Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы

Подосокорская, Ольга Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы"

О1

На правах рукописи

ПОДОСОКОРСКАЯ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА

НОВЫЕ АНАЭРОБНЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

005050892

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: Бонч-Осмоловская Елизавета Александровна

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Горленко Владимир Михайлович

доктор биологических наук, профессор, ИНМИ РАН, Зав. лабораторией

Щербакова Виктория Артуровна

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН), Зав. лабораторией

Ведущая организация: Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

Защита состоится «20» февраля 2013 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН Автореферат диссертации разослан «16» января 2013 г.

Ученый секретарь ^ Хижняк Т.В.

диссертационного совета, кандидат биологических наук СУ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Целлюлоза - основной компонент клеточных стенок растений, является самым распространенным (исключая ископаемые ресурсы) источником органического углерода на Земле (Coughlan, 1990). Кристаллическая структура целлюлозы обуславливает ее исключительную устойчивость к различным внешним факторам среды и необходимость синергетического действия нескольких типов гидролитических ферментов (целлюлаз) для ее полного гидролиза. Тем не менее, в природе происходит эффективная деструкция целлюлозы за счет деятельности грибов и бактерий, которые участвуют, таким образом, в минерализации органического вещества и глобальном цикле углерода. При этом доступность кислорода, по всей видимости, играет одну из ключевых ролей в стратегии разложения целлюлозы микроорганизмами. В аэробных условиях значительная роль в этом процессе принадлежит грибам, хотя среди аэробных бактерий также есть целлюлолитические представители (Cellulomonas fimi, Streptomyces cellulolyticus и др.). Аэробные целлюлолитики характеризуются высокими урожаями клеток и наличием неассоциированных целлюлазных систем (Рабинович и Мельник, 2000). В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют, как правило, бактерии, которые синтезируют мультидоменные гидролитические ферменты, связанные с клетками, либо надмолекулярные комплексы — целлюлосомы. В то же время открытым остается вопрос о способности факультативно анаэробных микроорганизмов разлагать целлюлозу, поскольку за исключением нескольких мезофильных бактерий - Cellulomonas terrae (An et al., 2005), Telmatobacter bradus (Pankratov et al., 2012) -для абсолютного большинства представителей этой физиологической группы рост на целлюлозе не показан.

Работы по изучению целлюлолитических микроорганизмов были начаты еще в середине прошлого века. Однако повышенный интерес к данной группе был вызван топливным кризисом 70-х гг., поскольку низкая себестоимость и повсеместное присутствие целлюлозного сырья делает его доступным ресурсом для производства топлива (Lynd et al., 2002). С тех пор был изучен целый ряд мезофильных и термофильных микроорганизмов, способных с разной степенью эффективности гидролизовать целлюлозу (Béguin et al., 1994; Schwarz, 2000; Blumer-Schuette et al., 2008). К настоящему времени целлюлазы уже нашли успешное применение во многих отраслях промышленности и сельском хозяйстве (Hongpattarakere, 2002; Sukumaran et al., 2005). Вместе с тем, использование именно термофильных представителей и их термостабильных ферментов позволяет избежать загрязнения нежелательной микрофлорой (Vielle & Zeikus, 2001). Кроме того, воздействие высоких температур способствует увеличению доступности трудногидролизуемых нерастворимых веществ (Niehaus et al., 1999) и делает возможным проведение консолидированной биообработки сырья (Consolidated Bioprocessing, СВР, Lynd et al., 2002).

К началу наших исследований большинство описанных термофильных целлюлолитических бактерий относились к типам Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes. Среди архей рост на целлюлозе был показан только для одного

гипертермофильного представителя - Desulfuroccocus fermentons (Perevalova et al, 2005). Помимо изучения биоразнообразия целлюлолитических микроорганизмов, многочисленные исследования, проводимые в настоящее время, направлены на попытки увеличения скорости и эффективности микробного разложения целлюлозы. У ряда микроорганизмов исследована структура и функции отдельных ферментов и целлюлазных систем в целом, проведено клонирование и экспрессия целлюлаз (Zverlov et al, 1998; Berger et al, 2006; Raman et al., 2009; Oison et al, 2010). Однако фундаментальное понимание процесса микробного разложения целлюлозы остается неполным, а энергетические проблемы - нерешенными (Lynd et al, 2002).

Вышесказанное свидетельствует об актуальности изучения термофильных целлюлолитических микроорганизмов как с научной, так и с прикладной точек зрения. В то же время данные о малом количестве культивируемых прокариот относительно их общего числа (Amann et al, 1995) и недостаточная изученность микробного разнообразия термальных мест обитания прямо указывают на возможность выделения новых термофильных целлюлолитических микроорганизмов. Они, в свою очередь, могут прояснить роль этой группы в занимаемых эконишах и оказаться потенциальным источником ценных ферментов.

Цели и задачи исследования

Целью работы было обнаружение, выделение и характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов и их ферментов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) изучение разнообразия термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов из различных термальных местообитаний;

2) характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов;

3) первичная характеристика целлюлолитической активности у представителей новых таксонов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Из наземных, подземных и морских термальных мест обитания было выделено 30 штаммов анаэробных целлюлолитических прокариот, относящихся к различным таксонам. Из них 26 штаммов оказались термофильными организмами.

Описаны новые виды экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Thermotogae - Thermosipho affectus sp. nov. и Fervidobacterium riparium sp. nov. Для представителей данных родов способность к росту на целлюлозе была показана впервые. Для представителей типа Thermotogae в целом впервые был продемонстрирован рост на микрокристаллической целлюлозе.

Выделена новая умеренно термофильная целлюлолитическая бактерия 'Melioribacter roseus' gen. nov., sp. nov., отнесенная к новому семейству 'Melioribacteraceae'. Предложен новый тип 'Ignavibacteriae', включающий класс Ignavibacteria, порядок Ignavibacterales и два семейства 'Melioribacteraceae' и Ignavibacteraceae.

Описан новый род термотолерантной бактерии - Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov. Впервые показан рост на целлюлозе, в том числе микрокристаллической, у представителей класса Anaerolinea типа Chloroflexi.

Частично охарактеризованы штаммы анаэробных целлюлолитических бактерий родов Thermotoga, Caldicellulosiruptor и Clostridium, представляющие новые виды. Кроме того, получены новые штаммы ряда известных целлюлолитических микроорганизмов, расширяющие представления об их распространении и физиологии.

В результате работы создана коллекция анаэробных целлюлолитических микроорганизмов (30 штаммов 22 видов), способных разлагать целлюлозу и другие полисахариды в широком диапазоне температуры (20 - 92°С), рН (5.0 — 9.5) и солености среды (0 - 8%). Новые микроорганизмы являются продуцентами термостабильных целлюлаз, которые могут быть устойчивы и к действию других физико-химических факторов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о большом разнообразии термофильных целлюлолитических микроорганизмов, которые могут играть существенную роль в процессах разложения целлюлозы в природе при высоких температурах, и демонстрируют, что способность разлагать целлюлозу широко распространена у представителей различных филогенетических групп.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles 2010", "Extremophiles 2010", "Thermophiles 2011", "Extremophiles 2012", "ISME 2012", "Copper in Biology 2012", а также на Конкурсе научных работ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН в 2011 году и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» в 2010 и 2012 году.

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 17 печатных работах: 5 экспериментальных статьях, 1 коллективной монографии и 11 тезисах конференций.

Место проведения работы и благодарности

Основная работа выполнялась в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук.

Секвенирование последовательностей полных геномов и генов 16S рРНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре «Биоинженерия» РАН. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и ИБФМ РАН (г. Пущино). Определение хинонов проводили в ИБФМ РАН (г. Пущино). Состав жирных кислот и фосфолипидов проводили в РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Бонч-Осмоловской Е.А. и к.б.н. Кубланову И.В. за практическую помощь, ценные советы, полезную критику и постоянное внимание на всех этапах выполнения работы. Также автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим активное участие в работе на разных ее этапах.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на /8/ страницах машинописного текста и включает 43 рисунка и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследований и их обсуждение, выводов и списка литературы, который включает 300 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили термофильные целлюлолитические микроорганизмы, выделенные из наземных горячих источников кальдеры Узон, Долины гейзеров, Паужетки (Камчатка), Байкальского региона, Кунашира (Курильские о-ва), о-ва Сан-Мигель (Азоры, Португалия); глубоководных морских гидротерм (бассейн Гуаймас и Срединно-Атлантический хребет); глубинных термальных мест обитания (скважины Томской области и г. Кисловодск).

Получение первичных накопительных культур целлюлолитиков

Накопительные культуры в источниках получали путем инкубации флаконов с добавленной в них целлюлозой, как это было описано ранее (КиЫапоу е/ а1., 2009). Время инкубации составляло от 1 до 7 суток. В лабораторных условиях накопительные культуры получали путем анаэробного внесения образцов воды, осадков или матов (0.5 мл) в пробирки Хангейта, содержащие минеральную среду. В качестве субстратов использовали различные типы целлюлозы: фильтровальную бумагу (ФБ), опилки, аморфную (АМЦ), микрокристаллическую (МКЦ) или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Посевы инкубировали при температуре и рН, близких к таковым в источниках.

Накопительные и чистые культуры целлюлолитических микроорганизмов культивировали на минеральных средах, описанных в публикациях (2, 3, 4) с добавлением дрожжевого экстракта (0.05-0.1 г/л) в качестве источника факторов роста. Органические субстраты добавляли в концентрации 20 мМ или 2 г/л. Растворимые акцепторы электронов вносили в концентрации от 2 до 10 мМ непосредственно перед инокуляцией, а элементную серу (5 г/л) и оксид Ре(Ш) (90 мМ) - перед стерилизацией. Среду готовили аэробно и разливали в пробирки с ватными пробками либо анаэробно. В последнем случае среду с резазурином (0.002 г/л) кипятили, охлаждали под током чистого N2 и добавляли Ыа28*9Н20 (0.3 г/л), в качестве восстановителя. рН доводили до нужного значения 6 н растворами НС1 или

NaOH, после чего под током азота среду разливали по пробиркам и герметично закрывали пробками из бутиловой резины. Стерилизацию сред проводили при 1 или 0.5 (при наличии в среде S0) ати. Среду с аморфным оксидом железа готовили без добавления восстановителя и резазурина.

Получение чистых культур

Чистые культуры целлюлолитиков получали анаэробно, методом предельных разведений в жидкой среде, либо выделением отдельных колоний на агаровых столбиках (1.5-2.5%) с использованием КМЦ и МКЦ в качестве субстрата. Чистоту культур проверяли микроскопически, а также геносистематическими методами.

Микроскопия

Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 (JIOMO, Россия) и Olympus СХ-41 (Япония). При наличии в среде Fe(III) его нерастворимые в воде формы растворяли в оксалатном буфере (Гаврилов и др., 2003), разведение учитывали при подсчете. Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Япония).

Целлюлазная активность

Целлюлазную активность коллекционных и выделенных в данной работе штаммов детектировали на агаризованных средах и методом зимографии с использованием красителя Конго красного. Определение концентрации редуцирующих Сахаров, высвободившихся в ходе гидролиза целлюлозы, определяли динитросалициловым методом (ДНС, DNS).

Хемотаксономические методы

Состав жирных кислот, фосфолипидов и хинонов чистых культур микроорганизмов определяли, как это описано в публикации (5).

Геносистематические методы

Выделение ДНК проводили согласно Park, 2007. Очистку ПЦР продуктов из реакционной смеси или агарозного геля проводили с помощью коммерческого кита фирмы Евроген (Россия). Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК определяли по кривым плавления (Marmur & Doty, 1962) или по данным анализа полного генома. ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации (De Ley et al., 1970). Амплификацию генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ) и секвенирование полученных ампликонов проводили согласно описанным ранее методикам (Kublanov et al., 2009). Сравнение генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базах данных GenBank и EzTaxon server (Kim et al., 2012), проводили с помощью алгоритма BLAST (Altshul et al., 1990). Построение филогенетических дендрограмм проводили с помощью различных алгоритмов, заложенных в программах MEGA 4 и MEGA 5.05 (Tamura et al., 2007, 2011) и ARB (Ludwig et al., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разнообразие анаэробных целлюлолитических прокариот и первичная характеристика их целлюлаз

Поиск и выделение термофильных целлюлолитических микроорганизмов проводили, используя в большинстве случаев образцы свежих проб и полевые накопительные культуры, полученные в ходе рейсов и экспедиций в 2008-2012 гг. в области с высокой геотермальной активностью - Камчатка, Кунашир, Байкальская рифтовая зона, Азорские острова, Срединно-Атлантический хребет, бассейн Гуаймас (Табл. 1). Кроме того, для посева использовались свежие образцы воды из нефтепоисковых скважин Томской области (отбор в 2009 и 2012 гг.), а также две пробы осадков, отобранные ранее (экспедиции 2005 г. на о-в Кунашир и 2003 г. в Байкальский регион). Как правило, выбор проб для выделения целлюлолитических микроорганизмов определялся наличием в месте отбора высшей растительности с признаками ее активного разложения либо мощных микробных обрастаний.

Первичную оценку роста и активности целлюлолитических прокариот в накопительных культурах проводили, учитывая урожай клеток при росте на различных типах целлюлозы и используя метод зимографии для определения активности целлюлаз, вырабатываемых микроорганизмами. В последнем случае в качестве положительных контролей были использованы экстремально термофильные целлюлолитические микроорганизмы Dictyoglomus гИегторИИит, штамм 1445(1 и Са1сИсе11и1оз1гир1ог кгопо1якуеп5'1$ штамм 2002, выделенные ранее в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ.

В результате для ряда накопительных культур методом зимографии была продемонстрирована активность эндоглюканаз, что в дальнейшем способствовало выделению из них чистых культур целлюлолитиков. Так, например, связанные с клетками целлюлазы удалось детектировать в полевых накопительных культурах 2319орУс, 2310орУс и 2307ор1к, полученных непосредственно в горячих источниках о-ва Кунашир в 2011 г. (Рис. 1). В лабораторных условиях из них были выделены штаммы целлюлолитических бактерий родов СаЫюеНиктгирШ, РеЫ(1оЬааегшт, Dictyoglomus (Табл. 1). Стоит отметить, что в целом, для накопительных культур была характерна высокая активность в образцах клеток и значительно меньшая в супернатанте, что хорошо соотносится с литературными данными об ассоциированности целлюлаз большинства анаэробных прокариот с клетками (Ьупс! е/ а1, 2002). Кроме того, характерным было то, что детектируемые методом зимографии эндоглюканазы обладали более высоким оптимумом активности по сравнению с вырабатывающими их продуцентами. Наглядным примером может служить штамм 2319орПс, для которого нами было показано, что вырабатываемые эндоглюканазы, ассоциированные с клеточными стенками, активны при температуре 85°С, а максимум роста для штамма - 75°С. Более того, после прогревания при 96°С в течение 10 мин активность данных ферментов снижалась незначительно. Тем не менее, после прогревания при 96°С в течение 30 мин ферменты инактивировались полностью. (Рис. 2). Таким образом, исследование целлюлазной активности накопительных культур и выделенных в данной работе штаммов термофильных микроорганизмов позволило обнаружить ряд

закономерностей и показало эффективность использования метода зимографии как ценного инструмента выявления наиболее активных целлюлолитических агентов.

. 2310орік-2 суп КП-КИ ч 2319орік суп КЛ-КИ суп 2321 орік 2310орік КЛ-КИ • КЛ-КИ 2307орік 1445с! КЛ-КИ КЛ-КИ •2002 КП-КИ

• * :

■в ... . т • !

ЦЩ г ' ■

Рисунок 1. Зимограмма. Субстрат КМЦ. Инкубация 2 часа, при 75°С в 40 мМ Трис, рН 8.8, 5 мМ СаС12.

Всего из образцов воды, осадков и матов различных по физико-химическим характеристикам термальных источников удалось выделить 30 штаммов анаэробных микроорганизмов, способных расти на целлюлозе и ее производных (Табл. 1). По физиологии они существенно отличались между собой: среди них присутствовали 4 мезофильных (оптимум роста в области умеренных температур) бактерии и 26 термофильных (оптимум роста выше 50°С) прокариот, в том числе 6 штаммов гипертермофильных (оптимум роста выше 80°С), 18 штаммов экстремально термофильных (оптимум роста выше 65 °С) и 2 штамма умеренно термофильных (оптимум роста выше 50°С) микроорганизмов. Большинство изолятов принадлежали к группе строгих анаэробов, однако, для 2 штаммов был характерен факультативно анаэробный образ жизни. По отношению к рН среди выделенных микроорганизмов были слабо

ацидофильные, нейтрофильные, а также слабо алкалофильные представители. С точки зрения филогении полученные штаммы относились к 6 глубоким филогенетическим линиям - археям типа Сгепагскаео1а и бактериям типов Thermotogae, Dictyoglomi, Ь'гггтсШея, СЫого/1ех1 и нового типа — '1^па\чЬасГег1ае'.

Внутр.жидк Клет. стенки Супернатант (§06"й- ■ ■ 96*С вб-С.

Рисунок 2. Зимограмма. Субстрат КМЦ. Инкубация 1 час, при 85°С в 50 мМ МОПС, рН 7.43, 5 мМ СаСЬ. Образцы прогревали при 96°С в течение 30 мин либо не прогревали.

Таблица 1. Основные характеристики штаммов, исследованных в данной работе.

Штамм Источник выделения Т опт, °С, рН опт Субстраты для роста Вид Ближайший родственник % сходства по гену 16Б рРНК Тип

1865 Долина гейзеров, Камчатка 92, 6.0 КМЦ1 Desulfurococcus sp. D. kamchatkensis 99 Crenarchaeota

1903 Паужетка, ВТП, Камчатка 92,5.5 КМЦ -II- -II- 99

2143opik3 Ист-ки «Дачные», Камчатка 92, 6.5 МКЦ, КМЦ 99

2307opik-2 Кунашир, Столбовские ист-ки 90, 7.0 КМЦ -//- D. amylolyticus 99

1910а Паужетка, ВТП, Камчатка 85, 6.0 МКЦ Fervidicoccus sp. F. fontis 99.8

¡к275таг^ Средннно- Атлантический хребет 70,6.6 МКЦ, КМЦ, ФБ, крахмал, декстрин Thermosipho affectum sp. nov. T. melanesiensis 94.5 Thermotogae

Rift-s3 Бассейн Гуаймас (Калифорн. залив) 65, 6.5 МКЦ, КМЦ 'Thermosipho activus' sp. nov. T. atlanticus 96.5

1445t Кунашир, «Горячий пляж» 65, 7.8 МКЦ, КМЦ, ФБ, АМЦ, опилки, ксилан, крахмал Fervidobacterium riparium sp. nov. F. gondwanensis 98.3

1868 Долина гейзеров, Камчатка 65, 8.0 МКЦ Fervidobacterium sp. F. riparium 99

2205c)opik Азоры, Португалия 65, 7.0 МКЦ -//- F. nodosum 99

2310opik-2 Кунашир, Столбовские ист-ки 70, 6.5-7.0 МКЦ, КМЦ, ФБ -//- -//- 99

1864opik Долина гейзеров, Камчатка 80,7.8 МКЦ 'Thermotoga agilis', sp. nov. T. hypogea 97.4

1944 Паужетка, «Речки», Камчатка 75, 7.8 КМЦ, МКЦ, АМЦ Dictyoglomus sp. D. thermophilum 99.9 Dictyoglomi

1923 Паужетка, террит. поселка, Камчатка 75, 7.0 КМЦ, МКЦ, ФБ -//- -//- 99.9

2307opik Кунашир, Столбовские ист-ки 75,7.5 МКЦ, ксилан 99

2320opik Кунашир, «Горячий пляж» 75, 7.5 МКЦ, CMC -II- 99

1809В1 Байкал, Гарга 60, 7.0 ФБ, МКЦ, ксилан Thermovenabulum sp. T. gondwanense 99.9 Firmicutes

2310opik Кунашир, Столбовские источники 70, 6.2 КМЦ, МКЦ, ФБ, бамбук 'Caldicellulosiruptor kunashiriensis' sp. nov. C. lactoaceticus 97.8

1023p Байкал, Баргузин, долина, Гусиха. 70, 7.5 ФБ, МКЦ, АМЦ Caldicellulosiruptor sp. C. acetigenes 99.3

1866opik Долина гейзеров, Камчатка 75, 7.0 МКЦ, -//- C. hydrothermalis 99

2319opik Кунашир, «Горячий пляж» 75, 7.0 МКЦ, КМЦ, ФБ -II- C. lactoaceticus 99

2320opik-2 -//- 70, 7.0 МКЦ -II- 99

1943opik Паужетка, «Под пиком», Камчатка 75, 6.0 МКЦ Caldanaerobacter sp. C. subterraneus subsp. tengcongensis 98.8

2321opik Кунашир, кальдера Головнина 65, 6.2 МКЦ, КМЦ, ФБ, кукурузные листья Thermoanaerobacter sp. T. uzonensis 98

P3M-3 Мат, Парабель, 37, 7.5- МКЦ, КМЦ, ФБ, 'Clostridium C. aminovalericum 94

Томск 8.0 целлобиоза parabelense' sp.nov. —

KK-282 Древесная труха, Подмосковье 37, 8.0 МКЦ, КМЦ 'Clostridium arboreum' sp. nov. C. phytofermentans 94

KK-28 -//- 37,7.5 МКЦ Bacillus sp. B. thermoamilovorans 99.4 ....

P3M-1 Мат, Парабель, Томск 42-45, 7.5-8.0 МКЦ, целлобиоза Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov. Levilinea saccharolytica 92.8 Chloroflexi

P3M-2 -//- 52-55, 7.5 МКЦ, КМЦ, ксилан, лихенан, агароза, крахмал 'Melioribacter roseus' gen. nov., sp. nov. Ignavibacterium album 90.8 'Ignavibacteriae'

Par-f-1 Вода из скважины, Парабель, Томск 54, 7.0-7.5 МКЦ, КМЦ, 'Melioribacter' sp. 'M. roseus ' 99.9%

1 - Сокращения: МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза, КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза, ФБ - фильтровальная бумага, АМЦ - аморфная целлюлоза, ВТП - Верхнее термальное поле

2 - жирным шрифтом обозначены представители новых таксонов

Гипертермофильные археи, выделенные на микрокристаллической и карбоксиметилцеллюлозе, принадлежали родам Desulfurococcus и Fervidicoccus. Экстремально и гипертермофильные бактерии были представлены организмами, хорошо известными своими целлюлолитическими способностями (роды Caldicellulosiruptor, Dictyoglomus), а также бактериями порядка Thermoanaerobacterales, для которых ранее только в одной работе была показана способность расти на целлюлозе (Kublanov et al., 2009). Кроме того, из наземных, подземных и морских мест обитания были выделены умеренно термофильные и термотолерантные бактерии типа Firmicutes (Табл. 1), что расширяет наши представления о физиологии и распространении уже известных ранее организмов — Thermovenabulum gondwanense и Bacillus thermoamilovorans. Повсеместная распространенность бактерий этого типа и их способность расти в широком диапазоне температур (от 20 до 85°С) может свидетельствовать о существенном вкладе данных бактерий в процесс разложения органического вещества, в том числе целлюлозы, в анаэробных условиях.

Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК выделенных в работе целлюлолитических микроорганизмов показал, что 9 из 30 штаммов представляют новые таксоны разного уровня (Табл. 1). Все эти микроорганизмы принадлежали домену Бактерии и являлись представителями 4 типов. Новыми представителями типа Thermotogae оказались гипертермофильная бактерия 'Thermotoga agilis', штамм 1864opik и экстремально термофильная бактерия 'Thermosipho activus', штамм Rift-s3. Ближайшими родственными организмами для изолятов были Thermotoga hypogea (97% сходства по генам 16S рРНК) и Thermosipho atlanticus (96.5% сходства по генам 16S рРНК), соответственно. Оба штамма имели типичную для представителей родов морфологию и являлись строго анаэробными хемоорганогетеротрофными организмами, что характерно для всех Thermotogae. Однако в нашей работе впервые для представителей рода Thermotoga удалось продемонстрировать рост штамма 1864opik на микрокристаллической целлюлозе, а для представителей рода Thermosipho рост штамма Rift-s3 на хитине, пектине и ксилане.

Представителями новых таксонов типа Firmicutes оказались экстремально термофильный штамм 2310opik (ближайший родственник - Caldicellulosiruptor lactoaceticus, 97.8% сходства по генам 16S рРНК) и два термотолерантных штамма -РЗМ-З и КК-282, для которых ближайшими родственниками оказались бактерии рода Clostridium - С. aminovalericum (94% сходства по генам 16S рРНК) и С. phytofermentans (94% сходства по генам 16S рРНК), соответственно.

Для остальных 4 термофильных анаэробных целлюлолитических бактерий, которые к настоящему моменту валидно описаны нами как представители новых таксонов, подробные характеристики будут приведены ниже.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о большом разнообразии анаэробных термофильных целлюлолитических прокариот в различных термальных местах обитания. При этом в процессе разложения целлюлозы в диапазоне температур 45-92°С принимают участие как бактерии, так и археи, хотя разнообразие целлюлолитических архей значительно уступает бактериальному.

2. Характеристика Thermosipho а//есШ яр. поу., штамм ¡к275шагт

Чистая культура 1к275шаг была выделена из накопительной культуры, полученной в ходе рейса Я/У ЯеуеНе (июль-август 2008) в район Срединно-Атлантического хребта. Клетки штамма представляли собой короткие, неподвижные палочки, окруженные «чехлом» из внешней мембраны («тогой») (Рис. 3). Длина клеток варьировала в пределах 1.2-6.0 мкм, ширина - 0.4-0.9 мкм. Часто наблюдали образование цепочек, содержащих до 11 клеток. Клеточная стенка - грамотрицательного типа. Образование спор не обнаружили.

Штамм ¡к275тагт рос в интервале температуры от 37 до 75°С, рН 5.6-8.2 и

солености среды 10-55 г/л №С1. Оптимальный рост штамма наблюдали при температуре 70°С, рН 6.6 и концентрации 20 г/л №С1 (Рис. 4). Минимальное время удвоения в оптимальных условиях, при росте на мальтозе составляло 32 мин. Рост поддерживался как на восстановленной (с добавлением №25*9Н20), так и на невосстановленной среде.

Рисунок 3. Электронная

микроскопия клеток штамма ¡к275шагт (негативное

контрастирование). Шкала, 1 мкм.

рН

Рисунок 4. Зависимость скорости роста штамма 1к275таг от температуры и рН.

Субстрат для роста - мальтоза. Линия тренда полиномиального типа.

Штамм ¡к275тагт использовал для роста следующие субстраты: дрожжевой экстракт, мясной экстракт, глюкозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, декстрин, МКЦ, КМЦ и фильтровальную бумагу (Рис. 5). Штамм сбраживал глюкозу до ацетата, молекулярного водорода и углекислоты. Элементная сера, сульфат и тиосульфат натрия не стимулировали рост штамма на МКЦ, в то время как сульфит натрия ингибировал его.

Морфологические и физиологические особенности штамма РЗМ-1Т в совокупности с данными филогенетического анализа позволили описать его как представителя нового рода - ОгпаШтеа арргта. Кроме того, это первый представитель класса АпаегоПпеа, для которого была показана способность расти на целлюлозе, в том числе микрокристаллической.

46 99

-Ornatilinea apprima РЗМ-f (JQ292916)

-Levilinea saccharolytica KIBI-1т (AB I09439)

-Leptoimea tardivitalis YMTK-2T (AB 109438)

-Longilinea arvoryzae КОМЕ-Г (AB243673)

- Bellilinea caldifistulae GOMI-11 (AB243672) "Thermanaerothrix daxensis " GNS-1т (HM596746)

— Anaerolinea thermolimosa IMO-17 (AB109437) -Anaerolinea thermophila UNI-Г (AB046413)

- Caldilinea aerophila STL-6-ОГ (AB067647)

-Dehalogenimonas lykanthroporepeüens BL-DC-9T (EU679419)

■ Thermosporothrix hazakensis JCM16142т (AB500145) -Ktedonobacter racemifer SOSP1 -21T (AM 180156)

-Thermomicrobium roseum ATCC275021 (M34115)

- Sphaerobacter thermophilus DSM207451 (AJ420142) -Roseißexus castenholzii DSM13941' (AB041226)

100

-Chloroflexus aurannacus DSM6351 (D38365)

-Chloroflexus aggregans DSM94851 (CP001337)

- Thermus aquaticus YT-lT (L09663)

-Deinococcus radiodurans DSM205391 (Y11332)

Рисунок 12. Филогенетическое положение штамма РЗМ-1Т и других представителей типа

Choloroflexi, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограмма построена при помощи Neighbour-joining метода (Saitou & Nei, 1987). Последовательности Deinococcus radiodurans DSM205397 и Thermus aquaticus УТ-1тиспользованы в качестве репера. Достоверность

ветвления (bootstrap test) определяли при 1000 повторах.

5. Характеристика 'Melioribacter roseus' gen. nov., sp. nov., штамм P3M-2T

Штамм P3M-2T был выделен из накопительной культуры РЗМ, описанной выше, на аналогичной среде, но с КМЦ в качестве субстрата. Морфологически штамм представлял собой прямые или слегка искривленные палочки, 0.65-10 мкм в длину и 0.25-0.35 мкм в ширину (Рис. 13А). Подвижность наблюдали только в ранней экспоненциальной фазе роста. Характерной особенностью было образование крупных розеток и биопленок (Рис. 13 Б), формирующихся за счет синтеза полисахаридного матрикса, который прокрашивался Конго красным (Bernardet et al.,

1996). Данные электронной микроскопии подтвердили наличие жгутиков и экзополисахаридов и, кроме того, были обнаружены включения запасных веществ. Клеточная стенка грамотрицательного типа. Споры не обнаружены.

Присутствие цитохрома типа С в мембранной фракции клеток штамма РЗМ-2Т, выращенных на КМЦ в полностью аэробных условиях, было обнаружено спектрофотометрически по характерным пикам при 409 нм (окисленная форма) и при 422, 526 и 552 нм (восстановленная форма). Показано полное восстановление цитохрома С раствором дитионита (0.1 мМ) и последующее полное его окисление кислородом (либо 30%-ное в случае с 3 мМ ферригидритом).

При добавлении 0.05 г/л дрожжевого экстракта в качестве источника факторов роста изолят использовал широкий спектр органических соединений, включая различные полисахариды: МКЦ, КМЦ, ксилан, крахмал, лихенан, декстран и др. Основными детектируемыми продуктами брожения штамма РЗМ-2Т на глюкозе были водород, С02 и ацетат. Наблюдали также образование лактата в следовых количествах.

Целлюлазную активность

умеренно термофильной бактерии нового типа 'М. roseusштамм РЗМ-2Т изучали с использованием ДНС метода, зимографии и агаризованных чашек с КМЦ в качестве субстрата.

Используя твердые

агаризованные среды с применением Конго красного в качестве красителя, в аэробных условиях удалось детектировать активность

целлюлолитических ферментов в образцах клеток штамма (Рис. 16); в супернатанте активность не была обнаружена. Это было также подтверждено методами ДНС и зимографией.

Методом зимографии было установлено, что присутствие хлорида кальция не являлось обязательным для поддержания активности целлюлолитических ферментов штамма РЗМ-2Т при экстремальных значениях температуры. Кроме того, целлюлазы были активны в присутствии хлорида натрия в концентрации от 0 до 100 мМ, что хорошо соотносится с ростовыми экспериментами. Для отделения целлюлаз от поверхности клеточных стенок были опробованы различные химические агенты: 1% додецилсульфат натрия (ДСН), 9М мочевина, 2.5% Тритон Х-100, 1 М NaCl. Во всех случаях были получены положительные результаты (Рис. 17).

[ Контр SDS • Urea Triton NaCl

Рисунок 17. Зимограмма. Субстрат КМЦ. Инкубация 3 часа, при 52°С в 50 мМ Трис, pH 8.8.

(а) - клетки, выращенные в аэробных условиях

(б) - клетки, выращенные в анаэробных условиях

Контроль — образцы нативных клеток

исунок ю. детекция целлюлазнои активности штамма РЗМ-2 по появлению зон просветления на агаризованной (1.5%) среде. Субстрат, КМЦ. Инкубация 21 час, при 54 °С. Окраска Конго красным. Слева - отрицательный контроль, справа - образец клеток штамма РЗМ-2Т.

а б ■ а 6 а о а о а б - - ; | - \ \

Размер генома штамма РЗМ-2Т составил 3.3 Мб. Содержание Г+Ц пар в ДНК -41.3 мол %. Наиболее близкородственным организмом был хемогетеротрофный, умеренно термофильный микроорганизм Ignavibacterium album, штамм Mat9-16T. Процент сходства генов 16S рРНК составил 90.8% (Рис. 20).

Ранее I. album был описан как представитель нового класса Ignavibacteria внутри типа Chlorobi (lino et al., 2010). Однако по фенотипическим признакам микроорганизмы этой группы резко отличаются от всех других представителей типа (отсутствие хлоросом, факультативно анаэробный и хемогетеротрофный образ жизни, подвижность за счет жгутиков, способность к разложению полисахаридов, а также состав жирных кислот и содержание Г+Ц пар). Эти данные коррелируют и с данными филогенетического анализа (процент сходства по генам 16S рРНК ниже 85% (Hugenholtz et al., 1998); кластеризация I. album, 'M. roseus' и ближайших клонов по генам 16S рРНК, 23 S рРНК и RecA в отдельную глубокую филогенетическую ветвь, описанную ранее как ZB-1 (Elshahed et al., 2003); распределение ближайших гомологов всех белков протеома). На основании этих данных мы предложили выделить класс Ignavibacteria в отдельный тип 'Ignavibacteriae'.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В пробах из наземных, подземных и морских местообитаний проведен поиск анаэробных термофильных микроорганизмов, способных разлагать целлюлозу, что привело к выделению чистых культур архей и бактерий различных филогенетических групп. Несмотря на редкую встречаемость этого свойства у микроорганизмов (Zverlov & Schwarz, 2008), целенаправленный поиск целлюлолитических прокариот позволил обнаружить новые организмы и расширить представления о распространении и физиологии уже известных таксонов. Использование целлюлозы в качестве субстрата и детекция целлюлазной активности в первичных накопительных культурах методом зимографии способствовали успешному получению штаммов активных целлюлолитиков. Установлено, что активность целлюлаз выделенных микроорганизмов, как правило, связана с клеточными фракциями штаммов-продуцентов. Температурный оптимум активности целлюлаз обычно более высокий, чем температурный оптимум роста вырабатывающих их микроорганизмов.

Выделенные нами представители экстремально и гипертермофильных целлюлолитических прокариот относились к типам Crenarchaeota, Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes. Для представителей типа Thermotogae нами впервые была показана способность расти на микрокристаллической целлюлозе. Полностью описаны два новых вида облигатно анаэробных бактерий — Thermosipho affectus и Fervidobacterium riparium. Обе бактерии являются первыми целлюлолитическими представителями своих родов. Кроме них, выделены еще два целлюлолитических представителя родов Thermosipho и Thermotoga, также представляющие новые виды.

Выделены новые умеренно термофильные и термотолерантные целлюлолитические бактерии Ornatilinea apprima и 'Melioribacter roseus', относящиеся к типу Chloroflexi и новому, предложенному нами типу 'Ignavibacteriae', соответственно. Обе бактерии обитали в микробном мате,

развивающемся под током глубинной термальной воды, и росли на микрокристаллической целлюлозе, являясь первыми целлюлолитическими представителями своих классов. Кроме того, и для О. opprima, и для 'M. roseus' была показана повышенная способность к формированию биопленок, изучение которых может стать важным этапом для понимания их роли в процессе гидролиза целлюлозы (Alonso, 2007; Wang et al., 2011).

Отличительные черты 'M. roseus ' - толерантность к высоким концентрациям хлорида натрия, широкий спектр гидролизуемых полисахаридов и факультативно анаэробный образ жизни. Известно, что за редким исключением мезофильных представителей, целлюлолитики являются либо аэробами, либо строгими анаэробами. Этот феномен связывают с невозможностью сочетания различных механизмов гидролиза целлюлозы, присущих аэробам и анаэробам (Lynd et al., 2002). Более того, среди термофилов факультативно анаэробные целлюлолитические организмы раньше не были обнаружены, и 'М. roseus ' является, по-видимому, первым описанным представителем данной физиологической группы. Кроме того, обнаружение конститутивного характера синтеза эндоглюканаз штаммом РЗМ-2Т представляет большой интерес, так как большинство целлюлаз являются индуцибельными ферментами (Sukumaran et al., 2005).

Способность 'M. roseus' использовать целлюлозу как субстрат, а также ферригидрит и нитрит в качестве акцепторов электронов существенным образом отличает его от ближайшего родственника — Ignavibacterium album, описанного ранее как представитель нового класса Ignavibacteria внутри типа Chlorobi. Детальный анализ физиологических особенностей и филогенетического положения представителей класса позволил нам предложить выделение его в новый тип 'Ignavibacteriae', включающий класс Ignavibacteria, порядок Ignavibacterales и два семейства Ignavibacteraceae и 'Melioribacteraceae'. Исследование вопроса эволюционных преобразований, которые претерпевал предковый организм, в ходе формирования 3 «сестринских» филогенетических линий — Chlorobi, Bacteroidetes и 'Ignavibacteriae ' - является актуальной задачей будущей работы.

Таким образом, в результате проведенного исследования выявлено значительное разнообразие целлюлолитических прокариот в термальных местах обитания. Полученные данные расширяют представления о физиологии, распространении и роли, которую играют целлюлолитические прокариоты в природе, где их субстратом может являться растительность, поступающая из окружающих низкотемпературных зон.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено высокое таксономическое разнообразие анаэробных целлюлолитических прокариот в термальных источниках различного происхождения с температурой от 45 до 92°С. Среди архей к росту на целлюлозных субстратах оказались способными представители типа Crenarchaeota, среди бактерий - представители типов Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes, Chloroflexi и нового типа 'Ignavibacteriae'. 9 целлюлолитических штаммов оказались представителями новых таксонов.

2. Охарактеризованы 2 новых вида экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Thermotogae — Thermosipho affectus и Fervidobacterium riparium. Для представителей типа впервые продемонстрирована способность расти на микрокристаллической целлюлозе.

3. Описан новый род, представленный термотолерантной целлюлолитической бактерией Ornatilinea apprima в классе Anaerolinea типа Chloroflexi. Это первый представитель класса Anaerolinea, способный расти на целлюлозе, в том числе микрокристаллической.

4. Предложен новый тип 'Ignavibacteriae', включающий факультативно анаэробную хемоорганотрофную умеренно термофильную целлюлолитическую бактерию нового рода и вида 'Melioribacter roseus' и Ignavibacterium album. На основании анализа филогенетического положения 'М. roseus' и его способности к росту на широком спектре полисахаридов (в том числе различных типах целлюлозы), использованию в качестве акцепторов электронов, помимо кислорода, ферригидрита и нитрита, предложено новое семейство 'Melioribacteraceae' внутри типа 'Ignavibacteriae'.

5. Продемонстрирована целлюлазная активность у новых представителей типов Firmicutes, Dictyoglomi и 'Ignavibacteriae'. Установлено, что данные организмы обладают термостабильными и связанными с клеточной стенкой эндоглюканазами. Синтез некоторых из детектированных эндоглюканаз 'М. roseus' может носить конститутивный характер.

Список работ по теме диссертации Экспериментальные статьи и обзоры

1. Кубланов И.В. и Подосокорская О.А. Термофильные микроорганизмы, разлагающие биополимеры. (2011) Глава в сборнике «Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского. Вып. 16: «Термофильные микроорганизмы», Отв. редактор В.Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 315 - 342.

2. Podosokorskava О.А.. Kublanov I.V., Reysenbach A.-L., Kolganova T.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. (2011) Thermosipho affectus sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 1160-1164.

3. Podosokorskava O.A.. Merkel A.Yu., Kolganova T.V., Chernyh N.A., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2011) Fervidobacterium riparium sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Kunashir hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 2697-2701.

4. Podosokorskava O.A.. Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. (2013) Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a novel cellulolytic representative of class Anaerolineae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 86-92.

5. Podosokorskava O.A.. Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Merkel A.Yu., Karnachuk O.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2013) Melioribacter roseus gen. nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic thermophilic cellulolytic bacterium, and the description of a novel bacterial phylum Ignavibacteriae. Environm. Microbiol., as doi: 10.1111/1462-2920.12067.

6. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Podosokorskava O.A.. Gavrilov S.N., Kublanov I.V., Beletsky A., Bonch-Osmolovskaya E.A., and Ravin N.V. (2013) Genomic analysis of organotrophic facultatively anaerobic bacterium Melioribacter roseus supports a novel phylum Ignavibacteriae within Bacteriodetes/Chlorobi group. PLOS ONE. 8, e53047.

Тезисы конференций

1. Подосокорская O.A.. Бонч-Осмоловская E.A., Кубланов И.В. Новые умеренно термофильные целлюлолитические бактерии филумов Chlorobi и Chloroflexi. VI Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2010, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 54-56.

2. Podosokorskava O.A.. Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. New data on diversity of cellulolytic Thermotogales. International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", August 2010, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book of abstracts, p. 25.

3. Podosokorskava O.A.. Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Novel cellulolytic representatives of Phylum Thermotogae. 8th International congress "Extremophiles", September 2010, Ponta Delgada, Portugal, Book of abstracts, p. 153.

4. Podosokorskava O.A.. Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. Thermophilic cellulolytic representative of a novel bacterial lineage within the superphylum Bacteroidetes - Chlorobi. International conference "Thermophiles", September 2011, Big Sky, Montana, USA, Book of abstracts, p. 92.

5. Kublanov I.V., Podosokorskava O.A.. Ravin N.V., Gavrilov S.N., Lebedinsky A.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Metabolic features of "Melioribacter roseus" and its genomic analysis support its phylogenetic position within Bacteria. International conference "Thermophiles", September 2011, Big Sky, Montana, USA. Book of abstracts, p. 109.

6. Podosokorskava O.A.. Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a first cellulolytic representative of class Anaerolineae. 9th International congress "Extremophiles", September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 140.

7. Kublanov I.V., Podosokorskava O.A.. Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Merkel A.Yu, Karnachuk O.L., Ravin N.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. "Melioribacter roseus " gen. nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic moderately thermophilic cellulolytic bacterium and proposal of "Ignavibacteriae " phyl. nov. 9th International congress "Extremophiles", September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 150.

8. Gavrilov S.N, Podosokorskava O.A.. Kublanov I.V., Merkel A.Yu, Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Ravin N.V., Frank Y.A., Karnachuk O.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Metabolic versatility of "Melioribacter roseus" gives insights into the evolution and deep subsurface origin of a novel phylum "Ignavibacteriae". 9th International congress "Extremophiles", September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 211.

9. Подосокорская O.A.. Бонч-Осмоловская E.A., Кадников B.B. и Кубланов И.В. Разложение целлюлозы факультативно анаэробными бактериями и их первый термофильный представитель "Melioribacter roseus". VII Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2012, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 30-32.

10. Karnachuk О., Avakian М., Podosokorskava О.. Gavrilov S., Frank Yu., Gerasimchuk A., Kublanov I. and Bonch-Osmolovskaya E. Genome insight into copper homeostasis in a new phylum of Bacteria. 8th International Copper Meeting "Copper in Biology", September-October 2012, Alghero, Italy. Book of abstracts, p. 61.

11. Kadnikov V., Mardanov A., Podosokorskava P.. Bonch-Osmolovskaya E. and Ravin N. Complete genome sequence of organotrophic bacterium Melioribacter roseus representing new phylum-level lineage affiliated with Chlorobi. 14th International Symposium on Microbial Ecology, August 2012, Copenhagen, Denmark. Book of abstracts, p. 942.

Подписано в печать 15.01.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1627. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,2.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Подосокорская, Ольга Андреевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы"

Целлюлоза - основной компонент клеточных стенок растений, является самым распространенным (исключая ископаемые ресурсы) источником органического углерода на Земле (Coughlan, 1990). Кристаллическая структура целлюлозы обуславливает ее исключительную устойчивость к различным внешним факторам среды и необходимость синергетического действия нескольких типов гидролитических ферментов (целлюлаз) для ее полного гидролиза. Тем не менее, в природе происходит эффективная деструкция целлюлозы за счет деятельности грибов и прокариот, которые участвуют, таким образом, в минерализации органического вещества и глобальном цикле углерода. При этом доступность кислорода, по всей видимости, играет одну из ключевых ролей в стратегии разложения целлюлозы микроорганизмами. В аэробных условиях значительная роль в этом процессе принадлежит грибам, хотя среди аэробных бактерий также есть целлюлолитические представители {Cellulomonas fimi, Streptomyces cellulolyticus и др.). Аэробные целлюлолитики характеризуются высокими урожаями клеток и наличием неассоциированных целлюлазных систем (Рабинович и Мельник, 2000). В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют, как правило, бактерии, которые синтезируют мультидоменные гидролитические ферменты, связанные с клетками, либо надмолекулярные комплексы - целлюлосомы. В то же время открытым остается вопрос о способности факультативно анаэробных микроорганизмов разлагать целлюлозу, поскольку за исключением нескольких мезофильных бактерий - Cellulomonas terrae (An et al2005), Telmatobacter bradas (Pankratov et al., 2012) - для абсолютного большинства представителей этой группы рост на целлюлозе не показан.

Работы по изучению целлюлолитических микроорганизмов были начаты еще в середине прошлого века. Однако повышенный интерес к данной группе был вызван топливным кризисом 70-х гг., поскольку низкая стоимость и повсеместное присутствие целлюлозного сырья делает его доступным ресурсом для производства топлива (Lynd et al., 2002). С тех пор был изучен целый ряд мезофильных и термофильных микроорганизмов, способных с разной степенью эффективности гидролизовать целлюлозу (Béguin et al, 1994; Schwarz, 2000; Blumer-Schuette et al., 2008). К началу наших исследований большинство описанных термофильных целлюлолитических бактерий относились к типам Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes. Среди архей рост на целлюлозе был показан только для одного гипертермофильного представителя — Desulfaroccocus fermentans (Perevalova et al., 2005).

Помимо изучения биоразнообразия целлюлолитических микроорганизмов, многочисленные исследования, проводимые в настоящее время, направлены на попытки увеличения скорости и эффективности микробного разложения целлюлозы. У ряда микроорганизмов исследована структура и функции отдельных ферментов и целлюлазных систем в целом, проведено клонирование и экспрессия целлюлаз (Zverlov et al., 1998; Berger et al., 2006; Raman et al, 2009; Oison et al, 2010). Однако фундаментальное понимание процесса микробного разложения целлюлозы остается неполным, а энергетические проблемы - нерешенными (Lynd et al., 2002),

Вместе с тем, сегодня целлюлазы уже нашли успешное применение во многих отраслях промышленности и сельском хозяйстве (Hongpattarakere, 2002; Sukumaran et al., 2005). Использование именно термофильных представителей и их термостабильных ферментов позволяет избежать загрязнения нежелательной микрофлорой (Vielle & Zeikus, 2001). Кроме того, воздействие высоких температур способствует увеличению доступности трудногидролизуемых нерастворимых веществ (Niehaus et al, 1999) и делает возможным проведение консолидированной биообработки сырья (Consolidated Bioprocessing, СВР, Lynd et al., 2002).

В то же время данные о малом количестве культивируемых прокариот относительно их общего числа (Amann et al, 1995) и недостаточная изученность микробного разнообразия термальных мест обитания прямо указывают на возможность выделения новых термофильных целлюлолитических микроорганизмов. Они, в свою очередь, могут прояснить роль этой группы в занимаемых эконишах и оказаться потенциальным источником ценных ферментов. Вышесказанное свидетельствует об актуальности изучения термофильных целлюлолитических микроорганизмов как с научной, так и с прикладной точек зрения.

Цели и задачи исследования

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

2) обнаружение, выделение и характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов;

3) первичная характеристика целлюлолитической активности у представителей новых таксонов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Описаны новые виды экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Ткегто^ае - Ткегтозірко а//ес1т эр. поу. и ¥егоійоЬасІегіит гірагіит эр. поу. Для представителей данных родов способность к росту на целлюлозе была показана впервые. Для представителей типа Ткегто^ае в целом впервые был продемонстрирован рост на микрокристаллической целлюлозе.

Выделены и частично охарактеризованы штаммы анаэробных целлюлолитических бактерий родов Thermotoga, Caldicellulosiruptor и Clostridium, представляющие новые виды. Кроме того, получены новые штаммы ряда известных целлюлолитических микроорганизмов, расширяющие представления об их распространении и физиологии.

В результате работы создана коллекция анаэробных целлюлолитических микроорганизмов (30 штаммов 22 видов), способных расти на целлюлозе и других полисахаридах в широком диапазоне температуры (20 - 92°С), pH (5.0 -9.5) и солености среды (0 - 8%). Новые микроорганизмы являются продуцентами термостабильных целлюлаз, которые могут быть устойчивы и к действию других физико-химических факторов.

Таким образом, в результате данной работы существенно расширились представления о разнообразии термофильных целлюлолитических микроорганизмов, которые могут играть определенную роль в процессах разложения целлюлозы в природе при высоких температурах.

Апробация работы

Публикации

Место проведения работы и благодарности

Секвенирование последовательностей полных геномов и генов 16S рРНК чистых и накопительных культур выполнялось в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) (г. Пущино). Ферментативное определение целлюллолитической активности проводили в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН). Определение хинонов проводили в ИБФМ РАН. Состав жирных кислот и фосфолипидов проводили в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования

Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина» (РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина).

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Бонч-Осмоловской Е.А. за практическую помощь, ценные советы и постоянное внимание на всех этапах выполнения работы. Автор приносит искреннюю благодарность сотрудникам Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ к.б.н. С.Н. Гаврилову, асп. А.Ю. Меркелю, к.б.н. A.A. Переваловой, д.б.н. Т.Г. Соколовой, к.б.н. H.A. Черных за помощь и участие в работе, а также всем сотрудникам и аспирантам лаборатории за содействие и поддержку.

Также автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим активное участие в работе на разных ее этапах, особенно д.б.н. Д.Ю. Сорокину.

Отдельную огромную благодарность автор выражает к.б.н. И.В. Кубланову за практическую помощь, постоянное внимание и полезную критику на всех этапах выполнения работы.

Работа выполнена при поддержке программам Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Происхождение и эволюция биосферы», грантов ФЦП (Госконтракты 02.512.11.2209, 02.740.11.0077, 16.512.11.2152, 11.519.11.2029, П2283, П646), а также гранта 7-ой рамочной программы научных исследований Евросоюза «HotZyme».

Список работ, опубликованных по материалам диссертации Экспериментальные статьи и обзоры

1. Кубланов И.В. и Подосокорская O.A. Термофильные микроорганизмы, разлагающие биополимеры. (2011) Глава в сборнике «Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского: Вып. 16: Термофильные микроорганизмы», Отв. Редактор В.Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 315 - 342.

2. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V., Reysenbach A.-L., Kolganova T.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. (2011) Thermosipho affectus sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 1160 - 1164.

3. Podosokorskaya O.A., Merkel A.Yu., Kolganova T.V., Chernyh N.A., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2011) Fervidobacterium riparium sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Kunashir hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 26972701.

4. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. (2013) Omatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a novel cellulolytic representative of class Anaerolineae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 8692.

5. Podosokorskaya O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Merkel A.Yu., KarnachukO.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2013) Melioribacter roseus gen. nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic thermophilic cellulolytic bacterium, and the description of a novel bacterial phylum Ignavibacteriae. Environm. Microbiol., as doi: 10.1111/1462-2920.12067.

6. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Podosokorskaya O.A., Gavrilov S.N., Kublanov I.V., Beletsky A., Bonch-Osmolovskaya E.A., and Ravin N.V. Genomic analysis of organotrophic facultatively anaerobic bacterium Melioribacter roseus supports a novel phylum Ignavibacteriae within Bacteriodetes/Chlorobi group. (2013). PLOS ONE. 8, e53047.

Тезисы конференций

1. Подосокорская O.A., Бонч-Осмоловская Е.А., Кубланов И.В. Новые умеренно термофильные целлюлолитические бактерии филумов Chlorobi и Chloroflexi. VI Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2010, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 54-56.

2. Podosokorskaya О.А., Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. New data on d iversity of eel lulolytic T hermotogales. International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", August 2010, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book of abstracts, p. 25.

3. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Novel cellulolytic representatives of Phylum Thermotogae. 8th International congress "Extremophiles", September 2010, Ponta Delgada, Portugal, Book of abstracts, p. 153.

4. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. Thermophilic cellulolytic representative of a novel bacterial lineage within the superphylum Bacteroidetes - Chlorobi. International conference "Thermophiles", September 2011, Big Sky, Montana, USA, Book of abstracts, p. 92.

5. Kublanov I.V., Podosokorskaya O.A., Ravin N.V., Gavrilov S.N., Lebedinsky A.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Metabolic features of 'Melioribacter roseus' and its genomic analysis support its phylogenetic position within Bacteria. International conference "Thermophiles", September 2011, Big Sky, Montana, USA. Book of abstracts, p. 109.

6. PodosokorskayaO.A., Bonch-OsmolovskayaE.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a first cellulolytic representative of class Anaerolineae. 9th International congress "Extremophiles", September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 140.

7. Kublanov I.V., Podosokorskava O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Merkel A.Yu, Karnachuk O.L., Ravin N.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. 'Melioribacter roseus' gen. nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic moderately thermophilic cellulolytic bacterium and proposal of"Ignavibacteriae" phyl. nov. 9th International congress "Extremophiles", September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 150.

8. Gavrilov S.N, Podosokorskava Q.A., Kublanov I.V., Merkel A.Yu, Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Ravin N.V., Frank Y.A., Karnachuk O.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Metabolic versatility of 'Melioribacter roseus' gives insights into the evolution and deep subsurface origin of a novel phylum "Ignavibacteriae ". 9th International congress "Extremophiles", September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 211.

9. Подосокорская O.A., Бонч-Осмоловская E.A., Кадников B.B. и Кубланов И.В. Разложение целлюлозы факультативно анаэробными бактериями и их первый термофильный представитель 'Melioribacter roseus'. VII Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2012, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 30-32.

10. Karnachuk О., Avakian М., Podosokorskava О., Gavrilov S., Frank Yu., Gerasimchuk A ., Kublanov I. and В onch-Osmolovskaya E . Genome ins ight i nto copper homeostasis in a new phylum of Bacteria. 8th International Copper Meeting "Copper in Biology", September-October 2012, Alghero, Italy. Book of abstracts, p. 61.

11. Kadnikov V., Mardanov A., Podosokorskava Q„ Bonch-Osmolovskaya E. and Ravin N. Complete genome sequence of organotrophic bacterium Melioribacter roseus representing new phylum-level lineage affiliated with Chlorobi. 14th International Symposium on Microbial Ecology, August 2012, Copenhagen, Denmark. Book of abstracts, p. 942.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Целлюлоза и ее гидролиз 1.1. Структура и свойства целлюлозы

Целлюлоза - это линейный полимер, состоящий из остатков глюкозы, связанных (3-1,4 гликозидной связью. Каждый остаток глюкозы повернут на 180° относительно соседнего, и таким образом, основной повторяющейся единицей является целлобиоза (Рис. 1). Длина целлюлозной цепи может варьировать в пределах от 100 до 14000 остатков глюкозы (Béguin & Aubert, 1994). А

Collobiose Glucoso

В Amorphous region

Crystalline region J Cryslalline region

Рисунок 1. Структура целлюлозы. А) Бета-гликозидные связи. Б) Схематичное изображение фибриллы, согласно Béguin & Aubert, 1994.

Приблизительно 30 индивидуальных молекул целлюлозы собраны в более крупную единицу - элементарную фибриллу, или протофибриллу. Последние упакованы в так называемые микрофибриллы. Толщина микрофибрилл колеблется в пределах от 3-4 нм у высших растений и до 20 нм у водорослей вида Valonia macrophysa, микрофибриллы которой состоят из нескольких сотен цепей целлюлозы. В свою очередь, микрофибриллы собраны в целлюлозные нити. Несмотря на различную ориентацию цепей, они становятся жесткими благодаря образованию меж- и внутрицепочечных водородных связей. Соседние «слои» лежат друг под другом и дополнительно удерживаются вместе за счет слабых Ван дер Ваальсовых сил. Хотя энергия подобных взаимодействий небольшая, суммарный эффект от многочисленных остатков, из которых состоит элементарная фибрилла, - значительный (Pizzi & Eaton, 1985).

Одно из важнейших свойств целлюлозы - кристалличность ее структуры, что весьма необычно для полисахаридов (Lynd et al, 2002). Кристаллическая природа целлюлозы основана на структурном порядке, при котором все ее атомы зафиксированы в определенной позиции относительно друг друга. Составляющие индивидуальную микрофибриллу молекулы упакованы настолько плотно, что способны препятствовать не только проникновению ферментов, но даже воды. Однако, несмотря на то, что целлюлоза способна формировать определенную кристаллическую структуру, нити целлюлозы в природе не являются кристаллически-чистыми. Кроме регионов с кристаллической структурой, целлюлозные нити содержат различного рода неупорядоченные аморфные участки (петли или витки на микрофибриллах, поверхностные микропоры и капилляры) (Marchessault & Sundararajan, 1993). В результате общая площадь поверхности целлюлозного волокна оказывается значительно большей, чем поверхность идеально гладкой фибриллы той же длины. Совокупный эффект такой структурной гетерогенности внутри нити как раз и позволяет, по крайней мере, частично гидратировать волокна целлюлозы, когда они попадают в водную среду. А микропоры и капилляры в значительной степени облегчают проникновение даже таких довольно крупных молекул как целлюлолитические ферменты (Stone & Scallan 1968; Stone et al, 1969).

Несмотря на огромное разнообразие состава и строения клеточных стенок растений, принадлежащих разным таксонам, высокое содержание целлюлозы (от 35 до 50 % от сухого веса растения) - их общее свойство (Lynd et al., 1999). В отличие от крахмала, который служит в качестве запасного полимера глюкозы, роль целлюлозы в растениях исключительно структурная. Высокая прочность целлюлозы при растяжении позволяет растительным клеткам противостоять осмотическому давлению, и, кроме того, благодаря особому строению целлюлозы, растения устойчивы к механическому давлению. Наглядными примерами последнего могут служить древесина и различные виды текстиля (хлопчатобумажная ткань, волокно рами, льняное полотно), нити которых состоят из стенок удлиненных пустых клеток. В некоторых случаях (в частности, в коробочках хлопчатника) целлюлоза представлена почти в чистом виде. В большинстве случаев, однако, целлюлозные нити погружены в матрикс из других структурных биополимеров - гемицеллюлоз и лигнина, - которые составляют 20-35 и 10-25 % от сухого вещества растения, соответственно (Lynd et al., 1999; Saha, 2004; Somerville, 2006) (Рис. 2).

Гемицеллюлозы представляют собой сложные углеводные полимеры, в которых ксиланы и глюкоманнаны являются основными компонентами. Разложение гемицеллюлоз происходит благодаря действию ферментов, гидролизующих ксилановый и глюкоманнановый остов и различные связи боковых цепей (Coughlan et al., 1993; Thomson, 1993). Лигнин - это сильно разветвленный, неупорядоченный полимер, который формируется по принципу свободно радикальной конденсации ароматических спиртов. Он устойчив к биодеградации и защищает целлюлозу и гемицеллюлозы от ферментативного гидролиза. Его окисление протекает по радикальному механизму за счет действия пероксидаз (Gold et al., 1989). Хотя взаимодействия в матриксе могут изменяться в зависимости от типа растительной клетки и степени зрелости целого растения, перечисленные полимеры являются доминирующими структурными элементами, ограничивающими доступность и степень разложения необработанной растительной биомассы. Также существуют данные, что связанные с целлюлозой гемицеллюлозы регулируют процесс самосборки индивидуальных молекул (линейных цепочек, состоящих из мономеров глюкозы) в сайте биосинтеза (Atalla et al., 1993; Brown & Saxena, 2000).

2012). Подобно целлюлозе растений, бактериальная целлюлоза высоко кристаллична, но эти два типа различаются по расположению гликозидных мономеров внутри кристаллов. Существуют генетические данные, подтверждающие то, что эти два типа целлюлозы синтезируются ферментативными аппаратами, которые значительно различаются на молекулярном уровне (Brown & Saxena, 2000). В свою очередь, растительная и бактериальная формы целлюлозы также существенно различаются по степени гидролиза целлюлазами грибов (Hayashi et al., 1997) и смешанными культурами бактерий рубца (Schofield et al., 1994; Weimer et al., 2000)

Очищенные (коммерческие) формы целлюлозы традиционно используются для изучения процессов гидролиза и утилизации ее микроорганизмами. При этом, поскольку их тонкая структура может существенно отличаться, выбор субстрата для таких исследований, несомненно, влияет на получаемые результаты. Голоцеллюлозы (например, Solka Floe) производятся путем делигнификации древесины. Эти препараты содержат большие количества различных гемицеллюлоз и часто имеют низкую объемную плотность, что может приводить к набуханию и размоканию целлюлозных волокон. Микрокристаллические целлюлозы (такие как, Avicel и Sigmacell) -практически чистые субстраты, поскольку используемая для их изготовления обработка разбавленной кислотой удаляет и гемицеллюлозы, и наиболее протяженные аморфные участки целлюлозных нитей. Различные типы коммерческой микрокристаллической целлюлозы отличаются, главным образом, размером частиц, количеством и длиной кристаллических участков, что важно для оценки степени гидролиза и утилизации субстрата.

Индекс кристалличности (crystallinity index) - важный параметр, который оценивают в препаратах целлюлозы, когда рассматривают ее как сырье для получения биотоплива. Однако ранее было показано, что в зависимости от метода измерения этой величины и способа обработки данных, значения могут варьировать (Thygesen et al., 2005; Park et al., 2009). В целом, можно говорить о том, что наиболее упорядоченной формой оказалась целлюлоза, вырабатываемая бактерией G. hansenii (индекс кристалличности 82.8%). Традиционно используемые коммерческие целлюлозы имеют индекс кристалличности в пределах от 45 до 65%. Для сравнения аморфная целлюлоза характеризуется 27% (Park et al., 2009). Кроме того, было сделано интересное наблюдение, что в гидратированном состоянии целлюлолоза становится более упорядоченной и имеет более высокий индекс кристалличности для всех изученных типов целлюлозы - от 3 до 5% для микрокристаллической целлюлозы и около 15% для аморфной (Park et al., 2010).

Чистые кристаллические формы используют, как правило, для оценки эффективности полной целлюлазной системы. Однако их физическая гетерогенность (степень кристалличности, доступная площадь поверхности, размер пор) усложняет детальные исследования ферментов. Кроме того, невозможным становится их использование при изучении неполных целлюлазных систем или их индивидуальных компонентов, которые проявляют лишь слабую активность по отношению к данным субстратам. Трудности, возникающие при работе с нерастворимыми субстратами, привели к широкому использованию растворимого эфира целлюлозы - карбоксимети л целлюлозы (КМЦ), - в качестве субстрата для изучения эндоглюканаз. Стоит отметить, что использование КМЦ в качестве субстрата упростило значение термина «целлюлолитический», поскольку существуют организмы, не способные разлагать целлюлозу, но гидролизующие КМЦ с помощью смешанных 1-4-р-глюкановых ферментов (Fields et al., 1998). Ранее существовало мнение, что из-за замещенной природы КМЦ относительно небольшое число микроорганизмов (например, некоторые грибы и штаммы рода Cellulomonas) способны использовать ее в качестве субстрата для роста (Lynd et al, 2002). Однако впоследствии было показано, что практически все описанные штаммы целлюлолитиков способны к росту на КМЦ. Другим часто используемым субстратом для проверки целлюлолитической активности является аморфная целлюлоза, которую получают при обработке фосфорной кислотой кристаллических форм целлюлозы. Благодаря такой обработке нарушается кристаллическая структура с сохранением химической структуры целлюлозы, что способствует более быстрому гидролизу данного субстрата. Для измерения кинетических параметров целлюлаз удобно использовать низкомолекулярные субстраты (растворимые олигодекстрины, состощие из 3-6 гликозидных остатков). Однако более удобными являются хромогенные и флуорогенные субстраты, в которых окрашенная или флуоресцентная составляющая связана с аиомерным углеродом целлобиозы или целлодекстрина за счет |3-гликозидной связи (Van Tilbeurgh et al., 1982). К наиболее часто используемым, коммерчески доступным веществам относятся р-нитрофенил-(3-0-целлобиозид (pNP-Cel) и метилумбеллиферил-|3-0-целлобиозид (MUC, МУЦ). Принцип метода с использованием таких субстратов состоит в детекции продуктов ферментативного гидролиза этих соединений путем визуализации высвободившихся хромофорных или флуорофорных групп. Как правило, спектрофлуорометрическое детектирование продуктов гидролиза субстратов, модифицированных флуоресцентными группами, дает на порядок большую чувствительность, чем при использовании хромофорных групп. Однако применение флуоресцентных субстратов имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, максимум флуоресценции или оптической плотности традиционных меток находится в области рН 8-10, в то время как большинство целлюлаз имеют оптимум активности при рН 7 или ниже, т.е. эти субстраты неудобны для спектрометрического анализа ферментативной реакции. Во-вторых, все эти субстраты совершенно непригодны для in situ определения ферментативной активности в образцах или на агаризованных средах, т.к. детектируемые продукты гидролиза растворимы и легко диффундируют из точки проявления активности. Попытки решить вышеперечисленные проблемы привели к разработке ряда методов, основанных на использовании дополнительных реагентов, образующих с детектируемым продуктом гидролиза нерастворимое соединение (Бобрикова и др., 2010).

1.2. Ферменты разложения целлюлозы

Полная деструкция целлюлозы всегда происходит под действием полиферментных систем. В природе, по-видимому, отсутствуют универсальные индивидуальные ферменты способные достаточно быстро расщепить целлюлозу до соответствующих мономеров, действуя эффективно на всех этапах реакции. Вместо этого в деструкции участвуют мультиферментные системы, в состав которых входят различающиеся по специфичности ферменты, выполняющие определенную частную функцию, без которой, однако, невозможна реализация всего процесса в целом (Синицын и др., 1995). Полиферментные системы характеризуются согласованностью действия составляющих их ферментов и, в ряде случаев, взаимным сверхаддитивным усилением эффективности действия друг друга (синергизмом) (Wilson, 2009). Специфика процесса ферментативной деструкции целлюлозы заключается в том, что субстрат имеет упорядоченную (кристаллическую) структуру, во многих случаях окружен сопутствующими соединениями (в первую очередь лигнин), которые служат физическим барьером, затрудняющим доступ ферментов к гликозидным связям. Важную роль играют также размеры поверхности, доступной молекулам ферментов, а также адсорбционные и диффузионные процессы, предшествующие и сопровождающие гидролитическое превращение нерастворимых субстратов.

Стоит отметить, что целлюлазы - индуцибельные ферменты, и регуляция их синтеза четко контролируется за счет механизмов активации и репрессии. Выработка целлюлаз индуцируется только в присутствии субстрата и подавляется, как только легко утилизируемые сахара становятся доступны. Ингибирование целлюлаз конечными продуктами (глюкозой и целлобиозой), образуемыми вследствие эндогенной целлюлолитической активности на субстрате, - является серьезной проблемой. Целлобиоза, например, представляет собой чрезвычайно мощный ингибитор биосинтеза эндоглюканаз и углевод-связывающих доменов (УСД, СВН) (Sukumaran et al, 2005). Низкий уровень синтеза (З-глюкозидаз (характерный для многих целлюлолитических микроорганизмов) приводит в итоге к замедлению разложения субстрата за счет ингибирования целлюлаз целлобиозой. Однако, как показывает практика, эта задача может быть решена несколькими способами: добавлением экзогенной р-глюкозидазы, для удаления избытка целлобиозы (Pakula et al., 2004) либо генно-инженерными методами, когда р-глюкозидазы синтезировались с избытком самим целлюлолитическим штаммом (Harkki et al., 1991). Кроме того, уже с 1962 г. (Mandéis et al., 1962, Vaheri et al., 1979, Kubicek & Penttila, 1998) были известны естественные индукторы целлюлазных систем, среди которых, в первую очередь, рассматривалась софороза (дисахарид). Впоследствии было показано, что для некоторых микроорганизмов целлобиоза, 8-целлобиозо-1-5 лактон и другие окисленные продукты гидролиза целлюлозы также могут выступать и в роли индукторов целлюлаз (Nogawa et al., 2001). В настоящий момент в промышленном производстве ферментов для индукции целлюлаз используют лактозу за счет ее экономической доступности. Но до сих пор механизмы лактозной индукции не полностью понятны.

Согласно классической схеме для полного разложения целлюлозы необходимо совместное действие трех типов гидролитических ферментов: эндоглюканаз, экзоглюканаз и Р-глюкозидаз. Эндоглюканаза (3.2.1.4) (целлюлаза; 1,4-(1,3;1,4)-Р-0-глюкан глюканогидролаза) разрывает Р-1,4 гликозидные связи внутри молекулы, что приводит к образованию больших фрагментов целлоолигосахаридов и резкому уменьшению степени полимеризации. Этот фермент гидролизует целлюлозу, целлоолигосахариды, аморфную целлюлозу, КМЦ, но не активен по отношению к целлобиозе. Экзоглюканаза (3.2.1.91) (1,4- P-D-глюкан целлобиогидролаза) отщеляет целлобиозу с восстановленных и невосстановленных концов цепи целлюлозы. Фермент активен к целлюлозе, целлоолигосахаридам и неактивен к целлобиозе и КМЦ. Р-глюкозидаза (3.2.1.21) (целлобиаза, P-D-глюкозид глюкогидролаза) катализирует гидролиз целлобиозы и целлоолигосахаридов до молекул D-глюкозы, но не способна к гидролизу кристаллической или аморфной целлюлозы. Однако помимо этих трех основных типов существует ряд других ферментов, в той или иной степени участвующих в разложении целлюлозы. Так, целлодекстрины и целлобиоза также могут быть гидролизованы с образованием а-глюкозо-1-фосфата и глюкозы благодаря действию целлобиозофосфоралазы (2.4.1.20) либо а-глюкозо-1-фосфата и декстрана со степенью полимеризации п-1 в реакции, осуществляемой целлодекстринфосфорилазой (2.4.1.49). По осуществляемой реакции они относятся к трансферазам, однако, при сравнительном анализе аминокислотной последовательности оказалось, что они принадлежат 94 семейству гликозидгидролаз (ОН94).

На последнем примере хорошо видны преимущества современной классификации целлюлаз и других углеводразлагающих ферментов, базирующейся на аминокислотной последовательности - СКЪу (САгутеБ, www.cazy.org) (НепиББа! & БаУ1е8, 1997; Сап1аге1 е/ а1., 2009). Такая классификация по структуре наиболее полно охватывает все ферменты, а также дает возможность выявить их гомологию, благодаря чему можно предсказать функцию в отличие от классификации по субстратной специфичности. В январе 2013 г. база данных CAZy включала 131 семейство гликозидгидролаз (вН), из которых 20 семейств содержали ферменты, участвующие в гидролизе целлюлозы и ее производных, и 66 семейств углевод-связывающих доменов (УСД, СВМ). Последние, в свою очередь, играют ключевую роль в прикреплении и последующем разложении именно кристаллических форм целлюлозы. Таким образом, можно говорить о том, что различные классификации хорошо, но не полностью согласуются друг с другом. Некоторые ферменты, относящиеся к одному семейству по субстратной специфичности (механизму катализа) могут входить в другое семейство по структуре (Табл. 1).

Таблица 1. Ферменты гидролиза целлюлозы, целлодекстринов и целлобиозы.

КФ Название Семейство Прежнее название

ЕС)*

3.2.1.4. Целлюлаза (Cellulase/ GH5 «Целлюлаза А»

Avicelase/Endoglucanase/ GH6 «Целлюлаза В»

CMCase) GH7 «Целлюлаза С»

GH8 «Целлюлаза D»

GH9 «Целлюлаза Е»

GH12 «Целлюлаза Н»

GH44 «Целлюлаза J»

GH45 «Целлюлаза К»

GH48 «Целлюлаза L»

GH51

GH61

GH74

GH124

GH131

3.2.1.91 1,4-бета-целлобиогидролаза GH5 «Целлюлаза А»

GH6 «Целлюлаза В»

GH9 «Целлюлаза Е»

GH48 «Целлюлаза L»

3.2.1.21 бета-глизозидаза/ GH1 целлобиаза GH3

GH9 «Целлюлаза Е»

GH30 Была выделена из GH5

GH116

2.4.1.20 целлобиозофосфорилаза GH94 GT36

2.4.1.49 целлодекстринфосфорилаза GH94 GT36

3.2.1.45 GH30 Была выделена из GH5

GH116

3.2.1.86 GH1

GH4

КФ (ЕС)* - код фермента, классификационный номер фермента по международной иерархической классификации (от англ. Enzyme commission (ЕС) number)

Целлюлазные системы организмов в целом, часто разделяют на комплексные и простые (Bayer et al., 2006; Doi, 2008). Аэробные грибы (Т. reesei), аэробные термофильные бактерии (Acidothermus cellulolyticns, Thermobifida fused) и анаэробные экстремально термофильные бактерии (<Caldicellidosiniptor saccharolyticus, A.thermophilum) имеют простые ферментные систем, в состав которых входят несколько индивидуальных секретируемых эндо-, экзоглюканаз и бета-глюкозидаз, действующих синергетически (Svetlichnyi et al., 1990; Rainey et al., 1994). Типичными примерами являются целлюлазы из Т.reesei: гриб вырабатывает 2 экзоглюканаз, 8 эндоглюканаз и 7 бета-глюкозидаз.

Комплексные ферментные системы обнаружены в анаэробных грибах (род Anaeromyces, Caecomyces, Cyllamyces и др.), мезофильных бактериях {Bacteroidetes cellulosolvens, Clostridium cellulovorans, C.cellidolyticum, Ruminicoccus flavefaciens) и термофильных бактериях (C.thermocellum) (АН et al., 1995; Nicolson et al, 2005, Ljungdahl, 2008). Эти микроорганизмы формируют на клеточной поверхности крупные внеклеточные ферментные комплексы - целлюлосомы, состоящие из некаталитических (структурных) белков, связанных с многочисленными каталитическими компонентами с целлюлазной и другими гидролитическими активностями (Bayer et al., 1983; Miron et al., 2001; Doi & Kosugi, 2004; Xu et al., 2004; Fendri et al., 2009). Наиболее изученными системами такого типа являются целлюлазы представителей рода Clostridium, однако, индивидуальный состав компонентов целлюлосом сильно варьирует в зависимости от организма (Lynd et al., 2002). В общем случае, в целлюлосомах структурный компонент, или скафолдин, содержит связывающие сайты - когезины, которые взаимодействуют со «стыковочными» модулями ферментов - докеринами, образуя энзиматическую единицу. Высоко специфичное и стабильное когезин-докериновое взаимодействие служит связующим звеном в сборке каталитических доменов на скафолдине (1 тип взаимодействий) и прикреплении самого скафолдина на поверхности клетки посредством «якорных» белков (2 тип взаимодействий) органические кислоты С02 и Н2. За некоторым исключением (Svetlichnyi et al., 1990; Rainey et al., 1994), анаэробы разлагают целлюлозу преимущественно через сложные целлюлазные системы, хорошо проиллюстрированные на примере целлюлосом термофильной бактерии Clostridium thermocellum (Schwarz, 2001). И хотя в культуре С. thermocellum целлюлазы располагаются как в жидкой фазе, так и на поверхности клетки, большинство анаэробных видов не выделяет значительных количеств свободных целлюлаз, и вместо этого локализует сложные системы целлюлаз прямо на поверхности клетки или клеточпо-гликокаликсном матриксе. Вероятно, по этой причине анаэробные целлюлолитики оптимально растут на целлюлозе, когда прикрепляются к субстрату, и, по крайней мере, в нескольких случаях такая адгезия является обязательной. Хотя механизм(ы) микробной адгезии на целлюлозе и ее относительная важность в процессе утилизации ими субстрата до сих пор не ясна и требует дальнейших исследований (Bayer et al., 1998; Demain et al., 2005).

Среди факультативно анаэробных бактерий на сегодняшний день, только несколько представителей мезофильных родов - Celliilomonas uda (Reguera & Leschine, 2001), С. terrae (An et al., 2005) и Telmatobacter bradus (Pankratov et al., 2012) - описаны как целлюлолитики, несмотря на широкое распространение группы факультативных анаэробов, в целом. Среди термофильных факультативно анаэробных микроорганизмов в настоящее время и вовсе не обнаружено целлюлолитических представителей. Является ли общая малочисленность целлюлолитиков в группе факультативных анаэробов следствием физиологической или экологической несовместимости двух фундаментально различающихся стратегий разложения целлюлозы пока не ясно. Этот вопрос требует дальнейшего рассмотрения.

С точки зрения таксономии целлюлолитические микроорганизмы являются представителями разнообразных групп. Большинство из них принадлежит к бактериям и грибам. Данных о наличии целлюлолитических представителей среди архей значительно меньше. Вместе с тем, в последние годы сформировалась тенденция к поиску именно термофильных представителей в каждой из этих групп. Обосновано это, прежде всего, технологическими требованиями промышленной переработки целлюлозосодержащих отходов. Мезофильные продуценты и их гидролитические ферменты не выдерживают жестких условий проведения промышленных процессов. Возможным выходом из этой ситуации может стать использование термофильных микроорганизмов и вырабатываемых ими целлюлаз.

Термофильными называют микроорганизмы, оптимально растущие при температуре выше 50°С. Внутри данной группы выделяют умеренно термофильных (оптимум роста от 50 до 65°С), экстремально термофильных (оптимум роста от 65 до 80°С) и гипертермофильных (оптимум роста от 80°С и выше) представителей. Кроме того, существуют термотолерантные микроорганизмы, способные расти при температуре выше 45°С, но с оптимумом в области умеренных температур.

Хотя в природе основная доля целлюлозы разлагается в мезофильных условиях, в термальных местах обитания также происходит ее эффективная деструкция. Как известно, при температурах выше 70°С фотосинтетические процессы не происходят. Однако зачастую термальные места обитания богаты органикой, в том числе целлюлозой и другими полисахаридами. Для наземных горячих источников ее происхождение связано с прилегающими низкотемпературными зонами, где активно развивается растительность (Рис.4).

Кроме того, существуют растения, способные расти при повышенных температурах. Так, например, ПтЬп^уЦБ оско!епз1з (Бахромчатостолбник охотский), А&юхНз раигкеИса (Полевица паужетская) и В1с1ет ктШБскаИса -(Череда камчатская) - это облигатно термофильные растения, составляющие покров термальных местообитаний (по изотермам - 48.5°С на глубине 5 см и 52.5°С на глубине 10 см) (Нешатаева, 2009). Для термальных ниш морского происхождения присутствие в них целлюлозы можно объяснить оседанием огромных масс водорослей из верхних слоев морской толщи, а также синтезом подходят для обнаружения и выделения таких микроорганизмов, что подтверждают данные об уже описанных представителях. Ниже речь пойдет об известных на сегодняшний день представителях термофильных грибов, бактерий и архей.

2.2. Целлюлолитические грибы. Термофильные представители

Среди 700 аэробных видов отдела Zygomycetes только некоторые виды рода Мисог обладают значительной целлюлолитической активностью. Напротив, гораздо большее разнообразие целлюлолитиков можно наблюдать среди Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes (каждый из отделов содержит свыше 15000 видов) (Carlile & Watkinson, 1997). Помимо аэробных грибов, разлагающих целлюлозу, в микрофлоре желудочно-кишечного тракта крупных травоядных млекопитающих (коров, овец), листоядных птиц (гоацин) и растительноядных насекомых (термиты, черви, личинки) были обнаружены анаэробные грибы, участвующие в разложении растительной пищи, которые классифицируют в 6 родов: Anaeromyces, Caecomyces, Cyllamyces, Neocallimastix, Orpinomyces и Pyromyces (Nicholson et al., 2005). В то время как многие грибы способны использовать целлюлозу в качестве источника энергии, только немногие штаммы секретируют комплексы целлюлаз, которые могут иметь практическое применение. Помимо Т. reesei, другие грибы -Humicola, Penicillium и Aspergillus - также способны синтезировать высокий уровень внеклеточных целлюлаз (Schulein, 1997; Jorgensen et al., 2003; Ong et al., 2004).

При этом не следует забывать, что понятие «термофилия» весьма условно, когда речь заходит о грибах. До настоящего времени не было описано ни одного представителя, растущего при температуре выше 60°С (Maheshwari et al., 2000). Большинство так называемых «термофильных» грибов оптимально растут при температуре от 37 до 45°С, с верхним температурным пределом около 50-55°С. К тому же, таких термотолерантных форм не так много: всего около 30 из более чем 50000 видов описанных на сегодня грибов. Среди наиболее перспективных целлюлолитических грибов, устойчивых к действию повышенных температур, следует назвать Sporotrichum thennophile (Топт - 4550°С) и Talaromyces emersonii (Топт - 40-45°С) (Coutts & Smith, 1976; Folan & Coughlan, 1978). Активность их эндо- и экзоглюканаз была на порядок ниже активности целлюлаз Т. reesei, однако, скорость роста S. thermophile и Т. emersonii была в 5 раз выше (Bhat & Maheshwari, 1987). Более того, оптимальная температура для экзоглюканаз S. thermophile составляла 63°С, а для эндоглюканаз Т. emersonii - 75-80°С (Moloney et al., 1985; Fracheboud & Canevascini, 1989). Кроме всего прочего, для бета-глюкозидаз Н. insolens было показано, что их активность стимулировалась добавлением детергентов и восстанавливающих агентов (бета-меркаптоэтанол и додецилсульфат натрия (ДСН), Rao & Murthy, 1991). Тем не менее, в целом, целлюлолитические ферменты грибов менее устойчивы к воздействию внешних факторов по сравнению с целлюлазами термофильных бактерий и архей.

2.3. Термофильные целлюлолитические бактерии

К настоящему моменту описано значительное число термофильных представителей домена Bacteria, однако, гипертермофилов среди них не так много: 9 видов и 5 родов - Aquifex, Geothermobacterium, Rhodothermus, Thermocrinis и Thermotoga (Kashefi, 2012). Несмотря на небольшое число описанных гипертермофильных бактерий, их физиология очень разнообразна: оптимум роста варьирует в пределах 80-90°С, рН и NaCl оптимумы - от 6.5-8.5 и от 0-3%, соответственно. Они способны к автотрофному, факультативно автотрофному и гетеротрофному росту в аэробных, факультативно анаэробных и строго анаэробных условиях. И, хотя один из экстремально термофильных представителей рода Rhodothermus описан как целлюлолитик, среди гипертермофилов рост на целлюлозе был показан только для бактерий типа Thermotogae.

Тип Thennotogae представляет собой группу экстремально и гипертермофильных грамотрицательных палочковидных неспорообразующих бактерий с так называемыми «тогами» (внешними отслоившимися на концах клетки оболочками в виде чехлов). Они являются гетеротрофами с бродильным типом метаболизма. Основные продукты брожения - ацетат, углекислый газ и водород (I-Iuber et al, 1986; Van Ooteghem et al, 2002, 2004). Первая описанпая гипертермофильная бактерия данного типа - Thermotoga maritima - была выделена из геотермально активной области на острове Вулкано, в Италии (Huber et al., 1986). Остальные виды рода оказались широко распространены по всему земному шару (Huber et al, 1986; Jannasch et al., 1988; Jeanthon et al., 1995; Ravot et al., 1995; Fardeau et al., 1997; Takahata et al., 2001; Balk et al, 2002). На сегодняшний день в типе Thennotogae описано уже 10 родов и 40 видов бактерий. Повсеместная распространенность представителей Thennotogae, по-видимому, является результатом их метаболической универсальности, поскольку геномы этих бактерий содержат большое.число генов, кодирующих ферменты различных путей утилизации углеводов, в том числе полисахаридов (Bronnenmeier et al, 1995; Zverlov et al., 1997a, b; Bibel et al, 1998; Bandlish et al, 2002; Kim et al., 2002; Suresh et al, 2002, 2003; Chhabra et al., 2003; Kluskens et al., 2003; Nguyen et al, 2004; Conners et al., 2005). Несмотря на это, гипертермофильных представителей типа, растущих на кристаллической целлюлозе, к моменту начала данной работы описано не было. Таким образом, можно говорить, что микроорганизмы, разлагающие кристаллическую целлюлозу, ограничены группой экстремальных и умеренно термофильных бактерий, оптимально растущих в области от 50 до 78°С (Рис.

5).

Среди экстремально и умеренно термофильных бактерий концентрация целлюлолитических микроорганизмов особенно велика в порядках Actinomycetales (тип Actinobacteria) и Clostridiales (тип Finnicutes), с преобладанием в них аэробных и анаэробных представителей, соответственно. В порядок Clostridiales входит огромное число мезофильных и термофильных видов бактерий, которые используют в качестве субстрата кристаллическую целлюлозу и другие ее формы. Среди них представители родов Caldicellulosiruptor, Clostridium, Caloramator, Ruminicoccus, Butyribibrio и др. Наиболее термофильными (Топт - 78°С) представителями являются Caldicelliilosiruptor kristjanssonii и 'Anaerocellum thermophilumпереописанный не так давно как Caldicellulosiruptor bescii (Svetlichnyi et al., 1990; Bredholt et al., 1999; Yang et al., 2010). Бактерии рода Caldicellulosiruptor синтезируют не связанные с клетками целлюлазы и не содержат целлюлосом. Их ферменты характеризуют как мультидоменные и мультифункциональные, поскольку они содержат УСД разных семейств (зачастую дуплицированные) и целлюлазы с несколькими каталитическими доменами разной функции (Gibbs et al., 2000; VanFossen et al., 2008). Так например, анализ генома С. saccharolyticus выявил, что у данного микроорганизма есть две бифункциональные целлюлазы CelA и CelB, которые содержат на С-конце молекулы домен с эндоглюканазной активностью, а на N-конце - домен с экзоглюканазной активностью, при этом участок, соединяющий домены содержит триплет из УСД (Те'о et al., 1995). Наличие такого рода ферментов позволяет бактерии эффективно разлагать целлюлозу, в том числе микрокристаллическую. Для подтверждения этих данных был проведен эксперимент, при котором аналогичный фермент из С. bescii был лишен домена с экзоглюканазной активностью. В результате этот «усеченный» фермент проявлял гораздо меньшую активность по отношению к кристаллической целлюлозе, сохраняя прежний уровень гидролиза по отношению к КМЦ (Zverlov et al., 1998).

Другим целлюлолитическим представителем порядка, оптимально растущим при 60°С, и наиболее интенсивно изучаемым на протяжении последних лет, является Clostridium thermocellum (Freier et al., 1988). Этот организм растет на широком спектре очищенных препаратов целлюлозы и ее производных и крайне медленно разлагает природные необработанные целлюлозные материалы (Bolshakova et al., 1994). Недавно было показано, что у С. thermocellum энергетический баланс разложения целлюлозы выше, чем при

Рисунок 5. Филогенетическое дерево термофильных микроорганизмов, содержащих целлюлазы (ВЬшег-БсЬиейе е1 а1., 2008). В голубую сферу помещены термофильные микроорганизмы, растущие на микрокристаллической

• целлюлозе.

Оптимальные температуры роста обозначены цветом: красным (Топт>80°С), рыжим (Топт>70°С), зеленым (Топт>60°С).

Расшифровка аббревиатур для видов (в скобках приведена Топт): Athe: Anaerocellum thermophilum (75°С); CRt8B4: Caldicellulosiruptor sp. Rt8B4 (70°C); Csac: Caldicellulosiruptor saccharolyticus (70°C); С Tok7B.l: Caldicellulosiruptor sp. Tok7B.l (70°C); Cthe: Clostridium thermocellum (60°C); Ckri: Caldicellulosiruptor kristjanssonii (78°C); Clac: Caldicellulosiruptor lactoaceticus (68°C); Cowe: Caldicellulosiruptor owensensis (75°C); Dthe: Dictyoglomus thermophilum (70°C); PAB: Pyrococcus abyssi (96°C); PF: Pyrococcus furiosus (100°C); PH: Pyrococcus horikoshii (98°C);Tcel: Thermoanaerobacter cellulolyticus (70°C); Telf: Thermotoga elfii (66°C); Trq2: Thermotoga sp. RQ2 (80°C); Tlet: Thermotoga lettingae (65°C); Tm: Thermotoga maritima (80°C); Tnea: Thermotoga neapolitana (80°C); Tna: Thermotoga naphthophila (80°C); Tpet: Thermotoga petrophila (80°C); SSO: Sulfolobus solfataricus (85°C); TK: Thermoccus kodakarensis (85°C). использовании моносахаров, поскольку на транспорт последних расходуется даже больше энергии, чем для транспортировки целлодекстринов (Zhang et al., 2005). Кроме того, конкурентное преимущество этой бактерии состоит в том, что разложение целлодектринов до мономеров внутри клетки препятствует их потреблению другими микроорганизмами. При этом для гидролиза целлюлозы С. thermocelliim использует особые полиферментные системы - целлюлосомы, которые были впервые обнаружены именно у этого микроорганизма (Lamed et al., 1983). Впоследствии было показано, что целлюлосомы присутствуют и у других анаэробных бактерий и грибов (Bayer et al., 2000; Gilbert, 2007; Doi, 2008), и в редких случаях обнаруживаются у аэробных микроорганизмов (Deng et al., 2005; Ohtsuki et al., 2005; Jiang et al., 2006). Однако ни у одной бактерии, растущей при температуре выше 65°С целлюлосомы обнаружены не были. Нет их и у представителей домена Archaea.

Для представителей порядка Actinomycetales, напротив, характерна выработка простых, не связанных с клеточной стенкой гидролитических ферментов. Абсолютное большинство представителей группы является мезофильными организмами. Однако термофилы среди них тоже присутствуют. Морфологически термофильные Actinomycetales представлены нитевидными либо палочковидными спорообразующими неподвижными клетками. К наиболее подробно охарактеризованным относятся следующие виды: Acidothermus cellulolyticus (Mohagheghi et al., 1986), Thermobifida cellidolytica (Kukolya et al., 2002), Thermobispora bispora, Thermobifida fusca, Thermomonospora curvata (Henssen, 1957).

Кроме перечисленных выше представителей типов Thermotogae, Firmicutes и Actinobacteria, хорошо известны своими целлюлолитическими способностями термофильные аэробные бактерии типа Bacteroidetes (Rhodothermus marimis) и анаэробные бактерии типов Dictyoglomys (D. thermophilimi, D. turgidum) и Spirochaetes (Spirochaeta thermophila) (Saiki et al., 1985; Alfredsson et al., 1988; Svetlichny & Svetlichnaya, 1988). Кроме того, совсем недавно сразу два целлюлолитических представителя было описано внутри типа Chloroflexi (Yabe et al., 2011a, b). Обе бактерии - Thermosporothrix hazakensis и Thermogemmatispora onikobensis - оказались аэробными умеренно термофильными нитчатыми бактериями, образующими воздушный мицелий и споры.

В целом, однако, только немногие виды каждого из перечисленных типов являются активными целлюлолитиками. И только некоторые из них используются для получения ферментативных препаратов целлюлаз (Ramirez & Coha, 2003).

2.4. Термофильные целлюлолитические археи

К настоящему моменту показано, что археи могут использовать большинство из доступных источников углерода и энергии на Земле. В то же время, об участии архей в процессе разложения целлюлозы известно совсем немного. Это тем более удивительно, поскольку в последнее десятилетие одной из основных целей исследователей стало получение как можно более термостабильных ферментов, а большинство гипертермофильных микроорганизмов относятся как раз к археям.

Описано уже более 35 родов архей, в состав которых входят гипертермофильные виды (Graham et al, 2011). Но только для одной из них -Desulfurococcus fermentans - удалось продемонстрировать рост на кристаллической целлюлозе (Perevalova et al., 2005). Однако гены, кодирующие известные экзоглюканазы и УСД, в геноме обнаружены не были (Susanti et al., 2012). В то же время, гены ферментов, участвующих в разложении целлюлозы, были найдены у некоторых других гипертермофильных архей, ß-глюкозидазы, обнаруженные в геномах гипертермофильных представителей родов Sulfolobus и Pyrococcus, были клонированы и экспрессированы в Е. coli, ß-глюкозидаза из Pyrococcus furiosus оказалась активна при температуре 103°С, а аналогичный фермент из Pyrococcus horikoshii активен в органических растворителях (Antranikian et al., 2005). Гены эндоглюканаз также были обнаружены у Р. furiosus, P. horikoshii (Antranikian, et al., 2005) и Siilfolobus solfataricus (She et al., 2001). Совсем недавно и для умеренно термофильной галофильной археи Halorhabdus utahensis было продемонстрировано, что она способна синтезировать галоалкалофильную термостабильную эндоглюканазу (Zhang et al., 2011). Однако ни для одного из этих микроорганизмов не была показана способность к росту на целлюлозе. В определенном смысле усложняет ситуацию и то, что целлюлазы архей лишены «опознавательных» углевод-связывающих доменов, в отличие от целлюлаз, продуцируемых Т.reesei и C.thermocellum (Kurokawa et al,. 2002; Martinez et al., 2008). Это с одной стороны, препятствует эффективному гидролизу целлюлозы чистыми культурами архей и, с другой стороны, затрудняет выявление целлюлолитиков среди них.

Отсутствие описанных гипертермофильных архей, имеющих полный набор целлюлаз, подтолкнуло Грэхема с соавторами (2011) изучить возможность разложения целлюлозы сообществом гипертермофильных архей (Graham et al., 2011). В результате была получена устойчивая накопительная культура, разлагающая при 90°С МКЦ, КМЦ, фильтровальную бумагу и измельченный Miscanthus gigas (веерник, мискантус гигантский). С помощью пиросеквенирования в составе этой накопительной культуры были детектированы следующие организмы: Ignisphaera aggregans (95%), Pyrobaculum islandicum (98%), Thermofdum pendens (93%). Доминирующим организмом оказалась I. aggregans, для которой была собрана полная геномная последовательность (1.92 Мб). Анализ полученного генома выявил наличие у организма генов, кодирующих 12 различных гликозидгидролаз, из которых одна была выбрана для дальнейшего анализа.

Молекулярная масса фермента составила 90 кДа. Авторам удалось доказать, что данная эндоглюканаза представляла собой мультидоменный фермент, чего ранее не было показано для гипертермофильных архей. Два из четырех доменов целлюлазы не имели охарактеризованных гомологов. Фермент был успешно клонирован и экспрессирован в Е. coli. Оптимальной температурой была 109°С, а время полужизни фермента при 100°С составляло 5 часов. Эндоглюканаза оказалась активна в широком рН диапазоне (3.5 - 8), с оптимумом при 5.5. Кроме того, была устойчива к детергентам, высоким концентрациям солей и ионным жидкостям (3-диметилимидазолин диметил фосфат (ОМ1М)ОМР) и 1-этил-З-метилимидазол ацетат (ЕМ1М)ОАс), которые потенциально могут использоваться при обработке целлюлозы (БЫЛ е/.а/., 2011).

Процент сходства аминокислотных последовательностей данной эндоглюканазы с ближайшими гомологами был крайне низкий (меньше 35%). Структурный анализ показал, что вероятно, этот фермент является мембрансвязанным, как и у Р. Уюпкохки (КазЫша et.al., 2005) Однако структура изучаемой гликозидгидролазы оказалась настолько уникальной, что, по-видимому, она может быть описана как фермент нового семейства либо глубокой ветви внутри 5 семейства гликозидгидролаз.

Таким образом, сегодня с уверенностью можно говорить о присутствии среди гипертермофильных архей целлюлолитических представителей. Вместе с тем трудность выделения их в чистые культуры может быть связана с компактностью их геномов по сравнению с целлюлолитическими бактериями и, вследствие этого, облигатностыо симбиоза с другими микроорганизмами для эффективной утилизации лигноцеллюлозы, требующей одновременного действия ферментов различных типов. С другой стороны, в ряде работ ранее было показано, что при тщательном изучении факторов, лимитирующих рост микроорганизма, и подборе оптимальных условий культивирования, разделение таких «облигатных симбионтов» становится вполне реальным (7Ш'щ & 01ег1 1983, ТМ1ес1егЬег§ег е/ а1., 2006). Наконец, с учетом последних достижений в области молекулярной биологии и биотехнологии можно предположить, что через определенное время большинство задач исследователи смогут решать, не прибегая к выделению чистых культур.

3. Перспективы использования целлюлаз термофильных микроорганизмов

3.1. Области применения целлюлаз

Важность понимания фундаментальных основ процесса разложения целлюлозы сегодня не вызывает сомнений. С научной точки зрения он является одним из ключевых этапов глобального цикла углерода, от которого зависит существование всего живого на Земле. Кроме этого, поиск новых целлюлолитических организмов и изучение механизмов влияния на характер и интенсивность протекания процесса разложения целлюлозы представляют собой ключевые задачи и с практической точки зрения, поскольку использование этих знаний может принести неоценимую пользу человечеству. В подтверждение этого мы приведем ряд примеров промышленных отраслей, где возможно использование целлюлолитиков и целлюлаз, некоторые из которых используются уже сегодня.

В пищевой промышленности целлюлазы и гемицеллюлазы в виде ферментативных препаратов уже сегодня применяют для осветления фруктовых соков от частиц мякоти. Кроме того, целлюлазы могут способствовать более эффективной экстрации соков и масел (оливкого, например) из мякоти фруктов, овощей и семян, производству фруктовых нектаров и пюре (Tsao et al., 2000). Также некоторые целлюлазы способны гидролизовать |3-1,3-Р-1,4-глюканы, которые в больших количествах присутствуют в низкосортном ячмене и затрудняют фильтрацию пива. Рекомбинантные дрожжи, синтезирующие Р-1,3-Р-1,4-глюканазы давно доступны для отрасли пивоварения (Penttila et al., 1989). В виноделии добавление экзогенных гемицеллюлаз и глюканаз также позволяет добиваться лучшей мацерации и экстрации цвета (Galante et al., 1998). Кроме того, целлюлазы традиционно используют для экстракции каротиноидов при производства пищевых красителей (Pajunen, 1986)

С другой стороны, создание дешевых ферментных препаратов целлюлаз и гемицеллюлаз может стать толчком в разработке современной технологии кормления животных. Частичный гидролиз клеточных стенок растений ускоряет высвобождение Сахаров, которые могут сбраживаться молочнокислыми бактериями, что облегчает усвоение силоса животными (Lewis et al., 1996; Kung et al., 1997). В настоящее время неочищенные ферментативные препараты из T.reesei и A. niger продаются на рынке, но некоторые технические проблемы их использования остаются нерешенными (Beauchemin et al., 1995; Bedford et al., 2003).

Текстильная промышленность - еще одна область, где целлюлазы находят свое применение. Целлюлазы занимают третье место среди ферментов, используемых в этой отрасли, и только потому, что их внедрение началось относительно недавно (Xia & Сеп, 1999). Целлюлазы, добавляемые к стиральным порошкам, удаляют микронити, которые зачастую выступают из полотна хлопчатобумажной ткани после нескольких стирок (Cortez et al., 2001), и тем самым способствуют сохранению мягкости и яркости ткани. Кроме того, возможно использование целлюлаз в составе детергентов для чистки тканей (Nielsen, 1994; Clarkson et al., 2000; Fowler, 2000). В качестве промышленных продуцентов целлюлаз применяют штаммы Т. reesei, Т. viride и Т. harziamtm и A. niger (Kottwitz & Schambil, 2005). Препараты целлюлаз, синтезируемых представителями рода Humicola (Н. insolens, Н. grísea), активны в умеренно щелочных условиях и при повышенных температурах, поэтому зачастую их добавляют в стиральные порошки и детергенты (Uhlig, 1998; Mitchinson & Wendt, 2001). Используют целлюлазы и для так называемого «состаривания» джинсовых изделий при производстве «полинялой» одежды, заменяя традиционные методы шлифовки (Olson, 1990; Olson & Stanley, 1991; Bhat, 2000). Наиболее часто применяют для «биосостаривания» джинсового полотна целлюлазы из Н. insolens, хотя использование кислых целлюлаз из Trichoderma в сочетании с протеазами - не менее эффективный способ (Cortez et al., 2001).

Наконец, целлюлазы применяют и для удаления излишков краски из джинсовой ткани и градиентного окрашивания (Galante & Formantici, 2003).

Значительный интерес сегодня сфокусирован на использовании цел л юл аз, гемицеллюлаз и ксиланаз для целлюлозо-бумажной промышленности. Эти ферменты применяют для биомеханического размягчения сырой массы (Bedford et al., 2003), удаления краски и химикатов из бумаги с целью подготовки ее для повторного использования (Franks et al., 1996; Yang et al., 2004), а также улучшения дренажности и пропускной способности целлюлозно-бумажных комбинатов (Prasad et al., 1992). Более того, целлюлазы используют для изготовления биодеградабельного картона (Buchert et al., 1998), бумажных полотенец и гигиенической бумаги (Hsu & Lakhani, 2002; Sharyo et al, 2002).

Другая важная область касается переработки целлюлозосодержащих отходов, которые образуются в огромных количествах. Среди муниципальных отходов на их долю приходится до 40% (Benoit et al., 1992), а объем сельскохозяйственных отходов и отходов лесной промышленности только в России составляет около 300 млн т/г (Варфоломеев, 2009). Сжигание -дорогостоящий и далеко не всегда возможный способ их утилизации. Наиболее перспективным способом представляется переработка такого сырья сообществами анаэробных микроорганизмов до СОг и метана. В настоящее время, в опытных установках для осуществления процесса используют консорциумы бактерий из естественных мест обитания, но в перспективе, эффективность его может быть существенно повышена за счет применения на двух лимитирующих стадиях (разложение целлюлозы и метаногенез) генетически модифицированных штаммов.

Кроме перечисленных областей, целлюлазы могут использоваться и в некоторых других областях. Например, в ряде работ целлюлазы рассматриваются как агенты для создания протопластов (Liu & Zhu, 2000) и антибактериальных хитоолигосахаридов, которые могут применяться для консервирования пищи (Тза1 е^ а1., 2000), иммуной стимуляции или в качестве потенциального противоопухолевого агента (\¥и et а1, 2004; С)т е/ а1., 2004).

Наконец, основной долгосрочной задачей для крупномасштабного применения целлюлаз на сегодняшний день остается утилизация целлюлозной биомассы как огромного возобновляемого источника энергии. Эта возможность начала активно исследоваться после топливного кризиса конца 70-х гг. Однако с экономической точки зрения топливо, получаемое из лигноцеллюлозы, не конкурентоспособно до сих пор по сравнению с бензином и даже продуктами, получаемыми из крахмала - субстрата более дорогого для производства топлива, но значительно проще разлагаемого. В настоящий момент использование отходов лигноцеллюлозы ограничено из-за отсутствия эффективной и дешевой технологии их переработки. Стратегия, применяемая сегодня для получения биоэтанола из лигноцеллюлозы, - это многостадийный процесс, включающий химическую или химико-энзиматическую предобработку сырья с целью удаления фракции лигнина и гемицеллюлоз, обработку целлюлазами при 50°С для гидролиза целлюлозы до сбраживаемых Сахаров и, в конечном счете, использование микроорганизма-бродильщика, синтезирующего спирты из продуктов гидролиза целлюлозы (8исШа, 1997). Для разработки эффективной технологии производства биотоплива, существенные усилия должны быть направлены не только на изучение биохимических и генетических возможностей усовершенствования существующих организмов, но и на выделение новых эффективных целлюлолитиков с мощным ферментативным аппаратом.

3.2. Термостабильные ферменты и их преимущества перед мезофильными аналогами

Термофильные микроорганизмы являются продуцентами термозимов -термостабильных ферментов, оптимумы активности которых находятся в области высоких температур ^е1киБ е1 а!., 1998). Термозимы обладают сходными с их мезофильными аналогами механизмами катализа, но имеют ряд особенностей в сравнении с последними: высокая термостабильность, резистентность по отношению к химическим денатурирующим агентам (таким как детергенты, растворители и др.), а также к экстремальным значениям pH (Friedrich & Antranikian, 1996; Egorova & Antranikian, 2005). Было показано, что эндоглюканаза из Rhodothenmis marinus обладает высокой термостабильностыо, сохраняя 50% активности после инкубации при 100°С в течение 3.5 часов и 80% активности после инкубации при 90°С в течение 16 часов (Hreggvidsson et al., 1996). Эндоглюканазы из Р. horikoshii (EGph) и Р. furiosus и вовсе имеют оптимум температуры при 95 и 100 °С, соотвественно (Bauer et al, 1999; Ando et al., 2002). Гипертермофильная эндоглюканаза из Thermotoga maritima (Tma Cel5A) остается стабильной в присутствии ионных жидкостей (Datta et al., 2010). А гликозидгидролаза Се1Аю из галофильной бактерии Cellovibrio japonicus сохраняет 50% и 30% активности в течение 64 дней инкубации в 4 М NaCl и 4 М KCl инкубации, соответственно (Pottkamper et al„ 2009).

При рассмотрении механизмов, обуславливающих стабильность термозимов, следует отметить, что к настоящему времени не обнаружено универсального фактора, ответственного за стабилизацию белков (Egorova & Antranikian, 2005). Напротив, существуют многочисленные механизмы, обуславливающие термостабильность, соотношение которых изменяется от фермента к ферменту (Zeikus et al., 1998). Из них к основным можно отнести следующие: изменения в первичной структуре, ведущие к увеличению эффективности последующей упаковки белка; водородные связи, играющие роль на всех уровнях структуризации, кроме первичного; изменения во вторичной структуре, ведущие к образованию а-спиралей и ß-слоев; гидрофобный эффект, ионные взаимодействия; образование дисульфидных мостиков.

Скорости реакций, осуществляемых ферментами мезофилов и термофилов, сходны в оптимальных для каждой из групп условиях. Несмотря на то, что термозимы не являются более эффективными катализаторами по сравнению с мезофильными аналогами, их использование привлекательно в связи с высокой стабильностью, поскольку протекание биотехнологических процессов при повышенных температурах имеет целый ряд преимуществ: повышение температуры оказывает значительное влияние на растворимость веществ; возрастают коэффициенты диффузии, а значит, снижается вязкость растворов (Bruins et al., 2001; Eichler, 2001); сокращается риск контаминации, и, следовательно, побочных процессов (Egorova & Antranikian, 2005). Также при повышенных температурах возможно существенное увеличение доступности трудно гидролизуемых нерастворимых веществ, благодаря чему будет происходить их более эффективная утилизация (Niehaus et al., 1999).

Принимая во внимание тот факт, что синтезируемые термофилами ферменты - термозимы - имеют ряд прикладных преимуществ, их использование для различных целей выглядит крайне привлекательным. Например, при комнатной температуре процесс получения этанола из возобновляемых ресурсов (в том числе целлюлозы) необходимо проводить в 2 стадии: гидролиз полисахаридного субстрата и ферментация проходят при комнатной температуре, а возгонка этанола при ~78°С (Рабинович, 2006). С помощью термофилов весь процесс можно осуществить в одну стадию: разложение полисахарида до мономеров и их сбраживание происходит при температуре выше 78°С. При этом происходит незамедлительная возгонка этанола, что ко всему прочему снижает его ингибиторный эффект на рост клеток и метаболизм, и следовательно, приводит к его повышенной продукции (Hamilton-Brehm et al., 2010).

Интерес к продукции ценных метаболитов и высокоэнергетических видов биотоплива (спирты и водород) в качестве альтернативы дизеля быстро возрастает. К настоящему моменту уже проведен ряд работ, посвященных проблеме получения биотоплива с использованием термофильных микроорганизмов. Была продемонстрирована принципиальная возможность продукции водорода археями рода Thermococcus (Smith et al., 2001; Kanai et al.,

2005) и бактериями порядка Thermotogales (Nandi & Sengupta, 1998; Bagi et al, 2007; Hong et al., 2007).

Среди других термофилов стоит отметить бактерий родов Caldicellulosiruptor, Thermoanaerobacter и Thermoanaerobacterium типа Firmicutes. Показано, что такие свойства бактерий рода Caldicellulosiruptor как широкая субстратная специфичность, высокий уровень синтеза водорода, а также способность к утилизации и гексоз, и пентоз делают их привлекательными кандидатами для производства водородной энергии (van Niel et al., 2002; Kadar et al., 2003; O-Thong et al., 2008; van de Werken et al., 2008; Vanfossen et al., 2009). Бактерии родов Thermoanaerobacter и Thermoanaerobacterium - хорошо известные продуценты этанола из растворимых Сахаров и некоторых полимеров (ксилан, крахмал) (Lee et al., 1993; Koskinen et al, 2008; Shaw et al., 2009). Например, Thermoanaerobacter ethanolicus штамм JW200 вырабатывает около 5г/л этанола из 20г/л сахарозы, а мутантный штамм 39Е Н8 адаптирован к росту в присутствии 8% этанола, в то время как дикий тип (39Е) был способен выдерживать менее 1.5% процентов (Lee et al, 1993; Koskinen et al, 2008). Более того, использование возможностей современной генетики привело к созданию стабильного генетического мутанта Thermoanaerobacterium saccharolyticiim, способного к использованию смеси Сахаров (глюкоза, ксилоза, манноза, сахароза) с продукцией этанола на уровне близком к теоретическому максимуму (Shaw et al., 2008, 2009). Этот штамм и технические аспекты проведения всего процесса впоследствии были запатентованы биотехнологической компанией Mascoma (Taylor et al., 2009). Однако до настоящего момента целлюлолитические представители перечисленных родов, вырабатывающие существенные количества целевых метаболитов, пока описаны не были.

Огромный интерес к термостабильным ферментам выражается не только в активном описании новых термофильных организмов и быстром развитии технологий, но и в росте продаж на рынке коммерческих ферментов. Последний занят в основном компаниями Novozyme и DuPont, однако, интерес к развитию этих ферментов привел также к формированию крупных коллабораций (Dupont Dan isco ce llulosic et hanol LLC ). В целом, глобальный рынок ферментов в 2007 оценивался в 2.3 млрд долл., с последующим ежегодным приростом на 6%. Таким образом, к 2012 году объем продаж, как предполагают специалисты, составит 2.7 млрд долл. (Thakore, 2008). Приблизительно 50% этого рынка приходится на потребительские и технические ферменты (1.1 и 1.4 млрд долл. в 2007 и 2012 годах, соответственно). Технические ферменты используются преимущественно в качестве детергентов, для выделки кожи, индивидуальной гигиены, целлюлозо-бумажной и текстильной промышленности, в молекулярной биологии, биотрансформации, биосинтезе и производстве топлива (Thakore, 2008). Остальная часть приходится на рынок ферментов пищевой промышленности (830 млн долл. в 2007) и для производства кормовых добавок в сельском хозяйстве (280 млн долл. в 2007). Таким образом, абсолютно очевидно, что в настоящий момент понимание теоретических основ процесса разложения целлюлозы и разработка способов увеличения интенсивности его протекания при высоких температурах не ограничивается только фундаментальными интересами ученых, а имеет большое прикладное значение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Подосокорская, Ольга Андреевна, Москва

1. Бобрикова Д.Р., Ронэ/сина Н.Л., Шабалин К.А., Кулъминская A.A. Субстраты из класса олигосахаридов, модифицированных флуоресцентной группой, для детектирования ферментов целлюлазного комплекса на твердых средах. Заявка на патент РФ: 2008131580/04. 2010.

2. Варфоломеев С. Новые биотоплива: циклические кетали // The Chemical Journal. 2009. 36-39.

3. Гаврипов С.Н., Боич-Осмоловская Е., Слободкин А.И. Физиология органотрофного и литотрофного роста термофильных железовосстанавливающих бактерий Thermoterrabactenum ferrireducens и Thermoanaerobacter siderophilus II Микробиология. 2003. T.72. С.161-167.

4. Жизнь животных: в 6-ти томах. Под редакцией Гладковой H.A., МихеевойA.B. М.: Просвещение, 1970.

5. Mamiamuc Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: методы генетической инженерии. Пер. с англ. М.: Мир, 1984.

6. Марданов A.B., Гумеров В.М., Белецкий A.B., Боич-Осмоловская Е.А., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Характеристика биоразнообразия термофильного микробного сообщества методом параллельного пироееквенирования // Доклады Академии наук. 2010. Т. 432. С. 544-548.

7. Нешатаева В.Ю. Растительность полуострова Камчатки. Под ред. ЯрмишкоB.Т. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2009. 537 с.

8. Рабинович M.JI. Производство этанола из целлюлозосодержащих материалов: потенциал российских разработок // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. С. 5-32.

9. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи в биологической химии. 2000. Т. 40. С. 205-266.

10. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов // М.: Издательство МГУ, 1995. 224 стр.

11. Alfredsson G.A., Kristjansson J.K., Hjorleifsdottir S., Stetter K.O. Rhodothermus marinus gen. nov., a thermophilic, halophilic bacterium from submarine hot springs in Iceland // J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 299-306

12. Alonso A.N., Pomposiello P. J., Leschine S.B. Biofilm formation in the life cycle of the thermophilic actinomycete Thermobifida fusca // Biofilms Journal. 2008. V. 3. P. 1-10.

13. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143-69.

14. Andrews K.T., Patel B.K.C. Fervidobacterium gondwanense sp. nov., a new thermophilic anaerobic bacterium isolated from nonvolcanically heated geothermal waters of the Great Artesian Basin of Australia // Int. J. Syst. Bacterid. 1996. V. 46. P. 265-269.

15. Gorlenko V.M. A new phototrophic green sulfur bacterium, Prosthecochloris aestuarii nov. gen., nov. spec. // Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie. 1970. V. 10. P. 147-149.

16. Guezennec J.G. Influence of cathodic protection of mild steel on the growth of sulphate-reducing bacteria at 35°C in marine sediments // Biofouling. 1991. V. 3. P. 339-348.

17. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids Symp. Ser. 1999. V. 41. P. 9598.

18. Hardman J.K., Stadman T.C. Metabolism of co-amino acids. II. Fermentation of A-aminovaleric acid by Clostridium aminovalericum n. sp. // Journal of Bacteriology. 1960. V. 79. P. 549-552.

19. Harkki A., Mantyla A., Penttila M., Muttilainen S., Buhler R., Suominen P., Knowles J., Nevalainen H. Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulase profiles // Enzyme Microb. Technol. 1991. V. 13. P. 227-233.

20. Hayashi N., Sngiyama J., Okano T., Ishihara M. The enzymatic susceptibility of cellulose microfibrils of the algal-bacterial type and the cotton-ramie type // Carbohydr. Res. 1997. V. 305. P. 261-269.

21. Henrissat B., Davies G. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. V. 7. P. 637-644.

22. Hemsen A. Beiträge zur Morphologie und Systematik der thermophilen Actinomyceten//Archiv fur Mikrobiologie. 1957. V. 26. P. 373-414.

23. Hongpattarakere T. Hyperthermostable cellulolytic and hemicellulolytic enzymes and their biotechnological applications // Songklanakarin J. Sei. Technol. 2002. V. 24. P. 481-491.

24. Hreggvidsson G.O., Kaiste E., Hoist O., Eggertsson G., Palsdottir A., Kristjansson J.K. An Extremely Thermostable Cellulase from the Thermophilic Eubacterium Rhodothermus marinus // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 3047-3049.

25. Hsu J.C., Lakhani N.N. Method of making absorbent tissue from recycled waste paper. US Pat. 6413363. 2002.

26. Huang X.P., Monk C. Purification and characterization of a cellulase (CMCase) from a newly isolated thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans gen. nov., sp. nov. // World J. Microbiol & Biotechn. 2004. V. 20. P. 85-92.

27. Huber R., Langworthy T.A., Konig H., Thomm M., Woese C.R., Sleytr U.B., Stetter K.O. Thermotoga maritima sp. nov. represents a new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up to 90°C // Arch. Microbiol. 1986. V. 144. P. 324-333.

28. Jeanthon C., Reysenbach A.L., L'Haridon S., Gambacorta A., Pace N.R., Glenat P., Prieur D. Thermotoga subterranea sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated from a continental oil reservoir//Arch. Microbiol. 1995. V. 164. P. 91-97.

29. Jeong H., Yi H., Sekiguchi Y., Muramatsu M, Kamagata Y., Chun J. Clostridium jejitense sp. nov., isolated from soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1465-1468.

30. Jiang Z., Dang W., Yan Q., Zhai Q., Li L., Kitsakabe I. Subunit composition of a large xylanolytic complex (xylanosome) from Streptomyces olivaceoviridis E-86 // J. Biotechnol. 2006. V. 126. P. 304- 312.

31. J0rgensen H., Eriksson T., Bipjesson J., Tjerneld F., Olsson L. Purification and characterization of five cellulases and one xylanase from Penicillium rasilianum IBT 20888//Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 32. P. 851-861.

32. Kadar Z., De Vrije T., Budde M.A. IV., Szengyel Z., Reczey K., Claasen P.A.M. Hydrogen production from paper sludge hedrolysate // Appl. Biochem. Biotechnol. 2003. V. 105. P. 557-566.

33. Kanai T., Imanaka H., Nakajima A., Uwamori K., Omori Y, Fukui T., Atomi H., Imanaka T. Continuous hydrogen production by the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus kodakaraensis KOD1 // J. Biotechnol. 2005. V. 116. P. 271-282.

34. Kashefi K. Hyperthermophiles: Metabolic Diversity and Biotechnological Applications. Extremophiles. Microbiology and Biotechnology. Edited by Anitori R.P. Beaverton: Caister Academic Press, 2012. P. 183-233.

35. Kashima Y., Mori K., Fukada H., Ishikawa K. Analysis of the function of a hyperthermophilic endoglucanase from Pyrococcus horikoshii that hydrolyzes crystalline cellulose//Extremophiles. 2005. V. 9. P. 37-43.

36. Kauri T., Kushner D.J. Role of contact in bacterial degradation of cellulose // FEMS Microbiol. Ecol. 1985. V. 31. P. 301-306.

37. Kevbrin V.V., Zavarzin G.A. The effect of sulfur compounds on growth of halophilic homoacetic bacterium Acetohalobium arabaticum II Microbiol (RF) 1992. V. 61. P. 563-567.

38. Komagata K, Suzuki K. Lipid and cell-wall analysis in bacterial systematics // Methods Microbiol. 1987. Y. 19. P. 161-207.

39. Kottwitz B., Schambil F. Cellulase and cellulose containing detergent. US Pat. 20050020472.2005.

40. Kukolya J., Nagy I., Laday M., Töth E., Oravecz O., Märialigeti K, Hornok L. Thermobifida celhdolytica sp. nov., a novel lignocellulose-decomposing actinomycete // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1193-1199.

41. Kyle J.E., Schroeder P., Wiegel J. Microbial silicification in siliceous sinters from two terrestrial hot springs in the Uzon Caldera, Kamchatka, Russia // Geomicrob. Journal. 2007. V. 24. P. 627-641.

42. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assemblage of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

43. Lamed R., Setter E., Bayer E. A. Characterization of a cellulose-binding, cellulase-containing complex in Clostridium thermocellum // J. Bacteriol. 1983. V. 156. P. 828-836.

44. Leschine S.B. Cellulose degradationin anaerobic environments // Annu. Rev. Microbiol. 1995. V. 49. P. 399-426

45. Lewis G.E., Hunt C.W., Sanchez W.K., Treacher R., Pritchard G.T., Feng P. Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on the digestive characteristics of a forage-based diet fed to beef steers //J. Animal. Sci. 1996. V. 74. P. 3020-3028.

46. Linder M., Teeri T.T. The cellulose-binding domain of the major cellobiohydrolase of Trichoderma reesei exhibits true reversibility and a high exchange rate on crystalline cellulose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 12251-12255.

47. Liu ¡V., Zhu W.M. Production and regeneration of Trichosporon cutaneum protoplasts // Process Biochem. 2000. V. 35. P. 659-664.

48. Liu Z., Frigaard N.-U., Vogl K., lino 71, Ohkuma M., Overmann J., Bryant D. Complete genome of Ignavibacterium album, a metabolically versatile, flagellated, facultative anaerobe from the phylum Chlorobi II Front. Microbiol. 2012. V. 3. Article 185.

49. Ljungdahl L.G. The cellulose/hemicellulase system of the of the anaerobic fungus Orpinomyces PC-2 and aspects of its applied use // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. V. 1125. P. 308-321.

50. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorious I.S. Microbial cellulase utilization: Fundamentals and biotechnology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. V. 66. P. 506-577.

51. Lynd L.R., Wyman C.E., Gerngross T.U. Biocommodity engineering // Biotechnol. Prog. 1999. V. 15. P. 777-793.

52. Maheshwari R., Bharadwaj G., Bhat B.K. Thermophilic Fungi: Their Physiology and Enzymes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. P. 461-488 .

53. Mandels M., Parrish F. W., Reese E.T. Sophorose as an inducer of cellulase in Trichoderma reesei //J Bacteriol. 1962. V. 83. P. 400-408.

54. Marchessault R.H., Sundararajan P.R. Cellulose. In The polysaccharides. Edited by Aspinall G.O. New York :Academic Press, Inc., 1993. V. 2. P. 11-95.

55. Marmur J., Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature // J. Mol. Biol. 1962. V. 5. P. 109-118.

56. Martinez D., Berka R.M., Henrissat B., Saloheimo M., Arvas M., Baker S.E. et al. Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei (syn. Hypocreajecorina) //Nat. Biotechnol. 2008. V. 26. P. 553-560.

57. Mechichi T., Labat M., Garcia J.L., Thomas P., Patel B.K.C. Characterization of a new xylanolytic bacterium, Clostridium xylanovorans sp. nov. // Syst. Appl. Microbiol. 1999. V. 22. P. 366-371.

58. Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar//Analyt. Chem. 1959. V. 31. P. 426-428.

59. Miron J., Ben-Ghedalla D., Morrison M. Invited review: adhesion mechanisms of rumen cellulolytic bacteria // J.Dairy Sci. 2001. V. 84. P. 1294-1309.

60. Mitchinson C., Wendt D.J. Variant EGIII-like cellulase compositions. US Pat. 6268328.2001.

61. Mladenovska Z, Mathrani I.M., Ahring B.K. Isolation and characterization of Caldicellulosiruptor lactoaceticus sp. nov., an extremely thermophilic, cellulolytic, anaerobic bacterium //Arch. Microbiol. 1995. V. 163. P. 223-230.

62. Moloney A.P., McCrae S.I., Wood T.M., Coughlan M.P. Isolation and characterization of 1,4-b-D-glucan glucanohydrolases of Talaromyces emersonii. II Biochem. J. 1985. V. 225. P. 365-374.

63. Moré M.I., Herrick J.B., Silva M.C., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment//Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 1572-1580.

64. Murray W.D., Khan A.W., Van Den Berg L. Clostridium saccharolyticum sp. nov., a saccharolytic species from sewage sludge // Int. J. Syst. Bacteriol. 1982. V. 32. P. 132-135.

65. Nadson G.A. The morphology of inferior Algae. III. Chlorobium limicola Nads., the green chlorophyll bearing microbe (in Russian) // Bulletin du Jardin Botanique, St. Petersbourg. 1906. V. 6. P. 190.

66. Nandi R., Sengupta S. Microbial production of hydrogen: an overview // Crit. Rev. Microbiol. 1998. V. 24. P. 61-84.

67. Nguyen T.N., Ejaz A.D., Brancieri M.A., Mikula A.M., Nelson K.E., Gill S.R., Noll KM. Whole-genome expression profiling of Thermotoga marítima in response to growth on sugars in a chemostat // J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 4824-4828.

68. Nicholson M.J., Theodorou M.K, Brookman J.L. Molecular analysis of the anaerobic rumen fungus Orpinomyces insights into an AT-rich genome // Microbiology. 2005. V. 151. P. 121-133.

69. Niehaits F., Bertoldo C., Kahler M., Antranikian G. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. P. 711-729.

70. Nielsen J.B. A process for producing localized variation in the colour density of fabrics. Int. Pat. WO. 94/19528. 1994.

71. Nogawa M, Goto M., Okada H., Morikawa Y L-Sorbose induces cellulase gene trancription in the cellulolytic fungus Trichoderma reesei H Curr. Genet. 2001. V. 38. P. 329-334.

72. Ohtsuki T., Suyanto S., Yazaki S., Ui S., Mimura A. Production of a large multienzyme complex by aerobic thermophilic fungus Chaetomium sp. nov MS-017 from on palm oil mill fibre // Lett. Appl. Microbiol. 2005. V. 40. P. 111-116.

73. Olson L. A., Stanley P.M. Cellulase compositions and methods that introduce variations in color density into cellulosic fabrics, particularly indigo dyed denim. US Pat. 5006126. 1991.

74. Olson L.A. Treatment of denim with cellulase to produce a stone washed appearance. US Pat. 4912056. 1990.

75. Ong L.G., Abd-Aziz S., Noraini S., Karim M.I., Hassan M.A. Enzyme production and profile by Aspergillus niger during solid substrate fermentation using palm kernel cake as substrate // Appl. Biochem. Biotechnol. 2004. V. 118. P. 73-79.

76. O-Thong S., Prasertsan P., Karakashev D., Angelidaki I. Thermophilic fermentative hydrogen p roduction by th e newly is olated T hermoanaerobacterium thermosaccharolyticum PSU-2 // Int. J. Hydr. Energy. 2008. V. 33. P. 1204-1214.

77. Pajunen E. Optimal use of (3-glucanases in wort production. In EBC-Symposium on Wort Production, Monograph XI (Maffliers, France). 1986. P. 13748.

78. Pakula T., Saloheimo M., Uusitalo J., Huuskonen A., Watson A., Jeenes D., Archer D., Penttila M. Method for production of secreted proteins in fungi. US Pat. 20040115790.2004.

79. ParkS., Johnson D.K., Ishizawa C.I., Parilla P.A., Davis M.F. Measuring the crystallinity index of cellulose by solid state 13C nuclear magnetic resonance // Cellulose. 2009. V. 16. P. 641-647.

80. ParkS., Baker J.O., Himmel M.E., Johnson D.K. Cellulose crystallinity index: measurement techniques and their impact on interpreting cellulase performance // Biotechnol. Biofuels. 2010. V. 24. P. 3 10.

81. Pat el B.K.C., Morgan H. W., Daniel R.M. Fervidobacterium nodosum gen. nov. and spec, nov., a new chemoorganotrophic, caldoactive, anaerobic bacterium // Arch. Microbiol. 1985. V. 141. P. 63-69.

82. Patrauchan M.A., Sarkisova S., Sauer K, Franklin M.J. Calcium influences cellular and extracellular product formation during biofilm-associated growth of a marine Pseudoalteromonas sp. // Microbiol (UK). 2005. V. 151. P. 2885-2897

83. Penttila M., Lehtovaara P., Knowles J. Cellulolytic yeasts and their applications. In: Yeast Genetic Engineering. Edited by Barr P.J., Brake A.J., Valenzuela P. Stoneham: Butterworth, MA, 1989. P. 247-267.

84. Pfennig N. Anreicherungskulturen für rote and grüne Schwefelbakkterien // Zentralbl. Bakteriol. I Abt. IS (Suppl. V). 1965. P. 179-185.

85. Pfennig N. Chlorobiam phaeobacteroides nov. spec, und C. phaeovibrioides nov. spec. Zwei neue Arten der grünen Schwefelbakterien II Archiv für Mikrobiologie. 1968. V. 63. P. 224-226.

86. Pizzi A., Eaton N. The structure of cellulose by conformational analysis. 2. The cellulose polymer chain // J. Macromol. Sei. Chem. 1985. V. 22 P. 105-137.

87. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T. V., Kublanov I. V. Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a novel cellulolytic representative of class Anaerolineae //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2012. V. 63. P. 86-92.

88. Pottkamper J., Barthen P., Ilmberger N., Schwaneberg U., Schenk A., Schlüte M., Ignatiev N., Streit W.R. Applying metagenomics for the identification of bacterial cellulases that are stable in ionic liquids // Green Chem. 2009. V. 11. P. 957-965.

89. Prasad D.Y., Heitmann J.A., Joyce T. W. Enzyme de-inking of black and white letterpress printed newsprint waste // Prog. Paper Recycl. 1992. V. l.P. 21-30.

90. Qin C., Zhou B., ZengL., Zhang Z., Liu Y., Du Y., Xiao L. The physicochemical properties and antitumor activity of cellulase-treated chitosan // Food Chem. 2004. V. 84. P. 107-115.

91. Ramirez P., Coha J.M. Enzymatic degradation of cellulose for thermophilic actinomycetes: isolation, characterization and cellulolytic activity determination // Rev. Peru. Biol. 2003. V. 10. P. 67-77.

92. Rao U. S., Murthy S.K. The effects of b-mercaptoethanol and sodium dodecyl sulfate on the Humicola insolens b-glucosidase // Biochem. Int. 1991. V. 23. P. 343348.

93. Rapp P., Beerman A. Bacterial cellulases. In Biosynthesis and biodégradation of cellulose. Edited by Haigier C.H., Weimer P.J. New York: Marcel Dekker, Inc. 1991. p. 535-595.

94. Ravot G., Magot M., Fardeau M.L., Patel B.K., Prensier G., Egan A., Garcia J.L., Ollivier B. Thermotoga elfii sp. nov., a novel thermophilic bacterium from an African oil-producing well // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 308-314.

95. Ravot G., Ollivier B., Patel B.K.C., Magot M., Garcia J.-L. Emended description of Thermosipho africanus as a carbohydratefermenting species using thiosulfate as an electron acceptor// Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 321-323.

96. Reguera G., Leschine S.B. Chitin degradation by cellulolytic anaerobes and facultative aerobes from soils and sediments // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 204. P. 367-374.

97. Reynolds E. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy // J. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208-212.

98. Reysenbach A.-L. Phylum BII. Thermotogae phy. nov. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Edited by Boone D.R., Castenholz R.W. Berlin: SpringerVerlag, 2001. P. 369-387.

99. Rogers G.M., Baecker A.A.W. Clostridium xylanolyticum sp. nov., an anaerobic xylanolytic bacterium from decayed Pinns patula wood chips // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 140-143.

100. Saha B.C. Lignocellulose biodégradation and applications in biotechnology. In Lignocellulose Biodegradation. Edited by Saha B.C., Hayashi K. Washington: American Chemical Society, 2004. P. 2-34.

101. Saiki T., Kobayashi Y., Kawagoe K., Beppu T. Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp. nov., a chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35. P. 253-259.

102. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406-425.

103. Seiko Y., Takai K., Ishida Y., Uchida A., Katayama Y. Rhodothermus obamensis sp. nov., a modern lineage of extremely thermophilic marine bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 1099-1104.

104. Sarikaya A., Ladisch M.R. Solid-state fermentation of lignocellulosic plant residues from Brassica napus by Pleurotus ostreatus II Appl. Biochem. Biotechnol. 1999. V. 82. P. 1-15.

105. Sasser M. Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. MIDI Technical Note 101. Newark, DE: MIDI Inc. 1990.

106. Schofield P., Pitt R.E., Pell A.N. Kinetics of fiber digestion from in vitro gas production // J. Anim. Sei. 1994. V. 72. P. 2980-2991.

107. Schulein M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens // J Biotechnol. 1997. V. 57. P. 71-81

108. Schwarz W.H. The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 56. P. 634-649.

109. Sharyo M, Sakaguchi H., Ohishi M., Takahashi M., Kida K., Tamagawa H., Schulein M., Franks N. Method of making sanitary paper from chemical pulp using a single component cellulase that does not contain cellulose-building domain. US Pat. 6468391.2002.

110. Shaw A. J., Podkaminer K.K., Desai S.G., Bardsiey J.S., Rogers S.R., Thome P.G., Hogsett D.A., Lynd L.R. Metabolic engineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. V. 105. P. 1376913774.

111. She Q., Singh R.K., Confalonieri F.,Zivanovic Y., Allard G., Aw ayez M.J. et al. The complete genome of the crenarchaeon Sidfolobus solfataricus P2 // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. V. 98. P. 7835-7840.

112. Shill K., Padmanabhan S., Xin Q., Prausnitz J.M., Clark D.S., Blanch H.W. Ionic liquid pretreatment of cellulosic biomass: enzymatic hydrolysis and ionic liquid recycle // Biotechnol. Bioeng. 2011. V. 108. P. 511-520.

113. Shipman J.A., Berleman J.E., Salyers A.A. Characterization of four outer membrane proteins involved in binding starch to the cell surface of Bacteroides thetaiotaomicron//. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 5365-5372.

114. Shoseyov O., Shani Z., Levy I. Carbohydrate binding modules: Biochemical properties and novel application // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V. 70. P. 283295.

115. Singh A., Abidi A.B., Aganval A.K., Darmwal N.S. Single cell protein production by Aspergillus niger and its evaluation // Zentbl. Mikrobiol. 1991. V. 146. P. 181-184.

116. Smibert R.M., Krieg N.R. Phenotypic characterization. In Methods for General and Molecular Bacteriology. Edited by Gerhardt P., Murray R. G. E., Wood W. A., Krieg N.R. Washington, DC, 1994. P. 607-651.

117. Smith E.T., Odom L.D., Awramko J.A., Chiong M., Blarney J. Direct electrochemical characterization of hyperthermophilic Thermococcus celer metalloenzymes involved in hydrogen production from pyruvate // J. Biol. Inorg. Chem. 2001. V. 6. P. 227-231.

118. Somerville C. Cellulose synthesis in higher plants // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2006. V. 22. P. 53-78.

119. Stone J.E., Scallan A.M. A structural model for the cell wall of water-swollen wood pulp fibres based on their accessibility to macromolecules // Cellulose Chem. Technol. 1968. V. 3. P. 343-358.

120. Stone J.E., Scallan A.M., Donefer E., Ahlgren E. Digestibility as a simple function of a molecule of similar size to a cellulase enzyme // Adv. Chem. Ser. 1969. V. 95 P. 219-241.

121. Sudha R.K., Swamy M.V., Seenayya G. Increased ethanol production by metabolic modulation of cellulose fermentation in Clostridium thermocellum II Biotech. Lett. 1997. V. 8. P. 819-823.

122. Suen G., Weimer P.J., Stevenson D.M., Aylward F.O., Boyum J. et al. The complete genome sequence of Fibrobacter succinogenes S85 reveals a cellulolytic and metabolic specialist // PLoS One. 2011. V. 6. e 18814.

123. Sukumaran R.K., Singhania R.R., Pandey A. Microbial cellulases. Production, applications and challenges // Journal of Scientific & Industrial Research. 2005. V. 64. P. 832-844.

124. Suresh C., Kitaoka M., Hayashi K. A thermostable nonxylanolytic alpha-glucuronidase of Thermotoga maritima MSB8 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67. P. 2359-2364.

125. Suresh C., Rus'd A.A., Kitaoka M., Hayashi K. Evidence that the putative alpha-glucosidase of Thermotoga maritima MSB8 is a pNP alpha-Dglucuronopyranoside hydrolyzing alphaglucuronidase // FEBS Lett. 2002. V. 517. P. 159-162.

126. Svetlichny V.A., Svetlichnaya T.P. Dictyoglomus turgidus sp. nov., a new extremely thermophilic eubacterium isolated from hot springs of the Uzon volcano caldera // Mikrobiologiya. 1988. V. 57. P. 435-441.

127. Takai K., Horikoshi K. Thermosipho japonicus sp. nov., an extremely thermophilic bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent in Japan // Extremophiles. 2000. V. 4. P. 9-17.

128. Tamura K, Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. // Mol. Biol. Evol. 2007. V. 24. P. 1596-1599.

129. Tamura K, Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molec. Biol. Evol. 1993. V. 10. P. 512-526.

130. Tamura K, Nei M., Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. P. 11030-11035.

131. Tamura K, Peterson D., Peterson N. Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Molec. Biol. Evol. 2011. V. 28. P. 2731-2739.

132. Taylor M.P., Eley K.L., Martin S., Tuffin M.I., Burton S.G., Cowan D.A. Thermophilic ethanologenesis: future prospects for second generation bioethanol production // Trends Biotechnol. 2009. V. 27. P. 398-405.

133. Te'o VS., Saul D.J., Bergquist P.L. CelA, another gene coding for a multidomain cellulase from the extreme thermophile Caldocellum saccharolyticum // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 43. P. 291-296.

134. Tengerdy R.P., Rho W.H., Mohagheghi A.M. Liquid fluidizedbed starter culture of Trichoderma reesei for cellulase production // Appl. Biochem. Biotechnol. 1991. V. 27. P. 195-204.

135. Thakore Y. (2008). Enzymes for industrial applications BI0030E. Available at: http://www.bccresearch.com/report/BI0030E.html (accessed 3 May 2010).

136. Thomson J.A. Molecular biology of xylan degradation // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 104. P. 65-82.

137. Thygesen A., Oddershede J., Lilholt H., Thomsen A.B., Stahl K. On the determination of crystallinity and cellulose content in plant fibres // Cellulose. 2005. V. 12. P. 563-576.

138. Tindall B. J. Lipid composition of Halobacterium lacusprofundi II FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 66. P. 199-202.

139. Tomme P., Warren R.A.J., GilkesN.R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi // Adv. Microbial Physiol. 1995. Vol. 37. P. 1—81.

140. Truper H.G., Schlegel H.G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae. I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii // Antonie van Leeuwenhoek. 1964. V. 30. P. 225-228.

141. Tsai G.J., Wu Z.Y., Su W.H. Antibacterial activity of a chitooligosaccharide mixture prepared by cellulase digestion of shrimp chitosan and its application to milk preservation // J. Food Prot. 2000. V. 63. P. 747-752.

142. Tsai Y.L, Olson B.H. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments//Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 1070-1074.

143. Tsao G.T, Xia L., Cao N., Gong C.S., Solid-state fermentation with Aspergillus niger for cellobiase production // Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. V. 84-86. P. 743749.

144. Tiigel J.B., Hines M.E., Jones G.E. Microbial Iron Reduction by Enrichment Cultures Isolated from Estuarine Sedimentst // Appl. Environ. Microbiol. 1986. V. 52. P.l 167-1172.

145. Uhlig H. Industrial Enzymes and their Applications. New York: John Wiley & Sons, Inc, 1998.435 p.

146. Vaheri M., Leisola M, Kaupinnen M. Transglycosylation products of cellulase system of Trichoderma reesei //Biotechnol. Lett. 1979. V.l. P. 41-46.

147. Van Ooteghem S.A., Beer S.K., Yue P.C. Hydrogen production by the thermophilic bacterium Thermotoga neapolitana II Appl. Biochem. Biotechnol. 2002. V. 98. P. 177-189.

148. Van Ooteghem S.A., Jones A., Van Der Lelie D., Dong B., Mahajan D. H(2) production and carbon utilization by Thermotoga neapolitana under anaerobic and microaerobic growth conditions // Biotechnol. Lett. 2004. V. 26. V. 1223-1232.

149. Van Tilbeurgh M., Claeyssens M., De Bruyne C.K. The use of 4-melhylumbelliferyl and other chromophoric glycosides in the study of cellulolytic enzymes//FEBS Lett. 1982. V. 149. P. 152-156.

150. VanFossen A.L., Lewis D.L., Nichols J.D., Kelly R.M. Polysaccharide degradation and synthesis by extremely thermophilic anaerobes// Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1125. P. 322-337.

151. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y. Modified spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms I IJ Lipid Research. 1968. V. 9. P. 396.

152. Widdel F., Bak F. Gram-negative mesophilic sulfate reducing bacteria. In The Prokaryotes. Edited by Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.H. New York: Springer-Verlag, 1992. V. 4. P. 3352-3378.

153. Wilson D.B. Cellulases and biofuels // Curr. Opin. Biotechnol. 2009. V. 20. P. 295-299.

154. Wilson D.B. Evidence for a novel mechanism of microbial cellulose degradation // Cellulose. 2009. V. 16. P. 723-727.

155. Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. Formation of methane by bacterial extracts //J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 2882-2886.

156. Wood P.J., Erfle J.D., Teather R.M. Use of complex formation between Congo Red and polysaccharides in detection and assay of polysaccharide hydrolases // Methods Enzymol. 1988. V. 160. P. 59-74.

157. Wu G.J., Tsai G.J. Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water-soluble hydrolysate with immunoactivity // Fisheries Sci. 2004. V. 70. P. 1113.

158. Xia L., Cen P. Cellulase production by solid state fermentation on lignocellulosic waste from the xylose industry // Process Biochem. 1999. V. 34. P. 909-912.

159. Xu Q., Bayer E.A., Goldman M., Kenig R., Sholam Y., Lamed R. Architecture of the Bacteroides cellulosolvens cellulosome: Description of a cell surface-anchoring scaffoldin and a family 48 cellulase // J.Bacteriol. 2004. V. 186. P. 968977.

160. Yamada Y., Yukphan P., Vu H.T.L., Muramatsu Y., Ochaikul D., Tanasupawat S., Nakagawa Y. Description of Komagataeibacter gen. nov., with proposals of new combinations (Acetobacteraceae) 11 J. Gen. Appl. Microbiol. 2012, V. 58. P. 397-404.

161. Yang J.L., Ma J., Pierce J.M., Eriksson K.E.L. Composition for enzymatic deinking of waste paper. US Pat. 6767728. 2004.

162. Yang S.J., Kataeva I., Wiegel J., Yin Y, Dam P., Xu Y, Westpheling J., Adams M.W.W. Classification of 'Anaerocellum thermophilum' strain DSM 6725 as Caldicellulosiruptor bescii sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. P. 2011-2015.

163. Zeikus J.G., Vieille C., Savchenko A. Thermozymes: biotechnology and structure-function relationships //Extremophiles. 1998. V. 2. P. 179-183.

164. Zhang Y.H., Lynd L.R. Cellulose utilization by Clostridium thermocellum: bioenergetics and hydrolysis product assimilation // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. V. 102. P. 7321-7325.

165. Zverlov V.V., Volkov I. Y., Velikodvorskaya T.V., Schwarz W.H. Thermotoga neapolitana bglB gene, upstream of lamA, encodes a highly thermostable beta-glucosidase that is a laminaribiase // Microbiol. (UK) 1997b. V. 143. P. 3537-3542.

Информация о работе

Подосокорская, Ольга Андреевна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Подосокорская, Ольга Андреевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы"

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Подосокорская, Ольга Андреевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология