Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаногенные микробные сообщества в охране окружающей среды

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Метаногенные микробные сообщества в охране окружающей среды"

российская академия наук

институт микробиологии

На правах рукописи УДК 579.851.11/12 - 262

НОЖЕВНИКОВА Алла Николаевна

МЕТАНОГЕННЬЕ МИКРОБШЕ С00Б1ЕСТВА В ОХРАНЕ ОКРУХАЮЯЕЙ СРЕДЫ

С03.00.07 - микробиология)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1994

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН Научный консультант член. -корр. РАН Г. А. Заварзин. Официальные оппоненты:

член-корр. РАН, профессор Л. В. КАЛАКУЦКИИ

доктор физико-математических наук В.А. ВАВИЛИН

доктор биологических наук С. С. БЕЛЯЕВ

Ведущая организация:

Кафедра биологии почв. Почвенный факультет МГУ, Москва

Защита диссертации состоится £-1994 г. в X/часов

на заседании Специализированного Совета Д. 002.64.01 по защите дисертаций при Институте микробиологии РАН, по адресу: 117811 Москва, Проспект. 60-летия Октября, д. 7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Диссертация разослана с 1994 г.

Ученый секретарь ^

Специализированного совета /у/

кандидат биологических наук ^О/С^сУгсг^^^

Л.Е. НИКИТИН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Анаэробная деградация органических соединений с образованием метана является важнейшим звеном в круговороте веществ в биосфере. Метаногенез осуществляется в таких естественных экосистемах, как почва, осадки водоемов, болота, желудлчно-кишечный тракт животных, а также в биотехнологических сооружениях систем анаэробной обработки отходов, играющих значительного роль в глобальной экологии.

Биотехнология охраны окружающей среды представляет одну из наиболее актуальных проблем современности. Она направлена на защиту в первую очередь вод от промышленных и сельскохозяйственных стоков и коммунальных отходов. С другой стороны, важным направлением авляется защита атмосферы от парниковых газов, важнейшим из которых является метая, образующийся при анаэробной деградации отходов в местах их концентрации. Общий объем органических отходов в России составляет около 250 млн. тонн в год по сухому веществу. Ежегодно образуется более 12 юР жидких стоков, порядка 600 млн. тонн навоза и не менее 20 мля. тонн* твердых городских бытовых отходов. Каждый из типов отходов представляет опасность для окружающей среды. Для России, с характерными для нее гигантскими производствами и локальным образованием большого количества сточныых вод и других отходов, всегда стояла проблема их эффективной оработки, которая чрезвычайно обострилась в настоящее время. Биологические методы очистки и стабилизации органических стоков давно завоевали признание, но в большинстве своем традиционная энергоемкая аэробная технология оказывается недостаточно эффективной для многих производств. Для очистки концентрированных стоков и отходов единственно приемлемой является анаэробная обработка, которая, благодаря положительному выходу энергии в виде биогаза, представляет энергосберегающую природоохранную технологию.

Основой анаэробной обработки отходов являются метаногенные микробные сообщества, представляющие действующий инструмент в анаэробных реакторах, где создаются условия, часто существенно отличающиеся от природных. Исследование микробных сообществ представляет собой новый этап развития микробиологии, которая в

- I -

течение века занималась преимущественно изучением чистых культур микроорганизмов. Однако, в биотехнологии окружающей среды для деградации разнообразных веществ требуется участие большого количества различных микроорганизмов, тем более в анаэробных условиях, где из-за низкого энергетического выхода осуществляемых реакций, микроорганизмы в сообществах находятся в чрезвычайно тесных трофических взаимосвязях. Изменение условий среды ведет часто к перестройке всего сообщества. Разнообразие условиий при обработке различных типов отходов обуславливает и разнообразие микробных сообществ, приспособленных к ним. Постановка задачи исследования метаногенных микробных сообществ, развивающихся в системах анаэробной обработки отходов представляется актуальной.

Состояние вопроса. Не имея возможности из-за ограничения объема подробно останавливаться на анализе известных на сегодняшний день данных в области исследования метаногенеза из сложных органических соединений и метаногенных сообществ, мы попытаемся ниже кратко изложить основные сведения, имевшие непосредственное отношение к теме диссертации и известные к начальному периоду нашей работы.

История изучения метанового брожения насчитывает более двух столетий со времени открытия горючего "болотного газа" Вольта в 1776 г., а начало практического применения метаногенеза для обработки сточных вод относится к 1895 г., когда в Экзетере САнглия) был введен в эксплуатацию первый метантенк. Метановые бактерии были открыты Эенгеном в 1906 г, который работая со смешанными культурами, установил строгую специфичность метановых бактерий к используемым субстратам. Благодаря разработке метода выделения строгих анаэробов (Нипда1е, 1969), вскоре начался бум в изучении метановых бактерий: выделялись и описывались новые виды, установлена принадлежность метановых бактерий к новой ветви живого мира - АгЬеа, активно исследовалась биохимия образования метана и механизм запасания энергии. В настоящее время группа метановых бактерий включает 18 родов и более 60 видов. Наряду с метаногенами исследуются другие строго анаэробные бактерии: целлюлолитики, бродильщики, гомоацетогены, синтрофные или протонвосстанавливающие бактерии. Эти бактерии участвуют в образовании метана из сложных органических соединений и являются компонентами метаногенных

- 2 -

микробных сообществ, их выделяют как из природных мест обитания, так и из реакторов для анаэробной обработки отходов. Постепенно были разработаны представления о метаногенезе из сложных субстратов как о многоступенчатом процессе и в целом сформулировано понятие о метаногенном микробном сообществе как системе, в которой составляющие его организмы находятся в тесном трофическом взаимодействии (McCarty, 1964; Toerin, Hatting, 1969; Kaflcevich et al., 1972; Ianotti et al.f 1973; Schefinger et al., 1975; Бонч-Осмоловская, 1976, 1982; Balch et al., 1979; Беляев 1988; Заварзин, 1986; Zehnder, ed., 1988).

Анаэробный метод обработки отходов долгое время применялся в основном для стабилизации осадков водоочистных станций и отходов животноводства. Однако с началом энергетического кризиса 1970-х гг. биотехнология анаэробной очистки привлекла особое внимание в связи с идеей получения биогаза как энергетического источника для локальных потребителей. Постепенно, однако, интерес сместился к малоэнергоемким методам охраны окружающей среды. Огромное количество работ было посвящено технологическим аспектам анаэробной обработки отходов с образованием метана, анализ работы 540 анаэробных реакторов приведен в монографии "Биогазовые заводы в Европе" (Denuonk et al., 1984). Интерес к этой проблею был существенным и в СССР, подавляющее большинство работ было посмчано технологически» аспектам сбраживания полужидких отходов -навоза и осадков сточных вод. В этой связи следует отметить работы М.Е. Беккера, А. А. Ковалева, Л. И. Монгайта, Л. И., Е.С.Панцхавы, Л. И. Гюитер, Д. А. Даниловича, А.Г.Пузанкова, Д.В.Унгуряну и др.

Революционным, в развития анаэробной технологии очистки сточных вод была разработка реакторов нового поколения с удержанием активной биокассы в них - анаэробного биофильтра с прикрепленным ростом микроорганизмов СYoung, McCarty, 1969) и особенно разработанного Леттингой CLettlnga et al, 1982) реактора с подачей среды снизу CUASB-реактор), в котором активная биомасса агрегируется в гранулоподобные структуры, удельный вес которых вше удельного веса воды, что препятствует нх выносу из реактора.

Центральной теоретической проблемой при исследования штаягенеэа хах в природных условиях, так и а бяотехнологическнх

- 3 -

сооружениях оказалось изучение особенностей взаимодействия популяции специфических видов микроорганизмов между собой в сообществе микроорганизмов. Было показано, что при мезофильном и умеренно термофильном процессах порядка 70У. метана образуется из ацетата (Smith, Mah, 1966; Cappenberg, 1974), рассчитаны потоки углерода и энергии при разложении органических соединений (Gujer, Zehnder, 1983). Большое внимание было уделено изучении синтрофного разложения летучих жирных кислот. Начало этим исследованиям было положено работой Бриана с сотрудниками, показавшими, что "Methanobacillus omelianskii" представляет собой смесь двух культур (Bryant et al., 1977). Тауэром с сотрудниками была рассчитана термодинамика основных анаэробных реакций и показана ключевая роль удаления водорода из метаногенной системы. При этом поток электронов с НАД.Н смещается в сторону образования молекулярного водорода, и становятся термодинамически выгодными реакции расцепления спиртов и летучих жирных кислот с образованием водорода, ацетата и углекислоты (Thauer et al., 1977). Значительное количество работ было посвящено экспериментальной верификации этих расчетов, были выделены синтрофные бактерии и исследовано разложение спиртов н летучих жирных кислот в системах, где водород потреблялся метановыми или сульфатредуцируюими бактериями, сформированы представления о функционировании метаногенных сообществ рубца жвачных, осадков водоемов, метантенков (Mclnerny et al., 1979; Boone, Briant, 1980; Mounfort, Briant., 1982; Жялина и др., 1984; Roy et al., 1986, Бонч-Осмоловская, 1982). На основании этих работ Заварзиным (1986) была . разработана концептуальная модель функционирования метаногенного микробного сообщества, учитывающая ингибирующий эффект промежуточных продуктов. Исследованию регуляторной роли ацетата в метаногенной системе, в частности, при разложении спиртов и летучих жирных кислот не уделялось достаточного внимания.

Значительное количество работ было посвящено исследованию самоорганизации метаногенного сообщества и агрегирования биомассы в реакторах нового поколения с восходящим потоком среды через слой активного ила (UASB-реактор), исследовались структура биопленок и гранул, видовой состав микрофлоры, ее численность и плотность,

- 4 -

соотношение представителей различных физиологических групп CLettinga et al., eds., 1988). В России и бывшем СССР до недавнего времени такие исследования не проводились, хотя Жилиной С1974) был показан агрегированный рост метаносарцины, и отмечено тесное взаимоотношение метаногена с гетеротрофными и сульфатредуцирующими спутниками.

Метаногенез в экстремально термофильных условиях исследовали в основном в гидротермальных экосистетах, откуда выделен ряд водородиспользуюшдх метаногенов, в том числе экстремально термофильных, имеющих температурный оптимум при 83-9$ С (Stetter et al., 1981; Jones et al., 1983). Считалось, что температура 65°C, являющаяся лимитирующей для ацетокластического и синтрофного разложения ацетата с образованием метана является температурным пределом для метаногенеза из органических веществ при обработке отходов (Zinder, 1988).

Об образованию! метана в психрофильных условиях имелись отдельные работы, в которых было показано, что в природных экосистемах происходит образование метана при низкой температуре CSvenson and Rosswal, 1984; Harris et al., 1985). Проводились исследования биотехнологических аспектов сбраживания отходов животноводства при пониженной температуре и было сделано заключение, что температура 15°С является лимитирующей для практического применения психрофильного , процесса (WellInger, Kaufmann, 1982; Zeeman et al., 1988). Детального исследования психрофильных метаногенных сробществ не проводилось.

Особый интерес представляет образование метана при кислой реакции среды, поскольку все известные метановые бактерии имеют оптимум в нейтральной зоне pH и повышение кислотности как правило полностью ингябирует процесс метаногенеза. "Захисление" в анаэробных реакторах является наиболее распространенной причиной сбоя и остановки процесса. Тем не менее образование метана наблюдается в верховых болотах с pH 4-5 CWillians, Crawford, 1984). О возможности существования облигатно ацидофильного метаногенного сообщества сведения отсутствовали.

Полигоны захоронения городских твердых бытовых отходов СТБО) представляют собой места концентрации биодеградабельных органических веществ по масштабу не имеющие аналогов в природе, в

- 5 -

которых происходит спонтанное формирование иетаногенного сообщества и развитие процесса иетаногенеза. Благодаря величине объектов масштабы образования метана на них имеет глобальное значение (Rotmans et al., 1992). В то же время это один из важнейших источников парниковых газов, вредное влияние которого может быть уменьшено путем усовершенствования методов захоронения отходов, эксплуатации и рекультивации полигонов и свалок. Объекты захоронения ТБО изучались в основном с точки зрения их воздейстия на окружающую среду, усовершенствования технологии организации полигонов ТБО и разработки систем добычи биогаза. Были выполнены отдельные работы по определение состава анаэробной микрофлоры и учету численности бактерий CBarlaz, 1988). Комплексного изучения биогеохимических процессов в местах захоронения твердых бытовых отходов с применением микробиологических, геохимических и изотопных методов не проводилось. Практически не принималась во внимание активность газооисляющей микрофлоры, разивающейся в аэрируемом слое грунта.

Таким образом, к началу наших исследований была проведена значительная работа по выделетю, описание и исследованию физиологии и биохимии метаногенов и некоторых других анаэробов, накоплены сведения по их взаимодействиям в метаногенных сообществах рубца жвачных, осадках водоемов, метантенках. В целом, по сравнению с изучением чистых культур метановых бактерий, их физиологии и биохимии, изучению метаногенного микробного сообщества, как целого, а также разнообразию метаногенных сообществ различных экосистем уделялось гораздо меньше внимания.

Одновременно с нами изучение метногенеза и метаногенных сообществ проводилось во многих лабораториях мира, в том числе и в нашей стране. Микробиологические, биохимические и кинетические аспекты проблемы исследовались в лабораторих академика М.В. Иванова (ИБФМ РАН, ИНМИ РАН), д.б.н.'В.К.Акименко СИБФЮ, д.б.н. Е. С. Панцхавы, д.б.н. Быховского СИНБИ РАН), проф. С. Д. Варфоломеева (МГУ), д.ф-м.н. В.А. Вавилина С Институт водных проблем РАН); биотехнологические и инженерные разработки проводились во Всесоюзном Институте электрификации сельского хозяйства Ск.т.н. A.A. Ковалев), в Московском научно-исследовательском и проектном Институте водоснабжения и

- 6 -

канализации СЛ.И. Монгайт, Д.А. Данилович), в Раменском филиале ВНИИ ядерной геологии (к.ф-м. н. О.В. Горбатюк, д.г-м.н. B.C. Лебедев), в Академии коммунального хозяйства Сд.б.н. Л.И.Гюнтер), и др. Со многими из них было налажено плодотворное сотрудничество.

Цель работы. Целью работы было провести сравнительное исследование метаногенных микробных сообществ, определяющих эффективность процесса деградации сложных органических соединений и развивающихся при разных физико-химических условиях среды, в том числе неблагоприятных и экстремальных, и разработать научные основы регулирования развития и деятельности этих сообществ для интенсификации процессов в биотехнологических сооружениях, а также для понимания потенциальной способности экосистем, находящихся под антропогенным воздействием, к самоочищению посредством анаэробной деградации загрязняющих веществ и в некоторых случаях последующего окисления образующегося мотана .

Для достижения поставленной цели представлялось важным более детально исследовать последовательные стадии деградации сложных органических веществ метаногенным сообществом микроорганизмов и регуляторную роль водород- и ацетатиспользующих метановых бактерий, при этом в первую очередь предстояло найти и выделить организм, ответственный за потребление ацетата в сообществе. Для повышения эффективности анаэробных процессов в биотехнологических сооружениях необходимо было проанализировать работу существующих реакторов первого поколения (ыетантенков) и исследовать процесс агрегирования активной биомассы, что позволяет повысить ее концентрацию в реактора. Исследование метаногенеза в неблагоприятных и экстремальных условиях С при избытке сульфата, кислой реакции среды, повышенной и низкой температурах, пониженной влажности) представлялось важны?! провести с целью установления пределов устойчивости процесса, сравнения метаногенных сообществ и путей разложения органических веществ и образования метана.

Работа включала последовательное выполнение перечисленных ниже задач:

I) исследование лимитирующих ступеней и регуляторных факторов в метаногенных сообществах, функционирующих в мезофильных и умеренно термофильных условиях;

- 7 -

2) изучение процесса самоорганизации (агрегирования) метаногенных микробных сообществ и его роли в биотехнологии;

3) исследование метаногенеза в неблагоприятных и экстремальных условиях: при высокой кислотной реакции среды, при температуре выше 65°С, в психрофильных условиях;

4) исследование процессов образования и окисления метана в местах захоронения твердых бытовых отходов.

Научная новизна работы. Исследованы лимитирующие ступени метаногенеза из сложных субстратов, определяющие скорость процесса: I) гидролиз трудноразлагаемых полимеров, 2) этапы синтрофного разложения спиртов и ЛШ; 3) стадия ацетокластического метаногенеза. Показано, что эффективность работы метаногенного микробного сообщества в решающей степени зависит от накопленной активной биомассы функциональных групп микроорганизмов, определяющих узкие места. Экспериментально подтверждено, что критическим для системы является удаление водорода метановыми или гомоацетатными бактериями. Исследована роль водорода как регулирующего фактора в метаногенной системе и впервые установлены его пороговые концентрации для разных температурных режимов.

Установлено, что полнота превращения органических соединений и скорость метаногенеза в мезофильных и умеренно термофильных условиях определяются наличием ацетокластических метаногенов, способных усваивать ацетат при его низкой концентрации в системе. Открыт и описан новый вид термофильных ацетокластических ацетогенов Ме1Ьапо1Ьг1х ^егтоасе^рЬИа. Впервые экспериментально установлена регуляторная роль ацетата при разложении летучих жирных кислот и спиртов.

Установлены микробиологические закономерности и даны характеристики облигатных анаэробов в метантенках первого поколения. Подобраны условия для формирования метаногеннных обрастний в биореакторах второго поколения (анаэробный биофильтр), что было использовано при разработке технологии и проектировании установки для анаэробной очистки животноводческих и промышленных стоков.

Впервые с нащей стране проведено изучение закономерностей формирования агрегированных метаногенных консорциумов (гранул) в

- 8 -

оиореакторах третьего поколения сиАБВ-реакторах), работавших на различных типах промышленных стоков.

Получено облигатно-ацидофильное метаногенное микробное сообщество с метаносарциной в качестве ведущей формы.

Показана возможность разложения ацетата с образованием метана при температуре 70-75°С, исследованы агрегированные микробные консорциумы, развивающиеся в экстремально термофильных условиях и обнаружена синтрофная ацетатиспользующая метаногенная микрофлора.

Исследованы процессы анаэробной деградации органики в психрофильных условиях микрофлорой гиперевтрофицированного загрязненного водоема, сброженного навоза и тундрового болота. Показано, что при понижении температуры ниже 15° С литотрофный ацетогенез начинает преобладать над метаногенезом, водород используется с образованием ацетата, который становится основным предшественником метана в психрофильном сообществе.

Впервые установлено зависимое от температуры различие направлености процессов непосредственно предшествующих образованию метана: если в психрофильных условиях образованию метана из водорода и углекислоты, формиата, окиси углерода предшествует синтез ацетата, то в экстремально термофильных условиях синтез метана предваряет ацетокластическое расщепление ацетата до водорода и углекислоты.

Проведено комплексное исследование микробиологических процессов в полигонах захоронения ТБО и показано, что несмотря на крайнюю гетерогенность систёмы, существует закономерная смена слоев с качественно различной микробиологячесикй активностью. Показано, что верхний аэрируемый слой грунта при определенных условиях его формирования может служить биологическим фильтром, предотвращающим С или снижающим} проникновение в атмосферу метана и других окисляемых газов.

Произведена оценка масштабов газогенерации и эмиссии метана в атмосферу с полигонов захоронения ТБО на территории СНГ.

Практическая значимость работе. Получены результаты, расяиряющие знания о разнообразия микробного мира я о функционирования микробных сообиеств, к исследованию которых найдены новые подходы. Описан я узаконен новый вид

- 9 -

ацетатиспользующей метановой1бактерии, выделены в чистые культуры новые психроактивные анаэробные бактерии. Создана коллекция метаногенных микробных сообществ, адаптированных к разложение различных загрязнений и к различным условиям среды.

На основе изученных микробиологических закономерностей разработаны принципы применения анаэробных методов для обработки различных отходов, послужившие основой для строительства завода по анаэробной обработке животноводческих стоков в Крымской области, опытно-промышленного анаэробного реактора для очистки жидких отходов виноделия на Объединении Массандра, пилотной установки для очистки сточных вод Сыктывкарского Лесо-промышленного Комплекса, опытной установки по добыче биогаза на полигоне захоронения бытовых отходов в Кучино Московской обл., разработаны рекомендации по уменьшению вредного воздействия свалок на воздушный бассейн города.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 14 международных и II всесоюзных совещаниях, конферециях и симпозиумах, это: V, VI и VII Международные симпозиумы "Рост микроорганизмов на CI-соединениях" СГронинген, 1986; Геттинген, 1989, Варвик, 1992); Биотехнологический симпозиум социалистических стран (София, 1986); V Международный симпозиум "Анаэробное сбраживание" СБолонья, 1989); VIII Международный Биотехнологический симпозиум СПариж, 1988); Международный симпозиум FEM3 "Межвидовой перекос водорода у строгих анаэробов" (Марсель, 1989); Международная конференция по биотехнологии (Мерзебург, 1989); Билатеральный симпозиум СССР-ФРГ "Архебактерии" (Тбилиси, 1990), Международный биогеохимический симпозиум (Москва 1989); Совещание СЭВ по возобновляемым источникам энергии (Крым, 1989), VI Международная конференция "Механизация в сельскохозяйственном производстве" (Пекин, 1991); Международный симпозиум "Анаэробное сбраживание твердых отходов" (Венеция, - 1992); Международная конференция по глобальным изменениям и экосистемам арктических территорий (Опдал, 1993); Всесоюзная конференция "Анаэробные микроорганизмы" (Пущино, 1982); Всесоюзная конференция по переработке растительного сырья (Рига, 1983); Всесоюзное совещание по анаэробной обработке навоза (Таллин,

- 10 -

1983); Всесоюзная конференция "Термофильные микроорганизмы в природе и на службе народного хозяйства" (Пущино, 1983); Всесоюзное совещание "Техническая биоэнергетика" (Саратов, 1985); Всесоюзная конференция по вулканологии (Москва, 1985); Всесоюзная конференция по возобновляемым источникам энергии (Ереван, 1986); Всесоюзная конференция "Биоценоз в природе и промышленных условиях" (Пущино, 1987); П Всесоюзная конференция "Техническая биоэнергетика" (Рига, 1987); Республиканская конференция "Анаэробная очистка сточных вод" (Кишинев, 1988); Всесоюзное рабочее совещание по архебактериям (Пущино, 1988).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 76 работ, в том числе более 50 статей в отечественных и международных изданиях. Основные материалы диссертации обобщены в монографии "Анаэробная очистка сточных вод" [43], брошюре "Технологические линии утилизации отходов животноводства с получением биогаза и удобрений" I361 и 6 обзорных и обобщающих статьях: "Микроорганизмы и биотопливо" [22], "Рост и развитие метановых бактерий в смешанных культурах и ассоциациях" Г44], "Анаэробное разложение органических веществ психрофильными микроорганизмами" [49], "Emission of methane from landfills into atmosphere in the former USSR" [66], "Landfills and waste deposits producing greenhause gases" [70], "Acetogenesis at low temperature" [72]. По теме диссертации получено 3 авторских свидетельства.

Место проведения работы. Работа в основном проводилась в Институте микробиологии РАН в лаборатории микробных сообществ, возглавляемой член-корреспондентом РАН Г.А.Заварзиным, и являлась частью плановой тематики лаборатории. Исследование метаногенеза в неблагоприятных и экстремальных условиях частично было выполнено в Университете Вагенингена (Нидерланды) и Технолгическом Университете Тампере (Финляндия). В работе участвовали сотрудники Института микробиологии РАН, Раменского филиала ВНИИГеоинформсистем, Всероссийского Института электрификации сельского хозяйства, Московского Государственного Университета (МГУ), Университета Вагенингена (Нидерланды), Технологического университета Тампере (Финляндия) и других институтов, чей вклад в

- II -

работу отмечен в соответствующих разделах диссертации, а также отражен в публикациях, приведенных в списке литературы. Всем им автор выражает сердечную благодарность за помощь в организации и проведении исследований.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному консультанту член-корр. РАН проф. Г. А. Заварзину за внимание к работе и ценные советы.

ОСНОВНЫЕ ЗАЩИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Взаимодействие микроорганизмов в метаногенном микробном сообществе есть определяющий механизм как для метаногенеза в природных -условиях, так и для крупнотоннажной анаэробной технологии обработки отходов. Оно определяется как качественными, так и кинетическими характеристиками микроорганизмов, входящих в систему. Метанобразующие бактерии, замыкающие трофическую цепь, определяют скорость всего процесса. Водород и ацетат являются ключевыми факторами в метаногенной системе. Удаление их из системы, осуществляемое в отсутствие сульфатов гомоацетатными (для водорода) и метановыми (для обоих субстратов) бактериями, поддерживает низкую концентрацию этих метаболитов и определяет сбалансированную работу сообщества и скорость процесса.

2. Формирование и развитие метаногенного сообщества происходит путем автоселекции природной микрофлоры на конкретных субстратах и при определенных физико-химических условиях, в том числе неблагоприятных и экстремальных, к которым сообщество оказывается приспособленным. Для инициирования развития метаногенного микробного сообщества предпочтительно использовать материал, содержащий по возможности максимально разнообрзную анаэробную микрофлору. В ответ на изменение условий среды метаногенное микробное сообщество отвечает перестройкой своей структуры, включая смену микробного состава.

3. Метаногенез из органических субстратов осуществляется в широком интервале температур. В экстремально термофильных условиях С70 - 7Е?С) основным предшественником метана является водород, а образование метана из ацетата происходит в результате двухступенчатого процесса по пути синтрофного механизма, вначале

- 12 -

ацетат разлагается на водород и углекислоту и затем из них синтезируется метан.

4. В психрофильных метаногенных сообществах основным предшественником метана является ацетат. Водород преимущественно используется гомоацетатными бактериями с образованием ацетата, который затем разлагается ацетокластическими нетаногенами с образованием метана. Метаногенез при пониженной температуре в биотехнологических сооружениях может осуществляться сообществом, отселекционированным из биомассы мезофильного активного ила и представленным в основном психроактивными мезофильными микроорганизмами. В природных экосистемах с постоянно низкими температурами сообщество представлено психротрофными и, возможно, псикрофильными организмами.

5. Агрегированное развитие метаногенных сообществ, особенно с образованием гранулоподобных структур, представляет собой уникальный пример естественной самоорганизации микробного сообщества в искусственных сооружениях, при этом достигаются оптимальные условия для массопереноса и функционирования сообщества. Развитие новых гранул происходит при наличии центров инициации гранулообразования, которыми могут быть твердые частицы, на которых происходит первичная сорбция бактерий из суспензии, макроколонии метаносарцин, колонии метанотрикса.

6. Технология анаэробной очистки должна следовать биологическим характеристикам живых компонентов системы, которая обладает широкими возможностями саморегуляции. Однако нарушение пределов устойчивости системы ведет к ее переходу в иное (неравновесное) состояние. Факторами, определяющими этот переход, являются физико-химические условия среды, такие как тип и концентрация обрабатываемого сырья, температура, рН, концентрация промежуточных продуктов. Решающее значение имеет организация сообщества в физическом пространстве, то есть геометрия реактора и организация потока в нем, обеспечивающие удержание активной биомассы.

7. Полигоны захоронения городских твердых бытовых отходов представляют собой места концентрации свежей биодеградабельной органики, по масштабу не имеющие аналогов в природе, в которых спонтанно развиваются микробные сообщества - метаногенное в

- 13 -

анаэробной зоне и метанотрофное в верхнем аэрируемом слое.грунта. Процессы образования и окисления метана уравновешиваются только при небольших масштабах свалочных отложений, в противном случае полигоны захоронения ТБО являются важным источником парниковых газов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Метаногенез является основным процессом при анаэробной деградации органического вещества в континентальных экосистемах. Деградация сложных органических веществ осуществляется как ступенчатый процесс, в котором углерод-углеродные связи постепенно разрушаются под действием различных групп микроорганизмов, составляющих метаногенное микробное соощество. Основными группами являются гидролитическая, бродильная, синтрофная и метаногенная микрофлора. Первичные анаэробы осуществляют разложение органического вещества до субстратов метаногенеза, таких как водород и углекислота, ацетат, метанол, метиламины, формиат. Ввиду субстратной специфичности метатаногенов, их развитие без трофической связи с бактериями предыдущих групп невозможно; в свою очередь, метановые бактерии, используя вещества, продуцируемые первичными анаэробами, определяют возможность и скорость реакций, осуществляемых этими бактериями.

Эти положения были уже сформулированы к началу нашей работы. Однако было важно выяснить более детально принципы регуляции и самоорганизации метаногенных микробных сообществ, в первую очередь функционирующих в мезофильных и умеренно термофильных условиях, характерных для биотехнологических процессов.

В природе деградация органического вещества с образованием метана происходит при различных условиях среды: от психрофильных в северных болотах и почвах до экстремально термофильных в гидротермальных системах, от ацидофильных в верховых болотах до алкалифильных в содовых озерах, от олигоминеральных в пресноводных водоемах до экстремально галофильных в соленых озерах. Практически любая природная органика, за исключением высокополимеризованного лигнина, и многие синтетические материалы разлагаются

- 14 -

метаногенными сообществами. В биотехнологии окружающей среды метаногенез используется для обработки сточных вод с содержанием органики от О,ГА, полужидких отходов животноводства, осадков сточных вод и твердых бытовых отходов городов, содержащих до 60'/. органических веществ. Метаногенные сообщества, функционирующие при различных условиях, различаются по своему составу и путям деградации органики. Например, галофильное метаногенное сообщество, исследованное Жилиной С1992), резко отличается от сообществ пресноводных систем.

Для нас представлялось важным, выяснить влияние условий, в которых развиваются метаногенные сообщества, на особенности их структуры и пути образования метана. С точки зрения экологии и природоохранной биотехнологии важно было исследовать метаногенез в психрофильных условиях, при повышенной температуре, при некоторых неблагоприятных условиях, которые могут создаваться а анаэробных реакторах и, наконец, при твердофазной ферментации городских бытовых отходов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обекты исследований и места отбора проб. Объектами исследования служили метаногенные сообщества ряда экосистем: альго-бактериальные маты гидротерм СКамчатка), сброженные и свежие отходы животноводства и свиноводства (Московская область. Крымская обл., Эстония, Латвия), сброженный осадок метантенков Курьяновской и Люблинской станций аэрации (Москва), активная биомасса лабораторных и промышленных анаэробных реакторов (МосводоканаНИИпроект, Москва; Университет Вагенингена и ряд компаний, Нидерланды; Технологический Университет Тампере, Финляндия), осадки загрязненного водоема (Сыктывкар), тундровая почва (Халмер-Ю, Коми), грунты полигонов ТБО и свалок (Москва и Московская обл.).

Подробные описания мест отбора проб и биотехнологических систем анаэробной обработки* отходов приведены в публикациях.

В работе использовали также культуры анаэробных бактерий, полученные от других исследователей: Methanosarcina vacuolata Z-761 C=DSM 2279), Methanosarcina mazei (=DSM 2083),

- 15 -

Methanobacterium thermoformicicum C=DSM 3720) CT.H. Жилина); Methanobacter iun thermoautotrophicum AH C=DSM I05cF) СА.Я. Образцова, КБФМ); Clostridium thermocellum Z-5; Methanothrix soehngenii C=DSM 2I39T), Acetobacterium woodii (=DSM 1030), A. wieringae (=DSM I911), A. carbinilicum (=DSM 2925), A. malikum (= DSM4I32) CH.Hippe, Германия).

Методы культивирования и выделения микроорганизмов. Для культивирования микробных ассоциаций и культур микроорганизмов обычно использовали минеральную среду Пфеннига, основанную на карбонатном буфере (Pfennig, 1965). Работу с пробами анаэробного материала, посевы, культивирование, выделение культур проводили в анаэробных условиях, используя методику Хангейта (Hungate, 1969) и ее модификации (Жилина, Заварзин, 1978). Накопительные культуры получали на элективных субстратах, для выледения чистых культур использовали метод серийных разведений в жидкой среде и выделение отдельных колоний. Детальное описание методов постановки опытов, микроскопического наблюдения и т.д. приведены в публикациях.

Аналитические методы исследования. Основными аналитическим методом исследования в нашей работе было хроматографическое определение газов, летучих жирных кислот и спиртов на газо-жидкостном хроматографе. В работе использовали также изотопные, энзиматические, химические, геохимические, биохимические методы анализа, подробно описанные в публикациях.

I. РЕГУЛЯЦИЯ ТРОФИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИИ В МЕЗОФИЛЬНОМ И УМЕРЕННО ТЕРМОФИЛЬНОМ МЕТАНОГЕННЫХ СООБЩЕСТВАХ

В практике анаэробной очистки традиционно применяются два температурных режима: мезофильный (30-4<? С) и термофильный (50-55°С). Эти температурные интервалы были определены чисто эмпирическим путем и совпали с температурными оптимумами большинства описанных гораздо позже метановых и других анаэробных бактерий, выделенных не только из метантенков, но и из природных экосистем с гораздо более низкой температурой. Лишь из естественных мест обитания с повышенной температурой в районах вулканической деятельности выделены термофильные анаэробные

- 16 -

бактерии с более высокими температурными оптимумами.

Задачей нашей работы на первом этапе было исследование метаногенных сообществ, функционирующих в меэофильных и умеренно термофильных условиях, обычно применяемых в практике анаэробной очистки. Целью исследования являлось изучение внутренних регуляторных факторов, определяющих стабильность жизнедеятельности этих сообществ, для чего необходимо было более детально исследовать лимитирующие ступени метаногенеза С"узкие места"), которыми являются ацетокластическое расщепление ацетата с образованием метана, синтрофная деградация спиртов и летучих жирных кислот, гидролитическое разложение полимеров СЗаварзин, 1986).

Основными объектами исследования были метаногенные сообщества метантенков и лабораторных реакторов для анаэробной обработки отходов животноводства и осадков городских сточных вод. Работа в значительной степени проводилась в рамках Комплексной программы научно-технической помощи странам СЭВ СКП НТП СЭВ), основной задачей была разработка энергосберегающей природоохранной технологии обработки сельскохозяйственных и коммунальных отходов, которая будет рассмотрена в разделе "Практическое применение метаногенеза".

1.1. Метанобразуюаие сообщества сброженных отходов.

1.1.1. Нормирование сбалансированного мвганогенного сообщества

и роль "заквасок" в биотехнологии анаэробной обработки отходов

Исследование проб сброженной массы из различных промышленных метантенков и лабораторных реакторов н сравнение их с исходным сырьем - свежим навозом или осадками сточных вод, показало, что они существенно отличаются по составу микрофлоры и интенсивности образования метана из сбраживаемого сырья и различных субстратов С2 , 8, 12 , 20, 23 , 24 , 36]. Основным отличием метаногенных сообществ сброженных отходов являлась высокая скорость потребления водорода, ацетата и летучих жирных кислот Стабл. I).

Численность водородиспользующих метановых бактерий в сброженной массе отходов была на 3-6 порядков выше, чем в исходном

- 17 -

Таблица I.

Образование метана из экзогенных субстратов микрофлорой нативного и сброженного в термофильных условиях навоза КРС в первые трое суток культивирования при 55°С, ммоль СН^/л среды в сутки

Субстрат, У. Нативный Сброженный

навоз навоз

Без субстрата 35 37,5

Н2 + С02 (4:I) 150 460

Формиат (0,3) ПО 320

Метанол (0,3) 43 675

Ацетат (0,3) 90 390

Этанол (0,3) 75 290

Бутират (0,2) 60 210

Пропионат (0,2) 40 105

сырье. На такую же величину была выше метанобраэ ующая активность ацетатиспользующих метаногенов [8, 29, 363. Эти результаты свидетельствуют о том,что при формировании метаногенного микробного сообщества из материала, содержащего богатую микрофлору, какими являются навоз и осадки сточных вод, происходит смена микрофлоры. Так, метаногенные сообщества сброженного навоза крупного рогатого скота существенно отличаются от сообщества свежего навоза и рубца. Хотя в рубце и кишечнике жвачных идет процесс образования метана, там он служит защитной реакцией для связывания образующихся в результате брожений водорода и углекислоты. Процесс анаэробного разложения органики в организме животного заканчивается образованием жирных кислот, которые всасываются в желудочно-кишечном тракте (Пивняк, Тараканов, 1982). Метан образущее микробное сообщество, сбраживающее навоз, напротив, отличается от метаногенного сообщества рубца жвачных высоким содержанием ситрофной микрофлоры, использующей летучие жирные кислоты, и метановых бактерий, использующих ацетат Стабл.

- 18 -

П. В свою очередь, мезофильная и термофильная метаногенные ассоциации различаются по видовому составу входящей в них метаногенной микрофлоры, однако родовой состав бактерий одинаков и в основном представлен родами Met.hanosarci.na, Methanot.hr 1х, Ме1ЬапоЬас1ег1ит С231.

Из практики эксплуатации метантенков на станциях аэрации, где процесс метаногенеза используется для стабилизации осадков и избыточного ила, известно, что для пуска нового метантенка и вывода процесса на рабочий режим требуется тем меньше времени, чем больше сброженного ранее осадка добавляется в качестве инокулята или так называемой "закваски" в начале процесса. При этом имеет значение температурный режим: в качестве инокулята предпочтительно использовать сброженный осадок из метантека, работающего при соответствующей температуре. Подобные наблюдения были сделаны также при работе с отходами животноводства. Для пуска анаэробных реакторов на сточных водах практически всех промышленных производств инокуляция материалом, содержащим метаногенную микрофлору, совершенно необходима [43].

В наших опытах по исследованию метанового сбраживания свежего навоза крупного рогатого скота СКРС) было отмечено два четких температурных максимума образования метана - при 38-40°С и при 52-53°С, причем увеличение температуры с 30° до 39°С увеличивало скорость образования метана на 20-30%, такие же результаты были получены с осадками сточных вод [12, 36]. В дальнейшем мы работали в интервалах оптимальных1 температур и рекомендовали их для практики эксплуатации метантенков.

Методом автоселекции из навоза КРС при температуре 35? С и 53°С были получены соответственно мезофильная и термофильная метанобразующие ассоциации микроорганизмов 2-СА-1001 и 2-СА-1002 [2, 3, 4], наиболее активные в той области температур, при которой проходило развитие метаногенных сообществ. Эти ассоциации были одними из первых микробных консорциумов, зарегестрированных как изобретения (Рыбальский, Лях, 1989). Нами был разработан метод ускоренной наработки заквасок. Он заключается в том, что автоселекция метаногенного сообщества проводится при соблюдении строго анаэробных условий и добавлении в качестве субстратов предшественников метана в последовательности: водород, метанол,

- 19 -

ацетат, бутират, пропионат. Добавление ассоциаций в качестве инокулята к свежему навозу, сырому осадку сточных вод и их сгущенным и жидким фракциям резко стимулировало и стабилизировало процесс метанового брожения, то есть обеспечивало быстрое формирование сбалансированного метаногенного. сообщества [12, 24]. При этом двухфаэность процесса, когда вначале накапливаются кислоты, а затем из них образуется метан, заметно сглаживалась, метан начинал образовываться практически сразу с высокой скоростью Срис. I).

Рис. I. Влияние добавления закваски (Z-CA-I00D на скорость образования метана из навоза крупного рогатого скота:

1 - сбраживание навоза в присутствии закваски;

2 - сбраживание навоза спонтанной микрофлорой.

В выполнении исследований по этому разделу принимали участие Т.Г.Соколова (Ягодина), P.A. Мельник, Т.Н. Жилина и др.

I.I.2. Водород, tau индикатор сбалансированности

метаногенного сообщества

Важнейшим регуляторным параметром в метаногенном сообществе является водород. В природных экосистемах его равновесные

Совместно с И.В. Боднаром были исследованы стационарные концентрации водорода з биогазе при сбраживании органических отходов и регуляторная роль водорода в метаногенных сообществах [25 , 25 , 30 , 40]. При высоких скоростях метаногенеза при сбраживании отходов животноводства и осадков сточных вод в стационарном режиме концентрация водорода в биогазе для мезофильного процесса составляла всего 5-6x10-3 У. С 5-6x10"^ атм., 5-6 ppmV), а для термофильного на порядок выше, не превышая 10-2% CIO" атм., 100 ppmV). Наблюдаемые уровни содержания водорода соответствуют пороговым концентрациям, при которых чистые культуры соответственно мезофильных и термофильных метанобразующих бактерия способны использовать его с образованием метана. Наши исследования показали, что концентрация водорода может служить индикатором состояния процесса в метаногенной системе. При нарушении равновесия в системе: изменении физико-химических условий среды (температура, рН, ЕЮ, увеличении концентрации субстрата, в частности, целлюлозы и промежуточных продуктов, наблюдается быстрое увеличение содержания водорода в газовой фазе. Наиболее

Таблица 2

Влияние концентрации кислот и рН на образование метана и водорода при сбраживании навоза КРС при 55°С*.

Кислота, г/л pH сн4. % н2. %

Контроль 7.25 18,0 3x1О-3

HCl 5,3 1,0 Ю"2 О

6,4 16,0 4x10

Ацетат, 4 5.4 Ю-2 10"!

6.0 0,15 I0"¿ о

7.5 20 ' 2x10

Пропионат, 4 5,2 Ю"§ IO"2 ,

6,0 6,85 I0"¿ 4 9xI0~o 7x10

Лактат, 4 5.35 6.4 IO"2 3,5 0.45 о 5x10 %

7,15 g 8x10

"Измерения производили через 36 часов после добавления кислот и установки рН.

сильный дестабилизирующий эффект на метаногенное сообщество оказывало увеличение концентрации пропионовой и масляной кислот, при этом ухе через несколько часов концентрация водорода в биогазе возрастала в 3-5 раз, а в гадкой фазе увеличивалась концентрация ацетата, продукция метана при этом резко падала или вообще прекращалась. Этот эффект усиливался при одновременном снижении pH и увеличении концентрации кислот (табл. 2). Метаногенная система тем быстрее приходила в равновесное состояние, чем более сбалансированным было микробное сообщество в начале эксперимента [25].

Таким образом, основным отличием сбалансированной работы метаногенного сообщества является высокая скорость потребления водорода и ацетата метановыми бактериями, обусловленная их высокой численностью [22, 43, 44].

1.2. Термофильрая ацетат-использующая метановая бактерия

Methanothrix Ihermoacetophi1а

1.2.1. выделение и характеристика Methanothrix

therwoacetophi la.

К началу нашей работы было показано, что в метантенках и илах пресноводных водоемов до 70-80% метана образуется из метильной группы ацетата CBusswell, 1952; Smith, Mah, 1966; Cappenberg, 1974), в то ie время было известно, что использовать ацетат в чистой культуре могли только представители рода Methanosarcina CStadtman, Barker, 1957; Жилина, 1978; Zinder, Mah 1979). Многие исследователи, начиная с Зенгена CSoehngen, 1910), наблюдали в мезофильных накопительных культурах на ацетате палочковидный организм, названный Methanobacterium soehngenii CBarker, 1956; Briant, 1974). Эту бактерию удалось выделить и описать под новым названием Methanothrix soehngenii Зендеру с соавторами (Zehnder et al., 1980; Huser et al., 1982). Одновременно и независимо от работы Зендера нами совместно с Т.Г.Соколовой СЯгодиной) при участии В.И. Чудиной была обнаружена и описана термофильная ацетатная метанобразующия бактерия Methanothrix thermoacetophila C=DSM 4774) [I, 5, 6, 13], сходная по морфофизиологическим признакам с Mt. soehngenii. Организм был обнаружен в пробах

- 22 -

переувлажненной почвы,, ила и разлагающихся альго-бактериальных матов гидротерм Камчатки, а также в метантенках, где сбраживались осадки сточных вод и навоз крупного рогатого скота. Штамм, выделенный из гидротерм, имел оптимум роста при 60-S? С, а штаммы из метантенков 50-55°С. Единственным субстратом роста для этой бактерии является ацетат, который превращается в метан в эквимолярных количествах. Организм обладает характерной морфологией, позволяющей идентифицировать его в смешанных культурах. Это неподвижные палочки размером 1,0-1,3x2,0-6,0 мкм, часто соединенные в нити, отдельные клетки имеют геометрически правильную форму циллиндра, в клетках часто присутствуют газовые везикулы, каждая клетка имеет чехол кольчатого строения, деление клетки начинается инвагинацией цитоплазматической мембраны и клеточной стенки, позже подстраиваются концевые пластинки чехла. Клетки Mt. thermoacetophila, также как и мезофильных метанотриксов Mt. soehngenii и Mt. concilii не люминесцируют при облучении ультрафиолетом, что связано с биохимическими особенностями синтеза метана из ацетата у метанотрикса СJetten et al., 1990). Видовое название Methanothrix thermoacetophila было узаконено, однако, в настоящее время предлагается пересмотреть систематику этого рода и переименовать его в род Methanosaeta CPatel, 1992), что нам не представляется целесообразным.

1.2.2. Роль Methanothrix thermoacetophila в "заквасках"

Метанотриксы обладают чрезвычайно низкой скоростью роста, время удвоения для мезофилов составляет порядка 4-5 суток (Zehnder et al., 1980; Huser et al. , 1982), а для Mt. thermoacetophila около 20 часов С1, 101. Поэтому для стабильной работы метаногенного сообщества важно накопить и удержать эти организмы в системе. Широкое распространение метанотриксов указывает на важность этих бактерий для процесса метанового сбраживания сложных органических соединений в различных экосистемах.

Добавление культуры Methanothrix thermoacetophila к сбраживаемому навозу КРС С10% инокулят) ускоряло использование ацетата и увеличивало скорость образования метана в 2 раза [2, 9, 14]. Из сброженного навоза КРС на среде с ацетатом в качестве субстрата после ряда пересевов с пенициллином была получена

- 23 -

устойчивая термофильная метаногенная культура Z-CA-I003, содержащая в качестве ведущих форм ML. thermoacetophila и термофильную Methanosarcina sp. [III. Добавление этой культуры к свежему навозу существенно ускоряло формирование сбалансированного микробного сообщества в нем и развитие процесса метаногенеза. Термофильная ацетатиспользующая метаногенная ассоциация бактерий Z-CA-I003 оказывала также стимулирующее действие на интенсивность образования метана при сбраживании осадков городских сточных вод и особенно при раздельном сбраживании твердой и жидкой фракций осадка [37]. При добавлении в качестве инокулята к свежему осадку и его фракциям она оказалась в расчете на биомассу клеток инокулята в 10 раз более эффективной, чем сброженный осадок. Сочетание метанотрикса, имеющего высокое сродство к ацетату, и метаносарцины, обладающей широкими метаболическими возможностями, обуславливает эффективность и перспективность этой культуры. Полученные результаты свидетельствуют также о неспецифичности ацетатиспользующих метаногенов, выделенная из навоза КРС культура Z-CA-I003 оказалась эффективной для стимуляции метаногенеза в осадках сточных вод, в свою очередь штамм ML. thermoacetophila, выделенный из гидротерм Камчатки, интенсифицировал сбраживание отходов животноводства.

В выполнении работ по этому разделу принимали участие P.A. Мельник, (ВИЭСХ), Т.Г. Соколова (Ягодина) З.М. Кольцова (АКХ), Л. Е. Кузнецов.

Таким образом, для эффективного образования метана из таких отходов, как навоз и осадки сточных вод, содержащих собственную микрофлору, определяющим является высокое содержание ацетатиспользующих медленно растущих метаногенов в системе. Суть добавления "закваски" сводится в первую очередь к увеличению концентрации метаногенов в сбраживаемой массе. Для инициации процесса сбраживания промыщленных сточных вод, не содержащих собственной анаэробной микрофлоры, необходима инокуляция полной метаногенной ассоциацией [43]. С другой стороны, избыток метаногенной биомассы из анаэробных реакторов, работающих на отходах пищевой промышленности, с успехом может быть использован в качестве "заквасок" для пуска анаэробных реакторов в

- 24 -

сельскохозяйственном производстве.

L_3._ Регуляторная роль водорода и ацетата в метаногенном

сообществе

1.2.I. Регуляторная роль водорода при разложении целлюлозы

В стабильно функционирующих микробных сообществах устанавливается хорошая сбалансированность между микрофлорой начальных и конечных этапов трофической цепи. При культивировании на среде с микрокристаллической целлюлозой микробного консорциума сброженной массы активно работающих биореакторов образование метана наблюдалось в посевах вплоть до 9 разведения, что свидетельствует о высокой численности всех бактерий, необходимых для образования метана из сложного полимерного субстрата С38].

Для изучения межвидового переноса водорода при разложении целлюлозы с образованием метана исследовали рост CI. thermocellum на целлюлозе в чистой культуре и в бинарных культурах с водородиспользующими бактериями: метановой Methanobacterium thermoformicicum и гомоацетатаной Clostridium thermoautotrophicum [16, 33 , 38 , 41]. При росте чистой культуры CI. thermocellum на целлюлозе и целлобиозе основными продуктами брожения были этанол, лактат, ацетат, водород, концентрация которого в газовой фазе достигала 10%, и углекислота. При совместном культивировании с Mb. thermoformicicum продуктами разложения целлюлозы были только метан и ацетат, продукция которого возросла в 1,5 раза по сравнению с чистой культурой. Концентрация водорода не превышала 50 ppmV, что соответствует нижнему порогу потребления этого газа термофильными метановыми бактериями £25]. Расчет показал, что с учетом водорода, использованного на образование метана, на самом деле его продукция в комбинированной культуре была в 2-2,5 раза выше, чем в чистой культуре CI. thermocellum.

При совместном культивировании CI. thermocellum с гомоацетатной бактерией CI. thermoautotrophicum наблюдалось гомоацетатное брожение целлюлозы: ацетат был практически единственным конечным продуктом, его продукция была почти на порядок выше, чем при развитии чистой культуры Стабл. 3). Концентрация водорода соответствовала нижнему порогу для

- 25 -

Таблица 3

Продукты разложения целлюлозы и целлюлазная активность монокультуры С.№егтоое11ит и бинарной культуры С.№егтосе11ит и С.Шегтоа^о^орЫсип н

-,-j-j-1-1-

Йультура ¡Этанол, !Ук'суснаяШолочная!Водород, ¡Редуцирую-?- рН 1 мМ ¡кислота,¡кислота,! мМ !щие саха-!

! мМ ! мМ ! !ра, мМ Г

! ! ! ! ! ! 1 I \ \

I_i Í ! i

SKT»»8- ¡Целлюлазная ак-леися целлюлозы _¡тивность,

исход-!^™-4)

г/л

¡B % от

{ного содержа-j |ния

энокультура 38,3 7,3 4,7 181,1 лнарная культура '3,8 43,4 Нет 2,43

0,38 4,8 3,85 38,5

0,045 5,0 5,05 50,5

0,777 0,652

со со

Данные по продуктам метаболизма, редуцирующим сахарам, целлюлозе и рН приведены для конца культивирования (14 сут.), по целлюлазной активности - для 3 сут. роста культуры.

Таблица 4

Концентрация промежуточных продуктов и баланс углерода при анаэробной деградации глюкозы (исходная концентрация с - 180 тмЗметаногеншм сообществом сброженного навоза крупного рогатого скота.

Время ! ^\(часы)! 24 30 40 72 144

Цродукты j тМ [CJ шН [с] шМ [0] шМ Го J шМ ГС1

Ацетат 20,0 40,0 24,5 49,0 25,0 50,0 26.0 52,0 2,0 4,0

Этанол 3,2 6,4 3,7 7,4 2,6 5,2 2,5 5,0 0 0

Бутират 6,25 25,0 6,25 25,0 . 6,25 25,0 5,0 20,0 1,0 4,0

црсоионат 1,0 3,0 1,0 3,0 1,3 3,9 1,3 3,9

со2 39,0 39,0 52,0 52,0 61,0 61,0 62,5 62,5 80,0 80,0

СН4 12,0 12,0 17,0 17,0 24,0 24,0 29,0 29,0 100,0 100,0

Сумма 125,4 — 151,4 - 169,1 - 172,4 - 188

гомоацетатных бактерий и не превышала 1300 ppmV.

Таким образом, удаление водорода метановыми или гомоацетатными бактериями приводило к ацетогенному сдвигу в метаболизме целлюлолитика: снижению образования восстановленных метаболитов и увеличению синтеза .ацетата, важнейшего предшественника метана.

Работа выполнена с М.В. Симаньковой и более подробно изложена в ее кандидатской диссертации.

1.2.2. Регуляторная роль водорода и ацетата при разложении

этанола и летучих хирных кислот

Основными промежуточными продуктами анаэробного разложения мономеров в метаногенном сообществе являются этанол и летучие жирные кислоты (ЛЖХтабл. 4). Деградация этих веществ является наиболее подверженной регуляции водородом и ацетатом ступенью метаногенеза и осуществляется синтрофными, или протон-восстанавливающими бактериями, нуждающимися в водородиспользующих партнерах [44, 48]. Синтрофное разложение ЛЖ и спиртов происходит в узких границах концентрации водорода: между нижней пороговой концентрацией для водородиспользующего организма и верхней для водородобразующего. Рассчитано, что разложение этанола идет до концентрации водорода в системе 1С* атм., а пропионата только до 10" атм. (Archer, 1983). В нашей работе большее внимание было уделено регуляторной роли ацетата, которая, в отличие от роли водорода, не была исследована. Изучали роль удаления ацетата бактериями рода Methanothrix на процесс разложения этанола, бутирата и пропионата метаногенными ассоцияциами микроорганизмов сброженного навоза КРС и полученными на соответствующих субстратах накопительными культурами [18, 27, 39. 42, 48].

Увеличение концентрации метаногенов, водородиспользующего Methanobacterium thermoformicicum и особенно ацетатиспользующего Methanothrix thermoacetophila, оказывало стимулирующий эффект на процесс термофильного разложения этанола с образованием метана микрофлорой сброженного навоза КРС (табл. 5) [39]. При подсеве культуры Mt. thermoacetophila скорость использования этанола увеличивалась более чем в 4 раза и единственным продуктом был метан. В опытах с подтитровкой NaOH для поддержания нейтральной

- 28 -

Таблица 5

Использование этанола термофильной накопительной культурой Е5 и метаногенными бактериями

Концентрация, мМ

Культура этанол ИСХ. кон. ацетат метан рн

Е5 65,0 5,4 60,1 14,4 5,0

Е5+МЬ.' 1ЬегтоГогга1с1-сит 65,0 0,1 60,8 31,5 5,0

Е5+М1.1Ьеггооасе1о-рШа 65,0 0,1 1,4 64,9 6.5

рекции среды и с вариациями начальной концентрации ацетата было показано, что стимулирущее действие Ме1Ьапо1Ьг1х Ичег тоасе1орЫ1а является суммарным эффектом, обусловленным поддержанием рН и удалением ацетат-иона, ингибирующего процесс разложения этанола Срис. 2).

Важность удаления ацетата подтвердилась также в наших опытах по исследование образования метана из бутирата и пропионата микрофлорой сброженного навоза КРС 148]. Подсевы культур МЬ. гоеЬпдепИ и М1.1Ьепюасе1орЫ1а к сбраживаемой с помощью метаногенных ассоциаций 2-СА-1001 и 2-СА-1002 жидкой фракции навоза стабилизировали, соответственно, в мезофильных и термофильных условиях, процесс разложения бутирата и пропионата, добавленных в качестве экзогенных субстратов. При этом ацетат не накапливался и увеличивалась скорость разложения летучих жирных кислот. Рост накопительных ЛЖ-использующих синтрофных культур в разведениях удалось получить только при подсеве метанотрикса. Хотя путем расчета по методике Тауэра (1977) было показано, что изменение концентрации ацетата, по сравнению с водородом, относительно мало влияет на изменение свободной энергии синтрофных реакций (ВоШпд, 1988), удаление ацетат-иона существенно стимулировало использование летучих жирных кислот. Предположения о значении межвидового переноса ацетата нашли подтверждение при исследовании математической модели синтрофяого разложения бутирата, включающей в себя термодинамическое ограничение протекания химических реакций, осуществляемых микроорганизмами

- 29 -

метаногенного сообщества (Петров и др. 1990), [48]. Показано, что при ограничении использования водорода межвидовой перенос ацетата может дать существенный выигрыш в энергии, при этом основную роль в моделируемом процессе играет метанотрикс, а не метаносарцина, из-за относительно низкого сродства к ацетату последней. Расчеты, сделанные для изменения свободных энергий разложения этанола пропионата и бутирата при поддержании низкой концентрации ацетата, также свидетельствуют о термодинамическом выигрыше С51апк, геЬпбег, 1990).

Рис. 2. Разложение этанола метаногенной ассоциацией микроорганизмов при 52РС: А - контроль; Б - при подсеве Ме1Ьапо1Ьг1х 1Ьегшоасе1орЫ1а; В - с подтировкой ИаОН; Г -при начальной концентрации СНдСООИа - 50 шМ. I - этанол, 2 - ацетат, 3 - метан, 4 - рН - 30 -

Результаты этого раздела получены в основном совместно с А.И. Слободкиным и более подробно будут изложены в его кандидатской диссертации.

Таким образом. жизнедеятельность микроорганизмов в метаногенных сообществах регулируется скоростью потребления продуктов их обмена, в первую очередь водорода и ацетата. Первичные анаэробы Сбродилыцики) образуют восстановленные продукты в меньших количествах при оттоке водорода за счет использования его метаногенами и ацетогенами. Синтрофное разложение спиртов и жирных кислот облигатно зависит от-этих групп микроорганизмов. Для эффективного функционирования всего сообщества критическим является наличие ацетокластических метаногенов, способных усваивать ацетат в низкой концентрации.

2. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТАНОГЕНЕЗА ДЛЯ ОБРАБОТКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ОТХОДОВ

Одной из задач нашей работы был поиск микробиологических путей интенсификации процесса анаэробной обработки отходов животноводства и свиноводства для получения органических удобрений и биогаза.

2.1.Характеристика микробиологических процессов в анаэробных реакторах первого поколения (метантенках) С целью исследования микробиологических процессов в метантенках для обработки отходов животноводства и свиноводства были исследованы пробы сбраживаемой массы из промышленных метантенков различной конструкции, работающих в разных климатических зонах бывшего СССР СИстра, Московская область; Пярну, Эстония; Огре, Латвия; Сумская, Запорожская, Крымская и Киевская области, Украина; Ашхабадский район, Туркмения) [36]. Исследовали также пробы из коммунальных метантенков Курьяновской и Люберецкой станций Мосочиствод (Москва).

В зависимости от используемого сырья, конструкции установки, условий и режима сбраживания метантенки различались по своим характеристикам, однако, был обнаружен ряд общих для всех установок закономерностей (табл. 6) [36, 20, 29]. Относительное

- 31 -

Характеристика сбраживаемой массы навоза КРС в трехсекционном горизонтальном мэнтантенке "Энбом". Истра, полигон ВИЭСХ

Таблица 6 \

Проба

-!-

! pH I а.с.в., ! ! г/л ! I

1 i I i

Микробная 'Содержание биомасса, ¡микробной г/л j биомассы в ja.c.B.,% j !

Кислота, г/л

Удельная скорость образования 14С4 из

!

!

уксусная j пропионовая j масляная

! !

j j ттата, i

! ! !'Ч.-1/г а.с.в.

!__!_!_

меченного аце-|тата. 10-Ь Mtvi.

Свежий навоз

Навозоотводный канал

Навозохранилище

Начало метантенка (I секция)

V W W Л л СМ Л Л V* л

(П секция)

Конец метантенка (III секция)

7,2 159,48 38,00 24 1,13 0,10 0,00 4,56

7,0 78,97 16,00 20 1,5 0,10 0,05 -

6,5 133,73 28,70 21 4,74 0,42 0,06 - 1 Я

7,0 120,61 22,70 19 3,00 0,91 0,03 137,00 1

7,5 90,22 22,20 24,4 0,40 0,14 0,00 540,0

8,0 85,05 21,30 25 0,05 0,00 0,00 43,70

содержание микробной биомассы к сухому веществу увеличивалось по мере прохождения сбраживаемой массы по технологической линии и на выходе из метантенков могло превышать 25%. Концентрация летучих жирных кислот (ЛЖ) была максимальна на стадиях, предшествующих собственно метаногенезу (навозохранилище, выдерживатель, первая секция в горизонтальном многосекционном метантеке), где она достигала Юг/л сбраживаемой массы. Использование этих субстратов наблюдалось в пробах с высокой активностью водород- и ацетатиспользующих метановых бактерий, что характерно для последних стадий процесса. Интенсивность образования метана из ацетата в расчете на единицу сухого вещества и микробной биомассы возрастала на последних ступенях процесса. Скорость образования ^СНд из ^С-ацетата достигала 1-ЗхЮ~^мМ СН^/час./г биомассы. Установлено, что низкие концентрации уксусной (до 0,5 г/л) и пропионовой (до 0,1 г/л) кислот в пробе в сочетании с высокой скоростью использования ацетата свидетельствуют об активной работе сбалансированной микробной ассоциации. Напротив, наличие ЛЖК в сброженной массе указывало на неудовлетворительное протекание процесса, что, как правило, подтверждалось низким выходом метана. В целом в метантенках, работающих на отходах КРС выбраживание происходило более полно, чем в работающих на отходах свиноводства, особенно в термофильном режиме.

На примере трехсекционной биогазовой установки, работающей на навозе КРС в мезофильном режиме>(полигон ВИЭСХ, Истринский район Московской обл.), и двухстадийной горизонтальной установки К0Б0С (полигон ВНИИМЖ, Киевская обл.) по выходу метана при добавке специфических для роста микроорганизмов субстратов (0,3-0,5%) и по определению численности и активности наиболее важных групп микроорганизмов была охарактеризована активность различных участков трофической цепи деструкторов навоза КРС [29, 38, 66]. Полученные результаты хорошо соответствовали данным химических анализов. Наивысшей метанобразуюздй активностью обладали микробные ассоциации в последних секциях метантенков, на выходе из реакторов, где наблюдалось полное сопряжение активностей целлюлолитической кислотогенной и метаногенной микрофлоры, а наименьшей - в свежем навозе, где активность микроорганизмов кислотогенной фазы значительно превышала активность ыетаногенов.

- 33 -

Гидролиз полимерных соединений считается одной из лимитирущих ступеней метаногенеза. Основными полимерами в свином навозе являются белковые соединения. В метантенках, сбраживающих свиной навоз, гидролитическая микрофлора представлена в основном протеолитическими бактериями, их численность здесь достигала кл/мл [381. Аммонификация и гидролиз белковых соединений происходит довольно быстро даже при пониженной температуре и не ограничивает скорости метаногенеза при сбраживании различных белков микрофлорой свиного навоза [62]. Значительно большие трудности представляет разложение целлюлозы, которая является основным природным полимером, а также составляет большую часть органических сельскохозяйственных и городских отходов. Целлюлолитическая и протеолитическая микрофлора метантенков, работающих в мезофильном и термофильном режимах на навозе КРС представлена в основном споровыми клостридиальными формами, а не Ruminococcus, который преобладает в рубце СПивняк, Тараканов, 1982). Из термофильных метантенков, работающих на навозе КРС и осадках сточных вод выделено несколько штаммов Clostridium thermocellum, представляющей в них основной целлюлолитический организм, численность которого достигала id* кл/мл [36, 38]. В коммунальных метантенках сырьем, подлежащим сбраживанию наряду с первичными осадками, является избыточная микробная биомасса из аэротенков. Активный анаэробный лизис микробной биомассы был установлен в опытах с суспензией клеток Alcaligenes eutrophus, при добавлении к ней сброженного осадка коммунального метантенка, и в меньшей степени при добавлении сброженного навоза КРС, что указывает на присутствие бактериолитической активности в них С33].

Водородиспользующие метановые бактерии в метантенках

представлены в основном представителями рода Methanobacterium,

численность их возрастала по мере прохождения сбраживаемой массы

по технологической линии с 1С?-1С? для свиного навоза и

Я Q

для навоза КРС до 10-10 кл/мл. Характерным для сброженного навоза и осадков сточных вод является обильное развитие метаносарцин, представленных в основном Methanosarcina mazei и его термофильным аналогом Methanosarcina thermophila, и мезофильных и термофильных видов рода Methanothrix. Поскольку из-за морфологических особенностей метаносарцин и метанотриксов их

- 34 -

численный учет методом разведений невозможен, их метанобразувдая активность была определена с использованием меченых субстратов. В сброженном навозе и осадках она была на 5-6 порядков выше, чем в исходном сырье [29].

Высокий вынос активной метанобразущеи микрофлоры на выходе из метантенков указывает на несовершенство установок первого поколения, в которых полужидкие отходы сбраживаюся без разделения на фракции, и твердые частицы субстрата преставляют собой иммобилизующие поверхности, на которых выносятся клетки активной микрофлоры. Система отделения и рецикла активной биомассы не может быть реализована при сбраживании полужидких отходов, но может быть рекомендован возврат части сброженной массы в метантенк, что равнозначно инокуляции свежего навоза активной метаногенной ассоциацией [29]. Подобные результаты получены для обработки осадков сточных вод [371.

Таким образом, метантёнки первого поколения для обработки полужидких отходов сельского хозяйства и осадков сточных вод, работающие по принципу полного смешения или вытеснения, ограничены в своей производительности конструкцией и технологией процесса. При прохождении сбраживаемой массы по технологической линии происходит развитие необходимой микрофлоры и формирование метаногенного сообщества. Время удвоения лимитирующих процесс ацетатиспользующих метаногенов и синтрофных бактерий составляет соответственно для термофильных и мезофильных видов 40-100 и 200-300 часов и определяет время пребывания субстрата в метантенках. Для отходов с содержанием сухих вешществ 4-8% оно составляет около 15 суток для мезофильного и 8-10 суток для термофильного процесса, что совпадает с экспериментально отработанными режимами обработки отходов животноводства и осадков сточных вод, обеспечивающими 30-40% разложения органического вещества [36]. Применение "заквасок" - активных метаногенных ассоциаций, в реакторах первого поколения имеет смысл только в период первоначального пуска метантенка и вывода его на рабочий режим. В дальнейшем из-за выноса активной микрофлоры из реактора использование их вполне успешно может быть заменено частичным возвратом сброженной массы, что было реализовано при эксплуатации опытно-промышленного метантенка "Энбои", установленного на

- 35 -

молочной ферме в Истринском районе Московской области. На этой установке получены наилучшие показатели для анаэробных реакторов первого поколения [36].

В выполнении работ по этому разделу участвовали И. В. Симанькова, А. И. Слободкин, В.К. Некрасова, Л.Е.Кузнецов, И.Я. Веденина.

2. 2.Адгезия метановых бактерий и ассоциаций на твердых носителях и разработка технологии обработки жидкой фракции отходов в реакторах типа "Анаэробный биофильтр".

Особую проблему для нашей страны представляет разработка эффективных технологий обработки стоков гигантских свиноферм, где применяется гидросмывная система уборки и отходы представляют собой сильно загрязненные сточные воды с содержанием органического вещества 1-3'/.. На среднем комплексе на 24 тыс. голов свиней ежесуточно образуется 500-600 стоков. Они оказывают пагубное воздействие на окружающую среду, загрязняя водоемы и грунтовые воды. Традиционные методы аэробной очистки чрезвычайно энергоемки и в большинстве случаев мало эффективны из-за сравнительно высокой загрязненности стоков [36, 43].

Перспективным направлением повышения эффективности работы анаэробных реакторов для обработки жидких стоков или жидкой фракции отходов является увеличение концентрации и удержание активной метанобразущей биомассы в реакторах путем иммобилизации ее на твердых носителях. К началу нашей работы такие реакторы уже в принципе были разработаны и применялись за рубежом для очистки сточных вод пищевой промышленности СИулБ е1 а1., 1986). Для обработки сельскохозяйственных отходов реакторы типа "анаэробный биофильтр" не применялись, в первую очередь из-за отсутствия в развитых странах столь крупных животноводчеких и свиноводческих предприятий.

Нами был исследован процесс прикрепления ацетатиспользующих метаногенов к поверхности различных материалов-носителей и формирования биопленок на них при культивировании чистой культуры Ме1Ьапо1Ьг1х 1Ьегтоасе1орЫ1а, метаногенных ассоциаций термофильной 2-СК- 1003 и мезофильной г-СА-1002, а также при

- 36 -

обработке жидкой фракции навозных стоков, и стоков винзавода, инокулированных этими ассоциациями. Мы иследовали также эффективность различных материалов-носителей в лабораторных реакторах с целью оценки возможности их использования в агропромышленных установках [36, 43, 45, 50].

Поверхностные свойства загрузочного материала, в первую очередь гидрофобность и шероховатость, играют наиболее важную роль на этапе первичного образования биопленки CLoosdrecht, et al., 1987; Messing et al., 1879; Звягинцев, 1987). Однако влияние гидрофобности поверхности на начальную адгезию чистых культур метановых бактерий неоднозначно: Methanothrix soehngenii лучше прикреплялся к гидрофобным полимерам, Methanospirillum hungatii -к Гидрофильным, Methanobrevibacter arboriphilus - и к тем и к другим, Methanosarcina nazei не прикреплялась ни к одному из исследованных материалов (Verrier et al., 1988). В наших опытах метанотриксы быстрее колонизовали такие гидрофобные материалы, как кглрон, полиэтилен, полихлорвинил, чем гидрофильные носители (стекловолокно, хлопчатобумажная ткань, астбест, кирпичная крошка). Однако, при более длительном сроке культивирования разница в обрастании различных материалов практически нивелировалась. Что касается метаносарцин, то в начальной стадии формирования биопленки происходит скорее всего их механическое прикрепление к поверхности носителя, чем его обрастание, однако в развитых биопленках колонии метаносарцин часто находятся в структуре, образованной Нитями метанотрикса. Эти результаты согласуются с данными зарубежных исследователей (Weiland, 1987).

Исследование сбраживания жидких стоков свинофермы в лабораторных и стендовых реакторах типа "Анаэробный биофильтр" с жесткой загрузкой показало, что на поверхности различных материалов - носителей наблюдалось развитие микробных биопленок, содержащих метаногенную микрофлору. Мощность обрастаний (мкг микробного белка/с»? поверхности материала-носителя) варьировала от 190-210 на капроновой и полихлорвиниловой сетках, до 300-310 на аналогичных материалах с более развитой поверхностью и до 600 на металлической сетке. Не исключено, что в последнем случае образующийся сульфид железа стимулировал формирование обрастаний.

- 37 -

Эффективность работы стендовых реакторов с фиксированной загрузкой была в два раза выше, чем контрольных. "Анаэробные биофильтры" отличались более стабильной работой и гораздо более быстрым выходом на рабочий режим после остановки реакторов при их повторном пуске (рис. 3). Природа загрузочного материала практически не играла роли после нескольких месяцев работы реакторов. Радиоизотопные определения скоростей образования метана

Рис.3. Суточный выход биогаза при анаэробной обработке жидкой фракции стоков свинофермы в лабораторных реакторах с различными материалами-носителями: а - при выводе реакторов на рабочий режим; б - при стабильной работе реакторов; в -при повторном пуске реакторов.

I - контрольный реактор без материала-носителя, 2 -керамзит, 3 - стеклохолст, 4 - астбестовый шнур.

- 38 -

из ацетата показали, что наряду с обрастаниями активная метаногенная микрофлора содержалась в осадках, где образовались флокулы активной биомассы. Эффективность очистки существенно повышалась при обработке стока в четырех последовательно соединенных реакторах, в трех из которых в качестве материала-носителя была использована капроновая бахрома.

Полученные в лабораторных исследованиях результаты были использованы при разработке технологии, проектировании и строительстве экспериментальной промышленной установки для обработки 100 т/сутки навозных стоков и при проектировании серийного промышленного комплекта оборудования для фермы по откорму 24 тыс. свиней в год с 4-секционным реактором с общим объемом 500 й5 для анаэробной обработки жидких стоков свинофермы [50]. При этом были внесены изменения в технологическую схему и проект, предложенный вначале [36]. Проект реализован на свиноферме в Нижнегорском районе Крымской области. Технологическая схема обработки навозных стоков включает разделение на сгущенную и жидкую фракции в отстойнике и раздельную их обработку: осадок обрабатывается в горизонтальном метантенке, емкостью 125 »?, а жидкая фракция в 4-секционном анаэробном биофильтре, общей емкостью 500 ^ Срис. 4) [503. В проекте предусмотрен культиватор для наработки закваски. Испытания экспериментальной промышленной установки показали, что эффект очистки жидкой фракции составлял 60-65%, содержание органических веществ в очищенном стоке не превышало 1000 иг/л, составляя в среднем 500-600 мг/л. Такой сток может быть подвергнут эффективной аэробной доочистке или использоваться на полив. Эта технология может быть реализована и при обработке осадков городских сточных вод.

Реакторы типа "Анаэробный биофильтр" успешно применяются для обработки концентрированных сточных вод различных типов промышленности. При нашем участии разработана технология очистки сточных вод АО "Массандра", в технологическую схему включен анаэробный биофильтр. Реакторы этого типа могут применяться при производстве витамина В^, который получают в результате метанового сбраживания ацетоно-бутиловой барды с добавлением метанола. Причем было показано, что основное количество ^ и его аналогов образуется гомоацетатными бактериями, а не метаногенами

- 39 -

[15, 193.

В выполнении исследований принимали участие В. К. Некрасова, A.A. Ковалев (ВИЭСХ), В.Р. Крюков, В.Б. Костюк (Крымский опорный путкт ВИЭСХЭ, В.Я. Быховский (ИНБИ РАЮ

1—1 1—1 / _ J

1 fWlf)1

S

',1

— s

* I 7

Рис. 4. Технологическая схема обработки навозных стоков: I - свинарник, 2 - отстойник, 3 - подогреватель, 4 - анаэробные биофильтры, 5 - горизонтальные метантенки 6 - хранилища для шлама и очищенной жидкости.

2.3. Перспективы развития анаэробной технологии на

животноводческих объектах и в коммунальном хозяйстве.

В настоящее время в России на животноводческих предприятиях реализуются стандартные технологические схемы обработки и утилизации отходов, включающие выдерживание их в навозохранилищах, компостирование, разделение на фракции и обработку жидких стоков в аэротерках ССНИП, 1980).

Совместно с A.A. Ковалевым СВИЭСХ) рассмотрены возможности включения анаэробной обработки в технологии, существующие на различных типах ферм [28, 35, 46]. На молочных фермах средних размеров С400-1200 голов КРС) и небольших репродуктивных свинофермах С100-300 голов), где используется подстилка, вместо компостирования может применяться твердофазная ферметнтация или, при недостатке наполнителя, метановое сбраживание с рециклом жидкой фракции. На откормочных комплексах КРС Сболее 800 голов),

- 40 -

где образуется навоз с содержанием 5-6% сухого вещества, в технологическую схему могут быть включены анаэробные реакторы полного смешения или вытеснения. Эти же реакторы могут использоваться для обработки сгущенной фракции свиного навоза на фермах до 24 тыс голов, где образуется полужидкий навоз содержащий 2-3% сухих веществ. На гигантских свинофермах (24-216 тыс. голов), где образуются сточные воды с содержанием 1-2% сухих веществ целесообразна обработка стоков в реакторах типа "Анаэробный биофильтр" или иАБВ с последующей доочисткой в аэротенках.

Подсчитано [28, 46], что анаэробной обработке с получением биогаза может быть подвергнуто порядка 10-15% (по органическому веществу) навоза, образующегося в промышленном животноводстве стран бывшего СССР. При этом, может быть получено около 9 млрд м^ биогаза в год, примерно половина этого количества будет использоваться для обгрева самих анаэробных реакторов. В отдельных случаях при обработке достаточно концентрированных отходов производство биогаэа может служить существенным источником дополнительной энергии в хозяйстве. Произведенные ранее расчеты возможного вклада в энергетический баланс страны подученного в результате анаэробной обработки животноводческих отходов метана, продукция которого оценивалась от 24до 70 млрд М3 в год, (Синяк, Авизов, 1984; Панцхава, 1985) представляются завышенными, так как авторы исходили из того, что весь или большая часть образующегося в сельском хозяйстве страны навоза может быть переработана в биогаз. Вероятно экологический аспект проблемы в целом более важен. Кроме того анаэробная обработка животноводческих отходов является методом быстрой стабилизации органического вещества и получения высококачественных удобрений.

3. АГРЕГИРОВАННЫЕ МЕТАНОГЕННЫЕ СООБЩЕСТВА В АНАЭРОбНЫХ

РЕАКТОРАХ СО ВЗВЕШЕННО-СЕДИМЕНТИРУЩЕИ БИОМАССОЙ (ЦАБВ)

3.1. Преимущества образования метаногенных гранул в

ЦАБВ-реакторах

Разработка голландскими исследователями анаэробного реактора с восходящим потоком очищаемой воды через слой анаэробного ила -

- 41 -

Up-flow anaerobic sludge blanket reactor CUASB-reactor), открыло новую страницу в развитии анаэробной технологии очистки концентрированных промышленных сточных вод (Lettinga et al. , I980J. Реактор оказался простым по конструкции, дешевым и несложным в эксплуатации, а его эффективность в несколько раз пойвосходила известные сооружения. Высокая скорость очистки обусловлена высокой концентрацией активной биомассы, которая благодаря образованию гранулоподобных агрегатов сферической формы диаметром 1-3 мм и плотностью 1040-1080 (Hulstof-Pol et al, 1983, 1989), обладает хорошей седиментационной способностью и не выносится из реактора, чему припятствует также применение специально встроенного газо-ило-отделительного устройства, расположенного в верхней части реактора.

Явление гранулообразования в UASB-реакторах представляет собой удивительный феномен самоорганизации микробного сообщества в искусственных сооружениях под действием физических гидродинамических факторов. К началу наших исследований уже был выполнен ряд работ по изучению строения и свойств гранулированной метаногенной биомассы. Эти работы были проанализированы и обощены в монографии С43], которая явилась первой публикацией, в которой в рамках единого подхода комплексно рассмотрены как фундаментальные, так и технологические аспекты проблемы анаэробной

микробиологической очистки. В главе "Агрегирование биомассы в анаэробных реакторах" обобщены сведения о формировании и свойствах метаногенных гранул. Агрегирование метаногенной микрофлоры обладает не только рядом технологических преимуществ по сравнениею с дисперсным ростом, но имеет очень важный биологический смысл как формирование под действием гидродинамических факторов микробного ценоза, в котором микроорганизмы,, находясь в тесной трофической взаимосвязи компактно сконцентрированы в физическом пространстве. Такая организация микробного сообщества влияет на общую стехиометрию, она , выгодна для массопереноса промежуточных продуктов, прежде всёго для межвидового переноса водорода, основного промежуточного и регуляторного компонента в метаногенной системе. По расчетам CShink, Thauer, 1988) при агрегировании метаногенной биомассы поток водорода между двумя видами бактерий увеличивается на 2 порядка по сравнению с дисперсной биомассой,

- 42 -

что подтверждается экспериментальными исследованиями (ВиЬогди1ег е1 а1. , 1988). Метаногенная активность гранул уменьшается даже при очень щадящем режиме разрушения их структуры. Механическая смесь тех же микроорганизмов была гораздо менее активной, чем агрегированная биомасса.

Из анализа литературы следовало, что феномен образования и функционирования гранул еще недостаточно исследован. В частности, требовала подтверждения предложенная классификация гранул сгееии, 1988); не было единого мнения о начальных этапах формирования гранул, хотя были предложены и защищались различные концепции инициирования их роста; практически отсутствовали данные по кинетике процесса при смене режимов протока среды и нагрузки по субстрату. Нами было проведено сравнительное исследование морфологических особенностей гранулированной биомассы, полученной на различных субстратах и стоках, исследовано развитие новых, гранул при изменении температурного режима и смене субстрата в иАБВ-реакторах, изучены кинетические закономерности работы реактора в условиях увеличения нагрузки и стратификация различных групп микроорганизмов по его объему С43, 57, 74, 76].

3.2.Морфология метаногенных гранул.

Морфология метаногенных гранул была исследована с помощью электронной микроскопии. Исследование метаногенных гранул из большого количества промышленных и лабораторных иАБВ-реакторов в сканирующем микроскопе показали большое разнообразие размеров и форм гранул. Установлены некоторые закономерности образования того или иного типа гранул в зависимости от обрабатываемого субстрата чли стока [43, 57, 74].

На сточных водах с высоким содержанием летучих жирных кислот образуются компактные плотные сферические или дисковидные гранулы, диаметром около 1,5 мм. Образование таких гранул было отмечено нами при двухступенчатой анаэробной обработке сточных вод предприятий целлюлозо-бумажной, пивоваренной, сахарной и картофелекрахмальной промышленности, в реакторах второй, метаногенной, ступени, куда поступает преацидифицированный на первой, кислотогенной ступени сток, а также в лабораторных реакторах, работающих на смеси ЛЖ. Доминирующими организмами в

- 43 -

них являются развивающиеся в соответствии с температурным режимом реактора мезофильный и термофильный метанотриксы, нити которых очень плотно упакованы и составляют внутреннюю структуру гранул, между ними располагаются клетки и колонии других бактерий.

При одноступенчатой анаэробной обработке промышленных стоков, как правило, образуются более крупные и менее плотные гранулы. Многочисленные наблюдения, в том числе наши, свидетельствуют о том, что чем сложнее состав обрабатываемой сточной воды, тем более рыхлые гранулы образуются. При этом они часто имеют неправильную форму, морфологический состав бактерий в них очень разнообразен, хотя скелет гранул составляет метанотрикс. Гранулы из реакторов, обрабатывающих модельные и реальные сточные воды молочной промышленности, достигали в диаметре 3-4 мм, были рыхловатыми, с неровной структурой поверхности, иногда они состояли как бы из более мелких, слипшихся агрегатов.

Гранулы с высоким содержанием метаносарцины образуются только в высоконагружаемых, в частности по метанолу и ацетату, системах. Тем не менее структура, форма и плотность гранул обуславливается присутствием метанотрикса. При высокой скорости протока и сильном преобладании метаносарцины наблюдался .рост в виде мелких агрегатов, представляющих собой макроколонии метаносарцины [63]. В гранулах из лабораторного реактора на среде с метанолом в качестве основного субстрата ведущими формами были метаносарцина и метанотрикс, что указывало на образование ацетата в системе и было подтверждено обнаружением гомоацетатных бактерий, использующих метанол. Колонии метаносарцины могут служить центрами инициирования образования новых гранул. В наших исследованиях, после переключения работающего в мезофильном режиме реактора на термофильный режим и увеличения концентрации ацетата в среде, налюдалось развитие новых гранул', которое начиналось с образования колоний метаносарцины на поверхности старых гранул или в среде. Термофильная метаносарцина преобладала в новых микроагрегатах, которые постепенно обрастали другими бактериями. Формирование плотных "зрелых" гранул было связано с развитием метанотрикса. На процесс гранулирования оказывало положительное влияние присутствие в среде глюкозы или других углеводов в небольшой концентрации, порядка I г/л среды [58, 74].

Таким образом, структура и бактериальный состав гранул обусловлены в первую очередь субстратом, его концентрацией и гидродинамическим режимом в реакторе.

Автор выражает глубокую благодарность Н.А.Кострикиной, с которой был выполнен этот раздел работы.

3.3. Формирование активной гранулированной биомассы в

ЦА5В-реакторе.

С целью исследования закономерностей формирования активной гранулированной биомассы были изучены кинетические и микробиологические особенности поведения иАБВ-реактора, работающего на смеси глюкозы и ацетата (1:3) при варьировании органической нагрузки в диапазоне от 3.4 до 45 г ХПК/л реактора в сутки (табл 3-1) [74, 76].

Таблица 7

Характеристики работы иАБВ-реактора при различных режимах.

нагрузка, время время N. степень

г ХПК/л работы, обмена об/сут конверсии

реакт. сут. реакт.ч г ХПК/л г ХПК/л У.

3.4 20 22.5 1.07 3.21 0.0 100

5.5 3 18.6 1.29 4.28 0.0 100

6.7 4 19.2 1.25 5.35 0.0 100

14.2 5 12.7 1.89 7. 49 0.43 94.3

17.7 I 10.2 2.36 7.49 0.285 96.2

23.3 2 7.7 3.12 7.49 0.23 97.0

34.0 10 5.3 4.54 7.49 0.12 98.4

45.1 7 4.0 6.02 7.49 0.2 97.8

N - количество объемов инфлюента, сменившихся в реакторе (объемов/сутки);

- начальная концентрация органических веществ в инфлюенте;

- концентрация органических веществ в эффлюенте.

Проведенные исследования позволили выяснить оптимальные условия формирования активной гранулированной биомассы для каждого

- 45 -

из исследованных режимов и установить некоторые общие закономерности этого процесса. Они заключается в следующем: для стабильной работы UASB-реактора желательно иметь концентрацию активной биомассы в среднем по объему реактора - не менее 20 г беззольного вещества микробной биомассы СБВБЭ/л реактора, в том числе в нижней части реактора в зоне наиболее плотного ила (sludge bed) 50-70 г БВБ /л реактора; при переходе к новому режиму работы реактора необходима смена не менее чем 10-15 объемов реактора; увеличение нагрузки следует проводить ступенчато, при этом переход к следующему режиму производить только после установления квазистацибнарного состояния реактора, когда достигается максимальная степень конверсии по органическим веществам. В результате была достигнута нагрузка 45,1 г ХПК/л реактора в сутки, при времени пребывания 4 часа и 98% степени конверсии субстрата, что является максимальным показателем для реакторов такого типа.

Микробиологическое обследование реактора показало высокую численность микроорганизмов различных физиологических групп метаногенного сообщества, обеспечивающих полное разложение субстратов до метана и углекислого газа при различных режимах нагрузки. В среднем концентрация бактериальной биомассы уменьшалась от нижней к верхней части реактора в среднем на 1-2 порядка. Однако, удельная активность микрофлоры была в верхней части реактора в 5 - 10 раз выше, чем в нижней. Такой феномен обусловлен тем, что молодые наиболее активные гранулы благодаря газолифтному эффекту выносятся наверх и функционируют в средней и верхней части реактора.

Электронно-микроскопическое изучение гранул при всех исследованных режимах показало, что значительной частью составляющей их микробной биомассы являются бактерии рода Methanotrix. Кроме того, обнаруживается большое количество морфологически разнообразных форм бактерий, которые располагаются внутри гранул между нитями метанотрикса, часто в виде микроколоний. Метаносарцина была характерна только для нижней части реактора, где концентрация ацетата была наивысшей.

Инициирование образования новых гранул в реакторе проходило различными путями. Часто на поверхности старых гранул наблюдалось развитие колоний метантрикса, которые обламывались, разрастались и

- 46 -

обрастали другими микроорганизмами, что подтверждает "Теорию спагетти" С Wiegant, 1988), получившую такое название из-за характерной морфологии метанотриксов. Иногда центрами первоначальной адгезии служили твердые частицы и даже кристаллы, на которых развивались колонии палочковидных бактерий или метанотрикса. Наблюдалось также развитие макроколоний метаносарцины, которые впоследствии колонизовались другими бактериями, в том числе метанотриксом.

Таким образом, при разработке технологий с использованием высокопроточных UASB-реакторов особое внимание следует уделять повышению эффективности удержания очень активной биомассы, циркулирующей в зоне взвешенных гранул.

Работа выполнена совместно с сотрудниками МГУ В. Скляром, C.B. Калюжным, М. Давляшиной, в работе принимали участи также С.Н. Паршина и М.В. Симанькова, H.A. Кострикина.

3.4. Перспективы применения анаэробных реакторов с

агрегированной биомассой в промышленности.

Жесткая политика в области охраны окружающей среды в развитых странах привела к широкому распространению современных систем анаэробной очистки [433. К настоящему времени UASB-реакторы, количество которых исчисляется сотнями, составляют большинство действующих анаэробных установок во всем мире. Другими распространенными конструкциями остаются анаэробный биофильтр и контактный реакторы. В последние годы более широко начинают применяться модификации UASB-реактора Сгазолифтный, с псевдоожиженным слоем ила, с расширенным слоем ила}, а также гибридные реакторы. Наибольшее число установок действует на спиртовых, сахарных, картофелеперерабатывающих, крахмало-паточных, пивоваренных, целлюлозо-бумажных производствах. Кроме того, анаэробная очистка эффективно применяется для сточных вод предприятий практически всех отраслей агро-промышленного комплекса: дрожжевой, коньячной, винодельческой, сыроваренной, молочной, консервной, мясной, переработки фруктов, овощей и кофе, производства безалкогольных напитков, животноводства и кормопроизводства, а также микробиологической,

- 47 -

химико-фармацевтической и некоторых отраслей химической промышленности. В последнее время анаэробные технологии применяются и для очистки таких сложных стоков, как образующиеся при переработке угля и на нефтехимических производствах, а также дренажной воды объектов захоронения твердых бытовых отходов.

В России на сегодняшний день не существует ни одной промышленной установки анаэробной очистки с гранулированной активной биомассой, хотя в МосводоканалНИИпректе разработана техническая документация на строительство систем локальной анаэробной очистки в иАБВ-реакторах для ряда отраслей пищевой и фармацевтической промышленности. Был подготовлен проект строительства экспериментальной промышленной установки на объединении "Массандра". На Сыктывкарском Ле'со-Промышленном Комплексе построена и начала эксплуатироваться пилотная станция анаэробной очистки стоков целлюлозно-бумажной промышленности, в составе станции есть ЦАБВ, анаэробный биофильтр и гибридный реакторы. Для развития природоохранных технологий в нашей стране необходимо совершенствование законодательства и механизмов его выполнения.

4. МЕТАНОГЕНЕЗ В НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ И ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Метайьгенные микробные сообщества обладают высокой способностью приспосабливаться к различным условиям среды, в том числе к неблагоприятным и даже экстремальным. В настоящем разделе рассматриваются метаногенные сообщества, развивающиеся в анаэробных реакторах, а не в природных экосистемах, поэтому речь идет об адаптации сообщества и Сили) селекции необходимой микрофлоры, приспособленной к даннному субстрату и физико-химическим условиям. Исследование метаногенеза в неблагоприятных и экстремальных условиях важно не только с точки зрения, практики, когда на промышленных предприятиях образуются специфические стоки, которые необходимо подвергать очистке, и в реакторах могут создаваться необычные ситуаций, но и с точки зрения фундаментальных исследований пределов устойчивости биологических систем и перехода их в другое качественное состояние.

4.1.Метаногенез в присутствии высоких концентраций сульфида.

Стоки целлюлозо-бумажной промышленности являются примером сточных вод с высоким содержанием сульфата. Для их очистки все большее применение находят UASB-реакторы [43]. Особый интерес представляет термофильный режим обработки, так как на предприятиях образуются горячие сточные воды с температурой до 7#С. При этом наиболее существенными проблемами с точки зрения технологии является образование больших количеств сульфида (сероводорода) и его влияние на скорость процесса очистки, а для микробиологии -конкурентные отношения между сульфатредуцирующими и метаногенными бактериями, которые достаточно хорошо исследованы для мезофильных условий, в том числе в нашей лаборатории (Бонч-Осмоловская, 1979, 1982), а также влияние высоких концентраций сульфида на метаногенную микрофлору в термофильных условиях. В этой связи было предпринято исследование влияния сульфата на эффективность термофильной анаэробной обработки сульфатсодержащих сточных вод в UASB-реакторе (Rintala et àl., 1991; Visser et al., 1992) и показано, что в термофильных условиях сульфатредуцирующие бактерии конкурируют с метаногенами как за водород, так и за ацетат.

Влияние сульфида на ацетокластическую микрофлору термофильных гранул в сравнении с дисперсным илом было исследовано с нашим участием [69], при этом целью работы было выяснить влияние рН на токсический эффект сульфида, так как известно, что концентрация HgS. способного проникать через клеточную стенку бактерий, строго зависит от кислотной реакции среды (Isa et al., 1986). Работу проводили с микрофлорой из двух UASB-реакторов, в один из которых в течение нескольких месяцев подавалась среда с заведомо завышенным содержанием сульфата С 1.7 г S/литр), который быстро восстанавливался в нижней части реактора, концентрация сульфида в основном его объеме составляла 250-300 мг/л, а соотношение количества органических веществ, превращаемых в реакторе в процессе метано- и сульфидогенеза было приблизительно равно I. Ацетатиспользующая метаногенная микрофлора в обоих реакторах была представлена Methanothrix thermoacetophila. Исследования ингибирующего эффекта сульфида на ацетокластическую метаногенную активность биомассы из обоих реакторов при различных рН, показало,

- 49 -

что что агрегированное метаногенное сообщество из реактора, адаптированного к сульфату, гораздо более устойчиво к высоким концентрациям сульфида, как общего Ссероводород, сульфид-ион, полисульфид), так и в виде сероводорода, особенно при кислой и нейтральной реакциях среды Стабл. 8). Эта разница вероятно обусловлена существованием в гранулах градиента pH CDeBeer, Van den Heuvel, 1988), который в свою очередь может обусловливать градиент сульфида. При щадящем разрушении гранул с соблюдением анаэробиоза чувствительность "сульфатного ила" к сульфиду резко возрастала.

Таблица 8.

Концентрации сульфида, при которых при 55°С наблюдается 50% ингибирование максимальной удельной ацетокластической метаногенной

активности.

Тип ила pH Общий

сульфид мг S/л

мг S/л

Адаптированный 6.35-6.40 81 54

гранулированный 7.10-7.20 338 75

7.95-8.00 450 24

Неадаптирован- 6.35-6.40 33 18

ный 7.10-7.20 7г 18

дисперсный 7.95-8.00 400 21

Таким образом, термофильное анаэробное сообщество способно адаптироваться к высоким концентрациям сульфата, отвечая на это развитием сульфидогенов, и к высоким концентрациям сульфида за счет организации структуры метаногенного сообщества в гранулах, что подтверждает перспективность применения анаэробных реакторов с агрегированным ростом активной биомассы, в частности, для очистки стоков целлюлозо-бумахной промышленности.

Работа выполнена совместно с А. Виссером в Отделе природоохранных технологий Сельскохозяйственного Университета Вагенингена.

4.2.Ацидофильный метаногенез из метанола

Образование метана при кислой реакции среды имеет место в природных условиях, в частности, в верховых болотах (Williams, Crawford, 1984, 1985; Паников и др., 1992, 1993). Метановые бактерии, за исключением выделенной недавно Methanobacterium espaniole (Patel et al, 1990), имеет оптимум роста при нейтральной реакции среды и не развиваются при рН ниже 6. Осуществление метаногенеза в ацидофильных условиях привлекательно и для анаэробной очистки, так как часто поддержание нейтральной реакции среды в реакторе требует затрат дорогостоящих реактивов.

Метанол является основным загрязнителем в конденсатных сточных водах целлюлозо-бумахной и некоторых видов химической промышленности, он является также промежуточным продуктом при разложении растительных остатков и других органических отходов.

В проточном UASB-реакторе с метанолом в качестве единственного источника углерода при 30° С была пoлyчeнá и исследована накопительная ацидофильная метногенная культура [51, 63]. Из-за образования органических кислот и отсутствия подтитровки реакция среды в реакторе поддерживалась на уровне рН 4.2-4.3. • Основная часть использованного метанола превращалась в метан, 8-10% в летучие жирные кислоты, 4-5% в биомассу клеток. Метаногенное сообщество, сформировавшееся в реакторе оказалось облигатно ацидофильным. Образование метана шло только при рН 4-5, но не рН 7-8 (табл. 9). Доминирующей бактериальной формой в реакторе была метаносарцина, которая была очищена до монокультуры с помощью ванкомицина и пенициллина. Организм не развивался при рН 7, при рН 4-5 рост продолжался в течение 4-5 суток, затем после исчерпания субстрата начинался быстрый лизис клеток, вероятно обусловленный накоплением протонов в цитоплазме, который ведет к ее подкислению и инактивации бактерий (Booth, 1985). Облигатная ацидофилия метаносарцины указывает на возможную ее принадлежность к новому виду, хотя недавно показано, что рост Methanosarcina barkeri на метаноле в атмосфере Hp/COj наблюдался даже при рН 4.3 (Maestrojüan. Boon, 1991). Помимо метаносарцины в метаногенном ацидофильном сообществе показано присутствие водородокисляюшей метаногенной бактерии, имеющей морфологиическте сходство с Methanobacterium espaniolae, и метанол- и водородиспользующих

- 51 -

Образование метана и летучих жирных кислот из метанола при различных рН накопительной культурой после 10 суток культивирования.

Таблица !

рН

!Не использован--1ный метанол

Началь-!Конечный !(мкмоль)

ный

Продукты*, мкмоль

"Г

Со

! Ю4

Т-

| пС^ ! 1

I пОс-

А

4 4,2 17,2 899,2 7,3 0,0 0,0 0,0 1,3

5 5,5 8,6 930,3 6,7 1.7 0,0 0,8 2,3

7 6,0 928,1 7,8 42,1 0,0 0,0 0,0 2,7

8 7,7 945,3 3,1 49,8 5,1 1,9 6,2 4,6

й С^ - ацетат, С^ - пропионат, 10^- изобутират, пС^ бутират.пС^- капроат.

ацетогенных бактерий.

Таким образом, показано существование облигатно ацидофильного метаногенного сообщества, развивающегося на метаноле, с метаносарциной, конвертирующей метанол в метан, в качестве ведущей формы. Использование ацидофильного метаногенеза в промышленных реакторах представляется на сегодняшний день сомнительным из-за быстрого лизиса активной биомассы при недостатке субстрата. Однако, полученные данные представляют интерес для понимания процессов образования метана в экотопах с низким pH, например в болотах.

Исследования проводились в Отделе природоохранных технологий и в Отделе Микробиологии Сельскохозяйственного университета Вагенингена совместно с Л. Флоренсио, А. Стамсом и др.

4.3. Метаногенез из ацетата при 70-75°С.

До недавнего времени считалось, что метаногенез из органических субстратов ограничен температурой 7(Яс, являющейся верхней температурной границей для ацетатиспользующих метаногенов, в том числе для синтрофной культуры, не развивающейся выше 6§ С (Zinder, Koch, 1984; Lee, Zinder 1988). Нам удалось показать, что метаногенез из органических веществ, в том числе из ацетата, осуществляется и при более высокой температуре, 70-7Í [47, 57, 58, 68, 72].

4.3.1. Сиена метаногенной микрофлоры при повышении

температуры до 70-7§ С.

Несколько анаэробных реакторов, UASB и полного смешения, были инокулированы различным мезофильным посевным материалом (дисперсным осадком из метантека, навозом КРС, гранулированным мезофильным илом из промышленного UASB-реактора) и запущены в работу при температуре 67-7§ С. Реакторы снабжались минеральной средой с глюкозой, ацетатом, пропионатом. бутиратом в качестве субстратов или сточной водой целлюлозо-бумажного комбината. Во всех реакторах, на всех субстратах в течение первых 1-2 месяцев наблюдалось увеличение концентрации и вынос растворенных органических веществ с эффлюентом. С помощью электронной

- 52 -

микроскопии и экспериментов с образцами биомассы из реакторов было установлено, что это происходит благодаря лизису мезофильной микрофлоры, в том числе метанотрикса и метаносарцин, содержавшихся в посевном материале. Во всех реакторах было замечено развитие новой весьма характерной микрофлоры, которая была представлена в основном палочковидными бактериями, светящимися в ультрафиолете. Мезофильные гранулы, при сохранении видимой внешней структуры, при исследовании в электронном микроскопе оказались заполненными внутри совершенно лизированными остатками метанотрикса, от которого сохранились скелеты клеточных стенок. Снаружи гранулы обросли новой термофильной микрофлорой, представленной палочковидными бактериальными формами.

4.3.2. Синтрофное использование ацетата с образованием метана

Образованием метана из таких субстратов, как метанол, ацетат, пропионат, бутират, галловая кислота, микрофлорой из "горячих" реакторов происходило с промежуточным образованием водорода. При 75°С, метан образовывался из ацетата в эквимолярных количествах активной гранулированной биомассой из иАБВ-реактора, работавшего на смеси глюкозы и летучих жирных кислот Срис. 5). Метаногенная активность при 7§ С составляла 0,42 мМ ХПК ацетата ССЦ )/г ХПК биомассы в час. Исследование пути превращения ацетата в метан, выполнение* с помощью метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) с *3С-ацетатом, показало, что более 70% ацетата превращается в метан посредством двухступенчатого процесса: сначала происходит окисление ацетата с образованием и С0>, а затем из них синтезируется метан. Из этого и других реакторов на ацетате, были получены морфологически сходные накопительные культуры, развивающиеся вплоть до 75? С с. оптимумом при 65? -7(Я С. Ведущей формой в них является палочковидная бактерия, светящаяся в ультрафиолете и растущая в чистой культуре на водороде. С помощью ЯМР показано, что превращение ацетата в метан ацетатиспользующей культурой осуществляется на 90-95% по двухступенчатому пути с промежуточным образованием водорода. В присутствии бромэтансульфоната из ацетата образуется водород и углекислота, а при использовании Н? и I?^ СС^ в качестве субстрата образуется меченый по I, 2 и обоим положениям ацетат. Эти результаты

- 53 -

подтверждают существование реверсивного механизма синтеза и разложения ацетата синтрофной культурой, как это было описано ранее (Lee, Zinder, 1988) и подтверждено СБеляев и др. 1990), но при более высокой температуре. Образование метана из водорода водородиспользующим метаногеном, выделенным из

высокотемпературного реактора происходило при температуре вплоть до 85? С. Метаногенное сообщество, развивающееся при 70-75? С на органических субстратах содержит также бродильную микрофлору, активную и при 85°С .

й

S S

22 20 • 18 16 ■ 14 12 10 -8 64 -2 -0

—i— 0.4

1.2 1.в сутки

2.8

Рис. 5. Оброазование метана из ацетата микрофлорой

гранулированного ила из 1!АБВ-реактора, работающего при 75°С на смеси глюкозы и ацетата: I - ацетат; 2 - метан

Таким образом из мезофильного посевного материала отселекционировано метаногенное сообщество, способное осуществлять метаногенез из органических веществ при температуре 75°С. Установлено, что разложение ацетата в экстремально термофильных условиях происходит по пути синтрофного механизма, с промежуточным образованием водорода.

Этот раздел работы выполнен совместно с Ж. ван Лиром при участии других сотрудников Отделов микробиологии и природоохранной технологии Университета Вагенингена и Ю. Ринтала из Технологического Университета Тампере.

- 54 -

5. МЕТАНОГЕНЕЗ В ПСИХРОФИЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Метаногенез в психрофильных условиях исследован очень мало, хотя изучение анаэробных микробиологических процессов в экосистемах холодных климатических зон вахно для понимания их роли в биогеохимических циклах и глобальной экологии, особенно в связи с продукцией парниковых газов. Обработка отходов при низкой температуре такхе представляется выгодной в связи с сокращением затрат на обогрев реакторов. Имеются работы, в которых исследовано образование метана при низкой температуре in situ в природных экосистемах (Svensson, Rosswal,1984; Harris et al., 1985; Слободкин и др., 1992; Паников и др., 1993), а такхе биотехнололгические работы по изучению метанового сбраживания отходов хивотноводства CVfellinger, Kaufmann, 1982; Zeeman et al., 1988). Нами исследовано анаэробное разлохение органических .веществ в психрофильных условиях метаногенными сообществами трех экосистем: сброженного навоза, осадков загрязненного водоема и переувлажненной тундровой почвы [49 , 55 , 58 , 59 , 60, 64 , 65]. Целью работы было выяснение путей деградации органики и образования метана при низкой температуре, выявление особенностей психрофильных метаногенных сообществ и выделение культур микроорганизмов, характерных для них.

Работ» выполнена в основном с О.Р.Коцюрбенко, и более подробно будет представлена в его кандидатской, диссертации. В исследованиях также принимали участие С.Н. Паршина, М.В. Симанькова и др.

5.1. Низкотемпературное ыетаногенное сообщество сброженных

отходов животноводства.

Исследование в динамике метанового сбраживания при 28-6°С осадка свиного навоза, взятого из заглубленного навозохранилища, показало, резкое уменьшение продукции метана при температуре ниже 20°С. При понижении температуры ацетогенез начинал превалировать над метаногенезом. Гидролиз белковых субстратов не являлся лимитирующей ступенью процесса. Динамика промежуточных продуктов свидетельствовала о том, что собственно стадия образования метана из ацетата и водорода наиболее подвержена влиянию температуры, что

- 55 -

вызывает разбалансирование метаболических путей в сообществе [62].

Все вышесказанное справедливо и для сбраживания нативного навоза КРС при низкой температуре (рис. 6) [601. При сбраживании свежего навоза при 6°С следовые количества метана были зарегестрированы лишь после двух месяцев культивирования, а через 5 месяцев образовалось всего 3 ммоля СН^/л сбраживаемой массы. Совершенно иная картина наблюдалась, когда в начале эксперимента к свежему навозу была добавлена в качестве инокулята психрофильная микробная ассоциация, полученная нами при низкой температуре путем акклимирования из мезофильно сброженного навоза. Образование метана начиналось без лаг-фазы и концентрация метана через 1,5 мес. достигла 23 ммоль СН^/л сбраживаемой массы с удельной скоростью 1,15 ммоль С!^ /г органического вещества в месяц. Накопление ацетата происходило в начальный период процесса, затем его концентрация оставалась постоянной.

СУТКИ

Рис. 6. Образование метана и ацетата при сбраживании навоза крупного рогатого скота при б3С с помощью акклимированной психрофильной закваски и спонтанной микрофлорой Сконтроль): I - метан, 2 - ацетат, 3 - метан Сконтроль), 4 - ацетат (контроль)

Психрофильная закваска оказалась эффективной в интервале температур от 6 до 3# С. Кинетический анализ образования метана при различных температурах при спонтанном сбрахивании навоза и с помощью психрофилького инокулята показал, что акклимированное метаногенное сообщество наиболее эффективно при низких температурах, когда скорость роста и концентрация микроорганизмов в начале эксперимента при б1 С были гораздо выше Стабл. 10).

Таблица 10.

Оценки значений удельной скорости роста С^) и начальной концентрации метаногенов (Х0), полученные при кинетическом анализе экспериментальных данных.

Температура, °С Акклимированная закваска Контроль

Рш. сут"1 Х0, мг/л мт. сут"1 Х0, мг/л

35 0,232 3,7 0,312 0,647

20 0,115 2,8 0,215 0,059

15 0,088 2,2 0,134 0,023

6 0,057 1.5 0.025 0.008

Напротив, удельная скорость роста метаногенов при более высокой температуре была выше в контрольном варианте, при сбрахивании навоза спонтанной микрофлорой. После культивирования при повышенной температуре С35Р и 5#С) акклимированный психрофильный инокулят терял способность стимулировать процесс метанового сбраживания при низкой температуре.

Из акклимированного психрофильного .сообщества при низкой температуре выделены в чистые культуры сахаролитичекая бактерия, с оптимумом роста при 2? С и гомоацетатная бактерия штамм 2Н (=Б:ЗМ 8238), о которой более подробно будет сказано ниже. При 6-Ю°С получены накопительные культуры метанобразующих бактерий на Спалочковидные, вероятно Ме1ЬапоЬас1ег1ит), метаноле

- 57 -

CMethanosarcina), ацетате (Methanosarcina, Methanothrix).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в процессе акклимирования в мезофильном метаногенном сообществе происходит перестройка, при которой получают преимущество психроактивные микроорганизмы, способные развиваться при низкой температуре. При повышении температуры они вытесняются быстрорастущими мезофильными или термофильными штаммами, присутствующими в сбраживаемой массе.

5.2. Анаэробные процессы в осадках загрязненного водоема.

Целлюлозо-бумажная промышленность является типичной для северных регионов. Пробы ила из пруда системы доочистки станции аэрации Сыктывкарского лесо-промышленного комплекса были использованы для исследования влияния температуры на разложение различных органических веществ и образование метана [49, 51, 65, 713. Всего было испытано 38 субстратов с регулярными измерениями в течение года. При самосбраживании посевного материала Сила) единственным конечным продуктом при 2$ и IE? С был метан, образование каких-либо промежуточных продуктов, за исключением следовых количеств ацетата не было отмечено. При $ С метан и ацетат образовывались примерно в равных количествах (рис. 7). Это свидетельствовало о том, что в осадках пруда сформировалось хорошо сбалансированное метаногенное сообщество, активное при пониженных температурах.

Исследование динамики использования различных субстратов метаногенным сообществом проводили при инокулировании 5У. ила. Высокая концентрация субстрата и низкая концентрация микрофлоры при посеве, вероятно, разбалансировали сообщество, тем не менее, это позволило нам выявить тенденции потоков веществ, оценить трофические взаимодействия в сообществе и скорости развития различных групп микроорганизмов. Скорость разложения всех испытанных субстратов строго зависела от температуры. Однако даже при 8 С, за исключением нескольких ароматических соединений и жирных кислот, происходило использование практически всех испытанных веществ, в том числе полимерных. При разложении целлюлозы формировалось полноценное микробное сообщество, конечным продуктом которого был метан. Скорость разложения субстратов

- 58 -

первичными анаэробами была наиболее высокой, в результате чего в качестве промежуточных продуктов накапливались жирные кислоты, в первую очередь ацетат, пропионат и бутират. Синтрофное разложение продуктов первичных анаэробов представляется наиболее узким местом в психрофильном процессе, оно обусловлено слабым водородным метаногенезом.

метан, ацетат СмЮ

сутки

Рис. 7. Образование метана в пробах ила загрязненного водоема: I - метан, 28°С; 2 - метан, 15°С; 3 - метан 6°С, 4 - ацетат, 6°С.

Психрофильные условия характеризуются высокой конкурентоспособностью гомоацетатных бактерий по отношению к метаногенам. Эту группу можно считать наиболее характерной для низкотемпературного сообщества. Наблюдается четкая тенденция в использовании субстратов, служащих источником водорода - самого Н2. формиата, окиси углерода. При понижении температуры они преимущественно используются гомоацетатными бактериями с образованием ацетата. Ацетат является основных! предшественником метана в исследуемой экосистеме. Он накапливается в первой фазе процесса, затем следует ацетокластический метаногенез, скорость которого замедляется пропорционально понижению температуры = 3). Метаногенез из С1-субстратов, метанола и триметиламина, меньше

- 59 -

подавляется при понижении температуры (Qj0 = 2), однако при 6°С из метанола образуется значительное количество ацетата.

Таким образом, для исследуемой экосистемы наиболее характерным является ацетогенный сдвиг при низкой температуре.

5.3. Психрофильный метаногенез в пробах из тундрового болота

С целью сравнения микробных сообществ, способных осуществлять метаногенез при пониженной температуре были исследованы также анаэробные процессы в пробах переувлажненной почвы из верхового болота кустарничковой тундры, которая является примером природной низкотемпературной экосистемы [59, 64, 71]. Наиболее интересным представлялось исследовать конкурентные отношения ацетогенов и метаногенов, входящих в анаэробное микробное сообщество тундрового болота.

Образование метана и ацетата в разбавленных вдвое образцах тундровой почвы наблюдалось при температуре от 28 до 6°С с увеличением доли ацетата при понижении температуры. Максимальное образование ацетата наблюдалось при , однако затем он превращался в метан. Исследование использования водорода этими образцами, показало, что при 28° водород-углекислотная смесь превращалась прямо в метан, при 15? и ниже наблюдалось в первой фазе одновременное образование метана и ацетата, а во второй использование ацетата с образованием метана. Таким образом, даже при 6°С единственным конечным продуктом при использовании водорода микрофлорой тундровой почвы был метан. Тем не менее роль литотрофного ацетогенеза повышалась с понижением температуры. Ацетогенный сдвиг при 1ЕР был более ярко продемонстрирован, когда количество посевного материала и соответственно начальная концентрация микроорганизмов были в 10 раз ниже 159]. В этом случае при 28° водород использоваляся с образованием метана, а при 15° и ниже - ацетата. Такие же результаты получены при использовании формиата и окиси углерода, метанол при всех температурах использовался с образованием ацетата. Таким образом в метаногенном сообществе тундровой почвы наиболее уязвимыми при дисбалансе сообщества оказываются метановые бактерии, использующие водород, и особенно ацетат.

сутки

Рис. 8. Образование метана из водорода микрофлорой тундрового болота: I - водород, 2 - метан, 3 - ацетат.

Для исследования трофических взаимоотношений в метанобразувдем сообществе тундрового болота был также использован метод наблюдения за изменением характерных продуктов и субстратов различных функциональных групп микроорганизмов в нем. В целом, результаты этих исследований соответсвуют выводам, сделанным выше для анаэробных процессов в осадках загрязненного водоема. Наиболее важное отличие заключается в том, что является оптимальной температурой для метаногенного сообщества тундрового болота, которое, таким образом, является истинно психрофильным. Полученные результаты совпадают с данными Омельченко и др. (1993}, выделившими из этой же экосистемы и описавшими психрофильную метанотрофную бактерию МеИгу^сосстк эр.

5.4. Гомоацетатные бактерии, выделенные из низкотемпературных экосистем.

Гомоацетатные бактерии можно считать наиболее характерной группой для анаэробного разложения органического вещества при низкой температуре. При € С выделены в чистые культуры и исследуются три штамма гомоацетатных бактерий [55, 721:

- 61 -

штамм 2-13 С=ОБМ 8238) из сброженного при низкой температуре навоза КРС,

штамм 2-11 С=Б5М 8239) из осадков загрязненного водоема, штамм 2-Т из тундрового болота.

Клетки всех выделенных штаммов представлены подвижными палочками с закругленными концами, грамположителъные, споры не обнаружены. Для всех штаммов рН-оптимум находится между 6 и 7. Все они растут на Н, /С0> при 6? С и образуют только ацетат, но различаются по набору используемых субстратов, составу липидов клеточной стенки и другим признакам. По морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам штаммы 2-11 и 2-13 отнесены к роду Асе1оЬас1ег1ит СБМпк, Вотаг, 1992). Сравнение с типовыми штаммами Асе1оЬас1ег1ит угоосШ, А. «1ег1пдае, А. сагЬопоПсиш и А. шаПсиш показало, что выделенные психроактивные гомоацетатные бактерии представляют новые виды. Для штаммов 2-11 и 2-13 соответственно предложены видовые названия Асе1оЬас1ег1шп ЬакП и А. Птиагхшп. Штамм 2-Т, выделенный из тундрового болота еще недостаточно исследован, его таксономическое положение еще не определено, возможно он тоже будет помещен в род Асе1оЬас1ег1ит.

Все выделенные организмы характеризуются достаточно высокой скоростью роста при 1-Й5С. Однако, они различаются по оптимальным температурам роста, которые совпали с характерными оптимумами для сообществ, из которых они были выделены. Штамм 2-13, выделенный из сброженного при низкой температуре навоза, имеет температурный оптимум роста при 30°С и может быть отнесен к психроактивным мезофилам. У штамма 2-1I, выделенного из осадков загрязненного водоема, температурный оптимум находится при 2(Яс, этот организм может быть отнесен к психротрофам. Штамм 2-Т растет с почти одинаковой скоростью в интервале температур от, 1° до 1£Рс, не исключено, что он является психрофилом.

5.5.Сравнительный анализ низкотемпературных микробных сообществ.

Во всех трех экосистемах, описанных выше, осуществляется психрофильный метаногенез. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в осадках водоема и в тундровой почве присутствуют

- 62 -

сбалансированные покхроактивные метаногенные микробные сообщества. Характерным для всех исследованных сообществ является то, что ацетат по-видимому служит основным предшественником метана в психрофильных условиях. Роль литотрофного ацетогенеза увеличивается с понижением темпетатуры. Представляется, что взаимодействие ацетогенов и ацетатиспользующих метаногенов определяет скорость последних ступеней метаногенеза в холодных местах обитания.

Для пониженной температуры характерно большое замедление процессов роста, что приводит к значительным лаг-фазам в использовании субстратов в сообществе. Медленное размножение бактерий предопределяет медленность процесса минерализации растительных остаков и соответственно медленность малого круговорота веществ. Вместе с тем, при накопленной биомассе процессы деградации идут довольно быстро. Отсюда следует заключить, что для северных районов не только высшие растения, но и бактериальное звено оказывается весьма уязвимым, для накопления активной биомассы требуются сотни суток.

Главным различием для исследованных экосистем являются оптимальные температуры роста микроорганизмов и функционирования метаногенных сообществ. Представляется, что микробное сообщество из тундровой почвы, имеющее температурный оптимум при 15°С, является действительно психрофильным. Метаногенное сообщество осадков сыктывкарского пруда может быть классифицировано как поихротрофное. Во время летнего периода, когда вода в водоеме прогревается до 28 С и даже выше, может накапливаться микробная биомасса. Наконец, низкотемпературное микробное сообщество сброженного навоза представлено психротолерантными мезофильными бактериями и акклимирование означает преимущественное развитие мезофильных бактерий, способных расти при низкой температуре.

Сравнение удельных метаногенных активностей исследованных экосистем Стабл. II) свидетельствует о том, что в сброженном навозе она в десятки и сотни раз выше, чем в природных экосистемах. Удельная метаногенная активность, рассчитанная на единицу органического вещества в пробе, прямо зависит от плотности активной микробной популяции, следовательно в сброженном навозе концентрация метаногенов гораздо выше, чем в пробе из тундрового

- 63 -

болота, где содержание органики очень высоко, а микробная биомасса составляет небольшую ее часть.

Таблица II

Удельные метаногенные активности при 6°С в пробах из исследованных экосистем

Проба ммоль СНд ммольСН^

мес. х г сухого в-ва мес. х г орг. в-ва

навоз КРС 0,54 1,15

осадок пруда 0,0031 0,09

тундровое болото 0,002 0,034

Для осуществления биотехнологического процесса обработки отходов при низкой температуре важно накопление и удержание в реакторе активной микробной популяции. Для сбраживания полужидких отходов животноводства или осадков сточных вод при пониженной температуре в реакторах первого поколения необходимо на начальном этапе применение большого количества психрофильного инокулята или длительная акклимация мезофильного сообщества, а затем рецикл значительной части сброженной массы. Для обработки жидких отходов гораздо более перспективными являются современные реакторы, обеспечивающие высокую концентрацию биомассы в рабочем пространстве. Кроме того, иАБВ-реакторы и анаэробные биофильтры очень эффективны для селекции необходимых микробных сообществ. Перспективным для биотехнологии представляется получение низкотемпературных микробных сообществ из микрофлоры естественных мест обитания.

6. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ НА ОБЪЕКТАХ ЗАХОРОНЕНИЯ ТВЕРДЫХ

БЫТОВЫХ ОТХОДОВ

Объекты захоронения твердых бытовых отходов СТБО), полигоны и свалки, считаются одним из наиболее значительных источников парниковых газов - метана и углекислоты, загрязняющих атмосферу. В

- 64 -

то же время, являясь антропогенными сооружениями, эти объекты подлежат контролю. В отличие от природных и большинства других антропогенных источников метана, технология организации и эксплуатации объектов захоронения ТБО может совершенствоваться с целью уменьшения их вклада в парниковый эффект и глобальное изменение климата СКо1пш)5 е1 а1., 1992).

6.1. Масштаб процесса и технология захоронения ТБО

Ежегодно в городах мира образуется около 500 млн. тонн твердых бытовых отходов СТБО), основная часть которых утилизируется путем захоронения на специально организованных полигонах и на стихийных свалках. В городах стран бывшего СССР ежегодно образуется около 40 млн. тонн ТБО, а крупные полигоны ТБО занимают »более 140 тыс. гектаров СГорбатюк и др. 1989). Значительная часть городских бытовых, строительных и промышленных отходов захоранивается на несанкционированных < свалках, обычно оказывающихся в непосредственной близости от городов или даже внутри их, так на территории Москвы зарегестрировано более 80 таких объектов. Для организации крупных полигонов ТБО обычно используются карьеры, овраги и другие понижения рельефа. Захораниваемый мусор пересыпается слоями песка или глины, при закрытии .полигона тодвцша запирающего слоя грунта обычно составляет около 0,5 метра. Мощность слоя сварочных отложений достигает десятков и в отдельных случаях даже сотен метров при содержании органических компонентов до 50-60%, площадь варьирует от первых единиц до сотен гектаров. В свалочных отложениях спонтанно формируется анаэробное микробное сообщество, осуществляющее деградацию органики с образованием биогаза, состоящего из метана (до 60'/.), углекислоты (до 40%) и большого числа других газообразных и летучих компонентов (Минько и др., 1993) [61, 66]. Активное газообразование начинается обычно через несколько лет после закрытия объекта, или его части, и остается особенно интенсивным на протяжении 20-40 лет» затем процесс постепенно затухает по мере исчерпания биодеградабельной органики (Горбатюк и др., 1989). Масштабы образования метана и диоксида углерода на объектах захоронения ТБО настолько велики, что они

- 65 -

считаются одним из основных антропогенных источников парниковых газов. По последним данным их вклад в эмиссию метана в атмосферу оценивается в 40 Тг/год, что составляет 7% от общей глобальной эмиссии метана (Rotmans et al., 1992>. Помимо глобального эффекта загрязнения атмосферы, объекты захоронения бытовых отходов имеют существенное отрицательное экологическое воздействие локального характера, которое связано с загрязнением приземного воздуха, грунтовых вод и почвы, созданием пожаро- и взрывоопасных ситуаций. Кроме того под свалки и полигоны изымаются значительные территории, рекультивация которых представляет чрезвычайно серьезную проблему.

Совместно с В. К. Некрасовой и с сотрудниками Раменского филиала ВНИИГеоинформсистем В.С.Лебедевым, А.Б. Лифшицем и др. проведено комплексное исследование процессов образования и окисления метана на объектах захоронения ТБО С17, 31, 34, 52, 67, 71].

6.2. Характеристика объектов исследования

Все объекты захоронения ТБО являются чрезвычайно гетерогенными образованиями, что определяется практикой складирования отходов. Это, в свою очередь, определяет неравномерность распределения очагов генерации биогаза, мозаичную картину его миграции и выделения с поверхности в атмосферу. В толще свалочных отложений преобладают анаэробные микробиологические процессы. Лишь в самом верхнем аэрируемом слое грунта происходят микробиологические окислительные процессы. Мощность аэробной зоны зависит от глубины проникновения кислорода воздуха в свалочный грунт, обычно она не превышает I м. При наличии мощных потоков биогаза из анаэробной зоны они могут препятствовать диффузии кислорода.

Работу проводили в основном на крупном полигоне ТБО "Кучино" и небольшой несанкционированной свалке "Раменки" на юго-западе Москвы. Отдельные исследования были выполнены на полигоне' "Митино"; Выбранные для исследований объекты захоронения ТБО различались по размерам, мощности и возрасту свалочных отложений, концентрации органического вещества в них. Характеристики объектов исследования приведены в таблице 12 [31, 61, 66, 71].

- 66 -

Таблица 12

Параметры обследованных объектов захоронения ТБО и

состав генерируемого биогаза.

Объект Кучино Раменки Митино

Параметр

Площадь, га 60 6 50

Мощность отложений, м 8-20 2-5 10-20

Время окончания

эксплуатации, лет 15 10 2

Содержание Сорг> У. Состав биогаза, % : 5-12 3-5 10-15

•

сн4 65-69 62-64 55-60

С0? то Изотопный состав С, й^С: 21-34 34-37 22-27

сн4 -58 - -60 -40 - -55 -52

со2 +0,8 - -I +4,5 - -10 НО

Максимальная скорость

генерации метана.

моль СНд/Скг а. с. в. х сут.) 2.2 0,23 НО

Максимальные потоки газов

с поверхй&сти, м^/м^.час: ЗхЮ"5

сн4 2хЮ"3 следы

со2 46хЮ~4 6x10"* НО

«2 0 0 8хЮ~4

НО - не определяли

6.3. Образование метана в анаэробной зоне.

Метаногенная активность грунтов обследованных объектов существенно различалась: на свалки "Раменки" она была в среднем на порядок ниже, чем на полигоне "Кучино". Это объясняется прежде всего низким содержанием органического вещества в захоронениях свалки Стабл. 12)

На полигоне Кучино были проведены исследования образования

- 67 -

метана пробами грунта, с глубин от 0,5 до 20 м., отобранными при бурении скважин в разных точках полигона. Усредненные данные по составу биогаза приведены в табл. 6-1. Одновременно определяли состав и скорость образования биогаза и характеристики грунта. Свалочное тело формирует температурную аномалия, в некоторых скважинах температура возрастала с глубиной. В анаэробной зоне она обычно варьировала от 2§ до 3§ С, достигая иногда на приповерхностных участках 50-60°С. Метаногенная активность свалочного грунта коррелировала с высоким содержанием органического вещества, нейтральной реакцией среды и относительно низкими концентрациями летучих лирных кислот. Высокое содержание последних было характерно для участков с преобладанием масляно-кислого брожения. Из-за гетерогенности свалочного тела наиболее активные зоны образования метана располагались на" разных уровнях, иногда возрастая с глубиной. Однако, характерным для этого объекта, во всяком случае для обследованного участка, было наиболее активное образование метана в верхней части анаэробной зоны на глубине 2,5-6 м. Стабл. 13). Скорость образования метана в пробах взятых с этой глубины была в 5 раз выше, чем в взятых с глубины 13-16 м. В верхнем слое анаэробной зоны также наблюдалась наибольшая концентрация органического вещества, летучих жирных кислот л микробной биомассы. С глубиной эти показатели уменьшались, однако численность и потенциальная активность анаэробной микрофлоры оставались высокими [17, 31, 54, 61, 66]. Максимальная активность метаногенеза в образцах грунта наблюдалась при 35-4(9 С и при содержании 4-10% сухого вещества, из чего следует, что метаногенное сообщество грунта полигона ТБО представлено мезофильной микрофлорой. В накопительных культурах, полученных на метаноле, ацетате, метиламине наблюдалось обильное развитие метаносарцины, на ацетате отмечено также развитие метанотрикса. При использовании в качестве субстратов формиата и водород-углекислотной смеси развивались палочковидные формы Ме1ЬапоЬас1ег1ит.

Изотопный состав углерода свалочного биогаза в целом типичен для метаногенеза из органического материала. Метан из сважин полигона Кучино был легче, чем на Раменской свалке. Это может быть объяснено более высоким содержанием органики в грунте полигона

- 68 -

Таблица 13

Основные характеристистики проб грунта полигона ТБО из разных горизонтов и образование метана при 25°

Горизонт, а.с.в., г/=„3 | | Г1 1 -"■■-■- сорг,^ а,с,в' .'Микробная ! ¡биомасса по! ! ДДК | | "[ ЛЖК, г/кг | ацетат ! пропионат ! сн4 Щ/(г а ме

2,5-5 0,33 11,36 35 0,2-0,3 0,02-0,03 60,8

8-11 0,37 7,4 19 0,02-0,03 34,1

16-18 0,34 4,9 21 0,009-0,012 2,2

8

I

Кучино. Микроорганизмы предпочитают легкий изотоп углерода тяжелому. Однако, при низкой концентрации доступной органики и более глубокой степени ее деградации метан может обогащаться тяжелым изотопом углерода. При исследовании роста Ме1Ьапозагс1па уасио1а!а было установлено, что при росте в присутствии избытка метанола образовывался легкий метан, по мере исчерпания субстрата образующийся метан утяжелялся [7, 213.

Биогаз свалок содержит большое количество примесей. Водород и окись углерода являются наиболее значительными в количественном отношении. Их присутствие особенно характерно для "молодых" объектов. На полигоне "Митино" был отмечен даже выход этих газов в атмосферу.

6.4. Окисление газов в верхнем аэрируемом слое грунта

На границе анаэробной и аэробной зон свалочного тела формируется переходный слой. Его месторасположение и толщина зависят от интенсивности газовых потоков из анаэробной зоны. Концентрации основных газов, метана углекислоты и азота на глубине 70 см варьируют от нулевых до максимальных, свидетельствуя либо об интенсивных процессах окисления, либо о выходах мощных потоков биогаза из глубины. В одних и тех же образцах грунта, взятых на глубине 50-90, см. обнаружено присутствие как метанобразущих, так и метанокисляющих бактерий, получающих преимущество при соответствующей окислительно-восстановительной обстановке среды [61, 66, 67, 713. Вверх по разрезу грунта на глубине 80-10 см происходило резкое уменьшение концентрации метана за счет его окисления. При этом благодаря фракционированию изотопов углерода наблюдалось утяжеление остающегося метана и облегчение образующейся углекислоты. Между характером изменения концентрации метана, изотопного состава метана и активности метанокисляющей микрофлоры наблюдалось хорошее совпадение (рис. II}.

Активность метанокисляющей микрофлоры верхнего слоя свалочного грунта варьировала в широких пределах в зависимости от места и глубины отбора проб. В целом газоокисляющая активность проб Кучинского полигона при 2§ С составляла около 0,4 ммольСН^/сут. х г сухого вещества грунта, а свалки Раменки 0,2

- 70 -

ммольСН^/сут. х г. При понижении температуры до 5-7°С газоокисляющая активность этих же образцов была в 3-5 раз ниже, оставаясь, однако, достаточно высокой, что свидетельствует о возможности протекания процессов окисления метана в естественных условиях при пониженных температурах. Численность метанокисляющих бактерий, определенная методом 10-кратных серийных разведений, дающих заниженный на 1-2 порядка результат, составляла 10^-10® кл/г сырой почвы. Морфологические и культуральные признаки полученных при 25"и £?С накопительных культур свидетельствовали о присутствии в них представителей различных родов и видов метанокисляющих бактерий. Иммунологическим методом были идентифицированы II видов метанотрофных бактерий, 6 из них оказались способны расти при £Рс, что свидетельствует о способности известных видов или их отдельных штаммов к росту при низкой температуре Стабл. 14)..

"И^ /

геохимических

'/.о

параметров

свалочного

Рис. 9. Изменение грунта по глубине.

По оси ординат: I - метан, '/,; 2 - углекислый газ, %; 3 - интенсивность окисления метана, ммоль/г а. с. в. в сутки; 4 - углекислоты.

В пробах с глубины 10-80 см обнаружена также активная водород- и СО-окисляющая микрофлора, активная также и при пониженной температуре. Численность водородокисляющих бактерий в сыром грунте достигала Ю11 кл/г, а СО-окисляющих - до 10®кл/г.

- 71 -

Таблица 14

Виды метанотрофных бактерий, идентифицированные иммунологическим методом в накопительных культурах, полученных из грунта верхнего слоя полигона ТБО, частота присутствия в образцах грунта С/.? и способность расти при 6°С**.

Вид Частота Рост при 6°С

присутствия, %

Methylococcus capsulatus 30 -

Methylomonas albus 90 ++

Methylobacter bovis 90 +++

Mb. chroococcum 100 ++++

Mb. capsulatus 30 -

Methylosinus sporium 60 +

Ms. thrichosporium 30 -

Methylocystis parvus 100 +++

Mcs. minimus 30 +

Mcs. piriformis 40 -

Mcs. echinoides 70 +-

* - количество образцов грунта, в которых вид был обнаружен, У. ** - количество бактериальных клеток в поле зрения микроскопа: С+-) - 1-2, С+) - 5-20, С++) - 20-50, С+++) - 50-100, С++++) - более 200

Выделенные культуры принадлежали к родам Pseudomonas, AIcaligenes, Comamonas, Micrococcus [32]. На минеральной среде без аммония в атмосфере водорода и воздуха получено обильное развитие Mycobacterium flavum. Ранее нами было показано, что эта бактерия способна к фиксации молекулярного азота при автотрофном росте за счет окисления водорода СНожевникова, Калининская, 1977, Калининская. Кожевникова, 1978).

Таким образом, в верхнем аэрируемом слое грунта объектов захоронения ТБО наблюдается развитие гаэоокисляющей микрофлоры, активной при пониженной температуре, и формирующей бактериальный

- 72-

биологический фильтр, уменьшающий эмиссию метана и других восстановленных газов в атмосферу. На свалке Раменки весь образующийсяв анаэробной зоне метан полностью окисляется в углекислоту. На Кучинском полигоне ТБО в летнее время окисляется порядка 50% генерируемого метана.

Автор выражает глубокую благодарность В.Ф. Гальченко за помощь в идентификации метанотрофов.

6.5. Эмиссия газов с поверхности объектов захоронения ТБО в

атмосферу.

Все исслеждованные объкты захоронения ТБО формируют над своей поверхностью газовые аномалии. Интенсивность газовых эмиссионных потоков была крайне неравномерно распределена по поверхности объектов. Максимальные зарегестрированные потоки приведены в табл. 12. Интенсивности газовых потоков зависят от количества, концентрации и степени преобразования органического вещества грунтов. Потоки метана с поверхности "зрелого" полигона "Кучино" были почти на 2 порядка выше, чем с "молодого" полигона "Митино", на последнем, однако, наблюдалось выделение водорода, что обусловлено несбалансированностью анаэробных процессов. На свалке "Раменки" метан в атмосферу не выделялся, газовая аномалия над поверхностью свалки обусловлена выделением углекислоты, обогащенной легким изотопом углерода [61, 71].

С учетом городского населения страны, количества захораниваемых отходов, скорости метаногенеза, окисления метана в аэрируемой зоне и т.д., была произведена оценка вклада объектов захоронения ТБО стран СНГ в глобальную эмиссию метана. По весьма приблизительному расчету этот вклад может быть оценен в 1.7 Тг иЛи 2,33 м^ метана в год [661.

6.6. Биотехнологические методы охраны атмосферы от

загрязнения свалочными газами.

Подсчитано, что снижение эмиссии метана в атмосферу на 10% позволило бы стабилизировать концентрацию метана в атмосфере и предотвратить развитие тепличного эффекта CRotmans et al., 1992).

- 73 -

Очевидно, что этого можно достичь только за счет уменьшения антропогенной эмисии метана.

Нарушение верхнего слоя грунта ТБО приводит в резкому увеличению выделения метана в атмосферу. Проведение земляных работ на объектах захоронения ТБО С при прокладке коммуникаций, строительстве и т.п.) нарушает структуру газовых потоков внутри свалочного тела и может привести к возникновению пожаро- и взрывоопасных ситуаций. Напротив, неглубокий дренаж , приводящий к увеличению объема аэрируемого слоя грунта, в конечной итоге приводит к уменьшению выделения метана в атмосферу. В наших опытах было исследовано формирование аэробного газоокисляющего биофильтра вокруг шурфа размером 60 х 60 х 60 см [61]. Вначале наблюдалось увеличение выделения метана, однако, благодаря доступу кислорода и подтоку газов из анаэробной зоны, в прилегающем к шурфу грунте наблюдалось развитие газоокисляющих бактерий, активность которых на глубине 60-100 см за полевой сезон увеличилась в десятки раз. Влияние шурфа рспространялось в радиусе до 2,5 м.

Из данных проведенных исследований вытекают два очевидных способа уменьшения вредного влияния объектов захоронения ТБО на окружающую среду. Для небольших свалок представляется целесообразным активация аэробных окислительных процессов в верхнем слое путем насыпки рыхлого грунта, посадки травянистой или кустарниковой растительности с мощной корневой системой, закладки дренажных канав и другие способы активации окислительных процессов. Перспективным является также разработка препарата газоокисляющих бактерий для использования в качестве инокулята в процессе рекультивации свалок и эксплуатации крупных полигонов (для пересыпающих и запирающих слоев грунта). Для обезвреживания крупных полигонов ТБО наряду с активацией окислительных процессов реальным является откачка и использование биогаза как энергетического сырья, что уже реализовано на экспериментально-промышленной станции на полигоне "Кучино". В ряде развитых стран производится промышленная добыча свалочного биогаза СRichards, 1989). В свете последних данных по вкладу объектов захоронения ТБО в развитие тепличного эффекта представляется, что экологический аспект этих мероприятий не менее важен, чем энергетический.

выводы

1. Активность метаногенного микробного сообщества определяется взаимодействием между различными функциональными группами микроорганизмов. Критическим фактором для сообщества является степень развития ацетокластических метаногенов, способных усваивать ацетат в низкой концентрации. Экспериментально установлена регуляторная роль концентрации ацетата при разложении летучих жирных кислот и спиртов. Открыт и описан новый вид ацетокластических метаногенов Methanot.hr 1х 1Ьегтоасе1орЫ1а, развивающийся при температуре до 65°С.

2. В сбалансированном метаногенном сообществе устанавливается стационарная концентрация водорода. Для термофильного сообщества, функционирующего при 50-й?С, она составляет 50-60 ррп, а для мезофильного 5-6 рри, что соответствует пороговым концентрациям водорода соответственно для термофильных , и мезофильных водородиспользующих метаногенов. Концентрация водорода в биогазе может служить оперативным индикатором состояния микробного сообщества в анаэробном реакторе.

3. Путем автоселекции природной микрофлоры получены анаэробные метаногенные сообщества, адаптированные к определенным физико-химическим условиям среды, в том числе неблагоприятным и экстремальным: облигатно ацидофильное метаногенное сообщество, развивающееся на метаноле при рН 4,2-4,5 с метаносарциной, конвертирующей метанол в метан, в качестве ведущей формы; термофильное сообщество, функционирующее при температуре 75°С; психрофильное, активное при 6°С.

4. Установлено зависимое от температуры различие направлености процессов, непосредственно предшествующих образованию метана. В экстремально термофильном метаногенном сообществе, развивающемся при 70-7!? С, разложение ацетата осуществляется не ацетокластическими метаногенами, а происходит по пути синтрофного механизма с промежуточным образованием водорода.

5. В психрофильном анаэробном сообществе с понижением

- 75 -

температуры увеличивается роль литотрофного ацетогенеэа, в то время как использующие водород метаногены мало активны. Основным предшественником метана при низкой температуре является ацетат, синтез которого из Н2+С02, формиата, окиси углерода гомоацетатными бактериями предшествует образованию метана. Выделены психроактивные ацетогенные бактерии, отнесенные к новым видам Асе1оЬас1ег1ит Ьаки и Асе1оЬас1ег1ш ПтИаПит.

6. Установлены микробиологические закономерности и даны характеристики облигатных анаэробов в метантенках первого поколения. Подобраны условия для формирования метаногеннных обрастний в биореакторах второго поколения (анаэробный биофильтр) и выданы рекомендации для разработки новой технологии обработки отходов животноводства.

7. Изучены закономерности формирования агрегированных метаногенных консорциумов Сгранул) в биореакторах третьего поколения сиАБВ-реакторах), работающих на различных типах стоков при разных физико-химических условиях. Установлены кинетические параметны при переходе реактора на новый режим с повышением нагрузки по субстрату, показано что наиболее активной зоной реактора является та его часть, где находятся молодые развивающиеся гранулы.

8. Исследованы микробиологические процессы в полигонах захоронения ТБО и показано, что несмотря на крайнюю гетерогенность системы, существует закономерная смена слоев грунта с качественно различной микробиологичесикй активностью. Установлено, что температура в свалочном грунте крупных полигонов постоянна и метаногнез осуществляется мезофильным метаногенным сообществом.

9. Показано, что в верхнем аэрируемом слое грунта объектов захоронения твердых бытовых отходов присутствует активная газоокисляющая микрофлора, представленная мезофильными бактериями, активными и при пониженной температуре. Эта микрофлора формирует биологический фильтр предотвращающий (или снижающий) проникновение в атмосферу метана и других окисляемых газов.

- 76 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кожевникова А. Н. ,Ягодина Т. Г. , Термофильная ацетатная метанобразующия бактерия СТАМБ). Микробиология, 1982, Т. 51, вып. 4, 642-649.

2. Ножевникова А. Н., Мельник Р.А., Ягодина Т.Г., Евдокименко И. И. Активные ассоциации микроорганизмов для интенсификации метаногенеза на отходах животноводства. Материалы Всесоюзной конференции по биологическим методам переработки жидкого навоза. Киев. 1983, С. 96-105.

3. Третьякова В.П., Пузанков А.Г., Бородин В.П., Жилина Т.Н., Ножевникова А.Н., Мельник Р.А., Евдокименко И. И. Синтрофная ассоциация микроорганизмов CA-I00I для переработки органических отходов сельского хозяйства в метан. Авт. свид. SU №Ю49э37, С 12 № 1/00, 1983.

4. Мельник Р.А., Ножевникова А.Н.. Ягодина Т.Г., Евдокименко И. И. Синтрофная ассоциация микроорганизмов №1002 для переработки навоза крупного рогатого скота в метан. Авт.свид. SU №1104152, С 12 № 1/00, Ï984.

5. Ножевникова А.Н., Чудина В. И. Морфология термофильной ацетатной метановой бактерии Methanothrix tnermoacetophila п. sp. Микробиология, 1984, 53, вып.5, С. 756-760.

6. Бонч-Осмоловская Е.А., Жилина Т.Н., Ножевникова А.Н., Слесарев А. В. Экстремально термофильные анаэробные бактерии гидротерм кальдеры Узон. Тезисы Всесоюзной конференции по вулканологии,»1985.

7. Калюжный С. А., Ножевникова А. Н., Варфоломеев С. Д. Кинетические закономерности роста Methanosarcina vacuolata. Микробиология, 1985, 54, вып.2, С.257-262.

8. Ножевникова А.Н., Ягодина Т.Г. Метаногенная микрофлора навоза крупного рогатого скота. Материалы Советско-Чехословацкого симпозиума "Копрологические аспекты промышленного животноводства", Ужгород, 1985, С. 56-61.

9. Nozhevnikova A.N. Participation of Methanothrix thermoacetophila in methanogenesis from complex organic substrate. Ananerobic digestion, Mircen, 1985 , 2j_ N4, P. 5-6.

10. Жилина Т.Н., Бонч-Осмоловская Е.А., Ножевникова А.Н. Метанобразующие бактерии и ассоциации. В сб. "Биоконверсия растительного сырья", М. Наука, 1986, С. 30-59.

11. Мельник Р.А., Ножевникова А.Н., Евдокименко И.И., Ягодина Т. Г.Способ метанового сбраживания навоза. Авт.свид. SU №1247354, С 12 N 1/20, 1986

12. Ножевникова А.Н., Мельник Р.А., Ягодина Т.Г. Поиски микробиологических путей интенсификации процесса метанового сбраживания отходов животноводства. В сб. "Биология термофильных

микроорганизмов". М. Наука, 1986, С.244-248.

13. Кожевникова А.Н., Чудина В. И. Цитологические особенности термофильной ацетатной метанобразующей бактерии Methanothrix thermoacetophila. В сб. "Биология термофильных микроорганизмов". М. Наука, 1986; С. I4I-I46.

14. Nozhevnikova A.N. The leading role of methanoganic bacteria in functioning of anaerobic microbial assotiation. Proc. of V Int.Symp. "Microbial growth on C-I compounds", Haren, the Netherlands, 1986, Poster abstr. 2.16

15. Быховский В.Я., Зайцева Н.И., Жилина Т.Н., Нохевникова А. Н., Заварзин Г. А. Биосинтез витамина BI2 и его аналогов метанобразующими бактериями и ацетогенными метилотрофами. Докл. АН СССР, 1987, 294 СЗ), С. 719-722.

16. Nozhevnikova А. N., Simankova М. V. The role of hydrogen-utilizing methanogenic bacteria in methanogenesis from organic substrates. Absr. of FEMS-sumposium on biochemistry and genetics of cellulose degradation. Paris, 1987.

17. Ножевникова А.Н. Елютина Н.Ю. Микробиологическое исследование грунта полигонов захоронения твердых бытовых отходов. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Техническая биоэнергетика", Рига, 1987, стр.81.

18. Ножевникова Д.Н., Слободкин А. И. Влияние метанобразуювдх бактерий на разложение этанола термофильной метаногенной ассоциацией микроорганизмов. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Техническая биоэнергетика", Рига, 1987, стр. 93.

19. Быховский В.Я., Зайцева Н.И., Жилина Т. Н., Ножевникова А.Н. Корриноиды метанобразуюдих бактерий. В сб. "Архебактерии" (ред. Г.А. Заварзин), Пущино, ЦБИ, 1988, С. 48-75.

20. Ковалев А.А., Лосяков И. П., Ножевникова А.Н., Кузнецов Л. Е., Слободкин А. И. Пилотная установка для исследования процесса биоконверсии отходов животноводства и оценка активности метаногенной микролоры. Материалы респ. научно-техн. конф. "Анаэробная биологическая обработка сточных вод' Кишинев, 1988, С. 87-92.

21. Лебедев B.C., Ножевникова А.Н., Горштейн, Фракционирование изотопов углерода при синтезе метана из метилового спирта культурой Methanosarcina vacuolata при 36 С. Микробиология, 1988, 57, вып.2, С. 209-213. ~~

22. Ножевникова А.Н. Биотопливо и микроорганизмы. В сб. "Биоценоз в природе и практике" Пущино-на-Оке, ЦБИ АН СССР, ОНТИ, 1988 , 93гЮ9 '

23. Ножевникова А.Н., Жилина Т.Н. , Соколова Т.Г. Видовой состав метановых бактерий в сброженном навозе крупного рогатого скота. Прикл. биохим. микробиол.. 1988 , 24, вып. 4, С. 555-559.

24. Ножевникова А.Н., Кузнецов Л.Е., Кольцова З.М., Луценхо Г.Н. Влияние термофильной ассоциации ацетат-используюиих

метанобразующих бактерий на интенсивность метаногенеза в осадках сточных вод. Материалы респ. научно-техн. конф. "Анаэробная биологическая обработка сточных вод" Кишинев, 1988, С. 97-101.

25. Нохевникова А.Н., Симанькова М.В., Слободкин А. В., Боднар И.В., Соколова Т.Г. роль метаногенных архебактерий в анаэробном разложении органических веществ. В сб. "Архебактерии" , Пущино, ЦБИ, 1988, С. 29-36.

26. Нохевникова А.Н., Слободкин А. И., Соколова Т. Г. Динамика потребления и выделения водорода метаногенным сообществом микроорганизмов. Тезисы Всесоюзной конференции "Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды" Пущино, 1988.

27. Nozhevnikova A.N., Slobodkin A.I. The role of Methanothrix Ihermoacetophila in anaerobic thermophilic degradation of ethanol with methane lormation. Abstr. of VlII Int. Biotechnology Symp.,

1988, Paris, Abstr. book 2nd, add. list, p.8.

28. Заварзин Г.A., Ковалев . A., Ножевникова A. H. Перспективы применения анаэробной обработки отходов с получением биогаза. Материалы семинара по обмену опытом в использовании возобновляемых источников энергии в странах - членах СЭВ. Симферополь, 1989, С. 230-241.

29. Кузнецов Л. Е., Ножевникова А.Н., Некрасова В.К., Слободкин А. И., Симанькова М.В., Веденина И. Я. Микробиологическая характеристива трехсекционной биогазовой установки, работающей сна отходах крупного рогатого скота. Прикл. биохим. микробиол., 1989, 25. вып.4. С. 540-547.

30. Ножевникова А.Н., Боднар И.В. Регуляторная роль водорода в метаногенном. сообществе. Матер. III Междунар. симп. по экологии промышленного животноводства "Экологизация-88", София, ЕЦБ БАН,

1989, С. 220-225

31. Ножевникова А.Н., Елютина Н.Ю., Некрасова В.К., Труфманова Е.А. Образование метана микрофлорой грунта полигона твердых бытовых отходов. Микробиология. 1989, 38, вып. 5, С. 866-870.

32. Ножевникова А.Н., Савельева Н.Д., Крюков В. Р. Биология водородных бактерий и карбоксидобактерий. "Хемосинтез" Сред. М.В. Иванов) М. Наука, 1989, стр. 48-75.

33. Симанькова М.В., Ножевникова А. Н. Термофильное гомоацетатное сбраживание целлюлозы комбинированной культурой Clostridium thermocellum и Clostridium thermoautotrophicum. Микробиология, 1989, 58, вып. 6, С. 897-902.

34. Minko 0.1., Gorbatyuk O.V., Lifshits А. В., Nozhevnikova А.Н. Gaseous compounds turnover in the solid wastes of landfills. Abstr. of 9th Int. Symp. on environmantal Biochtmistry. Moscow, 1989, P.128.

35. Nozhevnikova A. N., Simankova M. V., Kotsyurbenko 0. R. Simultaneous utilization of glucose and hydrogen by Clostridium theraoautotrophlcum. VI Int. Sgnp. "Microbial growth Si C=T

compounds", Gottingen, 1989, P. 435

36. Ковалев A.A., Ножевникова A. H. Технологические линии утилизации отходов животноводства в биогаз и удобрения. М. ЦП ВАНТО,

1990, 500.

37. Кузнецов Л.Е., Ножевникова А. Н., Кольцова 3. М. Интенсификация сбраживания осадков сточных вод термофильной ассоциацией ацетатиспользующих метанобразующих бактерий CA-I003. Прикл. биохим. микробиол., 1990, 26, вып.4, С. 825-831

38. Симанькова М.В., Ножевникова А.Н.1 Гидролитические бактерии из биогазовых установок. Прикл. биохим. микробиол., 1990, 27, вып. 2, С. 228-234 г~

39. Слободкин А.И., Ножевникова А.Н. Влияние Methanothrix thermoacetophila на разложение этанола метаногенной ассоциацией микроорганизмов. Прикл. биохим. микробиол., 1990, 26, вып.2, С.

40. Nozhevnikova А. N. , Bodnar I.V., Slobodkin A. I., Sokolova T.G. Hydrogen contentin biogas as a state indicator of methanogenesis from wastes. In "Microbiology and Biochemistry of Strict Anaerobes Involved in Interspecies Hydrogen Transfer". J. P. Belaich Ced). NewYork: Plenum Publ. Inc: 1990, P. 423-426.

41. Nozhevnikova A. N. , Simankova M. V. Interspecies transport of Hydrogen in thermophilic anaerobic cellulose decomposition. In "Microbiology and Biochemistry of Strict Anaerobes Involved in Interspecies Hydrogen Transfer". J.P. Belaich Ced). New York: Plenum Publ. Inc. 1990, P. 427-430.

42. Nozhevnikova A.N. , Slobodkin A.I. The partisipation of litotrophic homoacetogenic bacteria and Methanothrix in thermophilic anaerobic ethanol degradation with methane formation. In "Microbiology and Biochemistry of Strict Anaerobes Involved in Interspecies Hydrogen Transfer . J.P. Belaich Ced). New York: Plenum Publ. Inc. 1990, P 431-435.

43. Калюжный С.В., Данилович Д.А., Ножевникова А.Н. Анаэробная биологическая очистка сточных вод. Итоги науки и техники, серия Биотехнология, М. ВИНИТИ, 1991, I56C.

44. Ножевникова А.Н. Рост анаэробных бактерий в метаногенных. ассоциациях и смешанных культурах. Итоги науки и техники, серия Микробиология, М. ВИНИТИ, 1991, 129-148.

45. Kovaliov A.A., Nozhevnikova A.N. , Kostiuk V.В. Anaerobic treatment of pig-farm waste water in Anaerobic biofilter reactor. Proc. VI Int. conf. "Mechanization in Agriculture", Beijin, 1991, P. 54-63.

46. Kovaliov A.A. , Nozhevnikova A.N. The state and perspectives of anaerobic treatment of cattle and pig breeding wastes in the USSR. Poster Abstracts of 6th Int. Symp. on Anaerobic Digestion. May

1991, SaoPaolo. Brazil. P. 131.

47. Nozhevnikova A. N., Parshina S. N., Nekrasova V. K., Kotsyurbenko 0. R. Acidogenic fermentation of animalbreeding wastes under extremely thermophilic conditions. Poster Abstracts of 6th Int. Symp. on-Anaerobic Digestion. May 1991, SaoPaolo. Brazil, P.

48. Nozhevnikova A.N., Slobodkin A.I. Regulating role of acetate in anaerobic degradation of volatile fatty acids by methanogenic microbial community. Proc. of Int. Symp. on Environmental Biotechnology. April 1991, Ostende, Belgium., P. 58-63.

49. КоцБрбенко O.P, Кожевникова A.H., Заварэин Г. А. Анаэробное разложение органического вещества психрофильньми микроорганизмами. Журн. Общ. Биол., 1992, 53, »2, стр. 159-175.

50. Ножевникова А.Н., Ковалев А.А., Некрасова В.К., Костюк В.Б., Венецкая С.Л. Метановое сбраживание жидкого навоза в реакторе "Анаэробный биофильтр". Биотехнология, 1992, 4, С. 36-41.

51. Florencio L., v. Langerak A., Nozhevnikova A., Stams F., Field J., Lettinga G. Methanogenesis from methanol at low pH. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth on CI Compounds, August 1992, Varwick, U.K., A 41.

,52. Nozhevnikova A. N., Kotsyurbenko 0. R.. Zavarzin G.A. Methanogenesis from organic matter at low temperature. Int. Course on Anaerobic Waste Water Treatment, Case Studies. 1992. I HE Delft, Agriculture University, Wageningen, the Netherlands. P. 72-96.

53. Nozhevnikova A. N., Lebedev V. S., Lifshits A. B., Nekrasova V. K. Microbiological processes occurred in landfills. Proc. of Int. Symp. on Anaerobic treatment wastes. Venice, Italy, April 1992. F. Cecchi, J. MataAlvares, F.G.Pohland (Eds.), P.303-312.

54. Nozhevnikova A.N., Lebedev V.S., Lifshits А. В., Nekrasova V.K. Microbial production and oxidation of methane' in landfills. Int. Course on Anaerobic Waste Water Treatment, Case Studies. 1992. IHE Delft, Agriculture University, Wageningen, the Netherlands. P.

. 55. Kotsyurbenko 0. R. , Simankova M. V., Bolotina N. P., Zhllina T.N., Nozhevnikova A.N. Psychrotrophic homoacetogenic bacterium from several environments. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth on CI Compounds, August 1992, Warwick, U.K., u 136.

56. Nozhevnikova A. N., Nekrasova V.K., Galchenko V.F., Zavarzin G.A. Aerobic microbial/biofilter in upper lauer of landfill ground: functioning at low temperature. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth on CI Compounds,August 1992, Warwick, U.K., A

57. Nozhevnikova A., Rintala J., Kostrikina N., Lepisto S., Stams A. Acatate-utilizing methanoganic microflora developed -in granular sludge after shift of temperature from 35° to 55° ana 70 C. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth on CI Compounds, August 1992, Warwick, U.K. , C 116.

58. Rintala J., Lier v. J. В., Nozhevnikova A.N., Lepisto S., Grolle К. C. F., Nurmlaho-Lassila E. L., Lettinga G. Methanogenesis from acetate at 70-75uC. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth on CI Compounds, August 1992, Warwick, U.K., A 40.

59. Заварзин Г.A., Коцюрбенко 0.P., Соловьева Т. И., Ножевникова А.Н. Температурный порог при развитии метаногенного или ацетогенного микробного сообщества из почвы тундры. Докл. АН, 1993 , 329, JK5, С. II6-II8

60. Коцюрбенко 0.Р., Ножевникова А. Н., Калюжный С.В., Заварзин Г. А. Метановое сбраживание навоза крупного рогатого скота в психрофильны условиях. Микробиология, 1993, 62,

61. Ножевникова А.Н., Лебедев B.C., Заварзин Г.А., Иванов Д.В., Некрасова В.К., Лифшиц А.В. Образование, окисление и эмиссия'биогаза на объектах захоронения бытовых отходов. Журн. Общ. Биол., 1993, 54, Jtó,. С. 68-83.

62. Паршина С.Н., Ножевникова А.Н., Калюжный С.В. Разложение белковых субстратов микрофлорой свиного навоза при низкой температуре. Микробиология, 1993, вып.I, С. 169-179.

63. Florencio L., Nozhevnikova А. N., Langerak van А., Stams A. J.M., Field J. A., Lettinga G. Acidophylic degradation of methanol by a methanogenic enrichment culture. FEMS letters, 1993, 109, P. 1-6.

64. Kotsyurbenko 0. R., Nozhevnikova A. N., Zavarzin G. A. The competition between methanoganic and acetogenic bacteria from Tundra soil for H2 and C02 at low temperature after longterm adaptation

Eeriod. Abstr. of Int. conf. "Global Change and Arctic Terrestrial cosystems", Oppdal, Norway, 1993, P. 109.

65. Kotsyurbenko 0. R., Nozhevnikova A. N., Zavarzin G. A. Methanogenic degradation of organic matter at low temperature. Chemosphere, 1993, 27/9, СNOW 1993), P. I745-I76I.

66. Nozhevnikova A.N., Lifshits А. В., Lebedev V. S., Zavarzin G.A. Emission of methane from landfills into the atmosphere in the former USSR. Chemosphere, 1993, 26, 1-4, P. 657-674.

67. Nozhevnikova A. N., Nekrasova V. K., Lebedev V. S. , Lifshits А. В., Microbiological processes in landfills. Water Science and Technology. IS93, 27, N2, P. 243-252

68. Rintala J., Lepisto S., Nozheynikova A.N. , Chand S. The start-up of anaerobic digestion at 67-7(7 С with mesophilic inocula. Aqua Finica, 1993, И, 17-21

69. Visser A., Nozhevnikova A. N. , Lettinga G. Sulfide inhibition of methanogenic activity at various pH levels at 55 C. J. Chem. Technol. Biotechnol. 1993, 57, P. 9-13.

70. Zavarzin G.A. , Nozhevnikova A.N. Landfills and waste deposits producing greehouse gases. Current Opinion in Biotechnology, 1993, 4, N3, P. 356-362.

- 82 -

71. Лебедев B.C., Горб|атюк О.В., Иванов Д. В., Некрасова В-.К. Биогеохимические процессы образования и окисления биогаза на

полигонах захоронения бытовых отходов. Журнал экол. хим. В печати.

72. Nozhevnikova А. N., Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V. Acetogenesis at low" temperature. In "Acetogens" H. L. Drake ed., Chapmann & Holl, New-York, accepted.

-73. Rintala J., Nozhevnikova A.N., Nurmiacho-Lassila E-L, Lapisto S. Morphology ofn granular sludge from UASB-reactors operated at 55° and 70 C. accepted.

74. Skliar V.I., Davlyatshina M.A., Kalyuzhnvi S.V., Varfolomeev S. D.. Parshina S.N.,- Simankova •M.V., Kostrikina N.A., Nozhevnikova A.N. Investigation of kinetic and microbiological features of UASB-reactir perfermance under various organic loading rate. Bioresources, submitted.

75. Lier v. J., Nozhevnikova A.N., Stams A., Lettinga G. Two-stap methanogenesis from acetate in extremal thermophilic conditions. Appl.SEnviron. Microbiol, submitted.

76. Parshina S.N., Simankova M.V., Kostrikina N. A., Skliar V.I., Nozhevnikova A.N. Microbiological investigation of granulated biomass, grown on mixture of glucose and acetate in mesophilic UASB-reactor. Water Sci. Technol. accepted.