Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Низкотемпературная метаногенная деградация органического вещества микробным сообществом в антропогенных местообитаниях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Низкотемпературная метаногенная деградация органического вещества микробным сообществом в антропогенных местообитаниях"

?г од

1 О Г---А: г ""'~7

Па правах рукописи

КОЦЮРБЕНКО ОЛЕГ РОЛЛЛНДОВИЧ

НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ МЕТАНОГЕННАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА МИКРОБНЫМ СООБЩЕСТВОМ В АНТРОПОГЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ

Специальность 03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель: член-корреспондент РАН, профессор Г.А.Заварзин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук доктор физико-математических

С.С.Беляев наук В.А.Вавилин

Ведущая организация: кафедра микробиологии Биологическогс факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Защита состоится " " июня 1997 г. в '7 часов на заседанш диссертационного совета Д.002.64.01 в Институте микробиологии РАН. Адрес: 117811, г.Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Институте микробиологии РАН.

Автореферат разослан " " мая 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Л.Е.Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Агропромышленная деятельность человека является источником большого количества органических отходов, этрицательно влияющих на экологическую обстановку в природной греде. В связи с этим, их эффективная обработка является одной из зажнейших проблем современной цивилизации. В ряду природоохранных технологий, анаэробные биологические способы очистки считаются миболее приемлемыми. В настоящее время перспективные зиотехнологические методы анаэробной переработки промышленных и сельскохозяйственных отходов направлены не только на решение 1роблемы сохранения экологического равновесия, но также на снижение энергетических затрат на подогрев биогазовых установок. Проведение зроцесса метанового сбраживания различных органических отходов при температуре окружающей среды в условиях активной жизнедеятельности юихротрофных микроорганизмов позволяет успешно совмещать решение саких задач.

Повышенный интерес к изучению деятельности различных шкроорганизмов, способных развиваться при низких температурах эбъясняется также большой экологической значимостью

шзкотемпературных микробных экосистем в биосфере земли, поскольку шачительная часть земной биосферы имеет низкие среднегодовые температуры.

Микробное сообщество, образующее метан, включает в себя >азличные группы микроорганизмов, тесно связанных между собой трофически (Заварзин, 1986). При сбалансированной работе всех его ¡веньев метан является конечным продуктом. Однако, при различной >еакции функциональных микробных групп на понижение температуры юзможны изменения в трофической структуре сообщества, а :ледовательно в направлении его работы. Выявление особенностей >егуляции низкотемпературного метаногенного сообщества, изучение дазиологии отдельных микроорганизмов, входящих в его трофическую гтруктуру необходимо при прогнозировании поведения сообщества в :олодных природных экосистемах, в частности, находящихся под :ильным антропогенным воздействием. Понимание механизмов регуляции

и адаптации метаногенного сообщества в пснхрофильных условиях является также необходимой теоретической основой для осуществления низкотемпературных процессов анаэробной биологической очистки и энергетически выгодного получения биогаза.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение деградации различных органических веществ метаногенными микробными сообществами из двух различных антропогенных экосистем при низкой температуре, выделение наиболее характерных для этих условий психроактивных микроорганизмов, входящих в трофическую структуру исследуемых микробных сообществ.

Конкретные задачи исследования включали:

1. Изучение особенностей функционирования метаногенных микробных сообществ при пониженной температуре и оценку потенциала сообществ при разложении различных органических веществ с образованием метана.

2. Изучение особенностей трофической структуры метаногенных микробных сообществ, развивающихся при низкой температуре.

3. Выделение и описание психроактивных микроорганизмов, входящих в трофическую структуру метаногенных сообществ.

Исследован процесс метаногенной деградации различных органических веществ при низкой температуре. Обнаружено, что изменения в трофической структуре анаэробного микробного сообщества, развивающегося при пониженной температуре приводят к перераспределению в потоках вещества.

Показана исключительно важная роль ацетогенеза и его конкурентоспособность по отношению к метаногенезу при разложении органического вещества низкотемпературным микробным сообществом.

Установлено, что в условиях развивающегося сообщества при низкой температуре гомоацетогены выигрывают конкуренцию у метаногенов за основные субстраты, в частности водород и диоксид углерода. Низкая активность метаногенов приводит к подавлению синтрофных реакций и накоплению в системе различных органических кислот.

Показано, что низкотемпературный метаногенез происходит с приемлемой скоростью лишь при накоплении достаточного количества метанобразующих архебактерий. В исследованных нами экосистемах, лимитированных сульфатами, именно метаногены способны поддерживать уровень Нг, необходимый для работы синтрофной микрофлоры и обеспечивать сбалансированную работу сообщества.

Выделено и описано 3 новых вида психроактивных микроорганизмов: 2 гомоацетогена, представителей рода Acetobacterium и сахаролитическая бактерия, отнесенная к роду Clostridium.

микробная ассоциация, способная сбраживать навоз крупного рогатого скота при б°С с образованием метана. Показано, что основным препятствием для проведения процесса при низких температурах является длительный период адаптации микробного сообщества, который устраняется добавлением психроактивной закваски. Исследована активность полученной метаногенной ассоциации в различных температурных условиях. Даны рекомендации по ее получению.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Микробиологические процессы при промышленной переработке сельскохозяйственного сырья" . (Пущино, 1990), на б-ом Международном симпозиуме "Анаэробное сбраживание" (Сан-Паулу, Бразилия, 1991), на Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), на 7-ом Международном симпозиуме "Микробный рост на С1-соединениях" (Варвик, Великобритания, 1992), на 7-ом Международном симпозиуме "Анаэробное сбраживание" (Кейптаун, ЮАР, 1994), на международном совещании "Биологическое и технологическое значение микробной адаптации к экстремальным температурам и давлениям" (Брюссель, Бельгия, 1994) и на международном рабочем совещании EERO "Метаногенез в охране экружающей среды" (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (7 статей и 9 тезисов).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, включая 44 рисунка и 10

таблиц. Диссертация состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Объекты и методы исследования" и "Результаты исследований и их обсуждение"), "Заключение", "Выводы" и "Список литературы" ( наименований).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю, профессору, чл.-корр. РАН Г.А.Заварзину и д.б.н. А.Н.Кожевниковой за общее научное руководство и редактирование диссертации, а так же благодарит к.б.н. В.В.Кевбрина зэ. 1 помощь при освоении необходимого для работы аппаратурного оборудования, д.б.н. Т.Н.Жилину за помощь при проведении микроскопических исследований и при работе с технически трудной микробной группой метаногенов, Н.А.Кострикину и Л.Л.Митюшину за помощь при изучении ультраструктурной организации микроорганизмов, к.б.н. А.М.Лысенко за генетический анализ исследуемых штаммов, д.х.н. Г.А.Осипова за определение жирнокислотного состава липидного комплекса бактерий, к.б.н. А.Я.Образцову за проведение иммунофлуоресцентного анализа накопительных культур метаногенов, С.В.Калюжному за помощь при проведении кинетического анализа полученных данных, всех сотрудников отдела микробных сообществ, помогавших автору в повседневной работе.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили метаногенные микробные ассоциации из двух антропогенных низкотемпературных экосистем: навоз крупного рогатого скота (КРС), хранившийся в течение 1,5 лет при температуре 6-8°С и иловые осадки пруда системы доочистки сыктывкарского лесо-промышленного комплекса (ЛПК), а также чистые культуры анаэробных сахаролитической и гомоацетогенных бактерий, выделенные нами из вышеназванных экосистем.

Эксперименты по исследованию деградации различных органических субстратов анаэробным микробным сообществом, и культивирование микроорганизмов проводили с использованием анаэробной техники

(Hungate, 1969) на бикарбонатной среде Пфеннига (Pfennig, 1965). Выделение чистых культур проводили методом предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду во вращающиеся пробирки с целью получения отдельных колоний. При количественном.определении двуокиси углерода и в опытах по исследованию влияния pH на рост культур вместо бикарбоната натрия, была использована 3-(N-морфолино)-пропансульфокислота (МОПС) в концентрации 40 мМ в качестве буфера. В среду также добавляли раствор микроэлементов (Pfennig and Lippert, 1966), 0,5 г/л Na2Sx9H20 для создания восстановленных условий, 0,002% резазурина для контроля окислительно-восстановительного потенциала. В качестве факторов роста вносили дрожжевой экстракт и раствор витаминов (Wolin et al., 1963). Использование того или иного источника углерода и энергии зависело от конкретных задач исследования.

Морфологию клеток изучали в световом микроскопе МБИ-3 с фазово-контрастным устройством, в световом аноптральном микроскопе "ZETOPAN" Reichert (Австрия), а также в электронном микроскопе JEM-100. Ультратонкую структуру клеток исследовали на срезах, изготовленных по методу Ритер-Келенбергера (Ryter and Kelenberger, 1958).

Оптическую плотность клеточных суспензий определяли на спектрофотометре "Spekol-ll" (Карл Цейс ЙЕНА, Германия) при 600 нм.

Газы, летучие жирные кислоты (ЛЖК) и спирты определяли на газожидкостном хроматографе "Chrom-5" (Чехия, Прага). Расход газа-носителя (аргон) составлял 40 мл/мин. Для анализа газов использовали детектор по теплопроводности. Сорбентом служил активированный уголь марки АГ-3. Летучие жирные кислоты (ЛЖК) и спирты определяли с пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента использовали хромосорб-101.

Определение глюкозы проводили энзиматически с глюкозооксидазой и пероксидазой (Щербухин и др., 1970).

Формиат определяли колориметрически (Lang and Lang, 1972).

Пактат определяли энзиматически с лактатдегидрогеназой (Gutman and Wahlefeld, 1974), используя стандартный набор реактивов фирмы

Boehringer, а также методом дериватизации с йодной кислотой в качестве окислителя (Teunissen et al., 1989).

Клеточные липиды экстрагировали гексаном из высушенной при 60°С в токе гелия, а затем вакуумированной микробной биомассы клеток. Экстракт высушивали и силилировали в N,0-,бис(триметилсилил)-трифлорацетамида (БСТФА). Реакционную смесь анализировали на хромато-масс-спектрометре НР-5985В (Hewlett-Packard) с использованием капиллярной колонки из плавленного кварца НР-101.

Выделение и очистку ДНК проводили по методике Мармура (Marmur, 1961). Содержание ГЦ в ДНК определяли по температуре плавления (Marmur and Doty, 1962). Гибридизацию ДНК проводили методом оптической реассоциации по Де Лею (De Ley et al.,1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1-._метаногешше_сбраживание_навоза_крупного_рогатого_скота_пей

Предельно низкой температурой для практического осуществления процесса метаногенного сбраживания отходов животноводства, в частности, навоза КРС предлагают считать 15°С (Zeeman et al., 1988а). Дальнейшее понижение температуры резко снижает скорость метанообразования. В действительности же долговременное хранение большого количества отходов животноводческих ферм и комплексов происходит при температуре окружающей среды. В такой системе основной процесс разложения органического вещества может осуществляться при температуре ниже 15°С с продукцией значительных количеств СН4.

Методом автоселекции, которая продолжалась в течение 1,5 лет, из навоза КРС, сброженного в мезофильных условиях, было получено аклимированное микробное сообщество, образующее метан при 6-8°С. Исследование сбраживания навоза КРС при низкой температуре проводили при периодическом культивировании в стационарных условиях. Акклимированный к разным температурам инокулят добавляли в зависимости от задачи эксперимента.

навоза КРС в системе с психроактивной микробной Акклимированная микробная метаногенная ассоциация была добавлена к свежему навозу КРС. Образование метана при б°С, начавшееся сразу после 10%-ного инокулирования, свидетельствовало об активном функционировании низкотемпературного метаногенного сообщества микроорганизмов. За 140 дней концентрация СН4 достигла 47 ммоль/л сбраживаемой массы (Рис.1). В течение этого времени лишь 3 мМ метана образовалось в контрольной системе, содержащей свежий навоз КРС без добавления психроактивной микробной

8

7.5 7

6.5 £ 6

5.5

150

Дни

Рис. 1. Сбраживание навоза КРС с психроактивной закваской при 6°С. 1 ацетат; 2 - пропионат; 3 - бутират; 4 - метан; 5 - рН.

Рис. 2. Сбраживание навоза КРС при 6°С (контроль). 1 - ацетат; 2 пропионат; 3 - бутират; 4 - водород; 5 - метан; 6 - рН.

закваски (Рис.2). В дополнение, конечное количество летучих жирных кислот, в частности, ацетата в контрольном опыте было существенно выше.

адаптированной к б°С. Эффективность полученной низкотемпературной ассоциации (37%-ное инокулирование) по сравнению с контрольной системой при б°С и более высоких температурах (15, 20 и 35°С) оценивали по скорости образования метана. Для вычисления максимальной удельной скорости роста метаногенов, соответствующие экспериментальные данные были подвергнуты кинетическому анализу. При этом допускалось, что лимитирующей стадией конверсии органического вещества использованной нами полужидкой фракции навоза КРС в биогаз является ацетокластический метаногенез (Заварзин, 1986). Максимальная удельная скорость роста метаногенов оценивалась по концентрации продукта (метана) при избытке субстрата (ацетат). Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние температуры на максимальную скорость метаногенеза (в системе с акклимированной микробной ассоциацией и контроле и значения цт и Х0.

Аклимированная закваска Контроль

Т-ра

°С Иш Хо 1% Хо

мМхсут"1 сут""1 мг/л мМхсут"1 сут"1 мг/л

35 6,73 0,232 3,7 6,56 0,312 0,647

20 2,91 0,115 2,8 2,70 0,215 0,059

15 1,64 0,088 2,2 1,26 0,134 0,023

6 0,31 0,057 1,5 0,02 0,025 0,008

Анализ табличных данных показывает, что добавление в систему акклимированной закваски с накопленной биомассой метаногенов инициирует процесс при 6°С. Удельная скорость роста метаногенов при этой температуре в случае с акклимированной закваской более чем в два раза выше, чем в контрольном эксперименте, что говорит о

существенных изменениях в микробном метаногенном сообществе в процессе аклимирования. Этот вывод подтверждает и сравнение соответствующих удельных скоростей роста при более высоких температурах, которые, наоборот в 1,5-2 раза выше в контроле.

Акклимированная к низким температурам закваска теряла свою эффективность после пред-культивирования в мезофильных (35°С) и термофильных условиях (55°С). Скорость метаногенеза в данных случаях снижалась соответственно в 2 и 10 раз по сравнению системой инокулированной психроактивной ассоциацией, не подвергавшейся воздействию высоких температур. В случае с термофильным инокулятом скорость процесса лишь не намного превышала контрольную (система без инокулята).

Таким образом, проведенное исследование показало, что использование полученной психроактивной ассоциации позволяет существенно интенсифицировать процесс низкотемпературного метанообразования. В мезофильной ассоциации, по-видимому, присутствуют микроорганизмы, способные к жизнедеятельности при пониженной температуре. Напротив, слабый низкотемпературный метаногенез при использовании психроактивной закваски после ее пред-культивирования при 55°С указывает на гибель психроактивной микрофлоры в термофильном сообществе.

Для проведения технологического процесса при температуре ниже 15°С необходимо либо в начале выдерживать систему при более высоких температурах как предлагала Зееман (геетап еЪ а1., 1988 б) для накопления мезофильной микрофлоры, либо использовать

акклимированный инокулят, причем его количество, необходимое для стимуляции процесса, будет тем меньше, чем дольше период адаптации при низкой температуре.

Интенсивное разложение органического вещества происходит в зимний период под слоем льда, главным образом, в анаэробных условиях. Примером таких местообитаний может служить пруд системы

доочистки сыктывкарского лесопромышленного комплекса (ЛПК). Зимняя температура в нем составляет 4 - 6°С. В летний же сезон этот водоем прогревается обычно до 15°С, и лишь иногда, в особо теплые периоды, до 25°С. Пруд продолжительное время был выключен из системы очистных сооружений комбината, а предварительное накопление в нем органических отходов ЛПК создало условия сильно загрязненного водоема. Разложение субстратов, соответствующих трофическим блокам в метаногенном сообществе организмов (Заварзин, 1986), исследовали при трех температурах: 28°С (контроль), 15°С и 6°С. Всего было испытано 3 8 субстратов с регулярными измерениями в течение года. Динамика •продуктов и субстратов позволила оценить трофические взаимодействия в микробном сообществе.

Иловые осадки пруда-отстойника, разбавленные в 20 раз использовались в качестве инокулята. При самосбраживании данного Посевного материала в выбранном интервале температур метан и ацетат образовывались лишь в следовых количествах. В иловых образцах, разбавленных в 2 раза, наибольшая скорость метаногенеза наблюдалась при 28°С. Лишь 2,5 мМ метана образовалось в течение 320 суток при б°С (Рис.3).' При этой температуре в системе отмечалось небольшое накопление ацетата.

0

50

100 150 200 250 300 350

Дни

Рис. 3. Образование метана и ацетата в иловых осадках пруда-отстойника при различных температурах. 1 - метан (28°С); 2 - меган (15°С); 3 - метан

(6°С); 4 - ацетат (6°С).

2.1. Деградация полимеров. В качестве примера полимерных органических соединений были выбраны целлюлоза, крахмал, пептон, а так же нуклеиновые кислоты.

Дни

Рис. 4. Продукты деградации целлюлозы микробным сообществом прудовых осадков при 6°С. 1 - ацетат; 2 - пропионат; 3 - бутират; 4 - изо-бутират; 5 - водород; 6 - метан.

Самые низкие скорости процесса наблюдались при разложении целлюлозы, одного из основных компонентов растительного опада. Необычным в этом случае было сильное развитие пропионовокислого брожения. Пропионат образовывался в эквимолярном количестве с ацетатом. Следовые количества водорода обнаруживались в начале эксперимента. Скорость образования метана значительно снижалась при пониженных температурах (Рис.4). При 2 8°С 3 ммоля СН4 образовалось за 30 дней, при 15°С - за 100, при б°С - за 300 дней.

Основными продуктами анаэробной деградации крахмала. были ацетат и бутират, причем при понижении температуры доля последнего заметно увеличивалась. Пропионовокислое брожение играло подчиненную роль. Водород, образованный в больших количествах, потреблялся по-зидимому с образованием ацетата до некоторой пороговой величины (50-100 р.р.т. при 6°С) . Небольшие количества этанола, детектируемые в начале опыта, быстро использовались. Метаногенез

был крайне слабым. Накопление кислых продуктов снижало рН среды до 4,4 - 4,5.

В течение первой фазы разложения азотистых веществ происходило образование различных летучих жирных кислот. Вторая фаза была представлена ацетокластическим метаногенезом, очень медленным при б°С. Ионы аммония, высвобождающиеся при разложении азотистых веществ, поддерживали нейтральное значение рН, -благоприятное для протекания метаногенеза.

(глюкоза, ксилоза, арабиноза, рибоза) в общем следовало процессам, наблюдаемым при разложении легко доступного полимера - крахмала.: метаногенез подавлен, идет образование органических кислот и этанола, приводящее к снижению рН и остановке процесса.

При использовании аминокислот (Ь-глутаминовая кислота и серин) наблюдалось четкое разделение процесса на две фазы: ацидогенез с преимущественным образованием ацетата и ацетокластический метаногенез, скорость которого резко снижалась при пониженных температурах.

соединения могут быть промежуточными продуктами разложения лигнина. В качестве примера для исследования были выбраны галловая, ванилиновая и п-оксибензойная кислоты, а также фенол и катехол.

Основными продуктами разложения галловой и ванилиновой кислот были ацетат, С02, и СН4. При 28°С в течение 10 дней происходило накопление ацетата. Во второй фазе процесса ацетат потреблялся с образованием метана в эквимолярных количествах в случае с галловой кислотой. Дополнительный метаногенез при разложении ванилиновой кислоты, по-видимому, связан с использованием метоксильных групп. При 15° и 6°С основным процессом являлся ацетогенез. Метаногенез был очень слабым.

Практически не разлагались фенол, катехол и п-оксибензойная кислота. Возможно, для расщепления кольца данным микробным сообществом необходимо присутствие 3-гидрокси- или 3-метокси-заместителей.

Микробное разложение моносахаридов

тнений. Различные ароматические

2.4. Разложение этанола. Значительные количества этанола образуются три деградации Сахаров. Его разложение при 28°С в первой фазе 1риводило к быстрому накоплению ацетата в течение 7 суток, и эутирата в течение 20 суток. Далее следовал ацетокластический ¿етаногенез. Другими продуктами были пропанол, а также небольшие соличества пропионата, капроата и водорода, причем при 15°С их сонцентрация была существенно ниже. Единственными продуктами зазложения этанола при б°С были ацетат и Нг, которые накапливались с 150-м суткам в большом количестве.

?.5. Использование жирных кислот. Жирные кислоты и водород являются эсновными продуктами первичных анаэробов. Они используются в 1роцессе синтрофного разложения с межвидовым переносом водорода. Условием прохождения процесса является очень низкая концентрация зодорода, не выше сотен частей на миллион в стандартных условиях, в сачестве примера жирных кислот были выбраны бутират и пропионат. Разложение ЛЖК при низкой температуре было в значительной степени юдавлено. Для инициации процесса потребовался очень длительный iar-период, продолжавшийся несколько месяцев. Метан обнаруживался шшь в следовых количествах. При 28°С после некоторой лаг-фазы лившейся 30 и 60 дней в случае с бутиратом и пропионатом, ¡оответственно, наблюдалось их разложение с одновременным образованием метана.

».6. Использование вопоропа и диоксина углеропа г формиата и СО. Збьгшо в условиях умеренных и повышенных температур при .низком :одержании сульфатов водородиспользующие метаногены выигрывают :онкуренцию за водород у гомоацетогенных бактерий. В исследуемой шстеме автотрофный синтез ацетата наблюдался как при низких температурах (15° и 6°С), так и при 28°С, за которым следовала фаза 1етанообразования. В условиях низких температур процесс замедлялся. 1ри 6°С ацетогенез проходил за 150 суток, и затем начинался 1едленный ацетокластический метаногенез (Рис.5).

Еще одним субстратом для метаногенов и гомоацетатных бактерий шляется формиат. При его использовании вновь ацетогенез являлся [реобладающим процессом в исследуемой экосистеме при трех выбранных

температурах. Скорость ацетокластического метаногенеза, второй стадии процесса, существенно снижалась при низких температурах. Такой же результат был получен в случае с СО, использованном в качестве субстрата. Однако, в данном случае . наблюдался четко выраженный лаг-период, особенно продолжительный (100 суток) при 6°С.

160 140 --

— 120

2

S ЮО -5 80-

Q.

§ 60

о

£0 40 ..

20 -•

0 н' 0

Рис. 5. Потребление водорода и диоксида углерода микробным сообществом прудовых осадков при 6°С. 1 - водород; 2 - ацетат; 3 ■ метан.

ацетогенеза при пониженных температурах позволяет рассматривать ацетат в качестве основного субстрата для метанобразующих архебактерий в таких условиях. Скорость ацетокластического метаногенеза в опыте с прудовыми осадками, проходившего с соблюдением стехиометрического соотношения 1:1 (использованный ацетат/образовавшийся метан) снижалась в температурном интервале от 28 до 6°С (Рис.6). Наблюдалось резкое увеличение длительности лаг-периода , необходимого для начала образования метана из ацетата при понижении температуры. При 6°С этот период продолжался 150 суток. 2.8. Использование С-1 соединений. В исследуемой системе быстрый метаногенез из С-1 соединений (метанол, триметиламин и диметилсульфат) был основным процессом, происходящим во всем исследуемом интервале температур от 6 до 28°С. Метилотрофный ацетогенез из метанола был заметен лишь при 6°С (Рис.7).

Дни

Рис. 6. Ацетокластический метаногенез при различных температурах (микробное сообщество прудовых осадков). 1 - ацетат (28°С) ; 2 - ацетат (15°С); 3 - ацетат (6°С); 4 - метан (28°С); 5 - метан (15°С); 6 - метан (6°С).

350

Рис. 7. Продукты потребления метанола микробным сообществом прудовых осадков при различных температурах. 1 - метан (28°С) ; 2 - метан (15°С); 3 - метан (6сС); 4 - ацетат (28°С); 5 - ацетат (15°С); 6 - ацетат (6°С).

нетана. Кажущиеся скорости ацетогенеза из различных субстратов, вычисленные по углам наклона образования ацетата и соответствующие значения 0ю представлены в таблице 2. Причинами существенного различия значений СЬо, расчитанных для какого-либо субстрата при

двух температурных интервалах могут являтся смена доминирующей микрофлоры, участвующей в его утилизации при понижении температуры, в частности, наличие в рассматриваемом температурном интервале оптимума доминирующего вида или группы микроорганизмов, а также явное наложение друг на друга нескольких микробных процессов (например, при использовании глюкозы), заметно искажающих расчет истинной скорости образования рассматриваемого соединения, в данном случае ацетата.

Таблица 2. Максимальные кажущиеся скорости образования ацетата (ммольхл"1хсут"1) из различных субстратов микробным сообществом прудовых осадков, разбавленных в 20 раз в зависимости от температуры.

Температура, °С Ою в интервале

Субстрат температур

28 15 6 25-15 15-5

Целлюлоза (ФБ) 0,34 0,16 0,04 1,71 5,00

МКЦ 1,10 0,26 0,12 3,06 2,37

Крахмал 1,94 0,54 0,19 2,70 3,20

Пектин 2,73 0,85 0,40 2,47 2,31

Пептон 2,42 0,68 0,30 2,68 2,49

РНК 2,00 0,48 0,20 3,03 2,65

Глюкоза 1,07 0,28 0,05 2,83 7,13

Ксилоза 2,16 0,81 0,52 2,14 1,64

Серин 1,87 0,72 0,26 2,10 3,11

Галлат 0,93 0,25 0,11 2,77 2,55

2,З-Бутандиол 1,97 0,97 0,45 1,73 2,33

Лактат 3,37 1,79 0,93 1,63 2,07

Этанол 2,30 1,35 0,70 1,51 2,08

н2/со2 2,16 1,06 0,53 1,74 2,16

Формиат 1,00 0,46 0,26 1,83 1,89

со 1,23 0,52 0 , 20 1,95 2,90

Анализ данных таблицы 2 показывает, что наибольшему влиянию температуры подвержены микробные процессы разложения полимерных соединений. Наименьшие значения О10 отмечены при использовании различных низкомолекулярных, в том числе С-1, соединений, являющихся субстратами для гомоацетогенных бактерий. 1реимущественный ацетогенез на этих соединениях при низких температурах свидетельствует об активности психротолерантных гомоацетогенов.

Сравнительный анализ аналогичных параметров для процесса яетанообразования (Табл. 3) показывает, что наиболее благоприятным субстратом для метаногенов являются С-1 соединения. измерить жорости образования метана из водорода и С02 не представлялось зозможным вследствие полного доминирования ацетогенеза на этом ;убстрате. Большое значение в условиях пониженных температур имеет 1ериод адаптации, очевидно связанный с накоплением необходимого :оличества биомассы микроорганизмов.

?аблица 3. Максимальные скорости образования метана (ммольхл_1хсут_1) [з различных субстратов микробным сообществом прудовых осадков, избавленных в 20 раз в зависимости от температуры.

Температура, °С От в интервале

Субстрат температур

28 15 б 25-15 15-5

[ловые осадки 0,34 0,16 0,04 1,71 5,00

инокулят)

.цетат 1,21 0,35 0,14 2,62 2,69

[етанол 5,00 3,55 0,73 1,30 5,82

ТМА 4,86 3,23 1,38 1,37 2,58

ДМС 0,36 0,25 0,13 1,30 2,17

Таким образом, показана высокая конкурентоспособность омоацетатных бактерий по отношению к метаногенам при низкой емлературе. Субстраты, служащие источником водорода, - сам Нг,

формиат, СО (+ НгО) (5уе1ИсЬпу е! а1., 1991) - используются гомоацетатными бактериями и метаногенами в условиях конкуренции, которая приводит к накоплению ацетата в первой фазе, с последующим медленным ацетокластическим метаногенезом во второй фазе. В условиях низких температур использование С-1 субстратов метаногенеза наиболее благоприятно. Это положение согласуется с ранее полученными микробиологическими данными (Жилина и Заварзин, 1991). При понижении температуры до 15°С синтрофное разложение продуктов первичных анаэробов в значительной степени блокируется; гомоацетогенные бактерии, по-видимому, не могут обеспечить достаточно низкую концентрацию Нг. При разложении целлюлозы развивается полноценное микробное сообщество, конечным продуктом которого является метан.

Детальную расшифровку процесса метаногенной ферментации с установлением роли отдельных групп и видов бактерий, трофических взаимосвязей между ними, регулирующих факторов в сообществе может дать исследование физиологии и биохимии чистых культур микроорганизмов. Последующее культивирование метаногенных ассоциаций из исследуемых экосистем на различных субстратах привело к получению активных накопительных культур и выделению чистых культур организмов, входящих в ключевые функциональные группы низкотемпературного анаэробного микробного сообщества.

3. Выпеление и описание психроактивных микроорганизмов.

анаэробный сахаролитический организм штамм Я-2189 выделен из навоза крупного рогатого скота, сброженного при 6°С. Микробные клетки были представлены прямыми или слегка изогнутыми тонкими палочками размером 0,5-0,6 х 2,1-5,0 мкм, одиночными или собранными в цепочки, включающие до 10 бактерий. Клетки обладают подвижностью благодаря перитрихально расположенным жгутикам. Клеточная стенка грамположительного типа. Деление осуществляется перетяжкой. Электронно-микроскопическое исследование показало присутствие темных внутриклеточных включений, видимо представляющих запасы

полисахаридов. Клетки погружены в слизистый чехол. Характерна их агрегация боковыми сторонами, а также скручивание клеток в старых культурах. Организм является олигоспоровым. Споры терминальные овальные размером 1,1 х 1,3 мкм, в молодой культуре не обнаруживаются. Колонии блестящие белые гладкие, диаметром 0,1 мм. Культура выдерживает температуру 55°С в течение суток и 65°С в течение 1 часа.

Основным компонентом липидного комплекса является насыщенная кирная кислота Ci6:o- Отличительной особенностью является наличие яононенасыщенных гексадеценовых кислот Cie:i с положением двойной звязи у 7-го, 9-го и 11-го атомов углерода от карбоксильной группы, 1 также наличие двух изомеров мононенасыщенных альдегидов Ci6:i и -i8:i с двойной связью у 7-го и 9-го атомов углерода.

Штамм Z-2189 - облигатный анаэроб, хемоорганотроф, юпользующий только ограниченный набор Сахаров (глюкозу, фруктозу, 1альтозу, арабинозу, ксилозу, целлобиозу, галактозу и маннозу), а также пектин в качестве источника углерода и энергии. Сбраживает глюкозу до этанола, ацетата, лактата, формиата, Н2 и С02.

Организм растет при температуре от 1 до 30°С с оптимумом 20-!5°С и при рН от 5,5 до 8,3 с оптимальным значением 6,8. Скорость юста при 6°С равнялась 0,028 ч"1. Содержание ГЦ в ДНК составляет 15,6 ± 1 мол. %.

Согласно действующей таксономической классификации организм >ыл отнесен к роду Clostridium по четырем основным критериям: |бразование эндоспор, облигатный анаэробиоз, отсутствие способности : диссимиляционной редукции сульфата и наличие клеточной стенки ■раположительного типа. На основании сравнительного анализа штамма -2189 и других описанных представителей рода Clostridium данный рганизм был выделен в самостоятельный вид ClostridiuM fimetariшп.

. 2. Гомоапетогенные бактерии. Из исследуемых нами экосистем были ыделены в чистые культуры два новых вида психроактивных омоацетогенных бактерий: штамм Z-4 290 (навоз КРС, сброженный при °С) и штамм Z-4391 (пруд-отстойник сыктывкарского ППК).

Клетки штаммов были представлены овальными короткими палочками. Морфология клеток варьировала в зависимости от возраста культуры и состава среды. В активно растущих культурах клетки имели форму, близкую к коккондной, в старых культурах они были представлены короткими палочками. При росте на органических субстратах клетки часто имели неправильную форму и были собраны в цепочки из 3-20 клеток, а при росте на смеси Н2 + С02 были одиночные или в парах. Клетки штаммов имели сходные размеры - 0,81,5 х 1,5-2,9 мкм, были подвижны, но теряли подвижность в старых культурах. Клетки штамма г-4391 имели 2 субтерминальных жгутика, тогда как клетки штамма г-4290 являлись перитрихами. Клеточная стенка у выделенных штаммов имела грамположительный тип строения. Оба штамма делились перетяжкой. Ни один из штаммов не образовывал эндоспоры. Колонии штаммов были белые с округлыми краями, 0,6-1,0 мм в диаметре. Выделенные организмы - строгие анаэробы.

Основным компонентом липидного комплекса штамма г-4 391 являлся насыщенный альдегид С^о. Организм метаболизировал глюкозу, ксилозу, фруктозу, амльтозу, лактат, малат, 2-метоксиэтанол, метанол, метильные группы некоторых ароматических соединений, бетаин, формиат, СО и Н2 + С02. Ацетат являлся единственным продуктом метаболизма. Организм рос при температуре 1-30°С с оптимумом при 20°С и при рН 5,5-8,5 с оптимумом при 6,5. Содержание Г+Ц в ДНК составляло 42,1 ± 1 мол.%.

Характерной особенностью клеточного липидного комплекса штамма г-4290 являлось наличие ненасыщенных жирных кислот Сц:1 с положением двойной связи у 9-го и 11-го атомов углерода. Основными компонентами липидного комплекса штамма г-4290 являлись ненасыщенные жирные кислоты С^а Д9 и С16:1 Д11, а также насыщенный альдегид С^о- Фруктозу, лактат, малат, метильные группы ванилиновой кислоты и бетаина, Н2 + С02, СО и формиат организм сбраживал до ацетата, как единственного метаболита. Утилизировал также 2-метоксиэтанол с образованием ацетата и метанола. Температурный интервал роста 1-35°С с оптимумом при 30°С. Диапазон

?Н в котором происходил рост - 6,0-8,5 с оптимумом при 7,5. Содержание Г+Ц в ДНК составляло 45,8 ± 1 мол.%.

Выделенные штаммы как грамположительные неспорообразующие зактерии с содержанием Г+Ц в ДНК 42,1 и 45,8 мол.%, обладающие способностью к хемолитоавтотрофному росту на Н2 + СОг с эбразованием ацетата и сбраживающие сахара до ацетата, как гдинственного продукта метаболизма могут быть отнесены к роду \cetobacterium (Ва1сЬ еЪ а1., 1977). Выделенные организмы эазличаются между собой и от ранее описанных видов данного рода по 1втаболическим и физиологическим характеристикам, липидному составу :леточных стенок, содержанию Г+Ц в ДНК. Процент гибридизации между 5семи сравниваемыми организмами был низким (14-29%). На основании ¡ышеизложенного данные штаммы были выделены в самостоятельные виды >ода АсеЬоЬасЬегхит с присвоением им следующих видовых названий: ¡тамм г-4290 - А.£1теЬаг1ит и штамм й-4391 - А.ЬакИ.

1.3. Метаногены. Из исследуемых систем с использованием пенициллина I ванкомицина были получены накопительные культуры метаногенов, где [реобладающей формой являлась метаносарцина. Иммунофлуоресцентный ¡нализ психроактивных культур метаногенов из навоза КРС, выращенных [а ацетате и триметиламине при 6°С показал присутствие 1еЫ1апо8агс1па тпаяе!. Метаносарцина, выделенная из прудовых осадков 1а триметиламине при 6°С, которая росла также при 25°С оказалась ■акже сходной с Мв .таве!. При микроскопировании метаногенных ультур из навоза КРС на ацетате, а также при исследовании [икрофлоры иловых осадков, растущей на пептоне, было обнаружено [рисутствие метанотрикса.

ВЫВОДЫ

1) Для переработки органических отходов при низкой температуре еобходимо психроактивное сообщество, формирующееся из езофильного, но не термофильного и успешно функционирующее, как ри пониженных, так и при умеренных температурах.

2) Эффективное осуществление процесса низкотемпературно! метаногенной ферментации определяется накоплением биомассы ключевы: микробных групп.

3) В развивающемся при низкой температуре анаэробном микробно! сообществе происходит ряд изменений в потоках вещества i трофической сети. Доминирование ацетогенеза над метаногенезом и з значительной степени подавленное синтрофное разложение летучи: жирных кислот способствуют накоплению кислых продуктов.

4) Ключевая роль в образовании ацетата при низких температура: принадлежит гомоацетатным бактериям, которые характеризуются высокой конкурентоспособностью по отношению к метаногенам, Психроактивные гомоацетогены выигрывают конкуренцию за Н2 j метанобразующих архебактерий в условиях развивающегося сообществ; за счет более быстрой скорости роста.

5) Из исследуемых экосистем выделены психроактивные гомоацетатные бактерии, отнесенные к роду Acetobacterium в качеств« самостоятельных видов A.fimetarium sp.nov. и A.bakii sp.nov.

6) Из навоза КРС, сброженного при низкой температуре выделег психроактивный сахаролитический организм, который на основанш морфологических, физиологических, биохимических и генетически? критериев был отнесен к роду Clostridium с образованием нового виде Cl.fimetarium sp.nov.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N. Methanogenesis from organic compounds at low temperature. Poster-Abstracts of 6-th Int. Symp. on Anaerobic Digestion. Sao-Paolo, Brazil, May 1991, p.96.

2. Parshina S.N., Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N. Methanogenic fermentation of organic substrates of manure at low temperatures. Poster-Abstracts of 6th Int. Symp. on Anaerobic Digestion. Sao-Paolo, Brazil, May 1991, p.138.

3. Коцюрбенко О.P., Кожевникова A.H. Анаэробное разложение различных органических веществ при низких температурах микрофлорой загрязненного водоема Среднего Приуралья (Коми АССР). Тезисы

окладов Всесоюзного симпозиума "Микробиология охраны биосферы в 1егионах Урала и Северного Прикаспия. Оренбург,1991, с.60-61. . Коцюрбенко О.Р., Ножевникова А.Н., Заварзин Г. А. Анаэробное азложение органического вещества психрофильными микроорганизмами, урн. общ. биологии, 1992, т.53, N.2, с.159-175.

. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Soloviova Т.I., Zavarzin .A. Methanogenesis from Cl-compounds and acetate at low emperature. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth on CI ompounds, August 1992, Warwick, U.K., A 52.

. Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. Methanogenic egradation of organic matter by anaerobic bacteria at low emperature. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth on CI ompounds, August 1992, Warwick, U.K., A 53.

. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Bolotina N.P., Zhilina T.N., ozhevnikova A.N. Psychrotrophic homoacetogenic bacterium from everal environments. Abstr. of 7th Int. Symp. on Microbial Growth n CI Compounds, August 1992, Warwick, U.K., С 136.

Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Zavarzin G.A. ethanogenesis from organic matter at low temperature. Int. Course n Anaerobic Waste Water Treatment, Case Studies, IHE Delft, gricaltural University Wageningen, Netherlands, 1992, p.72-96. . Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. Methanogenic egradation of organic matter by anaerobic bacteria at low emperature. Chemosphere, 1993, v.27, N.9, p.1745-1761.

0. Коцюрбенко О.P., Кожевникова A.H., Калюжный С.В., Заварзин Г.А. етановое сбраживание навоза крупного рогатого скота в сихрофильных условиях. Микробиология, 1993, т.62, вып.4, с.761-71.

1. Simankova M.V., Kotsyurbenko O.R., Bolotina N.P., Zhilina T.N., ozhevnikova A.N. Psychrotrophic bacteria from several nvironments. Abstr. of 7th Int.Symp.on Anaerobic Digestion, Cape own. South Africa, January 1994, p.27-30.

2. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V. cetogenesis at low temperature. In: Acetogenesis, Ed.: H.L.Drake,

Chapman & Hall, 1994, p.416-431.

13. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Nozhevnikova A.N., Zhilina T.N., Bolotina N.P., Lysenko A.M., Osipov G.A. New species of psychrophilic acetogens: Acetobacterium bakii sp. nov., A.paludosum sp.nov., A.fimetarium sp. nov. Arch. Microbiol., 1995, v.163, N.l, p.429-434.

14. Коцюрбенко O.P., Ножевникова A.H., Осипов Г.А., Кострикина H.A., Лысенко A.M.. Новая психроактивная бактерия Clostridium finietarium, выделенная из навоза КРС, сброженного при низкой температуре. Микробиология, 1995, т.64, N.6, с.804-810.

15. Kotsyurbenko O.R., Kostrikina N.A., Nekrasova V.K., Nozhevnikova A.N. Methane formation and oxidation at low temperature by microflora of polluted small northern lake (pond). Absrt. of EERO Workshop. June 19-21, 1996, St.Petersburg, Russia, p.53.

16. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Nozhevnikova A.N., Zhilina T.N., Zavarzin G.A. New psychrophilic anaerobic bacteria. Absrt. of EERO Workshop. June 19-21, 1996, St.Petersburg, Russia, p.57.