Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анаэробные термофильные карбоксидотрофные бактерии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анаэробные термофильные карбоксидотрофные бактерии"

РГО ол

1 ^ ' --'З Российская Академия Наук

и Ц «»- Институт микробиологии

На правах рукописи УДК 579.81.063.

СОКОЛОВА ТАТЬЯНА ГЕННАДИЕВНА

АНАЭРОБНЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫЕ КАРБОКСНДОТРОФНЫЕ БАКТЕРИЙ

Специальность 03.00.07 — микробиология

А 8ТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН.

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, профессор Г. А. Заварзин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. Ф. Гальченко; доктор биологических наук Ю. А. Троценко.

Ведущая организация: кафедра химической эн-зимологии химического факультета Московского Государственного Университета им. М. В. "Ломоносова.

Защита состоится 19 января 1994 г. в 14.00 часов на заседании специализированного совета Д.002.64.01. в Институте микробиологии РАН по адресу 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, кор. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан ^/¿Г декабря 1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета

Л. Е. НИКИТИН

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Окись углерода является одним из основных еусокотоксичных газов антропогенного происхождения, загрязняющих атмосферу. Она оказывает влияние на биосферу как один га пар:шкошга газов, к тему жо играющий важную роль в фотохимии озона СКароль. 1986; Будыко, Иэраэль, I9S7; Александров и др. 19Э2). Представляет интерес поиск бактерий, способных использовать окись углерода с высокой скоростью, пригодных для биотехнологической очистки окружающей среди от промышленных загрязнений.

В 70-х годах в Отделе хемоавтотрофных микроорганизмов Института микробиологии АН СССР Г.А. Заварэиным с сотрудника!® - Э.У.Санжиевой, А.Н.Кожевниковой, В.Р.Крюковым - был выделен и описан ряд культур аэробных СО-окисляюшнс бактерий, названных "карбоксидобактерии" СЗаварзин, 1978), что послужило стартом к их дальнейшим исследованиям (Меуег, 1981). Было показано, что к использованию окиси углерода как источника углерода или энергии способны некоторые анаэробные бактерии: гомоацетатные, сульфатредуцирующие, метанобразуюоие (Diekert, 1985). Описан один штамм мезофильной фототрофной бактерии Rhodopseudanonas gelatinosa, растущий в анаэробных условиях с СО в темноте и продуцирующий при «этом Н2 (DashkeYicz, Uffen, 1979).

В 1991 году В.А. Светличным. в гидротермальных местообитаниях Курильских островов были обнаружены анаэробные СО-окисляюаше бактерии, с новым типом литотрофного метаболизма основанным на реакции СО + HgO. = СО2 + Н2 AG = -20 кДж. Были получены 23 накопительных культуры . (? учетом морфологии.

скоростя потребления СО и образования при 75°С,

максимальное температуры роста и местообитания все полученные культуры были разделены на 3 группы (Светличный и др., 1991).

Нелы? работы было описание, определение таксономического положения и изучение физиолого-биохимических особенностей анаэробных термофильных СО-окисляющих бактерий, принадлежали* к наиболее активной группе. Задачи исследования-

1.Выделение чистых культур и описание анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий.

2. Определение таксономического положения анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий.

3. Изучение физиолого-биохимических особенностей анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий.

Научная новизна и практическая значимость. Олисаи новый род анаэробных термофильных неспорообраэуюдих грамполохительных палочковидных эубактерий СахЬохуйо £ Ъвгчт, объединяющий два новых вида С. ИуЛгоёегю/огтапэ и С. гез1п'с1из.

Изучены физиолого-биохимические особенности С. Лусйго^епо/огтопз - представителя бактерий, характеризующихся новым типом метаболизма, основанном на использовании окиси углерода как единственного источника углерода и энерги:: с образованием только водорода.

Обнаружена активная СО-дегидрогенаэа с оптимумом при Ю9°С. обладающая исключительно высокой термостабильностью.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на совместном заседании лаборатории микробных сообществ, экологии и геохимической деятельности микроорганизмов и биогеохимической деятельности микроорганизмов.

Публикащю. По материал au диссертации опубликовано 5 научных работ. I статья сдана в печать.

Объем я структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 138 страницах, включая 13 таблиц и 30 рисунков. Список литературы содержит 35 отечественных и 169 иностранных наименования.

Автор выражает особую признательность своему научному руководителю Г.А.Заварзину, а ';акже глубокую благодарность В.А.Светличному, М.А.Путевой, Н.А.Кострикиной и А.М.Лысенко за помзаь и поддержку в работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследования служили культуры анаэробных карбоксидотрофных бактерий, полученных из проб воды, ила я грунта из пресноводных и морских гидротерм, отобранных В. А. Светличным в 1988г. во время экспедиции на НИС "Проф. Богоров" на Курильских островах и проб воды и грунта из пресноводной гидротермы на острове Рауль - архипелаг Кермодек, Тихий океан - предоставленные нам Е.А. Бонч-Осмоловской. Пробы на острове Рауль были отобраны Е. А. Бонч-Осмоловской в 1990г. во время 18-го рейса научно-исследовательского . судна "Академик Несмеянов" .

о

Культивирование анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий проводили в герметично закрывающихся флаконах объемом 125 мл, 100% СО в газовой фазе, с 20 мл стандартной жидкой минеральной среды Пфеннига СPfennig, 1965) приготовленной согласно методам анаэробной техники (Hungate, 1966; Жилина, Заварзин, 1978 ) содержащей дрожжевой эвстракт CDifco)- от О до 0,5 г/л; I мл/л раствора микроэлементов по Липперту

CPfennl g, Lippert, 1966), 2 шг/л раствора витаминов по Волину (Wolln et al., 1963 ); рН среды 6.8-7,0. Для характеристики роста на органических субстратах культивировали в атмосфере 80'/. 20% в жидкую минеральную среду

вносили 5 г/л субстрата.

Для получения накопительных культур анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий 1-2 мл пробы вносили в герметично закрывающиеся флаконы объемом 125 мл С газовая фаза содержала 100'/. СО, давление 100 кПа) с 20 мл стандартной жидкой минеральной среды. Инокулированные пробами флаконы инкубировали при 7(Р, 7ïPc, без перемешивания. . Чистые культуры выделяли методом предельных разведений и последовательных пересевов на агаризованных и жидких средах. Микроскопические методы исследования. . Культуры наблюдали в световом шкроскопе МБИ-3 с разово-контрастным устройством при увеличении 90x15. Тотальные препараты для просвечивающей электронной микроскопии готовили методом негативного контрастирования с 2'/, фосфовольфрамовой кислотой СФВЮ. Для изучения ультратонкой структуры клетки фиксировали по Ритер СRiter et al., 1958), препараты окрашивали по Рейнольдсу (Reynolds, 1953). Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-I00.

Окись углерода получали в лабораторной установке, добавляя муравьиную кислоту по каплям к нагретой до 120°С концентрированной серной кислоте .

Содержание Ç0 и ^ определяли хроматографически на Chrom-5 СЧСФРЗ Содержание, летучих жирных кислот и этанола определяли хроматографически на хроматографе 3700 (Россия) Белок определяли по Лоури (Lowry et. al., 1957) Содержание Г + Ц в ДНК определяли по температуре плавления

(Mar шг J., Doty P., 1962,) ДНК-ДНК гибридизации проводили оптическим методом (Da Ley J., Cattoir H., Reynaerts A., 1970).

Массовое культивирование проводили в 5-литровом ферментере с перемешиванием со 100% СО в газовой фазе на минеральной среде Пфеннлга. Клетки хранили при -18°С под азотом. Клетки разрушали обработкой лпэошшом яичного бэлка с послеяующш.1 осмотическим шоком протопластов или в прессе Френча под током азота.

Активности Ферментов СО-дегидрогеназы, формиат дегидрогенази и гидрогеиазы определяли спектрофотометричесгаш методом з регистрируваем спектрофотометре Specord UV VIS СГермания) с термостатируюоим устройством в анаэробных кюветах. Теютературу в кюветах определяли с помоадю термопары. Активность гидрогеиазы определяли по восстановлению бекзилиюлогена бесклеточным экстрактом в атмосфере водорода (Пушева и др., 1986). Активность формиатдегидрогеназы определяли при 600 нм по восстановлению метилвиологена в атмосфере азота в присутствии 50 мМ формиата. CAndresen, Ljungdahl, 1976). Активность СО-дегидрогеназн определяли по восстановлению беизилвиологена в атмосфере СО при 600 ни (Clark et.al., 1982).

Состав цитохромов определяли йЬ дифференциальным спектрам поглоаения на спектрофтометре SPECORD UV VIS СГермания) восстановленных дитионитом против окисленных HgO^ мембранных препаратов. Пиридинферрохром выделяли последовательными экстракциями ацетоном и 20 У. пиридином в 0,1 Н NaOH. Флавины. тетрагидрофояаты определяли по спектрам

о

флуоресценции на флуоресцентном спектрофотометре МРФ-2А (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

я

Выделение чистых культур анаэробных карбоксидотрофных бактерий.

Группа накопительных культур анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий была получена из проб с температурой от 50 до 82°С и рН от 5.0 до 6.5. отобранных на острове Кунашир из Столбовских Источников, Горячего Пляжа и Алехино. Из них были выделены чистые культуры штаммов 2-2901, 2-2801. 2-2905 и 2-2906. Выделенные штаммы были представлены палочковидными клетками длиной 1,3-2,4 мкм, средней скоростью потребления СО выше 150 мкмоль/ мл культуры в сутки и максимальной температурой роста до 80°С. Потребление окиси углерода и образование водорода происходило в соответствии с уравнением

СО + Н20 = С02<- Н2 № = -20 к&хШ. Экспериментально полученный стехиометрический коэффициент -молярное отношение потреоленного СО к образованному Н2 - был близок к 1.0 С 1.04 + 0.05 ), что свидетельствует о хемолитотрофном метаболизме исследуемых бактерий.

Анаэробные карбоксидотрофные бактерии были обнаружены и в пробах воды и грунта из пресного гидротермального источника на острове Рауль (архипелаг Кермодек, Тихий океан}. Значение температуры в месте отбора пробы составляло 80°С, рН 7,2. Была получена морфологически однородная культура штамма 2-М. представленная овальными или короткиш палочками. иногда удлиненными, длиной 1,4-2,2 мкм. шириной 0.4-0.5 мкм. По морфологии, скорости потребления СО и образования Н2. максимальной температуре роста и местообитанию штамм 2-Ы был отнесен к той же группе анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий, что и штаммы 2-2901,2-2801. 2-2905 и 2-2906 . Методом предельных разведений с последующим высевом

на агаразованную среду 2-К1 был выделен в чистую культуру. Таблица I. Характеристики новых СО-использующих бактерий

Номер штамма

Максимальная температура роста С°С)

Скорость потребления СО при 75°С мкмоль Смл культуры) сутки"*

-I

2-2901 2-2905 2-2906 2-2801 г-ы

78 80 80 во 82

178 192 155 196 148

I

3

Обнаружение анаэробных карбоксидотрофных бактерий в пробах отобранных на Курильских островах С Тихий океан ) и на одном из островов тихоокеанского архипелага Ке'рмодек указывает на отсутствие географического барьера в распространении анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий в гидротермальных местообитаниях, по меньшей мере в пределах Тихого океана. о

По данным ДНК-ДНК гибридизации штаммы 2-2901, 2-^Э06. 2-2801 принадлежат к одному виду С табл. 2). Штамм 2-КЮ1 был описан как типовой штамм нового рода, нового вида СагЬохуйо Ь Иегтиз Иу ¿годепо/огтапг.

Штамм 2-2901 существенно отличается от ранее известных анаэробных бактерий использующих СО. Он дЗлек от Р.. (¡еХаИпозия поскольку представляет собой бесцветный . грамположительный.

с

Таблица 2. Геномные характеристики анаэробных

IV

карбоксидотрофных бактерий.

Штамм ГЦ мол.% Гомология в ДНК по отношению

+]% Z-290I Z-280I

2-2901 39 100

Z-280I 41 91 100

2-2906 41 100

Z-RI 39 7 23

термофильный организм, содержание Г+Ц в ДНК которого существенно ниже, чем у R. gelatinosus (71-72 мол.%). Штамм 2-2901 эубактерия и не образует метана, следовательно он не

может быть отнесен к мэтанобразуюшш. По комплексу

i

характеристик штамм Z-290I суаестаенно отличается от СО-испольэущих гомоацетатных бактерий: I) растет хемолнтоавтотрофно на СО, осуществляя реакцию CD', 2) во время хемолитотрофного роста на окиси углерола образует -ig и СО^. но не ацетат: 3) не использует характерных для гомоацетатных бактерий субстратов; 4) термофил, оптимальная температура роста 70-72°С; 6) клеточная стенка гр^тгслоетте-ичо-.-j -лша: 7) не образует C'iop; 8) содержание Г+Ц в ЛЖ 33 + 2 ко..%. Ытагш Z-290I не принадлежит к сульфатредукторам. поскольку кроме прочих отличий, он не восстанавливает сульфат. Таким образом, по сочетанию морфологических и физиологических характеристик штамм Z-290I не мог быть отнесен ни к одному из известных родов. На основании морфологических и физиологических особенностей штамм 2-2901 был выделен в самостоятельный род Carboxydothermus gen. nov. с типовым видом Carboxydotherms

-9Т

hydrogenoformans sp. nov. Типовой штамм Z-290I (DSM 6008) CIGSB 1991, V.4, il. 41). Вид включает штаммы Z-280I. Z-2906. Диагноз Carboxydothermus gen. nov.

Car.bo.xy.do. ther'ims, L.masc.n. carbo углерод; L.fem.n. oxydatio окисление; Gr.fem.n. therm горячий; L.masc.n. Carboxycbtterims СО-использующий термофил.

Термофильные эубактерии. Клетки - грамположительные прямые или слегка изогнутые палочки, подвижные, неспорообразуюаие. Хемолитоавтотрофный рост в строго анаэробных условиях с СО как единственным источником углерода и энергии с образованием эквимолярных количеств С02 и Н2. Другие продукты не образуются. Не восстанавливают сульфат или серу. Не растет на других неорганических и органических субстратах кроме пирувата. При росте на пирувате образуются ацетат и водород.Содержание Г+Ц в ДНК составляет 39 + 2 иол.%. Типовой вид Carboxydothermus hydrogenoformns.

Диагноз Carboxydothermiis hydrogenoformns sp. nov. hy. dro. gen. o. for'mans, M. L. n. hydrogenm водород; L. v. form образовывать; M. L. pari.-adj. hydrogenoformans образующий водород.

Клетки прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1,3-2,4

мкм и шириной 0,4-0,5 мкм, подвижный, с одним или двумя

латеральными жгутиками, неспоросВразуюнше, клеточная стенка

Грам-положительного типа с внешним S-слоем. Колонии круглые.

белые, полупрозрачные. Деление септой.

. Облигатный анаэроб. Термофил. Растет при температуре от 40

до 78°С с оптимумом при 70-72°С, pH от 6,4 до 7,7 с оптимумом

6,8-7,0. Рост полностью ингибируется 100 мкг/мл пенициллина,

о

хлорамфеникола или стрептомицина.

Хемолитоавтотроф. Исдользует СО как единственный источник:

-1С-

-5.0 "2.5

Л0 га 8 _ 2,0

-з.о л -с с < ъ! <= г -1- 6 и! ■С

-2,0 о -1,0

-1,0 ЕЗ* О р2 \ / / \ - 0,5

в 16 32 ■

«1ч;«я иле) Рис.1. Динамика роста штамма 2-2901 (•). потребления СО (а) и образования Н2 (■).

го

АО 60 80 ш'нми (члг.)

(00

Рис.2.Динамика роста штамма 2-М (•), потребления СО С*) и образования Н, С«).

углерода и энергии с образованием эквимолярных количеств водорода и двуокиси углерода в соответствии с уравнением СО + №,0 -» СО^ + Срис.1)- Другие продукты не образуются. При росте на пирувате образует ацетат и водород. СО- и Н^ не ингибируют рост. Другие субстраты не использует. Не восстанавливает сульфат или серу. Содержание Г+Ц в ДНК 39+ I мол. 'А.

т

Типовой штамм СагЬохусЬИхетиэ Ну<1го(;епо¡огпапэ 2-2901 СОБМ 6008). Выделен из пресноводного гидротермального источника на острове Кунашир СБуеШсЬпу е! а1.1991).

Штамм 2-2906 отличается от типового оптимумами температуры и рН , которые составляют 6^С и 6,5, содержание Г+Ц в ДНК 41+1 мол. У,.

Описание СагЬохусЫНетиз геэЬгхсШэ штамм 2-Й.

Штамм 2-Й является облигатно анаэробным хемолитоавтотрофом. Растет в пересевах на полностью минеральной среде (без дрожжевого экстракта) в атмосфере 100'/.

-Ileo. осуществляя реакцию (I) (рис.2), при этом не образуются метан, ацетат, или какие-либо другие продукты метаболизма. Дрожжевой экстракт не влияет на, удельную скорость роста и выход биомассы, но сокращает лаг-фазу. Среди известных анаэробных бактерий, способных к росту на СО штамм Z-RI наиболее близок к С. hydr ogenofor mans. Оба организма термофильные, облигатно анаэробные, неспорообразуюише, грашолохителыше палочки; хемолитоавтотрофы, используют СО как единственный источник углерода и энергии в соответствии с уравнением CI). На основании такого сходства штамм Z-RI был отнесен к роду Cárboxydothermus.

В отличие от штамма Z-RI, штаммы С. hydrogenoformns способны сбраживать пируват с образованием водорода и ацетата. Штамм Z-RI отличается от С. hydrogeno/ormns максимальной температурой роста С82° вместо 78°С), временем генерации (8,3 часа вместо 2 часов у Z-2901^), отсутствием чувствительности к стрептомицину, перетрихиальным, а не латеральным расположением жгутиков; клетки Z-RI не имеют S-слоя.

Уровень гомологии ДНК по данным ДНК-ДНК гибридизации

методом оптической реассоциации. между С. hidrogeno formaos Z-т

2901 и штаммом Z-RI составляет 7% (табл.2).

Низкий уровень гомологии в ДНК по отношению к типовому

о

штамму С. hydrogenoformans в сочетании с отсутствием

способности к брожению на пирувате в отличие от штаммов

т

Z-290I , Z-2906. Z-280I, относящихся к виду С. hydrogenoformans, позволяют выделить штамм Z-RI в самостоятельный вид Carboxydathsrmis restrictus.

Описание нового вида: Carboxydothermug restrictus sp.nov. re'stric.tus L. mase. adj. restrictus - ограниченный, использующий только oifliH субстрат.

Короткие палочки длиной 1,4-2,2 мкм, шириной 0.4-0,5 мкм.

а

Имеют перетрихиально расположенные жгутики. Размножаются бинарным делением с образованием перетяжек. Клеточная оболочка грамположительного типа.

Хемолитоавтотроф. Источником углерода и энергии служит СО. Осуществляет реакцию СО + Н>0 = СО, + Н, . Не сбраживает глюкозу, фруктозу, ксилозу, галактозу, рибозу, лактозу, сахарозу, целлобиозу, крахмал, глицерин, этанол, метанол, лактат, пируват, ацетат, формиат, пептон, дрожжевой экстракт. При росте на СО не использует ни серу, ни сульфат в качестве акцептора.

Строгий анаэроб, термофил. Растёт при температуре от ¿5° до 82°С, оптимум 70-72°С, и pH от 6.6 до 8.0. оптимум pH 7.0. Пенициллин, ванкомицип. эритромицин, и хлорамфеникол подавляют рост и окисление СО. Устойчив к рифампицину, стрептомицину и тетрациклину (100 мкг/мл).

Содержание Г+Ц в ДНК 39 + 2 мол.'/..

Место обитания: пресный горячий источник на берегу озера вулканического происхождения на острове Рауль.

Типовой штамм: Z-RI. Монотипичен. Хранится в лаборатории микробных сообществ Института микробиологии РАН и в DSM (DSM 7242).

ФИЗИ0Д0Г0-БИ0ХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНАЭРОБНЫХ ТЕРМОФИЛЬНЫХ КАРБОКСИДОТРОФНЫХ БАКТЕРИИ.

Физиолого-биохимические особенности анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий были исследовали на одном из штаммов типового вида рода Caxb'oxydo 1 hermus -С. hydroßenoformans -штамме Z-2906, активно растущем на окиси углерода.

Было показано, что .суспензии клеток штамма Z-2906 в восстановленной минеральной среде Пфеннига окисляют СО и

образуют до 74 мкмоль за I сутки на I мл клеточной суспензии, содержащей 0.26 мг белка/мл, при 70°С. Ключевые ферменты метаболизма анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий. Активности формиатдегидрогеназы и гидрогеназы. В бесклеточном экстракте СагЬохусЬМегтиз Иус1го§епо/огтпз шт. 2-2906 из клеток, выращенных на окиси углерода, обнаружены высокие активности формиатдегидрогеназы -и гидрогеназы. В цитоплазматической фракции активность формиатдегидрогеназы, определенная при 74°, составляла 0.П мкмоль/мин мг белка. В мембранной фракции активность формиатдегидрогеназы не обнаружена. Удельная активность гидрогеназы, измеренная по восстановлению <Уензилвиологена в атмосфере водорода при 65° составляла 1,57 мкмоль/мин мг белка. Активности СО-дегидрогеназы.

А. Активность СО-дегидрогеназы в целых клетках. СО-дегидрогеназная активность целых клеток, выращенных на СО (определенная по восстановлению бензилвиологена). составляла 3.75 мкмоль х мин~*х мг белка-*. При росте на пирувате СО-дегидрогеназная активность целых клеток составляла 3,02 мкмоль х мин-* х кг белка"*. Б. Локализация СО-дегидрогеназы. 1

После разрушения замороженных клеток Френч прессом и разделения лиэата на фракции ультрацентрифугированием при 105000 д 99% тотальной активности СО-дегидрогеназы было обнаружено в цитоплазматической фракции. Этот результат аналогичен характеристикам СО-дегидрогеназ других анаэробных бактерий - гомоацетатных. метанобразуюишх, сульфатредуцируювшх ШекеК е1 а1., 1985. )

При использовании другого метода разрушения клеток с

применением лизоцима яичного белка с последующим осмотическим шоком протопластов были получены фракция супернатанта протопластов и фракция лиэата протопластов. В клетках, выращенных на СО. 80,8% общей активности СО-дегддрогенаэы обнаружено в супернатанте. 19,4% - в лизате протопластов. В клетках, выращенных на пирувате. 19,6% общей активности СО-дегидрогеназы обнаружено в супернатанте протопластов. 80,3% - в лизате протопластов (табл. 3). Таким образом, наблюдается обратное распределение активностей СО-дегидрогеназы между фракциями ^зависимости от используемого клетками субстрата -газообразного или хорошо растворимого органического. Известно, что при получении протопластов после гидролиза клеточной стенки грамположительных бактерий и последующего мягкого центрифугирования в присутствии Мд2+ в надосадочную жидкость

Таблица 3. Распределение СО-дегидрогеназной активности по фракциям в бесклеточном экстракте 2-2906.

№ Удельная активность Удельная активность Удельная активность СО-дегирогеназы СО-дегидрогеназы СО-дегидрогенаэы в клетках в супернатанте в лизате протопластов

протопластов

' -т -т

Смкмоль/мин мг х) (мкмоль/мин мг )

,-1

,-1

Смкмоль/мин мг)

,-1

1 3.75

2 3,02

2,28 0,833

1,04 2,93

Н°1 - клетки, выращенные на окиси углерода (100^ СО в газовой фазе).

№2 - клетки, выращенные на пирувате (5 г/л пирувата Иа)

переходят мембранные структуры (Rogers et al., 1980). Локализация СО-дегидрогеназы в супернатанте протопластов штамма Z-2906 при его росте на окиси углерода мохет быть связана с такого рода мембранными везикулами. Локализация СО-дегидрогеназы вне цитоплазмы при росте на окиси углерода, по-видимому, облегчает доступ в клетку плохо растворимого при высоких температурах газового субстрата. В. Кинетические характеристики СО-дегидрогеназы. Кинетические и температурные характеристики СО-дегидрогеназы измеряли в цитоплазматической фракции бесклеточного экстракта полученного из клеток, выращенных в ферментере под током окиси углерода и разрушенных в прессе Френча.

Максимальная активность наблюдалась при рН 7,0. С повышением рН до 9.0 активность фермента несколько уменьшалась.

При 73°С , рН 7,0. концентрации бензилвиологена 1.8 мМ удельная активность СО-дегидрогеназы в цитоплазматической фракции бесклеточного экстракта составляла 18,35 мкмоль/ мин мг

Это эна-

Z0U 2 72 31,0 [COI

Ряс.3. Зависимость активности СО-дегидрогеназы штамма Z-2906 от концентрации СО в реакционной смеси.

белка

чение в 6 раз

вше СО-дегидро-

геназной актив)

ности. измеренной в бесклеточном экстракте PhodopseudotTionas gelatinosa -- 3.5 мкмоль х мин"*х мг белка-3' выращенного в

темноте на окиси углерода за счет реакции СО + Н2Р =

Активность СО-дегидрогеназы зависела от концентрации окиси углерода в реакционной смеси в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен (рис.3). Концентрация растворенной окиси углерода в реакционной смеси рассчитывалась по растворимости СО в воде при 70° с учетом парциального давления окиси

рл

углерода в газовой фазе. Значение Ки составляло 20 мкМ. Г. Температурные характеристики.

.............- — - -------------------- Для изучения

влияния температуры на активность С0-дегидрогеназы, реакционную смесь прогревали в тер-мостатируемоЯ ячейке спектрофотометра в течение 10 минут при температуре от 30 до 140°С; реакцию начинали виесе-от нием фермента.

20 40 60 80 100 120 й.0

температура реакции °с Рис.4. Зависимость активности СО-дегидрогеназы штамма 2-2906 темпетатуры реакции.

Максимальная активность наблюдалась при Ю9°С (рис.4). При увеличении температуры от 40 до Ю9°С активность фермента увеличивалась более, чем в 30 раз. Реакция шла при температуре -до 135°С. Увеличить температуру б термостатируемых ячейках спектрофотометра не представлялось возможным. При 135°С активность СО-дегидрогеназы уменьшалась вдвое по сравнению с максимальным значением. Кривая

зависимости активности СО-дегидрогеназы от температуры в координатах Аррениуса имела точку перегиба при Ю9°С. Энергия активации составила 10.37 ккал/моль, что близко по значению энергиям активации получении?,! для термостабильных гидрогенаэ СПушева и др. 1987)

Термостабильность фермента определяли по остаточной активности, измеренной при 85°С после прогревания ферментного препарата в атмосфере смеси азота л углекислого газа при температурах 85°, ПО0, 13СЯС. Ферментные препараты прогревали в буфере с дитиотреитолом в атмосфере : СО, (4:1). После прогревания смесь азота и углекислого газа вытесняли с-исью углерода, кювету с реакционной смесью 10 минут выдерживали в термостатируемой * ячейке ■ спектрофотометра для установления заданной температуры, реакцию начинали внесением бензилвиологена. Периоды полуинактивации фермента составляли 35 минут при IICPC и 6 минут при 13(Яс. При 8ïPC активность фермента за время эксперимента не изменялась (рис.5).

Ш'нмя (у,'/н.) Рис.5. Термостабильность СО-дегидрогеназы штамма 2-2905.

В другой серии экспериментов исследовали устойчивость фермента к прогреванию В атмосфере окиси углерода. Анаэробную

< о

85°

10 20 30 и о 50 60

кювету заполняли буфером и окисью углерода, прогревали в глицериновой бане до заданной температуры, затем вносили ферментный препарат и инкубировали кювету с реакционной смесью в глицериновой бане в течение 4-10 минут, после чего кювету пометали в термостатируемую ячейку спектрофотометра, в реакционную смесь вносили бензилвиологен, и проводили измерение остаточной СО-дегидрогеназной активности при 85°С.

Таблица 4, Зависимость остаточной активности СО-дегидрогеназы при 85°С от температуры и длительности прогревания ферментного препарата в0атмосфере СО.

Температура С°С) Время инкубации (мин) Удельная активность СО-дегидрогеазы при 85°С (мкмоль/мин мг)

85 10 0.6

130 10 0,76

145 4 1.7

160 5 1,5

. Обнаружено, что в атмосфере окиси углерода СО-дегидрогеназа устойчива к кратковременному прогреванию при лкстремально высоких температурах, намного превышающих температуру денатурации белка (табл.4).

Присутствие фопатных производных в бесклеточных экстрактах штамма 2-2906.

С целью выявления соединений фолатной природы были исследованы спектры возбуждения и флуоресценции фракции супернатанта протопластов и фракции лизата протопластов, полученные из клеток С.кусЬо§ет/огттз, выращенных на окиси

углерода или на среде с пируватом под азотом.

Таблица 5. Распределение фолатов по фракциям в бесклеточном экстракте 2-2906.

N° Количество фолатов Количество фолатов

в супернатанте в лиэате протопластов

протопластов

мг/ мл мг/мл

1 0,19 0.13

2 0.35 0.20

Н°1 - клетки, выращенные на окиси углерода (I00V. СО в газовой фазе).

Н°2 - клетки, выращенные на пирувате С5 г пирувата Na на 1л среды).

* Количество фолатов расчитано по отношение к фолиевей кислоте и дано в мг в т ферментного препарата.

Сканирование клеточных фракций (содержание белка 0,2-0,3

мг/мл) полученных из клеток, выращенных на СО или пирувате.

показало флуоресценцию в области характерной для фолатов с

максимумом для возбуждения 365 нм и максимумом для эмиссии

i

440-450 нм. Приведенные в литературе спектры экстрактов Aceiobacterim Миш. (0,5 мг белка/мл экстракта) и термофильной гемоацетатяей бактериии AGR (0,5 мг белка/мл экстракта) также имели пик флуоресценции около 440 нм при возбуждении 360-370 нм приписываемый фолатным производным (Lee, Zinder, 1988). Среди соединений со сходным максимумом эмиссии известны фолат, 10-формилфолат. 6-метилптерин и 5.10-метенилтетрагидрофолат (Blakely, 1969).

Присутствие цитохрома с в клеточных мембранах штамма Z-£906.

Били исследованы дифференциальные спектри поглощения мембран Z-2908 (восстановленных дитионитом и окисленных перекисью водорода). Как видно из рис.^спектр характеризуется максимумами поглощения при 422 им. 523 им и 552 нм. Абсолютный спектр поглощения окисленных мембран имеет максимум поглощения при 405 нм. абсолютный спектр поглощения восстановленных мембран имеет максимумы поглощения при 419 нм, 522 нм и 551 им. (рис.6). Такие спектры характерны для цитохрома с. В дифференциальном спектре поглощения пиршшиферрохмохрома.

о

получелном для фракции не экстрагируемой ацетоном, имеются два максимума поглощения при 518 нм и 548 ни (рис.7).

> ¿,00 ' 500 •

Рис.6.Дифференциальный спектр поглощения мембран штамма 2-2906.

Исследование дифференциальных спектров но разделении» на

U2Z

5А8

фракцин бесклеточных экстрактов штам/а Z-2906 показало Наличие максш.ут поглоцения при 380 нм, что указывает на возможное присутствие ферредоксинов. Ферредокснн рассматривается как возмоп-ный естественный акцептор для СС-дегидрогеказы (Drake, Wood, 1980).

Таким образом.в клетках Carboxy dothercus hydro geno/ornans Z-2906 обнаружены гидрогенаэа. формиатдегидрогенаэа. СО-дегидрогеиаза и фолатные соединения, характерные для других анаэробных бактерий, использующих СО. Рост C.hydrogeno/ormns Z-2906 на пирувате с образованием аиетата и водорода возможно указывает на сходство метаболизм анаэробных карбоксидотрофных и гомоацетатных бактерий, некоторые из которых используют окись углерода как источник углерода и энергии с образованием ацетата. Однако катаболические превращения окиси углерода у карбоксидотрофных анаэробных бактерий вероятно происходят иначе: конечными продуктами являются только водород и двуокись углерода. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Были получены чистые культуры анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий, обнаруженных В.А.Светличным в гидротермах Курильских островов, и из пресноводной гидротермы острова Рауль: Z-290I. Z-2906, Z-280I и. Z-RÜC этими штаммами были проведены таксономические и биохимические исследования Они были объединены з новый род Carboxydo therms. Штамм Z-290I был описан как типовой штамм нового рода нового вида Ccsboxydolherms hydro geno {ormns, в который также вошли штаммы Z-2906 и Z-280I. Штаммы C.hydrogenoformans используют крайне ограниченный спектр субстратов - только окись углерода и пируват. Штамм Z-RI - облигатный карбоксидотроф - был описан как новый вид Carboxydotherrns restrictas.

На примере штамма г-2906 активно растущего на окиси углерода были исследованы физнолого- биохимячески* особенности анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий.

Было показано, что клеточные суспензии осуществляют конверсию окиси углерода в водород с высокой скоростью.

В работе охарактеризована термофильная СО-дегндрогеназа из клеток С. Ьу&овепо/олмдо г-2906. Исследованы ее локализация и кинетические характеристики. Показано, что при росте на газовом субстрате СО-дегидрогеназа локализована вне цитоплазмы. После разрушения замороженных клеток френч прессом СО-дегидрогеназная активность "обнаруживается в цитоплазме. СО-дегидрогеназа штамма г-2906 обладает высокой активностью и низким сродством к окиси углерода СКЫС0= 20 икЮ. Фермент имеет высокий температурный оптимум - 109°С,и остается активным до 135°С. Верхний температурный предел активности фермента не был определен из-за ограниченных возможностей прибора. Фермент отличается высокой термостабильностью. Периоды полуинактивации фермента составляли 35 минут при Н0°С и 6 минут при 130°С. Показано стабилизирующее действие окиси углерода на СО-дегидрогенаэу при прогревании при экстремально высоких температурах,

В бесклеточных экстрактах штамма 2-2906 быи обнаружены фолатные производные и цитохром с^ ~ вероятные компоненты цепи переноса электронов. ВЫВОДЫ.

1.Выделены и описаны штаммы анаэробных термофильных эубактерий, использующих СО в качестве единственного источника углерода и энергии с образованием водорода в соответствии с уравнением (I).

2. Среди штаммов анаэробных термофильных карбоксидотрофных бактерий выделены и описаны 2 новых вида

эубахтерий объединенные в новые роя СагЬохусЫЬеггш5 -С. Луйгояетю/опктя, растуиий только за счет окисления окиси углерода или ацетогенного сбраживания пирувата, и С.гев(гСс1ив -использующий только окись углерода.

3. В клетках С. Луйго^епо/огтаги 2-2906 обнаружены высоко активные ферменты литотрофного метаболизма: формиатдегидрогенаэа, гидрогеназа. СО-дегидрогеназа я фолатные соединения. Установлено, что мембранные препараты

С. Луайго^епо/огпапв 2-2906 содержат цитохром с^.

4. Охарактеризована СО-дегидрогеназа штамма 2-2906 отличающаяся высокими активностью и термостабильности): фермент сохраняет активность при повышении температуры до 135°С, оптимум - 109°С. Установлено активирующее действие, окиси углерода на СО-дегидрогенаэу при кратковременном прогревании ферментных препаратов - при, экстремально высоких температурах (до 160°С> в атмосфере СО.

Спнсок работ, опубликованных по теме диссертации.

1. В. А. Светличный, Т.Г.Соколова, 1.1- Герхардт,' Г.А.Заварзин. Новая группа анаэробных термофильных карбоксидобактерий, выделяющих водород. // Докл. АН СССР. 1990. Т.314, С. 742-744.

2. Путева И.А., Соколова Т.Г.. Герхардт И., Светличный В.А. Активности гидрогеназы, форшатдегндрогенаэы " и СО-дегидрогеназы термофильной анаэробной карбоксидобактерпи Carboxydottxermis hydrossno/ormns. // Микробиология. 1992. Т. 61. С. 939-944.

3. Светличный В. Л.. Соколова Т. Г., Кострикина Н.А., Лысенко A.M. Carboxydothermus restrictus sp. nov. - новая термофильная анаэробная карбоксидотрофная бактерия. // Микробиология. В печ.

4.Svetlichny V. А., Sokolova T.G., Gerchardt М., Kostrikina N. А., Zavarzin , G. A. Anaerobic extremely thermophilic carboxydotrophíc bacteria in hydrotherns of Kuril Islands. // Microb. Ecol. 1991. V. 21, P.I-IO.

5. Svetlichny V.A., Sokolova T.G., Gerhardt M., Ringpfeil M., Kostrikina N. A. , Zavarzin . G. A. Caxboxydolherms hydrogeno/ormans gen. nov. and sp. nov. - a CO-utilizing thermophilic anaerobic euhacterium from hydrotherns of Kunashir Island. // Syst: Appl. Microbiol. I991. V.14, P. 254-260.

6. Pusheva M.A., Sokolova T.G., Gerchardt M., Svetlichny V.A. СО-dehydrogenase of a thermophilic anaerobic carboxydotrophic bacterium Car boxy do t hermas hydrogeno for maris strain Z-2906. // In: Int.. Conf. Therraophiles; Science and Technology. Reykjavik, Iceland. 23-26th August 1992.. P. 47.

7. Пушева M. A., Сомова Т. Г. Локализация СО-дегидрогеназы и

4 *

компонентов цепи переноса электронов у анаэробной термофильной карбоксидобактерии Carboxydothermís hidrogeno/ or mans штамм .Z-2906. // Микробиология. В печ.