Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты

Кубланов, Илья Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты"

На правах рукописи

□ОЗ177315

КУБЛАНОВ Илья Валерьевич

НОВЫЕ АНАЭРОБНЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫЕ ПРОКАРИОТЫ И ИХ ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

Специальное гь 03 00 07

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 6 ЛЕН 2007

Москва - 2007

003177315

Работа выполнена в Институте микробиологии им С Н Виноградского РАН и Университете Нанга, Франция

Научные руководители

доктор биологических наук Е.А. Бонч-Осмоловская

профессор Т. Эртле

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Д.Ю. Сорокин

доктор химических наук, профессор В.П. Варламов

Ведущая организация

Кафедра микробиологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 17 декабря 2007 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 002 224 01 в Институте микробиологии им СН Виноградского РАН по адресу 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д 7, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им С Н Виноградского РАН

Автореферат разослан 17 ноября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

¿f'

Т.В.Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Термофильные и гипертермофильные микроорганизмы представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп экстремофильных микроорганизмов Продуцируемые ими ферменты, так называемые термозимы (Zeikus et al 1998), имеют ряд биотехнологических преимуществ перед мезофилъными аналогами прохождение ферментативных реакций при высоких температурах позволяет работать с более высокими концентрациями субстрата из-за снижения вязкости раствора и увеличения коэффициентов диффузии, снижается риск побочных процессов т к большинство микроорганизмов, способных оказать нежелательное влияние на протекающие реакции, гибнут при температурах выше 70°С, термостабильные ферменты, главным образом выделенные из архей, зачастую обладают повышенной устойчивостью к денатурирующим агентам, например, растворителям, детергентам (Brums et al 2001, Eichler, 2001, Egorova & Antramkian, 2005) Кроме того, упрощается очистка термозимов, клонированных и экспрессированных в мезофильных микроорганизмах, от остальных белков клеток хозяина благодаря возможности проведения термообработки, при которой многие мезофильные белки денатурируют (Bruins et al 2001, Vieille и Zeikus, 2001, Bertoldo et al, 2004)

К настоящему моменту известно довольно большое число термофильных микроорганизмов, обладающих гидролитической активностью Среди них продуценты гликозидаз умеренно-термофильные амилолитические бактерии Bacillus sp (Krishnan & Chandra, 1983, Gupta et al, 2003), археи Thermococcus profundus (Chung et al 1995) Pyrococcus sp (Egorova & Antranikian, 2005), термофильные целлюлолитические бактерии Rhodothermus marinus, Acidithermus cellulolyticus, Caldibacillus cellulovorans (Bergquist et al, 1999), Caldicellulosiruptor и Dictyoglomus spp , археи с ксиланолитической активностью Thermococcus zilligii (Uhl & Daniel, 1999), Pyrodictium abyssi (Andrade et al, 2001), растущая на агарозе термофильная бактерия 'Caldanaerobacler uzonensis ' (Kozina et al, в печати) и др Термофильные протеолитики представлены бактериями родов Thermoanaerobacter, Thermus, Fervidobacterium и др и археями родов Desulfurococcus, Thermococcus, Pyrococcus, Aeropyrum и др Большинство из них растут и используют в качестве источника углерода и/или энергии пептиды благодаря наличию внеклеточных протеаз (в большинстве случаев относящихся к щелочным субтилизин-подобным сериновым протеиназам), активных в широких диапазонах значений pH (Klingeberg et al, 1995, Ward et al, 2002) и температур Лишь немногие способны использовать в качестве субстрата белки, при гидролизе которых образуются пептиды, используемые другими органотрофными микроорганизмами

Области применения гидролаз, такие как текстильная и бумажная промышленность, выходящая в последнее время на передний план переработка отходов различной природы, и др постоянно расширяются, в связи с чем существует потребность в новых гидролазах, более эффективных, нежели имеющиеся, или обладающих новыми свойствами

Вместе с тем исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов в термальных местообитаниях показывают, что большое число термофильных микроорганизмов до сих пор не получено в лабораторных культурах, и, следовательно, их свойства неизвестны (Barns et al, 1996, Hugenholtz et al, 1998) Среди новых термофильных прокариот могут оказаться и организмы с новыми, биотехнологически привлекательными свойствами Таким образом, поиск новых термофильных микроорганизмов-гидролитиков остается актуальной проблемой исследований как с научной, так и с прикладной точки зрения

Цели и задачи исследования

Целью работы было обнаружение, выделение и изучение анаэробных термофильных микроорганизмов-гидролитиков, а также их ферментов

Задачи исследования состояли в следующем:

1 Изучение филогенетического разнообразия термофильных микроорганизмов-гидролитиков из горячих источников кальдеры Узон

2 Выделение и характеристика чистых культур анаэробных термофильных гидролитиков

3 Характеристика термостабильных гидролитических ферментов, продуцируемых новыми изолятами

Научная новизна и практическая ценность работы

Опробованный метод получения накопительных культур в условиях in situ с добавлением различных нерастворимых и слаборастворимых биополимерных субстратов является действенным методом накопления гидролитических микроорганизмов

Определение филогенетического положения наиболее многочисленных микроорганизмов, населяющих полевые накопительные культуры показало, что в них, помимо представителей уже известных родов бактерий, присутствуют термофильные археи, ранее известные исключительно по природным клонам

Выделены и охарактеризованы новые целлюлолитические термофильные бактерии Caldicellulosiruptor hydrothermalis, Caldicellulosiruptor kronotskyensis и Dictyoglomus sp штамм 1521-1, первая агаролитическая бактерия рода Dictyoglomus - штамм 1507-9, протеинолитические бактерии Caldanaerobacter proteolyticus и Thermoanaerobacter sp штамм 1004, протеинолитическая архея

Desulfurococcus kamchatkensis, являющаяся первым идентифицированным представителем отдела Crenarchaeota, растущим на кератине

Показана способность протеиназ из Caldanaerobacter proteolyticus и Thermoanaerobacter sp разрушать трудногидролизуемый белок кератин Такие свойства обеих кератиназ как активация додецилсульфатом натрия (ДСП), а также остаточная активность в присутствии растворителей, являются новыми для термофильных кератиназ

Выделенные нами кератиназы ввиду их исключительной активности в присутствии ДСН могут найти широкое применение в качестве добавок к моющим средствам Также привлекательна возможность их использования в качестве биодеградирующих агентов для разложения различных трудногидролизуемых белков, в том числе кератинов

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии», 2003, «Thermophiles», 2003, «Extremophiles», 2004, «Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова», 2004, «Archaea Meeting», 2005, «Biodiversity, molecular biology and biochemistry of thermophiles», 2005, «Химия протеолитических ферментов», 2007

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 12 работ 1 экспериментальная статья, 7 тезисов научных конференций и 4 статьи находятся в печати

Место проведения работы

Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С Н Виноградского РАН и в лаборатории функций и взаимодействий белков молока Национального Института Сельскохозяйственных исследований (INRA), г Нант при докторантуре Университета Нанта, Франция

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и включает 42 рисунков и 13 таблиц Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 141 наименование

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили термофильные микробные сообщества, обитающие в горячих источниках Камчатки (Центральное, Оранжевое, и Восточное термальные поля кальдеры Узон) и характеризующиеся температурами 40-95°С и рН 4 0-9 6, а также выделенные из них и из горячих источников долины Гейзеров и Паужетки, Камчатка и Байкальской рифтовой зоны (источник Уринский) микроорганизмы и синтезируемые ими гидролитические ферменты

Получение полевых накопительных культур. 50-мл пробирки с 20-30 мг нерастворимых биополимерных субстратов (карбоксиметил целлюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, хитин, агароза, казеин, а- и Р" кератины) заполняли термальной водой из каждого исследуемого источника, закрывали крышками с проделанными в них отверстиями для рециркуляции воды источника (при этом нерастворимые субстраты и ассоциированные с ними микроорганизмы оставались в пробирках) и инкубировали in situ в течение одной недели По истечении инкубации полевые накопительные культуры служили объектами дальнейших исследований, а также материалом для получения лабораторных накопительных и чистых культур

Культивирование анаэробных термофильных прокариот проводили на среде следующего состава (г/л) H4CI, 0 33, КС1, 0 33, КН2Р04, 0 33, СаС122Н20, 0 33, MgCl26H20 В среду добавляли 1 мл/л раствора витаминов (VI vitamins Kit, Sigma) и микроэлементов (Кевбрин и Заварзин, 1992), дрожжевой экстракт (50-200 мг/л), а также субстраты роста (5 г/л) и акцепторы электронов (2 г/л, элементная сера 10 г/л) Среды кипятили, охлаждали под током газа (С02 или N2) и добавляли Na2S 9Н20 (700 мг/л) в качестве восстановителя, анаэробные условия контролировались добавлением индикатора - резазурина (1 мг/л) После восстановления среды рН доводили 6М НС1 или ЗМ NaOH, после чего среду разливали по пробиркам Хангейта и автоклавировали при 1 0 или 0 5 (при наличии S0 в среде) избыточных атмосферах

Чистые культуры выделяли методом предельных разведений с последующим высевом на твердую среду как это описано в публикации (1) При выделении чистых культур архей использовали только метод предельных разведений на жидкой среде Чистоту культур проверяли микроскопическими, а также геносистематическими методами

Микроскопия. Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 вар 2-20 с фазово-контрастным устройством Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963) с

использованием микротома LKB 3R и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Tokyo, Japan)

Геносистемагические методы. Выделение ДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ), секвенирование и определение филогенетического положения проводили как это описано в публикации (3)

Определение гидролитических активностей. Целлюлозную активность штаммов 108, 2002 и 1521-1 исследовали путем определения концентрации высвободившихся в процессе гидролиза карбоксиметил целлюлозы восстановленных Сахаров с помощью динитросалицилового метода Протеиназную активность определяли методом зимограмм и характеризовали с использованием низкомолекулярных субстратов - р-нитроанилидов, а также по гидролизу молекулы инсулина В-цепи

Концентрацию белка определяли бицинхониновым методом (ВСА, Bicmchonimc acid assay protein kit) с реактивами фирмы Interchim (France) и в соответствии с методикой производителя

Масс-спектрометрия и последующая обработка данных проводилась в соответствии с тем как это описано в публикации (4)

2. Результаты исследования и их обсуждение

2.1. Культнвирование in situ и анализ полевых накоптельных культур гидролитиков

Для получения накопительных культур гидролитиков было выбрано семь термальных источников кальдеры Узон, характеризующихся значениями рН 4 1-7 0 и температурой в пределах 68-87°С В пяти из них исходно присутствовал органический материал цианобактериальные маты, нитчатые микробные обрастания, отмершие растения с окружающей горячий источник почвы, мертвые насекомые и т д Благодаря отсутствию газовой фазы, а также восстановленности термальной воды (Eh -300 - -200 мВольт, в зависимости от источника) можно предположить, что в пробирках устанавливались анаэробные условия После 7 дней инкубации во многих пробирках был обнаружен обильный микробный рост и конечная концентрация микроорганизмов значительно превышала таковую в контролях, не содержащих субстратов Количество и морфология клеток в накопительных культурах варьировали в зависимости от источника, и особенно от субстрата (Табл 1)

В ряде полевых накопительных культур состав микробного сообщества был проанализирован при помощи ПЦР генов 16S рРНК с Bacteria- Archaea- и Oewúrc/meoía-специфичными праймерами и последующим разделением продуктов амплификации с помощью ДГГЭ и определением последовательности нуклеотидов в гене 16S рРНК

Табл 1 Источники кальдеры Узон, выбранные для инкубации in situ и краткое описание полученных полевых накопительных культур_

Источник п описание

Т°С рН Субстрат

Название полевых накопительных

Микроскопия

Термофильный, ВТП1, белые филаменты, 68

циаяобакгериалыше маты

Вертолетный, ВТП 68

Зацепин, ВТП, Обильные обрастания на поверхности 70 осадков

6 0 Агароза 1524ag

Серый, ВТП, серые нитевидные обрастания по 75 краям гриффона

Шумный, ВТП 77

Бурлящий, ЦЩ осадки покрыты тонкими многослойными 86 отложениями (черные/ белые/рыжеватые) Малый, ОТП, Отмерший растительный материал 87 (листья, трава)_

Целлюлоза 1521сшс

Хитин 1521chi

Казеин 1521cas Альфа-

1521а-кег 1523ag Целлюлоза 1523 eel

кератин Агароза

Хитин Казеин

Альбумин

Альфа-

кератин

Бета-

кератин

Лышш

веревка

Агароза

Казеин

Альфа-кератин Агароза

Хитин Казеин

Альбумин

Альфа-

кератин

Бета-

кератин

Агароза

Казеин

Альфа-кератин

4 1 Хитин

1523chi

1523cas

1523 alb

1523a-ker

1523b-ker

1523rope

1507ag

1507cas

1507a-ker

1510ag

1510chi

1510cas

lSlOalb

1510a-ker

1510b-ker

1518ag 1518cas

1518a-ker 1532chi

Обильный2 рост, длинные и короткие палочки

Средний рост, толстые палочки с округлыми концами и нити Средний рост, овальные клетки Средний рост, клетки неопределенной морфологии Обильный рост, палочки и кокки

Средний рост, ниги собранные в клубки

Обильный рост, короткие палочки

Обильный рост, толстые палочки и длинные нити Средний рост, клетки неопределенной морфологии Средний рост, разнообразные палочки

Средний рост, то петые палочки

Обильный рост, короткие и длинные палочки Обильный рост короткие

палочки

Обильный рост, коккя Средний рост, одиночные клетки

Средний рост, подвижные палочки, небольшие кокки Средний рост, большие кокки Средний рост, разнообразные палочки

Средний рост,клетки неопределенной морфологии Средний рост, разнообразные палочки

Обильный рост, изогнутые палочки

Средний рост, единичные палочки и кокки Средний рост, палочки Слабый рост, палочки и кокки

Обильный рост, палочки и кокки

Обильный рост, кокки

1 ВТП - Восточное, ЦТП - Центральное, ОТП - Оранжевое термальные поля

2 Слабый рост - 5 10б, средний - 1-5 107, обильный > 108 клеток/мл

По результатам анализа ДГГЭ большинство архей, обнаруженных в накопительных культурах, были родственны некультивируемым представителям отдела СгепагсИаеоШ (Рис 1) Термофильные бактерии-целлюлолитики оказались представлены родами СаШ1се11и1о$1гир1ог и Dlctyoglomus, бактерии, растущие на альфа- и бета-кератинах были близки представителям сем ТИегтои^асеае (Рис 2)

Следует отметить, что в лабораторных культурах до сих пор удавалось получить только гипертермофильныех археи (за исключением некоторых ацидофилов), растущие при температуре 80°С и выше Наши опыты показывают, что в природных сообществах при 70-80°С археи участвуют в разложении полимерных субстратов, успешно конкурируя с бактериями

Distance 0 1

85 зо

1507cas

1521 cmc & 1523rope

hot env clone SK213 (AY882767) hot env clone SK214 (AY882768)

hot env clone Hverd03 IN (DQ4415U)

96,- 1510b-ker

Fervidococcusfontis (EF552404)

- 1507ag

Jgmcoccus pacificus (AJ271794) Aeropyrum pernix(AB008745) 1507cas 2 isolate OCU (X99561)

Desulfurococcus mobihs(M3G474) — Acidmnus mfernus (X89852) 1521 cmc 2

— Sulfolobvs solfatancus (AE006720) 1510b-ker2 Thermofdum pendens (CP000505) Vulcanisaeta soumana (AB063645)

Thermoproteus neutrophils (AB009618) soil env clone SCAU70 (U62817)

marine env clone 4B7 (U40238) hot env clone OPPD026 (AY86J959) 1523rope 2

hot env clone pSL12 (U63343)

Methanosarcma barken (AJ012094)

Рис. 1. Филогенетическое положение архейных компонентов накопительных культур 1523cel, 1523се1 2, 1521стс, 1521стс 2, 1507cas, 1507cas 2, 1507ag, 1510b-ker, 1510b-ker 2 и родственных организмов Внешним репером служила Metanosarcina barkeri

В супернатантах полевых накопительных культур, использующих белки, с помощью метода зимограмм были обнаружены протеиназные активности при рН 8 5 в накопительных культурах 1507саз, 1521а-кег, 1523Ь-кег и 1523сая, те же культуры были активны при рН 7 0, и только две из них -1507са5,1521а-кег - были активны при рН 4 0 (Рис 3 А, В, С)

Б1аапсе 0.1

100

89 , 1523горе

5оГ1- 1523се1

'СЫсИсеШтгирЮг Ь-опой'Исшм' (ЕР100911) Ь 'СЫсИсе 11и1озггир1ог Ьу<1го1ЬегтаЧз' (ЕР100908)

--СаШсеИгйоыгирюг зассЬаго1уИеш (АР130258)

- ТЪегтоапаегоЬааег ехУгапоИсиз (1*09164 )

100---'СаЫапаегоЪасиг Иу&оМегтаИз' (ЕР195126)

---Са1с1апаегоЬас1ег хиЪгеггапеиз (АР195797)

_ Г)1с1уоу,1оти'; ¡Иегторкйит (1.39875) - 1521стс

1 ШаШшес! ЬасЛепит с!ош:ЫАВ27 (АВ081520)

1523Ь-кег

1523$*е1

31 ЧI— 1521а-кег

20 Ч „01-ТЬегтоярИо эр. (АБ257289)

Ч 100|-РемсЗоЬааеИитЯр. (ЕР222228)

— Иеп>1с]оЬас1ег1ит реппыогапл (Ер'565822) юо— РегчхАоЬааегштЫагнИсит (АР434670) '--------------------- Ме1ИапозагЫпа Ьагкеп ( А-Ю12094)

Рис. 2. Филогенетическое положение бактериальных компонентов накопительных культур 1523Ь-кег, 1523§е1, 1523горе, 1523се1, 1521а-кег, 1521стс, 1507саз и родственных организмов. Внешним репером служила Ме1апо5агс1Уха Ьагкег1.

Ша

92 67

кйа

92 67 45

Б -

кег; В -

кег;

Рис. 3. ДСН желатин-содержащие зимограммы полевых накопительных культур:

А - Инкубация при рН 8.5. 1, маркеры; 2,1507а-кег; 3, 1507саз; 4, 1518а-кег; 5, 1518агоса5; 6, 1521а-кег; 7.1523Ь-кеп 8.1523саз.

Инкубация при рИ 7.0. 1, маркеры; 2, 1507саБ; 3, 1510а-кег; 4, 1518а-5, 1521а-кег; 6, 1523Ь-кег; 7, 1523а-кег; 8, 1523саз. Инкубация при рН 4.0. I, маркеры; 2, 1507саБ; 3, 1507агосак; 4, 1510Ь-5, 1510а-кег; 6, 1521а-кег; 7, 1523а-кег; 8, 1523саз.

Продукция внеклеточной протеиназы размером больше 100 кДа в кератинолитических культурах 1523b-ker и 1523cas не может быть приписана присутствовавшим там Thermotogaceae, так как организмы этой группы продуцируют связанные с клетками высокомолекулярные протеиназы, следовательно этот фермент продуцируется другими микроорганизмами, присутствующими в исследуемой культуре Низкомолекулярные внеклеточные протеиназы могут иметь архейное происхождение (Cowan et al, 1987, Sako et al, 1997)

2.2. Выделение и описание гидролитических микроорганизмов

Из полевых накопительных культур, а также из образцов воды и осадков горячих источников Камчатки и Байкальского региона было выделено 8 штаммов анаэробных термофильных прокариот, использующих биополимеры в качестве субстратов для роста

2 2.1. Dictyoglomus sp. штаммы 1521-1 и 1507-9

Штамм 1521-1 был выделен из полевой накопительной культуры 152lerne, растущей на карбоксиметил целлюлозе, а штамм 1507-9 - из культуры 1507ag, растущей на агарозе Клетки обоих штаммов имеют форму нитей, которые периодически образовывали структуры, напоминающие клубок (Рис 4А) Клеточная стенка Грамотрицательного типа Данный морфотип был одним из наиболее многочисленных в накопительной культуре 152lerne, что подтверждается филогенетическим анализом Штамм 1521-1 растет оптимально при 70°С и pH 7 0, а штамм 1507-9 - при 80°С и pH 7 0 Помимо карбоксиметил целлюлозы, штамм 1521-1 использует целлюлозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу и крахмал, штамм 1507-9 помимо агарозы растет также на глюкозе, сахарозе и мальтозе

Оба штамма относятся к отделу Dictyoglomi, представленному единственным родом Dictyoglomus (Saiki et al, 1985) Степень сходства последовательностей генов 16S гРНК типового штамм D thermophylum и штаммов 1521-1 и 1507-9 составила соответственно 97 1 и 96 7%, а штаммов между собой 97 7% Филогенетическое положение штаммов 1521-1 и 1507-9 показано на Рис 5 Способность к слабому росту на целлюлозе ранее была показана для Dictyoglomus turgidum (Светличный с соавт, 1988) Наши данные, включая результаты ДГГЭ анализа природных накопительных культур, указывают на активность и распространение целлюлолитических Dictyoglomus в горячих источниках кальдеры Узон Способность к росту на агарозе штамма 1507-9 установлена впервые для представителей р Dictyoglomus

Рис. 4. Электронные микрофотографии клеток новых

изолятов. I ¡егативное окрашивание ФВК А. штамм 1507-9, Б. штамм 108, 1}. штамм 1523-1, Г. штамм 1004, Д. штамм 761119, Е. штамм 1221а.

Distance 0.02

100

j Dictyoglomus thermophilum (L39875) "> Dictyoglomus thermophylum T (X69194)

100 — 1507-9

100 — 1521-1

Caldice/Iulosiruptor saccharolyticus (F130258)

84 Г

'---------------Thermoanaerobacter mathranii (Y11279)

Рис. 5. Филогенетическое положение штаммов 1507-9 и 1521-1 и родственных микроорганизмов. Внешним репером служила Methanosarcina barken штамм DSM 800.

2.2.2. Caldicellulosiruptor hydrothermalis штамм 108 и Caldicellulosiruptor kronotskyensis штамм 2002

Штамм 108 был выделен из горячего источника Паужетки, а штамм 2002 из горячего источника в Долине Гейзеров, Камчатка Клетки обоих штаммов схожи и имеют форму прямых коротких палочек длиной 3-3 2 мкм и шириной 0 5-0 7 мкм (Рис 4Б) Клеточная стенка Грамположительного типа Несмотря на то, что имеются жгутики, подвижности клеток не было обнаружено Рост штамма 108 наблюдается в температурных пределах 50-80°С и пределах рН 5 8-8 0, штамма 2002 при 50-75°С и рН 6 0-8 0, при оптимальных условиях для роста для обоих штаммов 70°С и рН 7 0 Оба штамма являются хемоорганогетеротрофами и растут на карбоксиметил целлюлозе, целлюлозе (микрокристаллическая целлюлоза, фильтровальная бумага), декстране, ксилане, пектине, крахмале, целлобиозе, и ряде моносахаров и дрожжевом экстракте Штамм 2002, в отличие от штамма 108, обладает способностью расти на пептоне Содержание Г+Ц в геноме составляет 36 4 мол % у штамма 108 и 35 1 мол % у штамма 2002

Оба штамма являются хемоорганогетеротрофами и растут на карбоксиметил целлюлозе, целлюлозе (микрокристаллическая целлюлоза, фильтровальная бумага), декстране, ксилане, пектине, крахмале, целлобиозе, и ряде моносахаров и дрожжевом экстракте Штамм 2002, в отличие от штамма 108, обладает способностью расти на пептоне Содержание Г+Ц в геноме составляет 36 4 мол % у штамма 108 и 35 1 мол % у штамма 2002

Distance 0 02

i--1

100

2002 _ 108

- Caldicellulosiruptor acetigeniis (AY772476) - Caldicellulosiruptor kristjanssonii (AJ004811) Caldicellulosiruptor lactoaceticus (X82842) — Caldicellulosiruptor owensensis (U80596)

--Caldicellulosiruptor saccharolyticus (NC009437)

Рис. 6. Филогенетическое положение штаммов 2002 и 108 и родственных микроорганизмов Внешним репером служил Dictyoglomus thermophilum штамм DSM 3960

Оба штамма относятся к отделу Firmicutes, группе Грамположительных бактерий с низким содержанием G+C пар оснований в геноме Внутри этой группы оба штамма относятся к классу Clostridia,

порядку Clostridiales, семейству Syntrophomonadaceae, роду Caldicellululosiruptor На основании филогенетических и фенотипических различий предложены новые виды Caldicellulosiruptor hydrothermahs (штамм 108) и Caldicellulosiruptor kronotskyensis (штамм 2002) Сходство последовательностей гена 16S рРНК новых видов с другими представителями рода составляет 94 5-97 7%, а друг с другом 98 1% ДНК-ДНК гомология между штаммами 108 и 2002 составила 40% Филогенетическое положение штаммов 108 и 2002 показано на Рис 6 Присутствие бактерий этой группы в горячих источниках Камчатки ранее было показано В Светличным (Светличный с соавт, 1990) Эти данные подтверждаются нашими результатами - как ДГГЭ-анализом полевых накопительных культур, так и выделением новых видов р Caldicellulosiruptor

2.2.3 Caldanaerobacíer proteolyticus штамм 1523-1

Выделен из полевой накопительной культуры 1523cas, инкубировавшейся на казеине в грифоне Зацепина Восточного термального поля кальдеры Узон

Клетки представляют собой палочки 3-8 х 0 5-0 6 мкм (Рис 4В) Клеточная стенка Грамположительного типа Штамм растет оптимально при температуре 70°С и рН 7 0 на казеине, желатине, альбумине, альфа-кератине (свиная щетина), без добавления каких-либо других субстратов и факторов роста, за исключением витаминов Кроме того, штамм 1523-1 растет на пептоне, дрожжевом экстракте и некоторых моно- и дисахарах На Р-кератине (перья) роста штамм 1523-1 не было обнаружено

Distance 0 02

98 --Cald subterraneus subsp subterraneus T (AF195797)

-Cald subterraneus subsp subterraneus (AY216597) _Cald subterraneus subsp yonseiensis (AF212925) _Thermoanaerobacter keratmophilus (AY278483) _Cald subterraneus subsp tengcongensis (DQ115806) Cald subterraneus subsp tengcongensis (AF209708)

40'_Cald subterraneus subsp pacificus (AF174484)

Cald subterraneus subsp pacificus (AY216596) _1523-1

100Г

__Thermoanaerobacter siderophilus (AFI20479)

Shermoanaerobacter ethanolicus (L09164) _Thermoanaerobactenum aciditolerans 761-119

Рис. 7. Филогенетическое положение штамма 1523-1 и родственных микроорганизмов Внешним репером служила Escherichia coli штамм С2

Штамм 1523-1 относится к отделу Firmicutes, классу Clostridia, порядку Thermoanaerobacteriales, семейству Thermoanaerobacteriaceae и роду Caldanaerobacter (Fardeau et al. 2004). Ближайшим родственным микроорганизмом является Caldanaerobacter subterraneus subsp. pacificus, штамм OCA1, степень сходства последовательностей генов 16S рРНК с которым составляет 96.6 %. Филогенетическое положение штамма 1523-1 показано на Рис. 7. На основании выявленных фенотипических и филогенетических различий предложен новый вид Caldanaerobacter proteolytics. Среди представителей этого рода способность к росту на кератине свойственна также Caldanaerobacter (ранее Thermoanaerobacter) keratinophilus, растущему на а- и (3-кератинах и продуцирующему внеклеточную кератиназу размером 135 кДа. (Riessen & Antranikian, 2001).

2.2.4. Thermoanaerobacter sp. штамм 1004

Выделен из горячего источника Уринский Байкальской рифтовой зоны. Клетки штамма 1004 являются палочками, длиной 3-10 мкм и шириной 0.4-0.6 мкм (Рис. 4Г) Клеточная стенка Грамположительного типа. Штамм 1004 оптимально растет при температуре 65°С и рН 6.8, используя желатин, альбумин, казеин, а- и (З-кератины, а также пептон и моно- и дисахара без добавления каких-либо других субстратов и факторов роста, за исключением витаминов. За 4 суток инкубации урожай клеток изолята 1004 достигал 1.9 х 108 клеток/мл при росте на (3-кератине и 3.8 х 10х клеток/мл при росте на альбумине. При росте на среде, содержащей пептон и (3-кератин (перья) наблюдалось полное разложение последних, что не происходило, когда штамм 1004 рос на перьях в качестве единственного субстрата (Рис. 8).

А Б

Рис. 8. Среда с ¡3-кератином (перья, обозначены стрелкой) и пептоном (по 2 г/л) до (А) и после (Б) 4-дневной инкубации штамма 1004 при 65°С.

Штамм 1004 относится к отделу Firmicutes, классу Clostridia, порядку Thermoanaerobacteriales, семейству Thermoanaerobacteriaceae и роду Thermoanaerobacter (Garrity et al., 2005), где его наиболее

близкородственным организмом является Thermoanaerobacter siderophilus (DSM 12299) с уровнем сходства 98 4% (рис 9) Мы обнаружили, что Т siderophilus также способен расти на а-кератине и продуцировать внеклеточную кератиназу размером ~170 кДа Другие исследованные виды р Thermoanaerobacter роста на а-кератине не показали Таким образом, также как и для р Caldanaerobacter, наличие кератаназ свойственно некоторым представителям р Thermoanaerobacter, однако не является общим свойством, тк многие другие виды этого рода способностью к росту на кератине не обладают, что также подтверждается данными Friedrich и Antramkian, 1996)

Distance 0 02

'-С

Thermoanaerobacter acetoethylicus (L09163)

Thermoanaerobacter ethanohcus (L09162) Thermoanaerobacter wiegeln (X92513) — Thermoanaerobacter sulfurophilus (Y16940) The> moanaerobacter siderophilus (AF120479) 10W

--The) moanaerobacter kivui (L09160J

--Thermoanaerobacter thermohydrosulfuncus (L09161)

Thermoanaerobacter brocku (L09165)

---Thermoanaerobacter itahcus (AJ250846)

-Thermoanaerobacter mathrann (Y11279)

■ Thermoanaerobacter sulfunglgnens (AF234164)

- Caldanaerobacter subterraneus subsp sublerraneus (AF195797) - Thermoanaerobacter keratmophilus (AY278483)

Рис. 9. Филогенетическое положение штамма 1004 и родственных микроорганизмов Внешним репером служила Escherichia coli штамм С2

2.2.5. Thermoanaerobacterium aciditolerans штамм 761-119

Штамм 761-119 был выделен из горячего источника Оранжевого поля кальдеры Узон, Камчатка Клетки штамма 761-119 представляют собой палочки длиной 3-12 мкм и шириной 0 4 мкм (Рис 4Д) с одним жгутиком и клеточной стенкой Грамположительного типа Штамм 761-119 растет в пределах 37-68°С и рН 3 2-7 1 и оптимально при 55°С и рН 5 7, с использованием Сахаров, дрожжевого экстракта, сорбитола, крахмала, ксилана, желатина и альбумина в качестве субстратов Роста на кератинах обнаружено не было Штамм 761-119 относится к отделу Firmicutes, классу Clostridia, порядку Thermoanaerobacteriales, семейству

Thermoanaerobacteriaceae и роду Thermoanaerobacterium (Lee et al 1993) Ближайшим родственным микроорганизмом является

Thermoanaerobacterium aotearoense (Shu-Ymg et al, 1996), степень сходства последовательностей молекул 16S рРНК с которым составляет 97 8% ДНК-ДНК гибридизация между Т aotearoense и штаммом 761-119

составила 33% Филогенетическое положение штамма 761-119 показано на рис 10 На основании выявленных фенотипических и филогенетических различий предложен новый вид ТИегтоапаегоЬааегтт аыскШегат

Distance 0 02

991— Thermoanaerobactermm xylanolyticwn (L09172)

100

100 -Thermoanaerobactermm aotearoense (X93359)

[¡^ Thermoanaerobactermm thermos actharolyticum (AF247003) L Thermoanaerobactermm thermosaccharolyticum T (M59119) — Caldanaerobmsfyiensis JW/YJL-F3

100

100 г Caldanaerobms zeae (U75993)

' Caldanaerobms polysaccharolyticum (U40229)

100

Caldanaerobacter sitbterraneus (AF195797)

----Thermoanaerobacter ethanolicus (L09162)

Рис. 10. Филогенетическое положение штамма 761-119 и родственных микроорганизмов Внешним репером служила Escherichia toll штамм С2

2.2 6. Desulfurococcus kamchatkensis штамм 1221п

Выделен из горячего источника Трещинный кальдеры Узон, Камчатка

Клетки штамма 122In имеют форму кокков диаметром 1 мкм (Рис 4Е), часто встречаются в виде сдвоенных клеток, а также скоплений до 40 клеток Штамм 122In растет при температурах 65-87°С и в пределах значений рН 5 5-7 5 Оптимальный рост наблюдается при 85°С и рН 6 5 Изолят 122In использует биотриптиказу, триптон, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, а-кератин (свиная щетина), альбумин, желатин, сахарозу, арабинозу в качестве субстратов для роста, добавление элементной серы стимулирует рост

По последовательности гена 16S рРНК (1320 пн) новый изолят оказался близок к представителям рода Desulfurococcus отдела Crenarchaeola, где его ближайшим родственным организмом является Desulfurococcus amylolyticus (97 8% сходства, Рис 11) На основании филогенетических и фенотипических различий нами предложен новый вид Desulfurococcus kamchatkensis

Это первый представитель гипертермофильных архей отдела Crenarchaeota, способный к росту на таких трудногидролизуемых субстратах как кератин Ранее среди архей это свойство было обнаружено только у неидентифицированных микроорганизмов отдела Euryarchaeota (Tsiroulnikov et al, 2004)

Distance О 02

100

Desulfurococcus amylolyticus (AF250331)

1221n

100

Uncultured crenarchaeota, strain OC11 (X99561)

Desulfurococcus Sp (AF411230)

Desulfurococcus mobilis (M36474)

Desulfurococcus fermentans (AY264344) Рис. 11. Филогенетическое положение штамма 122In и родственных микроорганизмов Внешним репером служила Methanosarcina barken штамм DSM 800

При исследовании способности других представителей р Ре5и^игососст расти на белках оказалось, что все они росли на тех или иных белках, включая а-кератин, и специфичность гидролизуемых ими белков зависела от видовой принадлежности каждого штамма (Табл 2)

Табл. 2. Рост представителей рода Desulfurococcus на белках

Субстрат D fermentans D amylolyticus D. mobilis D kamchatkensis

Альбумин - + + +

Желатин - + + +

а-Кератин + - + +

Казеин - + - -

Таким образом, способность к росту на негидролизованных белках, включая альфа-кератин, достаточно широко распространена среди микроорганизмов сем Thermoanaerobacteriaceae и р Desulfurococcus, однако наблюдается не у всех представителей этих таксонов, а лишь у некоторых видов

2.4. Гидролитические активности выделенных микроорганизмов

2.4.1. Целлюлазы из Caldicellulosiruptor hydrothermalis штамм 108, Caldicellulosiruptor kronotskyensis штамм 2002 и Dictyoglomus sp штамм 1521-1

Для обнаружения целлюлазной активности образцы супернатантов культуральной жидкости, а также клетчных суспензий штаммов 2002, 108 и 1521-1, выросших на целлюлозе и карбоксисметаш целлюлозе, инкубировали с субстратом - 0 4% карбоксиметил целлюлозой - при 70°С,

рН 8 0 в течение 76 часов Активность была обнаружена в супер натантах, но не в клеточных суспензиях всех трех штаммов (табл 3)

Табл. 3. Целлюлазная активность исследованных микроорганизмов

Активность 1521-1 кмц 1521-1 ц 108 ц 2002 ц

Образование восстановленных Сахаров, мкМ /мин/мл 112 42 14 36

Обнаруженная активность штамма 1521-1 является первым свидетельством того, что бактерии рода Dlctyoglomus продуцируют внеклеточную термостабильную целлюлазу

2 4 2. Кератиназы из СаЫапаетоЬасЬег рго1ео1уисиз штамм 1523-1 и ПегтоапаегоЬаШг ер. штамм 1004

Кератиназная активность была обнаружена в супернатантах культур штаммов 1523-1 и 1004, выращенных на альфа-кератине

Обе кератиназы были активны в широком диапазоне температур и значений рН, при этом оптимум активности кератиназы 1523-1 наблюдался при 66°С и рН 7 0, а для кератиназы 1004 оптимальными являлись 60°С и рН 9 3 (Рис 12)

Специфичность действия кератиназ 1523-1 и 1004 определялась по гидролизу инсулина (3-цепи (молекулы цистеина окислены) и по гидролизу низкомолекулярных синтетических субстратов -/?-нитроанилидов

После инкубации образца кератиназы 1523-1 с инсулином в течение 7 часов и при последующем хроматографическом разделении продуктов гидролиза на хроматограмме были обнаружены 2 пептидных пика, а также оставшийся негидролизованный инсулин После 24 часов инкубации новые пики не появились, уже имевшиеся увеличились, а пика инсулина не было обнаружено, что говорит о том, что субстрат полность гидролизовался Анализ данных масс-спектрометрии показал, что при гидролизе инсулина протеиназа 1523-1 показала себя узкоспецифичным ферментом (Рис 13А)

При использовании низкомолекулярных синтетических субстратов -/мштроанилидов - наибольшую активность кератиназа 1523-1 проявила по отношению к А-А-Р-Б р-нитроанилиду, в 1 7 раза меньше активность была по отношению к А-А-Р-Я /мштроанилиду и в 5 раз меньше по отношению к А-А-Р-Ь р-нитроанилиду, а А-А-Р-К р-нитроанилид не гидролизовался

Уже после 7 часов инкубации образца кератиназы 1004 молекула инсулина полностью гидролизовалась Масс-спектрометрический анализ показал, что полученные пептиды соответствовали сайтам гидролиза С*7-С8, Ы1-У12, Ы5-У16, Б24-Р25 в молекуле В-цепи инсулина (Рис 13Б)

10 20 30 40 50 60 70 ВО 90 Температуре *С

Рис. 12. Зависимость активности кератиназы 1523-1 (А) и 1004 (Б) от температуры и значений рН

По отношению к р-нитроанилидам наибольшую активность кератиназа 1004 проявляла по отношению к сукцинил-А-А-Р-Б р-нитроанилиду, по отношению к сукцинил-А-А-Р-Ь /?-нитроанилиду удельная активность была в 10 раза ниже, а сукцинил-А-А-Р-К р-нитроанилид и сукцинил-А-А-Р-К р-нитроанилид не гидролизовались

Р УМ^НЬС * ОБНЬУЕАЬУЬУС * ОЕ1ЮРР УТРКА

Р УЫСЩЬС * ОБНЬУЕАЬУЬУС * ОЕ1ШРР УТРКА

! I I \

Рис. 13. Гидролиз инсулина В-цепи, исследуемыми кератиназами 1523-1 (А) и 1004 (Б)

Пепстатин А, иодацетамид и ЭДТА незначительно ингибировали активности обеих кератиназ, в отличие от фенилметилсульфонил флуорида (phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF) - ингибитора сериновых протеиназ -который полностью ингибировал активность обоих ферментов

Ионы Са2+ (конечная коцентрация в растворе 5 мМ) как в присутствии ДСН (0 35 мМ), так и без него не оказывали существенного влияния на активность обоих ферментов Mg2+ активировал фермент 15231 в отсутствие ДСН в 1 5 раза и в меньшей степени в его присутствии, а также кератиназу 1004 вне зависимости от присутсвия ДСН в реакционной смеси Ионы Zn2' ингибировали кератиназу 1523-1 только в присутствии ДСН, а кератиназу 1004 - вне зависимости от присутствия ДСН, причем для кератиназы 1004 степень ингибирования цинком была близка к ингибированию ЭДТА Ионы Си2+ полностью ингибировали активность обеих кератиназ в присутствии ДСН, а также кератиназы 1004, когда ДСН не было в реакционной смеси Кератиназа 1523-1 в отсутствие ДСН значительно ингибировалась медью, но остаточная активность сохранялась (табл 5)

При увеличении концентрации хлорида натрия вплоть до 5М NaCl (что близко к концентрации насыщенного раствора) наблюдалось увеличение активности фермента При концентрации NaCl, равной 5М, активность кератиназы 1523-1 была в 2 раза выше, чем в опыте без соли, а кератиназы 1004 в 4 4 раза (табл 5)

Добавление в реакционную смесь растворителей (этанола и ацетона) снижало активность обеих кератиназ, однако и не вызывало полного ингибирования ферментов Даже в присутствии 10% этанола и ацетона активность кератиназы 1523-1 составляла соответственно 20 и 15% от интактной, а кератиназы 1004 - 15% в обоих случаях (табл 5)

ДСН значительно стимулировал активность обеих кератиназ В присутствии 0 01% (0 35 мМ) ДСН кератиназа 1523-1 была в 10 раз активнее, а в растворе, содержащем 0 4% ДСН - в 8 раз активнее, чем в опыте без ДСН Активность кератиназы 1004 стимулировалась добалением ДСН в еще большей степени 50-кратное увеличение активности в присутствии 0 35 мМ (0 01%) ДСН и 30-кратное при концентрации ДСН, равной 0 4%

Другие детергенты - 0 2 мМ CHAPSO, 0 5 мМ диоксихолиевая кислота, 0 4 мМ Triton XI00, а также восстанавливающие (14 3 мМ р-меркаптоэтанол) и денатурирующие (0 3 М мочевина) агенты либо ингибировали активность обеих кератиназ, либо не оказывали на нее никакого действия (табл 5)

Кератиназа 1523-1 была 101-кратно очищена в 3 стадии осаждение сульфатом аммония, обратно-фазная хроматография (Рис 13А), гель-фильтрация (табл 4) Размер очищенной кератиназы 1523-1 был равен -220 кДа (Рис 13Б), таким образом ее размер не отличался от неочищенной (из супернатанта культуральной жидкости) Не было

обнаружено и существенной разницы в их характеристиках, в том числе в способности гидролизовать кератин.

Таблица 4. Очистка внеклеточной кератиназы из СаШапаегоЬа^ег ргошЯуШж штамм 1523-1.____

Шаг Белок (мг) Активность (ед) Специфичная активность (ед/мг) Удельная активность (%) Очистка (разы)

Супернатант СА* ОФ** Гель- фильтрация 4020 42400 10.5 100 1 920 38920 42.3 92 4 1.2 1088 906.7 2.6 86 0.98 1036 1057.1 2.4 101

За единицу активности было принято количество фермента, повышающее оптическую плотность раствора при А405 на 0.01, за одну минуту при рН 7.060С и 60°С.

* - осаждение сульфатом аммония. ** - обратно-фазная хроматография.

Рис. 13. А. Обратно-фазная ВЭЖХ хроматография кератиназы 1523-1. Очищенная фракция находится в пределах, помеченных линиями. Б. ДСП желатин-содержащая зимограмма (полосы 1 и 2) и электрофорез (полоса 3) образца очищенной кератиназы 1523-1, Полоса А - маркеры, кДа.

Табл 5. Зависимость активности кератиназ 1523-1 и 1004 от химических агентов

Детергенты, восстанавливающие и Кератииаза1523-1 Кератииаза1004

гидролизующие агенты Активность (%)

- 100 100

0 35 мМ ДСН 1000 5000

300 мМ мочевина 57 60

0 2 мМ CHAPSO 10 20

0 5 мМ деоксихотиевая кислота 10 20

14 3 мМ р-меркаптоэтанол 48 80

0 4 мМ TRITON Х100 5 20

ДСН, мМ (%) Активность (%)

ООО 100 100

0 07 (0 002) 143 160

0 18 (0 005) 710 360

0 35 (0 01) 1000 5000

1 75 (0 05) 1000 4520

3 50 (0 1) 848 3600

7 00 (0 2) 814 4380

14 00 (0 4) 805 2880

Ингибиторы Активность (%)

- 100 100

1 MMFMSF 18 3

5 мМ PMSF 8 4

0 45 мМ пепстапш А 67 84

1 мМ иодоацетамид 63 95

ЮмМЭДГА 71 65

Металл Активность (%)

Без ДСН еден Без ДСН еден

- 100 100 100 100

Са2+ 97 101 105 115

Mg2* 148 117 122 126

Zn2+ 121 40 68 64

Cu2+ 17 2 5 1

NaCl (M) Активность (%)

00 100 100

0 1 102 84

05 111 110

10 139 144

30 189 305

50 197 440

Растворители Активность (%)

- 100 100

5% ацетон 43 32

10% этанот 19 14

5% этанот 44 49

10% ацетон 14 16

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инкубация полимерных субстратов в условиях свободного обмена воды в горячих источниках кальдеры Узон позволила получить обогащенные накопительные культуры, растущие в максимально приближенных к естественным условиях Оказалось, что в каждом исследованном источнике присутствуют микроорганизмы, ответственные за гидролиз различных полимерных субстратов, и внесение последних индуцирует развитие соответствующего сообщества Доминирующие в использующей карбоксиметил целлюлозу накопительной культуре бактерии, близкие роду Dlctyoglomus, были выделены в чистую культуру 1521-1, у которой впервые для этого рода была зарегистрирована целлюлазная активность Кроме того, из накопительной культуры 1507ag также была выделена первая растущая на агарозе бактерия рода Dlctyoglomus

Способность к росту на альфа-кератине за счет наличия связанной с клетками протеиназы была обнаружена нами у новой гипертермофильной археи Ов^и^шососсин катска1кепх1.ч Это первый микроорганизм отдела СгепагсИаеога, способный расти на данном субстрате Однако массовое развитие новых умеренно-термофильных архей в накопительных культурах с белковыми субстратами, сопровождающееся продукцией высокоактивных внеклеточных протеиназ, делает актуальным их дальнейший поиск и выделение в чистую культуру

Обнаруженные в супернатантах накопительных культур высокомолекулярные внеклеточные протеиназы коррелируют с присутствием представителей сем ТИегтоапаегоЬаШпасеае Из накопительной культуры 1523саз, в супернатанте которой была детектирована высокомолекулярная протеиназа (Рис ЗА и ЗБ), был выделен представитель этого семейства продуцент внеклеточной кератиназы размером -220 кДа СаШстаегоЬааег ргсАесЛупсиъ Мы установили, что кератиназы ТИегтоапаегоЬаМег ер штамма 1004 и С рго1ео1уПсиз (штамм 1523-1) обладают рядом свойств, не известных ранее для термофильных кератиназ Это высокая (до 10 раз для кератиназы 15231 и до 50 раз для кератиназы 1004) активация ДСН уже при концентрациях последнего, равных тысячным долям процента, увеличение активности при увеличении концентрации №01, вплоть до 5М ЫаС1, остаточная активность обеих кератиназ в присутствии растворителей Обнаруженные свойства делают кератиназы из С рШео1уисш и ТИегтоапаегоЬа^ег эр привлекательными для применения в биотехнологии

выводы

1 При инкубации биополимеров в горячих источниках кальдеры Узон было показано присутствие в этих местообитаниях активных и разнообразных сообществ термофильных бактерий и архей, способных гидролизовать биополимеры

2 В накопительные культурах, полученных в условиях in situ, были выявлены как известные, так и новые организмы с гидролитическими свойствами Изучение филогенетического положения компонентов полевых накопительных культур позволяет сделать предположения о фенотипических свойствах представителей «некультивируемых» таксонов, что в свою очередь может помочь в их выделении

3 Выделено и описано 5 новых видов термофильных бактерии и архей (Caldicellulosiruptor hydrothermahs, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Caldanaerobacter proteolytics, Thetmoanaerobacterium aciditolerans и Desulfurococcus kamchatkensis), использующих биополимерные субстраты - целлюлозу и белки, включая трудногидролизуемые кератины

4 Выделен первый представитель рода Dictyoglomus, растущий на агарозе и подтверждена способность представителей этого рода к росту на целлюлозе, обусловленному продукцией внеклеточной целлюлазы

5 Установлено, что способность к росту на альфа-кератине свойственна, помимо новых изолятов, ряду коллекционных штаммов - Ihermoanaerobacter siderophilus, Desulfurococcus fermentons и Desulfurococcus mobilis Представители рода Desulfurococcus являются первыми индентифицированными гипертермофильными археями, использующими кератины

6 Кератиназы из Caldanaerobacter proteolyticus и Thermoanaerobacter sp обладают рядом новых для термофильных кератиназ свойств, таких как возрастание активности в присутствии NaCl вплоть до концентрации, близкой к насыщению, активность (пониженная) в присутствии растворителей, а также уникально высокая активация в присутствии ДСН Эти свойства делают новые кератиназы привлекательными объектами для практического применения

Список публикаций но теме диссертации Статьи

1 Kublanov. I V . Prokofeva, M I, Kostnkina, N A, Kolganova, T V , Tourova, T P , Wiegel, J and Bonch-Osmolovskaya, E A 2007 fhermoanaerobactermm aciditolerans sp nov , a moderate thermoacidophile from a Kamchatka hot spring Int J Syst Evolut Microbiol 57, 260-264

2 Кубланов. И В . К Б Цирульников, E H Калиберда, Л Д Румш, Т Эртле, и Е А Бонч-Осмоловская 2007 Кератиназа из анаэробной термофильной бактерии

Thermoanaerobacter штамм 1004, выделенной из горячего источника Байкальсткой рифтовой зоны Микробиология, в печати

3 Kublanov. I V. A A Perevalova, G В Slobodkma, S Bidzhieva, Т Kolganova, EN Kahberda, L D Rumsh, T Haertle and E A Bonch-Osmolovskaya Biodiversity of thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities in Uzon Caldera hot springs studied by m situ enrichment method Appl Environ Microbiol, submitted

4 Kublanov. IV. M Dalgalarrondo, T Kolganova, J M Chobert, E A Bonch-Osmolovskaya and T Haertle Characterization of SDS-activated serine proteinase with keratinolytic activity produced by anaerobic thermophilic bacterium Caldanaerobacler sp strain 1523-1 Appl Biochem Biotechnol, submitted

5 Miroshmchenko, M L, IV Kublanov. N A Kostnkma, T P Tourova, T V Kolganova, NK Birkeland and EA Bonch-Osmolovskaya Caldtcellulosiruptor kronotskyensis sp nov and Caldtcellulosiruptor hydrothermahs sp nov, two novel extremely thermophilic cellulolytic anaerobic bacteria from Kamchatka thermal springs Int J Syst Evolut Microbiol, on revision

Тезисы

1 Kublanov. IV . IV Subbotma, В В Namsaraev and E A Bonch-Osmolovskaya Исследование термофильных прокариот, обладающих гидролитической активностью, выделенных из горячих источников Байкальского региона Международная конференция «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии», 21-29 июля 2003 г, Улан-Удэ, Россия С 76-77

2 Kublanov. IV. Subbotma, IV, Chernyh, NA, Kostrikma, NA, Turova, TP Bonch-Osmolovskaya, E A Screening for new anaerobic thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities Thermophiles Conference, 15-19 September 2003, Exeter, UK Abstract PI 25

3 Kublanov. IV. К В Tsiroulmkov, M Dalgalarrondo, T Haertle and E A Bonch-Osmolovskaya New anaerobic thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities Extremophiles Conference, 19-23 September 2004, Cambridge, USA Abstract № 188

4 Кубланов. И В. К Б Цирульников, Л Д, Румш, Т Эртле и Е А Бонч-Осмоловская Новая кератинолитическая протеиназа из термофильной прокариоты Международная конференция по физико-химической биологии посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова, 2004 г, Москва, Россия С 78

5 Kublanov. IV. Е A Bonch-Osmolovskaya and Т Haertle Hyperthermophilic archaea with proteolytic activity from Kamchatka hot springs Archaea Meeting, 2-4 June 2005, Hohenkammer, Germany Abstract, p 64

6 Kublanov. I V . E A Bonch-Osmolovskaya and T Haertle New hyperthermophilic crenarchaeota with proteolytic activity isolated from Uzon Caldera hot springs International workshop "Biodiversity, molecular biology and biochemistry of thermophiles" 20-26 August 2005, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia Abstract, p 29

7 Мишарина, К И, К Б Цирульников, С X Биджиева, ИВ Кубланов. Е А Бонч-Осмоловская и Л Д Румш Новые термостабильные протеиназы из гипертермофильной археи Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», 23-25 апреля, 2007 г, Москва, Россия С 74

Подписано в печать 16 11 2007 г Исполнено 16 11 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 990 Тираж 110 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кубланов, Илья Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Термофильные микроорганизмы и их ферменты - термозимы

1.1. Экстремофилы

1.2. Термальные местообитания и термофилы

1.3. Термозимы - ферменты термофильных микроорганизмов

1.4. Механизмы, обуславливающие стабильность белков

1.5. Термостабильные гидролазы

1.5.1. Амилазы

1.5.2. Целлюлазы

1.5.3. Ксиланазы

1.5.4. Хитиназы

1.5.5. Агаразы

1.5 .6. Эстеразы и липазы

Глава 2. Протеолитики и протеазы

2.1 Природные белковые полимеры как субстраты протеаз

2.2. Общие сведения. Классификация

2.3. Термофильные протеолитики и их протеазы

2.3.1. Протеиназы термофильных бактерий

2.3.2. Протеиназы термофильных архей

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы

Глава 3. Микробиологические методы

3.1. Отбор образцов и полевые работы

3.2. Культивирование термофильных прокариот в лабораторных условиях

3.3. Выделение чистых культур

3.4. Микроскопия

3.5. Оценка скорости роста

3.6. Определение продуктов роста исследуемых штаммов

Глава 4. Методы работы с ДНК и филогения

4.1. Выделение ДНК

4.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК

4.3. Детекция продуктов ПЦР

4.4. Денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ)

4.5. Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей

4.6. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей

Глава 5. Методы исследования протеолитических ферментов

5.1. Приготовление образцов протеиназ

5.2. ДСН-ПААГ электрофорез и зимограммы

5.3. Гидролиз казеина

5.4. Определение характеристик исследуемых кератиназ

5.5. Гидролиз B-цепи инсулина исследуемыми кератиназами

5.6. Очистка кератиназы из 'Caldanaerobacterproteolyticus' штамм 1523

5 .7. Определение концентрации белка Результаты и обсуждение

Глава 6. Разнообразие термофильных прокариот-гидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон

6.1. Фенотипическое разнообразие термофильных прокариот-гидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон

6.2. Филогенетическое разнообразие термофильных прокариот-гидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон

6.3. Протеолитическая активность в накопительных культурах

Глава 7. Выделение и описание анаэробных термофильных микроорганизмов-гидролитиков

7.1. Dictyoglomus sp. штаммы 1521-1 и 1507

7.2. 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' штамм 108 и 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' штамм

7.3. 'Caldanaerobacterproteolyticus' штамм 1523

7.4. Thermoanaerobacter sp. штамм

7.5. Thermoanaerobacterium aciditolerans штамм 761

7.6. 'Desulfurococcus kamchatkensis' штамм 122In

Глава 8. Определение гидролитических активностей новых изолятов

8.1. Целлюлазы из 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' штамм 108, 'Caldicellulosiruptor kronotskyensis' штамм 2002 и Dictyoglomus sp. штамм 1521

8.2. Протеиназа из 'Desulfurococcus kamchatkensis' штамм 122In 8.3 Рост штаммов 1523-1 и 1004 на белках, включаяя кератины, и продукция ими внеклеточных протеиназ

8.4. Определение кератинолитической активности 'Caldanaerobacter proteolyticus' штамм 1523-1 и Thermoanaerobacter sp. штамм

8.5. Специфичность кератиназ 1523-1 и

8.6. Зависимость активности кератиназ 1523-1 и 1004 от Т и pH

8.7. Физико-химические свойства кератиназ 1523-1 и

8.8. Очистка кератиназы 1523

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты"

Актуальность проблемы

На сегодняшний день ферменты широко используются человеком в таких областях применения как производство продуктов питания и напитков, химическая промышленность, фармакология, медицина, целлюлозобумажная промышленность, и многих других (Copeland, 2000). Большинство ферментов, нашедших применение на данный момент, было обнаружено и выделено из организмов, обитающих при средних, нейтральных в нашем понимании условиях (Hough и Danson, 1999) - животных, грибов и растений, а также неэкстремофильных микроорганизмов. Тем не менее, несмотря на достоинства ферментов, выделенных из неэкстремофилов, их использование может быть ограничено из-за их нестабильности при экстремальных значениях температуры, рН, солености и т.д., которые могут возникать в различных технологичских процессах. Обнаружение экстремофилов - микроорганизмов, способных расти при высоких и низких температурах и значениях рН, высокой солености, больших давлениях и т.д. дало толчок к исследованию новых свойств их ферментов, имеющих значительный потенциал использования в различных областях деятельности (Adams et al., 1995).

Экстремозимы - ферменты экстремофильных микроорганизмов (Adams et al., 1995) зачастую максимально активны в тех же, что и их продуценты, условиях, а иногда и в более широких областях. Кроме изменений в структуре ферментов, обуславливающих экстремофилию их продуцентов, было обнаружено, что некоторые экстремофилы, особенно представители архей, обладают новыми, уникальными метаболическими путями и благодаря этому могут являться продуцентами ферментов с новыми свойствами (Danson и Hough, 1998; Hough и Danson, 1999). Таким, образом, при изучении экстремофильных микроорганизмов и их ферментов наши знания о пределах и возможностях биокатализа расширяются, благодаря чему увеоичивается набор возможных применений экстремозимов (Adams., 1995). Например, в некоторых случаях экстремозимы могут решить вышеуказанную проблему совместимости условий технологических процессов и хрупкости биологических компонентов и систем, задействованных в них (Danson и Hough, 1998).

Термофильные и гипертермофильные микроорганизмы представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп экстремофильных микроорганизмов. Продуцируемые ими ферменты, так называемые термозимы (Zeikus et al., 1998), имеют ряд биотехнологических преимуществ перед мезофильными аналогами: прохождение ферментативных реакций при высоких температурах позволяет работать с более высокими концентрациями субстрата из-за снижения вязкости раствора и увеличения коэффициентов диффузии при высоких температурах (Bruins et al., 2001; Eichler, 2001; Egorova и Antranikian, 2005); термостабильные ферменты зачастую обладают повышенной устойчивостью к денатурирующим агентам (например, растворителям, детергентам; Egorova и Antranikian, 2005); снижается риск побочных процессов т.к большинство микроорганизмов, способных оказать нежелательное влияние на протекающие реакции гибнут при температурах выше 70°С. Кроме того, упрощается очистка термозимов, клонированных и экспрессированных в мезофильных микроорганизмах, от остальных белков клеток хозяина благодаря возможности проведения термообработки, при которой многие мезофильные белки денатурируют (Bruins et al., 2001; Vieille и Zeikus, 2001; Bertoldo et al., 2004).

На данный момент известно довольно большое число термофильных микроорганизмов, осуществляющих гидролиз полимерных субстратов. Среди них продуценты гликозидаз умеренно термофильные амилолитические бактерии Bacillus sp. (Krishnan и Chandra, 1983; Gupta et al., 2003), археи Thermococcus profundus (Chung et al., 1995) Pyrococcus sp. (Egorova и Antranikian, 2005), термофильные целлюлолитические бактерии Rhodothermus marinus, Acidithermus cellulolyticus, Caldibacillus cellulovorans (Bergquist et al., 1999), Caldicellulosiruptor и Dictyoglomus spp., археи с ксиланолитической активностью: Thermococcus zilligii (Uhl и Daniel, 1999), Pyrodictium abyssi (Andrade et al., 2001), растущая на агарозе термофильная бактерия 'Caldanaerobacter uzonensis' (Kozina et al., в печати) и др. Термофильные протеолитики представлены бактериями родов Thermoanaerobacter, Thermus, Thermoactinomyces, Fervidobacterium и др., археями родов Desulfurococcus, Thermococcus, Pyrococcus, Aeropyrum и др. Большинство из них растут и используют в качестве источника углерода и/или энергии пептиды благодаря наличию внеклеточных протеаз (в большинстве случаев относящихся к щелочным субтилизин-подобным сериновым протеиназам), активных в широких диапазонах значений рН (Klingeberg et al., 1995; Ward et al., 2002) и температур. Лишь немногие способны использовать в качестве субстрата белки, при гидролизе которых образуются пептиды, используемые большинством остальных протеолитиков. В целом, очевидно, что в природных местообитаниях гидролитики получают некоторое преимущество благодаря способности использовать недоступный для других микроорганизмов субстрат.

Области применения гидролаз, такие как текстильная и бумажная промышленность, выходящая в последнее время на передний план переработка отходов различной природы, и др. постоянно развиваются и расширяются, в связи с чем существует потребность в новых гидролазах, более эффективных, нежели имеющиеся или обладающих новыми свойствами.

Вместе с тем исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов в термальных местообитаниях показывают, что большое число термофильных микроорганизмов до сих пор не получено в лабораторных культурах, и, следовательно, их свойства неизвестны (Amann et al., 1995; Barns et al., 1996; Hugenholtz et al., 1998). Среди новых термофильных прокариот могут оказаться и организмы с новыми, биотехнологически привлекательными свойствами. Таким образом, поиск новых термофильных микроорганизмов-гидролитиков остается актуальной проблемой исследований как с научной, так и с прикладной точки зрения.

Цели и задачи исследования

Целью работы было обнаружение, выделение и изучение анаэробных термофильных микроорганизмов-гидролитиков, а также их ферментов.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Изучение филогенетического разнообразия термофильных микроорганизмов-гидролитиков из горячих источников кальдеры Узон.

2. Выделение и характеристика чистых культур анаэробных термофильных гидролитиков.

3. Характеристика термостабильных гидролитических ферментов, продуцируемых новыми изолятами.

Научная новизна и практическая ценность работы

Опробованный метод культивирования накопительных культур в условиях in situ с добавлением различных нерастворимых и слаборастворимых биополимерных субстратов является действенным методом накопления новых гидролитических микроорганизмов.

Определение филогенетического положения наиболее многочисленных микроорганизмов, населяющих полевые накопительные культуры, показало, что в них, помимо представителей уже известных родов бактерий, присутствуют термофильные археи, ранее известные исключительно по природным клонам.

Выделены и охарактеризованы новые целлюлолитические термофильные бактерии 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' и Dictyoglomus sp.; агаролитическая бактерия Dictyoglomus sp., а также протеолитические бактерии 'Caldanaerobacter proteolytics' и Thermoanaerobacter sp. и протеолитическая архея 'Desulfurococcus kamchatkensis

Показана способность протеиназ из 'Caldanaerobacter proteolyticus' и Thermoanaerobacter sp. разрушать трудногидролизуемый белок кератин. Такие свойства обеих кератиназ как активация додецилсульфатом натрия (ДСН), а также остаточная активность в присутствии растворителей, являются новыми для термофильных кератиназ.

Выделенные нами кератиназы ввиду их исключительной активности в присутствии ДСН могут найти широкое применение в качестве добавок к моющим средствам, также привлекательна возможность их использования в качестве биодеградирующих агентов различных трудногидролизуемых белков, таких как кератины.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии», 2003; «Thermophiles 2003»; «Extremophiles 2004»; «Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова», 2004; «Archaea Meeting», 2005; «Biodiversity, molecular biology and biochemistry of thermophiles», 2005; «Химия протеолитических ферментов», 2007.

Место проведения работы

Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и в лаборатории функций и взаимодействий белков молока (FIPL) Национального Института сельскохозяйственных исследований (INRA), г. Нант при докторантуре Университета Нанта, Франция.

Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов был проведен сотрудником лаборатории к.б.н. A.B. Лебединским (ИНМИ РАН). Выделение ДНК, проведение ПЦР и ДГГЭ анализ генов 16S рРНК были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории A.A. Переваловой и к.б.н. Г.Б. Слободкиной. Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполняли совместно с к.б.н. A.M. Лысенко и к.б.н. H.A. Черных (ИНМИ РАН). Определение последовательностей генов 16S рРНК и филогению чистых культур выполняли совместно с к.б.н. Б.Б. Кузнецовым, к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр Биоинженерии РАН). Электронную микроскопию накопительных и чистых культур проводили совместно с H.A. Кострикиной (ИНМИ РАН). Масс-спектрометрию, ВЭЖХ хроматографию и др. Исследования свойств ферментов проводили при содействии М. Далгаларрондо (М. Dalgalarrondo, INRA, Nantes), а также сотрудников лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. под руководством заведующего лабораторией д.х.н., проф. Румша Л.Д.

Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим участие на различных этапах работы: A.B. Лебединскому, A.A. Переваловой, Г.Б. Слободкиной, М.Л. Мирошниченко, A.M. Лысенко, H.A. Черных, H.A. Кострикиной, М.И. Прокофьевой, К.И. Мишариной, К.Б. Цирульникову, С.Х. Биджиевой, Б.Б. Кузнецову, Т.В. Колгановой и М. Далгаларрондо а также сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, Россия и лаборатории функций и взаимодействий белков молока INRA, Нант, Франция, за помощь в данной работе, а также за создание замечательной, способствующией рабочей и творческой дейтельности, атмосферы. Автор благодарит посольство Франции в Москве за предоставленную стипендию во время прохождения докторантуры в Университете Нанта. Автор благодарит Льва Давидовича Румша за критические и справедливые замечания, а также Алину Княженцеву за исправление множества ошибок, скрывшихся от взгляда автора. Автор выражает глубокую признательность Маше Прокофьевой за неоценимую помощь в освоении автором микробиологических методов, а также сотруднику лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН

Кириллу Цирульникову за большую помощь в работе с протеиназами. Огромную благодарность автор выражает руководителям Т. Эртле и Е.А Бонч-Осмоловской, за постоянное внимание, а также помощь в обсуждении результатов и направлений дальнейших иследований. Отдельную благодарность автор выражает Елизавете Александровне Бонч-Осмоловской, за все. За огромный вклад в становлении автора как микробиолога, а также за участие и поддержку, оказываемую автору как внутри лаборатории, так и вне ее.

Финансовая поддержка

Работа была поддержана Программами РАН "Молекулярная и клеточная биология", "Биоразнообразие" и "Эволюция биосферы", проектами РФФИ №00-04-48924, №02-04-48112, №03-04-49000, программами ИНТАС №99-1250, №01-250 и №04-83-2725.

Статьи

1. Kublanov, I. V., Prokofeva, M. I., Kostrikina, N. A., Kolganova, Т. V., Tourova, T. P., Wiegel, J. and Bonch-Osmolovskaya, E. A. 2007. Thermoanaerobacterium aciditolerans sp. nov., a moderate thermoacidophile from a Kamchatka hot spring. Int J Syst Evolut Microbiol 57, 260-264.

2. Кубланов, И.В., К.Б. Цирульников, E.H. Калиберда, Л.Д. Румш, Т. Эртле, и Е.А. Бонч-Осмоловская. 2007. Кератиназа из анаэробной термофильной бактерии Thermoanaerobacter штамм 1004, выделенной из горячего источника Байкальской рифтовой зоны. Микробиология, в печати.

3. Kublanov, I.V., A.A. Perevalova, G.B. Slobodkina, S. Bidzhieva, Т. Kolganova, E.N. Kaliberda, L.D. Rumsh, T. Haertle and E.A. Bonch-Osmolovskaya. Biodiversity of thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities in Uzon Caldera hot springs studied by in situ enrichment method. Applied Environm. Microbiol., submitted.

4. Kublanov. I.V. M. Dalgalarrondo, T. Kolganova, J.M. Chobert, E.A. Bonch-Osmolovskaya and T. Haertle. Characterization of SDS-activated serine proteinase with keratinolytic activity produced by anaerobic thermophilic bacterium Caldanaerobacter sp. strain 1523-1. Appl. Biochem. Biotechnol., submitted.

5. Miroshnichenko, M.L., I.V. Kublanov, N.A. Kostrikina, T.P. Tourova, T.V. Kolganova, N.K. Birkeland and E.A. Bonch-Osmolovskaya. Caldicellulosiruptor kronotskyensis sp. nov. and Caldicellulosiruptor hydrothermalis sp. nov., two novel extremely thermophilic cellulolytic anaerobic bacteria from Kamchatka thermal springs. Int. J. Syst. Microbiol., on revision.

Тезисы

1. Kublanov, I.V., I.V. Subbotina, B.B. Namsaraev and E.A. Bonch-Osmolovskaya. Исследование термофильных прокариот, обладающих гидролитической активностью, выделенных из горячих источников Байкальского региона. Международная конференция «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии», 21-29 июля 2003 г., Улан-Удэ, Россия. С 76-77.

2. Kublanov, I.V., Subbotina, I.V., Chernyh, N.A., Kostrikina, N.A., Turova, T.P. Bonch-Osmolovskaya, E.A. Screening for new anaerobic thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities. Thermophiles Conference, 15-19 September 2003, Exeter, UK. Abstract PI.25.

3. Kublanov, I.V. K.B. Tsiroulnikov, M. Dalgalarrondo, T. Haertle and E.A. Bonch-Osmolovskaya. New anaerobic thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities. Extremophiles Conference, 19-23 September 2004, Cambridge, USA. Abstract № 188.

4. Кубланов, И.В., К.Б. Цирульников, Л.Д, Румш, Т. Эртле и Е.А. Бонч-Осмоловская. Новая кератинолитическая протеиназа из термофильной прокариоты. Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, 2004 г., Москва, Россия. С. 78.

5. Kublanov, I.V., E.A. Bonch-Osmolovskaya and Т. Haertle. Hyperthermophilic archaea with proteolytic activity from Kamchatka hot springs. Archaea Meeting, 2-4 June 2005, Hohenkammer, Germany. Abstract, p. 64.

6. Kublanov, I.V., E.A. Bonch-Osmolovskaya and T. Haertle. New hyperthermophilic crenarchaeota with proteolytic activity isolated from Uzon Caldera hot springs. International workshop "Biodiversity, molecular biology and biochemistry of thermophiles". 20-26 August 2005, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Abstract, p. 29.

7. Мишарина, К.И., К.Б. Цирульников, С.Х. Биджиева, И.В. Кубланов, Е.А. Бонч-Осмоловская и Л.Д. Румш. Новые термостабильные протеиназы из гипертермофильной археи. Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», 23-25 апреля, 2007 г., Москва, Россия. С. 74.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кубланов, Илья Валерьевич

выводы

1. При инкубации биополимеров в горячих источниках кальдеры Узон было показано присутствие в этих местообитаниях активных и разнообразных сообществ термофильных бактерий и архей, способных гидролизовать биополимеры.

2. В накопительных культурах, полученных в условиях in situ, были выявлены как известные ранее, так и новые организмы с гидролитическими свойствами. Изучение филогенетического положения компонентов полевых накопительных культур позволяет сделать предположения о фенотипических свойствах представителей «некультивируемых» таксонов, что в свою очередь может помочь в их выделении.

3. Выделено и описано 5 новых видов термофильных бактерий и архей ('Caldicellulosiruptor hydrothermalis'Caldicellulosiruptor kronotskyensis 'Caldanaerobacter proteolytics', Thermoanaerobacterium aciditolerans и 'Desulfurococcus kamchatkensis'), использующих биополимерные субстраты - целлюлозу и белки, включая трудногидролизуемые кератины.

4. Выделен первый представитель рода Dictyoglomus, растущий на агарозе и подтверждена способность представителей этого рода к росту на целлюлозе, обусловленному продукцией внеклеточной целлюлазы.

5. Установлено, что способность к росту на а-кератине свойственна, помимо новых изолятов, ряду коллекционных штаммов -Thermoanaerobacter siderophilus, Desulfurococcus fermentans и Desulfurococcus mobilis. Представители рода Desulfurococcus являются первыми идентифицированными гипертермофильными археями, использующими кератины.

6. Кератиназы из 'Caldanaerobacter proteolyticus' и Thermoanaerobacter sp. обладают рядом новых для термофильных кератиназ свойств, таких как

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инкубация полимерных субстратов в условиях свободного обмена воды в горячих источниках кальдеры Узон позволила получить обогащенные накопительные культуры, растущие в максимально приближенных к естественным условиях. Оказалось, что в каждом исследованном источнике присутствуют микроорганизмы, ответственные за гидролиз различных полимерных субстратов, и внесение последних индуцирует развитие соответствующего сообщества. Доминирующие в использующей карбоксиметил целлюлозу накопительной культуре бактерии, близкие роду Dictyoglomus, были выделены в чистую культуру 1521-1, у которой впервые для этого рода была зарегистрирована целлюлазная активность. Кроме того, из накопительной культуры 1507ag также была выделена первая растущая на агарозе бактерия рода Dictyoglomus.

Способность к росту на а-кератине за счет наличия связанной с клетками протеиназы была обнаружена нами у новой гипертермофильной археи 'Desulfurococcus kamchatkensis'. Это первый микроорганизм отдела Crenarchaeota, способный расти на данном субстрате. Однако массовое развитие новых умеренно-термофильных архей в накопительных культурах с белковыми субстратами, сопровождающееся продукцией высокоактивных внеклеточных протеиназ, делает актуальным их дальнейший поиск и выделение в чистую культуру.

Обнаруженные в супернатантах накопительных культур высокомолекулярные внеклеточные протеиназы коррелируют с присутствием представителей сем. Thermoanaerobacteriaceae. Из накопительной культуры 1523cas, в супернатанте которой была детектирована высокомолекулярная протеиназа (Рис. 11 А, Б), был выделен представитель этого семейства продуцент внеклеточной кератиназы размером -220 кДа 'Caldanaerobacter proteolyticus'. Мы установили, что кератиназы Thermoanaerobacter sp. штамм 1004 и 'С. proteolyticus' (штамм 1523-1) обладают рядом свойств, не известных

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кубланов, Илья Валерьевич, Москва

1. Банникова, Г.Е., С.А. Лопатин, В.П. Варламов, В.В. Кузнецов, И.В. Козина, М.Л. Мирошниченко, Н.А. Черных, Т.П. Турова и Е.А. Бонч- Осмоловская. Термофильные бактерии гидролизующие агар: характеристика термостабильной агаразы. Микробиология. В печати.

2. Кевбрин, В.В. и Г.А. Заварзин. 1992. Влияние соединений серы на рост галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum. Микробиология. 61: 812-817.

3. Adams, M.W.W. 1993. Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 100°C. Annu. Rev. Microbiol. 47: 627-58.

4. Adams, M.W.W., F.B. Perler, and R.M. Kelly. 1995. Extremozymes: expanding the limits of biocatalysis. Bio/Technology. 13: 662-668.

5. Akasako, A., M. Haruki, M. Oobatake, and S. Kanaya. 1997. Conformational stabilities of Escherischia coli RNase HI variants with a series of amino acid substitutions at a cavity within the hydrophobic core. J. Biol. Chem. 272: 18686-18693.

6. Amann, R.I., W. Ludwig, and K.-H. Schleifer. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microb. Rev. 59: 143-169.

7. Amend, J.P. and E.L. Shock. 2001. Energetics of overall metabolic reactions of thermophilic and hyperthermophilic Archaea and Bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 25: 175-243.

8. Andrade, C.M., W.B. Aguiar and G. Antranikian. 2001. Physiological aspects involved in production of xylanolytic enzymes by deep-sea hyperthermophilic archaeon Pyrodictium abyssi. Appl. Biochem. Biotechnol. 91-93: 655-669.

9. Antranikian, G., C. Vorgias and C. Bertoldo. 2005. Extreme environments as a resource for microorganisms and novel biocatalists. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96: in press.?

10. Argos, P., M.G. Rossmann, U.M. Grau, H. Zuber, G. Frank and J.D. Tratschin. 1979. Thermal stability and protein structure. Biochemistry. 18: 5698-5703.

11. Baross, J.A., and S. E. Hoffman. 1985. Submarine hydrothermal vents and associated gradient environments as sites for the origin and avolution of life. Origins of life. 15: 327-345.

12. Basak, A., B.B. Touré, C. Lazure, M. Mbikay, M. Chrétien and NG. Seidah. 1999. Enzymatic characterization in vitro of recombinant proprotein convertase PC4. Biochem. J. 343: 29-37.

13. Bergquist, P.L., M.D. Gibbs, D.D. Morris, V.S.J. Te'o, D.J. Saul and H.W. Morgan. 1999. Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 28: 99-110.

14. Bertoldo, C., C. Dock and G. Antranikian. 2004. Thermoacidophilic microorganisms and their novel biocatalysts. Eng. Life Sei. 4: 521-531.

15. Birnboim, H. C., and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523

16. Blöchl, E., R. Rachel, S. Burggruf, D. Hafenbranl, H.W. Jannasch and K.O. Stetter. 1997. Pyrolobus fumarii, gen. and sp. nov., represents a novel group of archaea, extending the upper temperature limit for life to 113°C. Extremophiles. 1: 14-21.

17. Blumentals, I.I., A.S. Robinson and R.M. Kelly. 1990. Characterization of sodium dodecyl sulfate-resistant proteolytic activity in the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus. Appl. Environ. Microbiol. 56: 19921998.

18. Bredholt, S., J. Sonne-Hansen, P. Nielsen, I.M. Mathrani, and B.K. Ahring. 1999. Caldicellulosiruptor kristjanssonii sp. nov., a cellulolytic, extremely thermophilic, anaerobic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:991-996.

19. Brock, T.D. 1967. Life at high temperatures. Science. 158: 1012-1019.

20. Brown, S.H., H.R. Costantino, and R.M. Kelly. 1990. Characterization of amylolytic enzyme activities associated with the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus. Appl. Environ. Microbiol. 56: 19851991.

21. Bruins, M., A. Janssen and R. Boom. 2001. Thermozymes and their applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 90: 155-186.

22. Choi, I.G., W.G. Bang, S.H. Kim and Y.G. Yu. 1999. Extremely thermostable serine-type protease from Aquifexpyrophilus. J. Biol. Chem. 274: 881-888.

23. Chung, Y.C., T. Kobayashi, H. Kanai, T. Akiba and T. Kudo. 1995. Purification and properties of extracellular amylase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus profundus DT5432. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1502-1506.

24. Copeland, R.A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc.

25. Corpet, F. 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic. Acid. Res. 16: 10881-10890.

26. Cowan, D.A., and R.M. Daniel. 1982. Purification and some properties of an extracellular protease (caldolysin) from an extreme thermophile. Biochim. Biophys. Acta. 705: 293-305.

27. Cowan, D.A., K.A. Smolenski, R.M. Daniel and H.W. Morgan. 1987. An extremely thermostable extracellular proteinase from a strain of the archaebacterium Desulfurococcus growing at 88°C. Biochem. J. 247: 121-133.

28. Cregg, K., and Rogers G.E. 1986. Feather keratin: composition, structure and bioenergetics. In: Bereiter-Hahn, J., Maltotsy, A.G., Richards, K.S. (eds) Biology of the integument, Vertebrates vol II, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 666-694.

29. Dalev, P.G. 1994. Utilisation of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate. Biores. Technol. 48: 265-267.

30. Danson, M.J. and D.W. Hough. 1998. Structure, function and stability of enzymes from the Archaea. Trends Microbiol. 6: 307-314.

31. Dargatz, H., T. Diefenthal, V. Witte, G. Reipen, and D. von Wettstein.1993. The heterodimeric protease clostripain from Clostridium histolyticum is encoded by a single gene. Mol. Gen. Genet. 240: 140-145.

32. Das, T.K., S. Mazumdar and S. Mitra. 1998. Characterization of a partially unfolded structure of cytochrome c induced by sodium dodecyl sulphate and the kinetics of its refolding. Eur. J. Biochem. 254: 662-670.

33. De Azeredo, L.A.I., M.B. De Lima, R.R.R. Coelho and D.M.G. Freire.2006. Thermophilic protease production by Streptomyces sp. 594 in submerged and solid-state fermentations using feather meal. J. Appl. Microb. 100: 641647.

34. Deckert, G., Warren, P.V., Gaasterland, T. et al., 1998. The complete genome of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Nature. 392: 353-363. пока не нужно

35. Demirjian, D.C., F. Moris-Varas, and C.S. Cassidy. 2001. Enzymes from extremophiles. Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 144-151.

36. De Toni, C.H., M.F. Richter, J.R. Chagas, J.A.P. Henriques and C. Termignoni. 2002. Purification and characterization of an alkaline serine endopeptidase from feather-degrading Xanthomonas maltophilia strain. Can. J. Microbiol. 48: 342-348.

37. Eggen, R., A. Geerling, J. Watts and W.M. De Vos. 1990. Chearacterization of pyrolysin, a hyperthermoactive serine protease from the archaebacterium Pyrococcus furiosus. FEMS Microbiol. Lett. 71: 17-20.

38. Egorova, K., and Antranikian G. 2005. Industrial relevance of thermophilic Archaea. Curr. Opin. Microbiol. 8: 649-655.

39. Eichler, J. 2001. Biotechnological uses of archaeal extremozymes. Biotechnol. Adv. 19:261-278.

40. Facchiano, A.M., G. Colonna and R. Ragone. 1998. Helix stabilizing factors and stabilization of thermophilic proteins: an X-ray based study. Protein Eng. 11: 753-760.

41. Fischer, S. G., and L. S. Lerman. 1980. Separation of random fragments of DNA according to properties of their sequences. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:1579-1583.

42. Friedrich, A.B. and Antranikian, G. 1996. Keratin degradation by Fervidobacterium pennivorans, a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermotogales. Appl. Environ. Microbiol. 62-8: 2875-2882.

43. Fusek, M., X. Lin and J. Tang. 1990. Enzymatic properties of thermopsin. J. Biol. Chem. 265: 1496-1501.

44. Gao, J., M.W. Bauer, K.R. Shockley, M.A. Pysz, and R.M Kelly. 2003.

45. Growth of hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus on chitin involves two family 18 chitinases. Appl. Environ. Microbiol. 69-6: 3119-3128.

46. Garrity, G.M., J.A. Bell and T.G. Lilburn. 2005. Taxonomic outline of the Prokaryotes. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2H0 Edition

47. Gimenez, M.I., C.A. Studdert, J.J. Sanchez and R.E. De Castro. 2000. Extracellular protease of Natrialba magadii: purification and biochemical characterization. Extremophiles. 4: 181-188.

48. Gooday, G. 1990. The ecology of chitin degradation. Adv. Microb. Ecol. 11: 387-430.

49. Gupta, R., Beg, Q.K., and Lorenz, P. 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 15-32.

50. Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V., and Chauhan, B.2003. Microbial alpha-amylases: a biotechnological perspective. Process. Biochem. 38: 1599-1616.

51. Hanzawa, S., T. Hoaki, H.W. Jannasch and T. Maruyama. 1996. An extremely thermostable serine protease from a hyperthermophilic archaeum, Desulfurococcus strain SY, isolated from deep-sea hydrothermal vent. J. Mar. Biotechnol. 4: 121-126.

52. Hicks, P.M., K.D. Rinker, J.R. Baker and R.M. Kelly 1998. Homomultimeric protease in the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima has structural and amino acid sequence homology to bacteriocins in mesophilic bacteria. FEBS Letters. 440: 393-398.

53. Hobel, C.F., V.T. Marteinsson, G.O. Hreggvidsson and J.K. Kristjansson.2005. Investigation of the microbial ecology of intertidal hot springs by using diversity analysis of 16S rRNA and chitinase genes. Appl. Environ. Microbiol. 71: 2771-2776.

54. Hough, D.W. and M.J. Danson. 1999. Extremozymes. Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 39-46.

55. Huang, C.Y., B.K. Patel, R.A. Mah, and L. Baresi. 1998. Caldicellulosiruptor owensis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, xylanolytic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:91-97.

56. Huang, X.P. and C. Monk. 2004. Purification and characterization of a cellulase (CMCase) from newly isolated thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans gen. nov., sp. nov. World J. Microbiol. Biotechnol. 20: 85-92.

57. Hubbard, S.J., K.-H. Gross, and P. Argos. 1994. Intramolecular cavities in globular proteins. Protein Eng. 7: 613-626.

58. Hugenholtz, P., C. Pitulle, K.L. Hershberger, and N.R. Pace. 1998. Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring. Journal of Bacteriology 180:366-376

59. Jang, H.J., B.C. Kim, Y.R. Pyun and Y.S. Kim. 2002.A novel subtilisin-like serine protease from Thermoanaerobacter yonseiensis KB-1: cloning, expression, and biochemical properties. Extremophiles. 6: 233-243.

60. Jukes, T.H. and C.R. Cantor. 1969. Evolution of protein molecules. In Mammalian Protein Metabolism, pp21-32. Edited by H. N. Munro. New York Academic Press

61. Jurgens, G. 2002. Molecular phylogeny of Archaea in boreal forest soil, freshwater and temperate estuarine sediment. Academic dissertation in microbiology. Helsinki 2002.

62. Juszczak, A., S. Aono and M.W.W. Adams. 1991. The extremely thermophilic eubacterium Thermotoga maritima, contains a novel iron-hydrogenase whose cellular activity is depeHOent upon tungsten. J. Biol. Chem. 266: 13834-13841.

63. Kalisz, HM. 1988. Microbial proteinases. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 36: 1-65.

64. Kannan, Y., Y. Koga, Y. Inoue, M. Haruki, M. Takagi, T. Imanaka, M. Morikawa and S. Kanaya. 2001. Active subtilisin-like protease from a hyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2445-2452.

65. Keyhani, N.O. and S. Roseman. 1999. Physiological aspects of chitin catabolism in marine bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1473: 108-122.

66. Krishnan, Т. and A.K. Chandra. 1983. Purification and characterization of a-amylase from Bacillus licheniformis CUMC305. Appl. Environ. Microbiol. 46: 430-437.

67. Kristjansson, J.K., and G.O. Hreggvidsson. 1995. Ecology and habitats of extremophiles. World J. Microbiol. Biotechnol. 11: 17-25.

68. Kumar, C.G. and H. Takagi. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioiHOustrial viewpoint. Biotechnol. Adv. 17: 561-594

69. Kvist, Т., B.K. Ahring, and P. Westermann. 2006. Archaeal diversity in Icelandic hot springs. FEMS Microbiol. Ecol. 59: 71-80. надо прочесть еще

70. Ladenstein, R., and B. Ren. 2006. Protein disulfides and protein disulfide oxidoreductases in hyperthemophiles. FEBS. J. 273: 4170-4185.

71. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural protein during the assemblage of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

72. Lane, D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing, p. 115-175. In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.

73. Langbein, L., M.A. Rogers, H. Winter, S. Praetzel, U. Beckhaus, H.R. Rackwitz, and & J. Schweizer. 1999. The catalog of human hair keratins. I. Expression of the nine Type I members in the hair follicle. J. Biol. Chem. 274: 19874-19884.

74. LeClair, G.R., A. Buchan and J.T. Hollibaugh. 2004. Chitinase gene sequences retrieved from diverse aquatic habitats reveal environmental-specific distributions. Appl. Environ. Microbiol. 70: 6977-6983.

75. Lin, X. and J. Tang. 1990. Purification, characterization, and gene cloning of thermopsin, a thermostable acid protease from Sulfolobus acidocaldarius. J. Biol. Chem. 265: 1490-1495.

76. Lin, X., C.G. Lee, E.S. Casale and J.C.H. Shih. 1992. Purification and characterization of keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3271-3275.

77. Linden, A., O. Mayans, W. Meyer-Klaucke, G. Antranikian and M. Wilmanns. 2003. Differential regulation of a hyperthemophilic a-amylase with a novel (Ca, Zn) two-metal center by zinc. J. Biol. Chem. 278: 98759884.

78. Meyer-Dombard, D.R., E.L. Shock, and J.P. AmeHO. 2005. Archaeal and bacterial communities in geochemically diverse hot springs of Yellowstone National Park, USA. Geobiology. 3: 211-227.

79. Morana, A, M. Moracci, A. Ottombrino, M. Ciaramella, M. Rossi, and M. De Rosa. 1995. Industrial-scale production and rapid purification of an archaeal beta-glycosidase expressed in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Appl. Biochem. 22: 261-268.

80. Naeem, A., F. Fatima and R.H. Khan. 2006. Characterization of partially folded intermediates of papain in presence of cationic, anionic and nonionic detergents at low pH. Biopolymers. 83: 1-10.

81. Nam, G., D. Lee, H. Lee, N. Lee, B. Kim, E. Choe, J. Hwang, M. Suhartono and Y. Pyun. 2002. Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly keratinase-producing thermophilic anaerobe. Arch. Microbiol. 178: 538-547.

82. Nelson, K.E., R.A. Clayton, S.R. Gill, et al., 1999. Evidence for lateral gene transfer beween Archaea and Bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. Nature. 399: 323-338.

83. Nesterenko, M. V., M. Tilley and S.J. Upton. 1994. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 28: 239-242.

84. Niehaus, F., C. Bertoldo, M. Kahler, and G. Antranikian. 1999. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 711-729.

85. Pace, C.N. 1992. Contribution of the hydrophobic effect to globular protein stability. J. Mol. Biol. 226: 29-35.

86. Parry, D.A.D., and P.M. Steinert. 1999. Intermediate filaments: molecular architecture, assembly, dynamics and polymorphism. Quart. Rev. Biophys. 32: 99-187.

87. Peek, K., R.M. Daniel, C. Monk, L. Parker and T. Coolbear. 1992. Purification and characterization of a thermostable proteinase isolated from Thermus sp. strain Rt41A. Eur. J. Biochem. 207: 1035-1044.

88. Peeples, T.L., and R.M. Kelly. 1995. Bioenergetic Response of the Extreme Thermoacidophile Metallosphaera sedula to Thermal and Nutritional Stresses. Appl. Environ. Microbiol. 61: 2314-2321.

89. Rashin, A.A., M. Iofin, and B. Honig. 1986. Internal cavities and buried waters in globular proteins. Biochemistry. 25: 3619-3625.

90. Rawlings, N.D. and A.J. Barrett. 1994. Classification of peptidases. Methods Enzymol. 244: 1-18.

91. Rawlings, N.D. and A.J. Barrett. 1994. Families of serine peptidases. Methods Enzymol. 244: 19-61.

92. Rawlings, N.D. and A.J. Barrett. 1994. Families of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244: 461-486.

93. Reynolds, E.S. 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell. Biol. 17: 208-212.

94. Riessen, S. and G. Antranikian. 2001. Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity. Extremophiles. 5: 399-408.

95. Riffel, A., F. Lucas, P. Heeb and A. BrandeUi. 2003. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin. Arch. Microbiol. 179: 258-265.

96. Saiki, T., Y. Kobayashi, K. Kawagoe, and T. Beppu. 1985. Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp. nov. a chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium. Int. J. Syst. Bacterid. 35:253-259.

97. Sako, Y., P.C. Croocker and Y. Ishida. 1997. An extremely heat-stable extracellular proteinase (aeropyrolysin) from the hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix Kl. FEBS Letters. 415: 329-334.

98. Sangali, S. and A. Brandelli. 2000. Feather hydrolysis by a Vibrio sp. strain kr2. J. Appl. Microbiol. 89: 735-743.

99. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5463-5467.

100. Schiraldi, С., M. Giuliano and M. De Rosa. 2002. Perspectives on biotechnological applications of archaea. Archaea. 1: 75-86. пока не используется

101. Schmidt, M., A.M. Lupas and D. Finley. 1999. Structure and mechanism of ATP depended-proteases. Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 584-591.

102. Schönheit, P. and T. Schäfer. 1995. Metabolism of hyperthermophiles. World J. Microbiol. Biotechnol. 11: 26-57.

103. Schrooyen, P.M.M., P.J. Dijkstra, R.C. Oberthiir, A. Bantjes and J. Feijen. 2001. Stabilization of solutions of feather keratins by sodium dodecyl sulfate. J. Colloid. Interface. Sei. 240: 30-39.

104. Shames, R.B., L.W. Knapp, W.E. Carver, LD. Washington and R.H. Sawyer. 1989. Keratinization of the outer surface of the avian scutate scale: Interrelationship of alpha and beta keratin filaments in a cornifying tissue. Cell Tissue Res. 275: 85-92.

105. Shirley, B.A., P. Stanssens, U. Hahn and C.N. Pace. 1992. Contribution of hydrogen bonding to the conformational stability of ribonuclease Tl. Biochemistry. 31: 725-732.

106. Smith, C.A., H.S. Toogood, H.M. Baker, R.M. Daniel and E.N Baker. 1999. Calcium-mediated thermostability in the subtilisin superfamily: the crystal structure of Bacillus Ak.l protease at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 294: 1027-1040.

107. Spear, J.R., J.J. Walker, T.M. McCollom, and N.R. Pace. 2004. Hydrogen and bioenergetics in the Yellowstone geothermal ecosystem. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7): 2555-2560.

108. Svetlichny, V.A., and T.P. Svetlichnaya. 1988. Dictyoglomus turgidus sp. nov., a new extremely thermophilic eubacterium isolated from hot springs of the Uzon volcano caldera. Microbiology (Eng. Transl. of Mikrobiologiya). 57:364-369.

109. Takami, H., T. Akiba, and K. Horikoshi. 1990. Characterization of an alkaline protease from Bacillus sp. no. AH-101. Appl. Environ. Microbiol. 33: 519-523.

110. Takayanagi, T., K. Ajisaka, Y. Takiguchi, and K. Shimahara. 1991. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u. Biochem. Biophys. Acta. 1078: 404-410.

111. Teplyakov, A.V., I.P. Kuranova, E.H. Harutyunyan, B.K. Vainshtein, C. Frommel, W.E. Hohne and K.S. Wilson. 1990. Crystal structure of thermitase at 1.4 À resolution. J. Mol. Biol. 214: 261-279.

112. Tsiroulnikov, K., H. Rezai, E. Bonch-Osmolovskaya, P. Nedkov, A. Gousterova, V. Cueff, A. Godfroy, G. Barbier, F. Métro, J.-M. Chobert, P.

113. Clayette, D. Dormont, J. Grosclaude and T. Haertlé. 2004. Hydrolysis ofthe amyloid prion protein and nonpathogenic meat and bone meal by anaerobic thermophilic prokaryotes and Streptomyces subspecies. J. Agric. Food. Chem. 52: 6353-6360.

114. Uhl, A.M. and R.M. Daniel. 1999. The first decription of an archaeal hemicellulase: the xylanase from Thermococcus zilligii AN1. Extremophiles. 3: 263-267.

115. Van De Peer, Y. and R. De Wachter. 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput Applic Biosci 10: 569-570.

116. Vieille, C. and G.J. Zeikus. 2001. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microb. Molec. Biol. Rev. 65: 1-43.

117. Volkin, D.B., and A.M. Klibanov. 1987. Thermal destruction processes in proteins involving cystine residues. J. Biol. Chem. 262: 2945-2950.

118. Ward, D.E., K.R. Shockley, L.S. Chang, R.D. Levy, J.K. Michel, S.B. Conners and R.M. Kelly. 2002. Proteolysis in hyperthermophilic microorganisms. Archaea. 1: 63-74.

119. Wiegel, J., and L.G. Ljungdahl. 1981. Thermoanaerobacter ethanolicus gen. nov., spec, nov., a new, extreme thermophilic, anaerobic bacterium. Arch. Microbiol. 128: 343-348.

120. Woese C.R., O. Kandler, and M.L. Wheelis. 1990. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 4576-4579.

121. Wu, J., Y. Bian, B. Tang, X. Chen, P. Shen, and Z. Peng. 2004. Cloning and analysis of WF146 protease, a novel thermophilic subtilisin-like protease with four inserted surface loops. FEMS Microbiol. Lett. 230: 251258.

122. Xiao, X., X. Yin, J. Lin, L. Sun, Z. You, P. Wang and F. Wang. 2005. Chitinase genes in lake sediment of Ardley island, Antarctica. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7904-7909.

123. Yamamura, S., Y. Morita, Q. Hasan, K. Yokoyama and E. Tamiya.2002. Keratin degradation: a cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Bichem. Biophys. Res. Comm. 294: 1138-1143.

124. Yokoyama, H. and I. Matsui. 2005. A novel thermostable membrane protease forming an operon with stomatin homolog from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus horikoshii. J. Biol. Chem. 280: 6588-6594.

125. Zahn, H., J. Föhles, M. Nienhaus, A. Schwan and M. Spei. 1980. Wool as a biological composite structure. Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 19: 496-501.

126. Zeikus, J.G., C. Vieille and A. Savchenko. 1998. Thermozymes: biotechnology and structure-function relationships. Extremophiles. 2: 179-183.

127. Zhang, J., J. Liu, J. Zhou, Y. Ren, X. Dai and H. Xiang. 2003. Thermostable esterase from Thermoanaerobacter tengcongensis: high level expression, purification and characterization. Biotechnol. Lett. 25: 1463-1467.

128. Zillig, W., K.O. Stetter, D. Prangishvilli, W. Schafer, S. Wunderl, D. Janekovic, I. Holz, and P. Palm. 1982. Desulfurococcaceae, the second family of the extremely thermophilic, anaerobic, sulfur-respiring

Информация о работе

Кубланов, Илья Валерьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кубланов, Илья Валерьевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кубланов, Илья Валерьевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кубланов, Илья Валерьевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология