Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Систематика термофильных бактерий родов Methanobacterium и Methanosarcina

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Систематика термофильных бактерий родов Methanobacterium и Methanosarcina"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 579.22: 579.851.1/12^

КОТЕЛЬНИКОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИЛЕНОВНА

СИСТЕМАТИКА ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ

МеШапоЬаМпит и Микапохагста.

(специальность 03.00.07 - микробиологи«)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1993

Работа выполнена в лаборатории анаэробных процессов и отделе "Всероссийская коллекция микроорганизмов" Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, проф. Б.К. Акименхо, кандидат биологических наук А.Я. Образцова.

Официальные оппоненты, доктор биологических наук Т.Н.Жилина,

доктор биологических наук, проф. В.И. Дуда.

Ведущее учреждение: кафедра микробиологии МГУ им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится 1994 г. в И час. за и и. на

заседании Специализированного совета Д 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан " x V " ¿д-'аДд_199$/г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В. М. Вагабов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Меганобразующие бактерии являются представителями царства Еиап/шеош, входящего в состав домена Architect (Woese et al.,1990), и представляют собой уникальный объект для микробиологических, биохимических, молекулярно-генетическлх и биотехнологических исследований (Whitman, 1985). Поиск, выделение и изучение новых метаиогенов составляет основу зля развития таких исследований. Особый интерес представляют термофильные метаногенм, поскольку обладают высокими скоростями роста, способны осуществлять интенсивный процесс метаногенеза (Zinder, 1990) и, г-связи с этим, рассматриваются в настоящий момент в качестве наиболее перспективных объектов для использования в биотехнологии. Термофильные метанобразуюшие бактерии родов Melhariobacteriuni и Methanosarcimt являются основными компонентами термофильного анаэробного сообщества микроорганизмов, осуществляющего деструкцию органического вещества до метана. Таким образом, особую актуальность приобретает выделение новых термофильных организмов родов Methanobacterium и Methanosarc'tna и изучение их морфологии, ультраструктуры, физиологических свойств и таксономического положения.

В последнее десятилетие благодаря успешному применению техники культивирования анаэробных микрорганизмов резко возросло число новых видов метанобразуюгцих бактерий (Garcia, 1990), описанных, как правило, с преимущественным использованием фенотигтических признаков, что привело к необходимости ревизии ряда таксонов, переоценки систематических критериев (Zellner et al.,1989; Maestrojuan et al.,1990; Wilharm et a!.,1991; Xm et a!., 1989; Maestrojuan et al.,1992; Touzel et al., 1992). В ходе ревизии, однако, не было обращено должного внимания ка систематику рода Methanobactermm. Термофильные виды данного рода обладают высоким уровнем морфо-физйологического сходства, поэтому возникла необходимость оценки степени их родства на генетическом и хемотаксономическом уровнях.

Цель настоящего исследования состояла в выделении и изучении термофильных метанобразующих бактерий с привлечением современных таксономических методов. В конкретные задачи исследования входило:

1) Выделить из различных источников чистые культуры термофильных метанобразующих бактерий.

2) Изучить морфологию, тонкое строение и физиолого-бяохимические свойства изолятов.

3) Изучить химический состав клеточных стенок изолятов и типовых штаммов.

4) Провести таксономический анализ выделенных и типовых термофильных мета »oren ов методами гено- и хемосиелемлтики.

5) Оценить таксономическую значимость ряда фенотипических признаков в систематике термофильных меганогенов рода Methanobacteríwn.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые проведен детальный таксономический анализ выделенных из различных источников и типовых штаммов рода Methanobucteríum. thennoautothrophicum. Описаны новые виды thennophüwn sp. nov., Mb. thermoflexum sp. nov. и Mb. defluvii sp. nov. Ha основании хемотаксономическнх и геногипических признаков вид Л/А. thermoalcalip/ii/шп АС60 рскласскфицирован в качестве референтного штамма в составе вида Mahanobactcnutn thennoautothrophicum. Дополнено описание вида Mb. thermoautotrophicum способностью ряда штаммов к оптимальному росту при щелочных значениях рН.

Впервые в составе клеточных стенок Mb. thennoaggrcgans, Mb. thermophilum, Mb. defluvii обнаружена аминокислота глицин, не описанная ранее в составе клеточных стенок Methanobacteriuni spp.

Проведена оценка роли ряда таксономических критериев для выделения таксонов видового уровня для термофильных метанобразующих рода Methanobacteríum. Показано, что способность к потреблению формиата и степень алкалифильности, которые ранее рассматривались в качестве видоспецифичных и дифференцирующих признаков, таковыми не являются.

Создана коллекция детально охарактеризованных термофильных метанобразующих бактерий, которые могут быть использованы в микробиологии, экологии, генетики, биохимии, а также в биотехнологии в качестве продуцентов метана и ряда уникальных кофакторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конкурсе молодых ученых ИБФМ (1987), на Всесоюзных конференциях "Биоконверсия-88" (Латвия, Рига, 1988), "Архебактерии" (Пущико, 1988), Международном симпозиуме СССР-Ф1Т (Тбилиси, 1990), на Всесоюзной конференции "Микробиология охраны биосферы Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), и конкурсе научных работ ИБФМ (1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (314 ссылок). Работа изложена на 184 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 21 рисунок. 2

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектами исследований служили 22 штамма метзнобразующих бактерий, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ЗКМ, г. Пуицшо, Россия), Немецкой коллекции микроорганизмов (DSM, г. Брауншвейг, Германия), любезно предоставленных Т.Н. Жилиной (Россия), J.G. Zeikus (США), К.-Н. Blotcvogcl (Германия), а также выделенные нами.

Работы по выделению и поддержанию различных штаммов мстанобразующих бактерий проводились в соответствии с принципами техники анаэробною культивирования микроорганизмов (Hungate, 1969; Balch et al.,1979).

Для культивирования бактерий использовали среди N 1, 2, 3 (Boich et al.,1979), фосфатно-солевуюля среду (Zcikus et al, 1975), а также среды 119, 120, 141 (Catalogue of strains, DSM. 1089). Колонии получали в тонком слое агара в пробирках ("Bélico glass", США) или па поверхности чашек Петри в анаэробном боксе (Hirasawa). Хранение культур осуществляли модифицированным метолом Хиппс (Hippe., 1989).

Контроть чиетотм полученных К\льт\р осуществляли ь-окероч на с ролы 65, 144, 135(CalaiOpUC of strains, DSM. 1989),с гачледчющим микроскомировамисм препаратов живых клеток.

Морфолр;ик> и \льтраетруктуру клеюк изучали с помои,»ю светового микроскопа (NU-2К/, элсктрониои.- м ni" [ч к ñ опи О КМ \00' Препарата лль лсктронно-микроскотнческиь исследований готовтя»' fie Реино !ьлс> (ке>по!а^, 1^'м Г!.»ы ган.нгтнле стр}кт\р|>- клеток, и^уча.'и- метолом u..4')mkíh.i>. ¡- замороач и io-.î аос^нии 'Злчккр'.;, с: а!., 19£7 . Препараты гоюмпи с поч;>:иг>к » хмно-тпчлиплы'ш' устанч'ик!1 Ял-лкия'.

Ку.плугалмгм__с но^ ''-L____"fiV't" >_';•■ иj \ м„ ль по oí r.;;принят им

ченли'а-и ; Г ¡'-К- : '■ ; ¡ ' ' «Г , í

C'(ircie.'4-n-r rTcirím ci-l^í;'.!". »■• wcu-ikvl^c- nvoxvn i: ^»еггаял--гик./ сред.

•.'Hipirov nt-.iv ^ип'.ингр.ц vo, {.-'(, Kt-sn;v'c>.ii-ip»¡i; оп'.ч-де'ч.'о. М'Л0Д0".>

Пахмейег>а (СЬ'к ж. акктрп^чмо^стги "Speco'- Mf,)'1 manuo', ф;-зс.- определяли на

газ^ол; хроматгracr-c 'Jiiuau " íAuiai-s!; с плам^но-пон"-^^^.-^^.^ д'-т^кнчч"^'

Nte^O-l'-^_X с г i1 кг» тол'"1 С е î"j. i;>ni ск a ¡ ¡ j л í > ; н ; ■< >ьо пп к мс гол. > ■> непрямой

1!мм\hikjuko'vuíiн 1л'и : b^o'.ir. i , ч у ы*.л м. к ». к л\., I лpciU'pjtи клеточных ctchoi

потуч:ли по мпол> (handle and Komj., Нейтральные ca.vapi опрслсткли на универсальном

анализаторе "liiotronic" Catbr-hydratc Analyzer LС 200C Аминокислотный состав, созерцание N-анетилглюко.имииа. N-auci илг.ъ'иктешмнн,» я Ы-ане'1ил-1.-талозп\:и(|уроноиок кислоты проводили на аминокислот ком анализаторе "Biotronic" Chromotograph Svstem L С 6000 F после кислотною 1нлролиза препаратов Апатит обших ктеточкьп- белков проводили методом одномерного электрофореза в тралиенгном пилиакриламизном (IíAAI'í геле, в аппарате для вертикального электрофореза (1_аетт1\,1970к Денсигомстрировали фореграммы на лазерном сканере 2202 Ultrascan Laser densitometer "I.KB-Brormna". Расчет молекулярных масс белков, разделенных

электрофорезом на ПААГ, построение гистограмм, демонстрирующих распределение полипептидных спектров проводили с помощью пакета программ "Hist". Нумеричсский анализ хсмотаксокомичсских признаков проводили с использованием коэффициента попарного сходства Ks компьютерным методом с помощью программы "PIN".

Методы геносистематики. ДНК выделяли по методу Мармура (Marmur, 1962). Дифференциальные спектры выделенных ДНК снимали на универсальном спектрофотометре "Shimadiu" (Япония). Нуклсотидный состав ДНК (мол% ГЦ) определяли методом тепловой денатурации ДНК (Marmur and Doty, 1962). Содержание Г+ Ц пар в исследуемом препарате ДНК рассчитывали по формуле (Owen and Pitcher, 1985). Определение ДНК-ДНК гомологии проводили методом термальной реассоциации ДНК в растворе (De Ley, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Из различных источников был выделен ряд штаммов термофильных метанобразующих баоерий, имеющих форму палочек и сардин. В таблице 1 представлены основные морфологические, культуральные особенности и источники выделения чистых культур.

I. Характеристика термофильных метаносарции. Штаммы TS-1 и TS-2 были представлены сферообразными клетками, объединенными в пакеты, окруженные общей оболочкой. Клетки делились путем неравномерного дробления. Для роста и метаногенеза штаммы TS-1 и TS-2 использовали метанол, метиламины и ацетат. Н2 ■+ СО2 как источник роста и энергии использовался штаммом TS-2 крайне медленное, и не использовался штаммом TS-1. (Табл. 2). Особенностью изолятов явилась их высокая скорость роста на ацетате и метаноле.

Показано, что термофильные изоляты TS-1 и TS-2 облигатно нуждались для роста и метаногенеза в добавлении в среду таких органических факторов как дрожжевой экстракт, казаминовые кислоты, триптиказа.

Содержание Г + Ц пар в молекуле ДНК у штаммов TS-1 и TS-2 составляет 43 и 41 моль% соответственно. Эти цифры близки к значениям, сообщенным для Ms. thermophila ТМ-1 (Sowers et al., 1984; Zinder, Mah, 1979). Иммунологический анализ изолятов продемонстрировал их антигенную близость к штамму ТМ-1 (данные не показаны). Анализ клеточных белков изолята TS-1 и типового штамма ТМ-1 показали уровень сходства 70% (Рис. 2).

Таким образом, выделенные штаммы TS-1 и TS-2 на основе вышеперечисленных морфо-физиологических, геносистематических и хемотаксономических признаков близки к виду Ms. thermophila и могут быть идентифицированы как штаммы этого вида. Данные изоляты, обладая рядом таких преимуществ как широкая субстратспецифичность, высокая скорость роста и

мегзногспела на метаноле и анетате, моглг бык. персг;ектнмнь;.и;1 ;:л.-т использогшмя в биотехчологми.

2. \Ьр'|к>-фтнолг>пичес?л]й характеристик» иллочколилных и золятоя. Клетки штаммов М, ТГ-1, DV, 7VF, и ADZ бы;ж гфглстгп: юны одиночным.» палочка mi инегла образующими цепочки разлиляо» длины. Эш метанлгепь: облаял::;', строением клеточных сто ¡о к пода 'нич строите ю грамноложгл е бактерии. Деление клеток осуществлялось путем образования септы. Штамм ID7S, в отличие от вышеперечисленных, был представлен клеткдма сально изогнуто, формы, как. правило, одиночными или в плргх! Злектротчля мгроскопи-л еыязнлп у этого штампа наличие ч-хл:1. и стру ktvрi гро г '11;; •:;>гх"» г:о:;ерл1гхтпо1 о ело1,:. г.'.о п:'иее длл тер^офалп:? ",// ihnr.obucn-r.jm s?p. не отмечалось.

о-глс.-лъ'е фмз-'/лдсчу.--:гzy.v: 5<..<л г.аолдюз аре ;ст;:гс;г

таб.т1;:.*е с. ¡¡Пглм'.ш i)V ;; ]■■ [ псч.ольислалн и клчесич? источника углер-лл i: лнерпл' ч")1гл;о + CO-j, s то нр^чл к:.к ягглммы \IYL, IDZ,, ТГ-1 и 7VT мог/ч; Л^аллчи ¡l-ль''О и фосг-г.-ат. Оптлмальиье чо'п^и'г^лцкп

г"л гчгг-мчо^ ЛП£. Тп-1 и IUZ еоотлгшль -10 и 2!? inM, vuonvr-ii'.'*..

i-biT--мл с го: -ок !'мч кониеш piiau ми формн;!та, «и me S'J гЦ,6т10,.""1ЛЛСЬ >' СССХ И 'sy4 С;! Л' ГЛМУО!?.

1. Морг-с г<«г 5;--г;<-н<; и кулмур.чльл^о r-p.u:: .¿„я r^br-'.i-^Hrix : л-'!П,нс*г

! /, 1 ' ; t,„;' v;.

ТГ-1 OV 7Vr ADZ

IDZ XS'l 15-2

и r.:\

n-i

U-!?63/726? 11-'/.JO

ТАЛО".',:

0 5-Г5..7

П2

O.oi>.l\ n^uw ,I

[' Vi 1-J rsa.*"", ;н а.-1?.чЗ--Ь

яэл15чки

;!."">) 4vti4c пол1"-1.' *

о :■>

-'--¡•"c;ii c.'Ji-r lI'v'A i u cuy.v.ui

Терчатиным Лк-'Г PJC.1.7 tj v j

Гадютс^м^-г •ic.TiUv.i У v! Клмчйгк.!, J'acjH-i [¡очва, 1'Ьегмц .

1п'.о?с?,ктор по OMVicrvc сточицч иод ю'\;ичеС!<ого

к л л '!!!"■

!.р-'ллit'.i.i'i

Выделенные организмы развивались в интервале температур от 37 до 75 °С с оптимумами от 55 до 65 °С и, таким образом, представляют собой эвритермных умеренных термофилов (табл.2). Для роста, как правило, благоприятны значения pH, которые лежат в нейтральной области (6.8-7.4), за исключением штаммов IDZ и DV. Наилучшее развитие последних имело место в интервале pH от 7.9 до 8.3. Оптимум роста изолята ADZ. сдвинут в кислую сторону.

Изучение влияния различных факторов роста показало, что штамм М облигатно требовал для роста н метаногенеза присутствия в среде коэнзима М и ионов никеля; рост штамма ADZ стимулировался дрожжевым экстрактом, триптиказой и казаминовыми кислотами. Другие изоляты развивались в отсутствие факторов роста.

Наиболее чувствительными к присутствию сульбида был штамм М (табл. 2). Ингибирующие концентрации сульфида, для большинства изученных нами организмов, оказались ниже аналогичных значений, сообщаемых в литературе для другах кетапогенов (Daniels et al.,1986; Jarreli, Kalrnokoff, 1988). Наиболее устойчивым к содержанию хлориду натрия оказался штамм IDZ, который развивайся в среде с концентрацией NaCl до 50 г/л (табл. 2)

Таблица 2. Основные физиологические свойства выделенных термофильных метаногенон.

Штамм Источники углерода и энергии Время * удвоенна , (час) Факторы роста 0 Т С > Оптимальные значения (диапазон) pH S~2. NaC^ шМ г/л

М н2 + со2 2.3 Ni, 55-60 7,4-7,6 0.015-0.12 0-5

коэнзим М (40-75) (6.0-S .5) (0.75) (0-8)

TF-1 н2+со2, 1.43 - 55-60 7,4-7,6 0.4-5.2 0-5

формиат 1.49 (40-70) (6.0-8.5) (5.5) (0-15)

DV н2 + со2 1.84 - 60 7.9-8.3 0.1-2.3 0-1.0

(50-70) (7.0-9.5) (4.5) (0-3.5)

7VF н2 + со2, 1.92 - 60-65 7.4-7.6 0.1-3.0 0-1.0

формиат 4,71 (30-70) (6.0-8.5) (2.5) (0-5)

ADZ н2 + со2. 1.5 к.к,д.э. 60-65 6.5-7.0 0.15-1.2 0-20

формиат 2.7 тр. (37-75) (6.0-8.0) (3.0) (0-30)

IDZ н2 + С02, 3.5 - 55 7.9-8.2 0.2-4.0 2-40

формиат 8.6 (37-75) (7.0-9.0) (3.5) (1-50)

TS-1 метанол 4.9 к.к.,д.э. 58 6.6-7.0 0.5 0.5-2

ацетат 13.9 тр. (30-60) (6.0-8.5) (0.5-5.0) 0.9-10

метилами*!)' 43.3

TS-2 метанол 4.0 к.к.,д.э. 55 6.8-7,2 0.5 0.5-2

аиетзт 10.3 тр. (30-60)

метилам инь' 35.4

н2 + со2, 26.7

* - время удвоения расчитывалось при оптимальных условиях роста;

д.э. - дрожжевой экстракт, к.к.- казаминовыс кислоты; тр.- триптиказа; знак означает, что организм не нуждается в дополнительных факторах роста. 6

Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик вновь выделенных термофильных метаногенов позволило сделать заключение о принадлежности этих организмов к роду Methanobacteriiim.

3. Таксономический анализ группы термофильных метаногенов рола Mcthanobactcrium.

При описании новых таксонов метаиогенных бактерий, близких по своим морфо-физиологическим свойствам особое значение придается хемо-тзксономическпм и молекулярно-генетическим критериям (Boone, Whitman, 1988) .Следующий эгап нашей работы состоял в идентификации изолятов и изучении таксономических отношений среди термофилов рода Mctlnnobacteriwn.

Содержание Г fil пар в ЛИК у изученных нами штаммов варьировало от 47.9 до 62.0 иоль%. (табл.3).

На основании данных по ДНК-ЛИК репссопиаппи (табл. 3) была получена дендрограмма (рис. 1), которая показывает, что изученная группа организмов читается генетически гетерогенной и включает 6 геновидов с гомологией ог 18 до 46% (табл. 3). Так, первая и вторая подгруппы включают типовые штаммы Mb. Kolféi DSM 2970, Mb.thennoaggregans DSM 3266, а также штаммы M, ADZ и 1DZ, представляющие собой отдельные геновиды (рис.1). Третья подгруппа

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ДНК-ДНК реассоциэция, %

Рисунок 1. Дендрограмма полученная на основании результатов ДНК-ДНК реассоциацин термофильных штаммов рода Methanobacteriiim.

Таблица 3. Содержание Г+Ц пар в нллгякуле ДНК и ДНК-ДНК рпасппциация термофильных мегапогенов рода Methanobacterium

Организмы M % реяссодиации с ДНК из ADZ IDZ DV штаммов: TF-1 йН Z245 А050 3266 2970

Содержание Г+Ц пар в ДНК (моль %) штамм М 48.4 100 62.2 22.2* 55 20.2 49.99 47.2 50.5 32.2 50,78 49.4' 20.4 50.59 25.4 49.8 38.82г 22.7 47.9 42.23 45.0 58.0 61.04 23.8

шиш ADZ 100 46.9 24.0 27.5 38.7 44.7 29.4 42.2 25.7

штамм IDZ 100 45.3 43.& 44.5 44.3 32.0 22.5

штамм DV 100 S4.0 63.0 73.8 69.2 39.0 10.4

штамм TF-1 100 7в.4 91.7 98.0 39.0 19.3

Mb.thermoautothrophicum. нттаммлН, Mh.thermofonnicicum штамм Z-245 Mb.thermoalcaliphilum АС60 Mb.ttwrmoaggregans DSM 3266 Mb. wolfeit 100 99.5 100 99 6 91.4 100 38.3 31.4 37.fi 100 20.5 32.1 25.0 34.0 100

DSM 2970

1 - данные по ГЦ составу получены Mitchell et al.,1979; 2 - Blotevogel et я1.,1985;

3 - Blotevogel et Fisher.,1985; 4 - Winter et al.,1984; * - среднее из трехкратного подсчета по данным двух ДНК-ДНК

гибридизаций;

прелсгав.тепа аплммлм;) с уровнем реассоциаиии мем<ду собой (55%-99%, с другими термофилами 25-33%, и язл^ется, таким образом, отдельным генопидом. Как показывают результаты, к лтому геповпду относятся организмы,

описанные ранее как отдельные виды Л/Л. rlicnnnainotrophiami &U, Mb. llwrmoalcaliplulum АСЫ) и Mb. ihcrmofonmriaim Z-245 (Blotevogel et al.,1985; Жилина, Идлариопоз, 1934). Уровни ДНК-ДНК реассоциации между ними составляют 91.4-99.6'% (табл. 3). Такие генотипичсские различия квалифицируются в качестве ипаммовых (NVayne, 1957). Исключая факты генетической близости штампов л Н, АС60 и Z-245 (01.4-99.6% ДНК-ДНК реассоциации), уровень ДНК-ДНК реассоциации для разных видов в группе термофильных Mejuinubaclcriitm spp. составляет 10-45%, а для разных штаммов -65-99%.

Иммунологические гсследочания термофильных палочковидных метаногеноп показали, что изоляты имеют различное серологическое родство по отношению к типовым штаммам роди Mdhunohacterinni (табл. 4). Так, наиболее

Таблица 4. Перекрестнме реакции непрямой н.н^июфл.'оороецешдшг палочковидных термофильных метаногепов рода Methanobactcrium со специфическими иммунными сыворотками.

Интенсивность реакции сыворотки со штаммом: Штаммы DV АС60 М ADZ

Л It Z-245 3266 2970 IDZ

н 4 2 3 3 0 1 0 0 0

DV 4 4 1 2 1 0 0 0 0

TF-1 2 0 3 3 0 0 0 0 0

Z -1901 3 0 2 0 0 0 0 0 0

Z -1201 2 2 2 0 0 0 0 0 0

7VF 3 0 3 0 0 0 0 ' 0 0

Z-245 3 3 4 3 2 0 0 0 0

ЛС60 3 0 2 4 1 0 0 0 0

DSM 3266 0 0 1 1 4 0 0 0 0

DSM2970 0 0 0 1 0 1 4 0 0

М 0 0 0 0 2 3 0 0 0

ADZ 0 0 0 0 0 0 0 4 0

IDZ 1 О 0 О 0 0 0 0 4

йН - МЬ. 1ксппоаШо1юрЫсит Н, 1-245 - МЬ. ¡кеппо^ппкк'шп г-245, 3266 -МЬ. 1/1егтоп§£П%ап5, 2970 - МЬ. \\ю![ей. Интенсивность свечения клеток оценивали по четырехкрестовой системе - (4 + ,3 + ) - яркая люминесценция; (2 + ) - специфичное, но более слабое свечение; (1 +) - четкое, но отличающееся по интенсивности от собственной люминесценции клеток, свечение ; 0 - отсутствие свечения.

1 2 3 4 'J 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 'S 19

67 ООО 45 ООО 36 ООО

25 ООО 20 ООО

t . Г- ;

1. s: v.

¡■■■"■■У •■ ■.-¿' • (Л*

. Х- - ' * * • ;

Л : :

<1 1

дн АС60 Z- 1201 TF-1 Z-245 7VF DV 2-1901 DSM 3266 М IDZ ADZ DSM 2970 DSM 2095 DSM 2373 - ТМ-1 TS-1

.9 .8 .7 в .5 .4 .3 Коэффициент попарного сходства Ks

Рисунок 2. Электрофорез общих клеточных белков термофильных метаногенон. 1,10,19, стандарты молекулярных весов: бычий альбумин (67 ООО), яичный альбумин (45 ООО), лактатдегидрогешза (36 ООО), химотрипсин (25 ООО), ингибитор трипсина (20 ООО); 2, Mg.thermophilum DSM 2373; 3, Mc.therniolitolrophicus DSM 2095; 4, штамм TS-1; 5, Ms.tliermopliila TM-1; 6, Mb.thermoautotrophicum H; 7, штамм Z-1901; 8, штамм Z-1201; 9, штамм DV; 11, Mb.thermofonracicum Z-245; 12, штамм ADZ; 13, штамм IDZ; 14, штамм TF-1; 15, штамм Ы; 16, Mb.thermoaggregans DSM 3266; 17, Mb.vvolfeii DSM 2970; 18, Mb.lhermoalcaliphilurr, AC60; Дендрограмма построена по результатам сравнительного анализа белков термофильных метаногеноа родов Methar.obacterium, Methanogenium, Methanosarcina, Metliaiiococcus.

иммунологически близкими оказались штаммы 1901, 1201, Z-24S, TF-1, 7VF, АС60 и DV, которые являются серотипами вида Mb. thermoamotrophicum, а штаммы DSM 3266, DSM 2970, M, ADZ, IDZ продемонстрировали антигенную уникальность.

Таким образом, иммунологические исследования подтвердили данные по ДНК-ДНК реассоциации. Кроме того, наши результаты относительно родства Mb. ihcnnofonnicicum Z-245 и Mb. thcnnoauiotrophicum дН по иммунологическому анализу (3 + ) и ДНК-ДНК гомологии (91%) согласуются с результатами, полученными ранее Тоузелем с соавторами (Tousel et al., 1991).

По результатам нумерического анализа состава общих клеточных белков, вся группа термофильных организмов рода Mcthanobactcrium распределилась по трем кластерам, которые разделились на уровне коэффициента сходства 0.30 -0.50 (рис. 2). Наиболее уникальными по составу белков оказались следующие еиды: Mb. ihcrmoaggregaiis, Mb. wolfcii , a также штаммы M, IDZ, ADZ. Коэффициент сходства их белков между собой составлял 40-50% (рис. 2). Остальные палочковидные термофильные штаммы (Z-1201, Z-1901, TF-1, 7VF, DV) составили группу близких организмов с коэффициентом подобия 45-70%, включающую также виды Mb. thcrmoaiitothrophicum ь H, Mb. thennoalcaliphihim AC60, Mb. ihcrmofowiiciawi Z-245.

Коэффициенты попарного сходства белков (Ks) между штаммами одного геновида варьировали в пределах 50-75%, а между отдельными геновидами - от 30 до 50%., а между представители других родов - ниже 30% (рис. 2). Результаты по степени белкового сходства, полученные нами для Mb. thermoautotrophiciini дН, Mb. thennofonvicicum согласуются с данными Томаса с соавторами (Thomas et al.,1987).

Таким образом, сравнительный анализ белков термофилов рода Methanobactcnum подтвердил результаты ДНК-ДНК реассоциации и иммунного анализа об уникальности изолированных нами штаммов M, 1DZ и ADZ.

Исследование препаратов клеточных стенок ряда штаммов рода Methanobacterium показало, что они содержат N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин и N-ацетилталозаминуроновую кислоту и другие компоненты, типичные для псевдомуреина (табл. 5). Молярные соотношения N-апетиламиносахаров (N-ацетилглюкозамина и N-ацетил галактоза мина) варьировали у разных штаммов от 1.00 до 2.00 (табл. 5).Нейтральные сахара в клеточных стенках у изученных организмов были представлены небольшими количествами глюкозы 5.9-13.6 нм/мг сухого веса, а также следовыми количествами галактозы и рамнозы, что согласуется с данными полученными

а

el r-l

ä

rtj

î

Я

3

in

15

У

а

CJ

Iii со ■л:

Я

ГА О Ml

S

s.

В

Е- О : 1

-и-

ír:;

IÖ

s

ö о о

g g

ы

4- К

s

s «

ë + О

Г— OJ

I 8

O O uí O О

o> со со if ù O".1 ij CO а;- с ^ ц"> • ю . .со . . . .

О О О .ООН .О OU) О .О x-i CJ Ci <Г> M* if. --f С'J uLí lÔ г^

о S S о g о В S ci в

S ir-, S t й +

r. J a'.i -î ;7> ' Ln o О

, ■ , S 3 S £ ïï v

c^Î î- г'> vr> c<- r¡

Í-J - .1 : о: i г, о о

О Ю г.о :•- ..О -О Г- С J

il î О; .-.V v*"- о*: i¡-j у г О

Ii J «г? c£.i с J -J- с.-? «ч- j.: Од о

Т-» г-* м- —I ,.г - Г.', -г-ч О ô "VTJ'O х--tu" - А

о'/ С' ; г- с-. '-'.' -v ¡ л

;,") о'J с*.* ¡t- е.!

;[' v.

Г

>.Г> : '--.2 'У- и 1 Ю О? G'J с

«.•• О v-t í'-'j f.- n -î1 .

. AJ . . . . О . .

Л С": <\< С Î .--•î с-.? со г- д: т--< г ¡ о

О !' Г- 00 I о ««

- < -т-1 i'J t- С.Ч

OH C'.J v-i yi \-I Г'-.î t.-) V- s~< О «

I • ;•» —i

i'"' -f w ¡.vi c-t ^.i с: г

d ■ i û'-l <i-

11

й s

Iii! I

.i I ■s â *é а

ci. i.r,

о нд о --• : J

Шг? ï iï

i> 4J <-> 'Í-

й â S â P

o: 'jf е-н

к î;

О и SV

о - a.- ч й^йё'-й

Г?'.¿i

-:J 1 : .

o »-> *•- •'

-д> t-. -j' M. 3.-"

-IHl) -, '.-s

r-; c-< Í-. f-

w г- - • i so o 1.; fd

"а ' Й оГ'10

-H ;r, -J. N: O W

■r J X -•: cj

... i ■f -S} ó',

.AViZ

r: 'i v; fi. i-, О г- :-д t.! '-J

■¿•zms

с î-." с- о t u о :ь rj: oí crî

Л-' Г_) S « ÍE, rs i N

V-ii tí« et

«8Й '.2 , T

V-I К

05 .Pïû'H

0 C^ ^ О О fi ГД CJ> i-c—' ы>

■■i V à: •>: "" -' _ о C> - С-

'H l~J и Г ■ Ítí r% О l^&llll

1 «.Г?1

v.- i oc U)

8 3-13 У ñ ScÉJ g В

-i-ï Л i X, ХЛ Л-. Jrj O X-!

! Cj Ci Cl Pi çtî /"•î ci cl

:fJ

ранее для других представителей рода Methanobacterium (Konig et al.,1982). Однако, в Отличие от состава Сахаров в клеточных стенках у мезофилов рода Methanobacterium, у термофилов нами не было обнаружено маннозы. Кроме того, у нового изолята IDZ обнаружено большое количество галактозы 9.2 нм/мг сухого веса, что соответствует такому же количеству глюкозы. Эти результаты позволяют предположить чередование глюкозы и галактозы в гликановых последовательностях клеточных стенок изолята IDZ.

Такие штаммы каиН, DV, TF-1, АС60, Z-245 содержали одинаковый набор аминокислот (аланин, глютаминовая кислота, лизин) в сходных молярных соотношениях (табл. 5). Клеточные стенки типового штамма DSM 3266, а также М и ADZ содержали дополнительно к вышеперечисленным аминокислотам глицин в молярном соотношении с лизином 0.5:1.0 (табл. 5), что позволят у этих организмов предположить иную структуру псевдомуреина. Наличие глицина впервые показано для представителей рода Methanobacterium.

Состав клеточных стенок штаммов TF-1, Mb. thennoalcaliphilum АС60, Mb. lltermoformicicuni Z-245 близок к таковому у Mb. thennoautotrophicwn йН, а штаммы DSM 3266, М, ADZ и IDZ отличаются по составу клеточных стенок от вышеупомянутых организмов.

4. Оценка таксономической значимости фенотипических признаков в

систематике термофильных бактерий рода Methanobacterium.

При идентификации организмов рода Methanobacterium, сходных по своей морфологии, в качестве признаков, дифференцирующих виды, наибольшее внимание уделялось отношению организма к температуре, pH, его способности к потреблению формиата и облигатной потребности к факторам роста. Результаты наших исследований показали, что способность к потреблению формиата и степень алкалифильности, не коррелирует с геносистематическими и хемотаксономическими особенностями. Так, формиатпотребляющие штаммы TF-1 и 7VF по гено- и хемотйксономическим признакам близки к типовому штаммудН вида Mb. thennoautotrophicum, а штаммы ADZ и IDZ отличаются от всех типовых организмов. Штаммы DV и АС60, имея оптимум роста в щелочной области pH, по остальным изученным нами признакам оказались близки к штамму аН. Однако, алкалифильный штамм IDZ таксономически уникален. Таким образом, способность к потреблению формиата и алкалифильность не соответствует таксономическому положению организмов и не являются признаками, дифференцирующими виды.

5. Таксономическое положение термофильных бактерий рода Methanobacterium. Реклассификация Mb. themioalcaliphilum АС60 в качестве референтного штамма Mb. thermoautolrophicum. Новые виды метанобразующик бактерий.

Данные по геносиетематике и хемотаксономии позволили оценить степень родства среди термофилов рода Melhanobacterium. Полученные результаты свидетельствуют о таксономической гетерогенности изученной группы организмов.

Совокупность морфо-физиологических, гено - и хемотаксономических характеристик свидетельствует о близости изолятов DV, TF-1, 7 VF к типовому штамму Mb. íhermoautotrophícum дН и позволяет идентифицировать эти организмы в качестве референтных штаммов вида Mb. thermoautotrophkum.

Для Mb. thermoaggregans DSM 3266, и Mb. Wolfen DSM 2970 подтверждена их видовая принадлежность.

Результаты таксономического анализа указывают, что штаммь: дН и АС60, принадлежат к одному геноциду, серотипу, сходны по составу белков и клеточных стенок (габл. 3,4,.5, рис.Ц2>. tía основании этого мы предлагаем реклассифицировать Alb. themwcilcaliphiluni АС60 г, качестве референтного штамма вил;; Aít; ih^rinoautoíhrophicum. Прежнее название Mb. thermuakallphihtir* мы !ip-j;t.'í,'irac\t счvV.iíi синонимом Ml thertriQúuto:rop/iiíNi,i, Ъ свил: с включением г аки,: . Mf f,}icnno(i\tlot;ovhicíit>'. íirv\ алк:,лицп!.пьны). апаммоь. ми иредчагаем ;„н:олкит1 рпнеапи: rrore- hh;i¡. (Zriku- с; vVolíe., ¡972, lousei el »:.,W2> 'Л^соиностыо к o¡;гииа.'^л.ому poe~v' некоторых 1нтаммог- при шелочпь!> значения-., о:' 'i.b-i..?.

Llir.iMMb i i. 7". л > у.У I-:,.":.;;: w,/. '1; ^ i i/ n,^'::; ;>!.'! ..i, '

loitoí l>¡.!i7!.>hb,"; i l,¡ >.'Ir. 1: oi л ,:1]лк''[, огдр\ги\ ¡.ii.w.mo'. ju' ct'c'i;,!',

i i. :::;' гчч'1.:'-. 3n. í м^рфа-сри-нкмогпчегкис отличи*.

шг;;мм[»г /.Г)У. !í. '¡;: iвыде.'шп и>", l соответствии . требованиями

iKOkOMíiieTá nt.-описан,-¡к нлы). тпкеонон ме¡апогенои íVVh;ur::ni ata. Ьооле, l■ i иппьи ви'1ь: filt. 1".snnophiiait, ц„ um M, t . BKNí Ь-I'M, = OS'v" 6530;: A/ew»«'«WM.IcrtM». ¡Utrrn'ijiciu't sf r,;n ID,".. ;» BKk. b-19t>3.»DSM 71Ш, i hlethimobuittrtun, ckfiuvi. sp. n<« AD7,, (BKM Б-1962. = DSM 74b6>. прияж указанные штаммы за типовые.

выводы

1. Из различных источников выделены 8 чистых культур термофильных

метанобразующих бактерий. Детально изучены морфологические и физиолого-биохимические признаки изолятов.

2. На основании фенотипических и хемотаксономических признаков штаммы TS-1

и TS-2 отнесены к виду Ms. thermophila. Высокая скорость роста штамма TS-2 на ацетате, а также использование им для роста и метаногенеза широкого спектра субстратов (Н2/СО2, ацетат, метанол, moho-, ди-, и триметиламины) позволяют считать этот организм перспективным для использования в биотехнологии.

3. Проведен комплексный таксономический анализ группы термофилов рода

Methanobacterium, включающий ДНК-ДНК гибридизацию, сравнительный иммунологический анализ, нумернческий анализ состава общих белков и анализ клеточных стенок. Показано, что: а) изоляты DV, 7VF, TF-1 принадлежат в виду Mb. thermoautotrop/iicum; б) Mb. tltermocilcaliphilum АС60 и Mb. thennoautolrophicumkll принадлежат к одному серотипу, геновиду, а также сходны по ряду других фенотипических признаков. На основании этого ликвидирован вид Mb. thermoalcaliphilum, а штамм АС60 реклассифицирован в качестве референтного штамма вида Mb.thermoautotrophicuni. Составлен новый диагноз вида Mb.thennoautotrophicum.

4. Сравнение фенотипических признаков с геиосистемагическими и

хемотаксономическнми характеристиками термофильных представителей рода Methanobacterium, показало, что способность к потреблению формиата и степень алкал ифильности, которые ранее рассматривались а качестве видоспецифичных и дифференцирующих признаков, таковыми не являются.

5. В соответствии с требованиями Международного подкомитета по систематике

метаногенных бактерий описано три новых вида термофильных метанобразующих бактерий: Mahunobaacrium ihermnphilam sp. nov., Methanobacterium defluvii sp. nov., Methanobacterium thermojlexum sp. nov.

6. Впервые показано наличие глицина в составе клеточных стенок термофил!.пых

бактерий рода Methanobacterium. в частности, для Mb. ihermnaigregans, Mb. thennopfiilum, Mb. defluvii.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Котельникова С.В., Новоа М.- К., Образцова А. Я., Лауринавичус KtCM Акимснкс В.К. Характеристика термофильных мстаносарцин, выделенных из люберецкого и гаванского мстантснков. Сб. тез. Всесоюз. конф. " Биоконверсия-88" - Рига. - 1988. - С.64.

2. Лауринавичус К.С., Котельникова С.В.. Образцова А,Я. Новый ьид термофильных метанобразуюших бактерий Мethanobacierium thermophUum / / Микробиология.-19S8.-Т. 57.-Выг:. б.-Стр. 1035-1041.

3 Щербакова В.А., Образцова AS., Лауринавичус К.С., Котельникова С.В., Акименкс

B.К., Навоа М.-К., Круз М. Физиологические свойства термофильных метзносарцин, выделенных из активного ила мстантснков. / / Микробиология. - 1991.- Т.60.- Вып.З - С.466-472.

4. Лауринавичус Х.С., Образцова А.Я., Котельникова С.Е. Термофильные водород используюшие метаногены, // Архебактерии, СС. науч. тр. ред. Г.А.Заварзин. Пушинс. -C.Z1-2?.

5 Образцова А.Я., Котельникова С.В., Штзркман Н.Б., Галушко А.С., Лауринавичюс К.С., Акименко В.К. Биологическая очистка сточных вод. Анализ микроорганизмов метаногенного сообщества. / / Сб. Тез. Всесоюз. Конф. и Микробиология охраны биосферы в регионах >рала и Северного Прихаспия" Оренбург. - 1991. - С.94-93.

6. Котельникова С.В., Лысанская В.Я., Образцова А.Я. Химический состав клеточных стенок термофильных штаммов рода Methanobacterium,/ / Микробиология. - 1993. - Т.62, Выл.5. -

C.963-967.

7. Kotelnikova S.Y., Obrazsova A.Ya., Laurinavichus K.S., Akimenko V.K. Characterization of a thermophilic rod-like mcthanogen. Comparative immunological and protein analysis of Methanobacterium spp. //USSR-FRG Bilateral Symposium "Archaebacteria" abstracts, Tbilisi, 1990 P.25.

8. Kotelnikova S.V., Obraztsova A.Za., Laurinavichus K.S., Gongadze G.M. Isolation of new species of thermophilic methanogenic bacteria from ihe industrial digestor. // "Thermophiles-. science and technology.", Rekjavik, Iceland. - 1992. - P.72.

9. Kotelnikova S.V., Obraztsova A.Y., Blotcvogel K.-H., Popov I.N. Taxonomic analysis of thermophilic strains of the genus Methanobacterium. Reclassification of Methanobacterium thermoalcaUphllum as a synonym of Methanobacterium thermoautotrophicum. ( / Int. J.Syst.Bact. 1993., V.43\3, P.591-596.

10. Kotelnikova S.V., A.Y. Obraztsova, G.M.Gongadze, K.S. Laurinavichus. Methanobacterium therrnoflexum sp. nov. and Methanobacterium. defluvit sp. no v., thermophilic rod-shaped methanogens isolated from the pilot-scale plant for digesting the metacrilic wastes. // System, and Appl. Microbiol. 1993. V.16\3. P.427-435.