Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Целлюлазы термофильных анаэробных бактерий (биосинтез, выделение, свойства)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Целлюлазы термофильных анаэробных бактерий (биосинтез, выделение, свойства)"

я г д. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ' 6 (^РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ? $ и, - ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

Московская Государственная Академия пищевых производств

На правах рукописи

СТОЛБОВА ВАЛЕРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

УДК 677.152 321

ЦЕ ЛЛЮЛ А?Ы ТЕРМОФИЛЬНЫХ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ (БИОСИНТЕЗ, ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА)

Специальность 03.00 04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена во Всероссийском- научно-исследовательском институте пищевой .биотехнологии РАСХН и в Институте биохимии им А Н. Баха РАН.

-Научные руководители^-доктор' бкслсги\-сс1.;их наук..

профессор А С. Тихомирова — кандидат химических наук д ф. Тихомиров

Офйциальные оппоненты—доктор' технических наук,

профессор Гернет М. В —кандидат биологических наук,

Хоррычев М. П.

Ведущая организация —А О. Биотехнология

Защита состоится „А." 1994т. часов

на ' заседании ^Опециализировзннйго" "Ученого Совета К 063. 51. .06 ...Московской; государственной;:"академии пищевых производств (МГАПГ1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке М'АПП . ■

Отзьвы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим паправлять по адресу: 126080, Москва, Волоколамское шоссе, д 11. МГАПП, на имя ученого секретаря Специализированного Совета К 063 51. С6

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета К 063. .51. Сб., к. б н.

Т. Г. Генераловг

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проведение технологических процессов гидролиза целлюлозосодержащего растительного сырья в условиях повышенных температур (до 80-90°С)' имеет ряд несомненных преимуществ. При этом значительно снижается опасность инфицирования, увеличивается скорость и сокращается продолжительность гидролиза. улучшаются гидродинамические характеристики, становится возможным, комбинирование ферментативного гидролиза с тепловой обработкой сырья. Но используемые целлюлазы микромицетов не имеют необходимой устойчивости к повышению температуры. Наиболее перспективным является создание термостабильных ферментных препаратов, продуцируемых термофильными и экстремально термофильными. бактериями, целлюлазы которых возможно будут способны стабильно функционировать при температуре пастеризации (65°С) и выше (до 80-90°С).

Значительный интерес в этом отношении вызывает термофильная анаэробная бактерия Clostridium thermocellum и новая не изученная экстремально термофильная бактерия Anaerocellum thermoplülum gen.nov., sp.nov.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.' Целью работы являлось изучение свойств целлю-лозолитических ферментов термофильной анаэробной бактерии Clostridium thermocellum отечественного штамма 3, новой экстремально термофильной анаэробной бактерии Anaerocellum thermophilum штамм Z 1320 и оценка возможностей полученных на их основе термостабильных ферментных препаратов при высокотемпературной конверсии целлюлозы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Изучить закономерности биосинтеза и оптимизировать условия роста данных штаммов с целью увеличения выхода целлюлаз. 2. Оценить методы выделения препаратов целлюлаз , получить препараты, выделить гомогенный фермент. 3. Изучить молекулярные характеристики целлюлаз (удельную активность, термостабильность, адсорбционную способность. устойчивость к ингибированию продуктами реакции) и на этой основе выбрать перспективный продуцент. 4. Определить возможность высокотемпературной биоконверсии целлюлозы полученными препаратами целлюлаз.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучены основные закономерности биосинтеза целлюлаз новой анаэробной бактерией Anaerocellum tfaermophilum, выделен ферментный препарат и охарактеризованы би-

охимические свойства целлюлазного комплекса, существенные для биотехнологии. Показано, что эндоглюканаза препарата характеризуется высокой термостабильностью: период полуинактивации при 85° С равен 150 мин. Комплекс целлюлаз, гидролизующих фильтровальную бумагу, превышает по термостабильности эндоглюканазу (период полуинактивации при 85еС равен 250 мин).Впервые исследован высокотемпературный (75-80°) гидролиз целлюлозы препаратом целлюлаз А. thermophilum.

Показано, что эндоглюканазы отечественного штамма 3 Clostridium thermocellum входят б состав высокомолекулярных агрегатов - "целлюлосом". Предложена схема фракционирования эндоглю • каназ из "целлюлосом". Очищены до гомогенного состояния и охарактеризованы свойства индивидуальных эндоглюканаз, первоначально входящих в состав "целлюлосом". Обнаружено, что надмолекулярная организация целлюлазного комплекса С. thermocellum в виде "целлюлосом" обеспечивает эффективную сорбцию ферментов на кристаллическом субстрате.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Высокая термостабильность ферментов Anaerocellum thermophilum позволяет проводить гидролиз целлюлозы при 75°С на 60-70% за 24 ч при внесении 1 ед/г субстрата или на 100% за 6 ч при внесении 170 ед/г субстрата. Особенно важно, что основным продуктом гидролиза является глюкоза (70-90 молярных %). Препараты целлюлаз A.thermophilum в перспективе могут быть эффективно использованы в различных биотехноло-тиче§ких процессах гидролиза целлюлозосодержащего сырья до глюкозы в условиях повышенных температур (75-80°), особенно - после увеличения биосинтеза путем проведения генно-инженерных работ на основе ее генома.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты были представлены на Конференции молодых ученых (Пущино, 1988 ), на IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), на Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989), на 3 Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки" (Казань, 1990), на 7 Всесозном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991), на Конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), на заседаниях Ученого совета ВНИИ пищевой биотехнологии РАСХН и коллоквиумах в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 стат

и 12 тезисов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов. Основной текст диссертации изложен на 142 страницах, содержит 32 рисунка, 6 таблиц и 1 схему. В библиографии приводится 209 наименований. В приложении представлены 6 таблиц и 6 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

В обзоре литературы описаны новые виды термофильных и экстремально термофильных анаэробных бактерий, охарактеризованы известные особенности их роста, рассмотрена регуляция биосинтеза целлюлаз у изученных термофильных бактерий. Проанализированы пути увеличения продуктивности бактериальных продуцентов. Приведены сведения о компонентном составе целлюлазных комплексов термофильных бактерий и охарактеризованы индивидуальные ферменты: эндоглюканаза, целлобиогидролаза, экзоглюкозидаза и целлобиаза. Изложены современные представления о механизме гидролиза высоко-упорядоченных форм целлюлозы, прослежена взаимосвязь между особенностями бактериальной деградации целлюлозы и надмолекулярной организацией их целлюлазного комплекса. Обоснована необходимость изучения надмолекулярной организации целлюлазного комплекса бактериальных продуцентов и определения адсорбционных характеристик ферментов для оценки их гидролитического потенциала. Освещены термодинамические основы стабильности белковых молекул и биохимические особенности строения ферментов из термофильных микроорганизмов. Представлены сравнительные данные о термостабильности целлюлаз из различных микроорганизмов. Обзор подтверждает целесообразность стратегии поиска продуцентов термостабильных целлюлаз для биотехнологии среди термофильных и экстремально термофильных бактерий.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Объектами исследования служили чистые культуры: анаэробной термофильной целлюлолитической бактерии Clostridium thermocellum штамм 3 и новой экстремально термофильной анаэробной бактерии Anaerocellum thermophilum gen.nov., sp.nov. штамм Z 1320, выделенные в Институте микробиологии РАН.

В качестве субстратов для определения активности целлюлаз использовали: натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) средней вязкости фирмы "Serva" ; субстрат ОЦ-41 - растворимую окрашенную КМ-целлюлозу Вильнюсского НПО "Фермент"; микрокристалли-

ческую целлюлозу (МКЦ) LT и LC ("Chemapol"); фильтровальную] бумагу Ватман N 1 ("Whatman") ; D-целлобиозу ("Fluka"). !

В качестве носителей для очистки ферментов использовали: Акрилекс Р 6 ("Reanal"); ДЭАЭ-сефарозу CL-6B, сефарозу CL-4B, сефакрил S-300 ("Pharmacia"), реактивы для электрофореза в наборе фирмы "Reanal" .

Активность эндоглюканаз определяли тремя способами: виско-зиметрически; по осахариванию КМ-целлюлозы /Клесов и др., 1980/; колориметрически экспресс-методом с субстратом ОЦ-41 (растворимой окрашенной КМ-целлюлозой) /Рабинович и др., 1985/. Общук целлюлазную активность определяли по методике Мандельс-Веберг /Mándeles et al., 1974/ с использованием динитросалициловой кислоты для регистрации ВС, образующихся из фильтровальной бумага (ФБ) Ватман N 1, и выражали в ME. Определение целлобиазной активности проводили согласно методике Клесова с соавторам! (1980).

Культивирование С. thermocellum проводили при 60°С на сред? GS /Garcia-Martinez et al., 1980/, содержащей (в г /л): K¿HP0**í Н20 - 2,9; КНгР0„- 1,5; MgClz* 6HZ0 - 1,0; CaCl¿* 2 H¿0 - 0,15; Fe S04*6H¿0 - 0,00125;мочевину - 2, 0;цистеина гидрохлорида - 1,( дрожжевого экстракта - 6,0; резазурина - 0,002; 20 тМ Na-K-фос-фатный буфер рН 7,7. В качестве источника углерода использовал! микрокристаллическую целлюлозу LC - 10; или целлобиозу - 5,0. А. thergraphilum первоначально культивировали при 75° С на сред( "ПфенЙйга /Светличный и др., 1990/.

Получение препаратов целлюлаз проводили в соответствии i рекомендациями Кочетова (1980). Ультрафильтрация бесклеточной К: С. thermocellum велась через полисульфоновую мембрану("DDS", Да ния) с пределом исключения 200 kDa на модуле Mini-Lab по цикли ческой схеме со скоростью протока 6 л/мин и давлении до 6 ат при 4еС. Гель-фильтрация бесклеточной КЖ A. thermophilum и С thermocellum проводилась через Акрилекс Р-6.

Очистка гомогенных эндоглюканаз С. thermocellum включала ультрафильтрацию КЖ на модуле Mini-Lab 10 с мембранами GR 10 Р ("DDS", Дания; предел исключения для глобулярных белков -500 ООО Да, поры - 150-200 А),ионнообменную хроматографию на Д5 -сефарозе, гель-фильтрацию через сефарозу CL-4B и сефакрил S-3C высокоэффективное хроматофокусирование на колонке Mono Р.

Молекулярную массу эндоглюканаз определяли электрофорезом 7,5 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Изоэлектрические точ?

белков (pi) устанавливали с помощью горизонтального аналитического фокусирования в ПААГ-пластинках ("LKB", Швеция) с диапазоном рН 3,5-9,5.

Коэффициент распределения целлюлаз при адсорбции на поверхности целлюлозы (количественно характеризующий сродство фермента к нерастворимому субстрату) определяли, варьируя концентрацию адсорбента при постоянной концентрации фермента / Рабинович и др., 1981; Клесов и др.,1982/.

Изучение влияния целлобиозы на гидролиз субстрата ОЦ-41 эн-доглюканазами С. thermocellum и A. thermophilic вели, варьируя концентрацию субстрата от 0,4 до 10 г/л в присутствии целлобиозы ( 0; 0,01; 0,05; 0,08; 0,1 М) /Нуцубидзе и др., 1985/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ БИОСИНТЕЗА.

Бактериальные продуценты, особенно впервые изучаемая экстремально термофильная бактерия Anaerocellum thermophllum. характеризовались низким уровнем биосинтеза целлюлаз, что существенно затрудняло определение свойств ферментов. Поэтому на первом этапе исследований необходимо было оптимизировать условия культивирования для увеличения выхода целлюлаз. В качестве критерия нами была выбрана эндоглюканазная активность (по субстрату ОЦ-41).

1. Культивирование Clostridium thermocellum на

микрокристаллической целлюлозе и целлобиозе.

При изучении условий культивирования отечественного штамма 3 Clostridium thermocellum использовали 0,5 % целлобиозы и 1 % микрокристаллической целлюлозы (МКЦ). На среде с целлобиозой (рис.1) активность эндоглюканаз в культуральной жидкости (КЖ) обнаруживается уже в первые часы роста и к 100 ч достигает 0,3 ед/мл. Нарастание биомассы клеток коррелирует с увеличением активности. Принципиально иная картина наблюдается при выращивании культуры на МКЦ (рис.2). До 20 ч эндоглюканазная активность в КЖ не обнаруживается, а к 110 часу достигает 0,8 ед/мл ( 98% от синтезированного фермента).

Итак, при культивировании С. thermocellum на кристаллическом субстрате ( МКЦ ) получена активность эндоглюканаз в 2,6 ра-

ед/мл

Рис.1.Динамика биосинтеза эндоглюканаз Clostridium thermocellum при 60°С на 0,5 % целло-биозе: 1 - вискозиметри-ческая активность эндог-люканазы, измеренная при 60е С; 2 - оптическая плотность среди г.рн 600 нм; 3 - измерение рН среды.

о.з

о.г

од

Рис.2. Динамика биосинтеза эндоглюканаз Clostridium thermocellum при 60е С на 1% МКЦ:1 -■висфзиметрическая активность • эндоглюканазы, измеренная при 60еС; 2 - то же при 40°С; 3 измерение рН среды.

та час

о 20 40 60 80

за превышающая активность на растворимом легкометаболизируемо источнике углерода - целдобиозе.

2. Оптимизация биосинтеза эндоглкжаназ

Anaerocellum thermophilum.

На среде Пфеннига с 0,1-1 % МКЦ в качестве источника углерода активность эндоглюканазы по окрашенному субстрату (ОЦ-41) составляла через 90 ч 0,011-0.018 ед/мл. Накопление в КЖ эндог-люканазной активности значительно снижается при переходе от нерастворимых целлюлозных субстратов (МКЦ или фильтровальной бумаги) к растворимым легкоусвояемым источникам углерода: целлобиозе, глюкозо-6-фосфату или глюкозе. Наличие эндоглкжаназ при росте на растворимых углеводах, в том числе - на неспецифических, не являющихся субстратами эндоглюканазы, свидетельствует в пользу конститутивного характера биосинтеза.

В результате определения оптимальных условий биосинтеза (температура 68-75°, начальная величина рН 7,5) и подбора состава среды для A. thermophilum ( источников углерода, азота, фосфора, стимулирующих добавок , восстанавливающих агентов) получили среду, при культивировании на которой активность эндоглкжаназ достигала за 96 ч 0,33 ед/мл .

Дальнейшая оптимизация соотношения компонентов среды велась с использованием математического планирования эксперимента методом крутого восхождения. Для определения коэффициентов регрессии была поставлена серия опытов в соответствии с выбранной матрицей планирования ПФЭ 23. Варьировали концентрации трех изучаемых факторов: xt- МКЦ. ха- (NH^HPOi,, Xj- дрожжевого экстракта. Соответствующее уравнение регрессии имело вид:

Y=0,39 - 0,065*Xt+ О, 025*Х2+ 0,02*Xj- 0.015*Х1*Х3- 0,035*Х/Х^ использовалось для расчета программы движения к оптимуму но методу крутого восхождения. В итоге была получена среда следующего состава (в г/л): МКЦ -2.2; (Щц)гНР0ч- 1.3; дрожжевой экстракт-0,5; Mg Clj* 2HjO- 0,33; CaCLj * 6Н40 - 0.33; KC1 - 0.33; HaHCOj-1,5; Na2S * 9Нг0- 0,8. Раствор микроэлементов аналогичен исходному в среде Пфеннига ( в мг/л): Трилон Б - 0,1; FeSO, *7 Н20 -- 0,4; ZnSO«* 7 Нг0 - 0,02; МпС1г*4Нг0 - 0,006; НгВ03 - 0.06; СоС12* 6Нг0 - 0.04; СиС1г* 2Нг0 - 0.002; МС1г* 6Нг0 - 0,004; ИагМо0ч- 0,006; дрожжевой экстракт - 250; биотин - 0,02; фолие-вая кислота - 0,02; гидрохлорид пиридоксина - 0,1; рибофлавин -0,05; тиамин - 0,05; никотиновая кислота - 0,05; витамин В<г -0,001; п-аминобензойная кислота - 0.05; тиоктовая кислота -0,05; резазурин -2.0 /Светличный и др ., 1990/.

На оптимизированной среде при культивировании А. №егтор1Шит выход эндоглюканаз через 90 ч достигает 0,56 ед/мл (по субстрату ОЦ-41) и превышает уровень активности на исходной среде Пфеннига в среднем в 40 раз. Максимальная активность фильтрата КЖ после 140 ч роста составляла: по вискозиметрии 0,82 ед/ мл (1,28 ед/мг белка), по гидролизу фильтровальной бумаги -0,022 ед/ мл (0,034 ед/мг белка). Концентрация белка в фильтрате КЖ достигала 0,64 мг/мл.

II. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ И ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ТЕРМОФИЛЬНЫХ АНАЭРОБОВ.

При получении препаратов целлюлазного комплекса из культу-ральной жидкости А. №егторМ1ит штамм Ъ 1320 использовали осаждение белков сульфатом аммония или этанолом и гель-фильтрацию. Полученные после гель-фильтрации образцы лиофильно высушивали. Наибольший выход целлюлаз с максимальной очисткой от балластных белков достигался при использовании метода гель-фильтрации через Акрилекс Р 6 со сбором высокомолекулярной фракции. Удельная активность полученных препаратов достигает 5 ед/мг белка (по вискозиметрии) и 0,2 ед/мг белка (по осахарива-нию фильтровальной бумаги, ФБ ). При последующей лиофилизации препаратов выход вискозиметрической активности достигает 53,7%, а осахаривающей ФБ - 20,3% для фракции 1; и 100% и 40% - для соответствующих активностей фракции 2. Этот метод использован при получении препарата целлюлазного комплекса А. №егторЫ1ит для характеристики основных молекулярных свойств целлюлаз.

При выделении препаратов целлюлазы из КЖ С. ШегтосеПит наиболее простым и эффективным методом было высаливание сульфатом аммония (50% от насыщения). Получен препарат целлюлазы с удельной активностью 0,069 ед/мг белка по вискозиметрии (выход 55.3 %, степень очистки 4,6) и 0.0085 ед/мг белка по гидролизу ФЕ (выход 28,7%. степень очистки 2,4).

При осаждении этанолом достигается, более высокая степет очистки эндоглюканаз (6,8) по сравнению с лучшим результатом высаливания и удельная активность получаемого препарата составляет 0,103 ед/мг. Однако происходит значительная потеря фермента I выход достигает только 39% для активности по вискозиметрии (эн-доглюканазная) и 16% для активности по осахариванию ФБ. Кроме того, препараты, полученные этим методом, хуже хранятся . Е

дальнейшей работе для характеристики молекулярных свойств целлю-лаз С. thermocellum препарат получали осаждением сульфатом аммония.

Фракционирование целлюлосом С. thermocellum и очистка индивидуальных эндоглюканаз. В отличие от ферментов грибных продуцентов, являющихся индивидуальными белками, целлюлазный комплекс клостридии имеет сложную надмолекулярную организацию. Компоненты целлюлазного комплекса С. thermocellum ассоциированы в крупные агрегаты - "целлюлосомы" с молекулярной массой 5 и 100 млн.Da. Основной ферментный комплекс бактерии характеризуется средним диаметром агрегатов 180 А.

Поскольку нам необходимо было оценить перспективы применения целлюлаз отечественного штамма 3 С. thermocellum для высокотемпературной конверсии целлюлозы, представлялось интересным выяснить: является ли "целлюлосома" специфическим образованием, чья надмолекулярная структура необходима для гидролиза высокоу-порядоченного субстрата, или для этого достаточно ограниченного ряда составляющих ее белков. Поэтому разработана методика фракционирования эндоглюканаз С. thermocellum, первоначально входящих в состав "целлюлосом" (схема 1).

Схема I

СХЕМА ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ КЛОСТРИДИАЛЬШХ ЭНДОГЛЮКАНАЗ

Фильтрат КК

Ультрафильтрация

Фракция <500 ООО Фракция >500 ООО

1 < ИОХ на ДЭАЭ-Сефарозе

Гель-фильтрация через Сефарозу CL-4B

Фракция 2 млн. Фракция 210 ООО Фракция 45 ООО

Хроматофокуси-рованиэ на Mono Р Гель-фильтрация через Сесбакрил S-300 Гель-фильтрация через Сефакрил S-300

Хроматофокусиро* вание на Mono Р 'Хроматофокус иро-вание на Mono Р

Эндоглвканаза I — ■ - - ■ Эндоглвканаза П

Первоначально фильтрат был сконцентрирован в 4,4 раза ультрафильтрацией на полисульфоновых мембранах с пределом исключения 0,5 млн.Da ( 150 А ). Мембраной было задержано 42% общей эндоглюканазной активности. Это указывает на то, что в исходной КЖ значительная часть ферментов содержится в виде высокомолекулярных агрегатов диаметром более 150 А - "целлюлосом".

Полученная после ультрафильтрации высокомолекулярная фракци. эндоглюканаз была очищена анионообменной хроматографией на ДЭ-ЛЭ-сефарозе С1.-6В . при этом эндоглюканазная активность была ассоциирована практически со всеми белками (рис. 3).

Рис.3. Ионнообменная хроматография на ДЭАЭ-се-фарозе СЬ-6В сконцентрированной ультрафильтрацией высокомолекулярной фракции эндоглюканаз С. №егтосе11ит. Колонка Зх *12 см, уравновешенная 0,025 М натрий-ацетатным буфером рН 6,2. Элюция линейным градиентом ИаС1 0-0,6 М со скоростью 40 мл/час. Исходный образец - 6§р мл, фракции по 16 мл. 1 - содержание белка (мг/мл); 2 - активность эндоглюканазы по субстрату ОЦ-41 при 60°С (А эн-до).

500

1000

1500

^000

2500

Для изучения молекулярно-массового распределения агрегатов, содержащих эндоглюканазу, Фракция, полученная на стадии ионообменной хроматографии препарата (первый пик градиента, 20% от общего количества), была нанесена для гель-фильтрации на колонку с сефарозой CL-4B. Полученный профиль элюции (рис. 4) свидетельствует о присутствии в препарате агрегатов эндоглюканазы с молекулярной массой 2-4 млн. Da (фракция 1), 200-300 тыс. Da (Фракция 11) и 20-100 тыс. Da(фракция 111) в примерно равном соотношении. При этом агрегаты с большей молекулярной массой (фракция 1) ха-

рактеризуются более высокой удельной активностью в расчете на 1 мг белка. Таким образом, уже двухстадийная очистка приводит к значительному распаду агрегатов эндоглюканазы с первоначальной молекулярной массой свыше 0.5 млн.Da, полученных после ультрафильтрации.

Рис. 4. Гель-фильтрация через сефарозу а280 CL-4B (диапазон фракци- 12 г онирования 30-8000 кДа) фракции А эндоглюканазы С. thermocellum, полученной хроматографией на ДЭ- 0i8 г АЭ-сефарозе: 1 - поглощение при 280 нм (A.J; 2 -активность эндоглюканазы по субстрату 0Ц-41 при 60* 0>4 . С (А эндо). Колонка 4*100 см, уравновешенная 25 мМ буфером имидазол-HCl рН 6,5 (+2 мМ дитиотреитола 0 + 2 мМ ЭДТА). Элюция со о скоростью 30 мл/час, > фракции по 10 мл.

Для сравнительного изучения агрегатов с различной молекулярной массой фракции, соответствующие молекулярной массе 200 и 50 kDa (фракции 11 и 111, рис. 4), были использованы при дальнейшей очистке эндоглюканаз. Для каждой из фракций была проведена гель-фильтрация через сефакрил S-300. В обоих случаях эндог-люканазная активность элюировалась в виде одного основного пика.

Полученные таким образом эндоглюканазы 1 и 11 были очищены высокоэффективным хроматофокусированием (ионообменная хроматография при низкой ионной силе с элюцией нисходящим градиентом рН) на колонке Mono Р в диапазоне рН 7,2-4,0. При этом две Формы фермента обнаруживали резкое различие в хроматографпческом поведении. Если эндоглюканаза 1 при рН 7.2 прочно связывается с адсорбентом и элюируется только при снижении рН до 4,0 , то эндоглюканаза 11 в стартовых условиях элюируется с колонки без

0,25

0,20

- 0,15

- 0,10

0,05

200 400 600 С 00 1000

задержки. Это указывает на низкий заряд молекулы последнего бел ка.

Итак, в ходе фракционирования даже, при использовании мяги методов высокомолекулярные агрегаты, содержащие эндоглюканаз постепенно деградируют. Нестабильность "целлюлосом" необходи учитывать при исследовании механизма деградации целлюлозы во и бежание артефактов. Необходимо заметить также, что"целлюлосомы" thermocellum штамма 3, содержащие эндоглюканазы, характеризуют значительной гетерогенностью по заряду и по размеру. Обнаруженн гетерогенность высокомолекулярных агрегатов позволяет сдела предположение о неспецифическом характере их образования.

III. СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛАЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ АНАЭРОБОВ.

В процессе ультрафильтрации культуральной жидкост Clostridium thermocellum штамма 3 установлено, что около половины эндоглюканаз заключена в высокомолекулярные агрегаты - "цел-люлосомы", которые, деградируя в ходе очистки, высвобождают индивидуальные эндоглюканазы I и II. Поэтому необходимо былс сравнить свойства гомогенных индивидуальных эндоглюканаз I и II, первоначально входящих в состав "целлюлосом" и свойства эндоглюканазы неочищенного препарата культуральной жидкости, существующей в составе "целлюлосом".

г. 3. 1. Характеристика эндоглюканазы неочищенного препарата культуральной жидкости Clostridium thermocellum.

Удельная активность. Препарат целлюлазы С. thermocellui штамм N 3 был выделен осаждением сульфатом аммония из фильтрат; КЖ, полученной при культивировании продуцента на 1%-ной МКЦ П] 60° в течение 144 ч ( начало стационарной фазы роста) и обессол! на колонке с Акрилексом Р 6. Удельная активность препара' составляет (при 60°С): по образованию восстанавливающих Сахаров растворимой КМ-целлюлозы - 1,24 ед/мг белка: из ФБ - 0,024 ед/i белка (содержание белка - 5,87 мг/мл).

Ингибирование продуктами реакции. Мы использовали субстр; 0Ц-41 для определения одной из важных характеристик эндоглюканг зы: устойчивости к ингибированию целлобиозой (рис.5 а,б). Целл< биоза является основным продуктом гидролиза целлюлозы клострии альными эндоглюканазами. Ингибирование эндоглюканазы неочищенно:

препарата Clostridium thermocellum целлобиозой происходит по неконкурентному типу и характеризуется константой ингибирования К1 110 мМ (рис.5 а).

Термостабильность. Для полученного из культуральной жидкости препарата целлюлаз была изучена динамика термоинактивации эндог-люканазы. Как видно из кривых термоинактивации (рис. 6), при 85°С эндоглюканазная активность вначале быстро уменьшается с периодом

Рис.5. Ингибирование эндоглюканазы препарата культуральной жидкости С. №егтосе11ит (а) и А. №егторШит (б) различными концентрациями целлобиозы: 1 - без ингибитора; 2 - 0,01 М; 3 -0,05 М; 4 - 0,1 М; 5 - 0,08 М.

полуинактивации около 1 мин. При прохождении термоинактивации глубже, чем на 85% , на графике в полулогарифмических координатах наблюдается излом. Такое "поведение" эндоглюканазы может объясняться существованием в КЖ двух форм эндоглюканазы. различающихся по термостабильности. Излом на графике соответствует полной инактивации основной формы эндоглюканазы ( 85% активности ) и медленной термоинактивации минорной высокотермостабильной формы фермента (15% активности). Период полуинактивации для этой второй фазы -доставляет 10 мин. Детергент твин-80 оказывает на эндоглюканазы

1Г.

некоторое стабилизирующее действие.

Рис.6. Термоинактивация эндоглюканазы осажденного сульфатом аммония и обессоленного препарата культуральной жидкости С. ШегптосеИит при 85° С и рН 6,2 в присутствии детергента Твин-80: 1 - без детергента; 2 - 0,2% Тр.Ш -ЯЛ; 3 - Г/. ТВИИ 80 (начальная активность фермента - 0,2 ед/мл, концентрация белка - 2 мг/мл).

Ш 20 зи 40

Сродство к целлюлозе.,, Одним из важных биотехнологически требований, предъявляемых к компонентам целлюлазного комплекса является высокое сродство ферментов к целлюлозе. В настоящее вре мя для эндоглюканаз доказано, что активность в отношении кристал лического субстрата связана со способностью фермента эффективн связываться с поверхностью целлюлозы. Основным количественным по казателем эффективности адсорбции является соответствующий коэф циент распределения (Кр). Поэтому было целесообразно определит Кр для целлюлаз исследуемых термофильных бактерий, чтобы оценит их потенциал для гидролиза кристаллического субстрата.

Для полученного нами препарата целлюлаз величина Кр составляет 0,25 л/г. Эндоглюканазы данного препарата можно от нести к среднесорбирующимся Ферментам. Линейность изотермы ад сорбции свидетельствует об однородности по адсорбционным свойствам эндоглюканазы препарата.

3.2. Характеристика гомогем-шх эндоглюканаз С. thermocellum.

Таблица!

Свойства гомогенных

эндоглюканаз штамма 3.

Исследованные свойства выделенных эндоглюканаз 1 и 11 обобщены в табл.1.Оказалось. что индивиду-сюятаклп Шегшосепш альные гомогенные эн-доглюканазы 1 и 11 значительно различаются по термостабильности. Для эндоглюка-назы 1 период полуинактивации при 65°(рН 6,2) составил 19 ч. при 75°- 11 мин . Для эндоглюканазн 11 при 65°- 25сут, при 75°-16 ч. при 85* - 10 мин. При изучении термоинактивации при 85° С эндоглюканазн неочищенного препарата культуральной жидкости было сделано заключение о существовании в КЖ двух форм фермента, разли-щающихся термостабильностью. Это подтверждают исследования свойств индивидуальных ферментов. Сравнение данных по термоинактивации позволяет отождествить выделенные индивидуальные эндоглюканазн 1 и 11 с основной малотермостабильной (85* активности) и минорной высокотермостабильной (15% активности) формами эндоглюканазаны целлюлазного препарата культуральной жидкое-

Свойства Основная эндоглюканаза I Минорная эндоглюканаза И

Доля по активности в ЮН 853! 15%

Период пол^инактивации, 75* 85* 19 час 11 мин 1 мин 25 сут (расч.) 16 час 10 мин

Энергия активации для термоинактивации. Еакт. 105 ккал/мол между 65 и 75 115 ккал/мол между 75°и 85

Молекулярная масса 75900 ± 500 44700 ± 500

Изоэлектрическая точка 5,0 ± 0.1 5.9 + 0,1

Удельная активность (вискозиметрическая) 2 ед/мг 7 ед/мг

рН оптимум (по субстрату ОЦ-41) 6.0 5.0

Коэффициент распределения Кр, л/г 0.029 0.1

Гидролиз МКЦ и хлопка <5% <5%

Требования к Са1* нет нет

Требования к защите БН-групп нет нет

Заряд белковой молекулы высокий низкий

ти. Наблюдаемое отклонение от первого порядка в кинетике термои нактивации эндоглюканазы КЖ (препарат целлюлаз) можно отнести з счет различий в термостабильности двух индивидуальных ферментов и II.

Изучение сродства к целлюлозе выделенных нами ферментов показало, что в индивидуальном виде эндоглюканазы 1 и 11 не облада ют эффективной сорбционной способностью. Коэффициент распределе ния (Кр) при адсорбции на микрокристаллической целлюлозе состав ляет 0,029 л/г для основной эндоглюканазы 1 и несколько лучше О,10 л/г - для минорной эндоглюканазы 11. Сравнивая . данные, по лученные при определении величин Кр для эндоглюканазы неочищенно го препарата КЖ, и гомогенных эндоглюканаз 1 и 11, получили, чт для последних эта величина значительно меньше (0, 29 и 0,10 л/г соответственно) по сравнению с Кр препарата КЖ, равной 0,25 л/1 Линейность изотермы адсорбции эндоглюканазы препарата КЖ указыва ет на отсутствие множественных форм фермента, различающихся ад сорбционной способностью. Это свидетельствует в пользу того, чт индивидуальные эндоглюканазы I и II, в гомогенном виде существен но различающиеся величиной Кр, в изучаемом прапарате находятся составе "целлюлосом" и поэтому сорбируются как единое целое.

При выделении из агрегатов индивидуальных эндоглюканаз было также показано: обе формы фермента не способны деградировать до глубоких степеней конверсии как МКЦ, так и предобработанный хлопок . Степень конверсии этих субстратов была ниже 5% .Причиной этс^у может быть отсутствие природного окружения в виде"целлюло-сомы"

Таким образом, изучение эндоглюканаз С. ШегаюсеПит в сос таве высокомолекулярных агрегатов и в гомогенном виде показа; влияние надмолекулярной структуры комплекса на адсорбционные хе рактеристики эндоглюканазы.

3.3. Целлюлазный комплекс новой экстремально

термофильной бактерии Апаегосе11шп №егтор1111ит

При изучении целлюлазного комплекса А. №егторМ1ит опреде ляли две основные активности неочищенного препарата культуральж жидкости:эндоглюканазную (по гидролизу растворимой окрашеннс КМ-целлюлозы - субстрата ОЦ-41) и активность комплекса целлюлг (по гидролизу фильтровальной бумаги). Несоответствие между актш ностями свидетельствует о том, что ключевую роль в гидролизе дв;

субстратов (ОЦ-41 и ФБ) выполняют различные ферменты, т.е. эндог-люканаза, гидролизующая окрашенную растворимую КМ-целлюлозу. и компонент целлюлазного комплекса, лимитирующий гидролиз ФБ,представляют собой разные белки.

Удельная активность препарата. В результате концентрирования упариванием с последующим обессоливанием гель-фильтрацией через Акрилекс Р 6 из культуральной жидкости получен целлюлазный препарат с активностью, достаточной для изучения свойств компонентов комплекса: при 75°С - 4.20 ед/мг белка по КМЦ и 0,11 ед/мг белка по ФБ (содержание белка - 0.21 мг/мл). • :.

Нами была изучена рН-зависимость скорости гидролиза окрашенного субстрата ОЦ-41 и фильтровальной бумаги. Эндоглюканаза исследуемого препарата, гидролизующая окрашенную КМ-целлюлозу. обладает широким рН-оптимумом действия - в интервале рН 4-8 скорость гидролиза мало меняется. Для компонента целлюлазного комплекса, действие которого лимитирует гидролиз фильтровальной бумаги, характерен более узкий оптимум рН со смещением в кислую область - в районе рН 5-6.

Ингибирование продуктами реакции. Устойчивость эндоглюканаз к ингибированию продуктами гидролиза целлюлозы - желательное условие практической применимости целлюлазного комплекса. На рис. 5 (б) представлены данные ингибирования эндоглюканаз препарата цел-лобиозой. Ингибирование проходит по бесконкурентному типу и характеризуется константой ингибирования К1 = 0,19 М. Таким образом, исследуемая эндоглюканаза является среди известных одной из наиболее устойчивых к ингибированию целлобиозой.

Термостабильность. Как для активности по окрашенному субстрату ОЦ-41, так и для активности по ФБ препарата культуральной жидкости была изучена динамика термоинактивации при различных температурах. Период полуинактивации эндоглюканазы при 85°состав-ляет 150 мин, при 95°- 4 мин. Стабильность эндоглюканазы в препарате не зависит от присутствия СаС12. Термостабильность эндоглюканаз A. thermophllum зависит от температуры культивирования продуцента: после выращивания культуры при 75 термоинактивация эндоглюканаз КЖ при 85 протекает медленнее, чем в случае выращивания культуры при 68°: период полуинактивации составляет 300 против 200 мин, соответственно.

Для активности по ФБ неочищенного препарата культуральной жидкости характерны несколько иные закономерности термоинактивации. Прежде всего стабильность сильно зависит от ионов Са2+(рис.

100

я ю

7). Если в присутствии 2 тМ СаСТ^период полуинактивации при 85е составляет 250 мин (кривая 1), то при полном удалении следс кальция путем связывания его в присутствии 2 шМ ЭДТА он резь снижается до 5 мин (кривая 2). Аналогичный, но менее выраженнь эффект ионов Са наблюдается при 75°; здесь период полуинактиващ превышает 24 ч (кривые 3 и 4).

Рис. 7. Кривые термоинактивации компонента целлюлаз-ного комплекса А. 0

ШегторМ1ит, действие которого лимитирует гидролиз фильтровальной бумаги: 1 - при 85° С в присутствии 2 мМ СаС12; 2 - при 85е С в присутствии 2 мМ ЭДТА: 3 и 4 - аналогично 1 и 2, соот- _ии ветственно, при 75е С. Активность по Фильтровальной бумаге при 75", рН 6,2 в

присутствии СаЙ;.

2

-1,5

мг/мл

г. о

1.0

и

1 1 - 4 I

! ! 11

ч

¿-1_к"

400

еоо

Рис. 8. ^эндо.к/мл эндоглюканазы

1.0

1200

Гель-фильтраци* обессоленног препарата культуральной жидкое ти А. ШегторМ1ит через Сефарс зу СЬ-4В: 1 - концентрация бе; ка (мг/мл); 2 - активность э? доглюканазы по субстрату 0Ц-4 (А эндо). Колонка 3,5*100 о. скорость элюции 0.01 М буфере МЕБ-КОН рН 6,2 - 16 мл/ч.

- -

Надмолекулярная структура целлюлазного комплекса. Лля полученного целлюлазного препарата A. thermophllum гель-фильтрация через Сефарозу CL-4B (рис. 8) показала, что эндоглюканазная активность представлена в КЖ одним пиком с молекулярной массой около 70 kDA. Это указывает на отсутствие ассоциации целлюлаз бактерии в прочные мультиферментные высокомолекулярные агрегаты. Отсутствие ассоциации подтверждают также данные ультрафильтрации, в ходе которой 90% активности по фильтровальной бумаге было пропущено мембраной с порами диаметром 150 А (предел исключения 500 kDA). Отсутствие образования мультиферментных кластеров может оказаться благоприятным при практическом использовании целлюлаз. поскольку от целостности "целлюлосомы" может зависеть активность в отношении кристаллической целлюлозы.

ч Г а'/А

Рис. 9. Определение сродства к целлюлозе (Кр) для: 1 -эндоглюканазы обессоленного препарата культуральной жидкости А. thermophllum.no субстрату ОЦ-41; 2 - компонента целлюлазного комплекса обессоленного препарата, действие которого лимитирует гидролиз фильтровальной бумаги. Исходная концентрация эндоглюканазы - 0,5 ед/мл, белка - 0,1 мг/мл.

я

спор. ГД

Сродство к целлюлозе.Как уже отмечалось, важное место в характеристике целлюлазного комплекса занимает сродство его компонентов к целлюлозе. На рис. 9 приведены изотермы адсорбции двух основных активностей целлюлазного комплекса А. №егторМ1ит на микрокристаллической целлюлозе. Эндоглюканаза препарата существует в виде единственной по сорбвдонной способности формы с низким ^сродством к поверхности субстрата (Кр = 0,06 л/г, кривая 1). Напротив, компонент, действие которого лимитирует гидролиз ФБ,

11|)|'Д'''Т.'1|;.Ц|'!1 11(1 СроДСТГ.у п>) КраШЮЙ М> Ч н ■ дпумя МНОЖИТ! '.СИНИМИ фС мами (кривая 2 адсорбции состоит из двух участков), причем oj н;; Форм характеризуется высоким сродством к целлюлозе (Кр О, .1 л/г) и составляет основную часть активности - 70%, а друг (30%) по адсорбционной способности идентична эндоглюканазе (Кр О, 05 л/г). Высокая адсорбционная способность является необходю. предпосылкой эффективного гидролиза высокоупорядоченного субстр та. Поэтому закономерно обнаруженной нами относительно высок ородстпп к целлюлозе компонента комплекса А. thermoplülum, дей твие которого лимитирует гидролиз Фильтровальной бумаги.

Обобщая данные, полученные при изучении свойств фермент целлюлазных комплексов термофильных анаэробных бактерий, необх димо отметить, что с точки зрения молекулярных характеристик зн чительный интерес для биотехнологии представляют целлюлазы thermophilum. Наиболее привлекательным качеством в характеристи новой экстремально термофильной бактерии является термостабил нос.ть компонентов целлюлазного комплекса. В нашем случае целл лазная активность (по ФБ) оказалась даже более термостабильно чем активность зндоглюканазы (по субстрату ОЦ-41). Кроме тог обращает на себя внимание высокое сродство к целлюлозе целлюла ной активности комплекса (по ФБ ) и устойчивость эндоглюканазн ингибированию продуктом гидролиза - целлобиозой. Особенно хот лось бы отметить, что цел.шолазный комплекс экстремального терм1 филк не организован в виде "целлюлосом" - многоферментных агр' гатов. Это может оказаться благоприятным при практическом испод: зовании, поскольку от целостности "целлюлосом" зависят адсорбщ онные характеристики ферментов и следовательно - способность гидролизу кристаллического субстрата, как это имеет место Clostridium thermocellum штамм 3. Кроме того, наиболее вероятш способом увеличения выхода целлюлоз термофильных бактерий являе' ся клонирование генов в клетки других хозяев. Однако, при налич! сложной надмолекулярной организации целлюлазного комплекса Clostridium thermocellum получить подобную структуру при клонир< ванип вряд ли возможно.

Поэтому в качестве более перспективного продуцента целлюла: для проведения высокотемпературного гидролиза целлюлозы был ш пользован экстремальный термофил А. thermophilum.

IY. ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫЙ ГИДРОЛИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ПРЕПАРАТОМ

ЦЕЛЛЮЛАЗ AHAEROCELLUM THERMOPHILUM.

Изучен гидролиз различных образцов целлюлозы в реакторе перемешивания препаратом внеклеточного целлюлазного комплекса А. thermophilum. При гидролизе МКЦ при 80°С максимальная скорость образования Сахаров под действием целлюлазного препарата сохраняется в течение 24-72 ч с начала инкубации в зависимости от концентрации субстрата (5 - 40 г/л, соответственно). При постоянном количестве препарата в реакционной смеси (0.14 ед/м.п по ФБ) степень гидролиза МКЦ зависит от исходной концентрации субстрата и возрастает с 14% до 22% с уменьшением концентрации микрокристаллической целлюлозы в среде с 40 до 5 г/л, соответственно. При изучении зависимости степени конверсии целлюлозы от нагрузки фермента в ед на г субстрата найдено, что оптимальным является внесение ферментного препарата из расчета 7-8 ед (по гидролизу ФБ) на 1 г МКЦ. Степень конверсии кристаллического субстрата была значительно увеличена при изменении условий проведения гидролиза. Температура была снижена до 75°С, в качестве субстрата использовали целлюлозу со сниженной степенью полимеризации, предобрабо-танную по технологии компании "Tigney Technology" паровым взрывом. При нагрузке фермента, равной 1 ед/г (0,001 ед/мл среды при концентрации целлюлозы 1г/л) степень конверсии составляла 60-70% за 24 ч гидролиза. Повышения степени конверсии до 90-100% за 6 ч гидролиза можно достичь при увеличении степени нагрузки фермента до 170 ед/г (0,17 ед/мл реакционной среды при концентрации целлюлозы 1 г/л).

Особенно важно, что во всех случаях основным продуктом (70-90 молярных %) является глюкоза. При этом было обнаружено, что в целлюлазном комплексе активность целлобиазы (по гидролизу целлобиозы) практически равна нулю. Следовательно, образование глюкозы идет непосредственно из высокополимерных олигосахаридов по нецеллобиазному пути.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности А. thermophilum как продуцента целлюлаз для биоконверсии целлюлозы в глюкозу в условиях повышенных температур. Образование глюкозы выгодно отличает A. thermophilum от большинства микромицетов и от С. thermocellum. для которых характерно образование целлобиозы. Глюкоза является наиболее желательным продуктом гидролиза целлю-дозосодержащего сырья в ряде производств.

ВЫВОДЫ

R работе изучен биосинтез эндоглюканаз анаэробной термо фильной бактерии Clostridium thermocellum и новой экстремально термофильной анаэробной бактерии Anaerocellum thermophilum, также способы выделения целлюлаз. Охарактеризованы свойства фер ментов и возможность их использования при высокотемпературно гидролизе целлюлозы.

1. Наибольшее количество эндоглюканазы Clostridiu thermocellum штамма 3 синтезировалось на микрокристаллическо! целлюлозе ( МКЦ ): через 100 часов роста при 60° С и начальной величине рН 7,5 в культуральной жидкости сосредоточено 98% син тезированного фермента ( 0,8 ед/мл ). На растворимом субстрате ( целлобиозе ) уровень активности значительно ниже - 0,3 ед/мj

2. Для новой экстремально термофильной бактерго Anaerocellum thermophilum gen. nov., sp. nov., штамм Z 1320 подобраны состав среды ( источники углерода, азота, фосфора, стимулирующие добавки, восстанавливающие агенты ) и оптимальные условия роста (температура - 68-75°C, начальная величина рН 7,5), способствующие биосинтезу эндоглюканазы. Биосинтез усиливается на нерастворимых источниках углерода (глюкоза< глюкозо-6-фосфат целлобиоза< фильтровальная бумага< микрокристаллическая целлюлс за). Фермент конститутивен.

После оптимизации методами математического планирования сс отношения компонентов среды первоначальный уровень активное! (0,011-0,018 ед/мл ) увеличен в среднем в 40 раз (до 0,56 ед/м за 90 ч культивирования). Через 140 часов активность фильтрат культуральной жидкости (96 % синтезированного фермента) составля ет 0,82 ед/мл по вискозиметрии и 0, 02 ед/мл по гидролизу фильтро вальной бумаги.

3. Проведено сравнение различных способов выделения препаратов целлюлаз из кулътуралъных жидкостей: высаливание сульфатом аммония, осаждение этанолом, ультрафильтрация через мембраны с пределом исключения 200 кДа, гель-фильтрация на Акрилексе Р 6.

При получении препаратов из Clostridium thermocellum наилучшие результаты достигнуты при осаждении сульфатом аммония (выход активности - 62 и 33 %% , степень очистки - 3,7 и 2,0 по вискозиметрии и гидролизу фильтровальной бумаги, соответственно) Для Anaerocellum thermophilum оптимальным методом оказалась гель-фильтрация на Акрилексе Р 6 ( выход активности - 32 и 42

%%, степень очистки - 3 и 4 по вискозиметрии и гидролизу фильтровальной бумаги, соответственно).

4. Изучены свойства эндоглюканазы неочищенного препарата целлюлаз из культуральной жидкости Clostridium thermocellum.

Исходя из кинетики термоинактиваций при 85°обнаружено, что эндоглюканаза представлена двумя формами, значительно различающимися по термостабильности: основной ( 85% по активности ) с периодом полуинактивации 1 минута и - минорной ( 15 % по активности ) с периодом полуинактивации 10 минут.

Ингибирование целлобиозой эндоглюканазы препарата происходит по неконкурентному типу с константой ингибирования 110 мМ.

Эффективность сорбции на микрокристаллической целлюлозе эндоглюканазы препарата характеризуется коэффициентом распределения ( Кр ) 0, 25 л/г.

5. В процессе ультрафильтрации фугата культуральной жидкости Clostridium thermocellum установлено, что половина эндоглюка-наз первоначально заключена в высокомолекулярные агрегаты -"целлюлосомы". Предложена схема фракционирования эндоглюканаз "целлюлосом", включающая: ионнообменную хроматографию на ДЭ-АЭ-сефарозе, гель-фильтрацию через сефарозу CL-4B и сефакрил S-300, высокоэффективное хроматофокусирование на колонке Mono Р.

Показано, что "целлюлосомы" гетерогенны по размеру и ионно-обменным свойствам, лабильны, распадаются на низкомолекулярные "осколки", высвобождая индивидуальные эндоглюканазы I и II.

6. Очищены до гомогенного состояния и установлены основные характеристики индивидуальных эндоглюканаз I и II Clostridium thermocellum, первоначально входящих в состав "целлюлосом".

Соответственно, для эндоглюканаз I и II, молекулярная масса - 75900 и 44700 Да; изоэлектрическая точка - 5,0 и 5,9; рН-опти-мум действия - 5,7 и 4,8; период полуинактивации при 85°- 1 мин и 10 мин, причем сравнение термостабильности позволило отождествить индивидуальные эндоглюканазы I и II с основной формой (низ-котермостабильной) и минорной формой (высокотермостабильной) эндоглюканазы неочищенного препарата целлюлаз; коэффициент распределения (Кр) - 0,029 и 0.1 л/г, что существенно уступает значению Кр для эндоглюканазы неочищенного препарата (0,25 л/г). Сравнение эффективности сорбции (Кр) индивидуальных эндоглюканаз I и II, выделенных из "цел^осом". и эндоглюканазы препарата целлюлаз, входящей с состав "целлюлосом", позволяет заключить, что надмолекулярная организация целлюлазного комплекса

Clostridium thermocellum в виде "целлюлосом" необходима для эффективной сорбции на кристаллическом субстрате.

7. В неочищенном препарате из культуральной жидкост! Anaerocellum- thermophilum охарактеризованы свойства комплексг целлюлаз, гидролизующих нерастворимую целлюлозу - фильтровальнув бумагу (ФБ) и свойства эндоглюканазы, гидролизующей растворимув КМ-целлюлозу.

Комплекс целлюлаз, гидролизующих ФБ при рН 5-7. не организован в виде высокомолекулярных "целлюлосом"; характеризует« высокой термостабильностью: период полуинактивации при 85°раве1 250 минутам, присутствие ионов Саг* обеспечивает термостабильность; имеет высокое сродство к целлюлозе: Кр равен 0,5 л/г.

Зндоглюканаза препарата осуществляет гидролиз в интервале { 4-8; не связана с другими белками культуральной жидкости; имее низкое сродство к целлюлозе, характеризующееся Кр 0,06 л/г; фермент слабо ингибируется целлобиозой по бесконкурентному типу с константой ингибирования ( Ki ) 190 мМ; период полуинактиващ« при 85° равен 150 минутам, при 90° - 4 минутам.

8. Оптимизированы условия высокотемпературного гидроли; целлюлозы препаратом целлюлаз из Anaerocellum thermophilum. Пр внесении 1 ед/г субстрата при 75°за 24 часа гидролизуется 60-7С целлюлозы. Важно, что основным продуктом гидролиза является глк коза ( 70-90 % ).

ь Данный продуцент перспективен как источник целлюлаз для вь со^Ьтемпературной конверсии целлюлозы в глюкозу, особенно nocj генно-инженерных работ с геномом бактерии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Тихомиров Д.Ф., Фетисова В.В. (Столбова), Симаньковг М.В., КлесовА.А. Эндо-1,4-р-глюканаза анаэробной термофильно! бактерии Clostridium thermocellum в условиях распада мультифер-ментных кластеров// Биохимия. - 1988. - т.53, в. 5. - С. 758-763.

2. Тихомиров Д.Ф., Столбова В.В.. Клесов А.А. Эн-до-1,4-р-глюканаза анаэробной бактерии Clostridium thermocellur шт. N 3 с высокой термостабильностью// Прикл. биохим. микробиол. -1989. - т.25. в.1. - С. 48-55.

3. Тихомиров Д.Ф., Столбова В.В., Прабакаран К., Клесо( А. А. Использование растворимой окрашенной карбоксиметилцеллюлоз1 для измерения активности эндо-1,4-^-глюканаз ( целлюлаз )//Био-

технолога. - 1989. - т.5, N 4. - С. 518-524.

4. Тихомиров Д. Ф.. Столбова В.В., Светличный В. А., Клесов A.A., Заварзин Г.А. Секреция эндо-1,4-р-глюканаз целлюлазного комплекса новой экстремально термофильной анаэробной бактерией Anaerocellum thermophllum gen.nov., sp.nov.// Прикл.биохим.мик-робиол. - 1990. - т. 26, в. 2. - С. 252-259.

5. Тихомиров Д.Ф.. Столбова В. В., Светличный В. А., Клесов

A.А. Высокотермостабильный целлюлазный комплекс новой экстремально термофильной бактерии Anaerocellum thermophllum// Прикл. биохим.микробиол. - 1992. - т.28, B.3. - С. 19-27.

6. Тихомиров Д.Ф., Столбова В.В., Тихомирова А.С. Оптимизация биосинтеза эндо-^-^з-глюканаз при культивировании экстремально термофильной бактерии Anaerocellum thermophllum // Микробиология. - 1994.- в печати.

7. Тихомиров Д.Ф., Фетисова В. В. ( Столбова ). Перспективы использования Clostridium thermocellum штамм N 3 как источника целлюлаз// В сб.: Тезисы докладов конференции молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов". - Рига, 1987. - С. 77.

8. Тихомиров Д.Ф.. Фетисова В. В. ( Столбова ), Светличный

B. А. Рекордно термостабильная эндо-1,4-£гГЛюканаза экстремально термофильной анаэробной целлюлолитической бактерии// В сб.: Тезисы докладов VI Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимоло-гии. - Вильнюс, 1988. - С. 195.

9. Столбова В.В., Тихомиров Д.Ф. Целлюлазный комплекс новой экстремально термоф!пьной анаэробной бактерии// В сб.: Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами". - Ташкент, 1988. - С. 118.

10. Tikhomirov D.F., Stolbova V.V., KlyosovA.A. Cellulases . of thermophilic bacteria// In proc. V-th Sei. Sym. Soc. Countries Biotecnology, Hungary, Sept., 1989, MTESZ Hazinyomda, Budapest. P. 227-228.

11. Тихомирова А.С., Столбова В.В.. БолобоваА.В. Влияние надмолекулярной структуры целлюазного комплекса Clostridium thermophllum на гидролиз криталлического субстрата// В сб.: Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма",- Пущино, 1989. - С. 50.

12. Тихомиров Д.Ф., Столбова В.В., Баулина Т.В., Светличный В.А. Фермент бактерии Anaerocellum thermophllum, высокоактивный *в отношении кристаллической целлюлозы// В сб. : Тезисы докладов

III Всесозной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки". - Казань, 1990. - С. 135.

13. Баулина Т.В., Столбова В.В.. Тихомиров Д.Ф. Высокотемпературный гидролиз кристаллической целлюлозы целлюлазами экстремально термофильной бактерии Anaerocellum thermophilum// В сб.: Тезисы докладов III Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки". - Казань, 1990. -С. 106.

14. Tichomirow D.F.. Baulina Т.W.. Stolbowa V. V.,Klyosow А. A. Thermally stable cellulase from extremely thermophilic bacterium// In proc. 20-th Meeting of FEBS. Budapst, August, 1990, FEBS Publ. Comitee, Budapest. P. 340.

15. Тихомиров Д.Ф.. Столбова В. В., Баулина Т.В., Клесов А. А. Целлюлаза и jj-галоктозидаза экстремально термофильных бактерий// В сб.: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология". - Москва, 1991. - С. 25.

16. Тихомиров Д.Ф., Столбова В. В., Баулина Т.В. Условия высокотемпературного ферментативного гидролиза целллозы в глюкозу/ /В сб.: Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Химические превращения пищевых полимеров". - Светлогорск, 1991. - С. 34.

17. Баулина Т.В., Столбова В.В., Светличный В.А., Тихомиров Д.Ф. Скрининг экстремально термофильных бактерий по секреции и свойствам целлюлаз// В сб.: Тезисы докладов 5 конферении Рос. федерации "Новые направления биотехнологи". - Пущино, 1992. - С. .109. v

*1'8. Столбова В. В., Тихомиров Д.Ф., Тихомирова A.C. Anaerocellum thermophilum - как продуцент термостабильных целлюлаз для высокотемпературной конверсии целлюлозы//В сб.: Тезисы докладов Конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами".-Москва, 1993. - в печати.

Abstract

of the thesis " CELLULASES OF THERMOPHILIC ANAEROBIC BACTERIA (BIOSYNTHESIS, ISOLATION, PROPERTIES)"

To be competitive, an industrially implemented process of enzymatic conversion of cellulose into soluable sugars requiers considerable improvement of biotechnologlcal characteristies of the cellulase complex. From this point of view thermophilic anaerobic bacteria are believed to have good prospects for aplicatl-on.

We have studied biotechnologlcal properties of cellulolytic enzymes from an extremely thermophilic anaerobic bacterium Anae-rocellum thermophilum gen.nov., sp.nov. and thermophilic anaerobic bacterium Cloctridium thermocellum strain 3. To rise the activity of cellulase complex cultivation condition were optimized. Culturing of C. thermocellum for 100 h at 60° C on 1 % microcrys-talline cellulose resulted in accumulation of 0.8 IU/ml endoglu-canase in the culture fluid. For A. thermophilum on optimized medium the extracellular cellulase activity after 140-h cultivation at 75°C was raised up to 0,82 IU/ml (using viscometric technique) and up to 0,02 IU/ml (using filter paper).

After purification by ultrafiltration, ion exchange chromatography on Sepharose CL-6B and Mono P and gel filtration on Sep-harose CL-4B and Sefacryl S-300 two miltiple forms of endogluca-nase of C. thermocellum were isolated. The endoglucanases loose their ability to adsorb on crystalline cellulose and to hydralize the substrate being isolated from supramolecular cellulolytic clasters.

The endoglucanase of A. thermophilum, hydrolising soluable CM-cellulose at wide range of pH 4-8, is poorly inhibited by cel-lobiose with Ki 0.19 M and is loosely adsorbed on cellulose. Component hydrolysing filter paper at pH 5-7 posseses high affinity for cellolose surface. Both cellulase complex components are characterized by high thermal stability (the half-inactivation period being 150-250 min at 8ifc) and are not associated into multienzyme clasters. Cellulases from A. thermophilum is active against crystalline cellulose: 60-70 % mlcrocrystalline substrate is degraded to glucose at 75° C after 24 h.

The favourable characteristics of cellulase complexe of extremely thermophilic anaerobe make A. thermophilum attractive object for enhancement of productiveness by genetic engineering ^technique.