную СО-трофию 86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94 ВЫВОДЫ 96 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная детекция и новые фенотипические свойства термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter"
Актуальность работы. Интерес к термофильным микроорганизмам, которые активно исследуются последние два десятилетия, определяется задачами как фундаментального, так и прикладного характера. Последние в основном связаны с наличием у термофильных прокариот термостабильных ферментов и возможностью их применения в различных областях биотехнологии. Многие микробиологические и биохимические исследования посвящены органотрофным термофильным бактериям, в том числе обладающим способностью к гидролизу различных биомолекул. К ним относятся анаэробные умеренно-термофильные органотрофные бактерии, впервые описанные как представители рода Clostridium, но затем отнесенные к родам Thermoanaerobacterium и Thermoanaerobacter (Lee, 1993). В настоящее время в род Thermoanaerobacter входит 14 видов, выделенных из различных мест обитания: горячих источников (Zeikus et al., 1979), цианобактериальных матов (Бонч-Осмоловская и др., 1997), вулканических озер (Slobodkin et al., 1999), высокотемпературных нефтяных пластов (Cayol et al., 1995) и др. Это умеренные термофилы, облигатные анаэробы с бродильным типом метаболизма, способные в процессе брожения восстанавливать различные неорганические акцепторы электронов - серу, тиосульфат, окисное железо. Экстремально-термофильные организмы, первоначально отнесенные к этому роду (Xue et al., 2001; Kim et al., 2001), впоследствии реклассифицированы как представители нового рода Caldanaerobacter (Fardeau et al., 2004). Представители родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter оказались способными к синтезу протеиназ с новыми, ценными для биотехнологии свойствами (Riessen et al., 2001, Jang et al., 2002). Однако можно предположить, что разнообразие метаболических свойств и биотехнологический потенциал этих микроорганизмов еще далеко не г исчерпаны. Это делает актуальным детальное исследование распространения и метаболического разнообразия термофильных бактерий, относящихся к родам ТЬегтоапаегоЬаМег и СаЫапаегоЪа^ег.
Цель работы. Целью данной работы являлось исследование распространения и разнообразия бактерий рода ТкегтоапаегоЬаМег и СаМапаегоЪаМег молекулярно-биологическими методами.
Основные задачи исследования состояли в следующем:
1) разработка методов молекулярной детекции и/или идентификации термофильных бактерий родов ТкегтоапаегоЪа^ег и СаШапаегоЬа&ег;
2) детекция термофильных бактерий рода ТкегтоапаегоЪаМег и СаШапаегоЬа^ег в накопительных культурах и природных образцах;
3) идентификация изолятов, фенотипически сходных с ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЬа&ег, но имеющих новые для этих родов свойства;
4) выделение и характеристика новых представителей этих таксонов;
5) характеристика ферментативных активностей и/или генов, кодирующих новые ферменты, у бактерий группы ТкегтоапаегоЪаМег/СаШапаегоЬаМег.
Научная новизна. Впервые разработаны олигонуклеотидные зонды для детекции и идентификации бактерий родов ТкегтоапаегоЬа^ег и СаШапаегоЬа^ег. Доказана их высокая специфичность, что позволяет детектировать представителей ТкегтоапаегоЬаМег и СаШапаегоЬаМег непосредственно в накопительных культурах и природных образцах, а также идентифицировать штаммы без необходимости культивирования.
Полученные результаты расширяют представление о распространении и физиологии термофильных бактерий родов ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЪа&ег. В то время как все известные ранее виды родов
Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter являлись нейтрофилами с минимальным рН роста 4.7, нами были идентифицированы как представители рода Thermoanaerobacter два анаэробных ацидофильных штамма, способные развиваться при рН 3.5. Впервые бактерии рода Thermoanaerobacter были обнаружены в пробах из глубоководных гидротерм. Впервые для термофильных прокариот установлена способность микроорганизмов родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter к гидролизу агарозы.
Установлено, что некоторым представителям рода Caldanaerobacter свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода. Сравнительное исследование генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии, проведённое с помощью ПЦР с разработанными нами праймерами, показало их своеобразие у представителей Caldanaerobacter на фоне единства организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов. Полученные данные подтверждаются результатами анализа полных геномов анаэробных карбоксидотрофов.
Практическая ценность работы. Разработанные нами олигонуклеотидные зонды позволяют идентифицировать представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных и чистых культурах, минуя стадии определения фенотщшческих дескрипторов, а также детектировать их в природных образцах. Полученные данные важны для развития представлений о распространении и физиологии родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter. Разработанный нами метод может быть использован для экспресс-детекции изолятов, в том числе при поиске представителей новых филогенетических групп.
Описанные нами агаролитические штаммы могут быть использованы для получения термостабильной агаразы с целью ее применения в молекулярной биологии для освобождения нуклеиновых кислот и белков из тугоплавких агарозных гелей.
Разработанные нами методы детекции генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии могут быть использованы для исследования экологии и распространения водородобразующих СО-трофов.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Международном Конгрессе «Экстремофилы-2002» (Италия, Неаполь, 2002), 1-ом Международном FEMS Конгрессе Европейский микробиологов (Словения, Любляна, 2003), XV Международной зимней молодежной научной школе (Москва, 2003), VII Международной конференции «Термофилы-2003 (Экзетер, Англия), V Международном Конгрессе «Экстремофилы-2004» (США, Мэрилэнд, 2004), VIII Международной конференции «Термофилы-2005» (Серфере Парадайс, Австралия, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 9 тезисов, 1 статья находится в печати.
Объем работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах и включает 12 таблиц и 11 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов, результаты и обсуждения исследования, выводов и библиографического списка.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Козина, Ирина Владимировна
выводы
1. Показано, что род ТкегтоапаегоЬаМег может быть разделен на три филогенетические подгруппы, одна из которых была впоследствии реклассифицирована как новый род СаМапаегоЪаМег.
2. Разработан метод идентификации и детекции представителей родов ТкегтоапаегоЬаМег и СаМапаегоЪаМег., основанный на ДНК-ДНК гибридизации на мембранах с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов.
3. Установлено присутствие бактерий рода ТкегтоапаегоЪаЫег в глубоководных гидротермах Восточно- Тихоокеанского поднятия.
4. Среди идентифицированных представителей родов ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЪаЫег обнаружены штаммы, обладающие новыми для этих родов свойствами - способностью к гидролизу агарозы (ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЬаМег) и ацидотолерантностью (ТкегтоапаегоЬаМег), что расширяет представления о физиологии этих родов.
5. Впервые выделены термофильные агаролитические бактерии. Они идентифицированы как представители родов ТкегтоапаегоЬаМег и СаМапаегоЬаМег. Описан новый вид СаМапаегоЬаМег иго пет ¡я, являющийся вторым видом этого рода.
6. Охарактеризована агаролитическая активность штаммов ТкегтоапаегоЬа^ег и СаШапаегоЬас1ег — первых продуцентов термостабильной агаразы.
7. Установлено, что некоторым представителям рода СаЫапаегоЬасгег свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода.
8. Показано своеобразие генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии у представителей рода СаЫапаегоЪаМег на фоне единства их организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Примененный нами метод гибридизации с олигонуклеотидными зондами позволил не только отнести ряд штаммов к группе Thermoanaerobacter- Caldanaerobacter, но и дифференцировать штаммы по принадлежности к родам или одной из двух групп внутри рода Thermoanaerobacter. Полученные результаты расширяют представления о распространении и физиологических свойствах исследуемой группы термофильных прокариот. Впервые нами были обнаружены представители рода Thermoanaerobacter в глубоководных гидротермах Восточно-Тихоокеанского поднятия. Обнаружено, что к роду Thermoanaerobacter, ранее включавшему только нейтрофилов, относятся два ацидофильных штамма, способных расти при pH 3.5.
Установлено, что три штамма, относящиеся к родам Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter, способны к гидролизу агарозы (свойство, впервые обнаруженное у термофильных анаэробов). Ранее микроорганизмы с агаролитической активностью выделяли из морских местообитаний, где источником агара как субстрата для них служили морские красные водоросли. Наши данные указывают на то, что агаролитические прокариоты могут населять также наземные горячие источники, где субстратами для них могут являться полисахариды цианобактерий, образующих цианобактериальные маты (Герасименко и др., 1983; Намсараев и др., 2006). Агаролитическая активность бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter охарактеризована на примере штамма В5, идентифицированного нами как Thermoanaerobacter wiegeln. Фермент отличается высокой удельной активностью, высоким температурным оптимумом и может быть использован в препаративной молекулярной биологии.
Реклассифицированный французскими исследователями род СаЫапаегоЬа^ег до настоящего времени содержал только один вид. В данной работе описана анаэробная термофильная бактерия (штамм К67), выделенная из горячего источника Камчатки, представляющая второй вид рода СаМапаегоЬаМег - СаШапаегоЬаМег игопетгз, 8р поу.
Способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода свойственна многим термофильным прокариотам (8око1оуа е1 а!., 2002, 2004 а,Ь, 2005, 2006, 2007). Мы установили, что способный как к росту на СО, так и к органотрофному росту штамм 2707, выделенный из гидротерм Камчатки, относится к роду СаШапаегоЬаМег. Таким образом, это второй представитель этого рода, способный к анаэробному росту на СО с продукцией водорода.
Анализ функциональных генов, обуславливающих способность к росту на СО с образованием водорода у ряда анаэробных филогенетически разнообразных представителей ПгтжМез позволил установить ключевую роль в этом процессе генного кластера, кодирующего ферментный комплекс СО-дегидрогеназы и гидрогеназы. Разработанный нами метод может быть применен для экологических исследований природных образцов и накопительных культур. Кластирование генов специализированной гидрогеназы и СО-дегидрогеназы может рассматриваться как специфический признак и геномный маркер филогенетически разнообразных гидрогеногенных карбоксидотрофов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козина, Ирина Владимировна, Москва
1. Гусев М.В., Минеева JI.A. (1992). Микробиология, издательство МГУ.
2. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Соколова Т.Г., Слободкин А.И. (2004). Термофильные микробные сообщества: новые физиологические группы, новые местообитания. Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, Выпуск 12, Москва, Наука.
3. Дуда В.И. (1974). Физиологические и биологические особенности спорообразующих анаэробных бактерий. Жизнь растений; т.1 Ред. Федоров A.A., Красильников H.A., Уранов A.A. Просвещение; 487стр.
4. Лисицын, А. П., Богданов Ю.А. ,Воробьев П.В.; Гурвич Е.Г. (1993). Гидротермальные системы и осадочные формации срединно-океанических хребтов Атлантики, Москва, Наука, 147-160.
5. Логинова Л.Г. (1977). Новые формы термофильных бактерий.М.: Наука.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984). Молекулярное клонирование. М.:Мир,480с.
7. Назина Т.Н., Беляев С.С. (2004). Биологическое и метаболическое разнообразие микроорганизмов нефтяных месторождений. Труды
8. Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Юбилейный сборник к 70-летию Интситута. T.XII. // Ред. В.Ф. Гальченко. М.: Наука, 2004
9. Перельман А.И. (1979). Геохимия. М.: Высшая школа, 422 с.
10. Светличный, В.А., Соколова, Т.Г., Герхард, М., и Заварзин, Г.А. (1990). Новая группа анаэробных термофильных карбоксидобактерий, образующих Н2, Доклады Академии Наук, vol. 314, pp. 742-744.
11. Слободкин А.И., Заварзина Д.Г., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. (1999). Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами. Микробиология, том 68, № 5, стр. 522 543.
12. Соколова Т.Г. (1993). Анаэробные термофильные карбоксидотрофные бактерии. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва.
13. Шестакова Н. М. (2007). Филогенетическое разнообразие и активность микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов, Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.
14. Amann RI, Binder BJ, Olson RJ, Chisholm SW, Devereux R, Stahl DA. (1990). Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl Environ Microbiol. Jun;56(6):1919-25.
15. Amann RI, Zarda B, Stahl DA, Schleifer КЩ1992). Identification of individual prokaryotic cells by using enzyme-labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes.
16. Appl Environ Microbiol. Sep;58(9):3007-11.
17. Amann R.T., (1995). Fluorescently labeled, RNA-targeted oligonucleotide probes in the study of microbial ecology. Mol Ecol 4:543-554.
18. Amann R, Ludwig W. (2000). Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology. FEMS Microbiol Rev. 2000 Dec;24(5):555-65. Review.
19. Artiushin S, Stipkovits L, Minion FC. (1993). Development of polymerase chain reaction primers to detect Mycoplasma hyopneumoniae.Mol Cell Probes. Oct;7(5):381-5.
20. Ashlcin A., Dziedzic J.M. 1987. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria // Science 235: 1517-1520.
21. Bateson, M. M., J. Weigel, and D. M. Ward. (1989). Comparative analysis of 16S ribosomal RNA sequences of thermophilic fermentative bacteria isolated from hot spring cyanobacterial mats. Syst. Appl. Microbiol. 12:1-7
22. Beimfohr C., Krause A., Amann R., Ludwig W., Schleifer K-H.(1993). In situ identification of lactococci, enterococci, and streptococci. Syst Appl Microbiol 16:450-456.
23. Ben-Bassat, A. & Zeikus, J. G. (1981). Thermobacteroides acetoethylicus gen. nov. sp. nov., a new chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium. Arch Microbiol 128, 365-370;
24. Bentley RW, Leigh JA. (1995). Development of PCR-based hybridization protocol for identification of streptococcal species. J Clin Microbiol. May;33(5): 1296-301
25. Boehringer Mannheim Gmb. H, Biocemica. The DIG system users guide for filter hybridization. A laboratory manual. 1995.
26. Bonch-Osmolovskaya, E.A., Miroshnichenlco, M.L.,Slobodkin, A.I., Sokolova, T.G., Karpov, G.A., Kostrikina,N.A., Zavarzina, D.G., Prokof eva, M.I.,Rusanov, I.I., and Pimenov, N.V. (1999). Distribution and Diversity of
27. Anaerobic Lithotrophic Prolcaryotes in Terrestrial Hydrotherms of Kamchatka. Mikrobiologiya, 1999, vol. 68, pp. 398-406
28. Britschgi TB, Giovannoni SJ. (1991). Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing. Appl Environ Microbiol. Jun;57(6):l707-13.
29. Bruce KD, Hiorns WD, Hobman JL, Osborn AM, Strike P, Ritchie DA.( 1992).Amplification of DNA from native populations of soil bacteria by using the polymerase chain reaction. Appl Environ Microbiol. 0ct;58(10):3413-6.
30. Cayol JL, Ducerf S, Patel BK, Garcia JL, Thomas P, Ollivier B. (2000). Thermohalobacter berrensis gen. nov., sp. nov., a thermophilic, strictly halophilic bacterium from a solar saltern. Int J Syst Evol Microbiol. Mar;50 Pt 2:559-64.
31. Cook, G. M., P. H. Janssen, and H. W. Morgan. (1991). Endospore formation by Thermoanaerobium brockii HTD4. Syst. Appl. Microbiol. 14:240-244.
32. Cook, G. M., Rainey, F. A., Patel, B. K. & Morgan, H. W. (1996).Characterization of a new obligately anaerobic thermophile, Thermoanaerobacter wiegeln. Int J Syst Bacteriol 6, 123-127)
33. Corpet F., 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering Nucleic Acids Res. 16:10881-10890
34. DeLong E.F., Wickham G.S., Pace N.R. (1989). Phylogenetic stains:ribosomal RNA-based probes for the identification of singl microbial cells. Science 243:1360-1363.
35. DeLong EF, Taylor LT, Marsh TL, Preston CM.(1999). Visualization and enumeration of marine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. Dec;65(12):5554-63.
36. DeLong EF, Pace NR.(2001 ^Environmental diversity of bacteria and archaea. SystBiol. 2001 Aug;50(4):470-8.
37. Edwards U, Rogall T, Blocker H, Emde M, Bottger EC (1989). Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. Oct 11;17(19):7843-53
38. Engle M, Li Y, Woese C, Wiegel J. Isolation and characterization of a novel alkalitolerant thermophile, Anaerobranca horikoshii gen. nov., sp. nov. Int J Syst Bacteriol. 1995 Jul;45(3):454-61.
39. Ensign SA, Bonam D, Ludden PW.(1989). Nickel is required for the transfer of electrons from carbon monoxide to the iron-sulfur center(s) of carbon monoxide dehydrogenase from Rhodospirillum rubrum. Biochemistry. Jun 13;28(12):4968-7.
40. Erbeznik, M., Dawson, K. A. & Strobel, H. J. (1998). Cloning and characterization of transcription of the xylAB operon in Thermoanaerobacter ethanolicus. J Bacteriol 180, 1103-1109.
41. Fardeau ML, Patel BK, Magot M, Ollivier B (1997).Utilization of serine, leucine, isoleucine, and valine by Thermoanaerobacter brockii in the presence of thiosulfate or Methanobacterium sp. as electron acceptors.Anaerobe. Dec;3(6):405-10.
42. Farrelly V, Rainey FA, Stackebrandt E. (1995). Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. Jul;61(7):2798-801.
43. Fell JW. (1993).Rapid identification of yeast species using three primers in a polymerase chain reaction.Mol Mar Biol Biotechnol. Jun;2(3): 174-80.
44. Fox, J.D., He, Y., Shelver, D., Roberts, G.P. & Ludden, P.W. (1996b) Characterization of the region encoding the CO-induced hydrogenase of Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. 178, 6200-6208
45. Fuhrman JA, Comeau DE, Hagstrôm A, Chan AM. (1988).Extraction from Natural Planktonic Microorganisms of DNA Suitable for Molecular Biological Studies.Appl Environ Microbiol. Jun;54(6): 1426-1429.
46. Fukusawa S, Kobayashi F (1987). Propeties of agarase from a luminous bacterium, Vibrio harvei. Agric Biol Chem 51:269-270.
47. Gold P. (1992). Use of a novel agarose gel-digesting enzyme for easy and rapid purification of PCR-amplified DNA for sequencing. Biotechniques. Jul;13(l):132-4.
48. Hattori S, Kamagata Y, Hanada S, Shoun H. (2000). Thermacetogenium phaeum gen. nov., sp. nov., a strictly anaerobic, thermophilic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. Jul;50 Pt 4:1601-9.
49. Head I.M, Gray N.D, Clarke K.J., Picup R.W., Jones J.G. (1996). The phylogenetic position and ultrastructure of the uncultured bacterium Achromatium oxaliferum. Microbiology 142:2341-2354.
50. Head I.M., Saunders J.R., Pickup R.W. (1997). Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms. Microb Ecol 35:1-21.
51. Hahn D, Amann RI, Ludwig W, Akkermans AD, Schleifer KH.(1992). Detection of micro-organisms in soil after in situ hybridization with rRNA-targeted, fluorescently labelled oligonucleotides. J Gen Microbiol. May;138(5):879-87.
52. Holben WE, Jansson JK, Chelm BK, Tiedje JM.(1988). DNA Probe Method for the Detection of Specific Microorganisms in the Soil Bacterial Community. Appl Environ Microbiol. Mar;54(3):703-711.
53. Hudson, J. A., H. W. Morgan, and R. M. Daniel. (1990). Cellulolytic properties of an extremely thermophilic anaerobe. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:687-691.
54. Hungate, R. E. (1969). A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol 3B, 117±132.
55. Hunger W, Claus D (1978). Reisolation and growth conditions of Bacillus agar-exedens. Ant Leeuwen 44:105-113.
56. Jang J., Kim C., Pyun R., Kim S. (2002). A novel subtilisin-like serine protease from Thermoanaerobacter yonseiensis KB-1: its cloning, expression, and biochemical properties // Extremophiles. V. 6 № 3. P. 233-243.
57. Jeanthon C.(2000). Molecular ecology of hydrothermal vent microbial communities // Antonie van Leeuwenhoek. V. 77 № 2. P. 117-133.
58. Jin, F., Yamasato, K. & Toda, K. (1988). Clostridium thermocopriae sp. nov., a cellulolytic thermophile from animal feces, compost, and a hot-spring in Japan. IntJSyst Bacteriol 38, 279-281.
59. Johnson, J. L., and B. L. Francis. (1975). Taxonomy of the Clostridia: ribosomal ribonucleic acid homology among the species. J. Gen. Microbiol. 88:229-244
60. Kerby, R.L., Ludden, P.W., and Roberts, G.P. (1997). In vivo nickel insertion into the carbon monoxide dehydrogenase of Rhodospirillum rubrum:molecular and physiological characterization of cooCTJ. JBacteriol 179(7):2259—2266.
61. Kim B.C., Grote R., Lee D.W., Antranikian G, Pyun YR. (2001). Thermoanaerobacter yonseiensis sp. nov., a novel extremely thermophilic, xylose-utilizing bacterium that grows at up to 85 degrees C // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 51 № 4. p. 539-548.
62. Kim DJ, Jang HJ, Pyun YR, Kim YS. (2002). Cloning, expression, and characterization of thermostable DNA polymerase from Thermoanaerobacter yonseiensis J Biochem Mol Biol. 2002 May 31 ;35(3):320-9.
63. Kuisiene N, Raugalas J, Stuknyte M, Chitavichius D. (2007). Identification of the genus Geobacillus using genus-specific primers, based on the 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer. FEMS Microbiol Lett. Dec;277(2):165-72.
64. Laemmli, V.K. //Nature 1970. V. 227. P. 680-685.
65. Lane D.J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Ed. Stackebrandt E., Goodfellow M. New York: John Wiley & Sons,. P. 115-147.
66. Larsen, L., Nielsen, P. & Ahring, B. K. (1997). Thermoanaerobactermathranii sp. nov., an ethanol-producing, extremely thermophilic anaerobic bacterium from a hot spring in Iceland. Arch Microbiol 168, 114-119
67. Lee S., Malone C., Kemp P.F. (1993). Use of multiple 16S rRNA targeted fluorescent probes to increase signal strength and measure cellular RNA from natural planktonic bacteria. Marine Ecol Prog Ser 101:193-201.
68. Leigh, J. A., Mayer, F. & Wolfe, R. S. (1981). Acetogenium kivui, a new thermophilic hydrogen oxidizing, acetogenic bacterium. Arch Microbiol 129, 275-280.
69. Liesack W., Weyland H., Stackebrandt E. (1991). Potential risks of gene amplification by PCR as determined by 16S rDNA analysis of a mixed culture of strict barophilic bacteria. Microb Ecol 21:191-198.
70. Ludwig W, Schleifer KH. (1994). Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis. FEMS Microbiol Rev. 1994 Oct; 15(2-3): 155-73. Review.
71. Macnaughton SJ, O'Donnell AG, Embley TM.(1994).Permeabilization of mycolic-acid-containing actinomycetes for in situ hybridization with fluorescently labelled oligonucleotide probes.Microbiology. Oct; 140 ( Pt 10):2859-65.
72. Magot M, Ollivier B, Patel BIC.(2000). Microbiology of petroleum reservoirs. Antonie Van Leeuwenhoek. 2000 Feb;77(2):103-16.
73. Maidak B.L., Cole J.R., Lilburn T.G., Parker C.T., Jr, Saxman P.R., Farris R.J., Garrity G.M., Olsen G.J., Schmidt T.M., Tiedje J.M. (2001). The RDP-II (Ribosomal Database Project) // Nucleic Acids Res. V. 29. № 1. P. 173 4.
74. Manz, W., Amann R., Ludwig W., Wagner M.,Schleifer K.-H. (1992). Phylogenetic oligonucleotide probes for the major subclasses of the proteobacteria: problems and solutions.Syst Appl Microbiol 15:593-600.
75. Marmur, J. (1961) A procedure for the isolation of desoxyribonucleic acid from microorganisms. J.Mol.Biol. 3: 208-218.
76. Meyer O, Schlegel HG.(1983). Biology of aerobic carbon monoxide-oxidizing bacteria.Annu Rev Microbiol. 1983;37:277-310. Review.
77. Moré MI, Herrick JB, Silva MC, Ghiorse WC, Madsen EL.( 1994).Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment.
78. Appl Environ Microbiol. May;60(5): 1572-80.
79. Mori K, Hanada S, Maruyama A, Marumo K (2002). Thermanaeromonas toyohensis gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic anaerobe isolated from a subterranean vein in the Toyoha Mines. Int J Syst Evol Microbiol. Sep;52 (Pt 5):1675-80.
80. Morrice LM, McLean MW, Long WF, Williamson FB (1984). ß-Agarases from Pseudomonas atlantica. Hydrobiologia 116/117:576-579.
81. Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. (1993). Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. Mar;59(3):695-700.
82. Onyenwoke RU, Brill JA, Farahi K, Wiegel J. (2004). Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch ( Firmicutes).Arch Microbiol. 2004 Oct; 182(2-3): 182-92.
83. Onyenwoke RU, Kevbrin VV, Lysenko AM, Wiegel J.(2007). Thermoanaerobacter pseudethanolicus sp. nov., a thermophilic heterotrophic anaerobe from Yellowstone National Park. Int J Syst Evol Microbiol. Oct;57(Pt 10):2191-3.
84. Pace NR, Stahl DA, Lane DJ, Olsen GJ (1986). The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequenses. Adv Microb Ecol 9:1-55.
85. Pfennig, N. & Lippert, K. D. (1966). Über das Vitamin B12 bedürfnis phototropher Schwefel bacterien. Arch Microbiol 55, 245-256
86. Plügge CM, Balk M, Zoetendal EG, Stams AJ. (2002). Gelria glutamica gen. nov., sp. nov., a thermophilic, obligately syntrophic, glutamate-degrading anaerobe. Int J Syst Evol Microbiol. Mar;52(Pt 2):401-7.
87. Potin P, Richard C, Rochas C, ICloareg B (1993). Purification and characterization of the alfa.-agarase from Alteromonas agarolyticus (Cataldi) comb nov., strain GJ1B. Eur J Biochem 214:599-607.
88. Poulsen LK, Ballard G, Stahl DA.(1993). Use of rRNA fluorescence in situ hybridization for measuring the activity of single cells in young and established biofilms. Appl Environ Microbiol. May;59(5): 1354-60.
89. Qian Z, Wang JQ, Zhou CQ, Ma YH, Liu SQ.(2006). Expression and catalysis of glucokinase of Thermoanaerobacter tengcongensis at different temperatures. Wei Sheng Wu Xue Bao. 2006 Apr;46(2):243-8.
90. Ragsdale SW. (2004). Life with carbon monoxide. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2004 May-Jun;39(3): 165-95.
91. Rainey, FA, Ward NL, Morgan HW, Toalster R, Stackebrandt E.(1993). Phylogenetic analysis of anaerobic thermophilic bacteria: aid for their reclassification. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. p. 4772-4779 Vol. 175, No. 15
92. Rainey FA, Fritze D, Stackebrandt E. (1994). The phylogenetic diversity of thermophilic members of the genus Bacillus as revealed by 16S rDNA analysis. FEMS Microbiol Lett. 115(2-3):205-l 1.
93. Raskin L, Stromley JM, Rittmann BE, Stahl DA.(1994).Group-specific 16S rRNA hybridization probes to describe natural communities of methanogens. Appl Environ Microbiol. Apr;60(4): 1232-40.
94. Rees G, Rainey FA, Harfoot CG (1994). Characterization of a novel obligate anaerobe that ferments agar. Arch Microbiol 162:395-400
95. Rees GN, Patel BK, Grassia GS, Sheehy AJ.Anaerobaculum thermoterrenum gen. nov., sp. nov., a novel, thermophilic bacterium which ferments citrate. Int J Syst Bacteriol. 1997 Jan;47(l): 150-4.
96. Reysenbach AL, Giver LJ, Wickham GS, Pace NR. (1992). Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction. Appl Environ Microbiol. Oct;58(10):3417-8.
97. Riessen S., Antranikian G. (2001). Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity // Extremophiles. V. 5 № 6. P. 399-408.
98. Rochelle PA, Fry JC, Parkes RJ, Weightman AJ.(1992). DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determine genetic diversity in deep sediment communities. FEMS Microbiol Lett. Dec 15;79(l-3):59-65.
99. Roh Y, Liu SV, Li G, Huang H, Phelps TJ, Zhou J. (2002). Isolation and characterization of metal-reducing thermoanaerobacter strains from deep subsurface environments of the Piceance Basin, Colorado. Appl Environ Microbiol. Dec;68(12):6013-20.
100. Sahm K, MacGregor BJ, Jergensen BB, Stahl DA.(1999).Sulphate reduction and vertical distribution of sulphate-reducing bacteria quantified byrRNA slot-blot hybridization in a coastal marine sediment. Environ Microbiol. 1999 Feb;l(l):65-74.
101. U.Schmid, H.Giesel, S.M. Schoberth, and H.Sahm (1986).Thermoanaerobacter finnii spec.nov., a new ethanologenic sporogenous bacterium. System.Appl.Microbiol. 8, 80-85.
102. Shieh WY, Jean WD (1998). Alterococcus agarolyticus, gen. nov., sp. nov., a halophilic thermophilic bacterium capable of agar degradation. Can J Microbiol 44:637-645.
103. Skovhus TL, Holmstrom C, Kjelleberg S, Dahllof I. (2007). Molecular investigation of the distribution, abundance and diversity of the genus Pseudoalteromonas in marine samples. FEMS Microbiol Ecol. Aug;61(2):348-61. Epub 2007 Jun 16
104. A. I. Slobodkin, D. G. Zavarzina, T. G. Sokolova, and E. A. Bonch-Osmolovskaya. (1999). Dissimilatory Reduction of Inorganic Electron Acceptors by Thermophilic Anaerobic Prokaryotes. Microbiology, Vol. 68, No. 5, 1999, pp. 600-622.
105. Slobodkin AI. (2005). Thermophilic microbial metal reduction Mikrobiologiia. 2005 Sep-Oct;74(5):581-95.
106. B Soboh, D Linder and R Hedderich. (2004). A multisubunit membrane-bound NiFe. hydrogenase and an NADH-dependent Fe-only hydrogenase in thefermenting bacterium Thermoanaerobcicter tengcongensis. Microbiology, 150, 2451-2463.
107. Spector, T. // Anal. Biochem. 1978. V. 86. P.141-146.
108. Stackebrandt,E. and Woese,C. (1981). The evolution of prokaryotes. In Molecular and cellular aspects of microbial evolution. Carlise,M.J., Collins,J.R., and Moseley,B.E.B. (eds). Cambridge: Cambridge University Press, 1-31.
109. Steffan, R. J., J. Goksoyr, A. K. Bej, R. M. Atlas. (1988). Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54:2908-2915
110. Stahl DA, Flesher B, Mansfield HR, Montgomery L.(1988).Use of phylogenetically based hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology. Appl Environ Microbiol. May;54(5): 1079-84
111. Stetter K.O. (1999). Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Lett. Jun 4;452(l-2):22-5.
112. Stoffels M, Ludwig W, Schleifer KH. (1999). rRNA probe-based cell fishing of bacteria.
113. Environ Microbiol. 1999 Jun;l(3):259-71.
114. Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G., Kostrikina, N.A., and Zavarzin, G.A. (1991). Anaerobic Extremely Thermophilic Carboxydotrophic Bacteria in Hydrotherms of Kunashir Island, Microb. Ecol., 1991, vol. 21, pp. 1-10.
115. Svetlichnyi, V.A., Sokolova, T.G., Kostrikina, N.A., and Lysenko, A.M. (1994). Carboxydothermus restrictus sp.nov.—A New Thermophilic Anaerobic Carboxydotrophic Bacterium. Mikrobiologiya, vol. 63,pp. 523-528.
116. Svetlitchnyi, V., Peschel, C., Acker, G., and Meyer, O. (2001).Two membrane-associated NiFeS-carbon monoxide dehydrogenases from theanaerobic carbon-monoxide-utilizing eubacterium Carboxydothermus hydrogenoformans. JBacteriol 183(17):5134-5144.
117. Tanner, R. S., E. Stackebrandt, G. E. Fox, R. Gupta, L. G. Magnum, and C. R. Woese. (1982). A phylogenetic analysis of anaerobic eubacteria capable of synthesizing acetate from carbon dioxide. Curr. Microbiol. 7:127-132.
118. Tebbe, C. C., W. Vahjen. (1993). Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Appl. Environ. Microbiol. 59:2657-2665
119. Trebesius K, Amann R, Ludwig W, Mühlegger K, Schleifer KH.(1994). Identification of Whole Fixed Bacterial Cells with Nonradioactive 23 S rRNA-Targeted Polynucleotide Probes. Appl Environ Microbiol. Sep;60(9):3228-3235.
120. Trevors, J. T., H. Lee, S. Cook. (1992). Direct extraction of DNA from soil. Microb. Releases 1:111-115.
121. Tsai, Y., B. H. Olson. (1991). Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 57:1070-1074
122. Uffen RL.(1983). Metabolism of carbon monoxide by Rhodopseudomonas gelatinosa: cell growth and properties of the oxidation system. J Bacteriol. Sep;155(3):956-65.
123. Van der Meulen HJ, Harder W, Veldkamp H (1974). Isolation and characterization of Cytophaga flevensis sp. nov., a new agarolytic flexibacterium. Ant Leeuwen 40:329-346.
124. Van de Peer Y., De Wachter R. (1994). TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. V.10. P. 569-570.
125. Van de Peer, Chapelle S, De Wachter R (1996). A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA. Nucl Acids Res 24:3381-3391.
126. Vanfossen AL, Lewis DL, Nichols JD, Kelly RM. Polysaccharide degradation and synthesis by extremely thermophilic anaerobes. Ann N Y Acad Sci. 2008 Mar; 1125:322-37. Review.
127. Vieille C, Zeikus GJ.( 2001). Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev. Mar;65(l):l-43.
128. Wallner G, Amann R, Beisker W.(1993). Optimizing fluorescent in situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes for flow cytometric identification of microorganisms. Cytometry. 14(2): 13 6-43.
129. Ward D.M., Bateson M.M., Weller R., Ruff-Roberts A.L. (1992). Ribosomal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature. Adv MicrobEcol 12:219-286.
130. Wang G.C.-Y., Wang Y. (1996). The frequency of chimeric molecules as a consequence of PCR co-amplification of 16S rRNA genes from different bacterial species. Microbiology 142:1107-1114.
131. Watt, R.K. and Ludden, P.W. (1998). The identification, purification, and characterization of CooJ. A nickel-binding protein that is co-regulated with the Ni-containing CO dehydrogenase from Rhodospirillum rubrum. J Biol Chem 273(16): 10019-10025.
132. Watt, R.K. and Ludden, P.W. (1999). Nickel-binding proteins. Cell Mol Life Sci 56(7—8):604-625.
133. Wiegel, J., Ljungdahl, L. G. & Rawson, J. R. (1979). Isolation from soil and properties of the extreme thermophile Clostridium thermohydrosidfuricum. J Bacteriol 139, 800-810
134. Wiegel, J., Braun, M., and Gottschalk, G .(1981 ^.Clostridium thermoautotrophicum Species Novum, a Thermophile Producing Acetate from Molecular Hydrogen and Carbon Dioxide. Curr. Microbiol., vol. 5, pp. 255-260.
135. Wiegel, J., and L. G. Ljungdahl. (1986). Genus Thermoanaerobacter, p. 1379-1383. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 2. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.
136. Wiegel J. (1998).Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles. Extremophiles. Aug;2(3):257-67.
137. Woese,C.R., Kandler,0., and Wheelis,M.L. (1990). Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87: 4576-4579.
138. Wolin, E. A., Wolin, M. J. & Wolfe, R. S. (1963). Formation of methane by bacterial extracts. J Biol Chem 238, 2882-2888.
139. Xue Y., Xu Y., Liu Y., Ma Y., Zhou P. (2001).Thermoanaerobacter tengcongensis sp. nov., a novel anaerobic, saccharolytic, thermophilic bacterium isolated from a hot spring in Tengcong, China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 51 № 4. P.1335-1341.
140. Zarda B, Amann R, Wallner G, Schleifer KH.(1991). Identification of single bacterial cells using digoxigenin-labelled, rRNA-targeted oligonucleotides. J Gen Microbiol. Dec;137(12):2823-30.
141. Zeikus J.G.,Hegge P.W., and Anderson M.A (1979). Thermoanaerobacter brockii gen. nov. and spec, nov., a new chemoorganotrophic, caldoactive, anaerobic bacterium //. Arch. Microbiol. V. 122. P. 41-48.
142. Zhi XY, Tang SK, Li WJ, Xu LH, Jiang CL. (2006). New genus-specific primers for the PCR identification of novel isolates of the genus Streptomonospora.FEMS Microbiol Lett. Oct;263(l):48-53.
143. Zuckerkandl E, Pauling L (1965). Molecules as documents of evolutionary history. J Theor Biol 8:357-366.y>
-
Козина, Ирина Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.07
- Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты
- Биоразнообразие анаэробных термофильных микроорганизмов морских гидротермальных полей
- Микроорганизмы нефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи
- Свойства новых штаммов термофильных анаэробных бактерий
- Клонирование генов синтеза пролина proB и proA термофильной бактерии Thermus ruber, их характеристика и анализ кодируемых ими белков
