Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты в горячих источниках Камчатки

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты в горячих источниках Камчатки"

На правах рукописи

СЛЕПОВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ГИДРОГЕНОГЕННЫЕ КАРБОКСИДОТРОФНЫЕ ПРОКАРИОТЫ В ГОРЯЧИХ ИСТОЧНИКАХ КАМЧАТКИ

Специальность03 00 07 -микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗ168357

Москва-2008

003168357

Работа выполнена в Институте микробиологии им СН Виноградского РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

ТГ Соколова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А Н. Ножевникова

доктор биологических наук Ю А Троценко

Ведущая организация: факультет Почвоведения

Московского Государственного Университета им МВ Ломоносова

Защита состоится «12» мая 2008 г в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 224 01 при Институте микробиологии им СН Виноградского РАН по адресу 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д 7, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им СН Виноградского РАН

Автореферат диссертации разослан «11» апреля 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

^Г/ ТВ Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты представляют физиологическую группу микроорганизмов, способных расти за счет энергии окисления СО в реакции с водой с образованием Н2 и С02 Впервые термофильные микроорганизмы с данным типом литотрофного метаболизма были обнаружены В.А Светличным в микробных сообществах горячих источников Курильских островов (Светличный и др, 1990, Svetlichny et al, 1991а) Впоследствии в различных типах гидротерм, а также в антропогенных горячих местах обитания было показано широкое распространение гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, относящихся к обоим доменам - бактериям и археям (Svetlichny et al, 1991b, Sokolova et al, 2001, 2002, 2004a, b, 2005, 2007, Parshma et al, 2005, Zavarzina et al, 2007, Kozina et al, 2008) Биохимия этого процесса была подробно исследована на первом выделенном организме этой группы - Carboxydothemus hydrogenoformans (Dobbek et al, 2001, Svetlichnyi et al, 2001, 2004, Soboh et al, 2002; Jeoung, Dobbek, 2007) Полностью прочитан геном С hydrogenoformans (Wu et al, 2006), и в стадии аннотирования находятся геномы еще трех представителей данной группы

Интерес к термофильным гидрогеногенным карбоксидотрофам связанпрежде всего с тем, что данная группа прокариот является компонентом микробных сообществ гидротермальных мест обитаний, рассматриваемых учеными как аналоги древнейших биоценозов (Заварзин, 1984, Stetter, 2006) Также представляет интерес, в том числе и прикладной, исследование термостабильных ферментов организмов, относящихся к данной группе термофилов Запатентована РНК-зависимая ДНК-полимераза Carboxydothermus hydrogenoformans (Европейский патент No 97 1211511), обладающая рядом полезных свойств Ведутся исследования по использованию гидрогеногенных карбоксидотрофных термофилов в очистке синтез-газа, состоящего в основном из Н2, СО и С02, и увеличении эффективности получения Н2 из него (Sipma et al, 2007) Однако об экологии данной группы в природных местообитаниях термофильных прокариот - горячих источниках ничего не известно

В гидротермах основными энергетическими субстратами литотрофных прокариот считаются Н2 и восстановленные соединения серы (Бонч-Осмоловская и др, 1999, Spear et al, 2005) СО также поступает в гидротермы с вулканическими газами (Symonds et al, 1994), образуется за счет термального и фотохимического разложения органического вещества (Hellebrand et al, 2008) и как продукт метаболизма некоторых термофильных прокариот (Conrad, Thauer, 1983, Diekert et al, 1984) Таким образом, и СО может также являться источником энергии для литотрофных прокариот

Известно, что СО могут использовать для роста следующие группы термофильных прокариот метаногены (Daniels et al, 1977), ацетогены (Diekert, Thauer, 1978, Savage et al, 1987, Balk et al, 2008), железоредуцирующие (Slobodkm et al, 2006) и сульфатредуцирующие (Parshma et al, 2005a, b, Henstra et

al, 2007) прокариоты, а также большая группа гидрогеногенных карбоксидотрофов, которым посвящено данное исследование Несмотря на большое разнообразие анаэробных термофилов, способных расти на СО, не известно, идет ли в горячих источниках микробное потребление СО Не известно также, микроорганизмы каких физиологических групп участвуют в трансформации СО в анаэробной зоне гидротерм, и какова роль гидрогеногенных карбоксидотрофов в ней Одним из направлений данной работы было определение с помощью радиоизотопных и хроматографических методов скорости микробной трансформации СО, идущей в горячих источниках В задачи исследования входило также определение основных продуктов микробной трансформации СО для оценки участия различных физиологических групп прокариот в исследуемом процессе

К началу наших исследований группа анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов состояла из бактерий, относящихся к классу Clostridia (Svethchny et al, 1991, Sokolova et al ,2001, 2002, 20046, 2005), и одной археи рода Thermococcus (Sokolova et al, 2004a) Впоследствии было выделено еще несколько представителей Clostridia, способных расти на СО с образованием Н2 (Parshina et al, 2005, Zavarzina et al, 2007, Kozina et al, 2008), а также описан представитель нового бактериального класса Thermolithobacteria (Sokolova et al., 2007) Таким образом, стало ясно, что физиологическая группа гидрогеногенных карбоксидотрофов не является филогенетически однородной Поэтому данная работа включала поиск новых термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных бактерий и архей

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование микробной трансформации СО на примере микробных сообществ горячих источников Камчатки и характеристика разнообразия участвующих в ней термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

Для достижения цели были поставлены следующие задачи-

(1) определение активности и основных продуктов трансформации СО чистыми культурами и микробными сообществами карбоксидотрофных термофильных прокариот,

(2) определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников,

(3) выявление возможных агентов трансформации СО в микробных сообществах горячих источников при помощи методов молекулярной экологии,

(4) выделение и характеристика новых анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые с помощью радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной СО трансформации в термальных местообитаниях Определены основные продукты микробной трансформации СО Для количественного разделения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами разработан радиоизотопный метод

Выделены, частично или полностью охарактеризованы новые термофильные анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты Выделен новый вид гипертермофильных архей 'Thermofilum carboxydotrophus' sp nov, новые виды термофильных бактерий 'Dyctioglomus carboxydivorans' sp nov, 'Carboxydothermus siderophilus' sp nov, Carboxydocella sporoproducens sp nov , а также четыре новых штамма рода Carboxydocella Показано широкое распространение представителей р Carboxydocella в горячих источниках Камчатки Полученные результаты расширяют филогенетические и фенотипические границы группы термофильных анаэробных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

Создана коллекция новых термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, которая может быть использована в водородной энергетике, очистке сточных вод, а также как потенциальный источник термостабильных ферментов

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Extremophiles 2004", "Thermophiles 2005", "Biochversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles 2005", "The Ii"1 International Symposium on Microbial Ecology - 2006", "Extremophiles 2006", "Thermophiles 2007", "The 18Л International Symposium on Environmental Biogeochemistry - 2007" и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005»

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 11 печатных работах 3 экспериментальных статьях и 8 тезисах конференций

Место проведения работы

Основная работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С Н Виноградского РАН (ИНМИРАН)

Радиоизотопные исследования проводились в лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов ИНМИ РАН Секвенирование последовательностей 16S рДНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре Биоинженерии РАН Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и МГУ имени MB Ломоносова

Автор приносит искреннюю благодарность всем, кто помогал и участвовал в данной работе д б н Пименову Н В, д г -м н Карпову ГЛ., Камзолкиной О В., к б н Русанову ИИ, к б н Дулову Л Е , к б н Слободкиной Г Б , к б н Черных НА, к б н Лысенко АМ, к б н Переваловой А А., к б н Туровой Т П, к б н. Колгановой ТВ, к б н Кострикиной НА, к б н Гаврилову С Н, а также всем сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Автор выражает глубокую признательность к б н Соколовой Т Г, д б н Бонч-Осмоловской Е А и к б н Лебединскому А В за практическую помощь, постоянное внимание и ценные советы на всех этапах выполнения работы

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на (Ч& страницах машинописного текста и включает 22 рисунка и 9 таблиц Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 165 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования

Отбор проб Пробы воды, ила и бактериальных обрастаний отбирали из 53 горячих источников Камчатки, расположенных в кальдере Узон, Долине гейзеров, в районах вулканов Мутновский и Карымский Температура воды в источниках была от 30 до 94°С, рН воды от 4 0 до 8 4

Для детальных исследований трансформации СО с помощью радиоизотопных, хроматографических и молекулярно-биологических методов было выбрано 4 источника кальдеры Узон Характеристики этих источников приведены в таблице 1

Объектами исследования служили микробные сообщества горячих источников, накопительные культуры, осуществляющие анаэробное окисление СО, а также выделенные из них гидрогеногенные карбоксидотрофные микроорганизмы

Определение концентрации растворенного в источнике СО проводили с использованием "head-space" метода отбора проб воды, по методике равновесной дегазации (Большаков, Егоров, 1987) Концентрацию СО в воздушной фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматэк», Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором

Влияние концентрации СО на скорость его анаэробной трансформации микробными сообществами горячих источников

В 60-мл флаконы помещали 2 мл пробы СО вводили в воздушную фазу, заполненную N2, в концентрации 0 2-155 мкмоль/л газовой фазы. Пробы инкубировали при температурах, близких к ш situ, на водяной бане-шейкере ThermoHaake SWB25 (Германия) со скоростью 80 об/мин Заранее была подобрана такая скорость перемешивания, при увеличении которой скорость потребления СО уже не повышалась Остаточное содержание СО в газовой фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматэк», Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором Расчет концентрации СО в осадках проводили с использованием табличного значения коэффициента его растворимости при данной температуре и минерализации среды

Таблица 1. Характеристика горячих источников кальдеры Узон, в которых проводились комплексные исследования СО трансформации

Источник Т/С рН ЕЬ, мВ Описание источника Тип пробы

Заварзина 60 62 -296 воронка, 2 5x7 м, сверху покрытая гранулами нативной серы белого цвета, по краям воронки активно развиваются циано-бактериальные маты циано-бактериальный мат

«Оранжевый нейтральный» 70 60 -310 воронка, 1 м в диаметре, с мутной водой светло-серый осадок

«Трещинный» 80 65 -270 глубокая трещина, 1 м в длину, стенки покрыты серыми обрастаниями серые обрастания со стенок

«Бурлящий» 90 65 -290 воронка, 15 м в диаметре, с постоянным интенсивным выходом газа в центре серые обрастания со дна

Оценка потенциальной активности и определение основных продуктов анаэробной термофильной трансформации СО

Перед началом исследования трансформации СО термофильными прокариотами была проверена эффективность действия при высоких температурах трех традиционных в радиоизотопных исследованиях способов фиксации добавления ШОН, глютарового альдегида и автоклавирования Оптимальным фиксатором для данных исследований оказался глютаровый альдегид (в конечной концентрации 2 5% от общего объема)

Скорости трансформации СО чистой культурой термофильной гидрогеногенной бактерии и микробными сообществами горячих источников были измерены с использованием 14СО Интенсивность трансформации СО чистой культурой определяли модифицированным радиоизотопным методом (Беляев и др , 1975) Вносили 0 1 мл 14СО общей активностью 0 2 мКи, в конечной концентрации 450 мкмоль/л культуры Культуру инкубировали с меченным

субстратом в течение 3 часов при 65 °С, после чего фиксировали глютаровым альдегидом

Опыты с природными пробами проводили в 18мл пробирках Хангейта 2 мл осадка заливали до края водой из источников, герметично закрывали За счет вытеснения воды вводили 1 мл газовой смеси, содержащей N2 и ,4СО (общая активность 0 0046 мКи, конечная концентрация 116 мкмоль |4СО/л осадка) Пробы инкубировали т situ 3, 6, 9, 12 и 24 часа, после чего образцы фиксировали глютаровым альдегидом Также оценивали потенциальную активность аэробной микробной СО трансформации в источниках, для чего увеличивали газовую фазу в пробирках до 10 мл и наполняли воздухом

Интенсивность микробной трансформации 14СО в природных пробах оценивали по образованию 14СН4, 14С02, включению углерода ,4СО в растворенное органическое вещество (РОВ), биомассу клеток и летучие жирные кислоты (ЛЖК) Для отделения газообразных продуктов трансформации 14СО (14СН4, иС02, ,4С-ЛЖК) от оставшегося субстрата была разработана и успешно апробирована специальная установка Разделение продуктов состояло из следующих этапов в реакционной колбе 14СО, связывалась добавлением 2 Н NaOH, затем проба нагревалась и 14С-ЛЖК конденсировались при помощи обратного холодильника, подсоединенного к колбе, оставшаяся смесь 14СН4 и 14СО пропускалась через нагретую до ЗОО'С колонку с СиО, где происходило окисление 14СО до 14С02, которая на выходе улавливалась Р-фенилэтиламином в сцинтилляционной смеси, '"CHj поступал в нагретую до 700-800°С кварцевую трубку, наполненную силикагелем, пропитанным солями кобальта, где сжигался до 14С02 Остальные продукты '4С0 трансформации разделяли и количественно определяли, используя описанные ранее методики (Беляев и др, 1975, Гальченко, 1994) Радиоактивность образовавшихся продуктов определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack-Beta (LKB, Швеция)

Получение и филогенетический анализ первичных накопительных культур анаэробных карбоксидотрофных прокариот

Под током чистого N2 в пробирки Хангейта вносили 2 мл осадков и 8 мл воды из источника Пробирки закрывали крышками и подсоединяли при помощи резиновых шлангов и инъекционных игл к 100-мл сосуду, полностью заполненному СО По градиенту концентрации СО диффундировал в опытные пробирки Наибольшее содержание СО в газовых фазах опытных пробирок могло составить 5-6%. Пробирки инкубировали in situ в течение трех суток (контрольные пробирки - без соединения с сосудом с СО)

Филогенетический анализ полученных накопительных культур проводили при помощи ПЦР-ДГТЭ метода (см геносистематические методы) Состав микробной популяции накопительной культуры, полученной в присутствии СО, сравнивали с составом популяции, инкубированной без СО

Культивирование накопительных и чистых культур анаэробных СО-трофных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

проводили на среде следующего состава (г/л) NH4CI - 0 66, MgCl2*6H20 - 0 16, СаС12*2Н20 - 0 1, КС1 - 0 33, КН2Р04 - 0 33, NaHC03 - О 5 В среду добавляли 1 мл/л раствора витаминов (Wolin et al, 1963), микроэлементов (Кевбрин, Заварзин, 1992), иногда в виде ростового фактора вносили дрожжевой экстракт (0 2 г/л) По 2 г/л вносили органические субстраты роста и акцепторы электронов S°, Fe(III) в виде аморфного оксида или цитрата и 9,10-антрахинондисульфонат Na (АХДС) вносили в концентрациях 10 г/л, 90 мМ, 20 мМ и 20 мМ, соответственно Среду готовили анаэробно, с кипячением и последующим охлаждением под током чистого N2, с добавлением резазурина (0 002 г/л) и, в качестве восстановителя, Na2S*9H20 (0 5 г/л) Среду с аморфным оксидом железа готовили согласно методике (Sokolova et al, 2004b) Среды, содержащие Fe(III) или АХДС, готовили без добавления восстановителя и резазурина До нужного значения рН доводили с помощью 6Н НС1 или 6Н NaOH, лосле чего под током газа разливали среду по пробиркам и флаконам с герметично закрывающимися крышками После этого газовую фазу во флаконах полностью или частично замещали СО (100, 45, 15 или 5% СО в газовой фазе) Автоклавирование среды проводили при 1 или 0 5 (при наличие в среде S0) АТИ

Численность карбоксидотрофных анаэробов в осадках определяли методом предельных разведений, инкубируя пробы на минеральной среде со 100% СО в газовой фазе Численность органотрофных анаэробов определяли на той же минеральной среде, содержащей по 0 1% глюкозы, пептона и дрожжевого экстракта в атмосфере N2 Общую численность прокариот определяли прямым счетом, окрашивая препараты раствором ДАФИ (4', 6'-диамидино-2-фенилининдол) в течение 5-7 мин (Huber et al, 1985), с использованием флуоресцентного микроскопа (Ахю Imager D1, Германия).

Чистые культуры гидрогеногенных карбоксидотрофов получали методом предельных разведений, зачастую с последующим высевом на твердые среды для получения отдельных колоний Использовали твердые (1-3% агара) и полутвердые среды (0 5% агара) двух типов «агаровые столбики» с органическими субстратами или «roll-tubes» со 100% СО в газовой фазе

Микроскопия Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 с фазово-контрастным устройством КФ-4 (JIOMO, Россия) При присутствии в среде Fe его нерастворимые в воде формы растворяли в оксалатном буфере (Гаврилов и др, 2003), разведение учитывали при подсчете Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Япония)

Определение продуктов метаболизма и субстратов Определение газообразных продуктов метаболизма {С02, СНЦ, Н2) и СО определяли на газово-

жидкостном хроматографе GLC-Chrom 5 (Laboratorm Pnstrozhe, Чехия) со стеклянной колонкой, заполненной активированным углем АГ-3, газ-носитель -Ar, детектор - катарометр. Определение концентрации Fe(II) проводили с дипиридилом, согласно методике (Балашова, Заварзин, 1980)

Проверка устойчивости микроорганизмов к антибиотикам Антибиотики добавляли в среду для культивирования в концентрации 100-500 мкг/мл

Геносистематические методы Выделение ДНК проводили методами Мармура или Бирнбойма-Доли в модификациях (Marmur, 1961; Булыгина и др, 2002), с применением технологии фирмы Promega (США). Определение содержания Г+Ц пар оснований в ДНК проводили по кривым плавления (Marmur, Doty, 1962) ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации (De Lay et al, 1970) Амплификацию генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирование полученных ампликонов проводили согласно описанным ранее методикам (Субботина и др, 2003) При этом использовали следующие бактериальные, архейные и универсальные праймерьг Bact8-27F, Arch338F, Bact907R, Archl381R, Arch915R, Umv515F, Umvl492R Денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГТЭ) проводили согласно описанной ранее методике (Kublanov et al, submitted)

Филогенетическое положение изотятов и разделенных ДГТЭ фрагментов природной ДНК определяли путем сравнения последовательностей генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных GenBank, с использованием программ BLAST (http //www nebí nlm nih gov/blast) и CLUSTAL W v 1.75 (Thompson et al, 1994) Филогенетические деревья были построены с помощью программ TREECON W (Van de Peer, De Wächter, 1994) и PHYLIP (Felsenstein, 1989)

2. Результаты исследования и их обсуждение

Исследование условий трансформации СО культуральными методами.

Пробы воды и осадков из 53 различных источников инкубировали в лабораторных условиях на минеральной среде в атмосфере 100% СО (10% засев) Анаэробная трансформация СО активна шла в пробах из источников с температурами 50-94°С и pH 5.0-8 5 При этом в горячих источниках с температурой воды ниже 80°С карбоксидотрофные анаэробы были представлены в основном клетками палочковидной формы, а в источниках с температурой выше 80°С окись углерода метаболизировали клетки нитевидной и кокковидной формы.

Влияние концентрации СО на скорость его анаэробной трансформации микробными сообществами горячих источников. Опыт проводили на осадках из источника «Трещинный» (80°С) (табл 1) Была показана двухступенчатая зависимость трансформации СО от его концентрации. Этот эффект можно

объяснить тем, что в осадках горячего источника функционирует СО-трофное

СО, мкмоль/л

Рис. 1. Зависимость скорости потребления СО от его концентрации в газовой фазе пробами из ист «Трещинный» (кальдера Узон, Камчатка)

Были найдены следующие кинетические параметры KS\ = 54 нМ (нмоль СО/л осадка, соответствующая равновесная концентрация в воздухе составляет 3 75 мкмоль СО/л или 84 ppm), V,"1 = 0 45 ммоль СО/л осадка/сут, = 1 мкМ (69 мкмоль СО/л равновесной газовой фазы или 1568 ppm), V2"1 = 45 ммоль СО/л осадка/сут Зная концентрацию СО в источнике (в данном случае 20 нМ) и пользуясь полученной зависимостью, можно оценить реальную скорость трансформации СО микробным сообществом источника «Трещинный» как 0 12 ммоль/л осадка/сут

Полученные результаты говорят о том, что в микробном окислении СО в горячем источнике участвует сообщество СО-трофных прокариот с высоким и низким сродством к субстрату При этом внутри сообщества могут существовать как разные по сродству к СО различные группы карбоксидотрофов, так и организмы, у которых функционируют ферментативные системы с разным сродством к СО Возможно, это позволяет организмам лучше адаптироваться в условиях циклических перепадов доступности СО

Исследование трансформации СО термофильными прокариотами с помощью радиоизотопных методов. Для радиоизотопных исследований трансформации 14СО был взят автотрофно растущий на СО штамм Carboxydocella sp 1503 Общая интенсивность потребления 14СО штаммом составила 38 - 56 ммоль/л/сут За время инкубации в продукты трансформировалось до 4% от внесенного меченого СО При этом более 99 4% от потребленного иСО окислялось до 14С02, оставшийся углерод 14СО шел на образование клеточных структур

Трансформацию СО термофильными микробными сообществами исследовали на примере четырех источников кальдеры Узон (табл 1) В отобранных пробах воды всех источников растворенный оксид углерода был обнаружен в концентрациях 20-30 нМ 14СО был добавлен к пробам в больших

концентрациях (116 мкМ) для того, чтобы проследить трансформацию метки во все возможные продукты Поэтому полученные данные характеризуют потенциальную активность процесса Проведенные опыты показали быструю трансформацию СО микробными сообществами Более 90% от внесенной метки трансформировалось за 9 часов инкубации в источнике Заварзина (60°С), за 3 часа в ист. «Трещинный» (80°С) В источнике «Бурлящий» (90°С) 80% от внесенной 14СО трансформировалось в различные продукты за 12 часов инкубации (рис 2) Потенциальная активность анаэробной микробной трансформации СО в источниках с температурами 60, 70, 80 и 90°С составила 0 09, 0 10, 0 48 и 0 13 ммоль/л осадка/сут, соответственно

9 12 15 время инкубации (ч)

Рис. 2. Динамика трансформации 14СО в 1 СО2 и 14С-органическое вещество (14С-ОВ) микробными сообществами ист «Бурлящий» (90°С), где 14С-ОВ-это сумма 14С-ЛЖК, 14С-РОВ и 14С-клеточной массы

Основным продуктом микробной трансформации СО являлся С02(90-100% от использованного 14СО) Не более 5% от использованного СО трансформировалось в ЛЖК, доля метки, обнаруживаемой в ЛЖК, снижалась с повышением температуры в источнике Оставшийся 14С включался в РОВ и биомассу (рис 3) Перехода метки в 14СН4 обнаружено не было

Отсутствие метаногенной активности в исследованных горячих источниках согласуется с полученными ранее результатами, показавшими незначительные скорости литотрофного метаногенеза из С02 в источниках кальдеры Узон с температурами 55-75°С и полное его отсутствие в источниках с температурами выше 80°С (Бонч-Осмоловская и др, 1987, 1999, Pimenov et al, 2007)

Присутствие воздуха в газовой фазе экспериментальных пробирок при инкубации с 14СО полностью ингибировало процесс в пробе циано-бактериального мата из ист Заварзина (рис 4) Это говорит о том, что СО-трофные прокариоты, видимо, населяют анаэробную зону мата и очень чувствительны к Ог В ист «Трещинный» кислород, наоборот, стимулировал процесс почти вдвое, что может означать участие в трансформации СО в этом источнике как анаэробных, так и аэробных прокариот В ист. «Бурлящий» присутствие 02 практически не повлияло на СО трансформацию (рис 4)

ист. «Оранжевый нейтральный» (70°С)

100% 14со2

ист. Заварзина (60°С)

14СО2

95.0%

"С-ЛЖК 14С-клеточная 4.8% масса

0.1%

ист. «Трещинный» (80°С)

,4СО2

99.2%

ист. «Бурлящий» (90°С)

14СОз 90.4%

14С-ЛЖК |4С-ЛЖК '"с-РОВ 14С-клеточная

0.8% 0.8% 8.3% масса

0.5%

Рис. 3. Распределение метки в продуктах трансформации 14СО микробными сообществами горячих источников кальдеры Узон (Камчатка). Время инкубации 6 часов.

Наши результаты указывают на то, что в горячих источниках Камчатки активно функционируют как анаэробные, так и аэробные прокариоты, использующие СО как источник энергии. Надо отметить, что пока не выделен ни один гипертермофильный аэроб, способный расти на СО. Таким образом, полученные результаты могут помочь в поиске новых СО-трофных прокариот.

Заварзин-60°С Оранжевый Н-70°С Трещинный-80°С Бурлящий-90°С

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1

скорость, ммоль/л/сут В инкубация в условиях in situ □ инкубация с воздухом

Рис. 4. Потенциальная скорость трансформации СО микробными сообществами осадков горячих источников в условиях in situ (анаэробные условия) и в присутствии воздуха.

Определение численности анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот.

Результаты определения численности анаэробных СО-трофов в источниках кальдеры Узон и Долины гейзеров приведены в таблице 2

Таблица 2. Численность анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников

Название нли № источника Численность, клетки/мл Доминирующие

ГС формы прокариот в последнем разведении, где наблюдали потребление СО

инкубации* Анаэробные СО-трофные Анаэробные органотрофные Общая

прокариоты прокариоты

ист Заварзина 60 105 10® 2 3*10® короткие палочки

«Трещинный» 82 10 10® 0 7*10® длинные тонкие нити, кокки

«Бурлящий» 90 106 ю8 14*10® кокки

1525 70 10б н о но короткие палочки

1534 90 10* 107 но кокки

1507 82 106 н о н о овальчики, кокки

1260 52 10 но но н о

1312 70 ю5 107 н о палочки

1315 70 ю4 10б н о палочки

* - инкубировали при рН среды 6 8-7 О, н о - не определяли

Как видно из таблицы 2, численность карбоксидотрофных анаэробных термофилов может достигать 106 кл/мл осадка

Численность органотрофных анаэробов в этих же источниках составила 10б-108 кл/мл осадка Прямой подсчет микроорганизмов в источниках Заварзина,

t

«Трещинный» и «Бурлящий» показал присутствие 2 3* 10s, 0 7* 10s и 1 4* 10s кл/мл осадка, соответственно Таким образом, доля анаэробных СО-окисляющих прокариот составляет около 1% от общей численности микроорганизмов(табл 2)

Филогенетический анализ микробных популяций первичных карбоксидотрофных накопительных культур из проб воды и ила, отобранных из источника «Бурлящий» (90°С/рН 7 0), проводили ПЦР-ДГГЭ методом Было показано присутствие в источнике представителей термофильных архей и бактерий, родственных Thermococcus sp АМ4 (100% сходства фрагментов 16S рДНК) и Meiothermus silvanus (97% сходства), соответственно

Thermococcus sp АМ4 - единственный представитель этого рода, способный расти на СО с образованием Н2 и С02 (Sokolova et al, 2004а) Возможное присутствие его аналога в источнике «Бурлящий» подтверждается еще и тем, что в описанных экспериментах по подсчету численности СО-окисляющих анаэробов в источнике «Бурлящий» в последних разведениях, где шло потребление СО, доминирующими формами были кокки (табл 2) Таким образом, можно предположить, что представители рода Thermococcus, обладающие способностью к гидрогеногенному окислениюь СО, , являются основными СО-окисляющими агентами в 90-градусном источнике

Для представителей бактериального рода Meiothermus, как и для всего порядка Thermales, ранее не была отмечена способность использовать окись углерода в своем метаболизме (Tenreiro et al, 1995, Ramy, da Costa, 2001, Miroshnichenko et al, 2003a, 20036) Бактериальную ДНК из накопительной культуры, инкубированной без СО в газовой фазе, не удалось выделить Возможно, это говорит о том, что Meiothermus присутствует в источнике в минорных количествах и его численность возросла в присутствии СО В свою очередь, этот результат также подтверждает предположение, что в трансформации СО в высокотемпературных источниках могут участвовать факультативно-анаэробные прокариоты

Выделение анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот. Из СО-трофных накопительных культур с устойчивым ростом, полученных из различных горячих источников Камчатки, было выделено 7 штаммов бактерий и 1 штамм археи

Carboxydocella sporoproducens sp. nov.

(Bacteria>Firmicutes>Clostridia>Clostridiales>Syntrophomonadaceae> Carboxydocella)

Выделена из горячего источника вулканического озера Карымское, в районе вулкана Карымский Температура и pH в источнике - 60°С/6 6, соответственно

Клетки представляют собой спорообразующие прямые палочки без жгутиков, 1-6 мкм длиной и 0 5 мкм шириной (рис 5) Клеточная стенка грамположительного типа Образование спор - терминальное (рис 6Ь,с)

Облигатный анаэроб. Термофил, растущий при 50-72°С, с оптимумом при 60°С. Нейтрофил, растущий в пределах 6.2-8.0, с оптимумом при 6.8. Растет хемолитоавтотрофно в атмосфере 100% СО на минеральной среде с образованием равных количеств Н2 и С02 (рис. 6). Время удвоения в атмосфере СО в оптимальных условиях (о.у.) - 1 час.

2,8 30

10 20 30 время, ч

Рис. 5. Электронные микрофотографии Carboxydocella sporoproducens KarT ( а, b -негативное контрастирование, с -ультратонкий срез). Шкала, 0.5 мкм.

Рис. 6. Рост, потребление СО и образование водорода С. sporoproducens Кагт (о.у.). жидкой культуры.

Растет органотрофно в атмосфере N2 на дрожжевом экстракте, сахарозе или пирувате. Не растет на пептоне, крахмале, глюкозе, арабинозе, фруктозе, ксилозе, галактозе, лактозе, мальтозе, глицерине, цитрате, сукцинате, ацетате, формиате, этаноле, метаноле или на смеси Н2:С02 (4:1). Не восстанавливает SO42", S2O32", SO32", S°, N03" или Fe3+ в присутствии различных органических и неорганических доноров электронов. S032", S° и N03" ингибируют рост.

Содержание Г+Ц пар в ДНК составляет 49.5±1 мол%.

Ближайшим родственником является Carboxydocella thermoautotrophica 41т (Sokolova et al., 2002)co сходством последовательностей генов 16S рРНК 99.5% (рис. 7). ДНК-ДНК гибридизация с С. thermoautotrophica 41г составила 45%. Типовой штамм Кагт депонирован в российской и немецкой коллекциях микроорганизмов (=DSMZ 16521Т=ВКМ В-2358т).

Carboxydocella spp., штаммы 1244, 930,961 и 1503

Штаммы 1244, 930 и 961 выделены из горячих источников кальдеры Узон. Температура воды в источниках была 57°С, 60°С, 58°С, соответственно, значения рН близки к нейтральным. Штамм 1503 выделен из источника в районе в. Мутновский (75°С/6.5).

СагЬохуйосеПа ер. Ш4(Е11260048) СагЬпхчЛпсеИа чп. <Л() ГИ12ЙП049Г СагЬпхуйпсеНа чп 961 ГЕИ260П5П>

СагЬохус1осе1!а_1ИетоаШо1горЬ1са Г СагЬохуЛосеПа ¡рогоргоЛисею (АУ673988) 1 СагЬрхус1псе11дър 1503 (ЕШ60047)

'СагЪохуаосеПа/етгеаиса 019 | ТегтоапаегоЪас1ег_е1Ыпо1кт ТегтоапаетоЬаШг_пгаЛгаги г

__Г СаМапаегоЬас1ег_шЫеггапеш_расШси$

\_Caldanaerobacter зиЫеггапеш шЫеггатив СаШпаегоЬаМег 5иЬ Шсоп^епт Мооге11а_1кегтоасе!1са —Г Ое$и1/о1отаси1ит_т&фсат

ВехшШотасиЫт сагЬохуЖуогапя

8рого1отаси1ит Иу&охубеюснсит ТИегттсо1а_сагЪохус1орШа

_....... ........

ТИегттсокг{етасеиса

-Г" Ое$иШоЬасТегтт_ка{тете

_ Ое$иЩХоЪас1епит <1ека1о%епапв

~ АпаегоЪгапса ЬогТкозЪп \ ТЪегтоууМгорЬа ¡1ро1}11Са \ &п1горпо5рога_БгуаМ11

_5уп1горкотопаз_у/оЩ1

_ие!и1/о1отаси1ит_шегтоЬепго1сит

—Г ТЫгтоЫ1поЪас1ег_сагЪо'хус11Уогат

_ТкегтоЫИоЬаМегггпгеаисет

_ ТИегтаегоЬас1ег тапапетгя

-) Ткегтозтт сагЪохусЬуогат

_ОепйгозрогоЬаМеглиегасо1и$

__Аттотуех (¡еёети

_| СагЪохуйоШегтиз{етгескюепв М 'СагЪохуШкегтиь 5и/егор/и//м'(ЕГ542810) \СагЬохуао1пегти5^кус1го£епо]огтат

-\2Diciyoglomus ер. 1512 _01сгуоя1оти8_тегторЫит

~ Е$сЫпскш_соЬ КиЬгтгахее1сШпо5из Шюс1озр1гшит_гиЬгит Ююйорьеийотопаз ра1ш1пз

Рис. 7. Филогенетическое положение новых анаэробных термофильных гидрогенных СО-трофных бактерий (внешний репер - МеЛапоЪасЫгшт /оггтсгсит)

Все выделенные штаммы представлены палочками, размерами 0 5x2-3 мкм Штаммы 1244 и 961 способны образовывать споры Растут при оптимальной температуре 60-65°С и нейтральном значении рН

Все штаммы растут хемолитоавтотрофно на 100% СО в газовой фазе, образуя равные количества Нг и СОг, или хемоорганогетеротрофно на дрожжевом экстракте и глюкозе Не растут на смеси Н2 С02 (4 1, об %), на пептоне, казеине, сукцинате, оксалате, цитрате, малате, лактате, пирувате, ацетате и фумарате

Ближайшим родственником по анализу последовательности генов 16Б рРНК является С ¿ИегтаиШгорЫса 41т (8око1оуа ег а1, 2002) (99 5% сходства с генами штаммов 1244,930 и 961 и 97 5% сходства с геном штамма 1503) (рис 7)

Таким образом, было показано широкое распространение представителей рода СагЬохус1осе11а в различных гидротермальных системах Камчатки. Все представители рода СагЪохуйосеНа, включая выделенную ранее из горячего источника Долины гейзеров С. IкегтаиШгорЫса (БокоЬуа е1: а1., 2002), являются строгими анаэробами, умеренными термофилами и нейтрофилами. Способны расти хемолитоавтотрофно на 100% оксида углерода в газовой фазе, образуя равные количества водорода и углекислого газа, согласно реакции СО + Н?0 —* С02 + Н2. Представлены короткими прямыми подвижными палочками с грамположительным типом клеточной стенки, некоторые способны образовывать споры. Эта способность показана для представителей гидрогеногенных карбоксидотрофов впервые.

'СагЬохучШИегтиь вЫегоркИиъ' ер. ноу.

(Вас1епа>Ри'ткШез>С1озМсИа>С1озигШа1ез>Рер1ососсасеае> СагЬохусклЬегтт)

Выделен из горячего источника Долины гейзеров (72°С/рН 8.4). Клетки представляют палочки 0.4 мкм шириной и 1-2 мкм длиной (рис. 8). Жгутики отсутствуют. Термофил. Растет в диапазоне температур от 52 до 70°С, с оптимумом при 65°С. Нейтрофил, также может расти в умеренно щелочных условиях.

Растет только в присутствии Ре(Ш) или АХДС, восстанавливая их до Ре(П) или АХДСН2, соответственно. Хемоорганотрофно растет на глюкозе, ксилозе, лактате или дрожжевом экстракте в атмосфере Ы2, или хемолитотрофно на 100% СО. Нуждается в дрожжевом экстракте (0,2 г/л). Во время роста на СО в присутствии Ре(Ш) или АХДС образует Н2, С02 и БеЩ) или АХДСН2, соответственно.

Рис. 8. Электронная микрофотография 'СагЬохускэ^егтт згс/егоркПиз' 1315х(негативное контрастирование). Шкала, 1 мкм.

Не растет на смеси Н2:С02 (4:1), пептоне, сахарозе, галактозе, фруктозе, мальтозе, формиате, ацетате, пируваге, сукцинате, оксалате, цитрате, малате, фумарате, глицерине, этаноле или метаноле, как в присутствии, так и в отсутствии

Ре(Ш) или АХДС Восстанавливает до 30 мМ Ре(Ш), образуя магнетит Не восстанавливает 8042\ 520з2", БОз2", Б0, ЫОз' или фумарат Содержание Г+Ц пар в ДНК 41 5±0 5 мол%

Ближайшим родственником по анализу последовательности гена 16Б рРНК является СагЬохуйо1кегти5 hydrogenoformans (97 5%) (БуеШсЬпу е1 а1, 1991) (рис 7). По филогенетическим и фенотипическим отличиям был отнесен к новому виду 'Carboxydothermus з^егоркйиъ'

Типовой штамм 1315т (НЭБМг 21278т, ВКМ В-2474т, ВКПМ В-9905т)

Род Carboxydothermus к началу исследования состоял из двух видов С hydrogenoformans (БуеШсЬпу е1 а1, 1991) и С /егп^исет (Б1оЬоёкт е! а1, 1997, 2006) Основные отличия нового изолята от остальных видов приведены в таблице 3 'С slderopЫus' способен расти на СО с образованием Н2 и С02, восстанавливая Ре(Ш) до Ре(П) С hydrogenoformans не способен к железоредукции при росте на СО (БуеЙкЬпу е1 а1, 1991, НепБ^а, 81атБ, 2004), однако восстанавливает Ре(Ш) при росте на Н2 (табл 3) С /етгейисепз, напротив, растет на СО, восстанавливая Ре(Ш), однако без образования Н2 (БЬЬоёкт е1 а1, 2006) Новый вид С з^егорЫш также не способен восстанавливать иные чем Ре(Ш) неорганические акцепторы электронов, в отличие от двух других видов (НепБ&а, 31ат5,2004) (табл 3)

Таблица 3. Способность представителей рода Carboxydoíhermus восстанавливать различные акцепторы электронов при росте на неорганических и органических субстратах

Условия С Ьу<1гоцепо/огтап5 С /етгейисет 'С. $1йегорУп1т'

Донор электронов - СО

Акцептор электронов Ре(Ш) АХДС +** +* +*

Донор электронов - Н2

Акцептор электронов Ре(Ш) АХДС + + + + -

Донор электронов - лактат

сульфат А сульфит Акцептор 1 , тиосульфат электронов г сера + + + + + + -

нитрат фумарат + + +

Ссылки Не1Ыга, 51аш8,2004, БЬЬоакт й а1,2006 НепвИа, Б1ат8, 2004, 81оЬо<йап й а!, 2006 данная работа

* - рост без образования Н2, ** - рост с образованием Н2

'Dictyoglomus carboxydivorans' sp. nov. (штамм 1512)

(Bacteria>Dictyoglomi>Dictyoglomi>Dictyoglomales>Dictyoglomaceae> Dictyoglomus)

Выделен из источника Трещинный (78°С/6.5) (Восточное термальное поле, кальдера Узон).

Представляет собой тонкие длинные нити толщиной 0.3 мкм, длиной до 15 мкм (рис. 9). Экстремальный термофил. Растет при температурах от 65 до 85°С, с оптимумом при 15° С. Нейтрофил. Анаэроб. Клеточная стенка

грамотрицательного типа.

Рис. 9. Электронная микрофотография 'Dictyoglomus carboxydivorans' 1512 (негативное контрастирование). Шкала, 1 мкм.

Хемолитотрофно растет при 5% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и С02. Выдерживает также 15% СО в газовой фазе, при 45% уже не растет. Не растет на смеси Н2:С02 (4:1). Органотрофно растет на пирувате. Нуждается в дрожжевом экстракте (0.2 г/л). Время генерации при росте на 5% СО в оптимальных условиях - 60 часов.

Инкубация природных проб в атмосфере с низким содержанием СО позволила выделить гидрогеногенный карбоксидотрофный микроорганизм, относящийся к новому для СО-трофов филогенетическому' типу Dictyoglomi. По анализу последовательности гена 16S рРНК отнесен к роду Dictyoglomus (рис. 7), с ближайшим родственником D. thermophilum Н-6-12г (98.6% сходства) (Saiki et al., 1985). На основании филогенетических и фенотипических отличий отнесен к новому виду D. carboxydivorans' 1512т.

Первый представитель рода Dictyoglomus, D. thermophilum Н-6-12т, был описан более 20 лет назад (Saiki et al., 1985). Однако за прошедший период времени в литературе появилось описание только одного нового вида, D. turgidus' (Светличный, Светличная, 1988), который был выделен из горячего источника кальдеры Узон. Совсем недавно из этого же термального региона Камчатки были выделены в чистые культуры еще два новых штамма рода Dictyoglomus (Kublanov et al., submitted). При этом все перечисленные организмы росли только за счет энергии окисления органических субстратов. Новый вид 'D.

сагЪохусИмогат таким образом, является первым представителем филогенетического типа Dictyoglomi, способным к литотрофному росту.

'Thermofilum carboxydotrophus' sp. nov. (штамм 1505)

(Archaea>Crenarchaeota>Thermoprotei>Thermoproteales>Thermofilaceae> Thermofilum)

Выделен из горячего источника в районе вулкана Мутновский (84°С/6.5). Клетки представляют собой очень тонкие длинные нити толщиной 0.2 мкм и длиной до 15-20 мкм (рис. 10). Гипертермофил. Температурный оптимум роста 90°С, минимум 80°С. Нейтрофил.

Хемолитотрофно растет на 45% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и С02. Облигатно зависит от присутствия дрожжевого экстракта и цистеина (0.2 г/л). Время генерации в данных условиях при температуре инкубации 92°С - 30 часов. Не растет при 15% СО в газовой фазе, при 100% СО рост значительно замедляется. Органотрофно растет на дрожжевом экстракте. Не растет на смеси Н2:С02 (4:1), лактате или пептоне.

Ближайший родственник по анализу последовательности гена 16S рРНК -Thermofilum pendens Hrk-5T (97.8%) (рис. 11) (Zillig et al., 1983). По филогенетическим и фенотипическим отличиям новый изолят отнесен к новому

На момент начала работы среди архей был известен только один представитель, способный окислять СО в реакции с водой с образованием Н2 и С02. Это представитель типа Еигуагскаеога, ТЪегтососым эр. АМ4, выделенный

Рис. 10. Электронная микрофотография 'Thermofilum carboxydotrophus '1505 (негативное контрастирование). Шкала, 1 мкм.

виду Т. carboxydotrophus' 1505т.

из глубоководной гидротермы и растущий при 100% СО в газовой фазе (Sokolova et al, 2004а) В работе, инкубируя накопительную культуру при пониженном содержании СО в газовой фазе, удалось выделить еще одну гидрогеногенную карбоксидотрофную архею, обладающую наиболее высоким температурным оптимумом роста среди СО-трофных прокариот - 92°С Более того, новый изолят оказался представителем другого филогенетического типа - Crenarchaeota, и лишь третьим видом рода Thermofilum (Zillig et al, 1983; Burggraf et al, 1997)

Thermococcus_gammatolerans Thermococcusjsp _AM4 Thermococcusjceier MethanöbacteriumJormieicum

-Methanopyru3_kandlen

-Thermoplasmajicidophüum

- ArchaeoglobusJulgidus

-Meihanosarana_barkert

......——Halobactenum salinarum

p-

-Melhanotmcrobaimjnobile

- Methanococcus_vanmelii -Sulfolobus_actdocaldanus

- Desulfitrococcusjmbüis

-Thermoproteusjenax

r- Thermofilum_pendens 'Thermofilum carboxydotrophus'

- Escherichia coli

Euiyarchaeota

Crenarchaeota

Рисунок 11. Филогенетическое положение новой гипертермофильной археи 'Thermofilum carboxydotrophus' 1505

Также оказалось, что последовательность гена 16S рРНК выделенного изолята полностью совпала с последовательностями ДНК-клонов, полученных из различных проб горячих источников Йеллоустонского Национального Парка (США) (Barns et al, 1994, Reysenbach et al, 2000, Korf et al, неопубликованные данные) Это говорит, во-первых, о широком распространении этого вида в гидротермальных местах обитания, отнесенных друг от друга на тысячи километров и разделенных океаном, во-вторых, можно предположить, что микроорганизмы, обитающие в горячих источниках Йеллоустонского Национального Парка, также способны расти на СО с образованием Н2 и С02

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Используя разнообразие горячих источников Камчатки, мы предприняли комплексное исследование микробной СО трансформации Для детального анализа были выбраны три нейтральных источника с температурами, соответствующими оптимумам роста умерено термофильных (6 0°С), экстремально (70-80°С) и гипертермофильных (90°С) прокариот Выбранные значения рН (6 0-7 0) соответствовали оптимумам развития большинства выделенных на данный момент карбоксидотрофных термофилов Были исследованы источники, в которых присутствовали циано-бактериальные маты (ист Заварзина), и источники, где не было обрастаний, осуществляющих фотосинтетическую продукцию органического вещества (источники «Оранжевый нейтральный», «Трещинный» и «Бурлящий») Проведенные исследования показали присутствие во всех источниках окиси углерода

Хроматографические и радиоизотопные исследования показали, что в горячих источниках происходит активная трансформация СО микробными сообществами Основным продуктом микробной СО трансформации является С02 Незначительное образование других продуктов трансформации является прямым или косвенным указанием на то, что за трансформацию СО в горячих источниках кальдеры Узон ответственны отличные от метаногенов и ацетогенов микроорганизмы Как было показано, в источниках присутствуют, наряду с анаэробными, и аэробные прокариоты, окисляющие СО

При помощи культуральных методов были показаны границы СО трансформации в горячих источниках Камчатки Прокариоты, способные активно метаболизировать СО, обнаруживаются в местах обитания с диапазоном температур и рН от 50 до 94°С и от 5 0 до 8 5, соответственно Было показано, что численность анаэробных карбоксидотрофных прокариот в источниках может достигать значительных величин - до 10б клеток/мл, что составляет около 1% от всей численности микроорганизмов в сообществах этих источников В источнике «Трещинный» (80°С), где была показана самая высокая микробная активность СО трансформации, не было отмечено значительного присутствия анаэробных СО-трофов, способных расти на минеральной среде со 100% СО в газовой фазе Однако из этого источника удалось впоследствии выделить чистую культуру СО-трофного микроорганизма Новый вид 'В1с1уо§1отш сагЪохуйхчогат' был способен хемолитотрофно расти на СО с образованием равных количеств Н2 и С02, но при концентрациях СО в газовой фазе, не превышающих 15% Таким образом, истинная численность микроорганизмов, окисляющие СО, может оказаться выше за счет видов, чувствительных к его высоким концентрациям

В другом подробно исследованном источнике Заварзина (60°С) удалось показать активный процесс микробной трансформации СО, высокую численность анаэробных СО-трофных прокариот (10 клеток/мл осадка), а также выделить термофильную бактерию, осуществляющую этот процесс Ей оказался представитель рода СагЪохуйосеИа (штамм 1244), растущий

хемолитоавтотрофно в присутствии 100% СО в газовой фазе, с образованием равных количеств Н2 и С02 На момент начала работы этот род состоял из одного представителя, С thermautotrophica (Sokolova et al, 2002), выделенного из горячего источника Долины гейзеров В ходе работы было показано широкое распространение фенотипически сходных представителей рода Carboxydocella во всех исследованных гидротермальных системах Камчатки

Из горячего источника Долины гейзеров выделен новый вид гидрогеногенной карбоксидотрофной бактерии р Carboxydothermus, 'С siderophilus', способный к литотрофной железоредукции

В самом горячем источнике «Бурлящий» (90°С), где также была показана активная микробная трансформации СО и высокая численность анаэробных СО-трофов, с помощью молекулярных методов удалось выявить возможных агентов трансформации СО - архей рода Thermococcus и бактерий рода Meiothermus Представители рода Thermococcus широко распространены в морских гидротермах, однако известны два вида, обитающие в наземных пресных источниках Новой Зеландии (Klages, Morgan, 1994, González et al, 1999)

Другим организмом, способным проводить процесс трансформации СО при температуре выше 90° С, оказался новый архейный вид 'Thermofilum carboxydotrophusтакже образующий только Н2 и С02 при росте на СО Данный изолят обладает наиболее высоким температурным оптимумом роста для карбоксидотрофных прокариот (92°С) и является первым представителем типа Crenarchaeota, способным расти за счет окисления СО

Таким образом, несмотря на низкие концентрации растворенной в горячих источниках СО, результаты свидетельствуют о наличии активной популяции СО-трофных прокариот и активной трансформации СО в гидротермах Камчатки В ходе работы было показано широкое распространение в гидротермах Камчатки, а также фенотипическое и филогенетическое разнообразие группы гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, которая может играть важную, если не основную роль в трансформации СО

выводы

1 Установлено, что в горячих источниках кальдеры Узон при температуре 60-90°С и нейтральных значениях pH идет активное окисление СО до С02

2 Анаэробные карбоксидотрофы присутствуют в источниках Камчатки с температурами 50-94°С и pH 5 0-8 5, где их численность составляет до 1% от общей численности микроорганизмов

3 Снижение концентрации СО в газовой фазе при культивировании увеличивает разнообразие выделяемых термофильных прокариот, способных к его гидрогеногенному окислению.

4 Обнаружено высокое филогенетическое разнообразие гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в наземных горячих источниках Камчатки среди архей - представители филогенетических типов Crenarchaeota и Euryarchaeota, среди бактерий - представители типов Firmicutes, Dictyoglomi и ThermuS'Deinococcus

5 Выделены новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты Carboxydocella sporoproducens sp nov - первый спорообразующий представитель этой группы, 'Carboxydothermus siderophilus' sp nov -облигатно зависящий от Fe(III), 'Dictyoglomus carboxydivorans' sp nov -первый литотрофньш и карбоксидотрофный представитель типа Dictyoglomi, 'Thermofilum carboxydotrophus' sp nov - первый карбоксидотрофный представитель типа Crenarchaeota

6 Показано широкое распространение представителей гидрогеногенного карбоксидотрофного рода Carboxydocella в источниках Камчатки с температурами 50-70°С и значениях pH, близких к нейтральному

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи

1 Слепова Т В. Русанов И И, Соколова Т Г, Бонч-Осмоловская Е А и Пименов Н В (2007) Радиоиозотопное измерение интенсивности трансформации СО анаэробными термофильными прокариотами Микробиология 76(5), 594-601

2 Slepova Т V. Sokolova Т G, Lysenko А М, Tourova Т Р, Kolganova Т V, Kamzolkma О V , Karpov G A and Bonch-Osmolovskaya Е А (2006) Carboxydocella sporoproducens sp nov, a novel anaerobic CO-utilizing/Hrproducmg thermophilic bacterium from a Kamchatka hot spring Int J Syst Evol Microbiol 56, 797-800

3 Slepova T V . Sokolova T G, Kolganova T V , Tourova T P and Bonch-Osmolovskaya E A Carboxydothermus siderophilus sp nov, a novel thermophilic hydrogenogeruc carboxydotrophic dissimilatory Fe(III)-reducmg bacterium from Kamchatka hot spring Int J Syst Evol Microbiol, in press

Тезисы конференций

1 Слепова TВ. Колганова ТВ и Соколова ТГ Распространение анаэробных термофильных СО-окисдякяцих/Нг-образующих микроорганизмов в наземных горячих источниках Долины Гейзеров и Кальдеры Узон, Камчатка, Россия Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии", Ноябрь 2005, Москва, Россия

2 Slepova Т V. Subbotma IV, Chernyh N А, Tourova Т Р , Kostnkina N А, Sokolova Т G Carboxydocella sporoforma sp nov, a novel anaerobic, thermophilic, CO-utilizing hydrogenogemc bacterium from a Kamchatka hot spring International conference "Extremophiles", September 2004, Baltimore, USA Abstract 187

3 Slepova T V. Sokolova T G, Kolganova T V and Bonch-Osmolovskaya E A Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogemc microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser Valley and Uzon Caldera, Kamchatka, Russia International workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", August 2005, Petropavlovsk-Kamchatky, Russia

4 Slepova T. Sokolova T and Kolganova T Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogemc microorganisms from terrestrial hot spnngs of Geyser valley and Uzon caldera, Kamchatka, Russia International conference "Thermophiles", September 2005, Cold Coast, Australia Abstract P45

5 Slepova T V. Sokolova T G, Kolganova T V , Pimenov N V, Rusanov II and Bonch-Osmolovskaya E.A Hydrogenogemc CO-oxidizmg prokaryotes m microbial communities of Kamchatka hot environments 11th International Symposium on Microbial Ecology, August 2006, Vienna, Austria Abstract 374

6 Slepova T V . Sokolova T G, Kolganova T V, Tourova T P , Kostnkina N A, Bonch-Osmolovskaya EA A novel thermophilic hydrogenogemc СО-oxidizing Fe(III)-reducing bactenum International conference "Extremophiles", September 2006, Brest, France Abstract P032

7 Slepova T. Sokolova T , Rusanov I, Pimenov N, Lebedinsky A, Kolganova T , Kostnkina N, Bonch-Osmolovskaya E CO transformation by anaerobic microbial communities of Kamchatka hot spnngs International conference "Thermophiles", September 2007, Bergen, Norway Abstract L9

8 Pimenov NV, T V Slepova, T G Sokolova, I I Rusanov, and E A Bonch-Osmolovskaya Microbial activity in Uzon Caldera (Kamchatka) hot spnngs 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry, November 2007, Taupo, New Zealand Abstract G-9

Подписано в печать 10 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 254 Тираж 120экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Слепова, Татьяна Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Разнообразие и распространение гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

Глава 2. СО-дегидрогеназа - ключевой фермент окисления СО

2.1. Окисление СО гидрогеногенными карбоксидотрофными прокариотами

Глава 3. Трансформация СО в природных местах обитания термофильных прокариот

3.1. Природные места обитания термофильных прокариот

3.2. Источники СО в гидротермах

3.3. Использование СО микроорганизмами, обитающими в горячих источниках

Глава 4. Камчатка - полигон исследования трансформации СО термофильными микробными сообществами

Глава 5. Использование термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Места отбора проб

1.2. Отбор проб

1.3. Объекты исследований

1.4. Определение концентрации растворенного в источнике СО

1.5. Исследование условий трансформации СО культуральными методами

1.6. Влияние концентрации СО на скорость его анаэробной трансформации микробными сообществами горячих источников

1.7. Оценка потенциальной активности и определение основных продуктов анаэробной термофильной трансформации СО радиоизотопными методами

1.7.1. Постановка радиоизотопных опытов

1.7.2. Определение радиоактивности продуктов трансформации СО

1.8. Получение и филогенетический анализ первичных накопительных культур анаэробных карбоксидотрофных прокариот

1.9. Культивирование накопительных и чистых культур анаэробных термофильных СО-трофных прокариот

1.9.1. Приготовление сред для термофильных анаэробов

1.9.2. Субстраты и акцепторы роста

1.9.3. Методика приготовления твердых сред

1.10. Подсчет численности термофильных прокариот в микробных сообществах горячих источников

1.11. Выделение чистых культур

1.12. Исследование морфологии и тонкого строения клеток

1.12.1. Световая микроскопия

1.12.2. Трансмиссионная электронная микроскопия

1.13. Характеристики микробного роста

1.13.1. Прямой подсчет клеток

1.13.2. Определение термостабильности спор

1.13.3. Определение продуктов метаболизма

1.14. Проверка устойчивости прокариот к антибиотикам

1.15. Массовое культивирование

1.16. Геносистематические выводы

1.16.1. Выделение ДНК

1.16.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1.16.3. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ)

1.16.4. Секвенирование ПЦР-фрагментов

1.16.5. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей

1.16.6. Определение суммарного содержания гуанина и цитозина в ДНК

1.16.7. ДНК-ДНК гибридизация

Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1. Определение концентрации растворенного в источнике СО

2.2. Трансформация СО термофильными анаэробными микробными сообществами горячих источников

2.2.1. Исследование физико-химических параметров горячих источников, в которых присутствуют СО-трофные прокариоты

2.2.2. Влияние концентрации СО на скорость его анаэробной трансформации микробными сообществами горячих источников

2.2.3. Исследование трансформации СО радиоизотопными методами

2.3. Определение численности анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников

2.4. Филогенетический анализ микробных популяций первичных карбоксидотрофных накопительных культур методом ПЦР-ДГГЭ

2.5. Выделение и описание новых анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты в горячих источниках Камчатки"

Природными местами обитания термофильных прокариот являются горячие источники и почвы районов современной вулканической активности или рифтовой зоны. Разнообразие условий в гидротермальных местах обитания (различных значений рН, температуры, окислительно-восстановительного потенциала, концентраций растворенных веществ, газового и минерального состава) позволяет развиваться генетически и метаболически разнообразным прокариотам. С вулканическими эксгаляциями в источники поступают восстановленные соединения, используемыми литотрофными прокариотами в качестве доноров электронов. Анаэробные термофильные литотрофные прокариоты г метанобразующие, ацетогенные, серо-, сульфат-, железо(Ш)- и нитрат-восстанавливающие микроорганизмы - для восстановления различных неорганических акцепторов используют водород (Бонч-Осмоловская и др., 1999; Spear et al., 2005). Однако не только водород может являться субстратом для анаэробных литотрофов. Оксид углерода (СО), являясь постоянным компонентом вулканических газов, также может служить субстратом для анаэробных прокариот.

Известно, что среди термофильных анаэробов СО могут использовать для роста некоторые метаногены, ацетогены, сульфатредуцирующие и железоредуцирующие прокариоты, а также большая группа гидрогеногенных карбоксидотрофов, обнаруженных в различных наземных и морских гидротермах по всему миру. Однако, несмотря на большое разнообразие анаэробных термофилов, способных к хемолитотрофному росту на СО, к началу нашей работы не было известно, идет ли в горячих источниках микробное потребление СО. Не было известно также, микроорганизмы каких физиологических групп участвуют в трансформации СО в анаэробной зоне гидротерм, и какова роль гидрогеногенных СО-трофов в ней.

Вулканические места обитания традиционно ассоциируются с представлением о геологических событиях, происходивших на нашей планете около 4 млрд. лет назад, и поэтому микробные сообщества гидротерм рассматривают как аналоги древнейших биоценозов (Заварзин, 1984; Stetter, 2006). Есть мнение, что первыми организмами были хемолитоавтотрофные анаэробные прокариоты, фиксирующие углерод по ацетил-КоА пути (Martin, Russell, 2003), одним из ключевых ферментов которого является СО-дегидрогеназа. Предполагается, что древние автотрофы использовали в качестве доноров электронов, в основном, СО и Нг (Brock, 1989). Если такой сценарий верен, то использование прокариотами оксида углерода является одним из древнейших метаболических процессов, сохранившихся до наших дней (Ragsdale, 2004; Wachtershauser, 2007). Поэтому исследование группы термофильных СО-трофных прокариот, а также процесса анаэробной трансформации СО микробными сообществами горячих источников представляется очень актуальным.

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование микробной трансформации СО на примере микробных сообществ горячих источников Камчатки и характеристика разнообразия участвующих в ней термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) определение активности и основных продуктов трансформации СО чистыми культурами и микробными сообществами карбоксидотрофных термофильных прокариот;

2) определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников;

3) выявление возможных агентов трансформации СО в микробных сообществах горячих источников при помощи методов молекулярной экологии;

4) выделение и характеристика новых анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые с помощью радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной СО трансформации в термальных местообитаниях. Определены основные продукты микробной трансформации СО. Для количественного разделения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами разработан радиоизотопный метод.

Выделены, частично или полностью охарактеризованы новые термофильные анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты. Выделен новый вид гипертермофильных архей 'Thermofilum carboxydotrophus' sp. nov.; новые виды термофильных бактерий 'Dyctioglomus carboxydivorans' sp. nov., 'Carboxydothermus siderophilus' sp. nov., Carboxydocella sporoproducens sp. nov., а также четыре новых штамма рода Carboxydocella. Показано широкое распространение представителей p. Carboxydocella в горячих источниках Камчатки. Полученные результаты расширяют филогенетические и фенотипические границы группы термофильных анаэробных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.

Создана коллекция новых термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, которая может быть использована в водородной энергетике, очистке сточных вод, а также как потенциальный источник термостабильных ферментов.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Extremophiles 2004", "Thermophiles 2005", "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistiy of thermophiles 2005", "The 11th International Symposium on Microbial Ecology - 2006", "Extremophiles 2006", "Thermophiles 2007", "The 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry - 2007" и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005».

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 11 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 8 тезисах конференций.

Место проведения работы

Основная работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ РАН).

Радиоизотопные исследования проводились в лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов ИНМИ РАН. Секвенирование последовательностей 16S рДНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре Биоинженерии РАН. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и МГУ имени М.В. Ломоносова.

Работа выполнена при поддержке программам Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Физико-химическая биология» и «Происхождение и эволюция биосферы», грантов РФФИ № 04-04-58742, 05-04-49311, 06-04-58748, 06-04-49045, 07-0408504, ФЦНТП «Исследование и разработка приоритетных направлений развития науки и техники».

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. Т.Г. Соколовой за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.

Автор приносит искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ к.б.н. Г.Б. Слободкиной, к.б.н. Н.А. Черных, к.б.н. А.А. Переваловой, к.б.н. С.Н. Гаврилову, к.б.н. И.В. Кубланову за помощь и участие в работе, а также всем сотрудникам и аспирантам лаборатории за содействие и поддержку. Отдельную благодарность автор выражает зав. лаб., д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской и к.б.н. А.В. Лебединскому за практическую помощь, постоянное внимание и ценные советы на всех этапах выполнения работы.

Искренняя благодарность всем коллегам, принимавшим участие в различных этапах работы: д.б.н. Н.В. Пименову, к.б.н. И.И. Русанову, к.б.н. Л.Е. Дулову, к.б.н. A.M. Лысенко, к.б.н. Т.П. Туровой, , к.б.н. Н.А. Кострикиной (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН); к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр Биоинженерии РАН); д.г.-м.н. Карпову Г.А. (Институт вулканологии и сейсмологии ДВО РАН); д.б.н. Камзолкиной О.В. (МГУ им. М.В. Ломоносова).

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Экспериментальные статьи

1. Слепова Т.В. Русанов И.И., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. и Пименов Н.В. (2007) Радиоиозотопное измерение интенсивности трансформации СО анаэробными термофильными прокариотами. Микробиология. 76(5), 594-601.

2. Slepova T.V. Sokolova T.G., Lysenko A.M., Tourova T.P., Kolganova T.V., Kamzolkina O.V., Karpov G.A. and Bonch-Osmolovskaya E.A. (2006) Carboxydocella sporoproducens sp. nov., a novel anaerobic CO-utilizing/H2-producing thermophilic bacterium from a Kamchatka hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 797-800.

3. Slepova T.V. Sokolova T.G., Kolganova T.V., Tourova T.P. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Carboxydothermus siderophilus sp. nov., a novel thermophilic hydrogenogenic carboxydotrophic dissimilatory Fe(III)-reducing bacterium from Kamchatka hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. In press.

Тезисы конференций

1. Слепова T.B., Колганова Т.В. и Соколова Т.Г. Распространение анаэробных термофильных СО-окисляющих/Нг-образующих микроорганизмов в наземных горячих источниках Долины Гейзеров и Кальдеры Узон, Камчатка, Россия. Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии", Ноябрь 2005, Москва, Россия.

2. Slepova T.V. Subbotina I.V., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Sokolova T.G. Carboxydocella sporoforma sp. nov., a novel anaerobic, thermophilic, CO-utilizing hydrogenogenic bacterium from a Kamchatka hot spring. International conference "Extremophiles", September 2004, Baltimore, USA. Abstract 187.

3. Slepova T.V. Sokolova T.G., Kolganova T.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of

Geyser Valley and Uzon Caldera, Kamchatka, Russia. International workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", August 2005, Petropavlovsk-Kamchatky, Russia.

4. Slepova Т. Sokolova T. and Kolganova T. Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser valley and Uzon caldera, Kamchatka, Russia. International conference "Thermophiles", September 2005, Cold Coast, Australia. Abstract P45.

5. Slepova T.V. Sokolova T.G., Kolganova T.V., Pimenov N.V., Rusanov I.I. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Hydrogenogenic СО-oxidizing prokaryotes in microbial communities of Kamchatka hot environments. 11th International Symposium on Microbial Ecology, August 2006, Vienna, Austria. Abstract 374.

6. Slepova T.V. Sokolova T.G., Kolganova T.V., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. A novel thermophilic hydrogenogenic СО-oxidizing Fe(III)-reducing bacterium. International conference "Extremophiles", September 2006, Brest, France. Abstract P032.

7. Slepova Т., Sokolova Т., Rusanov I., Pimenov N., Lebedinsky A., Kolganova Т., Kostrikina N., Bonch-Osmolovskaya E. CO transformation by anaerobic microbial communities of Kamchatka hot springs. International conference "Thermophiles", September 2007, Bergen, Norway. Abstract L9.

8. Pimenov N.V., Т. V. Slepova. T. G. Sokolova, I. I. Rusanov, and E. A. Bonch-Osmolovskaya. Microbial activity in Uzon Caldera (Kamchatka) hot springs. 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry, November 2007, Taupo, New Zealand. Abstract G-9.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Слепова, Татьяна Вячеславовна

120 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в горячих источниках кальдеры Узон при температуре 60-90°С и нейтральных значениях рН идет активное окисление СО до С02.

2. Анаэробные карбоксидотрофы присутствуют в источниках Камчатки с температурами 50-94°С и рН 5.0-8.5, где их численность составляет до 1% от общей численности микроорганизмов.

3. Снижение концентрации СО в газовой фазе при культивировании увеличивает разнообразие выделяемых термофильных прокариот, способных к его гидрогеногенному окислению.

4. Обнаружено высокое филогенетическое разнообразие гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в наземных горячих источниках Камчатки: среди архей

- представители филогенетических типов Crenarchaeota и Euryarchaeota, среди бактерий

- представители типов Firmicutes, Dictyoglomi и Thermus-Deinococcus.

5. Выделены новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты: Carboxydocella sporoproducens sp. nov. - первый спорообразующий представитель этой группы; 'Carboxydothermus siderophilus' sp. nov. - облигатно зависящий от Fe(III); 'Dictyoglomus carboxydivorans' sp. nov. - первый литотрофный и карбоксидотрофный представитель типа Dictyoglomi; 'Thermofilum carboxydotrophus' sp. nov. - первый карбоксидотрофный представитель типа Crenarchaeota.

6. Показано широкое распространение представителей гидрогеногенного карбоксидотрофного рода Carboxydocella в источниках Камчатки с температурами 50-70°С и значениях рН, близких к нейтральному.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Используя разнообразие горячих источников Камчатки, мы предприняли комплексное исследование микробной СО трансформации. Для детального анализа были выбраны три нейтральных источника с температурами, соответствующими оптимумам роста умерено термофильных (60°С), экстремально (70-80°С) и гипертермофильных (90°С) прокариот. Выбранные значения рН (6.0-7.0) соответствовали оптимумам развития большинства выделенных на данный момент карбоксидотрофных термофилов. Были исследованы источники, в которых присутствовали циано-бактериальные маты (ист. Заварзина), и источники, где не было обрастаний, осуществляющих фотосинтетическую продукцию органического вещества (источники «Оранжевый нейтральный», «Трещинный» и «Бурлящий»). Проведенные исследования показали присутствие во всех источниках окиси углерода.

Хроматографические и радиоизотопные исследования показали, что в горячих источниках происходит активная трансформация СО микробными сообществами. Основным продуктом микробной СО трансформации является СОг. Незначительное образование других продуктов трансформации является прямым или косвенным указанием на то, что за трансформацию СО в горячих источниках кальдеры Узон ответственны отличные от метаногенов и ацетогенов микроорганизмы. Как было показано, в источниках присутствуют, наряду с анаэробными, и аэробные прокариоты, окисляющие СО.

При помощи культуральных методов были определены физико-химические условия функционирования СО-трофов в микробных сообществах горячих источников Камчатки. Прокариоты, способные активно метаболизировать СО, обнаруживаются в местах обитания с диапазоном температур и рН от 50 до 94°С и от 5.0 до 8.5, соответственно. Было показано, что численность анаэробных карбоксидотрофных прокариот в источниках может достигать значительных величин - до 106 клеток/мл, что составляет около 1% от всей численности микроорганизмов в сообществах этих источников. В источнике «Трещинный» (80°С), где была показана самая высокая микробная активность СО трансформации, не было отмечено значительного присутствия анаэробных СО-трофов, способных расти на минеральной среде со 100% СО в газовой фазе. Однако из этого источника удалось впоследствии выделить чистую культуру СО-трофного микроорганизма. Новый вид 'Dictyoglomus carboxydivorans' был способен хемолитотрофно расти на СО с образованием равных количеств Н2 и С02, но при концентрациях СО в газовой фазе, не превышающих 15%. Таким образом, истинная численность микроорганизмов, окисляющие СО, может оказаться выше за счет видов, чувствительных к его высоким концентрациям.

В другом подробно исследованном источнике Заварзина (60°С) удалось показать активный процесс микробной трансформации СО, высокую численность анаэробных СО-трофных прокариот (106 клеток/мл осадка), а также выделить термофильную бактерию, осуществляющую этот процесс. Ей оказался представитель рода Carboxydocella (штамм 1244), растущий хемолитоавтотрофно в присутствии 100% СО в газовой фазе, с образованием равных количеств Н2 и С02. На момент начала работы этот род состоял из одного представителя, С. thermautotrophica, выделенного из горячего источника Долины гейзеров. В ходе работы было показано широкое распространение фенотипически сходных представителей рода Carboxydocella в источниках Камчатки с температурами от 50 до 70°С и значениях рН, близких к нейтральному.

Из горячего источника Долины гейзеров выделен новый вид гидрогеногенной карбоксидотрофной бактерии p. Carboxydothermus, 'С. siderophilus', способный к литотрофной железоредукции.

В самом горячем источнике «Бурлящий» (90°С), где также была показана активная микробная трансформации СО и высокая численность анаэробных СО-трофов, с помощью молекулярных методов удалось выявить возможных агентов трансформации СО - архей рода Thermococcus и бактерий рода Meiothermus. Представители рода Thermococcus широко распространены в морских гидротермах, однако известны два вида, обитающие в наземных пресных источниках Новой Зеландии.

Другим организмом, способным проводить процесс трансформации СО при температуре выше 90°С, оказался новый архейный вид 'Thermofilum carboxydotrophus', также образующий только Нг и СОг при росте на СО. Данный изолят обладает наиболее высоким температурным оптимумом роста для карбоксидотрофных прокариот (92°С) и является первым представителем типа Crenarchaeota, способным расти за счет окисления СО.

Таким образом, несмотря на низкие концентрации растворенной в горячих источниках СО, результаты свидетельствуют о наличии активной популяции СО-трофных прокариот и активной трансформации СО в гидротермах Камчатки. В ходе работы было показано широкое распространение в гидротермах Камчатки, а также фенотипическое и филогенетическое разнообразие группы гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, которая может играть важную, если не основную роль в трансформации СО.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Слепова, Татьяна Вячеславовна, Москва

1. Басков Е.А., Суриков С.Н. (1989) Гидротермы Земли. JL: Недра.

2. Беляев С.С., Лауринавичус К.С., Иванов М.В. (1975) Определение интенсивности процесса микробиологического окисления метана с использованием 14СН4. Микробиология, Т. 44(3). С. 542-545.

3. Большаков A.M., Егоров А.В. (1987) Об использовании методики фазово-равновесной дегазации при газометрических исследованиях. Океанология. Т. 27(5). С.861-862.

4. Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М., Карпов Г.А., Старынин Д.А. (1987) Анаэробная деструкция органического вещества в цианобактериальных матах источника Термофильного. Микробиология. Т. 56. С. 1022-1028.

5. Бонч-Осмоловская Е.А., Светличный В.А. (1989) Экстремально термофильные сероредуцирующие архебактерии. Архебактерии. Пущино.

6. Буккель В. (2005) Анаэробный энергетический метаболизм. В кн.: Й. Ленгелер, Г. Дрейвс, Г. Шлегель (ред.), Современная микробиология: Прокариоты. Т. 1. М.: Мир.

7. Гальченко В,Ф. (1994) Сульфатредукция, метанообразование и метаноокисление в различных водоемах оазиса Бангер Хиллс, Антарктида. Микробиология. Т. 63(4). С. 683-698.

8. Дедыш С.Н., Паников Н.С. (1997) Влияние концентрации метана на скорость его бактериального окисления в сфагновом торфе. Микробиология. Т. 66(4). С. 563-568.

9. Заварзин Г.А. (1978) Водородные бактерии и карбоксидобактерии. М.: Наука.

10. Заварзин Г.А. (1984) Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука.

11. Заварзин Г.А., Карпов Г.А., Горленко В.М., Головачева Р.С., Герасименко Л.М., Бонч-Осмоловская Е.А., Орлеанский В.К. (1989) Кальдерные микроорганизмы. М.: Наука.

12. Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. (1992) Влияние соединений серы на рост галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum. Микробиология. Т. 61(5). С. 812817.

13. Короновский Н.В., Якушева А.Ф. (1991) Основы геологии. М.: Высшая школа.

14. Меняйлов И.А., Никитина Л.П., Шапарь В.Н. (1984) Геохимические особенности эксгаляций Большого трещинного Толбачинского извержения. М.: Наука.

15. Милановский Е.Е. (1976) Рифтовые зоны континентов. М.: Недра.

16. Ножевникова А.Н., Юрганов Л.Н. (1979) Цикл атмосферной окиси углерода и использование ее бактериями. В кн.: Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М.: Наука.

17. Пушева М.А., Соколова Т.Г. (1995) Распределение активностей СО-дегидрогеназы при СО-зависимом и пируватзависимом росте анаэробной термофильной карбоксидотрофной бактерии Carboxydothermus hydrogenoformans. Микробиология. Т. 64(5). С. 581-586.

18. Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. (1970) Методы анализа природных проб. М.: Недра.

19. Светличный В.А., Светличная Т.П. (1988) Dictyoglomus turgidus sp. nov. новая экстремально термофильная эубактерия, выделенная из горячих источников Кальдеры вулкана Узон. Микробиология. Т. 57. С. 435-441.

20. Светличный В.А., Соколова Т.Г., Герхард М., Заварзин Г.А. (1990) Новая группа анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий, выделяющих водород. Докл. АН СССР. Т. 314. С. 742-744.

21. Светличный В.А., Соколова Т.Г., Кострикина Н.А., Лысенко A.M. (1994) Carboxydothermus restrictus sp. nov. новая термофильная анаэробная карбоксидотрофная бактерия. Микробиология. Т. 63. С. 523-528.

22. Справочник химика (1964) Б.П. Никольский и др. (ред.), Второе издание, Т. 3, Химическое равновесие и кинетика. М.: Химия.

23. Федотов С.А. (1991) О механизме вулканической деятельности на Камчатке, Курило-Камчатской дуге и в сходных структурах, с. 18-35. В кн.: Действующие вулканы Камчатки. Т.1. М.: Найка.

24. Шарп Д., Госни И., Роули А. (1993) Практикум по органической химии. М.: Мир.

25. Amend J.P., Shock E.L. (2001) Energetic of overall metabolic reactions of thermophilic and hyperthermophilic Archaea and Bacteria. FEMS Microbiol. Rev. V. 25. P. 175-243.

26. Auchtung T.A., Takas-Vesbach C.D., Cavanaugh C.M. (2006) 16S rRNA phylogenetic investigation of the candidate division "Korarchaeota". Appl. Environ. Microbiol. V. 72. P. 5077-5082.

27. Balk M., van Gelder Т., Weelink S.A., Stams A.J.M. (2008) (Per)chlorate reduction by the thermophilic bacterium Moorella perchloratireducens sp. nov., isolated from underground gas storage. Appl. Environ. Microbiol. V. 74. P. 403-409.

28. Barns S.M., Fundyga R.E., Jeffries M.W., Pace N.R. (1994) Remarkable archaeal diversity detected in a Yellowstone National Park hot spring environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 91. P. 1609-1613.

29. Barns S.M., Delwiche C.F., Palmer J.D., Pace N.R. (1996) Perspectives on archaeal diversity, thermophily, and monophyly from environmental rRNA sequences. PNAS USA. V. 93. P. 9188-9193.

30. Bazhenova O.K., Arefiev O.A., Frolov E.B. (1998) Oil of the volcano Uzon caldera, Kamchatka. Organic Geochemistry. V. 29. P. 421-428.

31. Bell J.M., Falconer C., Colby J., Williams E. (1987) CO metabolism by a thermophilic actinomycete, Streptomyces strain G26. J. Gen. Microbiol. V. 133. P. 3445-3456.

32. Bender M., Conrad R. (1992) Kinetics of CH4 oxidation in oxic soils exposed to embient air or high CH4 mixing ratios. FEMS Microbiol. Ecol. V. 101. P. 261-270.

33. Benstead J., King G.M., Williams H.G. (1998) Methanol promotes atmospheric methane oxidation by methanotrophic cultures and soils. Appl. Environ. Microbiol. V. 64. P. 10911098.

34. Birnboim H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic. Acids Res. V. 7(6). P. 1513-1523.

35. Bonjour F., Graber A., Aragno M. (1988) Isolation of aerobic autotroph from geothermal and nongeothermal environments. Microb. Ecol. V. 16. P. 331-338.

36. Brock T.D. (1989) Evolutionary relationships of the autotrophic bacteria, p. 499-512. In H.G. Schlegel, and B. Bowien (eds.), Autotrophic bacteria. Science Tech Publishers, Madison, WI.

37. Champine J.F., Uffen R.I. (1987) Regulation of anaerobic carbon monoxide oxidation activity in Rhodocyclis gelatinosus. FEMS Microbiol. V. 44. P. 307-311.

38. Cole J. R., Chai В., Farris R.J., Wang Q., Kulam S.A., McGarrell D.M., Garrity G.M., Tiedje J.M. (2005) The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. V. 33. Database issue. D294-D296.

39. Conrad R., Meyer O., Seiler W.G. (1981) Role of carboxy do bacteria in consumption of atmospheric carbon monoxide by soil. Appl. Environ. Microbiol. V. 42. P. 211-215.

40. Conrad R., Thauer R.K. (1983) Carbon monoxide production by Methanobacterium thermoautotrophicum. FEMS Microbiol. Lett. V. 20. P. 229-232.

41. Daniels L., Fuchs G., Thauer R.K., Zeikus J.G. (1977) Carbon monoxide oxidation by methanogenic bacteria. J. Bacteriol. V. 132. P. 118-126.

42. Dashekvicz M.P., Uffen R.L. (1979) Identification of a carbon monoxide-metabolizing bacterium as a strain of Rhodopseudomonas gelatinosa (Molisch) van Niel. Int. J. Syst. Bacteriol. V.29. P. 145-148.

43. Davidova M.N., Tarasova N.B., Mukhitova F.K., Karpilova I.U. (1994) Carbon monoxide in metabolism of anaerobic bacteria. Can. J. Microbiol. V. 40. P. 417-425.

44. De Lay J., Cattoir H., Reynaerts A. (1970) The quantities measurements of DNA hybridization from renaturation rates. Eur. Biochem. V. 12. P. 133-142.

45. Diekert G., Thauer R.K. (1978) Carbon monoxide oxidation by Clostridium thermoaceticum and Clostridium formicoaceticum. J. Bacteriol. V. 136. P. 597-606.

46. Diekert G., Hansch M., Conrad R. (1984) Acetate synthesis from 2 CO2 in acetogenic bacteria: is carbon monoxide an intermediate? Arch. Microbiol. V. 138. P. 224-228.

47. Dobbek H., Svetlichny V., Gremer L., Huber R., Meyer O. (2001) Crystal structure of the carbon monoxide dehydrogenase reveals a Ni-4Fe-5S. cluster. Science. V. 293(5533). P. 1281-1285.

48. Dunfield P.F., Conrad R. (2000) Starvation alters the apparent half-saturation constant methane in the type II methanotroph Methylocystis strain LR1. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. P.4136-4138.

49. Felsenstein J. (1981) Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. J. Mol. Evol. V. 17(6). P. 368-376.

50. Felsenstein J. (1989) PHYLIP Phylogenetic Inference Package version 3.2. Cladistics. V. 5. P. 164-166.

51. Fitch W. M., Margoliash E. (1967) Construction of phylogenetic trees. Science. V. 155. P. 279-284.

52. Fitch W. M. (1971) Toward defining the course of evolution: minimum change for a specified tree topology. Systematic Zoology. V. 20. P. 406-416.

53. Fox J.D., He Y., Shelver D., Roberts G.P., Ludden P.W. (1996) Characterization of the region encoding the СО-induced hydrogenase of Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. V. 178. P. 6200-6208.

54. Gadkari D., Schricker K., Acker G., Kroppensetdt R.M., Meyer O. (1990) Streptomyces thermoautotrophicus sp. nov., a thermophilic CO- and H2- oxidizing obligate chemolithotroph. Appl. Environ. Microbiol. V. 56. P. 3727-3734.

55. Gonzalez J.M., Sheckells D., Viebahn M., Krupatkina D., Borges K.M., Robb F.T. (1999) Thermococcus waiotapuensis sp. nov., an extremely thermophilic archaeon isolated from a freshwater hot spring. Arch. Microbiol. V. 172. P. 95-101.

56. Grahame D.A., Gencic S., DeMoll E. (2005) A single operon-encoded form of the acetyl-CoA decarbonylase/synthase multienzyme complex responsible for synthesis and cleavage of acetyl-CoA in Methanosarcina thermophila. Arch. Microbiol. V. 184. P. 32-40.

57. Hardy K.R., King G.M. (2001) Enrichment of high-affinity CO oxidizers in Maine forest soils. Appl. Environ. Microbiol. V. 67. P. 3671-3676.

58. Hellebrand H.J., Schade G.W. (2008) Carbon monoxide from composting due to thermal oxidation of biomass. J. Environ. Qual. V. 37. P. 592-598.

59. Henstra A.M., Stams J.M. (2004) Novel physiological features of Carboxydothermus hydrogenoformans and Thermoterrabacterium ferrireducens. Appl. Environ. Microbiol. V. 70. P. 7236-7240.

60. Henstra A.M. (2006) CO metabolism of Carboxydothermus hydrogenoformans and Archaeoglobus fulgidus. The PhD Thesis Wageningen University, Wageningen, the Netherlands, ISBN: 90-8504-408-1.

61. Henstra A.M., Dijkema C., Stams A.J.M. (2007a) Archaeoglobus fulgidus couples CO oxidation with sulfate reduction and acetogenesis with transient formate accumulation. Environ. Microbiol. V. 9(7). P. 1836-1841.

62. Henstra A.M., Sipma J., Rinzema A., Stams A.J. (2007b) Microbiology of synthesis gas fermentation fro biofuel production. Curr. Opin. Biotechnol. V. 18. P. 200-206.

63. Hochstein M.P., Browne P.R.L. (2000) Surface manifestations of geothermal systems with volcanic heat sources, p. 835-855. In Encyclopedia of volcanoes. Academic Press, London.

64. Hoehler T.M., Bebout В. M., Marais J.D. (2001) The role of microbial mats in the production of reduced gases on the early Earth. Nature. V. 412. P. 324-327.

65. Huber H., Huber G., Stetter K.O. (1985) A modified DAPI fluorescence staining procedure suitable for the visualization of lithotrophic bacteria. Syst. Appl. Microbiol. V. 6. P. 105106.

66. Hugenholtz P., Pitulle C., Hershberger K.L., Pace N.R. (1998) Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring. J. Bacteriol. V. 180. P. 366-376.

67. Jensen A., Finster K. (2006) Isolation and characterization of Sulfurospirillum carboxydovorans sp. nov., a new microaerophilic carbon monoxide oxidizing epsilon Proteobacterium. Antonie van Leeuwenhoek. V. 87. P. 339-353.

68. Jeoung J.H., Dobbek H. (2007) Carbon dioxide activation at the Ni,Fe-cluster of anaerobic carbon monoxide dehydrogenase. Science. V. 318. P. 1461-1464.

69. Jung G.Y., Jung H.O., Kirn J.R., Ahn Y., Park S. (1999a) Isolation and characterization of Rhodopseudomonas palustris P4 which utilizes CO with the production of Нг- Biotechnol. Lett. V.21.P. 525-529.

70. Jung G.Y., Kim J.R., Jung H.O., Park J-Y., Park S. (1999b) A new chemoheterotrophic bacterium catalyzing water-gas shift reaction. Biotechnology Letters. V. 21. P. 869-873.

71. Karnovsky M.J. (1965) A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J. Cell. Biol. V. 27. P. 137A-138A.

72. Karpov G.A., Naboko S.I. (1990) Metal contents of recent thermal waters, mineral precipitates and hydrothermal alteration in active geothermal fields, Kamchatka. J. Geochem. Explor. V. 36. P. 57-71.

73. Kerby R.L., Ludden P.W., Roberts G.P. (1995) Carbon monoxide-dependent growth of Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. V. 177. P. 2241-2244.

74. King G.M., Weber C.F. (2007) Distribution, diversity and ecology of aerobic CO-oxidizing bacteria. Nat. Rev. Microbiol. V. 5. P. 107-118.

75. Kim S.B., Goodfellow M. (2002) Streptomyces thermospinisporus sp. nov., a moderately thermophilic carboxydotrophic streptomycete isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 52. P. 1225-1228.

76. Kimura H., Sugihara M., Kato K., Hanada S. (2006) Selective phylogenetic analysis targeted at 16S rRNA genes of thermophiles and hyperthermophiles in deep-subsurface geothermal environments. Appl. Environ. Microbiol. V. 72. P.21-27.

77. Klages K.U., Morgan H.W. (1994) Characterization of an extremely thermophilic sulfur-metabolizing archaebacterium belonging to the Thermococcales. Arch. Microbiol. V. 152. P. 261-266.

78. Lane D.J. (1991) 16S/23S rRNA sequencing, p. 115-175. In E. Stackebrandt, and M. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Inc., New York, NY.

79. Lilley M.D., de Angelis M.A., Gordon L.I. (1982) CH4, H2, CO and N20 in submarine hydrothermal vent waters. Nature. V. 300. P. 48-49.

80. Lovely D.R., Holmes D.E., Nevin K.P. (2004) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. Adv. Microb. Physiol. V. 49. P. 219-286.

81. Lupton F.S., Conrad R., Zeikus J.G. (1984) CO metabolism of Desulfovibrio vulgaris strain Madison: physiological function in the absence or presence of exogeneous substrates. FEMS Microbiol. Lett. V. 23. P. 263-268.

82. Lyons C.M., Colby J.P., Williams E. (1984) Isolation and characterization and autotrophic metabolism of a moderately thermophilic carboxydobacterium, Pseudomonas thermocarboxydovorans sp. nov. J. Gen. Microbiol. V. 130. P. 1097-1105.

83. Maness P.-C., Weaver P.F. (1994) Production of poly-3-hydroxyalkanoates from CO andby a novel photosynthetic bacterium. Appl. Biochem. Biophys. V. 45/46. P. 395-406.

84. Maness P.-C., Huang J., Smolinski S., Тек V., Vanzin G. (2005) Energy generation from the CO oxidation-hydrogen production pathway in Rhubrivivax gelatinosa. Appl. Environ. Microbiol. V. 71. P. 2870-2874.

85. Marmur J. (1961) A procedure for the isolation DNA from microorganisms. J. Molecular. Biol. V. 3. P. 208-218.

86. Marmur J., Doty P. (1962) Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturizing temperature. J. Molec. Biol. V. 5. P. 109-118.

87. Martin W., Russell M.J. (2003) On the origins of cells: a hypothesis for the evolutionary transitions from abiotic geochemistry to chemoautotrophic prokaryotes, and from prokaryotes to nucleated cells. Phil. Trans. R. Soc. Lond. В. V. 358. P. 59-85.

88. Mathis B.J., Marshall C.W., Milliken C.E., Makkar R.S., Creager S.E., May H.D. (2008) Electricity generation by thermophilic microorganisms from marine sediment. Appl. Microbiol. Biothecnol. V. 78(1). P. 147-155.

89. Meyer O., Frunzke K., Gadkari D., Jakobitz S., Hugendieck I., Kraut M. (1990) Utilization of carbon monoxide by aerobes: recent advances. FEMS Microbiol. Lett. V. 87. P. 253-260.

90. Muyzer G. (1998) Structure, function and dynamics of microbial communities: the molecular biological approach, 306, p. 87-117. In G. R. Carvalho (ed.), Advances in molecular ecology. NATO Science Series.

91. Patel B.K., Morgan H.W., Wiegel J., Daniel R.M. (1987) Isolation of an extremely thermophilic chemoorganotrophic anaerobe similar to Dictyoglomus thermophilum from New Zealand hot springs. Arch. Microbiol. V. 147. P. 21-24.

92. Perler F.B., Kumar S., Kong H. (1996) Thermostable DNA polymerases. V. 48. P. 377-435. In F.M. Richards et al. (ed.), Advances in protein chemistry. Academic Press, London.

93. Pfennig N. (1965) Anreicherungskulturen fur rote und griine Schwefelbakterien. Zbl. Bakt. I. Abt. Orig. Supplementheft, V. 1. P. 179-189.

94. Pimenov N.V., Slepova T.V., Sokolova T.G., Rusanov 1.1., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2007) Microbial activity in Uzon Caldera (Kamchatka) hot springs. 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry, Taupo, New Zealand. Abstract G-9.

95. Ragsdale S.W. (2004) Life with carbon monoxide. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. V. 39. P. 165-195.

96. Rainey F.A., da Costa M.S. (2001) Order II. Thermales ord. nov., p. 403. In D. R. Boone, R. W. Castenholz, and G. M. Garrity (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd ed., V. 1. Springer, New York, NY.

97. Reynolds E. S. (1963) The use of lead citrate at high pH as electron opagae strain in electron microscopy. J. Cell. Biol. V. 17. P. 208.

98. Reysenbach A.L., Ehringer M., Hershberger K. (2000) Microbial diversity at 83 degrees С in Calcite springs, Yellowstone National Park: another environment where the Aquificalesand 'Korarchaeota'coexist. Extremophiles. V. 4. P. 61-67.

99. Ricchetti M., Buc H. (1993) E. coli DNA polymerase I as a reverse transcriptase. EMBO J. V. 12(2). P. 387-396.

100. Rother M., Oelgeschlager E., Metcalf W.W. (2007) Genetic and proteomic analyses of CO utilization by Methanosarcina acetivorans. Arch. Microbiol. V. 188. P. 463-472.

101. Saiki Т., Kobayashi Y., Kawagoe K., Beppu T. (1985) Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp. nov., a chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 35. P. 253-259.

102. Saitou N., Nei M. (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol. Evol. V. 4(4). P. 406-425.

103. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . V. 84. P. 5463-5467.

104. Sato M., Mori Т., Shimoile Y., Nagao K., Notsu K. (2002) Carbon isotope systematic of СОг, CO and CH4 in fumarolic gases from Satsuma-Iwojima volcanic island, Japan. Earth Planets Space. V. 54. P. 257-263.

105. Savage M.D., Wu Z., Daniel S.L., Lundie LL., Drake H.L. (1987) Carbon monoxide dependent chemolithotrophic growth of Clostridium thermoautotrophicum. Appl. Environ. Microbiol. V. 53. P. 1902-1906.

106. Shock E.L., Holland M., Meyer-Dombard d'A., Amend J.P. (2005) Geochemical sources of energy for microbial metabolism in hydrothermal ecosystems: Obsidian Pool, Yellowstone National Park, p. 95-110. In W. Inskeep, and T. McDermott (eds.),

107. Geothermal biology and geochemistry in Yellowstone National Park. Thermal Biology Institute, Montana University, TBI Print & Media.

108. Sipma J., Henstra A.M., Parshina S.N., Lens P.N., Lettinga G., Stams A.J. (2006) Microbial CO conversions with applications in synthesis gas purification and bio-desulfurization. Crit. Rev. Biothechnol. V. 26. V. 41-65.

109. Soboh В., Linder D., Hedderich R. (2002) Purification and catalytic properties of a CO-oxidizing:H2-evolving enzyme complex from Carboxydothermus hydro genofor mans. Eur. J. Biochem. V. 269. P. 5712-5721.

110. Stetter K.O. (2006) Hyperthermophiles in the history of life. Phil. Trans. R. Soc. B. V. 261. P. 1837-1843.

111. Stupperich E., Fuchs G. (1984) Autotrophic synthesis of activated acetic acid from two CO2 in Methanobacterium thermoautotrophicum. Arch. Microbiol. V. 139. P. 14-20.

112. Svetlichny V.A., Sokolova T.G., Gerhardt M., Kostrikina N.A., Zavarzin G.A. (1991a) Anaerobic extremely thermophilic carboxydotrophic bacteria in hydrotherms of Kuril Islands. Microb. Ecol. V. 21. P. 1-10.

113. Svetlichnyi V.A., Peschel C., Acker G., Meyer O. (2001) Two membrane-associated NiFeS-carbon monoxide dehydrogenases from the anaerobic carbon monoxide-utilizing eubacterium Carboxydothermus hydrogenoformans. J. Bacterid. V. 183. P. 5134-5144.

114. Svetlichnyi V.A., Dobbek H., Meyer-Klaucke W., Meins Т., Thiele В., Huber R., Meyer O. (2004) A functional Ni-Ni-4Fe-4S. cluster in the monomeric ,acetyl-CoA synthase from Carboxydothermus hydrogenoformans. PNAS. V. 101. P. 447-451.

115. Symonds R.B., Rose W.I., Bluth G.J.S., Gerlach T.M. (1994) Volcanic-gas studies: methods, results and application. Rev. Mineral. V. 30. P. 1-66.

116. Tenreiro S., Nobre M.F., da Costa M.S. (1995) Thermus silvanus sp. nov. and Thermus chliarophilus sp. nov., two new species related to Thermus rubber but with lower growth temperatures. Int. J. Syst. Bacterid. V. 45. P. 633-639.

117. Thauer R.K., Zinkhan-Moller D., Spormann A.M. (1989) Biochemistry of acetate catabolism in anaerobic chemotrophic bacteria. Ann. Rev. Microbiol. V. 43. P. 43-67.

118. Uffen R.L. (1976) Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 73. P. 3298-3302.

119. Uffen R.L. (1983) Metabolism of carbon monoxide by Rhodopseudomonas gelatinosa'. cell growth and properties of the oxidation system. J. Bacteriol. V. 155. P. 956965.

120. Van de Peer Y., De Wachter R. (1994) TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Applic. Biosci. V. 10(5). P. 569-570.

121. Wachtershauser G. (2007) On the chemistry and evolution of the pioneer organism. Chemistry & Biodiversity. V. 4. P. 584-602.

122. Woese C.R. (1987) Bacterial evolution. Microbiological reviews. V. 51(2). P. 221271.

123. Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. (1963) Formation of methane by bacterial extracts. J. Biol. Chem. V. 238. P. 2882-2888.

124. Yagi T. (1958) Enzymatic oxidation of carbon monoxide. Biochem. Biophys. Acta. V. 30. P. 194-195.

125. Zhao W., Romanek S.C., Mills G., Wiegel J., Zhang C.L. (2006) Geochemistry and microbiology of hot springs in Kamchatka, Russia. Geological J. of China Universities. V. 11(2). P. 217-223.