Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства новых штаммов термофильных анаэробных бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Свойства новых штаммов термофильных анаэробных бактерий"

П ; ^ О Я V1 * 0 Ьи

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи УДК 579.852.13

Митрофанова Татьяна Ивановна Свойства новых штаммов термофильных анаэробных бактерий

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научные руководители:

Оффицальные оппоненты: профессор

действительный член РАН, профессор

Е. Н. Кондратьева

кандидат биологических наук, Е. В. Захарова.

доктор биологических наук,

В. И. Дуда,

доктор биологических наук, Т. Г. Добровольская.

Диссертация направлена на офицальный отзыв в институт микробиологии РАН.

.3 О

Защита диссертации состоится "6 " дасабря 1995 г. в /5_часов на

заседании специализированного совета Д053.05.66 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу : 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд итория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "3 " ноября 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Н. Ф. Пискункова.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Благодаря своей способности расти при температурах, приближающихся к температуре кипения вода или даже превышающих ее, термофильные микроорганизмы постоянно привлекают к себе пристальное внимание ученых. По-прежнему не решена проблема механизмов их адаптации к росту при высоких температурах. Постоянным остается интерес оиотехнс.тогсп I; гэдолспшз новых штаммоь тормофилышх бактерии, обладающих крайне термостабилышми ферментными системами. Особый интерес в этом плане представляют возможные продуценты этанола и коммерчески значимых ферментов.

Выделение новых культур термофильных бактерий расширяет наши представления о разнообразии микроорганизмов и условий, в которых может существовать жизнь на Земле.

Наконец, особую актуальность в настоящее время имеет исследование филогенетических взаимоотношений внутри группы термофильных бактерий с целью выяснения возможных путей бактериальной эволюции.

В настоящее время отсутствует четкая корреляция между исторически сложившейся фототипической и формирующейся филогенетической систематикой бактерий. Особенно сложной является ситуация в систематике термофильных анаэробных эубактерий. Выделен целый ряд штаммов термоанаэробов, имеющих низкую степень филогенетического родства и крайне сходных фенотштически. Это придает особую актуальность задаче упорядочения систематики данной группы бактерий.

Задачи настоящей работы заключались в следующем :

1. Выделить чистые культуры термофильных анаэробных бактерий из антропогенных местообитаний.

2. Изучить морфологические, физиолого-биохимические и серологические свойства выделенных штаммов.

3. Определить таксономическое положение выделенных штаммов бактерий методами геносистематики.

4. Изучить биохимический состав клеточной стенки выделенных бактерий и определить его значимость для систематики термофильных анаэробных бактерий.

Научная новизна и практическая ценность.

Выделены 6 новых штаммов термофильных анаэробных бактерий. На основе детольного изучения физиолого-биохимических, серологических и генетических свойств выделенных штаммов описан новый вид и новый род термофильных анаэробных бактерий - Thermohydrogcntum kl-rlahlenae gen. nov , sp. nov.

На основании генетических признаков выделенный ранее Thermo-апавгоЫт lactoethyllcw предложено реклассифицировать в Therm-hydrogenlum lactoethyllcvm.

Произведен детальный анализ биохимического состава клеточной стенки термофильных анаэробных эубактерий. Впервыо показано наличие в ней рибозы.

Проведена оцешса критериев способности к спорообразованию, состава конечных продуктов метаболизма, спектра сбраживаемых субстратов и биохимического состава пептидогликаиа для систематики термофильных анаэробных эубактерий.

Создана коллекция штаммов термофильных анаэробных бактерий, которые могут представлять интерес для биотехнологии в качество продуцентов этанола, амилолитических и протеолитических ферментов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены па Всесоюзной школе-конференции молодых ученых "Систематика и эволюция микроорганизмов" (Пущино-на-Оке,1988).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и об'ем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и мотодов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиография составляет 191 литературный источник.

Работа изложена на 11$ страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 5 рисунков.

ОБ'ЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ •

Выделение бактерий производили из различных образцов дрожжевой биомассы (КиришскиЯ завод), взятых со стадии термообработки и вакуумной випарки.

Свойства этих штаммов сравнивали со свойствами Thermoanaero-Ыит procklt НТД4, Thermobact его Idea acetoethylicua НТВ2, Clostridium thermosaccharolyttcum DSM 567, Clostridium thermohydrosul/u-ricum 39E, Clostridium stercorcirium NC 4B, Clostridium thermoaiito-troptitcw Z и Clostridium thermocellum 1Щ I, из коллекции лаборатории микросрт*я!птагс1з Института С'лоха.иц и йшиологии микроорганизмов РАН. Штамм Tliermoanaerobiш lactoethylicum ZE-1 бил взят из коллекции кафедры микробиологии МГУ.

Бактерии выделяли и культурц их поддерживали на среде, содержащей (г/л): КН2Р04-2,0; К2НР04-3,0; (NH4)2S04-2,0; MgCl2'6H20 -0,2; Са012*2Hg0-0,05; дрожжевой экстракт ("Difoo") - 1,0; пептон -4,0; глюкоза-6,0. Начальное значение рн 7,2, температура б5°с.

Для культивирования применяли модифицированную технику Хан-гейта ( Жилина, Заварзин,1978). Культуральные свойства изучали по общепринятым методикам (Герхард, 1984). О росте бактерий судили по увеличению оптической плотности культур при длине волны 650 им и снижению рП среда.

Морфологию клеток изучали в фазово-контрастном микроскопе МБИ-15 У4.2 и в электронном микроскопе JEM-ЮОС. Препараты для электронной микроскопии фиксировали по методике Ритор-Келленбергер (Пуter-Kellenberger,1950), обезвоживали в спиртах и помещали в смесь эпоксидных смол. Срезы клеток получали на ультрамикротоме LKB-II и окрашивали по Рейнольдсу (Reynolds, 1963).

Концентрацию глюкозы в сродо определяли по стандартной Оифер-ментной методике (Березин и др., 1977). Лактат определяли спектро-фотометрически по восстановлению nad лактатдегидрогеназой (Кочетов, 1980). Другие продукты брожения определяли газо-хроматографическим методом (Калюжный, Варфоломеев,1986).

Наличие цитохромов выявляли путем дифференциальной спектрофо-тометрии целых и разрушенных клеток (Борисов и др.,1969).

ДНК выделяли по Мармуру и Доти (Marmur, Doty, 1961). Нуклео-тидный состав определяли методом тепловой денатурации ДНК (Marmur, Doty, 1962). Уровень ДНК - ДНК гомологии разных штаммов определяли

по методу До Лея и соавторов( De bey et al,1970) из кривых оптической роассоциации дик.

Последовательность нуклеотидов 5S РНК определяли химическим методом (Peatie.1979) с некоторыми модификациями. Нуклеотидпые последовательности были выровнены в соответствии с форматом Эмблского банка данных. (Wolters, Erdman, 1980) и использованы для расчета матрицы взаимных мутациошшх расстояний (Мр), где расстояния выражались в виде доли отличающихся позиций. Дендрограмма была построена с использованием метода "Максимального топологического сходства" ( Чумаков, Усманов, 1988, Усманов, Чумаков, 1988). ' >

Серологический анализ проводили методом непрямой иммунофлуо-ресценции (Вязов, 1973, Чувильская и др., 1989).

Препараты клеточных стенок получали по методу Канцлера (Kandier, Konig ,1978)'. Моносахара, аминосахара и аминокислоты в составе неточной стенки определяли как описано в работе Наумовой (Nau-mova et al,1909).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Всего было выделено в виде чистых культур шесть штаммов бактерий: ZE-1, ZE-7, ZE-13, ZE-16, ZE-17 И ZE-19.

Морфология выделенных бактерий и биохимический состав их

клеточных стенок

Клетки всех шести штаммов палочковидные, 0,4-0,8 х 1,1-11 мкм. Располагаются одиночно или парами. В старых культурах клетки иногда образуют короткие цепочки. Неподвижны. На всех стадиях роста по Граму окрашиваются отрицательно, но наружная мембрана, характерная для грамотрицателышх микроорганизмов отсутствует. Выявляются мезо-сомше структуры, характерные для грамполол!итолышх бактерий.

Клетки имеют тип деления, промежуточный между делением, характерным для грамположителышх и грамотрицателышх бактерий. Иногда в одной и той же клетке можно обнаружить и септу, и перетяжку. В результате возникают так называемые "мшш-клотки". Образование бактериями эндоспор не обнаружено mi при одних из применявшихся условий культивирования.

На электронных фотографиях ультратонких срезов iuiotoic выявляется наружный электрошюплотный слой, видимо, белковой природы. Белковая природа наружного слоя клеточной стенки выделенных штаммов подтверждается обнаружением в ое составе большого количества

аминокислот, не входящих в состав поптидогликана. Су шла непепти-догликановнх аминокислот составляет 20-32 % от веса сухих клеточных стенок из разных партий бактериальной биомассы.

Белок обладает, вероятно, кислыми свойствами, поскольку содержание кислых аминокислотных остатков (28,9%) существенно превы-ет количество основных (9,2% ).Серусодержащие аминокислоты в белке клеточной стенки бактерий практически отсутствуют (таСл.1). Наличие наружных белковых s-слоев кислого характера показано и для ряда других термофильных микроорганизмов (Sleytr, Thome, 1976, sinytr, Ывавпвс, 198З, Lnpnn ct al, 1334). "аиирцслюй. особенность» выделенных штаммов является большое содержание в их клеточной стенке гидроксиаминных аминокислот.

Таблица \ . Содержание аминокислот в клеточных стенках штамма

ze-7 (средние величины по препаратам из 4-х разных . партий бактериальной биомассы)

Аминокислота мкмоль / МГ /

100 мг стенки 100 мг стенки

Ala* 32.36 2.88

Glu* 22.65 3.63

Тге* 26.63 3.45

ILeu + leu* 14.24 1 .86

Gly* 25.85 1 .78

Asp 49.10 6.12

Ser 27.79 2.63

Lys 15. ВО 2.43

Г1ш 7.95 1.05

Arg His 5.80 0.88

1 .46 0.20

Туг 6.95 1 .10

Fro 11.00 1.12

Cys 0.76 0.22

* за вычетом аминокислот поптидогликана, GicN и мурамовой кислоты.

Обнаружение пептидогликана в составе меточной стенки выделенных бактерий в количестве 8-13% от сухого веса клеточной стенки из разных партий бактериальной биомассы говорит о их принадлежности к эубактериям. Принадлежность их к эубактериям подтверждается и подавлением роста всех шести штаммов тетрациклином, биомицином и пенициллином в концентрации 10 мкг/мл.

Молярное отношение компонентов пептидогликана, определенное на аминокислотном анализаторе( табл.2), составило A2pm-Mur-GloN-Glu-Ala, 1:1:1:1:2. Диаминопимелииовая кислота входит в состав пептидогликана в мозоформэ. Эти дашшо свидетельствуют о том, что пеп-тидогликан выделенной бактерии по классификации Шляйфора и Канд-лера (Schleifer, Kandier, 1972) может быть отнесен к А17- типу.

Таблица 2. Мольное отношение аминокислот в клеточной стенке

штамма ZE-7 и полученном из нее поптидогликане (средние величины по препаратам из 4-х разных партий бак-бактериальной биомассы).

Аминокислота Нативная стенка Пептидогликан

А2рт 1 .00 1 .00

Тге + Mur* 4.82 0.72

ILeu + Leu

+ GloN* 2.71 о: 15

Ala G.34 2.14

С lu 4.04 1.08

Gly 2.65 0.21

Авр 5.26 0.15

Ser 2.09 0.17

1>ув 1.95 0.08

Phe 0.85

Arg 0.60

His 0.15

Туг 0.74

Pro 0.94

Сув 0.11

♦ без учота разрушения при гидролизе.

о

Прямосвязашшй мозодиаминопимелиновый (A?7J тип пептидогли-кана является, вероятно, является общим свойством термофильных анаэробных бактерий. Наряду с выделенными штаммами термоанаэробов, он обнаружен в клеточной стенке T.ethanolicua, T.flnnli, C.thermohyd-roaulfurlcum, G.thermoaulfurogenea и C.thermoaaccharolyttcum (Sleytr, Thorne, 1976, Sohinlc, Zeilcus,1983, Schmid et al, 1986).

В составе пептидогликана изучаемых бактерий обнаружен галак-тозамин, отношение галактозамин-глюкозамин составляет 1:2. Галак-тозамин, редко встречающийся у мезофильных прокариот (Стрешииская и др., !9вь), у терг.^тапых микроорганизмов, шзможно, является довольно обычным аминосахаром. Он входит в состав пептидогликана G.thermosulfvrogenes ( Sahmid et а1,198б) и Thermmlcroblum газет ( Merkel et al, 1980) и является оддним из гликозилирукхцих компонентов s-слоя у ¿.fttvul. (Ьираз et al, 1994).

Изучение моносахаридного состава клеточной стенки выделешшх штаммов выявило присутствие в ней рибозы, icpaiüra редко встречающейся в клеточных стенках прокариот. Другие моносахариды обнаружены не были.

Тейхоевые кислоты в клеточных стенках выделешшх бактерий не найдены.

Таким образом, несмотря на наличие целого ряда характерных особенностей, таких как наличие рибозы и галактозамина и высокое содержание гидроксиаминокислот в составе бежа, состав клеточных стенок выделенных штаммов обнаруживает скорее свойства общие для всех термофильных анаэробных бактерий, нежели характеристшш, которые могли бы послужить в качестве их надежного хемотаксономи-ческого маркера.

Культуральные свойства

Все штаммы являются облигатными анаэробами. Но в присутствии молекулярного кислорода при комнатной температуре сохраняют жизнеспособность в течение нескольких часов. Каталазу но образуют. Цито-хромы не обнаружены. Азид натрия (ICf3 М) не ингибирует рост культур.

Оптимальная температура для роста - 65°С, максимальная - 75°С. Рост культур на среде с глюкозой и пептоном наблюдается при начальных значениях рн от 5,5 до 8,5. Оптимальное значение pH 7,07,4.

Лучшим источником азота для всех штаммов являются поптон и гидролизат казеина. Мочевина такжо поддерживает рост всех штаммов, хотя конечная биомасса при этом несколько ниже. По способности использовать б качестве источника азота аминокислоты штаммы различаются. Нитраты и аммоний в качество источника азота не используются. Ни один из штаммов не растет на среде без экзогенного источника азота.

Все выделенные штаммы бактерий являются хемоорганогетеротро-фами. Рост в автотрофных условиях в присутствии Н2 и С02 не происходит. В качество источника углерода и энергии, кроме глюкозы, все штаммы используют фруктозу, сахарозу, галактозу, лактозу, мальтозу, машюзу, ксилозу и крахмал. Рамноза но поддерживает роста культур.

Органические спирты в качестве источника углерода не использует ни один из штаммов.Штаммы гв-1 и гЕ-17 хорошо растут, на среде с машштом.

Все штаммы бактерий растут на среде с бутиратом. Слабый рост возможен на среде с пируватом. Штаммы гв-1 и гЕ-7 используют мале-ат. Формиат, ацетат, гликолят, цитрат, фумарат, малат, лактат, про-пионат и сукцинат не используются ни одним из штаммов.

При росте разных штаммов на среде с сахарами происходит снижение рН среды от 7,0 - 7,4 до 4,5 - 5,0. К 20 часам культуры достигают стационарной фазы роста и начинается постепенный лизис клеток (рис.1 А).

Виделешше бактерии способны образовывать культуры, имокхцие необычайно высокую для термоанаэробов плотность клеток. 20-часовоя культура бактерий, выращенных на среде, содержащей глюкозу и пептон, имеет при 650 нм оптическую плотность 1,3-1,5 ед. Выход клеточной биомассы составляет 35-40 г на моль потребленной глюкозы.

Бактерии не способны к диссимиляционной сульфат- и сульфит-редукции.

Водород и составе газовой фазы не ингибирует роста культур.

ю

Накопление продуктов брожения происходит параллельно росту культур (рис.4 А,В).

Рисунок и

Рост, потребление глюкозы и образование газообразных продуктов брожения штаммом йЕ-чб.

1 - биомасса (ед. оптич. плотн.); 2 - концентрация глюкозы (мкг/мл); 3 - Н2 {%); 4 - С02 (%) аб.%

Рисунок 1В

Рост и образование жидких продуктов брожения штамма 2Е-16. I - этанол; 2 - ацетат; 3 -пропионат; 4 - бутанол" (об'ем.%)

Метаболизм глюкозы

Основными продуктами брожения глюкозы у всех штаммов являются этанол, ацетат, н2 и со2 (табл.3). В следовых количествах обнаруживаются изопропанол, бутанол, бутират и лактат. Стехиометрия брожения глюкозы, рассчитанная для штамма 2Ж-7, близка следующему

уравнению:

С6Н12°б —' 1 .502Н50Н + 0,7СН3СООН + 1,бС02 + 2,ОН2

Таблица з. Продукты брожения глюкозы у разных штаммов выделенной бактерии (в молях на моль потребленного сахара).

Продукты гЕ-1 ЯЕ-7 гв-13 ИЕ-16 гЕ-17 йЕ-19

Этанол 1,2 1,5 1,1 2,6 2,7 2,0

Ацетат 1.0 0,7 0,6 0,5 0,7 1,2

% 2,1 2,0 2,0 1,0 1,3 1,0

со2 1,9 1,6 2,0 0,5 1,3 0,5

При росте разных штаммов на среде с крахмалом соотношение этанол: ацетат несколько сдвигается в сторону увеличения выхода спирта .

Накопление продуктов брожения происходит параллельно росту культур (рис.1А,В).

Определение активности ферментов углеводного метаболизме показало, что все штаммы изучаемых бактерий сбраживают углеводы по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса.

Бактерии содержат фосфофруктокиназу, альдолазу фруктозобис-фосфата и дегидрогеназу З-фосфоглицершювого альдегида. Пентозо-монофосфатшй путь, вероятно, не принимает активного участия в метаболизме Сахаров. Активности б-фосфоглюконатпвгидрпгвнаэн, г™ козо-б-.}» ч^зтдет^дргсп":; л ад-ХГ-альлолазн очень низкие.

Виктории содержат некоторые ферменты цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта, но активности а-оксоглутаратдегидро-геназы и фумаразы не выявлены. Активность цитратсинтазы, сукцинат-дегидрогеназы и изоцитратлиазы очень низкая. Вероятно, ферменты ЦТК и глиоксилатного шунта принимают участие в биосинтетических реакциях.

Бактерии содержат гидрогеназу, имеющую максимальную ферментативную активность при 70 °С.

Нуклеотидный состав ДНК. Уровни гомологии ДНК выделенных штаммов бактерий с другими термоанаэробами.

Содержание Г+Ц в ДНК у разных штаммов составляет 33.2 - 34.0 мол.%. Уровень гомологии ДШС отдельных штаммов - 97-99% (табл.2), что говорит в пользу принадлежности их к одному виду бактерий.

В качестве генотипического критерия вида Комитет по согласованию подходов к систематике бактерий, собравшийся 14-16 мая 1987 года установил 70% уровень ДНК-ДНК гомологии ( Wayne et al, 1987). Уровень гомологии разных штаммов выделенной бактерии с Т. lacto-ethyllcum составляет 20-27Ж. Уровень гомологии ДНК изучаемой бактерии с фенотипически близкими к ней видами Thermoanaerobacter ethaiiollcus, ThermobacteraIcies acetoethyllcua и Clostridium thermohydroaulfurtcum составляет 8-16% ( табл.4). Это дает нам основание рассматривать выделенные штаммы термоанаэробов как новый вид эубактерий.

Видовая обособленность выделеных штаммов подтверждается и отсутствием выраженных перекрестных реакций с сыворотками других термофильных бактерий.

Таблица 4. Уровни гомологии ДНК разных представителей термофильных анаэробных бактерий.

Штаммы гЕ-1 гЕ-7 гЕ-13 ЙЕ-16 гЕ-17 гЕ-19

гЕ-1 100 99,8 99,1 99,8 96,7 98,1

гЕ-7 99.8 100 99,6 99,2 97,5 98,3

гЕ-13 99,1 99,6 100 99,8 99,4 96,5

гЕ-16 99,8 99,2 99,8 100 95,9 99,2

ТНегтоапаего-Ыит 1а&о-еШуИсит гЕ-1 21 22 20 27 18 25

ЧЬегтоЪасге-го1без асе1о-еЫиИсиз НТВ 2 10 12 8 8 15 10

С1оз1г1й1ш ^гтоЬувго-аи\/иг1сит ШЫ 576 15 16 14 10 16 14

ТПегтоопоего-ЪаМег et/lшoUcцз АТСО 2246 12

ГЦ в ДНК, мол % 33,8 33,2 34,0 34,0 33,6 34,0

Серологические свойства выделенных штамнов.

Применение реакции непрямой иммунофлуоресценции показало, что выделенные нами штаммы (гЕ-1 - ZE-^Э) не дают выракешшх перекрестных реакций с сыворотками других термофильных бактерий, как с бесспоровыми, так и со спорообразукхцими видами (табл.5). Слабые (+/-) -(+) перекрестные реакции с ТЛасЮетуИст, Т.ЬгосШ1, С. Пгегто-}1ус!гози1/иг1сит свидетельствуют о наличии общих антигенных детерминант у этих организмов.

Таблица 5. Перокростшо реакции иммунофлуоресценции новых штаммов анаэробных термофильных бактерий со специфическими иммунными сыворотками.

Штаммы r!;jr)mv~> rinr

1 2 3 4 5 . 6 7 8 9

ZE-1 - - - - - + - +- +4

ZE-7 - +- +- - - +- - + +3.+4

ZE-16 - +- +- - - +- - + +3

ZE-19 - = +- - - + +- +- +3

1 .G.themocellum LQR1 2.0. thermohyärosulfvrtcum 39Е 3.C.thermo3accharolytlcum DSM 567 4.0.thermoautotrophlcum Z S.G.atercorarlum NC4B

6.ТЬегтоалаегоЫит brockll HTD4

7.Thermobacteroidea acetoethy-ÜCU3 НТВ 2

8.Thermoanaerob tum lactoethy-llcum ZE-1

9.Штамм ZE-1 .

Последовательность нуклеотидов в 5S pPHK.

Сравнение нуклеотидных последовательностей 5S рРПК разных штаммов выделенной бактерии с последовательностями нуклеотидов других термофильных анаэробов указывает на то, что филогенетически она довольно близка к Г. lactoethyltcw. Как видно из дендрогроммы (рис.2), выделенная бактерия и T. lactoethyllcum относительно удалены от Т. brockt I НТД4, T. olldum 1501/70, T. curvatvm 1504, T. crenophylum 803 и близкого к ним спорообразукхцзго вида Gl.ther-mohydroaulphurlcum. Таким образом, перечисленные бактерии образуют два равнозначных кластера,в один из которых входят выделенные штаммы термофильной анаэробной бактерии и Т.lactoethyllcum,а во второй виды, близкие к Thermoanaer ob Ivm ЬгосШ. Однако из-за существующего различия' в скоростях эволюций разных групп бактерий считается невозможным нахождение количественного критерия для определения ранга таксона по данным анализа нуклеотидных последовательностей pPHIC (Wayne et al, 1987, Murray ey al, 1990).

ггС ti

Clostridium atercorarlvm HC 4B

Thermocmaerobium olldum 1501/70 Thermoanaerob lum curvatum 1504 Thermoanaeroblum crenophylum 803 Thermoanaeroblum brocktt HTD 4 Clostridium thermohydro-

sul/urlcum 39E

majuZE-7 нш ZE-1 mau ZE-13 там ZE-16

-Thermoanaeroblum laato-

ethyltcm ZE-1

-Clostridium thermosaccharo-

lytlcum DSU 571

■Anaerocellum thermophulum

-Thermobacteroldes acetoethy-llcus НТВ 2

0.368 0.286 0.18Ц 0.092

Mp

Рисунок 5. Матрица взаимных мутационных расстояний

термофильных анаэробных бактерий, построенная по результатам секвенирования 5 в рРНК. Мр - взаимное мутационное расстояние в долях отличающихся позиций

В равной степени правомочными представляются два предположения:

1) Отдельные кластеры бактерии представляют собой два довольно близких рода внутри одного семейства.

2) Отдельные кластеры соответствуют двум обособленным группам видов внутри одного рода.

Так как вида кластера Т1\егтоапаегоЬ1ит и выделенные штаммы термофильной анаэробной бактерии имеют очень близкие фенотипические свойства и степень дивергенции их 5в рРШС не слишком велика, можно было бы, вероятно, признать их двумя обособленными группами видов внутри одного рода.

В то жо время, уровень ДНК-ДНК гомологии выделенных штаммов с Т.brockt I, T.ethanolicu3 и C.thermohyároaxilfvrlcwn составляет лишь 10-15%, что ниже, чем это обычно обнаруживается у видов, относящихся к одному роду бактерий - около 30% ( Блохина, Левонова, 1990, Гутина,1992). Межродовые уровни гомологии двух близких родов Thermoanaerobacter и Thermoanaerobacterlum ( Lee et ai. i9<n) также OKBSHHSKTC:! несколько Eüüiü (I7-Z5Xj уровня ГОМОЛОГИИ BN ппппнн.ЧХ

штаммов и видов кластера Thermoanaeroblum. Это дает нам основание утверждать, что выделенные штаммы не относятся к роду Thermoanaeroblum.

Thermobactего Idea acetoethyllcua, также имеющий близкие фе-нотипические свойства и способный расти но дрожжевом экстракте в отсутствие Сахаров, имеет крайне низкий (8-12%) уровень ДНК-ДНК гомологии и большую степень дивергенции в последовательности 5S рРНК

с выделенными штаммами термоанаэробов, что говорит об их генетической обособленности и от данного рода бактерий.

Таким образом, совокупность молокулярно-генотических и физи-олого-биохимичоских данных дает нам основание отнести выделенные штаммы термофильных анаэробных бактерий к новому роду эубакторий, присвоив ему название Thermohydrogenlum klrlshlenae. Данные молеку-лярно-генетических исследований позволяют нам также предложить ро-классифицировать Thermoanaeroblum. lactoethyllcum в Thermohydrogenlum lactoethyllcum, вследствие его большего филогенетического родства с выделенными штаммами бактерий , нежели с Thermoanaeroblum brockt I.

виводы

1. Из образцов промышленной дрожжевой биомассы.взятой со стадии ее термообработки, выделено 6 штаммов термофильных анаэробных бактерий: ZE-1, ZE-7, ZE-13, ZE-16, ZE-17, ZE-19.

2. Изучены морфологические, ультраструктурные, физиолого-биохими-ческие, серологические и генетические свойства выделенных штаммов термофильных анаэробных бактерий.

3. Высокий выход этанола и водорода, относительно высокий для термофильных бактерий выход биомассы на моль потребленного субстрата и способность к росту на крахмале позволяют считать этот организм перспективным для использования в биотехнологии.

4. В соответствии с требованиями Международного комитета по согласованию подходов к систематике бактерий описан новый вид и новый род экстремально-термофильных бактерий -Thermohyclrogenlum klrt-ahlenae gen.nov. apeo.nov.

5. Предлагается реклассифицировать Thermoanaeroblm ladhaety Ileum в Thermohydrogenltim lacthoetyllcum.

6. Впервые на примере Thermohyclrogenlum klrlahlense показано наличие рибозы в составе клеточной стенки термоанаэробов. Показано, что биохимический состав клеточной стенки не является надежным хемотаксономическим критерием для термофильных анаэробных бактерий.

Список работ, опубликованых по теие диссертации.

1. Шевцова Т.И.(Митрофанова Т.И.), Захарова Е.В. Свойства новых штаммов анаэробных термофильных эубактерий./ Эволюция и систематика прокариот.Тр. I Всесоюзной школы-конференции молодых ученых, Пущино, 1988 - Деп. в ВИНИТИ N5II-B90 стр.62-64.

2. Захарова Е.В..Митрофанова Т.И., Заикина А.И., Митюшина Л.Л. Анаэробная термофильная бактерия, выделенная из промышленных биоценозов. Микробиология, 1992, Т.61, Вып.1, стр. I09-II4.

3. Митрофанова Т.И., Лысенко A.M., Булыгина Е.С., Образцова А.Я., Захарова Е.В. Иммунологическая и генотипическая характеристика анаэробной термофильной бактерии Thermohyclrogenlum klrtaht. Микробиология, 1992, Т.61, Вып.З, стр. 472-477.

4. Zacharova E.V., Mitrofanova T.I., Krasilnikova E.N., Kondratieva E.N. Thermohydrogenium kirishiense gen.nov. and spec, nov., a new anaerobic thermophilic bacterium. Archives оГ Microbiology, 1993. vol.160. No.6, p.1-6.

5. Митрофанова Т.И., Захарова Е.В., Кондратьева Е.Н. Состав клеточных стенок Thermohydroeenium k-i-piRh->>r!?e v. Th~— hydrcgcniii" laoluuliiyiioum. Микробиология, 1995, T.C5 (3 печати;.