Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Целлюлолитические бактерии в анаэробном сообществе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Целлюлолитические бактерии в анаэробном сообществе"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР' ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579.26.017.723.

Симанькова Мария Владимировна

Цэллюлолитические бактерии в анаэробном сообществе Специальность 03.00.07.- микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-1991

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР

Научный руководитель: чл-корр. АН СССР, профессор Г.А.Заварзин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессог

В. К.Плакунов

доктор биологических наух, профессор В.Т.Емцев

Ведущая организация: кафедра биологии почв *лкулы£Тл

ПЬчтшмЯ- Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Защита состоится . .flf.G&yij. 1991г в/ часов на

заседании специализированного совета Д. 002.64.01. в Институте микробиологии АН СССР по адресу II73I2, Мйсква, проспект 60-летия Октября, д.7, кор. 2

С диссертацией можно ознакомиться • в библиотеке Института микробиологии АН ССР

Автореферат разослан "Ж". iff^f/b-/... I99Ir

Ученый секретарь специали . зированного f.a.H.

Актуальность проблемы. Целлюлоза наиболее распространенный в природе растительный полимер. Деградация целлюлозы является преимущественно микробиологическим процессом CSwlft, 1977; Fenchel, Yorgensen, 1977), и хотя большая часть целлюлозы разлагается в аэробных условиях, однако ее анаэробная деструкция протекает достаточно интенсивно а анаэробные бактерии вносят весомый вклад в процесс разрушения клетчатки микроорганизмами. В настоящее время в связи с проблемами разложения растительного сырья и органических отходов возрос интерес исследователей к анаэробным целлюлолитическим бактериям (АнЦБ). Исследована целлюлолитическая микрофлора рубца и пищеварительного тракта растительноядных животных (Hungate et al., 1964; Bryant, 1964; Hungate, 1966; Hobson, I971; Wolin, 1979; Hobson, Wallace, 1982). В настоящее время проводятся работы по выделению новых видов АнЦБ, преимущественно из биореакторов и различных- органических отходов, а также из экстремальных мест обитания - термальные источники, фумаролы. Другим аспектом изучения АнЦБ является исследование их роли в анаэробном сообществе. Невысокая скорость гидролиза целлюлозы ограничивает развитие микроорганизмов, функционирующих на следующих этапах трофической цепи. Необходимо исследование метабиотических связей в анаэробном сообаестве, поиск путей интенсификации гидролиза целлюлозы. Решение этих проблем имеет практическое значение, так как тесно связано с задачами по активизации процессов переработки органических отходов в метантенках.

Цель и задачи исследования. Иель настоящей работы - изучение АнШ5 анаэробных очистных сооружений, соленых и гиперсоленых водоемов. Конкретные задачи исследования состояли в следующем: I. Исследовать целлюлолитическую микрофлору, а также некоторые

другие группы гидролитических бактерий ' метантанков.

сбраживаювшх различные органические отходы. Разработать микробиологические методы оценки стабильности работы установок, разлагающих целлюлозосодержащие органические отходы. 2 Исследовать процессы гидролиза целлюлозы в анаэробных осадках соленых и гиперсоленых водоемов. Описать целлюлолитическую микрофлору данных экосистем и проследить ее возможные трофические связи в анаэробном сообществе.

3. Выделить и описать чистда культуры АнЩ> из различных экосистем.

4. Исследовать трофические связи в анаэробном сообществе, разлагающем целлюлозу, используя, бинарные культуры, содержащие целлслолитический организм. . Установить стационарные концентрации метаболитов в данных системах. На основании исследования бинарных культур выявить закономерности разложения целлюлозы анаэробным бактериальным сообществом.

Научная новизна работы. Из различных экотопов выделен ряд штаммоз термофильной целлюлолитической бактерии Clostridiuro thermocellum. Среди них отобран штамм Кб - продуцент высокоактивных i термостабильных целлюлаз.

Впервые, установлена деструкция целлюлозы в условиях предельно« солености. Выявлено раэноообраэие форм АнЦБ в данном экотопе. Впервые выделена чистая культура галофильных анаэробны: целлюлолитических бактерий - Halocella cellulolytica gen. nov., sp. nov.

Исследовано влияние различных групп бактерий анаэробногс сообщества на процесс разложения целлюлозы. Определены стационарны! концентрации метаболитов в системе. , ,

Показано наличие активных процессов лизиса микробной биомассы : метантенках и в исходных органических отходах, приводящих ] появлению дополнительных источников питания микрофлоры исследовании

систем.

Практическая ценность исследования. Разработаны

микробиологические методы оценки стабильности работы метантенков, сбраживающих твердые органические отходы. Показано влияние концентрации метаболитов в сообществе на процесс разложения целлюлозы. Полученные данные могут быть использованы для интенсификации метанового брожения в метантенках, разлагавших твердые органические отходы.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были доложены на 4-ой Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси. 1985), на конференции "Архебактерии" СПущино, 1987), на конференции молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии (Рига. 19873, на 3-й Всесоюзной конференции ".Микробиологические методы запиты окружающей среды" СПущино. 1988), на международном .симпозиуме "Рост микроорганизмов на Cj соединениях" С ФРГ, Геттинген, 1989). -на международном симпозиуме "Микробиология и биохимия, строгих анаэробов, участвующих в межвидовом переносе водорода" С Франция,. Марсель, 1989).

Публикации. По метериалам диссертации опубликовано 16 печатных работ С7 статей и 9 тезисов), получено одно авторское свидетельство. Две статьи сданы в печать.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 8 глав, включающих обзор литературы и экспериментальную часть, заключения,выводов и списка литературы.' Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 17 таблиц и 21 рисунок.Список литературы содержит отечественных и иностранных наименований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили чистые культуры анаэробных целлюлолитических бактерий, выделенные нами из метантенков, сбраживающих навоз крупного рогатого скота С 1С'О и ил сточных вод городского коммунального хозяйства, почв Африки и анаэробных осадков соленых и гйперсоленых водоемов; чистые культуры гомоацетатных бактерий, выделенные нами из навоза КРС, а также коллекционные кул'цгуры Clostridium thermocellum и Methanobactenun thermoformicicum. полученные нами от сотрудников ИНМИ АН СССР.Храпцовой Г.И. и Жилинрй Т.Н.

Полевые исследования проводили в июне 1990 года на озере Сиваш и Арабатской косе. Пробы были отбраны из мест активного разложения целлюлозы, в Сиваше и в 4-х лагунах. Выбранные нами лагуны Ш-4) различались по концентрации NaCl, толщине анаэробного слоя и слоя нераэложившейся целлюлозы. .

Основой для культивирования анаэробных бактерий служила бикарбонатная среда Пфеннига CPfennig, 1965). При культивировании галофильных бактерий в среду дополнительно вносили NaCl. В среду также добавляли раствор микроэлементов по Липперту" CPfennig, Llppert, 1966), 0,002/i резазурина для контроля окислительно восстановительного потенциала, 0,5г/л NagS для создания восстановленных условий. В качестве факторов роста вносили дрожжевой экстракт и раствор витаминов по Волину CWolin et al., 1963). В качестве источников углерода и энергии для культивирования целлюлолитических бактерий использовали микрокристаллическую целлюлозу СМКЦ), фильтровальную бумагу, глюкозу или целлобиозу.

Морфологию клеток изучали в световом микроскопе МБИ-3 с фазово-контрасным устройством, а также б электронном микроскопе JEM-100 и в сканирующем микроскопе JSM-T300. Ультратонкую структур]

клеток исследовали на срезах, изготовленных по методу Ритер-Келенбергер CRyter, Kelenberger, 1958).

Определение белка проводили методом Лоури CLowry et al., 1951). Газы, летучие жирные кислоты (JDKK) и спирты определяли на хроматографе "Chrom-5". Газ-носитель аргон. Расход газа-носителя 40 мл/мин. Для анализа газов в качестве сорбента использовали активированный уголь марки АГ-3, детектор - катарометр. ЛЖ и спирты анализировали с пламенно-ионизационным детектором, в качестве сорбента использовали хромосорб-IOI. Лактат определяли энзимамически с лактатдегидрогенаэой СGutnan. Wahlefeld, 1974). Определение сероводорода проводили йодометрическим титрованием СРезников и др., 1970). Глюкозу определяли глюкозоокзидаэным- пероксидазным методом (Шербухин др., 1970). Концентрацию редуцирующих Сахаров определяли методом Шомоди-Нельсона (Nelson, 1944). Эидоглюканазную активность определяли вискозиметрически скорости гидролиза натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (КМШ СКлесов и др., I9S0). КМЦ-азиую' активность измеряли по образованию редуцирующих Сахаров при гидролизе IV, раствора Na-КЩ. Для определения активности целлюлаз по фильтровальной бумаге использовали бумагу Ватман №I; продукты гидролиза определяли по Шомоди-Нельсону. Определение активности целлюлаз по отношению к окрашеному растворимому целлюлозному субстрату ОЦ-41 проводили ранее описанным методом (Рабинович и др., 1985 ). Клеточные липиды экстрагировали гексаном.. Супернатант высушивали и силюлировали в бис-триметилтрифтор-ацетамиде. Образцы анализировали на хроматографе НР-5985В Hewlett Packard. Выделение ДНК и определение процентного содержания Г+11 в ДНК осуществляли по описанным методам (Marmur, I9SI; Магшг, Doty,' 1962). Гибридизацию ДНК проводили методом оптической реассоииации по Де Лею CDe L'ey et а!.. 1970). Определение 'последовательности нуклеоткдов и

филогенетический анализ проводили методом, описанным ранее (Ви1уд1па е1 а1., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I. Целлюлолитические бактерии биогазовых установок. '

Исследование гидролитической микрофлоры метантенков. Значительную часть поступающего в метантенки органического вещества составляет целлюлоза. Однако ее содер^ние в биореакторах сильно колеблется в зависимости от вида сбраживаемого органического сырья. В метантенках, разлагающих органические отходы с высоким содержанием целлюлозы (навоз КРС. ил сточных вод городского коммунального хозяйства), численность целлюлолитических бактерий достигала 10**клеток/мл. В свином навозе, где преобладает не целлюлоза, а другие органические полимеры, численность целлюлолитиков была не

7

высока и не превышала 10 клеток/мл.

Эффективность работы целлюлолитических бактерий оценивали по увеличению их численности в биореакторах по сравнению с исходным сырьем, по выходу•метана при разложении целлюлозы и по степени "сбалансированности" целлюлолитической и метаногенной микрофлоры при разложении целлюлозы. Степень "сбалансированности" оценивали по образованию метана из целлюлозы в разведениях. В стабильно работающих метантенках происходило возрастание численности целлюлолитических бактерий, степени их "сбалансированности" с метаногенами и увеличение выхода метана при разложении целлюлозы по сравнению с исходными органическими отходами. Такие показатели были нами получены при исследовании метантенка, перерабатывающего, навоз КРС-(табл. I). В установках, разлагающих свиной навоз,происходили сбои в работе, и выше перечисленные показатели оставались в них ка том же уровне, что и в исходном субстрате, или снижались (табл.2).

Полученные нами результаты оценки стабильности работы метантенков совпадают с данными других микробиологических и химических исследований, проведенных на тех же установках С Веденина, Слободкин, 1988: Кузнецов и др., 1989).

Таблица I. Численность целлюлолитических бактерий в сброженном и исходном навозе КРС и образование метана при разложении целлюлозы.

з метантенка 3-я секция

исходный навоз

сброженный навоз из метантенка: 1-я секция

целлмолитические бактерии, кл/мл

предельное разведение, где обнаружен метан

выход метана в 1-м разЕедении, ММольтХ мг сухого навоза

10ю-

3

0,083

Ю10 5

0,38

Ю11

7

4.12

Таблица 2. Численность целлюлолитических бактерий в сброженном и исходном свином навозе и образование метана при разложении целлюлозы.

исходный навоз

сброженный навоз из метантенков, ра-ботаюздх в разных температурных режимах:

целлюЛолитические бактерии, кл/мл

предельное разведение. где обнаружен метан

10'

37° Ю5

• 2

44°

Ю6

2

50° Ю5

. Некоторые органические отходы перед поступлением в метантенки проходят аэробную стадию разложения, в процессе которой образуется значительное количество микробной биомассы. В метантенках должет проходить лизис поступающих в них микроорганизмов, однако до настоящего времени эти процессы не исследовались. Нами Сил

установлен активный анаэробный лиэис суспензии клеток А1са.11депез еЛгорЫк в присутствии сброженной массы из метантенка, разлагающего ил сточных вод. Лизис клеток устанавливали по падению величины оптической плотности суспензии и путем микроскопирования. За 14 С} гок оптическая плотность в опытном варианте составляла 5354 от контроля (рис.1). Контролем служила культура А.еи1горЬиз, . не содержащая пробы из метантенка.

оп600нм 1.00.80.60,40.2-

2 I

т

Рис.¡.Изменение оптической плотности суспензии клеток А. eut.ro-рЬиз в присутствии микрофлоры коммунального метантенка (I) и в контроле С2)

8 10 12 14 сутки

Таким образом, разработанные нами методы анализа эффективности работы целлюлолитической микрофлоры наряду с определением содержания бактериальной биомассы, уровня : Ш и .выхода метана позволяет получить достаточно полное представление о ' стабильности работы установок и об интенсивности протекания в них процессов разложения органических отходов. Одновременно с гидролизом органического вещества в метантенках происходит лиэис бактериальной биомассы. В результате этого процесса должны появлятся дополнительные источники питания, которые могут быть использованы микрофлорой метантенков.

• Выделение и описание термофильной целлюлолитической бактерии

Clostridium thermocellum, определение целлюлолитической активности

культуры. Из метантенка, сбраживающего ил сточных вод в термофильном режиме и из почв нами был выделен ряд штатов термофильных целлюлолитических бактерий, которые на- основании морфологических, биохимических и культуральных свойств были отнесены к виду Clostridium thermocellum СМсВее, 1950). 'Клетки выделенных штаммов

Таблица 3. Использование углеводов, образование продуктов брожения. рост на МКЦ и целлобиоэе

С. 1Ьегиосе11ит. • ■

ТЛ ол

N Источник . Использование углеводов1 Продукты брожения целлюлозы. мМ Оптическая плотность суспензии

штам- выделения целлю- целло- глю- фрук- этанол уксусная молочная клеток в стационарной стадии .

малоза биоэа коза тоэа - кислота кислота субстрат ОП600„,,

4; почва + + + + 28.4 9.1 4.2 целлобиоза МКЦ 0.45 0.30

5 ; почва + + + + 32,2 7,1 3.9 целлобиоза.. МКЦ 0,51 0.39

6 ; почва + + 15.5 18.2 7.1 целлобиоза ШЩ 0.40 0,25

7 . . метантенк, сбраживающий + + — 20,5 12.4 6.2. целлобиоза-ШЩ 0.42 0.28

8 осодок сточных вод + + + + 34,9 9.1 4.5 целлобиоза' ШЩ 0,30 0,22

9 метантенк. • сбраживающий + + — + 8,7 20,2 7,1 целлобиоза - МКЦ 0,49 0.30

10 . назоз КРС + + 9.2 18.4 4.5 целлобиоза МКЦ 0.32 0.29

1) "+" - утилизирует; "-" - не утилизирует

2) Ланные по Н2 и СО, не приводятся

представлены прямыми или слегка изогнутыми палочками размером 0,5-0,7x3,2-6.0 мхм. Клетки подвижны за счет перетрихиально расположенных жгутиков. Споры овальные, термимальные 0,8-1,0x1,5-1.8 ши.. Культура образовывал!! желтый пигмент. При гидролизе целлюлозы наблюдали адсорбцию клеток на поверхности субстрата. Выделенные штаммы отличались по скорости роста на целлюлозе и целлоби.озе. целлюлолитической активности, по способности утилизировать глюкозу и фруктозу, количеству и сосаяошению продуктов метаболизма (табл.3),

С целью выявления штамма, способного гидролизовать различные целлюлозные субстраты,' обладающего высокой целлюлолитической активностью и термостабильность», проводилось сравнительное изучение целлюлаз у различных штаммов СЛЬегшосеПт, У штамма 5 активность по отношению к разным целлюлозным субстратам превышала активность других штаммов Стабл.4). Он также обладал высокой термостабильностью. Время полуинактивациии эндоглюканази данного штамма при температуре 65° составляло 108 часов, что-на два порядка выше, чем у других исследованных наш культур СЛЬегиосеПци. Таким образом, изучение целлюлолитической активности у С. игагпосеПия выявило штамм-продуцент высокоактивных и .термостабильных целлюлаз, который и был использован нами в дальнейшей работе.

2. Целлюлолитические бактерии анаэробных осадков соленых и гиперсоленых водоемов.

Анаэробное разложение целлюлозы в озере Сиваш и гиперсоленых лагунах Арабатской косы. Разложение целлюлозы в осадках соленых и гаперсоленых водоемов в отличии от гидролиза целлюлозы в метантенках практически не исследовано. Для изучения анаэробных целлюлолитических бактерий данных экотопов исследовали микрофлору соленого озера Сиваш (концентрация'ИаС1 5ЭД и прилегающих к нему

Таблица 4. Целлслазная активность в культуральной жидкости С. 1Кегпюсе11ия при действии на различные целлюлозные субстраты. '

■N штам- -Щеточник ма . выделения

.1 2

3

4

5 8 9

Горячие источники Бурятии Горячие источники Камчатки Горячие источники Камчатки почва

почва

А К Т И В . Н . О С Т Ь, ед/Смл х мин) КЩ-аэная эндоглюканазная по фильтрозаль- по растворимому окрашен-(визкозимэтрическая) ной бумаге ному субстрату ОЦ-41

0.041 0.036 0.071 0.057 0,089

Метантенк. сбраживающий 0.048 осадок сточных вод

Метантенк. сбраживающий 0,052 навоз КРС

О

0,044 0,041 0,062 0,075 0,034 0,060

0.012 0,020 0.028 0,034 0,043 0.037 0,036

О

2,17 5,21 4.51 6,73 4.87 3.24

- is-

лагун Арабатской косы (15-36% NaCl). Источником целлюлозы в Сиваше является некромасса зеленой водоросли Cladophoi a sivashensis. В лагуны аллохтонная целлюлоза заносится штормовыми ветрами. В лагунах высокая численность целлюлолитических бактерий установлена при 5,10 и-15% солености Стабл. 5). При 20% наблюдалось значительное снижение их количества. При 25% численность целлюлолитиков была минимальная и не превышала Ю^клеток/мл. Как правило, наибольшая численность АнЦБ

Ю^-Ю^клеток/мл наблюдала^ при 15% NaCl. В Сиваше наиболее высокая

■г -9

численность целлюлолитиков до 10 клеток/мл установлена при 5 и 10%

солености (табл.5). • .',...

Влияние концентрации NaCl на скорость анаэробной деградации целлюлозы оценивали по скорости образования водорода при разложении кладофоры илом Сиваша и лагуны. При ' обработке данных учитывали количество водорода,. образованного в контроле, которым служила среда, засеянная илом и не содержащая целлюлозного субстрата.'-Скорость разложения кладофоры микрофлорой Сиваша достигала максимального значения при концентрации NaCl 5%. С повышением содержания соли .в среде скорость деструкции снижалась и была минимальной при 20%: при 25% разложение целлюлозы отсутствовало. Целлюлолитическая микрофлора лагуны ' разлагала целлюлозу - быстрее всего при концентрации NaCl 15'/,. с несколько меньшей скоростью - при 10% NaCl, то есть в интервале солености от 10 до 15% сбраживание целлюлозы в лагунах происходило наиболее интенсивно. При концентрации соли 5,20 и 25% деградация целлюлозы протекала в 2-2,5 раза медленнее. Аналогичные данные по образованию водорода были получены при разложением микроорганизмами ила микрокристаллической целлюлозы. ■

В лагунах присутствует несколько форм АнЦБ. физиологически различающихся по способности расти при ■ определенной солености.1

Таблица 5. Численость целлшолитическях бактерий и образование Н^ при разложении целлюлозы в в условиях различного содержания КаС1 в среде. • - ,

Место отбора пробы Численность целлюлолитических Предельное разведение, где был

пробы ■ ;; бактерий Склеток/мл) обнаружен Н^Б

5 54 . 10% 1554 20% 2554 5 54 .1054 1554 20% 2554

I. лагуна I 10*0 ю8 Ю9 Ю7 .Ю3 V .7 9 : 7 отсут.

2 •. лагуна 2 Ю6 ю7 107' ю5 102 - 6 7 7 5 отсут.

3. лагуна 3 ю5 ю6 ю7. ю5 ю* - 5 , 6 7 ■ 4 отсут.

4. ' лагуна 4 . ' ю6 1о7 Ю8 ю5 М4 6 7.,; 8 4 отсут.

5. Прибрежная зона Сиваша Ю8 - Ю8 ; ю7 ко • НО 8 8 ; 7- НО НО

6. Зализ Сиваша ■ ю9 Ю9 ю7 но но 9 9 6 НО но

7. Иловая площадка в юж- ю7 Ю6 Ю5 но • НО 7 6 5 НО КО

ной точке Сиваша

НО- не определяли; отсут. - отсутствует

Организм, обозначенный нами как штамм z-10151. рос в диапазоне от 5 до 20% NaCl с оптимумом 15%. В данном экотопе также присутствовала целлюлолитическая бактерия, наиболее интенсивно развивающаяся при концентрации соли до 10%. В условиях предельной солености разложение целлюлозы осуществлял экстремально галофильный целлюлолитический организм z-41.

Таким образом, в иследованном нами биотопе концентрация соли является основным фактором, определяющим интенсивность процессог разложения целлюлозы, численность микроорганизмов и их видово? состав. В Сиваше наиболее . высокая численность целлюлолитическга бактерий и максимальная скорость разложения целлюлозы установлен при 5% NaCl, что соответствует солености среды обитания исследуемо! нами микрофлоры. В лагунах .оптимальная концентрация' соли длл развития целлюлолитических бактерий и гидролиза целлюлозы составляет 10-15%, что соответствует нижней границе солености лагун. Выявлен« разнообразие форм АнЦБ в исследованном экотопе. Впервые установлен, анаэробная деградация целлюлозы в условиях предельной солености.

Выделение и описание новой облигатно анаэробной и галофилыigt целлюлолитической бактерии Halocella cellulolytlca gen. nov., sp. noy.. Из гиперсоленых, лагун. Арабатской косы нами был • выделен j чистую культуру целлюлолитический организм, обозначенный как штамз Z-I0I5I. Организм представлен.палочками размером 0,4-0.6x3,8-23мкм. Длина клеток значительно варьировала' в зависимости от услови! культивирования и используемого субстрата роста. Клетки подвижные а-. счет перетрихиально расположенных жгутиков. В стационарной стадт роста клетки преобразовывались в сферопласты, которые' зате! лизировались. Клетки размножались делением перетяжкой. Клеточна: стенка грамотрицательного типа. • Организм облигатный анаэроб Умеренный галофил • с оптимумом роста при 15%. NaCl. Мезофил

оптимальная температура роста - 39°, максимальная - 50°. минимальная - 20°. рН диапазон роста 5.5 - 8,5, оптимум - 7.0. Рост ингибировался стрептомицином, бениилпенициллином,- ванкомицином, рифампицином, бацитрацином. Организм относится к эубактериям. Хемоорганотроф. Утилизирует целлюлозу, крахмал, целлобиозу, галактозу, мальтозу, глюкозу, маннозу, сахарозу, сорбитол. Продуктами ферментации целлюлозы являются ацетат, этанол,, лактат, С02- Одерживает концентрации водорода вплоть до 8 мМ. Клеточный липидний комплекс содержит жирные кислоты, окси-кислоты и альдегиды, как прямые, так и разветвленные. Основным компонентом липидного комплекса являются насыщенные жирные кислоты 'nCj^. g и nCjg.q, а также насыщенные альдегиды nCj¿. 0 и nCjg. д. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 29 мол.И. ■

Выделенный организм как облигатный анаэроб и галофпл с низким содержанием Г+Ц в ДНК и грамотрицательним типом 'строения клеточкой стенки является представителем семейства Haloanaerobiaceae СОгеп, 1984). Однако он значительно отличается от остальных анаэробных галофильных эубактерий. На основании морфологических и физиологических особенностей, данных по составу лклидов клетки и последовательности нуклеотидов в 5S рРНК наш организм был выделен в самостоятельный род Halocella gen. nov. с типовым видом Halocella cellulolytica sp. nov. Характерными признака»® нового рода Halocella являются следующие. Развитие в строго анаэробных и галофильных условиях. Возможность, использовать в качестве источников углерода только углеводы, отсутствие роста на пептидах и аминокислотах. В липидный клеточный комплекс входят как прямые, так и разветвленные жирные кислоты, окси-кислоты и альдегиды. Основными компонентами липидного комплекса являются насыщенные жирные кислоты rtCjg.g и пС14'0" такхе насыщенные альдегиды nCjg.Q и nCj^.g. Содержание Г+Ц в

-16- \ ■■•■" ДНК составляет 29+1 мол. У.. '

3. Трофические взаимодействия в анаэробном сообществе, разлагающем целлюлозу. В микробных экосистемах, осуиествляюпшх .. деструкцию сложного органического вещества, цёллюлолитические бактерии являются первичным звеном трофической цепи. Продукты гидролиза целлюлозы и метаболиты АнЦБ используют микроорганизмы, функционирующие на следующих этапах трофической цепи. В исследованных нами биотопах терминальные участки этой цепи различны. В метантенках конечным продуктом разложения целлюлозы является метан. В осадках соленых и гиперсоленых водоемов, в условиях высокой концентрации сульфатов -сероводород; метан в данном экотопе образуется по, неконкурентному пути из метиламинов. В стабильно функционирующих микробных сообществах устанавливается высокая сбалансированность между микрофлорой начальных и конечных этапов трофической цепи: в активно работающих биореакторах метан обнаруживался при разложении целлюлозы вплоть до 7-9 разведения С табл.I), в илах соленых и гиперсоленых водоемов сероводород образовывался практически во всех разведениях, где происходило разложение целлюлозы С табл.5).

Концентрация ключевых метаболитов трофической цепи .'анаэробного сообщества регулирует как работу отдельных групп, так и сообщества в целом СЗаварзин. 1986). Для исследования роли ключевых метаболитов трофической цепи, и определения их концентраций в сообществе, находящемся в стационарном состоянии, а также для изучения, влияния отдельных групп бактерий '. на целлюлолитическую микрофлору использовали бинарные культуры анаэробных термофильных .бактерий, содержащие целлюлолитический организм и бактерии. потребляющие, продукты его метаболизма.

Взаамодейстьке целдгполитических и метанобразуюдих бактерий. В

опытах по совместному культивированию целлюлолитических и метанобразуюпшх бактерий . использовали комбинированную культуру, включающую Clostridium thermocellum и Methanobacterium thermofcrraicicum. В бинарной культуре основным продуктом разложения целлюлозы являлся метан. Концентрация водорода . в сбалансированной бинарной культуре не превышала 50 ppmV, ' что соответствует нижнему порогу потребления: этого, газа чистыми культурами термофильных метанобразующих бактерий (Nozhevnikova et al., 1990). Концентрация водорода в газовой фазе чистой культуры С.thermocellum постоянно возрастала, достигая к концу культивирования (6-е сутки) 8,5% (рис. 2). Хотя концентрация водорода в чистой культуре целлюлолитика значительно превышала его содержание в комбинированной культуре, однако с учетом водорода, использованного на образование метана, его продукция в бинарной культуре была в 2-2,5 раза выше, чем в чистой

Рис. .2. Образование Hg и СН4 16 бинарной культурой С. thermocellum и М. thermoformlcicum (I) и чистой культурой С. thermocellum (2)

(х) водород . (о) метан

1 2 3 4 5 6 сутки культуре С. ^егтосеПит. Удаление водорода из системы приводило к ацетогенному сдвигу в метаболизме целлюлолитического организма: увеличению синтеза окисленных продуктов метаболизма и снижению образования восстановленных метаболитов. Так, количество уксусной кислоты, образованной в бинарной культуре, было в 1,5 раза больше, чем в чистой культуре С. ШгюсеПит.

Взаимодействие целлюлояитических и гомоацетатных бактерий. Для изучения влияния гомоацетатных бактерий на целлюлолитическую микрофлору использовали бинарную культуру, состоящую из С. игегтосеПит и гомоацетатного организма С1оз1.г1с11шп 1Ьегтоаи1о1горЫсит. В чистой культуре С. 1Непюсе11ит основными продуктами разложения целлюлозы являлись этанол и водород Срис.ЗА, 4). Их концентрации к концу культивирования (14 суток) составляли 38,3 и 181,8 мМ соответственно. В значительно меньшем количестве

мМ

50 40 30 20 10

6 8 10 12 сутки

14

6 8 10 12 14 сутки

Рис. 3. Образование продуктов метаболизма чистой, культурой С. ^ег-тосе11ит (А) и бинарной культурой С.1Ьегшосе11ит и С. 1Ьегшоац1о-1горЬ1сит (Б): (х) ацетат; (о) этанол; (н) лактат

Н2. мМ 160 120 80 40

Рис.4. Образование водорода чистой культурой С.и^егтосеПш (I) и би-.бинарной культурой СЛЬегтосе11ит и С. 1Ьег-поаи1о1гор1сит (2)

1— 1^4

6 8 1С 12 14 сутки

образовывались ацетат и лактат. В бинарной культуре С. 1Ьегтосе11ит и С. thernoautot.rophi.cum наблюдали снижение концентрации водорода до 1300 рртУ (рис.4). Создание низкого парциального давления водорода в системе приводило к изменению соотношения окисленных и восстановленных продуктов брожения целлюлозы. Основным метаболитом разложения целлюлозы являлся ацетат - 43,4 мМ. этанол присутствовал в незначительном количестве - 3,8 мМ, лактат не образовывался (рис.ЗБ). Одновременно с использованием водорода гомоацетатный организм утилизировал сахара, образованные при гидролизе целлюлозы. Концентрация Сахаров в бинарной культуре снижалась до уровня 0,045 г/л, на котором поддерживалась в течение последующего периода культивирования, тогда как в чистой культуре целлюлолитика концентрация Сахаров постоянно возрастала и составляла к концу опыта

0.38 г/л.

Таким образом, разложение целлюлозы в анаэробном сообществе значительно отличается от процесса ее гидролиза чистыми культурами целлюлолитических бактерий. Отток водорода иэ системы приводил к ацетогенному сдвигу в метаболизме разложения целлюлозы. В бинарной культуре, включающей целлюлолитическую и метано^бразующую бактерии, основным продуктом разложения целлюлозы являлся метан, в присутствии в бинарной культуре гомоацетатного организма, после короткого адаптационного периода,- в, течение которого синтезировалось незначительно© количество восстановленных продуктов метаболизма, начинался процесс гомоацетатного разложения целлюлозы:

ВЫВОДЫ:

1. Численность ' гидролитических бактерий, степень их "сбалансированности" с метаногенами, выход метана при разложении целлюлозы могут служить критерием оценки стабильности функционирования бисреакторов.

2. Из метантенка, сбраживающего осадок сточных вод городского коммунального хозяйства, и из почв выделен в чистую культуру и описан ряд штаммов анаэробной термофильной целлюлолитической бактерии Clostridium thermocellum. Проведеннный скрининг культур выявил штамм-продуцент высокоактивных целлюлаз, обладающих термостабильностью, значительно превосходящей термостабильность других исследованных нами штаммов. Данный организм - может быть рекомендован для проведения биотехнологических исследований.

3. Изучена анаэробная деструкция целлюлозы в осадках соленых и гиперсоленых водоемов на примере озера Сиваш и прилегающих к нему лагун. Оптимальная соленость для развития целлюлолитической микрофлоры и гидролиза целлюлозы в озере Сиваш составляет 5Я NaCl, в лагунах 10-15%. Выявлена высокая численность и разнообразие форм АнШЗ в исследованном экотопе. Впервые установлена анаэробная деградация целлюлозы в экстремально галофильных условиях.

4. Впервые выделена в чистую культуру и описана облигатно анаэробная и галофильная' целлюлолитическая . бактерия. На -основании морфологических и физиологических особенностей, данных по составу липидов клетки непоследовательности нуклеотидов S 5S рРНР организм был выделен в самостоятельный род Halocella gen. nov. с типовым видом Halocella cellulolytica sp. nov.

5. В модельных опытах с использованием бинарных, культур показано, что разложение целлюлозы анаэробным микробным сообаествок значительно отличается от процесса ее гидролиза чистьш культурами целлюлолитрческих бактерий. В бинарной культуре., состоящей из целлюлолитической й мётано-бразуюдей бактерий, основным продуктом разложения : целлюлозы являлся метан; стационарная концентрация водорода составляла 50 ppmV. В бинарно!

культуре. включающей целлюлолитическую и гомоацетатную бактерии, наблюдали процесс гомоацетатного разложения целлюлозы; стационарная концентрация водорода не превышала 1300 ppmV; стационарная концентрация Сахаров - 0,045 г/л.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

I Симанькова М.В. Изучение некоторых ферментов целлюлолитического комплекса элективной культуры термофильных бактерий. Труды 4-й Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки", 1985, часть 2. с.667-668

2. Симанькова М.В.. Храпцова Г.И., Тодоров П.Т.. Логинова Л.Г. Элективная культура термофильных бактерий, разлагающая целлюлозу.- Прикладная биохимия и микробиология. 1987, т. 23, с. 360-365

3. Симанькова М.В. Исследование микрофлоры 1-й -фазы брожения навоза сельскохозяйственных животных. - Тезисы докладов конференции "Техническая биоэнергентика", Рига, 1987, с.92

4. Корнилова И.Г.. Симанькова М.В. Целлюлолитическая активность различных штаммов Clostridium thermocellum. - Тезисы докладов конференции молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов", Рига, 1987, с. 50

5. Кожевникова А. Н., .Симанькова .М. В. Роль водородиспольэующих метановых бактерий в метаногенезе из органических субстратов. -FEMS симпозиум по биохимии и генетике разложения целлюлозы, Париж. 1987 .

6. Кузнецов Л.Е., Симанькова М.В. Определение оптимального . температурного режима переработки отходов животноводства. -Тезисы докладов 3-й Всесоюзной конференции "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущине. 1988, с.96-97

7. Симанькова М.В., Ножевникова А.Н. Изучение гидролитической микрофлоры различных органических отходов. - Тезисы докладов республиканской конференции "Анаэробная обработка сточных вод", Кишинев. 1988,-с. 85-86

8. Ножевникова А.Н., Симанькова М.В., Слободкин А.И., Боднар И.В., Соколова Т.Г. Роль метаногенных архебактерия в анаэробном разложении органических веществ. - В. сборнике: Архебактерии, Луихно, 1988, с. 29-36 . ,

9. Болобова А.В., Корнилова И.Г., Симанькова М. В., Клесов A.A. Целлюлазы Clostridium thermocellum. - Прикл. биохим. и микробиол.. 1988. т.24, с.342-352

10. Симанькова М.В. Разложение целлюлозы бинарной культурой Clostridium thermocellura и Clostridium thermoautotrophicum. -Тезисы докладов республиканской конференции молодых ученых, Баку. 1988, с.69

П. Nozhevnikova A.N.. Simankova М.V., Kotzurbenko 0. R. Simultaneous utilization of glucose and hydrogen by Clostridium thermoautotrophicum. Abstracts of Cj sixth International Symposium, Gottingen (FRG), 1989, p.435

12. Nozhevnikova A.N., Simankova M.V. Interspecies transport of hydrogen in thermophilic, anaerobic cellulose decomposition. In: Microbiology and Biochemistry of strict anaerobes involved in interspecific hydrogen transfer. - New-York, Plenum Pabl. Corp.. J.P.Belaich ed, 1990, p.427-429

13. Кузнецов Л.E.. Кожевникова А.Н. . Некрасова ,В.К., Слободкин А.Н., Симанькова М. В., Веденина ■ И. Я. Микробиологическая характеристика 3-х секционной • горизонтальной биогазовой установки, работающей на отходах КРС. - Прикл. биохим. и микробиол.. 1989. т.25. с.540-547

14. Симанькова М.В., Ножевникова А. Н. Термофильное гомоацетатное сбраживание целлюлозы комбинированной культурой Clostridium thermocellura и Clostridium thermoautotrophicum. Микробиология. 1989, т.58. 897-902

15. Nozhevnikova А. N., Nekrasova V. К., Kuznezov L. Е.,. Simankova М. V. , Slobodkin • A.I. Miklobielle charakterislerirung von methanbildnern fur die Verarbeitung organisher abproducte. - 2 Merzeburg Tagung "Biotechnologie" Abstracts of reports, 1989,p.4

16. Симанькова M.В., Ножевникова A. R. Гидролитические бактерии биогазовых установок. - .Прикл. биохим и микробиол., 1991, т.27. К2. с.228-235 ' ' .'

17. Симанькова М.В., Заварзин Г.А.' Анаэробное разложение целлюлозы в озере Сиваш и ■ гиперсоленых лагунах Арабатской •косы, -Микробиология, в печати . . '

18. Simankova М. V., Chernych N. А.. Qsipov G. А., Zavarzin G. А.' Kalocella cellulolytica gen. nov., sp. nov,, a new obligate^ anaerobic haiophilic cellulolytic eubacterium., - System; Appl. MicrobioJs, g печати

СШАНЬКОВА МАРШ ВДАДИМИРОША

ЦЕРМОШПШЕСКИЕ БАКТЕРИИ В АНАЭРОБНОМ СООВДВСТВЕ (Автореферат)

Подписано к печати II.10.91 Формат 60x90 1/16 1,5 гг.л. Уч.изд. л.1,3 Тираж 90 Заказ 842

Ротапринт МОИ (ВТУЗ-ЗИЛ), 109280.Москва,Автозаводская, 16